CN114137212A - 一种胶体金免疫层析试纸、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫层析检测技术领域，公开了一种胶体金免疫层析试纸、制备方法及应用，所述胶体金免疫层析试纸的制备方法包括：胶体金的制备；胶体金最适标记pH浓度的确定；胶体金最适标记蛋白浓度的确定；胶体金标记抗体制备；胶体金层析免疫试纸条的组装；胶体金免疫层析试纸条的性能考察。本发明通过改良标记胶体金的制备方法，采用Tris辅助法制备优质的胶体金，制备猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条，适合于临床粪便样品中轮状病毒的快速检测。本发明基于胶体金的猪轮状病毒胶体金免疫层析快速检测方法，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、简单快捷等特点，可以实现对临床样品的快速检测，适用于轮状病毒性腹泻疾病的快速诊断和流行病学。

Description

一种胶体金免疫层析试纸、制备方法及应用
技术领域
本发明属于免疫层析检测技术领域，尤其涉及一种胶体金免疫层析试纸、制备方法及应用。
背景技术
目前，猪轮状病毒(Porcine Rotavirus，PoRV)是含有11个双链RNA的双股RNA病毒，基因组分为11个基因节段，分别编码6种结构蛋白(VP1-VP4， VP6和VP7)和5或6种非结构蛋白(NSP1-NSP5/6)，PoRV的11个基因之间均易发生重配事件。该病毒通过粪-口途径传播，仔猪易感，可引起仔猪精神烦躁、呕吐、厌食以及严重腹泻等，在引起仔猪生长缓慢的同时，导致高死亡率。育成猪和成年猪通常为隐形感染，引起急性肠胃炎，表现为食欲下降、冷漠和不同程度严重的腹泻。在腹泻仔猪中经常发现病毒、细菌和寄生虫联合猪轮状病毒感染。PoRV感染仔猪呈世界流行，各国猪场中阳性率为3.3～67.3％，对世界养猪业产生了严重的经济损失。国内的病原学检测结果显示，PoRV在我国规模化猪场中普遍存在，仔猪腹泻粪便中阳性率为7.69～28.76％。据2017～2019 年四川地区猪A群轮状病毒的分子流行病学调查显示，猪场RVA阳性率为 62.5％，RVA个体阳性率为32.34％，较2014～2016年四川地区RVA的阳性率 (7.69～26.7％)明显增高。在国外，据研究表明，PoRV感染可能非常普遍，在发达国家的猪群中已经流行了几十年，最近对美国和加拿大猪样本的研究表明， PoRV患病率为46％，其中幼龄(≤3日龄78％)和幼龄(4～20日龄65％)仔猪患病率更高。目前，尚无针对该病毒的有效治疗药物，虽然开发出了相应的疫苗，国内临床应用最广泛的疫苗是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的胃－腹－轮腹泻三联弱毒苗，但由于PoRV区域流行不同和遗传多样性，导致该病毒不能完全被控制，因此当前疫苗的保护作用较有限。轮状病毒基因群、基因型多样及该病毒与猪其他引起肠道症状病毒发病症状相似，在临床上难以辨别，故对本病毒快速准确诊断方法的建立就显得尤为重要。
目前，猪轮状病毒的临床检测，多是借助实验室诊断对病原进行进一步的分析诊断，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)和逆转录-环介导等温核酸扩增技术 (RT-LAMP)、原位杂交技术(ISH)、纳米孔测序等。ELISA技术灵敏度较高，但诊断时间长，操作较繁琐。后者几种检测技术具备很高的灵敏度和特异性，但费用成本较高，且对操作人员技术和检测环境要求较高。上述技术对仪器和分析仪的高要求，限制现场或临床诊断的使用。免疫层析技术，始于20世纪后期，是一种将色谱层析和免疫技术相结合的快速检测技术。目前，常见的标记材料包括胶体金、量子点、时间分辨荧光微球、上转换纳米颗粒、磁性纳米颗粒等。其中，最经典的一种标记检测技术是胶体金免疫层析技术。传统的胶体金免疫层析技术，依靠大量金颗粒聚集达到肉眼可见效果，使得基于胶体金标记的免疫层析检测产品的灵敏度较低，稳定性较差，但由于其检测周期短、成本低、对仪器设备和人员没有特殊要求，在即时快速检测方面发挥着不可替代的作用，发展前景广阔。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有针对猪轮状病毒的临床检测技术中，ELISA技术诊断时间长，操作较繁琐；RT-PCR、RT-qPCR、RT-LAMP、ISH、纳米孔测序等技术费用成本较高，对操作人员技术和检测环境要求较高，且现有技术对仪器和分析仪的高要求，限制现场或临床诊断的使用。
(2)传统的胶体金免疫层析技术依靠大量金颗粒聚集达到肉眼可见效果，使得基于胶体金标记的免疫层析检测产品的灵敏度较低，稳定性较差。
