JP3512545B2 - ヘモグロビンａ１ｃの測定方法 - Google Patents
ヘモグロビンａ１ｃの測定方法Info
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- JP3512545B2 JP3512545B2 JP34871195A JP34871195A JP3512545B2 JP 3512545 B2 JP3512545 B2 JP 3512545B2 JP 34871195 A JP34871195 A JP 34871195A JP 34871195 A JP34871195 A JP 34871195A JP 3512545 B2 JP3512545 B2 JP 3512545B2
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヘモグロビンＡ１
Ｃの測定方法に関する。本発明方法によれば、ヘモグロ
ビンＡ１Ｃよりも高濃度で存在するヘモグロビンと抗ヘ
モグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体との交叉反応を抑
制して、低濃度のヘモグロビンＡ１Ｃを高感度で測定す
ることができる。
Ｃの測定方法に関する。本発明方法によれば、ヘモグロ
ビンＡ１Ｃよりも高濃度で存在するヘモグロビンと抗ヘ
モグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体との交叉反応を抑
制して、低濃度のヘモグロビンＡ１Ｃを高感度で測定す
ることができる。
【０００２】
【従来の技術】糖尿病患者の血液試料では、グルコース
の血中濃度が増加するだけでなく、ヘモグロビンがグル
コシル化されて生成するヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１
Ｃ）の血中濃度も増加することが知られている。従っ
て、ヘモグロビンＡ１Ｃは、糖尿病患者の血糖コントロ
ール状態の中期的ないし長期的指標として、糖尿病の臨
床検査において広範に利用されている。従来、ヘモグロ
ビンＡ１Ｃ濃度の測定は、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）を用いて実施されてきた。しかし、ＨＰＬ
Ｃでは、長時間かけないと多数の検体を測定することが
できなかった。また、ヘモグロビンＡ１Ｃ値は糖尿病検
査項目として重視されているにもかかわらず、ＨＰＬＣ
による測定値の精度は必ずしも良好ではなかった。この
最大の原因は、被検試料から不安定ヘモグロビンＡ１Ｃ
分画を十分に除去していないことによるものであった。
また、ヘモグロビンＡ１Ｃに特異的なモノクローナル抗
体を用いて、ヘモグロビンＡ１Ｃを免疫学的に測定する
方法も知られている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃ Ｉｎｃ．；特開平７−５１０８７号公
報）。しかし、その方法では、モノクローナル抗体が安
定型ヘモグロビンＡ１Ｃとのみ特異的に反応するため、
ヘモグロビンＡ１Ｃを３Ｍグアニジン塩酸で５６℃にて
１５分間処理しないと、全体の正確な量を測定すること
ができなかった。また、加熱処理が必要であるため、操
作も煩雑であった。
の血中濃度が増加するだけでなく、ヘモグロビンがグル
コシル化されて生成するヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１
Ｃ）の血中濃度も増加することが知られている。従っ
て、ヘモグロビンＡ１Ｃは、糖尿病患者の血糖コントロ
ール状態の中期的ないし長期的指標として、糖尿病の臨
床検査において広範に利用されている。従来、ヘモグロ
ビンＡ１Ｃ濃度の測定は、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）を用いて実施されてきた。しかし、ＨＰＬ
Ｃでは、長時間かけないと多数の検体を測定することが
できなかった。また、ヘモグロビンＡ１Ｃ値は糖尿病検
査項目として重視されているにもかかわらず、ＨＰＬＣ
による測定値の精度は必ずしも良好ではなかった。この
最大の原因は、被検試料から不安定ヘモグロビンＡ１Ｃ
分画を十分に除去していないことによるものであった。
また、ヘモグロビンＡ１Ｃに特異的なモノクローナル抗
体を用いて、ヘモグロビンＡ１Ｃを免疫学的に測定する
方法も知られている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃ Ｉｎｃ．；特開平７−５１０８７号公
報）。しかし、その方法では、モノクローナル抗体が安
定型ヘモグロビンＡ１Ｃとのみ特異的に反応するため、
ヘモグロビンＡ１Ｃを３Ｍグアニジン塩酸で５６℃にて
１５分間処理しないと、全体の正確な量を測定すること
ができなかった。また、加熱処理が必要であるため、操
作も煩雑であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、測定対象であるヘモグロビンＡ１Ｃと比較して被検
試料内に過剰量で存在するヘモグロビンによる干渉を受
けずに、安定型ヘモグロビンＡ１Ｃをモノクローナル抗
体を用いて高感度で正確及び迅速に測定することのでき
る手段を提供することにある。
は、測定対象であるヘモグロビンＡ１Ｃと比較して被検
試料内に過剰量で存在するヘモグロビンによる干渉を受
けずに、安定型ヘモグロビンＡ１Ｃをモノクローナル抗
体を用いて高感度で正確及び迅速に測定することのでき
る手段を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】前記の目的は、本発明に
よる、抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体を用い
て被検試料中のヘモグロビンＡ１Ｃを検出する免疫学的
測定方法において、炭素数２〜６で直鎖状のアルキルモ
ノアルデヒド若しくはアルキレンジアルデヒド、又はベ
ンズアルデヒドの存在下で、前記モノクローナル抗体と
被検試料とを接触させることを特徴とする、ヘモグロビ
ンＡ１Ｃの測定方法によって達成することができる。
よる、抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体を用い
て被検試料中のヘモグロビンＡ１Ｃを検出する免疫学的
測定方法において、炭素数２〜６で直鎖状のアルキルモ
ノアルデヒド若しくはアルキレンジアルデヒド、又はベ
ンズアルデヒドの存在下で、前記モノクローナル抗体と
被検試料とを接触させることを特徴とする、ヘモグロビ
ンＡ１Ｃの測定方法によって達成することができる。
【０００５】ヘモグロビンは、４個のサブユニット（α
鎖及びβ鎖各々２個）から構成されたタンパク質であ
り、分子量は約６４，０００である。ヘモグロビンをグ
ルコースと反応させると、ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端ア
ミノ酸であるバリン残基にグルコースが非酵素的に結合
し、ヘモグロビンＡ１Ｃが生成する。また、ヘモグロビ
ン分子表面（α鎖及びβ鎖）のリジン残基のε−アミノ
基がグルコースと非酵素的に反応して、グリコヘモグロ
ビン（ＧｌｙｃｏＨｂと略することがある）が生成する
〔Ｍ．Ｐ．Ｃｏｈｅｎ ａｎｄ Ｖ．Ｙ．Ｗｕ．，Ｍｅ
ｔｈｏｄ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２３１，６５
（１９９４）〕。従って、本明細書において用いる「ヘ
モグロビン」の用語には、前記の「ヘモグロビンＡ１
Ｃ」及び「グリコヘモグロビン」は含まれないものとす
る。
鎖及びβ鎖各々２個）から構成されたタンパク質であ
り、分子量は約６４，０００である。ヘモグロビンをグ
ルコースと反応させると、ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端ア
ミノ酸であるバリン残基にグルコースが非酵素的に結合
し、ヘモグロビンＡ１Ｃが生成する。また、ヘモグロビ
ン分子表面（α鎖及びβ鎖）のリジン残基のε−アミノ
基がグルコースと非酵素的に反応して、グリコヘモグロ
ビン（ＧｌｙｃｏＨｂと略することがある）が生成する
〔Ｍ．Ｐ．Ｃｏｈｅｎ ａｎｄ Ｖ．Ｙ．Ｗｕ．，Ｍｅ
ｔｈｏｄ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２３１，６５
（１９９４）〕。従って、本明細書において用いる「ヘ
モグロビン」の用語には、前記の「ヘモグロビンＡ１
Ｃ」及び「グリコヘモグロビン」は含まれないものとす
る。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明方法では、特定のアルデヒ
ド化合物の存在下で、抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクロー
ナル抗体と被検試料とを接触させる。本発明方法で用い
ることのできるアルデヒド化合物は、炭素数２〜６の直
鎖状非置換のアルキルモノアルデヒド、例えば、アセト
アルデヒド、プロピオンアルデヒド（プロパナール）、
ブチルアルデヒド（ブタナール）、バレルアルデヒド
（ペンタナール）若しくはカプロンアルデヒド（ヘキサ
ナール）；炭素数２〜６の直鎖状非置換のアルキレンジ
アルデヒド、例えば、グリオキサール、マロンアルデヒ
ド（ジアルデヒドメタン）、スクシンアルデヒド（コハ
ク酸ジアルデヒド）、グルタルアルデヒド（グルタルジ
アルデヒド）若しくはアジポアルデヒド（アジピンジア
ルデヒド）；又はベンズアルデヒドである。これらのア
ルデヒド化合物の中では、アセトアルデヒド、プロピオ
ンアルデヒド、ブチルアルデヒド、グルタルアルデヒ
ド、又はベンズアルデヒドが好ましく、グルタルアルデ
ヒドが特に好ましい。
ド化合物の存在下で、抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクロー
ナル抗体と被検試料とを接触させる。本発明方法で用い
ることのできるアルデヒド化合物は、炭素数２〜６の直
鎖状非置換のアルキルモノアルデヒド、例えば、アセト
アルデヒド、プロピオンアルデヒド（プロパナール）、
ブチルアルデヒド（ブタナール）、バレルアルデヒド
（ペンタナール）若しくはカプロンアルデヒド（ヘキサ
ナール）；炭素数２〜６の直鎖状非置換のアルキレンジ
アルデヒド、例えば、グリオキサール、マロンアルデヒ
ド（ジアルデヒドメタン）、スクシンアルデヒド（コハ
ク酸ジアルデヒド）、グルタルアルデヒド（グルタルジ
アルデヒド）若しくはアジポアルデヒド（アジピンジア
ルデヒド）；又はベンズアルデヒドである。これらのア
ルデヒド化合物の中では、アセトアルデヒド、プロピオ
ンアルデヒド、ブチルアルデヒド、グルタルアルデヒ
ド、又はベンズアルデヒドが好ましく、グルタルアルデ
ヒドが特に好ましい。
【０００７】本発明方法で用いる被検試料は、検査対象
であるヘモグロビンＡ１Ｃを含有するおそれのある試料
であれば特に限定されないが、ヘモグロビンＡ１Ｃと比
較して多量のヘモグロビンが共存する試料について適用
するのが好ましい。従って、被検試料としては、例え
ば、血液試料、好ましくは全血溶血液又は溶血赤血球
液、特には、フッ化ナトリウム、エチレンジアミン四酢
酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ２Ｎａ）、又はヘパリン等を
含む全血溶血液又は溶血赤血球液を挙げることができ
る。
であるヘモグロビンＡ１Ｃを含有するおそれのある試料
であれば特に限定されないが、ヘモグロビンＡ１Ｃと比
較して多量のヘモグロビンが共存する試料について適用
するのが好ましい。従って、被検試料としては、例え
ば、血液試料、好ましくは全血溶血液又は溶血赤血球
液、特には、フッ化ナトリウム、エチレンジアミン四酢
酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ２Ｎａ）、又はヘパリン等を
含む全血溶血液又は溶血赤血球液を挙げることができ
る。
【０００８】本発明方法で用いる抗ヘモグロビンＡ１Ｃ
モノクローナル抗体は、それ自体公知の方法で調製する
ことができる。すなわち、前記の抗ヘモグロビンＡ１Ｃ
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（好まし
くはマウス・ハイブリドーマ）を、培地又は哺乳動物
（特にはマウス）の腹腔内で培養することによって製造
することができる。前記のハイブリドーマは、一般的に
はヘモグロビンＡ１Ｃで免疫したマウスの脾臓細胞とマ
ウス骨髄腫細胞とを、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｉｓｔｅ
ｉｎの細胞融合の基本方法〔Ｎａｔｕｒｅ，第２５６
巻，４９５頁（１９７５年）参照〕により製造すること
が可能である。
モノクローナル抗体は、それ自体公知の方法で調製する
ことができる。すなわち、前記の抗ヘモグロビンＡ１Ｃ
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（好まし
くはマウス・ハイブリドーマ）を、培地又は哺乳動物
（特にはマウス）の腹腔内で培養することによって製造
することができる。前記のハイブリドーマは、一般的に
はヘモグロビンＡ１Ｃで免疫したマウスの脾臓細胞とマ
ウス骨髄腫細胞とを、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｉｓｔｅ
ｉｎの細胞融合の基本方法〔Ｎａｔｕｒｅ，第２５６
巻，４９５頁（１９７５年）参照〕により製造すること
が可能である。
【０００９】免疫原は、前記のヘモグロビンＡ１Ｃに限
定されず、例えば、本発明者は、ヒトグリコヘモグロビ
ンを免疫原として用いて、所望のモノクローナル抗体を
分泌するハイブリドーマを得ることができた。免疫原と
してヒトグリコヘモグロビンを用い、スクリーニング用
抗原として、ヒトグリコヘモグロビン、ヒトヘモグロビ
ンＡ１Ｃ及びヒトヘモグロビンを用いてモノクローナル
抗体を作製したところ、下記の実施例で詳述するとお
り、グリコヘモグロビンに特異的に反応するモノクロー
ナル抗体（Ｎｏ．７及びＮｏ．３５）に加えて、ヘモグ
ロビンＡ１Ｃに特異的に反応するモノクローナル抗体
（Ｎｏ．１９）が得られた。
定されず、例えば、本発明者は、ヒトグリコヘモグロビ
ンを免疫原として用いて、所望のモノクローナル抗体を
分泌するハイブリドーマを得ることができた。免疫原と
してヒトグリコヘモグロビンを用い、スクリーニング用
抗原として、ヒトグリコヘモグロビン、ヒトヘモグロビ
ンＡ１Ｃ及びヒトヘモグロビンを用いてモノクローナル
抗体を作製したところ、下記の実施例で詳述するとお
り、グリコヘモグロビンに特異的に反応するモノクロー
ナル抗体（Ｎｏ．７及びＮｏ．３５）に加えて、ヘモグ
ロビンＡ１Ｃに特異的に反応するモノクローナル抗体
（Ｎｏ．１９）が得られた。
【００１０】上記のハイブリドーマを培養する培地とし
ては、ハイブリドーマの培養に適した培地であればよ
く、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地
にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸及び
抗生物質（ペニシリンＧとストレプトマイシン）を含む
培地が用いられる。このようにして製造された培養液又
はマウスの腹水から、タンパク質の単離、精製に一般的
に用いられる方法により前記の抗ヘモグロビンＡ１Ｃモ
ノクローナル抗体を分離、精製することが可能である。
そのような方法としては、硫安塩析、イオン交換セルロ
ースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分
子節ゲルを用いる分子節カラムクロマトグラフィー、プ
ロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグ
ラフィー、透析、又は凍結乾燥などがある。
ては、ハイブリドーマの培養に適した培地であればよ
く、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地
にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸及び
抗生物質（ペニシリンＧとストレプトマイシン）を含む
培地が用いられる。このようにして製造された培養液又
はマウスの腹水から、タンパク質の単離、精製に一般的
に用いられる方法により前記の抗ヘモグロビンＡ１Ｃモ
ノクローナル抗体を分離、精製することが可能である。
そのような方法としては、硫安塩析、イオン交換セルロ
ースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分
子節ゲルを用いる分子節カラムクロマトグラフィー、プ
ロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグ
ラフィー、透析、又は凍結乾燥などがある。
【００１１】本発明方法において、前記の特定アルデヒ
ド化合物の存在下で、前記の抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノ
クローナル抗体と被検試料とを接触させると、被検試料
中に一般に多量に含まれるヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端ア
ミノ酸基（バリン残基）が、前記の特定アルデヒド化合
物によって修飾されるので、修飾されたヘモグロビンと
前記モノクローナル抗体との非特異的結合が実質的に形
成されなくなり、前記モノクローナル抗体とヘモグロビ
ンＡ１Ｃ（検査対象）との特異的結合が妨害されないた
めに、正確な測定が可能になるものと考えられる。本発
明は前記の推論に限定されるものではないが、本発明方
法では、前記の特定アルデヒド化合物で処理されたヘモ
グロビンとは反応せずに、ヘモグロビンＡ１Ｃとは特異
的に反応することのできるモノクローナル抗体を用いる
のが特に好ましい。
ド化合物の存在下で、前記の抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノ
クローナル抗体と被検試料とを接触させると、被検試料
中に一般に多量に含まれるヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端ア
ミノ酸基（バリン残基）が、前記の特定アルデヒド化合
物によって修飾されるので、修飾されたヘモグロビンと
前記モノクローナル抗体との非特異的結合が実質的に形
成されなくなり、前記モノクローナル抗体とヘモグロビ
ンＡ１Ｃ（検査対象）との特異的結合が妨害されないた
めに、正確な測定が可能になるものと考えられる。本発
明は前記の推論に限定されるものではないが、本発明方
法では、前記の特定アルデヒド化合物で処理されたヘモ
グロビンとは反応せずに、ヘモグロビンＡ１Ｃとは特異
的に反応することのできるモノクローナル抗体を用いる
のが特に好ましい。
【００１２】本発明方法で用いる特定アルデヒド化合物
の量は特に限定されるものではないが、ヘモグロビンの
β鎖Ｎ末端アミノ基を十分に修飾することのできる量を
存在させるのが好ましい。具体的な量は個々の被検試料
によって適宜選択することができるが、一般的には被検
試料の０．０５〜５重量％、好ましくは０．１〜１重量
％である。０．０５重量％未満であるとＮ末端アミノ基
の修飾が不充分となり、５重量％を越えるとヘモグロビ
ンの分子間の凝集が起こり、沈殿が生じることがある。
の量は特に限定されるものではないが、ヘモグロビンの
β鎖Ｎ末端アミノ基を十分に修飾することのできる量を
存在させるのが好ましい。具体的な量は個々の被検試料
によって適宜選択することができるが、一般的には被検
試料の０．０５〜５重量％、好ましくは０．１〜１重量
％である。０．０５重量％未満であるとＮ末端アミノ基
の修飾が不充分となり、５重量％を越えるとヘモグロビ
ンの分子間の凝集が起こり、沈殿が生じることがある。
【００１３】前記のアルデヒド化合物とヘモグロビンＮ
末端アミノ酸基（バリン残基）との反応は、中性領域
（リン酸緩衝塩類溶液：ＰＢＳ）よりも、アルカリ性領
域（ｐＨ９〜１２、より好ましくはｐＨ１０〜１１）の
方が、ヘモグロビンのクロスリンクが起こらないので良
好である。特には、０．０５〜０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐ
Ｈ９〜１１）／０．１〜０．５％グルタルアルデヒドを
用いると精度よく測定できることがわかった。
末端アミノ酸基（バリン残基）との反応は、中性領域
（リン酸緩衝塩類溶液：ＰＢＳ）よりも、アルカリ性領
域（ｐＨ９〜１２、より好ましくはｐＨ１０〜１１）の
方が、ヘモグロビンのクロスリンクが起こらないので良
好である。特には、０．０５〜０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐ
Ｈ９〜１１）／０．１〜０．５％グルタルアルデヒドを
用いると精度よく測定できることがわかった。
【００１４】本発明方法では、特定のアルデヒド化合物
の存在下で、前記モノクローナル抗体と被検試料とを接
触させる限り、それらを接触させる順序は特に限定され
ない。従って、被検試料と特定のアルデヒド化合物と抗
ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体とを実質的に同
時に接触させてもよい。また、被検試料と抗ヘモグロビ
ンＡ１Ｃモノクローナル抗体とを接触させた直後に特定
のアルデヒド化合物を加えてもよい。しかし、特定のア
ルデヒド化合物で被検試料を処理してから、被検試料と
抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体とを接触させ
るのが好ましい。これらの場合、前記のアルデヒド化合
物は、前記のようにヘモグロビンのＮ末端バリン残基と
結合し、単独のアルデヒド化合物の形で存在するもので
はないと考えられるが、こうした状態も特定アルデヒド
化合物の「存在下」での前記モノクローナル抗体と被検
試料との接触に包含される。
の存在下で、前記モノクローナル抗体と被検試料とを接
触させる限り、それらを接触させる順序は特に限定され
ない。従って、被検試料と特定のアルデヒド化合物と抗
ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体とを実質的に同
時に接触させてもよい。また、被検試料と抗ヘモグロビ
ンＡ１Ｃモノクローナル抗体とを接触させた直後に特定
のアルデヒド化合物を加えてもよい。しかし、特定のア
ルデヒド化合物で被検試料を処理してから、被検試料と
抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体とを接触させ
るのが好ましい。これらの場合、前記のアルデヒド化合
物は、前記のようにヘモグロビンのＮ末端バリン残基と
結合し、単独のアルデヒド化合物の形で存在するもので
はないと考えられるが、こうした状態も特定アルデヒド
化合物の「存在下」での前記モノクローナル抗体と被検
試料との接触に包含される。
【００１５】本発明は、任意の免疫学的測定方法に適用
することができる。以下、代表的な実施態様を説明す
る。第１の態様は、被検試料（例えば、ヒト溶血赤血
球）中に含まれるヘモグロビンＡ１Ｃを、前記の特定ア
ルデヒド化合物の存在下で固相（例えば、ＥＬＩＳＡプ
レート）に結合させ、続いて抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノ
クローナル抗体と反応させた後、酵素などで標識した第
