JP2001004624A - Ａｇｅ化タンパクの定量用試薬および測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来の免疫学的測定法よりも更に迅速かつ簡
便にＡＧＥ化タンパクを測定でき、非特異的な凝集反応
が起こりにくく、かつ保存安定性の良いＡＧＥ化タンパ
ク定量用試薬を提供する。 【解決手段】 ＡＧＥ化タンパクを特異的に認識する抗
体が感作されたラテックスと第４級アンモニウム塩を共
存させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＡＧＥ化タンパク
定量用試薬およびその測定法に関する。更に詳しくは、
試料中のＡＧＥ化タンパクを免疫反応にてラテックス凝
集反応を利用して定量を行うに適した試薬およびその測
定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＡＧＥ（終末糖化産物）は、糖尿病性合
併症の重篤度（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ，
１９８８，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１８：１３
１５−１３２１）や老化（Ａｒａｋｉ，Ｎ．，ｅｔ ａ
ｌ，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１
０２１１−１０２１４）、慢性腎疾患（Ｍｉｙａｔａ，
Ｔ．，ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅ
ｐｈｒｏｌ．，７：１１９８−１２０６）、アルツハイ
マー病（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ，１９９
４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
９１：５７１０）等と関連があることが明らかになって
きており、上記疾患の診断、治療、予防あるいはその薬
効評価に有用な指標とされている。ＡＧＥ化タンパクの
うち、カルボキシメチル化タンパク（以下、「ＣＭ化タ
ンパク」と呼ぶこともある。）はＡＧＥ化タンパクの主
成分であること（Ｒｅｄｄｙ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ，１９
９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４：１０８７２−
１０８７８）から、ＡＧＥ化タンパクの有用な指標とさ
れている。

【０００３】従来、血液中のＡＧＥ化タンパクの測定
は、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー
／質量分析等の機器分析による方法で行われていた。し
かしながら、機器分析による測定法は操作が煩雑であり
感度も低いという問題点があることから、測定が容易で
感度も高い抗原抗体反応による方法が多用されるように
なった。抗原抗体反応によるＡＧＥ化タンパクの測定法
としては、ＥＬＩＳＡ法（酵素標識免疫測定法）（特表
平１０−５０４６４０号公報）、ドットブロッティング
法あるいはラテックス凝集法が知られているが、ＥＬＩ
ＳＡ法においては、例えば、特表平１０−５０４６４０
号公報に記してあるように、界面活性剤、蛋白変性剤等
による被検体の前処理が必要であり、操作が煩雑で時間
もかかるという問題がある。また、ＥＬＩＳＡ法、ドッ
トブロッティング法とも機器分析よりは迅速で簡便なも
のの、半日〜１日の時間を要し、操作においても熟練度
が必要であるという問題があった。一方、ラテックス凝
集法を用いた場合、測定操作は簡便でしかも迅速に測定
できるという利点はあるものの、Ｂ／Ｆ分離を行わない
ためＥＬＩＳＡ法やドットブロッティング法に比べ非特
異的な反応（凝集）が起こり易く、また、ＡＧＥ化タン
パクを特異的に認識する抗体が感作されたラテックスの
保存安定性も悪いという欠点があった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者の目
的は、ＥＬＩＳＡ法やドットブロッティング法よりも更
に迅速かつ簡便にＡＧＥ化タンパクを測定でき、かつ非
特異的な凝集反応が起こりにくく、ＡＧＥ化タンパクを
特異的に認識する抗体が感作されたラテックスの保存安
定性も良い、ラテックス凝集法によるＡＧＥ化タンパク
の定量用試薬を提供することにある。