解决以上问题及缺陷的难度为：传统柠檬酸钠还原法制备的标记物—胶体金存在颗粒均匀度较低、非球型颗粒含量占比较高、批间差异较大等缺陷，致使抗体标记不均一，进而是所制备试纸条重复性差、稳定性低。
解决以上问题及缺陷的意义为：采用均一性好、球型占比高、颜色更鲜艳的胶体金作为标记材料，可有效改善抗体标记的均匀度，进而提高试纸条产品重复性和稳定性。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种胶体金免疫层析试纸、制备方法及应用，尤其涉及一种基于Tris辅助法制备胶体金的猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条及其制备方法。
本发明是这样实现的，一种胶体金免疫层析试纸的制备方法，所述胶体金免疫层析试纸的制备方法包括以下步骤：
步骤一，胶体金的制备；采用Tris辅助法制备的胶体金的可控性更高、均一性更好、标准球型率更高、稳定性更强、颜色更鲜艳，有利于抗体均匀标记在金球表面，利于保障最终产品的稳定性、重复性、敏感性和特异性。
步骤二，胶体金最适标记pH浓度的确定；通过调整溶液pH在抗体等电点±0.5的范围内，有利于抗体与胶体金靠近，并通过疏水相互作用、静电吸附和配位键形成等相互作用力进行连接，让更多的抗体更好地固定在纳米金球表面，保证抗体的利用率；
步骤三，胶体金最小标记蛋白浓度的确定；标记体系中过量的抗体并不会提高标记效果，但会造成抗体的浪费。通过确定最小的蛋白标记浓度，可确保在保证标记效率和最终产品性能的基础上，最大量地减少抗体的使用量，进而在大规模生产中最大程度降低产品的制造成本。
步骤四，胶体金标记抗体制备；在步骤二和步骤三确定的最佳标记条件下，确定稳定的胶体金标记抗体工艺，是工艺放大的关键。
步骤五，胶体金层析免疫试纸条的组装；通过将固定有检测抗体和质控抗体的NC膜、固定有胶体金标记抗体的金垫、用于添加样品的样品垫和储存层析液体的吸水纸固定在PVC地板上，然后利用裁切机器的压实和裁切，得到所需的试纸条原型，可直接用于检测，也可加装卡壳或贴上塑料标签，是大规模生产的主要工艺过程。
步骤六，胶体金免疫层析试纸条的性能考察。试纸条的敏感性、特异性和稳定性是决定其能否应用于实际生产的关键，必须对其进行严格的考察，符合使用要求，才能进行生产和临床应用。
进一步，步骤一中，所述胶体金的制备，包括：分别采用柠檬酸钠还原法和Tris辅助法制备胶体金，并观察胶体金的颜色在内的外观特征；利用紫外分光光度计扫描紫外吸收图谱，通过粒径分析仪测定粒径大小及分布情况，采用透射电镜测定胶体金的均一性和颗粒大小。
其中，所述柠檬酸钠还原法制备胶体金，包括：在250mL三角瓶中；加入99mL 的超纯水和1mL 1％w/v的HAuCl4溶液及磁力搅拌子1个，在磁力搅拌器上加热至沸腾；加入1.0mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续搅拌15min，继续煮沸10min出现透明的橙红色，之后颜色不再变化；自然冷却至室温；用超纯水补充液体体积至 100mL；原液面高度处，常温避光保存。
所述Tris辅助法制备胶体金，包括：量取140mL纯净水于三颈烧瓶中，放入搅拌子，将三颈烧瓶放置在油浴锅中油浴加热；三颈烧瓶上方连接冷凝管，设定磁力加热搅拌器温度为137℃，搅拌转速为900rpm；油浴温度到达100℃，将 10mL 1％柠檬酸钠溶液加入到三颈烧瓶中；继续加热40min，温度稳定于137℃附近，从侧边的口中注入1mL 1％氯金酸溶液；60s后，再将5mL 0.1M Tris-base 溶液注入三颈烧瓶中的漩涡中心处，塞上空心塞；反应30min后，将温度设置成 100℃，开启通风橱加速降温；油浴温度到达100℃时，一次性快速将1mL 1％氯金酸注至三颈烧瓶中的漩涡中心处，反应30min；重复上一步骤，反应结束后停止加热；在搅拌状态下自然冷却至室温；避光，常温保存。
进一步，所述油浴为二甲基硅油。
进一步，步骤二中，所述胶体金最适标记pH浓度的确定，包括：
取6只1.5mL透明玻璃瓶，每管加入1mL胶体金溶液，加入5μg轮状病毒特异性抗体Ab2，分别加入不同体积的0.1mol/L K2CO3调整pH，确定最适标记pH浓度。
进一步，步骤三中，所述胶体金最适标记蛋白浓度的确定，包括：取6只1.5mL 的透明玻璃瓶，每管加入1mL胶体金溶液，加入2μL 0.1mol/L的K2CO3，加入不同体积的轮状病毒特异性抗体Ab2，确定最适标记蛋白浓度。
