DD282924A5 - Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen rotaviren - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikoerpern gegen Rotaviren, die in der medizinischen Diagnostik angewendet werden koennen. Das der Erfindung zugrunde liegende Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dasz man in an sich bekannter Weise Milzzellen von Balb/c-Maeusen, die mit Rotaviren immunisiert wurden, mit Maus-Myelomzellen mittels Polyethylenglykol fusioniert. Erfindungswesentlich ist die Immunisierung der Balb/c-Maeuse mit dem humanen Rotavirusisolat R 326, der Einsatz der FO-Zellinie als Maus-Myelomzellinie und die Auswahl der spezifischen Hybridome II C6 (ZIM-0478) und IV F4 (ZIM-0479) zur Antikoerperproduktion. Die erfindungsgemaeszen Hybridome sind stabil, hochproduktiv und in allen Standardmedien ohne Adaptionszeit kultivierbar. Die von diesen beiden Hybridomen produzierten mAK erkennen zwei verschiedene Epitope des Rotavirus. Sie gehoeren der Immunglobulinklasse IgG an und zeigen gute kreuzreaktive Eigenschaften.{Antikoerper, monoklonale; Rotaviren; Milzzellen; Maus-Myelomzellen; Rotavirusisolat R 326; FO-Zellinie; Hybridome, spezifische; Epitope, verschiedene; Immunglobulinklasse}

Description

Es werden zwei stabile Hybridomklone mit spezifischer Antikörperproduktion gegen Rotaviren selektiert, die unerwartet günstige Merkmalskombinationen aufweisen. Diese erfindungsgemäßen Klone zeichnen sich durch eine hohe Produktivität, gute Kultivierbarkeit und Medienverträglichkeit aus. Sib sind in allen Standardmedien ohne Adaptationszeit kultivierbar. Bei 3—4tägigem Passagerhythmus sind die Hybride 1:3 umsetzbar. Sie sind mindestens über 10 Passagen boi gleicher Abgabe von monokloralen Antikörpern ins Medium ohne Reklonierung zu führen.

Die beiden Klone erzeugen monokionaie Antikörper gegen das gruppenspezifische Antigen der Rotavirusgruppe A. Sie sind mit den humanen Rotavirusstämmen Wa, DS1 und dem RotavirusisolarR326sowiedemAffenrotavirusSA11 kreuzreaktiv. Die beiden monoklonal.^ Antikörper gehören der Immunglobulinklasse IgG an.

Tabelle 1

Registrier	Hybridklon	produzierten	Maus-Ig-	Verdünnung im
nummer		mAk	Subklasse	Sandwich-ELISA
ZIM-0478	. IIC6	IVE-IIC6	IgGi	> 1:2000
ZIM-0479	IV F4	IVE-IV F4	IgG 2 b	1:5000

Durch einen Block-ELISA wird bewiesen, daß die monoklonalen Antikörper IVE-II C6 und IVE-IV F4 zwei verschiedene Epitope des Rotavirus erkennen. Der monokionaie Antikö per IVE-IIC 6 besitzt sehr gute Bindungseigenschaften an die Mikrotiterplatten und ist daher als Capture-Antikörper hervorragend geeignet. Der an die Platte gebundene Antikörper IVE-IIC6 weist eine srhr hohe Aktivität und Affinität auf. Für den Nachweis von Rotavirusantigen im Sandwich-ELISA werden daher nur kurze Inkubationszeiten benötigt. Der monokionaie Antikörper IVE-IV F4 läßt sich ausgezeichnet mit POD markieren. Er ist in sehr hohen Verdünnungen einsetzbar und besitzt somit ebenfalls eine hohe Affinität. Die erfindungsgemäß hergestellten rotavirusspezifischen monoklonalen Antikörper sind zum Aufbau von Testoestecken geeignet. Die für die erfindungsgemäße Antikörperproduktion eingesetzten Hybridome wurden im ZIM in der Hinterlegungsstelle für Zellinien am 2O.April 1989 unter folgenden Registriernummern hinterlegt: Il C6 (ZIM-0478) und IV F4 (ZIM-0479).