２抗体（例えば、抗マウスＩｇＧ抗体）と反応させ、固
相に結合したヘモグロビンＡ１Ｃと抗ヘモグロビンＡ１
Ｃモノクローナル抗体との複合体を測定する工程を含
む。この態様においては、被検試料を固相へ結合させる
際に、タンパク質の非特異的吸着をブロックするため
に、一般にブロッキング剤が使用されるが、そのブロッ
キング剤に前記の特定アルデヒド化合物を混合して用い
るのが好ましい。例えば、０．１〜０．５％グルタルア
ルデヒド／０．１〜０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで
ブロッキングするのが好ましい。
することができる。以下、代表的な実施態様を説明す
る。第１の態様は、被検試料（例えば、ヒト溶血赤血
球）中に含まれるヘモグロビンＡ１Ｃを、前記の特定ア
ルデヒド化合物の存在下で固相（例えば、ＥＬＩＳＡプ
レート）に結合させ、続いて抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノ
クローナル抗体と反応させた後、酵素などで標識した第
２抗体（例えば、抗マウスＩｇＧ抗体）と反応させ、固
相に結合したヘモグロビンＡ１Ｃと抗ヘモグロビンＡ１
Ｃモノクローナル抗体との複合体を測定する工程を含
む。この態様においては、被検試料を固相へ結合させる
際に、タンパク質の非特異的吸着をブロックするため
に、一般にブロッキング剤が使用されるが、そのブロッ
キング剤に前記の特定アルデヒド化合物を混合して用い
るのが好ましい。例えば、０．１〜０．５％グルタルア
ルデヒド／０．１〜０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで
ブロッキングするのが好ましい。
【００１６】次いで、ブロッキング剤を洗浄した後、固
相に結合されたヘモグロビンＡ１Ｃと抗ヘモグロビンＡ
１Ｃモノクローナル抗体とを抗原抗体反応させ、モノク
ローナル抗体液を洗浄してから、固相に結合されたヘモ
グロビンＡ１Ｃと抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル
抗体との複合体の量を測定する。これらの工程は、周知
の方法で行うことができる。例えば、抗ヘモグロビンＡ
１Ｃモノクローナル抗体に特異的に反応し、しかも酵
素、蛍光色素、発光物質又は放射性物質等で標識した第
２抗体を更に反応させ、第２抗体上の標識由来の信号を
測定することにより行うことができる。また、標識した
前記第２抗体を用いる代わりに、前記抗ヘモグロビンＡ
１Ｃモノクローナル抗体を酵素、蛍光色素、発光物質又
は放射性物質等で標識しておき、その標識からの信号を
測定することもできる。あるいは、抗ヘモグロビンＡ１
Ｃモノクローナル抗体にビオチンを結合させておき、こ
のビオチンを標識アビジンと反応させて、標識からの信
号を測定することもできる。
相に結合されたヘモグロビンＡ１Ｃと抗ヘモグロビンＡ
１Ｃモノクローナル抗体とを抗原抗体反応させ、モノク
ローナル抗体液を洗浄してから、固相に結合されたヘモ
グロビンＡ１Ｃと抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル
抗体との複合体の量を測定する。これらの工程は、周知
の方法で行うことができる。例えば、抗ヘモグロビンＡ
１Ｃモノクローナル抗体に特異的に反応し、しかも酵
素、蛍光色素、発光物質又は放射性物質等で標識した第
２抗体を更に反応させ、第２抗体上の標識由来の信号を
測定することにより行うことができる。また、標識した
前記第２抗体を用いる代わりに、前記抗ヘモグロビンＡ
１Ｃモノクローナル抗体を酵素、蛍光色素、発光物質又
は放射性物質等で標識しておき、その標識からの信号を
測定することもできる。あるいは、抗ヘモグロビンＡ１
Ｃモノクローナル抗体にビオチンを結合させておき、こ
のビオチンを標識アビジンと反応させて、標識からの信
号を測定することもできる。
【００１７】第２の態様は、抗ヘモグロビン抗体を固相
（例えば、ＥＬＩＳＡプレート）に結合させ、前記の特
定アルデヒド化合物の存在下で被検試料（例えば、溶血
赤血球）を前記固相に結合された抗体と反応させ、更に
抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体と反応させた
後、酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体と結合させる工程を含
むＥＩＡサンドイッチ法である。この方法では、前記抗
ヘモグロビン抗体及び抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクロー
ナル抗体を介して固相に結合されたヘモグロビンＡ１Ｃ
を測定する。
（例えば、ＥＬＩＳＡプレート）に結合させ、前記の特
定アルデヒド化合物の存在下で被検試料（例えば、溶血
赤血球）を前記固相に結合された抗体と反応させ、更に
抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体と反応させた
後、酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体と結合させる工程を含
むＥＩＡサンドイッチ法である。この方法では、前記抗
ヘモグロビン抗体及び抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクロー
ナル抗体を介して固相に結合されたヘモグロビンＡ１Ｃ
を測定する。
【００１８】固相に結合させる抗ヘモグロビン抗体とし
ては、周知のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗
体のいずれも用いることができる。抗ヘモグロビン抗体
の固相への結合は、例えば抗体溶液（約０．１〜１μｇ
／ｍｌ）を固相に加え、約４℃で一夜放置することによ
り行うことができる。ウシ血清アルブミン含有のリン酸
緩衝塩類溶液（ＢＳＡ／ＰＢＳ）などのブロッキング剤
で処理してタンパク質の非特異的吸着をブロックするこ
とができる。なお、ヒトヘモグロビンＡ１Ｃをサンドイ
ッチＥＩＡ法で測定する場合には、抗ヘモグロビン抗体
を固相に結合させることが望ましい。次いで、このよう
に固相に結合された抗ヘモグロビン抗体と被検試料とを
アルデヒド化合物の存在下で反応させ、被検試料中のヘ
モグロビンＡ１Ｃを抗原抗体反応により、前記固相に結
合された抗ヘモグロビン抗体を介して固相に結合させ
る。被検試料は、フッ化ナトリウム、ＥＤＴＡ２Ｎａ又
はヘパリン等を含む溶血赤血球液又は全血溶血液である
ことができる。次いで、固相を洗浄し、抗ヘモグロビン
抗体を介して固相に結合されたヘモグロビンＡ１Ｃと抗
ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体とを抗原抗体反
応させる。
ては、周知のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗
体のいずれも用いることができる。抗ヘモグロビン抗体
の固相への結合は、例えば抗体溶液（約０．１〜１μｇ
／ｍｌ）を固相に加え、約４℃で一夜放置することによ
り行うことができる。ウシ血清アルブミン含有のリン酸
緩衝塩類溶液（ＢＳＡ／ＰＢＳ）などのブロッキング剤
で処理してタンパク質の非特異的吸着をブロックするこ
とができる。なお、ヒトヘモグロビンＡ１Ｃをサンドイ
ッチＥＩＡ法で測定する場合には、抗ヘモグロビン抗体
を固相に結合させることが望ましい。次いで、このよう
に固相に結合された抗ヘモグロビン抗体と被検試料とを
アルデヒド化合物の存在下で反応させ、被検試料中のヘ
モグロビンＡ１Ｃを抗原抗体反応により、前記固相に結
合された抗ヘモグロビン抗体を介して固相に結合させ
る。被検試料は、フッ化ナトリウム、ＥＤＴＡ２Ｎａ又
はヘパリン等を含む溶血赤血球液又は全血溶血液である
ことができる。次いで、固相を洗浄し、抗ヘモグロビン
抗体を介して固相に結合されたヘモグロビンＡ１Ｃと抗
ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体とを抗原抗体反
応させる。
【００１９】抗体液を洗浄した後、抗ヘモグロビン抗体
を介して固相に結合されたヘモグロビンＡ１Ｃと抗ヘモ
グロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体との複合体を測定す
る。この測定も上記の第１の態様の検出方法と同様に、
抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体を酵素、蛍光
色素、発光物質又は放射性物質等で標識しておき、その
標識からの信号を測定することができる。あるいは、抗
ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体にビオチンを結
合しておき、このビオチンを標識アビジンと反応させて
標識からの信号を測定することができる。更には、抗ヘ
モグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体に特異的に反応す
る標識抗体を更に反応させ、その抗体上の標識からの信
号を測定することもできる。
を介して固相に結合されたヘモグロビンＡ１Ｃと抗ヘモ
グロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体との複合体を測定す
る。この測定も上記の第１の態様の検出方法と同様に、
抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体を酵素、蛍光
色素、発光物質又は放射性物質等で標識しておき、その
標識からの信号を測定することができる。あるいは、抗
ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体にビオチンを結
合しておき、このビオチンを標識アビジンと反応させて
標識からの信号を測定することができる。更には、抗ヘ
モグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体に特異的に反応す
る標識抗体を更に反応させ、その抗体上の標識からの信
号を測定することもできる。
【００２０】第３の態様は、抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノ
クローナル抗体を固相（例えば、ＥＬＩＳＡプレート）
に結合させた後、被検試料（例えば、溶血赤血球）に含
まれるヘモグロビンＡ１Ｃとビオチン標識ヘモグロビン
Ａ１Ｃ（既知量）とを、前記の特定アルデヒド化合物を
含む緩衝液中で競合反応させ、更にアビジン結合酵素標
識抗マウスＩｇＧ抗体と結合させる工程を含むＥＩＡ法
である。この方法では、前記抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノ
クローナル抗体を介して固相に競合的に結合されたビオ
チン標識ヘモグロビンＡ１Ｃを、アビジン結合酵素標識
抗マウスＩｇＧ抗体のアビジン（標識）からの信号で測
定することにより、前記抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクロ
ーナル抗体を介して固相に競合的に結合されたヘモグロ
ビンＡ１Ｃを間接的に測定する。被検試料は、フッ化ナ
トリウム、ＥＤＴＡ２Ｎａ又はヘパリン等を含む溶血赤
血球液又は全血溶血液であることができる。
クローナル抗体を固相（例えば、ＥＬＩＳＡプレート）
に結合させた後、被検試料（例えば、溶血赤血球）に含
まれるヘモグロビンＡ１Ｃとビオチン標識ヘモグロビン
Ａ１Ｃ（既知量）とを、前記の特定アルデヒド化合物を
含む緩衝液中で競合反応させ、更にアビジン結合酵素標
識抗マウスＩｇＧ抗体と結合させる工程を含むＥＩＡ法
である。この方法では、前記抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノ
クローナル抗体を介して固相に競合的に結合されたビオ
チン標識ヘモグロビンＡ１Ｃを、アビジン結合酵素標識
抗マウスＩｇＧ抗体のアビジン（標識）からの信号で測
定することにより、前記抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクロ
ーナル抗体を介して固相に競合的に結合されたヘモグロ
ビンＡ１Ｃを間接的に測定する。被検試料は、フッ化ナ
トリウム、ＥＤＴＡ２Ｎａ又はヘパリン等を含む溶血赤
血球液又は全血溶血液であることができる。
【００２１】第４の態様は、ヘモグロビンＡ１Ｃに特異
的なモノクローナル抗体をラテックス粒子に結合させた
抗体結合ラテックスと、ヘモグロビンＡ１Ｃを含む試料
を前記の特定アルデヒド化合物の存在下でラテックス粒
子に結合させた試料結合ラテックスとを混合し、生成す
る凝集を測定すると、ＨＰＬＣ法で測定したヘモグロビ
ンＡ１Ｃ（％）と相関することを見い出した。この方法
において用いる粒子としては、直径０．０５〜１μｍの
ラテックスが良好であった。ラテックス粒子への抗体の
結合方法は、抗体の溶液中に粒子を分散させることによ
り行った。ラテックス粒子上にモノクローナル抗体を結
合した場合、ヘモグロビンＡ１Ｃを含む検体が凝集する
ことにより、吸光度測定でヘモグロビンＡ１Ｃを定量す
ることができる。
的なモノクローナル抗体をラテックス粒子に結合させた
抗体結合ラテックスと、ヘモグロビンＡ１Ｃを含む試料
を前記の特定アルデヒド化合物の存在下でラテックス粒
子に結合させた試料結合ラテックスとを混合し、生成す
る凝集を測定すると、ＨＰＬＣ法で測定したヘモグロビ
ンＡ１Ｃ（％）と相関することを見い出した。この方法
において用いる粒子としては、直径０．０５〜１μｍの
ラテックスが良好であった。ラテックス粒子への抗体の
結合方法は、抗体の溶液中に粒子を分散させることによ
り行った。ラテックス粒子上にモノクローナル抗体を結
合した場合、ヘモグロビンＡ１Ｃを含む検体が凝集する
ことにより、吸光度測定でヘモグロビンＡ１Ｃを定量す
ることができる。
【００２２】本発明による試薬は、被検試料と接触する
ベース液に前記の特定アルデヒド化合物を含有する。ベ
ース液は、一般に適当な緩衝液に前記の特定アルデヒド
化合物を含有する。例えば、０．０５〜０．１Ｍ炭酸緩
衝液（ｐＨ９〜１１）中に、前記の特定アルデヒド化合
物０．１〜０．５重量％を含む。前記のベース液として
は、例えば、被検試料の希釈用液、又は固相（例えば、
ＥＬＩＳＡ用プレート又はラテックス粒子）に被検試料
中のヘモグロビンＡ１Ｃを固定するのに用いる固定液又
は固定洗浄液を挙げることができる。
ベース液に前記の特定アルデヒド化合物を含有する。ベ
ース液は、一般に適当な緩衝液に前記の特定アルデヒド
化合物を含有する。例えば、０．０５〜０．１Ｍ炭酸緩
衝液（ｐＨ９〜１１）中に、前記の特定アルデヒド化合
物０．１〜０．５重量％を含む。前記のベース液として
は、例えば、被検試料の希釈用液、又は固相（例えば、
ＥＬＩＳＡ用プレート又はラテックス粒子）に被検試料
中のヘモグロビンＡ１Ｃを固定するのに用いる固定液又
は固定洗浄液を挙げることができる。
【００２３】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。以下の実施例において、特に断らない限り、ヒトヘ
モグロビンはＳｉｇｍａ社のヘモグロビン、ヒトヘモグ
ロビンＡ１ＣはＥｘｏｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．のヘモグロビ
ンＡ１Ｃ、そしてグリコヒトヘモグロビンはＣａｌｚｙ
ｍｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．のグリコヘ
モグロビンを用い、更に９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートと
してはＤｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
Ｉｎｃ．のＩＭＭＵＬＯＮ２を用いた。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。以下の実施例において、特に断らない限り、ヒトヘ
モグロビンはＳｉｇｍａ社のヘモグロビン、ヒトヘモグ
ロビンＡ１ＣはＥｘｏｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．のヘモグロビ
ンＡ１Ｃ、そしてグリコヒトヘモグロビンはＣａｌｚｙ
ｍｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．のグリコヘ
モグロビンを用い、更に９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートと
してはＤｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
Ｉｎｃ．のＩＭＭＵＬＯＮ２を用いた。
【００２４】実施例１：モノクローナル抗体の作製
ヒトグリコヘモグロビン（Ｃａｌｚｙｍｅ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）をフロイント完全アジュバ
ントに十分に分散させ、得られた分散液１００μｌでＢ
ａｌｂ／ｃマウスを２週間おきに４回免疫した。この免
疫マウスを屠殺した後、脾臓を摘出し、脾細胞１×１０
8 個を得た。この脾細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３−
Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３とを、電気融合装置ＳＳＨ
−２（島津製作所）によって細胞融合させ、培養した。
増殖した細胞の上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により抗原
としてヒトグリコヘモグロビン及びヒトヘモグロビンＡ
１Ｃを用いて、上清内の抗グリコヘモグロビン抗体及び
抗ヘモグロビンＡ１Ｃ抗体の有無を調べた。抗体産生細
胞を限界希釈法により試験し、抗ヒトグリコヘモグロビ
ン抗体を産生している細胞及び抗ヒトヘモグロビンＡ１
Ｃ抗体を産生している細胞を確認した。こうして得られ
た細胞を抗ヒトグリコヘモグロビンマウスモノクローナ
ル抗体産生細胞（ハイブリドーマＮｏ．７及びハイブリ
ドーマＮｏ．３５）及び抗ヒトヘモグロビンＡ１Ｃマウ
スモノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマＮｏ．
１９）として大量に培養し、各々マウス腹控中に注入し
た。２週間後より２日毎に腹水を採取し、前記のハイブ
リドーマＮｏ．７及びハイブリドーマＮｏ．３５からは
目的の抗ヒトグリコヘモグロビンマウスモノクローナル
抗体Ｎｏ．７及び抗ヒトグリコヘモグロビンマウスモノ
クローナル抗体Ｎｏ．３５を得、そして前記のハイブリ
ドーマＮｏ．１９からは抗ヒトヘモグロビンＡ１Ｃマウ
スモノクローナル抗体Ｎｏ．１９を得た。各抗体のサブ
クラスをクローンタイピングシステム（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ
Ｉｎｃ．）によって測定した結果を以下の表１に示
す。
ａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）をフロイント完全アジュバ
ントに十分に分散させ、得られた分散液１００μｌでＢ
ａｌｂ／ｃマウスを２週間おきに４回免疫した。この免
疫マウスを屠殺した後、脾臓を摘出し、脾細胞１×１０
8 個を得た。この脾細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３−
Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３とを、電気融合装置ＳＳＨ
−２（島津製作所）によって細胞融合させ、培養した。
増殖した細胞の上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により抗原
としてヒトグリコヘモグロビン及びヒトヘモグロビンＡ
１Ｃを用いて、上清内の抗グリコヘモグロビン抗体及び
抗ヘモグロビンＡ１Ｃ抗体の有無を調べた。抗体産生細
胞を限界希釈法により試験し、抗ヒトグリコヘモグロビ
ン抗体を産生している細胞及び抗ヒトヘモグロビンＡ１
Ｃ抗体を産生している細胞を確認した。こうして得られ
た細胞を抗ヒトグリコヘモグロビンマウスモノクローナ
ル抗体産生細胞（ハイブリドーマＮｏ．７及びハイブリ
ドーマＮｏ．３５）及び抗ヒトヘモグロビンＡ１Ｃマウ
スモノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマＮｏ．
１９）として大量に培養し、各々マウス腹控中に注入し
た。２週間後より２日毎に腹水を採取し、前記のハイブ
リドーマＮｏ．７及びハイブリドーマＮｏ．３５からは
目的の抗ヒトグリコヘモグロビンマウスモノクローナル
抗体Ｎｏ．７及び抗ヒトグリコヘモグロビンマウスモノ
クローナル抗体Ｎｏ．３５を得、そして前記のハイブリ
ドーマＮｏ．１９からは抗ヒトヘモグロビンＡ１Ｃマウ
スモノクローナル抗体Ｎｏ．１９を得た。各抗体のサブ
クラスをクローンタイピングシステム（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ
Ｉｎｃ．）によって測定した結果を以下の表１に示
す。
【００２５】
【表１】モノクローナル抗体 サブクラス
Ｎｏ．３５ ＩｇＧ１ λ
Ｎｏ． ７ ＩｇＭＮｏ １９ ＩｇＧ１ κ
【００２６】実施例２：グリコヘモグロビン及びヘモグ
ロビンＡ１Ｃへの特異性 （１）５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中のヒトグリ
コヘモグロビン（１．０μｇ／ｍｌ）、ヒトヘモグロビ
ンＡ１Ｃ（１．０μｇ／ｍｌ）、又はヒトヘモグロビン
（１．０μｇ／ｍｌ）を９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートの
各ウェルに１００μｌずつ分注し、４℃で一夜放置し
た。このプレートを１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
／ＰＢＳ（リン酸緩衝塩類溶液）で１時間ブロッキング
した。上清を除去した後、前記実施例１で作製したハイ
ブリドーマＮｏ．３５、ハイブリドーマＮｏ．７、又は
ハイブリドーマＮｏ．１９の培養上清各５０μｌを加え
て室温で２時間放置し、続いて０．２％ＢＳＡ／０．２
％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。次に、アル
カリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗マウスＩｇＧ１
抗体（ヤギ）１００μｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、
室温で２時間放置し、再び０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔ
ｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。このプレートの
各ウェルにｐ−ニトロフェニルリン酸を含むジエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ９．６）５０μｌを添加し、室温
で３０分間放置した後、４０５ｎｍの吸光度を測定し
た。この結果を表２に示す。表２〜７において、Ｇｌｙ
ｃｏＨｂはグリコヘモグロビンであり、ＨｂＡ１Ｃはヘ
モグロビンＡ１Ｃであり、Ｈｂはヘモグロビンである。