进一步，步骤四中，所述胶体金标记抗体制备，包括：将制备的胶体金与轮状病毒特异性单抗Ab2进行偶联；将1mL胶体金和2μL 0.1M的K2CO3混匀，再加入1μL4.9mg/mL的轮状病毒Ab2抗体，静置1h；反应结束后，10％BSA溶液封闭30min；8000g转速下离心15min，弃上清，沉淀用偶联复溶液按300倍比例稀释，均匀喷涂于结合垫上，37℃烘干3h。
进一步，步骤五中，所述胶体金层析免疫试纸条的组装，包括：利用接触式自动划膜仪将轮状病毒捕获抗体Ab1与羊抗鼠IgG包被在NC膜上作为检测线T 与质控线C，37℃烘干；将样品垫、结合垫、包被有T线与C线的NC膜和吸水纸组装到PVC底板上，采用数控裁条机裁成3.0mm宽的试纸条，干燥条件下避光保存备用。
进一步，步骤六中，所述胶体金免疫层析试纸条的性能考察，包括：
(1)灵敏度试验
用传统PCR验证A3粪便样品为轮状病毒阳性样品，用样品稀释液配制稀释度为1：10、1：50、1：100、1：200、1：300、1：400、1：500、1：1000的轮状病毒阳性样品；取60μL滴加到样品垫上，静置10min，肉眼观察检测结果并拍照，确定试纸的检测灵敏性。
(2)特异性试验
制备好的试纸条，分别检测猪传染性胃肠炎病毒、猪疱疹病毒I型、流行性腹泻病毒、猪蓝耳病病毒四种相似的病毒以及大肠杆菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、锡那罗州弧菌、金色葡萄球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌以及肺炎克雷伯杆菌，通过观察结果分析试纸条的特异性。
(3)重复性试验
从同一批制备的试纸条中随机抽取12根试纸条，对高、中、低浓度的阳性样品进行检测，同时做阴性对照；分别从3个不同批次制备的试纸条中，分别抽取4根对高、中、低浓度的阳性样品进行检测，考查试纸条的批间重复性，同时做阴性对照。
(4)稳定性试验
将同一批次的试纸条分别在4℃、室温和37℃条件下干燥避光保存，并分别在第7d、14d、21d、56d，抽取试纸条，对阴性及阳性样品以1：10，1：50，1： 100，1：300，1：500稀释样品进行检测，同时做阴性对照，此后每三个月重复此操作。
(5)临床样品的检测
收集的粪便临床样品，用棉拭子蘸取，于1mL样品稀释液中，5000r/min 离心10min，取上清，用制备的胶体金试纸条，对20份临床样品进行检测。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的胶体金免疫层析试纸的制备方法制备得到的胶体金免疫层析试纸。
本发明的另一目的在于提供一种所述的胶体金免疫层析试纸在制备猪轮状病毒检测用试剂盒中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的胶体金免疫层析试纸、制备方法及应用，通过改良标记胶体金的制备方法，采用Tris辅助法制备优质胶体金，制备猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条。本发明通过Tris辅助法制备优质胶体金，标记轮状病毒检测抗体作为标签，研制一种用于粪便样品中猪轮状病毒检测的胶体金免疫层析试纸条，并考察该试纸条的性能。该试纸条具备良好的灵敏度、特异性和稳定性，可在10min内完成检测。本发明旨在采用新型Tris辅助法制备优质胶体金，通过对胶体金质量的改进，提高胶体金免疫层析试纸条的性能。
本发明为建立一种能稳定、快速、便捷的猪轮状病毒现场检测技术，本发明利用Tris-base辅助法制备胶体金，将其与轮状病毒标记抗体Ab2偶联，喷涂在结合垫上，以轮状病毒捕获抗体Ab1和羊抗鼠IgG包被硝酸纤维素膜(NC 膜)分别作为检测线和质控线，组装试纸条，确定最适标记pH和最小蛋白量，建立胶体金免疫层析试纸条制备工艺，并通过灵敏度试验、特异性试验、重复性试验、稳定性试验以及临床试验，考察该试纸条的性能。结果表明，基于 Tris-base辅助法制备的胶体金，颗粒大小均匀，颜色鲜艳，稳定性好。以此为标记物建立的猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条，敏感性高，特异性好，稳定性强，各方面性能均达到临床快速检测的要求。说明本发明基于Tris辅助法制备的轮状病毒胶体金免疫层析试纸条，可用于临床检测。