Ausführungsbeispie!

Die Gewinnung der Hybridome erfolgt nach an sich bekannten Verfahren (Köhler, G. and C. Milstein, Nature 256,495-497, [1975]). Hierzu werden Balb/c-Mäuse mehrfach in4wöchigen Intervallen mit je 0,5 ml eines 1:1 Gemisches aus dem Rotavirusisolat R 326 und kompletten bzw. inkompletten Freund'schen Adjuvants i. p. immunisiert. Vier Tage vor der Fusion werden die Mäuse täglich mit 0,4ml des humanen Rotavirusisolats R 326 i. p. goboostert. Die Fusion der Milzzellen mit der Myelomzellinie FO erfolgt mit Polyethylenglykol 4000. Die FO-Zellinie wird in RPM11640 + 15% foetalem Kälberserum kultiviert. In einem S' lektivmedium (Azaserin) werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und Zellklone selektiert, die monokionaie Antikörper der gewünschten Spezifität sezernienn. Dazu werden die Zellen unmittelbar nach der Fusion in 96-well Mikrotiterplatten angezüchtet. Die Überstände der Kulturen, die Hybridzellen enthalten werden mit einem Sandwich-ELISA auf die Anwesenheit von rotavirusspezifischen monoklonalen Antikörpern geprüft. Antikörperproduzierende Hybridomkulturen werden mehrfach nach der G'enzverdünnungsmethode klonisrt. Dabai werden Hybridklone ausgewählt, die stabil monokionaie Antikörper in hoher Menge produzieren. Die Eigenschaften der von den Hybridomen produzierten mAk sind in Tabelle 1 dargestellt. Mit Hilfe eines Rleck-ELISA (Peters, J. H. u.a., Monokionaie Antikörper, Herstellung und Charakterisierung, Springer-Verlag, Berlin, 1985) wird nachgewiesen, daß die monoklonalen Antikörper IVE-IIC6 und IVE-IV F4 verschiedene Epitope des Hotavirusantigens erkennen.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Rotaviren durch Immunisierung von 3alb/c-Mäusen mit Rotavirusantigen, Fusion ihrer Milzzellen mit murinen Myelomzellen mittels Polyethylenglykol, Selektion der antikörperproduzierenden Hybridome, Auswahl der spezifischen Hybridome mittels Sandwich-ELISA und ihre Kultivierung In-vitro oder in der Aszitesform durch Transplantation auf Mäuse, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunisierung der Balb/c-Mäuse mit dem humanen r.ct.avirusisolat R326 erfolgt, als Myelomzelle die FO-Zellinie eingesetzt wird und als spezifische Hybridome zur Produktion der monoklonalen Antikörper die Hybridome Il C6 (ZIM-0478) und IV F4 (ZIM-0479) ausgewählt werden.

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Die Erfindung betritt ein Verfahien zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Rotaviren. Anwendungsgebiet i'er Erfindung ist die medizinische und veterinärmedizinische Diagnostik.

   Charakteristik des bekrnnten Standes der Technik

   Rotaviren stellen die wichtigsten crreger einer akuten Gastroenteritis im Säuglings- und Kleinkindalter dar. Ähnliche Krankheitsbilder verursachen sie auch bei fast aller Tierarten, wobei die entstehenden Aufzuchtverluste bei Kälbern jnd Ferkeln wirtschaftlich bedeutungsvoll sind.

   Als Referenzmethode für den Nachweis von Rotaviren in Untersuchungsmaterialien gilt die Elektronenmikroskopie. Die Anzüchtung der Viren in Zellkulturen ist schwierig, langwierig und daher für den Routinenachweis ungeeignet. So kommt immunologischen Methoden die größte diagnostische Bedeutung zu. Die Zuverlässigkeit jeder immunologischen Methode zum Virusnachweis hängt wesentlich von der Qualität der Immunreagentien ab. Die hohe Spezifität der monoklonalen Antikörper überwindet hier frühere Probleme.