ロビンＡ１Ｃへの特異性 （１）５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中のヒトグリ
コヘモグロビン（１．０μｇ／ｍｌ）、ヒトヘモグロビ
ンＡ１Ｃ（１．０μｇ／ｍｌ）、又はヒトヘモグロビン
（１．０μｇ／ｍｌ）を９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートの
各ウェルに１００μｌずつ分注し、４℃で一夜放置し
た。このプレートを１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
／ＰＢＳ（リン酸緩衝塩類溶液）で１時間ブロッキング
した。上清を除去した後、前記実施例１で作製したハイ
ブリドーマＮｏ．３５、ハイブリドーマＮｏ．７、又は
ハイブリドーマＮｏ．１９の培養上清各５０μｌを加え
て室温で２時間放置し、続いて０．２％ＢＳＡ／０．２
％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。次に、アル
カリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗マウスＩｇＧ１
抗体（ヤギ）１００μｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、
室温で２時間放置し、再び０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔ
ｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。このプレートの
各ウェルにｐ−ニトロフェニルリン酸を含むジエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ９．６）５０μｌを添加し、室温
で３０分間放置した後、４０５ｎｍの吸光度を測定し
た。この結果を表２に示す。表２〜７において、Ｇｌｙ
ｃｏＨｂはグリコヘモグロビンであり、ＨｂＡ１Ｃはヘ
モグロビンＡ１Ｃであり、Ｈｂはヘモグロビンである。
【００２７】
【表２】 モノクローナル抗体 ＧｌｙｃｏＨｂ ＨｂＡ１Ｃ Ｈｂ
Ｎｏ．３５ ０．０９９ ０．０１４ ０．０１０
Ｎｏ．７ ０．４２６ ０．３０１ ０．１８８ Ｎｏ．１９ ０．７５１ ０．９３９ ０．４１８
【００２８】（２）３Ｍグアニジン塩酸中のヒトグリコ
ヘモグロビン（１．０μｇ／ｍｌ）、ヒトヘモグロビン
Ａ１Ｃ（１．０μｇ／ｍｌ）、又はヒトヘモグロビン
（１．０μｇ／ｍｌ）を、それぞれ５６℃にて１５分間
熱変性した後、各変性物含有液１００μｌずつを９６穴
ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルに分注し、４℃で一夜
放置した。このプレートを１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間
ブロッキングした。上清を除去した後、前記実施例１で
作製したハイブリドーマＮｏ．３５、ハイブリドーマＮ
ｏ．７、又はハイブリドーマＮｏ．１９の培養上清各５
０μｌを加えて室温で２時間放置した後、０．２％ＢＳ
Ａ／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。
次に、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗マウ
スＩｇＧ１抗体（ヤギ）１００μｌ（１００ｎｇ／ｍ
ｌ）を加え、室温で２時間放置し、再び０．２％ＢＳＡ
／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。こ
のプレートの各ウェルにｐ−ニトロフェニルリン酸を含
むジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．６）５０μｌを
添加し、室温で３０分間放置した後、４０５ｎｍの吸光
度を測定した。この結果を表３に示す。
ヘモグロビン（１．０μｇ／ｍｌ）、ヒトヘモグロビン
Ａ１Ｃ（１．０μｇ／ｍｌ）、又はヒトヘモグロビン
（１．０μｇ／ｍｌ）を、それぞれ５６℃にて１５分間
熱変性した後、各変性物含有液１００μｌずつを９６穴
ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルに分注し、４℃で一夜
放置した。このプレートを１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間
ブロッキングした。上清を除去した後、前記実施例１で
作製したハイブリドーマＮｏ．３５、ハイブリドーマＮ
ｏ．７、又はハイブリドーマＮｏ．１９の培養上清各５
０μｌを加えて室温で２時間放置した後、０．２％ＢＳ
Ａ／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。
次に、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗マウ
スＩｇＧ１抗体（ヤギ）１００μｌ（１００ｎｇ／ｍ
ｌ）を加え、室温で２時間放置し、再び０．２％ＢＳＡ
／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。こ
のプレートの各ウェルにｐ−ニトロフェニルリン酸を含
むジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．６）５０μｌを
添加し、室温で３０分間放置した後、４０５ｎｍの吸光
度を測定した。この結果を表３に示す。
【００２９】
【表３】 モノクローナル抗体 ＧｌｙｃｏＨｂ ＨｂＡ１Ｃ Ｈｂ
Ｎｏ．３５ ０．２６５ ０．０２２ ０．０２２
Ｎｏ．７ ０．６１３ ０．０４７ ０．０６７ Ｎｏ．１９ ０．８３１ ０．６７８ ０．１９１
【００３０】実施例３：ＥＬＩＳＡ法によるヒト赤血球
中のヘモグロビンＡ１Ｃの測定 （１）グアニジン塩酸／尿素による変性体との反応性 １Ｍ、３Ｍ又は５Ｍグアニジン塩酸中でヒトグリコヘモ
グロビン（１．０μｇ／ｍｌ）、ヒトヘモグロビンＡ１
Ｃ（１．０μｇ／ｍｌ）、又はヒトヘモグロビン（１．
０μｇ／ｍｌ）をそれぞれ５６℃にて１５分間熱変性し
て得た変性物含有液、あるいは２Ｍ、４Ｍ、６Ｍ又は８
Ｍ尿素でグリコヘモグロビン（１．０μｇ／ｍｌ）、ヘ
モグロビンＡ１Ｃ（１．０μｇ／ｍｌ）、又はヘモグロ
ビン（１．０μｇ／ｍｌ）をそれぞれ変性して得た変性
物含有液、各１００μｌずつを９６穴ＥＬＩＳＡ用プレ
ートの各ウェルに分注し、室温で１時間放置した。この
プレートを１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間ブロッキングし
た。上清を除去した後、前記実施例１で作製したハイブ
リドーマＮｏ．１９の培養上清５０μｌずつを加えて室
温で２時間放置し、０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔｗｅｅ
ｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。次に、アルカリフォス
ファターゼ（ＡＬＰ）標識抗マウスＩｇＧ１抗体（ヤ
ギ）１００μｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、室温で２
時間放置し、再び０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔｗｅｅｎ
２０／ＰＢＳで５回洗浄した。このプレートの各ウェル
にｐ−ニトロフェニルリン酸を含むジエタノールアミン
緩衝液（ｐＨ９．６）５０μｌを添加し、室温で３０分
間放置した後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。この結
果を表４に示す。
中のヘモグロビンＡ１Ｃの測定 （１）グアニジン塩酸／尿素による変性体との反応性 １Ｍ、３Ｍ又は５Ｍグアニジン塩酸中でヒトグリコヘモ
グロビン（１．０μｇ／ｍｌ）、ヒトヘモグロビンＡ１
Ｃ（１．０μｇ／ｍｌ）、又はヒトヘモグロビン（１．
０μｇ／ｍｌ）をそれぞれ５６℃にて１５分間熱変性し
て得た変性物含有液、あるいは２Ｍ、４Ｍ、６Ｍ又は８
Ｍ尿素でグリコヘモグロビン（１．０μｇ／ｍｌ）、ヘ
モグロビンＡ１Ｃ（１．０μｇ／ｍｌ）、又はヘモグロ
ビン（１．０μｇ／ｍｌ）をそれぞれ変性して得た変性
物含有液、各１００μｌずつを９６穴ＥＬＩＳＡ用プレ
ートの各ウェルに分注し、室温で１時間放置した。この
プレートを１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間ブロッキングし
た。上清を除去した後、前記実施例１で作製したハイブ
リドーマＮｏ．１９の培養上清５０μｌずつを加えて室
温で２時間放置し、０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔｗｅｅ
ｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。次に、アルカリフォス
ファターゼ（ＡＬＰ）標識抗マウスＩｇＧ１抗体（ヤ
ギ）１００μｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、室温で２
時間放置し、再び０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔｗｅｅｎ
２０／ＰＢＳで５回洗浄した。このプレートの各ウェル
にｐ−ニトロフェニルリン酸を含むジエタノールアミン
緩衝液（ｐＨ９．６）５０μｌを添加し、室温で３０分
間放置した後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。この結
果を表４に示す。
【００３１】
【表４】 変性剤 ＧｌｙｃｏＨｂ ＨｂＡ１Ｃ Ｈｂ
ＰＢＳ ０．３４９ ０．４２８ ０．１７４
１Ｍ グアニジン−ＨＣｌ ０．２９５ ０．３１７ ０．０６７
３Ｍ グアニジン−ＨＣｌ ０．２８８ ０．３１３ ０．０７６
５Ｍ グアニジン−ＨＣｌ ０．２９１ ０．３４１ ０．１２７
２Ｍ 尿素 ０．３８８ ０．３６１ ０．１１０
４Ｍ 尿素 ０．３２６ ０．３４５ ０．１１４
６Ｍ 尿素 ０．３２３ ０．３３４ ０．１１４８Ｍ 尿素 ０．３１５ ０．３３０ ０．１１５
【００３２】（２）アルデヒド処理による変性体との反
応性 ヒトヘモグロビンＡ１Ｃ又はヒトヘモグロビンを、５０
ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）又はＰＢＳ／０．１％各
種アルデヒド化合物に溶解（１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍ
ｌ又は２０μｇ／ｍｌ）し、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレー
トの各ウェル内に１００μｌずつ分注した後、室温で１
時間放置した。このプレートを１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３
０分ブロッキングした。ヒト血液中の赤血球内では、ヘ
モグロビンはヘモグロビンＡ１Ｃよりも、約５〜２０倍
過剰に存在しており、ヒトヘモグロビン量が増加すると
各種アルデヒド化合物とヘモグロビンとの反応に影響を
与えるため、各種アルデヒド化合物に溶解するヘモグロ
ビン量及びｐＨを変え、最適なアルデヒド化合物の検討
を行った。すなわち、ヒトヘモグロビン量を過剰とした
場合（２０μｇ／ｍｌ）及びヘモグロビンＡ１Ｃとヘモ
グロビンの量比を１対１０（ＨｂＡ１Ｃ２μｇ＋Ｈｂ２
０μｇ／ｍｌ）で、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）