【０００５】本発明の他の目的は、本発明の上記定量用
試薬を用いてラテックス凝集法によりＡＧＥ化タンパク
を精度良く定量する方法を提供することにある。本発明
の更に他の目的および利点は、以下の説明から明らかに
なろう。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、試料中の
ＡＧＥ化タンパクを測定するにあたり、ＡＧＥ化タンパ
クを特異的に認識する抗体が感作されたラテックスと第
４級アンモニウム塩を共存させることによって非特異的
な凝集が抑制でき、しかも、ＡＧＥ化タンパクを特異的
に認識する抗体が感作されたラテックスの保存安定性も
向上することを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明の上記目的および利点
は、第１に、ＡＧＥ化タンパクを特異的に認識する抗体
が感作されたラテックスおよび第４級アンモニウム塩を
組み合わせてなる、ＡＧＥ化タンパク定量用試薬によっ
て達成される。また、本発明の上記目的および利点は、
第２に、溶血試料中のＡＧＥ化タンパクを、ＡＧＥ化タ
ンパクを特異的に認識する抗体が感作されたラテックス
と、第４級アンモニウム塩の存在下に免疫凝集反応せし
め、次いで免疫凝集物の濃度を測定することを特徴とす
る、ＡＧＥ化タンパクの測定法によって達成される。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明をより詳細に説明す
る。本発明のＡＧＥ化タンパクとは、メイラード反応の
後期段階反応に見られる３つの特徴的な現象（蛍光性、
褐色変化、および分子内／分子間架橋形成）の少なくと
も１つを伴う反応生成物が付加したタンパク、および／
或いはＣＭ化タンパクを指す。３つの特徴的な現象の少
なくとも１つを伴う反応生成物として、例えば、ペント
シジン化タンパク、イミダゾロン化タンパク、クロスリ
ン化タンパク等が挙げられる。特に、ＣＭ化タンパクは
ＡＧＥ化タンパクを特異的に認識する抗体の主要なエピ
トープであり、また、糖尿病性の合併症を発症している
患者においては該血中濃度が健常者のそれと比較して有
意に高いことから、糖尿病性合併症用マーカーとして好
適に用いられる。

【０００９】かかるＡＧＥが付加したタンパクの種類と
しては特に限定はされないが、例えば、血中濃度の高い
アルブミン、寿命の長いヘモグロビン、沈着アミロイド
の主要成分であるβ２マイクログロブリン（β２Ｍ）、
動脈硬化の発症と関連の深い低密度リポタンパク（ＬＤ
Ｌ）や高密度リポタンパク（ＨＤＬ）等が挙げらる。特
に、ヘモグロビンは血液中のタンパクの中でも最も寿命
が長いことが知られており、ＡＧＥが付加したタンパク
の中でも好適なタンパクとして用いられる。

【００１０】ＡＧＥ化タンパクを特異的に認識する抗体
（以下、「ＡＧＥ化タンパク抗体」と呼ぶこともあ
る。）は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体
でもよく、ポリクローナル抗体あるいはモノクローナル
抗体の作製は公知の方法に従って行うことが出来る。本
発明で用いるラテックスは、通常の免疫測定用担体とし
て用いられているもの、例えば、スチレン、プロピレ
ン、アクリルアミド、アクリロニトリル等の合成樹脂、
またはこれらにそれ自体公知の方法により反応性官能基
を導入したものであれば特に制限されず、使用できる。

【００１１】ラテックスの形状は特に制限はされない
が、球状のものがラテックスの製造が容易なこと、或い
はＡＧＥ化タンパク抗体感作ラテックスの作製が容易な
こと、から一般的に用いられている。ＡＧＥ化タンパク
を感作する球状ラテックスの平均粒子径は、抗原抗体反
応後の凝集の起こり易さや凝集度（濁度）の測定、凝集
度の判別のし易さなどの観点から０.０５〜０.５μｍで
あることが好ましい。

【００１２】ＡＧＥ化タンパク抗体のラテックスへの感
作は、一般的には物理的吸着法にて４〜５０℃で行われ
るが、これに限定されず、例えば化学的にラテックス表
面に結合させてもよい。感作時のｐＨは特に制限はされ
ないが、抗体の立体構造の変化が起こりにくいｐＨ４〜
１０で感作を行うことが好ましい。通常、ラテックスに
対し０.００１〜１０重量％程度のＡＧＥ化タンパク抗
体を担持させたものが、ＡＧＥ化タンパク抗体感作ラテ
ックスとしてＡＧＥ化タンパク定量用試薬に供される。