本发明构建了一种基于Tris辅助法制备胶体金的猪轮状病毒胶体金免疫层析快速检测方法，用于检测粪便样本中轮状病毒的快速检测。本发明结果表明， Tris辅助法制备的胶体金，胶体金颗粒大小均匀，形状呈球状，更利于金颗粒与抗体的偶联。从紫外扫描仪和粒径仪的数据呈现，确定制备的胶体金质量佳，更加适用于检测方法的建立。此外，该试纸条最小检出稀释倍数为1：400，表明该试纸条灵敏性良好。此外，该试纸条与猪传染性胃肠炎病毒、猪疱疹病毒I 型、猪流行性腹泻病毒、猪蓝耳病病毒四种相似的病毒和常见的细菌均无交叉反应，具有很高的特异性。而且，试纸条在4℃、室温和37℃条件下，保存40d，无假阳性，对高、中、低浓度的阳性样品的检测，T线显色清晰，具有良好的稳定性。猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条的重复性良好，从同一批次和不同批次随机抽取试纸条，C线、T线清晰明显。本发明研制的胶体金免疫层析试纸条，对临床样品的检测结果与PCR检测结果的符合率为100％。因此，本发明研制的猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条，适合于临床粪便样品中轮状病毒的快速检测，在轮状病毒性腹泻疾病的快速诊断和流行病学研究中具有广阔的应用。
本发明研制了一种基于Tris辅助法制备胶体金的猪轮状病毒胶体金免疫层析快速检测方法，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、简单快捷等特点，可实现对临床样品的快速检测，适用于轮状病毒性腹泻疾病的快速诊断和流行病学。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的胶体金免疫层析试纸的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的胶体金表征结果示意图。
其中，图2A是本发明实施例提供的柠檬酸钠还原法制备胶体金示意图。
图2B是本发明实施例提供的Tris辅助法制备胶体金示意图。
图2C是本发明实施例提供的柠檬酸钠还原法制备胶体金透射电镜图 (x30.0k)。
图2D是本发明实施例提供的Tris辅助法制备胶体金透射电镜图(x30.0k)。
图2E是本发明实施例提供的Tris辅助法制备胶体金粒径图。
图2F是本发明实施例提供的Tris辅助法制备胶体金紫外可见吸收图谱。
图3是本发明实施例提供的试纸条最适pH试验阴性样品结果示意图；
图中：1～6分别为0、1、2、4、8、10μL K2CO3。
图4是本发明实施例提供的试纸条最适pH试验阳性样品结果示意图；
图中：1～6分别为0、1、2、4、8、10μL K2CO3。
图5是本发明实施例提供的试纸条最适蛋白量试验阴性样品结果示意图；
图中：1～6分别为0、2.5、5、7.5、10μg Ab2。
图6是本发明实施例提供的试纸条最适蛋白量试验阳性样品结果示意图；
图中：1～6分别为0、2.5、5、7.5、10μg Ab2。
图7是本发明实施例提供的试纸条灵敏性试验结果示意图；
图中：1为阴性样品；2为阳性样品；3～10对应的阳性样品稀释倍数为1： 10；1：50；1：100；1：200；1：300；1：400；1：500；1：1000。
图8是本发明实施例提供的试纸条特异性试验结果示意图；
图中：1、阴性样品；2、阳性样品；从3～15分别为TGEV；PCVR；PRV； PEDV；大肠杆菌；副溶血弧菌；溶藻弧菌；锡那罗州弧菌；金色葡萄球菌；沙门氏菌；奇异变形杆菌；无乳链球菌；肺炎克雷伯杆菌。
图9是本发明实施例提供的试纸条批内试验结果示意图；
图中：1～4分别为阴性样品及高、中、低浓度的阳性样品。
图10是本发明实施例提供的试纸条批间试验结果示意图；
图中：1～4分别为阴性样品及高、中、低浓度的阳性样品。
图11是本发明实施例提供的试纸条稳定性试验结果示意图；
图中：1～6阴性及阳性样品以1：10，1：50，1：100，1：300，1：500稀释样品。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种胶体金免疫层析试纸、制备方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的胶体金免疫层析试纸的制备方法包括以下步骤：
S101，胶体金的制备；
S102，胶体金最适标记pH浓度的确定；
S103，胶体金最适标记蛋白浓度的确定；
S104，胶体金标记抗体制备；
S105，胶体金层析免疫试纸条的组装；
S106，胶体金免疫层析试纸条的性能考察。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
本发明为建立一种能稳定、快速、便捷的猪轮状病毒现场检测技术，试验利用Tris-base辅助法制备胶体金，将其与轮状病毒标记抗体Ab2偶联，喷涂在结合垫上，以轮状病毒捕获抗体Ab1和羊抗鼠IgG包被硝酸纤维素膜(NC膜)分别作为检测线和质控线，组装试纸条，确定最适标记pH和最小蛋白量，建立胶体金免疫层析试纸条制备工艺，并通过灵敏度试验、特异性试验、重复性试验、稳定性试验以及临床试验，考察该试纸条的性能。结果表明，基于Tris-base辅助法制备的胶体金，颗粒大小均匀，颜色鲜艳，稳定性好。以此为标记物建立的猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条，敏感性高，特异性好，稳定性强，各方面性能均达到临床快速检测的要求。说明基于Tris辅助法制备的轮状病毒胶体金免疫层析试纸条，可用于临床检测。