   Monoklonal Antikörper gegen Rotaviren gibt es seit 1982 (Gary, G.W. et al., Archives of Virology 72,223-227 (1982]). Für immunologische Nachweioverfahren sind monoklonale Antikörper vo'i Interesse, die kreuzreaktiv sind, also mit humanen und tierischen Rotaviren reagieren sowie alle 4 Serotypen der Rotaviren rrfassen. Hierbei handelt es sich um monoklonale Antikörper, die gegen die Proteinkomponente VP6 des inneren Kaps'.ds gerichtet sind, die bei Roiaviren aller Spezies vorhanden ist. Solche monoklonalen Antikörper werden in der Literatur beschrieben (Greenberg, H. B. et al., J. of Virology 47,267-275 [1983]; Taniguchi, K. etai., J. of Medical Virology 14,115-125 [1984]; Coulson,B.S.etal., J. of Virology 54,14-20 [1985]; Grunert, B. et al.. Eur. J. of Clin. Microbiol.6,136-141 [1987]). Die hier beschriebenen monoklonalen Antikörper werden nur in geringen Verdünnungen eingesetzt und benötigen lange Inkubationszeiten in c'^n verwendeten Testsystemen. Dies läßt auf einen geringen Antikörpergehalt in den verwendeten Präparaten bzw. auf eine geringe Affinität schließen. Angaben über die Eigenschaften der Hybridome (Medienansprüche, Vermehrungsrate, Kulturbedingungen, Stabilität), die diese monoklonalen Antikörper produzieren, fehlen völlig. Jedoch ist bekannt, daß die verwendeten Myelomzellinien, P3-X63-Ag8,653; NS-I; NS-O hohe Anforderungen an die Kulturbedingungen und Medien stellen.

   Ziel der Erfindung

   Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Rotaviren zur Verfügung zu stellen, bei dem Hybi idome eingesetzt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglicii ist. Die Hybridome sollen rotavii usspezifische mAK mit guten kreu/reaktiven Eigenschaften und hohen Titern erzeugen, die jeweils verschiedene Epitope des Rotavirus erkennen.

   Darlegung des Wesens der Erfindung

   Aufgabe der Erfindung ist es, stabile und hochproduktive Hybridome zu erzeugen, die keine hohen Anforderungen an Kulturbedingungen und Medien stellen. Die Aufgabe wird gelöst, indem man in an sich bekannter Weise Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mii Rotavirusantigen immunisiert wurden, mit Maus-Myelorruelleri mittels Polyethylenglykol fusioniert. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonaien Antikörpern gegen Rotaviren ist dadurch gekennzeichnet, daß das humane Rotavirusisolat R326 für die Immunisierung der Mäuse sowie als Myelomzellinie die Myelomzellinie FO verwendet werden. Die verwendete FO-Zellinie zeichnet sich durch eine gute Kultivierbarkeit sowie durch eine gute Fusionsrate und gute Klonierungseigenschaften aus. (Fazekas de St.Groth, S. and D.Soheidegger, J. of Immun. Meth.35,1-21 [1980]). Sie ist in allen Standardmedien (DMEM, RPM11640, Iscove's) ohne Adaptationszeit kultivierbar. Die erhaltenen Hybridome werden in Mikrotiterplatten kultiviert, antikörperproduziorende Klone werden mit einem Sandwich-ELISA nachgewiesen. Die gefundenen Hybridome werden kloniert und mittels Sandwich-ELiSA auf die Verwendungsfähigkeit für den vorgesehenen Einsatz geprüft. Die spezifischen Hybridklone werden vermehrt, und Anteile von ihnen werden als Zellkonserven in flüssigem Stickstoff gelagert. Die Produktion der monoklonalen Antikörper erfolgt entweder In-vitro in üblichen Zellkulturverfahren oder In-vivo in Aszitesflüssigkeit nach Transplantation in Balb/c-Mäuse.