【００１３】ＡＧＥ化タンパク定量用試薬を構成する第
４級アンモニウム塩としては、例えば、塩化コリン、臭
化コリン、塩化アセチルコリン、臭化アセチルコリン、
塩化テトラメチルアンモニウム等が挙げられる。これら
の化合物は、１種類または2種類以上で使用される。抗
原抗体反応時の第４級アンモニウム塩の濃度は０.１重
量％以上であることが好ましい。これ以下の濃度だと、
第４級アンモニウム塩の添加効果が見られ難くなる。

【００１４】本発明のＡＧＥ化タンパク定量用試薬を用
いて、ＡＧＥ化タンパクを測定する方法は、例えば、以
下のようにして行われる。ＡＧＥ化タンパクを含むかも
しれない試料、およびＡＧＥ化タンパク抗体が感作され
たラテックスが含まれる溶液に、少なくとも１種類の第
４級アンモニウム塩を共存させて抗原抗体反応を起こさ
せ、吸光度を測定し、そしてこの測定値から試料中のＡ
ＧＥ化タンパクを定量する。

【００１５】上記試料としては、ＡＧＥ化タンパクを含
むかもしれない試料であれば特に限定はされないが、本
発明のＡＧＥ化タンパク定量用試薬を臨床検査薬として
用いる場合の試料としては、血液、血漿、血清、尿等が
挙げられる。また、第４級アンモニウム塩は、試料ある
いはＡＧＥ化タンパク抗体が感作されたラテックスが含
まれる溶液に予め添加しておいても、或いは試料とＡＧ
Ｅ化タンパク抗体が感作されたラテックスが含まれる溶
液を混合するする時に第４級アンモニウム塩の水溶液を
添加してもよい。

【００１６】上記抗原抗体反応開始後、上記混合液の吸
光度は３４０〜８００ｎｍの範囲から適切な波長を選択
して測定される。吸光度の測定は、特定の時間の吸光度
を求めてもよいし、特定の２点の吸光度を測定し、その
間の吸光度の増加分または単位時間当たりの増加分を求
めてもよい。ＡＧＥ化タンパクの定量は、既知量のＡＧ
Ｅ化タンパクを含む試料を用いて上記測定方法にて吸光
度または吸光度増加分を求め、ＡＧＥ化タンパク濃度と
吸光度または吸光度増加分との関係から検量線を作成
し、次いで同一条件で未知量のＡＧＥ化タンパクを含む
試料の吸光度または吸光度増加分を求め、前記検量線か
ら吸光度または吸光度増加分に対応するＡＧＥ化タンパ
ク濃度を求めることにより行われる。

【００１７】

【発明の効果】本発明のＡＧＥ化タンパク定量用試薬を
用いることにより、被検体中のＡＧＥ化タンパク濃度を
簡便かつ迅速に測定でき、かつ非特異的な凝集反応を抑
制できた。また、該試薬の構成成分であるＡＧＥ化タン
パク抗体が感作されたラテックスの保存安定性も向上す
る。

【００１８】ＡＧＥ化タンパク定量用試薬に第４級アン
モニウム塩を共存させることによって非特異的な凝集が
抑制できかつＡＧＥ化タンパク抗体感作ラテックスの保
存安定性を向上できる理由は必ずしも明らかではない
が、第４級アンモニウム塩を添加することにより反応系
内のイオン強度が高くなったことが一因となって、タン
パク間の非特異的な結合が抑制でき、ひいてはＡＧＥ化
タンパク抗体感作ラテックスの分散性も良くなり、保存
安定性が向上したのではないかと考えられる。

【００１９】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではな
い。

【００２０】実施例１〜５ （１）ＣＭ化ヘモグロビン抗体の調製 ハイブリドーマ２Ｂ３株（寄託番号：生命研菌寄第１６
６３２号（ＦＥＲＭＰ−１６６３２））を、１０％ＦＣ
Ｓを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。ハイブリ
ドーマの培養上清に等量の飽和硫酸アンモニウムを加
え、遠心分離し沈殿を分取した。この沈殿を少量の１０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.５）に溶解させ、同じ
緩衝液に対して透析した。透析後遠心分離し不溶物を除
き、これをＤＥＡＥ−セルロースカラムにかけた。緩衝
液で洗浄後、食塩濃度勾配により溶出しＩｇＧ画分を分
取した。この画分をゲル濾過ＨＰＬＣカラム（バイオラ
ッド社、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ ＴＳＫ２５０）にかけ、クロ
マトグラフィーを行うことにより精製モノクローナル抗
体を得た。