本发明通过改良标记胶体金的制备方法，采用Tris辅助法制备优质胶体金，制备猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条。
本发明通过Tris辅助法制备优质胶体金，标记轮状病毒检测抗体作为标签，研制一种用于粪便样品中猪轮状病毒检测的胶体金免疫层析试纸条，并考察该试纸条的性能。该试纸条具备良好的灵敏度、特异性和稳定性，可在10min内完成检测。本发明旨在采用新型Tris辅助法制备优质胶体金，通过对胶体金质量的改进，提高胶体金免疫层析试纸条的性能。
1、材料
1.1主要试剂
轮状病毒单克隆抗体Ab1和Ab2，均购自美国Meridian公司；羊抗鼠IgG，购自上海生工生物工程有限公司；牛血清白蛋白、柠檬酸钠、四氯金酸等，均购自美国Sigma公司；硝酸纤维素膜，购自德国Sartorius公司；样品垫、结合垫、吸水纸、PVC底板等，购自上海金标生物科技有限公司；轮状病毒临床样本，由南宁诸福莱动物健康管理有限公司收集和保存。
1.2主要仪器
高速冷冻离心机(型号为5430R)，购自德国Eppendorf公司；微电脑自动斩切机(型号为ZQ2002)、数控裁条机((型号为CTS300)XYZ)和三维化膜喷金仪(型号为HM3035)，均购自上海金标生物科技有限公司；马尔文纳米粒度电位仪(型号为ZetasizerNanoZS)，购自美国马尔文仪器公司；日立透射电子显微镜(型号为HT7700)，购自日本日立公司；紫外可见光分光光度计(型号为 UV-1800)；购自岛津仪器有限公司。
2、方法
2.1胶体金的制备
分别采用柠檬酸钠还原法和Tris辅助法制备胶体金，然后观察其颜色等外观特征，利用紫外分光光度计扫描紫外吸收图谱，通过粒径分析仪测定粒径大小及分布情况，采用透射电镜测定其均一性和颗粒大小。
柠檬酸钠还原法制备胶体金，在250mL三角瓶中；加入99mL的超纯水和1mL 1％(w/v)的HAuCl4溶液及磁力搅拌子1个，在磁力搅拌器上加热至沸腾；加入 1.0mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续搅拌15min，继续煮沸10min出现透明的橙红色，之后颜色不再变化；自然冷却至室温；用超纯水补充液体体积至100mL；(原液面高度处)，常温避光保存。
Tris辅助法制备胶体金，量取140mL纯净水于三颈烧瓶中，放入搅拌子，将三颈烧瓶放置在油浴锅中油浴(二甲基硅油)加热；三颈烧瓶上方连接冷凝管，设定磁力加热搅拌器温度为137℃，搅拌转速为900rpm；油浴温度到达100℃，将10mL 1％柠檬酸钠溶液加入到三颈烧瓶中；继续加热40min，温度稳定于137℃附近，从侧边的口中注入1mL 1％氯金酸溶液；60s后，再将5mL 0.1M Tris-base 溶液注入三颈烧瓶中的漩涡中心处，塞上空心塞；反应30min后，将温度设置成 100℃，开启通风橱加速降温；油浴温度到达100℃时，一次性快速将1mL 1％氯金酸注至三颈烧瓶中的漩涡中心处，反应30min；重复上一步骤，反应结束后停止加热；在搅拌状态下自然冷却至室温；避光，常温保存。
2.2胶体金最适标记pH浓度的确定
取6只1.5mL透明玻璃瓶，每管加入1mL胶体金溶液，加入5μg轮状病毒特异性抗体Ab2，分别加入不同体积的K2CO3(0.1mol/L)调整pH，确定最适标记pH 浓度。
2.3胶体金最适标记蛋白浓度的确定
取6只1.5mL的透明玻璃瓶，每管加入1mL胶体金溶液，加入2μL K2CO3 (0.1mol/L)，加入不同体积的轮状病毒特异性抗体Ab2，确定最适标记蛋白浓度。
2.4胶体金标记抗体制备
将制备的胶体金与轮状病毒特异性单抗Ab2进行偶联。首先，将1mL胶体金和2μLK2CO3(0.1M)混匀，再加入1μL4.9mg/mL的轮状病毒Ab2抗体，静置1h。反应结束后，10％BSA溶液封闭30min。8000g转速下离心15min，弃上清，沉淀用偶联复溶液按300倍比例稀释，均匀喷涂于结合垫上，37℃烘干3h。
2.5胶体金层析免疫试纸条的组装
利用接触式自动划膜仪将轮状病毒捕获抗体Ab1与羊抗鼠IgG包被在NC膜上作为检测线(T)与质控线(C)，37℃烘干。将样品垫、结合垫、包被有T线与C线的NC膜和吸水纸组装到PVC底板上，采用数控裁条机裁成3.0mm宽的试纸条，干燥条件下避光保存备用。