又は５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１１）／０．５％各種ア
ルデヒド化合物に溶解し、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレート
の各ウェル内に１００μｌずつ分注した後、室温で１時
間放置した。このプレートを０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／
０．５％各種アルデヒド化合物／ＰＢＳ及び１％ＢＳＡ
／ＰＢＳで３０分ブロッキングした。これらのプレート
の上清を除去した後、前記実施例１で作製したハイブリ
ドーマＮｏ．１９の培養上清１００μｌを加えて室温で
２時間放置した後、０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔｗｅｅ
ｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。次に、アルカリフォス
ファターゼ（ＡＬＰ）標識抗マウスＩｇＧ１抗体（ヤ
ギ）１００μｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、室温で２
時間放置し、再び０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔｗｅｅｎ
２０／ＰＢＳで５回洗浄した。このプレートの各ウェル
にｐ−ニトロフェニルリン酸を含むジエタノールアミン
緩衝液（ｐＨ９．６）５０μｌを添加し、室温で３０分
間放置した後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。この結
果を表５及び表６に示す。
応性 ヒトヘモグロビンＡ１Ｃ又はヒトヘモグロビンを、５０
ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）又はＰＢＳ／０．１％各
種アルデヒド化合物に溶解（１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍ
ｌ又は２０μｇ／ｍｌ）し、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレー
トの各ウェル内に１００μｌずつ分注した後、室温で１
時間放置した。このプレートを１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３
０分ブロッキングした。ヒト血液中の赤血球内では、ヘ
モグロビンはヘモグロビンＡ１Ｃよりも、約５〜２０倍
過剰に存在しており、ヒトヘモグロビン量が増加すると
各種アルデヒド化合物とヘモグロビンとの反応に影響を
与えるため、各種アルデヒド化合物に溶解するヘモグロ
ビン量及びｐＨを変え、最適なアルデヒド化合物の検討
を行った。すなわち、ヒトヘモグロビン量を過剰とした
場合（２０μｇ／ｍｌ）及びヘモグロビンＡ１Ｃとヘモ
グロビンの量比を１対１０（ＨｂＡ１Ｃ２μｇ＋Ｈｂ２
０μｇ／ｍｌ）で、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）
又は５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１１）／０．５％各種ア
ルデヒド化合物に溶解し、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレート
の各ウェル内に１００μｌずつ分注した後、室温で１時
間放置した。このプレートを０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／
０．５％各種アルデヒド化合物／ＰＢＳ及び１％ＢＳＡ
／ＰＢＳで３０分ブロッキングした。これらのプレート
の上清を除去した後、前記実施例１で作製したハイブリ
ドーマＮｏ．１９の培養上清１００μｌを加えて室温で
２時間放置した後、０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔｗｅｅ
ｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。次に、アルカリフォス
ファターゼ（ＡＬＰ）標識抗マウスＩｇＧ１抗体（ヤ
ギ）１００μｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、室温で２
時間放置し、再び０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔｗｅｅｎ
２０／ＰＢＳで５回洗浄した。このプレートの各ウェル
にｐ−ニトロフェニルリン酸を含むジエタノールアミン
緩衝液（ｐＨ９．６）５０μｌを添加し、室温で３０分
間放置した後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。この結
果を表５及び表６に示す。
【００３３】
【表５】
緩衝剤＋変性剤 HbA1C Ｈｂ HbA1C Ｈｂ 0.1μｇ 0.1μｇ 0.2μｇ 0.2μｇ
コントロール〔50mM NaHC03 (pH9.6) 〕 1.223 0.100 1.238 0.236
PBS+0.1% HCHO 1.214 0.308 1.219 0.554
PBS+0.1% CH3 CHO 0.599 0.015 1.181 0.027
PBS+0.1% CH3 CH2 CHO 0.543 0.012 1.171 0.029
PBS+0.1% OHC(CH2 ) 3 CHO 0.467 0.010 0.900 0.036
PBS+0.1% ベンズアルデヒド 0.111 0.003 0.579 0.006 PBS+0.1% バニリン 1.039 0.053 1.280 0.142
【００３４】
【表６】
緩衝剤＋変性剤 HbA1C ＋ Ｈｂ Ｈｂ 0.2μｇ 2.0μｇ 2.0μｇ
コントロール〔50mM NaHC03 (pH9.6) 〕 １．２７３ １．１５２
50mM Na2C03 (pH11)+0.5% HCHO １．１８０ ０．５４４
50mM Na2C03 (pH11)+0.5% CH3 CHO １．２９３ ０．３３７
50mM Na2C03 (pH11)+0.5% CH3 CH2 CHO １．２９１ ０．６８０
50mM Na2C03 (pH11)+0.5% OHC(CH2 ) 3 CHO ０．８３６ ０．０７６
50mM Na2C03 (pH11)+0.5% ベンズアルデヒド １．３２６ ０．６５４ 50mM Na2C03 (pH11)+0.5% バニリン １．３２７ １．１８２
【００３５】（３）ＥＬＩＳＡ法によるヒト赤血球中の
ヘモグロビンＡ１Ｃの測定 ヒト血液検体を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した
後、上清をアスピレーターで除去して得た赤血球画分１
００μｌを採取し、精製水３００μｌを加えて溶血させ
た。得られたヒト溶血検体を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ
１１）／０．５％グルタルアルデヒドで５０倍に希釈
し、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルに希釈液１
００μｌずつを分注し、室温で１時間放置した。上清を
除去し、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％グルタルア
ルデヒド／ＰＢＳ２００μｌを添加して１時間ブロッキ
ングした。再度上清を除去し、前記実施例１で作製した
ハイブリドーマＮｏ．１９の培養上清１００μｌを加
え、室温で２時間放置した後、０．２％ＢＳＡ／０．２
％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。次に、アル
カリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗マウスＩｇＧ１
抗体（ヤギ）１００μｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、
室温で２時間放置し、再び０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔ
ｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。このプレートの
各ウェルにｐ−ニトロフェニルリン酸を含むジエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ９．６）５０μｌを添加し、室温
で３０分間放置した後、４０５ｎｍの吸光度を測定し
た。
ヘモグロビンＡ１Ｃの測定 ヒト血液検体を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した
後、上清をアスピレーターで除去して得た赤血球画分１
００μｌを採取し、精製水３００μｌを加えて溶血させ
た。得られたヒト溶血検体を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ
１１）／０．５％グルタルアルデヒドで５０倍に希釈
し、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルに希釈液１
００μｌずつを分注し、室温で１時間放置した。上清を
除去し、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％グルタルア
ルデヒド／ＰＢＳ２００μｌを添加して１時間ブロッキ
ングした。再度上清を除去し、前記実施例１で作製した
ハイブリドーマＮｏ．１９の培養上清１００μｌを加
え、室温で２時間放置した後、０．２％ＢＳＡ／０．２
％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。次に、アル
カリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗マウスＩｇＧ１
抗体（ヤギ）１００μｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、
室温で２時間放置し、再び０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔ
ｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。このプレートの
各ウェルにｐ−ニトロフェニルリン酸を含むジエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ９．６）５０μｌを添加し、室温
で３０分間放置した後、４０５ｎｍの吸光度を測定し
た。
【００３６】ＨＰＬＣ法によるヘモグロビンＡ１Ｃの測
定は、自動グリコヘモグロビン測定装置ＨＡ−８１２１
（京都第一科学）を用いて行った。この装置では、試料
ラックにのせた検体が、オートサンプラーにより約３μ
ｌずつセットされた順にインジェクションバルブのサン
プリングループに導入され、定められた送液シーケンス
に従って自動的に注入した液体を分離測定する。この装
置の溶離液には、Ｈｉ−ＡＵＴＯＡ１Ｃ（京都第一科
学）を用いた。これらの結果を図１に示す。図１におい
て、横軸はＨＰＬＣ法の測定値ＨｂＡ１Ｃ（％）（以下
の図２〜図４も同様）であり、□はＥＩＡ法の測定値で
あり、破線は相関を示す直線である。
定は、自動グリコヘモグロビン測定装置ＨＡ−８１２１
（京都第一科学）を用いて行った。この装置では、試料
ラックにのせた検体が、オートサンプラーにより約３μ
ｌずつセットされた順にインジェクションバルブのサン
プリングループに導入され、定められた送液シーケンス
に従って自動的に注入した液体を分離測定する。この装
置の溶離液には、Ｈｉ−ＡＵＴＯＡ１Ｃ（京都第一科