【００２１】（２）甲剤（CM化ヘモグロビン抗体担持ラ
テックス懸濁液）の調製 ２０ｍMリン酸緩衝液（ｐH７.２）で希釈した平均粒子
径０.３２μｍ、ラテックス濃度１％のポリスチレン粒
子（藤倉化成（株）、Ｃａｔ． Ｎｏ．２８８０）懸濁
液５ｍｌと、２０ｍMリン酸緩衝液（ｐH７.２）で希釈
した０.３ｍｇ／ｍｌのＣＭ化ヘモグロビン抗体溶液５
ｍｌを混合し、３７℃で１時間静置した。次いで、０.
２５％牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ）を含む２０ｍM
リン酸緩衝液（ｐH７.２）１０ｍｌを添加し、更に、３
７℃で２時間静置した。得られたCM化ヘモグロビン抗体
担持ラテックスを遠心分離にて２０ｍMリン酸緩衝液
（ｐH７.２）で２回洗浄した後、３３.５ｍｌの１００
ｍＭ塩化ナトリウム、０.１％アジ化ナトリウム、並び
に７.５％スクロースを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８.０）を沈さに加えて甲剤を調製した。

【００２２】（３）乙剤（緩衝液）の調製 １００ｍＭ塩化ナトリウム、０.１％アジ化ナトリウ
ム、１.９％ポリビニルピロリドンＫ３０（東京化成
（株）、分子量４０,０００）、並びに表１に示す塩化
コリン濃度となるように、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８.０）に加えて乙剤とした。

【００２３】（４）被検体 アミノ酸分析でカルボキシメチルバリン（以下、「ＣＭ
Ｖ」と呼ぶこともある。）濃度が確認されている糖尿病
患者の全血、赤血球画分、および血漿画分を用いた。ア
ミノ酸分析の結果から、該全血中、赤血球画分中、血漿
画分中のＣＭＶ濃度は、それぞれヘモグロビン１ｍｇ当
たり３０ｐｍｏｌ、３０ｐｍｏｌ、検出限界以下（２ｐ
ｍｏｌ以下）であった。

【００２４】（５）測定法 乙剤２２０μｌに被検体１０μｌをガラスセル中で添加
撹拌した後、３７℃で約５分間静置した。次いで甲剤を
１００μｌ添加して撹拌し、３０秒後から２００秒まで
の波長８０４ｎｍにおける光学密度変化量を測定し、光
学密度変化量から被検体中のＣＭ化ヘモグロビン濃度を
求めた。以上の操作には、自動分析装置ＴＢＡ−３０Ｒ
形（東芝メディカル）を用いた。

【００２５】（６）甲剤（ＣＭ化ヘモグロビン）の保存
安定性の評価 試薬を静置し、転倒混和せずに３７℃、５日間保存後の
感度（３０秒後から２００秒までの波長８０４ｎｍにお
ける光学密度変化量）を測定した。その結果を表１に示
した。

【００２６】

【表１】

【００２７】実施例６ ＣＭ化ヘモグロビン抗体の代わりにＡＧＥ化ヘモグロビ
ン抗体を用いたこと以外は実施例１と同様の操作で行っ
た。結果を表１に示した。尚、ＡＧＥ化ヘモグロビン抗
体は、以下のように作製した。

【００２８】（１）ＡＧＥ化ヘモグロビンの作製 ０.１５Mの塩化ナトリウムを含む０.５Mリン酸緩衝液１
ｍｌに、ヒトヘモグロビン（ＳＩＧＭＡ、フラクション
Ｖ）を６ｍｇ／ｍｌ、グルコースを０.１７Ｍとなるよ
うに溶解した。この溶解液を０.２２μｍのフィルター
で濾過した後、３７℃で２ヶ月間静置した。次いで、２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）で４℃にて２日間透
析され、未反応のグルコースを除去した後に、ＡＧＥ化
ヘモグロビン抗体作製のための免疫原として供された。