2.6胶体金免疫层析试纸条的性能考察
2.6.1灵敏度试验
用传统PCR验证A3粪便样品为轮状病毒阳性样品，用样品稀释液配制稀释度为1：10、1：50、1：100、1：200、1：300、1：400、1：500、1：1000的轮状病毒阳性样品。取60μL滴加到样品垫上，静置10min，肉眼观察检测结果并拍照，确定试纸的检测灵敏性。
2.6.2特异性试验
制备好的试纸条，分别检测猪传染性胃肠炎病毒、猪疱疹病毒I型、流行性腹泻病毒、猪蓝耳病病毒四种相似的病毒以及大肠杆菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、锡那罗州弧菌、金色葡萄球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯杆菌等菌，通过观察结果分析试纸条的特异性。
2.6.3重复性试验
从同一批制备的试纸条中随机抽取12根试纸条，对高、中、低浓度的阳性样品进行检测，同时做阴性对照。分别从3个不同批次制备的试纸条中，分别抽取4根对高、中、低浓度的阳性样品进行检测，考查试纸条的批间重复性，同时做阴性对照。
2.6.4稳定性试验
将同一批次的试纸条分别在4℃、室温和37℃条件下干燥避光保存，并分别在第7d、14d、21d、56d，抽取试纸条，对阴性及阳性样品以1：10，1：50，1： 100，1：300，1：500稀释样品进行检测，同时做阴性对照，此后每三个月重复此操作。
2.6.5临床样品的检测
收集的粪便临床样品，用棉拭子蘸取，于1mL样品稀释液中，5000r/min离心10min，取上清，用制备的胶体金试纸条，对20份临床样品进行检测。
3、结果
3.1胶体金颗粒的表征
柠檬酸钠还原法和Tris辅助法制备胶体金溶液外观颜色，如图2中A图和B图所示，制得的金溶液分别呈紫红色和清澈透亮的酒红色。图2中C图和D图表明， Tris辅助法所制备的胶体金，颗粒大小均匀，形状呈圆球状，而柠檬酸钠还原法制备的胶体金，颗粒大小不一，形状呈椭圆形。图2中E图表明，Tris辅助法制备胶体金，粒径集中40nm。图2中F图表明，Tris辅助法制备胶体金，紫外吸收峰波长为520nm。
3.2胶体金最适标记pH浓度的确定
胶体金标记轮状病毒特异性抗体Ab2抗体最适pH值试验，如图3和图4结果显示，当1mL胶体金溶液中添加2μL 0.1mol/LK2CO3时，C、T线最清晰，膜面干净，无假阳性。当1mL胶体金溶液中添加4μL 0.1mol/L K2CO3时，膜面不太干净。根据C、T线显色程度及膜面干净程度，后续实验选择1mL胶体金溶液中添加2μL 0.1mol/LK2CO3。
3.3胶体金最适标记蛋白浓度的确定
胶体金标最适标记蛋白浓度试验，如图5和图6结果显示，当1mL胶体金溶液中添加加入2.5μg轮状病毒特异性抗体Ab2时，膜面不干净，有胶体金沉积。当 1mL胶体金溶液中添加加入5μg轮状病毒特异性抗体Ab2时，膜面干净，C、T线最清晰，后续实验选择1mL胶体金溶液中添加5μgAb2。
3.4胶体金免疫层析试纸条的性能考察
3.4.1胶体金免疫层析试纸条的灵敏度
胶体金免疫层析试纸条检测不同稀释倍数的轮状病毒阳性样品，结果如图7 所示，阳性样品稀释倍数为1：10时，T线显色清晰，肉眼最低可观测至稀释倍数为1：400。当浓度低于稀释倍数1：400时，在自然光线下无法观察到检测线。
3.4.2胶体金免疫层析试纸条的特异性
轮状病毒胶体金免疫层析试纸条特异性检测结果正如图8所示。轮状病毒检测样品试纸条只有C线上形成红色条带，而T线位置无可见的红色条带。因此，所制备的胶体金免疫层析试纸条与常见猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪疱疹病毒I型(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪蓝耳病毒(PRRS)四种相似的病毒以及大肠杆菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、锡那罗州弧菌、金色葡萄球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯杆菌病原菌无交叉反应，具有较高的特异性。
3.4.3胶体金免疫层析试纸条的重复性
从同一批制备的试纸条中随机抽取12根试纸条，做批内重复性实验，对阴性样品及高、中、低浓度的阳性样品进行检测，如图9、10所示，可见不同试纸条的C线、T线显色程度基本一致。分别从3个不同批次制备的试纸条中，分别抽取4根对阴性样品及高、中、低浓度的阳性样品进行检测，不同试纸条的C线、T 线显色程度基本一致。
3.4.4胶体金免疫层析试纸条的稳定性