学）を用いた。これらの結果を図１に示す。図１におい
て、横軸はＨＰＬＣ法の測定値ＨｂＡ１Ｃ（％）（以下
の図２〜図４も同様）であり、□はＥＩＡ法の測定値で
あり、破線は相関を示す直線である。
【００３７】実施例４：血液検体に対するＨＰＬＣ法及
びＥＬＩＳＡ法による測定 （１）ヘモグロビンＡ１Ｃの作製 クエン酸ナトリウムを含むヒト血液２０ｍｌを３，００
０ｒｐｍで５分間遠心分離し、赤血球画分を得た。この
赤血球画分をＰＢＳで２回洗浄し、３，０００ｒｐｍで
５分間更に遠心して得られた赤血球画分に等量のＨ2 Ｏ
を加えて溶血させた。この溶血液を１２，０００ｒｐｍ
で３０分間遠心分離して得た上清にグルコース（５００
ｍｇ／ｍｌＰＢＳ）を添加した後、ろ過滅菌（０．２３
μｍ）を行い、３７℃で１〜７日反応させた。経時的に
試料５ｍｌを採取し、ＰＢＳ２００ｍｌで３回透析し
た。 （２）ＨＰＬＣ法による測定 透析して得た試料をＨＰＬＣ法（京都第一科学）を用い
実施例３（３）に記載した方法で測定した。 （３）モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法による
測定 透析して得た試料３μｌ又は６μｌを０．１Ｍ炭酸緩衝
液（ｐＨ１１）／０．５％グルタルアルデヒド１００μ
ｌに加え、上記実施例３（２）に記載のＥＬＩＳＡ法と
同様の方法で４０５ｎｍの吸光度を測定した。これらの
結果を図２に示す。図２において、□はＨＰＬＣ法によ
る既知検体の測定値であり、△はＥＬＩＳＡ法による試
料６μｌの場合の測定値であり、◇はＥＬＩＳＡ法によ
る試料３μｌの場合の測定値であり、破線は相関を示す
直線である。
びＥＬＩＳＡ法による測定 （１）ヘモグロビンＡ１Ｃの作製 クエン酸ナトリウムを含むヒト血液２０ｍｌを３，００
０ｒｐｍで５分間遠心分離し、赤血球画分を得た。この
赤血球画分をＰＢＳで２回洗浄し、３，０００ｒｐｍで
５分間更に遠心して得られた赤血球画分に等量のＨ2 Ｏ
を加えて溶血させた。この溶血液を１２，０００ｒｐｍ
で３０分間遠心分離して得た上清にグルコース（５００
ｍｇ／ｍｌＰＢＳ）を添加した後、ろ過滅菌（０．２３
μｍ）を行い、３７℃で１〜７日反応させた。経時的に
試料５ｍｌを採取し、ＰＢＳ２００ｍｌで３回透析し
た。 （２）ＨＰＬＣ法による測定 透析して得た試料をＨＰＬＣ法（京都第一科学）を用い
実施例３（３）に記載した方法で測定した。 （３）モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法による
測定 透析して得た試料３μｌ又は６μｌを０．１Ｍ炭酸緩衝
液（ｐＨ１１）／０．５％グルタルアルデヒド１００μ
ｌに加え、上記実施例３（２）に記載のＥＬＩＳＡ法と
同様の方法で４０５ｎｍの吸光度を測定した。これらの
結果を図２に示す。図２において、□はＨＰＬＣ法によ
る既知検体の測定値であり、△はＥＬＩＳＡ法による試
料６μｌの場合の測定値であり、◇はＥＬＩＳＡ法によ
る試料３μｌの場合の測定値であり、破線は相関を示す
直線である。
【００３８】実施例５：サンドイッチＥＩＡ法によるヘ
モグロビンＡ１Ｃの測定 抗ヒトヘモグロビンポリクローナル抗体（ダコ社）をＰ
ＢＳで１００倍に希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレート
の各ウェルに希釈液１００μｌずつを分注し、室温で１
時間放置した。このプレートに１％ＢＳＡ／ＰＢＳを加
えて１時間ブロッキングした。上清を除去し、前記実施
例３（３）に記載の方法で調製したヒト赤血球溶血検体
を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ１１）／０．５％グルタル
アルデヒドで最終的に２００倍に希釈した後、前記の各
ウェルに希釈液１００μｌずつを添加し、室温で１時間
放置した。このプレートを０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／
０．５％グルタルアルデヒド／ＰＢＳで１時間ブロッキ
ングした。上清を除去し、前記実施例１で作製したハイ
ブリドーマＮｏ．１９の培養上清１００μｌを加え、室
温で２時間放置した後、０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔｗ
ｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。次に、アルカリフ
ォスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗マウスＩｇＧ１抗体
（ヤギ）１００μｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、室温
で２時間放置し、再び０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔｗｅ
ｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。このプレートの各ウ
ェルにｐ−ニトロフェニルリン酸を含むジエタノールア
ミン緩衝液（ｐＨ９．６）５０μｌを添加し、室温で３
０分間放置した後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ま
た、対照方法として実施例３（３）と同様のＨＰＬＣ法
を実施した。この結果を図３に示す。図３において、横
軸はＨＰＬＣ法の測定値〔ＨｂＡ１Ｃ（％）〕であり、
□はＥＩＡ法の測定値であり、破線は相関を示す直線で
ある。
モグロビンＡ１Ｃの測定 抗ヒトヘモグロビンポリクローナル抗体（ダコ社）をＰ
ＢＳで１００倍に希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレート
の各ウェルに希釈液１００μｌずつを分注し、室温で１
時間放置した。このプレートに１％ＢＳＡ／ＰＢＳを加
えて１時間ブロッキングした。上清を除去し、前記実施
例３（３）に記載の方法で調製したヒト赤血球溶血検体
を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ１１）／０．５％グルタル
アルデヒドで最終的に２００倍に希釈した後、前記の各
ウェルに希釈液１００μｌずつを添加し、室温で１時間
放置した。このプレートを０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／
０．５％グルタルアルデヒド／ＰＢＳで１時間ブロッキ
ングした。上清を除去し、前記実施例１で作製したハイ
ブリドーマＮｏ．１９の培養上清１００μｌを加え、室
温で２時間放置した後、０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔｗ
ｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。次に、アルカリフ
ォスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗マウスＩｇＧ１抗体
（ヤギ）１００μｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、室温
で２時間放置し、再び０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔｗｅ
ｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。このプレートの各ウ
ェルにｐ−ニトロフェニルリン酸を含むジエタノールア
ミン緩衝液（ｐＨ９．６）５０μｌを添加し、室温で３
０分間放置した後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ま
た、対照方法として実施例３（３）と同様のＨＰＬＣ法
を実施した。この結果を図３に示す。図３において、横
軸はＨＰＬＣ法の測定値〔ＨｂＡ１Ｃ（％）〕であり、
□はＥＩＡ法の測定値であり、破線は相関を示す直線で
ある。
【００３９】実施例６：ＥＬＩＳＡ競合法によるヘモグ
ロビンＡ１Ｃの測定 （１）ビオチン標識ヘモグロビンＡ１Ｃの作製 Ｎ−ヒドロキシサクシニミドビオチン（ＮＨＳ−ビオチ
ン）（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）のジメ
チルスルホキシド溶解液（２ｍＭ）１０μｌをヘモグロ
ビンＡ１Ｃ〔０．１Ｍ−ＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．２）中
０．４ｍｇ／ｍｌ〕２５０μｌに加え、室温で２時間振
盪した。次に、１Ｍ−ＮＨ4 Ｃｌ（１０μｌ）を添加
し、１０分間反応させた。この反応溶液をＰＢＳで透析
した。 （２）モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法による
測定 前記実施例１で作製したハイブリドーマＮｏ．１９の培
養上清１００μｌずつを９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートの
各ウェルに分注し（１μｇ／ｍｌ）、室温で１時間放置
した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを加え、更に１時間ブロッ
キングし、上清を除去した。次に、前記実施例３（３）
で調製したヒト赤血球溶血検体を水で２０倍に希釈して
得た希釈液１００μｌと、前記（１）で調製したビオチ
ン標識ヘモグロビンＡ１Ｃ（１μｇ／ｍｌ）とを０．１
Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ１１）／０．５％グルタルアルデヒ
ド中で混合し、その混合液１００μｌずつを各ウェルに
加え、室温で１時間放置した。０．２％ＢＳＡ／０．２
％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した後、アルカリ
フォスファターゼ（ＡＬＰ）標識アビジン結合抗マウス
ＩｇＧ１抗体（ヤギ）１００μｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）
を加え、室温で１時間放置し、再び０．２％ＢＳＡ／
０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。この
プレートの各ウェルにｐ−ニトロフェニルリン酸を含む
ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．６）５０μｌを添
加し、室温で３０分間放置した後、４０５ｎｍの吸光度
を測定した。また、対照方法として実施例３（３）と同
様のＨＰＬＣ法を実施した。この結果を図６に示す。図
６において、横軸はＨＰＬＣ法の測定値〔ＨｂＡ１Ｃ
（％）〕であり、□はＥＩＡ法の測定値であり、破線は
相関を示す直線である。
ロビンＡ１Ｃの測定 （１）ビオチン標識ヘモグロビンＡ１Ｃの作製 Ｎ−ヒドロキシサクシニミドビオチン（ＮＨＳ−ビオチ
ン）（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）のジメ
チルスルホキシド溶解液（２ｍＭ）１０μｌをヘモグロ
ビンＡ１Ｃ〔０．１Ｍ−ＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．２）中
０．４ｍｇ／ｍｌ〕２５０μｌに加え、室温で２時間振
盪した。次に、１Ｍ−ＮＨ4 Ｃｌ（１０μｌ）を添加
し、１０分間反応させた。この反応溶液をＰＢＳで透析
した。 （２）モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法による
測定 前記実施例１で作製したハイブリドーマＮｏ．１９の培
養上清１００μｌずつを９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートの
各ウェルに分注し（１μｇ／ｍｌ）、室温で１時間放置
した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを加え、更に１時間ブロッ
キングし、上清を除去した。次に、前記実施例３（３）
で調製したヒト赤血球溶血検体を水で２０倍に希釈して
得た希釈液１００μｌと、前記（１）で調製したビオチ
ン標識ヘモグロビンＡ１Ｃ（１μｇ／ｍｌ）とを０．１
Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ１１）／０．５％グルタルアルデヒ
ド中で混合し、その混合液１００μｌずつを各ウェルに
加え、室温で１時間放置した。０．２％ＢＳＡ／０．２
％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した後、アルカリ
フォスファターゼ（ＡＬＰ）標識アビジン結合抗マウス
ＩｇＧ１抗体（ヤギ）１００μｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）
を加え、室温で１時間放置し、再び０．２％ＢＳＡ／
０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。この
プレートの各ウェルにｐ−ニトロフェニルリン酸を含む
ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．６）５０μｌを添
加し、室温で３０分間放置した後、４０５ｎｍの吸光度
を測定した。また、対照方法として実施例３（３）と同
様のＨＰＬＣ法を実施した。この結果を図６に示す。図
６において、横軸はＨＰＬＣ法の測定値〔ＨｂＡ１Ｃ
（％）〕であり、□はＥＩＡ法の測定値であり、破線は
相関を示す直線である。
【００４０】実施例７：ラテックス凝集法による測定
（１）ヒト赤血球溶血液結合ラテックスの調製
ポリスチレンラテックス〔セラダイン社製；１０％（ｗ
／ｖ）；直径＝０．３０１μｍ〕２００μｌを、４００
倍に希釈した赤血球希釈液２ｍｌ〔希釈液＝０．５％グ
ルタルアルデヒド／０．１Ｍ 炭酸緩衝液（ｐＨ１１．
０）〕に混合し、スターラーで攪拌した。これを遠心分
離（１８，０００ｒｐｍ，３０分間）し、１％ＢＳＡを
含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させた。
／ｖ）；直径＝０．３０１μｍ〕２００μｌを、４００
倍に希釈した赤血球希釈液２ｍｌ〔希釈液＝０．５％グ
ルタルアルデヒド／０．１Ｍ 炭酸緩衝液（ｐＨ１１．
０）〕に混合し、スターラーで攪拌した。これを遠心分
離（１８，０００ｒｐｍ，３０分間）し、１％ＢＳＡを
含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させた。
【００４１】（２）抗ヘモグロビンＡ１ＣマウスＩｇＧ
結合ラテックスの調製 ポリスチレンラテックス〔セラダイン社製；１０％（ｗ
／ｖ）；直径＝０．３０１μｍ〕２００μｌを、実施例
１で作製したハイブリドーマＮｏ．１９の培養上清から
精製した抗ヒトヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体
Ｎｏ．１９（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含む０．１Ｍトリス
塩酸緩衝液に混合し、スターラーで攪拌した。これを遠
心分離（１８，０００ｒｐｍ，３０分間）し、１％ＢＳ
Ａを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させ
た。
結合ラテックスの調製 ポリスチレンラテックス〔セラダイン社製；１０％（ｗ
／ｖ）；直径＝０．３０１μｍ〕２００μｌを、実施例
１で作製したハイブリドーマＮｏ．１９の培養上清から
精製した抗ヒトヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体
Ｎｏ．１９（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含む０．１Ｍトリス
塩酸緩衝液に混合し、スターラーで攪拌した。これを遠
心分離（１８，０００ｒｐｍ，３０分間）し、１％ＢＳ
Ａを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させ
た。
【００４２】（３）ラテックス凝集によるヒトヘモグロ
ビンＡ１Ｃの調製 ヒト赤血球溶血液結合ラテックス懸濁液２０μｌ、モノ
クローナル抗体結合ラテックス懸濁液２０μｌ、及び
０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００μｌを
黒色ガラススライド上で混和させ、数回ゆるやかに混和
した。３分間経過後及び１０分間経過後にその凝集の有
無を目視で確認した。その結果を表７に示す。なお、表
７において、ｗ＋は弱陽性、＋は陽性、＋＋は中陽性で
ある。また、全ヘモグロビンに対するＨｂＡ１Ｃの割合
（％）は、ＨＰＬＣ法によって求めた。
ビンＡ１Ｃの調製 ヒト赤血球溶血液結合ラテックス懸濁液２０μｌ、モノ
クローナル抗体結合ラテックス懸濁液２０μｌ、及び
０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００μｌを
黒色ガラススライド上で混和させ、数回ゆるやかに混和
した。３分間経過後及び１０分間経過後にその凝集の有
無を目視で確認した。その結果を表７に示す。なお、表
７において、ｗ＋は弱陽性、＋は陽性、＋＋は中陽性で
ある。また、全ヘモグロビンに対するＨｂＡ１Ｃの割合
（％）は、ＨＰＬＣ法によって求めた。
【００４３】
【表７】
モノクローナル抗体 No.19を用いた凝集の有無全ヘモグロビンに対するHBA1C(%) ３分後 １０分後
０ − −
４．９ ｗ＋ ＋ １０．２ ｗ＋ ＋＋
【００４４】
【発明の効果】本発明方法によれば、測定対象であるヘ
モグロビンＡ１Ｃと比較して被検試料内に過剰量で存在
するヘモグロビンによる干渉を受けずに、しかも安定型
ヘモグロビンＡ１Ｃ及び不安定型ヘモグロビンＡ１Ｃの
両者を含めて、ヘモグロビンＡ１Ｃを高感度で正確及び
迅速に測定することができる。
モグロビンＡ１Ｃと比較して被検試料内に過剰量で存在
するヘモグロビンによる干渉を受けずに、しかも安定型
ヘモグロビンＡ１Ｃ及び不安定型ヘモグロビンＡ１Ｃの
両者を含めて、ヘモグロビンＡ１Ｃを高感度で正確及び
迅速に測定することができる。
【図１】ヒト血液検体中のＨｂＡ１ＣをＨＰＬＣ法で測
定した結果と、同一検体の赤血球溶血液をグルタルアル
デヒドで処理してからモノクローナル抗体を用いてＥＩ
Ａ法で測定した結果との相関を示すグラフである。
定した結果と、同一検体の赤血球溶血液をグルタルアル
デヒドで処理してからモノクローナル抗体を用いてＥＩ
Ａ法で測定した結果との相関を示すグラフである。
【図２】ヒト赤血球溶血試料に関してＨＰＬＣ法で測定
した結果と、同一試料をグルタルアルデヒドで処理して
からモノクローナル抗体を用いてＥＩＡ法で測定した結
果との相関を示すグラフである。
した結果と、同一試料をグルタルアルデヒドで処理して
からモノクローナル抗体を用いてＥＩＡ法で測定した結
果との相関を示すグラフである。
【図３】ヒト血液試料に関して、ＨＰＬＣ法で測定した
結果と、同一試料の赤血球溶血液をグルタルアルデヒド
で処理し、抗Ｈｂポリクローナル抗体とモノクローナル
抗体とを用いてサンドイッチＥＩＡ法で測定した結果と
の相関を示すグラフである。
結果と、同一試料の赤血球溶血液をグルタルアルデヒド
で処理し、抗Ｈｂポリクローナル抗体とモノクローナル
抗体とを用いてサンドイッチＥＩＡ法で測定した結果と
の相関を示すグラフである。
【図４】ヒト血液試料をＥＬＩＳＡ競合法で測定した結
果を示すグラフである。
果を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平６−308122（ＪＰ，Ａ)
特開 平６−347460（ＪＰ，Ａ)
特開 平２−231565（ＪＰ，Ａ)
特開 昭63−277967（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/53
G01N 33/531
G01N 33/577
Claims (3)
- 【請求項１】 抗ヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗
体を用いて被検試料中のヘモグロビンＡ１Ｃを検出する
免疫学的測定方法において、炭素数２〜６で直鎖状のア
ルキルモノアルデヒド若しくはアルキレンジアルデヒ
ド、又はベンズアルデヒドの存在下で、前記モノクロー
ナル抗体と被検試料とを接触させることを特徴とする、
ヘモグロビンＡ１Ｃの測定方法。 - 【請求項２】 グルタルアルデヒドを用いる請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】 ヘモグロビンＡ１Ｃ測定系のベース液中
にグルタルアルデヒドを添加したことを特徴とするヘモ
グロビンＡ１Ｃ測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34871195A JP3512545B2 (ja) | 1995-12-19 | 1995-12-19 | ヘモグロビンａ１ｃの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34871195A JP3512545B2 (ja) | 1995-12-19 | 1995-12-19 | ヘモグロビンａ１ｃの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09171016A JPH09171016A (ja) | 1997-06-30 |
| JP3512545B2 true JP3512545B2 (ja) | 2004-03-29 |
Family
ID=18398857
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34871195A Expired - Lifetime JP3512545B2 (ja) | 1995-12-19 | 1995-12-19 | ヘモグロビンａ１ｃの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3512545B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9341633B2 (en) | 2008-12-11 | 2016-05-17 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Method for pre-treating sample containing glycated hemoglobin |
-
1995
- 1995-12-19 JP JP34871195A patent/JP3512545B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9341633B2 (en) | 2008-12-11 | 2016-05-17 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Method for pre-treating sample containing glycated hemoglobin |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09171016A (ja) | 1997-06-30 |
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