【００２９】（２）ＡＧＥ化ヘモグロビン抗体の作製 体重が２ｋｇ以上のウサギに、上記作製したＡＧＥ化ヘ
モグロビンを抗原として、以下の要領で免疫した。２ｍ
ｇ／ｍｌになるように調製した該抗原溶液０.５ｍｌ
に、フロイントの完全アジュバント０.５ｍｌを加えた
ものをウサギの耳静脈に注射した。その後、２週間おき
に２ｍｇ／ｍｌの該抗原溶液０.２５ｍｌにフロイント
の不完全アジュバント０.２５ｍｌを加えたものを追加
免疫した。この間、ＡＧＥ化ヘモグロビン抗体が産生さ
れたか否かを確認するために、２週間に１回ウサギの外
縁耳静脈から部分採血した。６週間後、ＡＧＥ化ヘモグ
ロビン抗体が産生されたことを酵素免疫測定（ＥＬＩＳ
Ａ）法で確認し、全採血した。

【００３０】（３）アフィニティ精製カラムの作製 ２５ｍｌのアフィゲル１５（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を７５ｍ
ｌの１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４.５）で洗浄した後、
１０ｍｇ／ｍｌのヒトヘモグロビン溶液を６２.５ｍｌ
加え、室温で緩やかに撹拌した。次いで、未反応のヒト
ヘモグロビンを濾過にて除去し、１Ｍのエタノールアミ
ンを３０ｍｌ加え、室温で緩やかに撹拌し、未反応のＮ
−ヒドロキシサクシイミドエステルをブロッキングし
た。該ヒトヘモグロビンを固定化した支持体をカラムに
詰め、２８０ｎｍの吸光度が０になるまでイオン交換水
で洗浄した。更に、０.１５Ｍの塩化ナトリウムを含む
２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）でカラムを平衡
化した。

【００３１】（４）ＡＧＥ化ヘモグロビン抗体のアフィ
ニティ精製 作製したＡＧＥ化ヘモグロビン抗体を１ｍｇ／ｍｌにな
るように０.１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭの
リン酸緩衝液（ｐＨ７.４）で希釈したものを、１００
ｍｇ程度になるように該アフィニティ精製カラムにアプ
ライした。次いで、２８０ｎｍの吸光度が０になるまで
前記リン酸緩衝液を流速０.５ｍｌ／ｍｉｎで流した。
カラムに結合しなかった抗体をＡＧＥ化ヘモグロビン抗
体として回収した。２８０ｎｍの吸光度が０になったと
ころで、リン酸緩衝液から０.１Ｍのグリシン緩衝液
（ｐＨ３.０）に換え、カラムに結合している抗体を溶
離させ、０.１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７.４）でカラムを平衡化し、回収し
た抗体を再度カラムにアプライし、カラムに結合しなか
った抗体を回収した。次いで、５０ｍＭのグリシン緩衝
液（ｐＨ８.２）で透析し、ラテックス凝集法の抗体と
して供された。

【００３２】比較例１ 塩化コリンを用いない以外は実施例１と同様の操作で行
った。結果を表１に示した。

【００３３】比較例２ ８％塩化コリンの代わりに、０.０１％塩化コリンを用
いたこと以外は実施例１と同様の操作で行った。結果を
表１に示した。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＡＧＥ化タンパクを特異的に認識する抗
   体が感作されたラテックスおよび第４級アンモニウム塩
   を組み合わせてなる、ＡＧＥ化タンパク定量用試薬。
2. 【請求項２】 ＡＧＥ化タンパクを特異的に認識する抗
   体がカルボキシメチル化タンパクを特異的に認識する抗
   体である請求項１に記載の定量試薬。
3. 【請求項３】 溶血試料中のＡＧＥ化タンパクを、ＡＧ
   Ｅ化タンパクを特異的に認識する抗体が感作されたラテ
   ックスと、第４級アンモニウム塩の存在下に免疫凝集反
   応せしめ、次いで免疫凝集物の濃度を測定することを特
   徴とする、ＡＧＥ化タンパクの測定法。