该试纸条至于4℃、室温和37℃条件下干燥避光保存，第40d随机抽取试纸条，对阴性及阳性样品以1：10，1：50，1：100，1：300，1：500稀释样品进行检测，如图11所示，4℃保存的试纸条，C线、T线显色明显，膜面干净，37℃和常温保存的试纸条，C线、T线显色明显，但显色效果无4℃明显。
3.4.5胶体金免疫层析试纸条的临床实验
同时采用本发明制备的胶体金免疫层析试纸和常规RT-PCR方法，对已知背景的20例轮状病毒临床阳性样本和10例阴性样本进行检测，结果如表1所示，两种方法阳性符合率、阴性符合率与总符合率均为100％，这说明本试验制备的胶体金免疫层析试纸条比较可靠。
表1试纸条临床试验结果
Figure BDA0003369469940000151
4、猪轮状病毒是导致哺乳仔猪和断奶仔猪腹泻的主要原因之一，给全球的养猪业造成了巨大的经济损失。该病毒含有多种血清群，尤其是A群轮状病毒，最为常见且为人畜共患的腹泻病毒，通过粪－口途径传播，感染肠道肠上皮细胞，临床症状为腹泻、呕吐、厌食、脱水。尚无针对该病毒的有效治疗药物，虽然开发出了相应的疫苗，但由于PoRV区域流行不同和遗传多样性，导致该病毒不能完全被控制。轮状病毒基因群、基因型多样及该病毒与猪其他引起肠道症状病毒发病症状相似，在临床上难以辨别，故对本病即时准确诊断方法的建立就显得尤为重要。
近年来胶体金检测技术逐步兴起，基于其快速、特异、不受场地限制、无需专业技术人员的优势，该技术已广泛应用于多个领域。胶体金免疫层析技术是否可以成功建立，金溶液的质量是决定性因素之一，金溶液的质量好坏会影响后期标记的效果、显色、灵敏度、特异性等。劣质的胶体金在胶体金标记过程中无法被蛋白均匀的包被，以致影响其在溶液中分布的均匀性，进而影响产品的性能。试验表明金溶液中仅有5％形状不均一的金颗粒都会影响标记的效果、检测性能、及其重复性。蛋白被标记的不均一会导致标记的胶体金积聚与凝集，即便立即将标记好的胶体金干燥于金标垫上，也会由于金颗粒形状的不规则，导致其表面标记的蛋白易于脱落，造成检测结果的假阳性。
本发明构建了一种基于Tris辅助法制备胶体金的猪轮状病毒胶体金免疫层析快速检测方法，用于检测粪便样本中轮状病毒的快速检测。本发明结果表明， Tris辅助法制备的胶体金，胶体金颗粒大小均匀，形状呈球状，更利于金颗粒与抗体的偶联。从紫外扫描仪和粒径仪的数据呈现，确定制备的胶体金质量佳，更加适用于检测方法的建立。此外，该试纸条最小检出稀释倍数为1：400，表明该试纸条灵敏性良好。此外，该试纸条与猪传染性胃肠炎病毒、猪疱疹病毒I 型、猪流行性腹泻病毒、猪蓝耳病病毒四种相似的病毒和常见的细菌均无交叉反应，具有很高的特异性。而且，试纸条在4℃、室温和37℃条件下，保存40d，无假阳性，对高、中、低浓度的阳性样品的检测，T线显色清晰，具有良好的稳定性。猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条的重复性良好，从同一批次和不同批次随机抽取试纸条，C线、T线清晰明显。本发明研制的胶体金免疫层析试纸条，对临床样品的检测结果与PCR检测结果的符合率为100％。因此，本发明研制的猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条，适合于临床粪便样品中轮状病毒的快速检测，在轮状病毒性腹泻疾病的快速诊断和流行病学研究中具有广阔的应用。
本发明研制了一种基于Tris辅助法制备胶体金的猪轮状病毒胶体金免疫层析快速检测方法，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、简单快捷等特点，可实现对临床样品的快速检测，适用于轮状病毒性腹泻疾病的快速诊断和流行病学。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，所述胶体金免疫层析试纸的制备方法包括以下步骤：
步骤一，胶体金的制备；
步骤二，胶体金最适标记pH浓度的确定；
步骤三，胶体金最适标记蛋白浓度的确定；
步骤四，胶体金标记抗体制备；
步骤五，胶体金层析免疫试纸条的组装；
步骤六，胶体金免疫层析试纸条的性能考察。
2.如权利要求1所述胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述胶体金的制备，包括：分别采用柠檬酸钠还原法和Tris辅助法制备胶体金，并观察胶体金的颜色和透明度的外观特征；利用紫外分光光度计扫描紫外吸收图谱，通过粒径分析仪测定粒径大小及分布情况，采用透射电镜测定胶体金的均一性和颗粒大小；
所述Tris辅助法制备胶体金，包括：量取140mL纯净水于三颈烧瓶中，放入搅拌子，将三颈烧瓶放置在油浴锅中油浴加热；三颈烧瓶上方连接冷凝管，设定磁力加热搅拌器温度为137℃，搅拌转速为900rpm；油浴温度到达100℃，将10mL 1％柠檬酸钠溶液加入到三颈烧瓶中；继续加热40min，温度稳定于137℃附近，从侧边的口中注入1mL 1％氯金酸溶液；60s后，再将5mL 0.1M Tris-base溶液注入三颈烧瓶中的漩涡中心处，塞上空心塞；反应30min后，将温度设置成100℃，开启通风橱加速降温；油浴温度到达100℃时，一次性快速将1mL 1％氯金酸注至三颈烧瓶中的漩涡中心处，反应30min；重复上一步骤，反应结束后停止加热；在搅拌状态下自然冷却至室温；避光，常温保存。
3.如权利要求2所述胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，所述油浴为二甲基硅油。
4.如权利要求1所述胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述胶体金最适标记pH浓度的确定，包括：取6只1.5mL透明玻璃瓶，每管加入1mL胶体金溶液，加入5μg轮状病毒特异性抗体Ab2，分别加入不同体积的0.1mol/LK2CO3调整pH，确定最适标记pH浓度。
5.如权利要求1所述胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述胶体金最适标记蛋白浓度的确定，包括：取6只1.5mL的透明玻璃瓶，每管加入1mL胶体金溶液，加入2μL 0.1mol/L的K2CO3，加入不同体积的轮状病毒特异性抗体Ab2，确定最适标记蛋白浓度。
6.如权利要求1所述胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述胶体金标记抗体制备，包括：将制备的胶体金与轮状病毒特异性单抗Ab2进行偶联；将1mL胶体金和2μL 0.1M的K2CO3混匀，再加入1μL4.9mg/mL的轮状病毒Ab2抗体，静置1h；反应结束后，10％BSA溶液封闭30min；8000g转速下离心15min，弃上清，沉淀用偶联复溶液按300倍比例稀释，均匀喷涂于结合垫上，37℃烘干3h。
7.如权利要求1所述胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述胶体金层析免疫试纸条的组装，包括：利用接触式自动划膜仪将轮状病毒捕获抗体Ab1与羊抗鼠IgG包被在NC膜上作为检测线T与质控线C，37℃烘干；将样品垫、结合垫、包被有T线与C线的NC膜和吸水纸组装到PVC底板上，采用数控裁条机裁成3.0mm宽的试纸条，干燥条件下避光保存备用。
8.如权利要求1所述胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，步骤六中，所述胶体金免疫层析试纸条的性能考察，包括：
(1)灵敏度试验，用传统PCR验证A3粪便样品为轮状病毒阳性样品，用样品稀释液配制稀释度为1：10、1：50、1：100、1：200、1：300、1：400、1：500、1：1000的轮状病毒阳性样品；取60μL滴加到样品垫上，静置10min，肉眼观察检测结果并拍照，确定试纸的检测灵敏性；
(2)特异性试验，制备好的试纸条，分别检测猪传染性胃肠炎病毒、猪疱疹病毒I型、流行性腹泻病毒、猪蓝耳病病毒四种相似的病毒以及大肠杆菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、锡那罗州弧菌、金色葡萄球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌以及肺炎克雷伯杆菌，通过观察结果分析试纸条的特异性；
(3)重复性试验，从同一批制备的试纸条中随机抽取12根试纸条，对高、中、低浓度的阳性样品进行检测，同时做阴性对照；分别从3个不同批次制备的试纸条中，分别抽取4根对高、中、低浓度的阳性样品进行检测，考查试纸条的批间重复性，同时做阴性对照；
(4)稳定性试验，将同一批次的试纸条分别在4℃、室温和37℃条件下干燥避光保存，并分别在第7d、14d、21d、56d，抽取试纸条，对阴性及阳性样品以1：10，1：50，1：100，1：300，1：500稀释样品进行检测，同时做阴性对照，此后每三个月重复此操作；
(5)临床样品的检测，收集的粪便临床样品，用棉拭子蘸取，于1mL样品稀释液中，5000r/min离心10min，取上清，用制备的胶体金试纸条，对20份临床样品进行检测。
9.一种应用如权利要求1～8任意一项所述胶体金免疫层析试纸的制备方法制备得到的胶体金免疫层析试纸。
10.一种如权利要求9所述的胶体金免疫层析试纸在制备猪轮状病毒检测用试剂盒中的应用。
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