DD230879A1

DD230879A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper fuer human-igm

Info

Publication number: DD230879A1
Application number: DD25464783A
Authority: DD
Inventors: Helmut Fiebig; Reinhard Gruhn; Ingrid Behn; Herwart Ambrosius
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1983-09-08
Filing date: 1983-09-08
Publication date: 1985-12-11
Also published as: DD230879B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer Human-IgM. Es ist das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer Human-IgM anzugeben, das die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen dieses spezifischen Antikoerpers gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualitaet gewaehrleistet sein, der Antikoerper soll stabil und lagerfaehig sein und sich zur einfachen und exakten Bestimmung von humanem IgM eignen. Die Aufgabe wird darin gesehen, Antikoerper hoher Affinitaet und guter Spezifitaet herzustellen. Die Aufgabe wird geloest, indem zunaechst ein Hybridom erzeugt, selektioniert, kloniert und rekloniert wird, das in der Lage ist, Antikoerper fuer Human-IgM zu sezernieren. Mit Hilfe dieses Hybridoms wird in vivo oder in vitro der Antikoerper BL-IgM/1 hergestellt. Er ist spezifisch, stabil und lagerfaehig.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die in der Lage sind, humanes IgM spezifisch zu bilden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt, konventionelle Antiseren gegen Human-lgM herzustellen. Diese Antiseren können zur Konzentrationsbestimmung von humoralen IgM und zur Bestimmung von Antikörpern der IgM-Klasse verwendet werden. Solche konventionellen Antiseren haben eine Reihe von Nachteilen. Dabei ist besonders die Unmöglichkeit einer exakten Reproduktion anzuführen, was eine Standardisierung nur begrenzt zuläßt. Die Ursache hierfür ist die äußerst heterogene humorale Immunantwort der Serumspendertiere. Die qualitative Zusammensetzung der Antiseren unterscheidet sich von Tier zu Tier, ja selbst von Blutabnahme zu Blutabnahme bei ein und demselben Individuum. Monoklonal Antikörper, die von einer permanent wachsenden Zellinie gebildet werden, überwinden diesen Nachteil.

Es ist bereits bekannt, monoklonaie Antikörper herzustellen. So haben Köhler und Milstein (Nature 256, (1975) 495) durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie eine Hybridzellinie erzeugt, die permanent wächst und stabil Antikörpersezerniert. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß verschiedene Hybridomlinien, die Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren, hergestellt worden sind. Es sind jedoch keine Hybridomlinien bekannt, die in hoher Ausbeute monoklonaie Antikörper vom Typ BL-IgM sezernieren, die spezifisch humanes IgM binden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung eines mo'noklonalen Antikörpers des Typs BL-IgM anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses spezifischen Antikörpers gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, der Antikörper soll stabil und lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem sensitiven und exakten Nachweistest für humanes IgM eignen, wobei Kreuzreaktionen mit anderen Immunglobulinen nicht vorkommen sollen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die für humanes IgM spezifisch sind, abzuwickeln. Das Verfahren soll in reproduzierbarer Weise Antikörper hoher Affinität und Spezifität liefern. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zunächst in an sich bekannter Weise eine Immunglobulinf raktion aus dem Serum eines Patienten mit Waldenströms Makroglobulinämie isoliert wird, z. B. durch Aussalzen. Aus dieser Immunglobulinfraktion wird durch tropfenweises Zugeben der Immunglobulinlösung in 2% Borsäure eine IgM-reiche Fraktion ausgefällt. Das Präzipitat wird in 0,1 M Tris/HCL-Puffer (pH 8,0) gelöst und durch Gelchromatographie an Sepharose 6B wird eine IgM-Präparation hergestellt.

Mit diesem IgM-Myelomprotein werden erfindungsgemäß Mäuse immunisiert. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet. Die 2. Immunisierung wird mit einem Waldenström-lgM vorgenommen, welches aus dem Serum eines anderen Patienten präpariert wird. Eine dritte Immunisierung wird wieder mit dem zuerst verwendeten Waldström- IgM durchgeführt. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P3-X-63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979], 1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (Littlefield, Science, 145, [1964], 709), werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß ein Zellklon selektioniert, der Antikörper der gewünschten Art sezerniert. Die Selektionierung des Hybridoms erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-jul-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit humanem IgM reagieren. Die Testung erfolgt zweckmäßigerweise mittels indirekter Radiobindungstechnik oder monoklonaler PAP-Technik. Als Antigen wird humanes IgM verwendet, das aus Serum von Patienten mit Waldenströms Makroglobulinämie präpariert wurde. Weitergezüchtet werden nur die Hybridome, die mit humanerem IgM, nicht aber mit humanen Immunglobulinen der Isotypen IgA, IgG, IgD, IgE reagieren. Die Bindung des Antikörpers erfolgt dabei an eine μ-kettenspezifische Determinante des IgM. — Auf die geschilderte Weise wird ein Hybridom selektioniert, das die wertvolle Eigenschaft hat. Antikörper zu produzieren, die spezifisch mit humanem IgM reagieren. Das Hybridom kann kloniertund rekloniert werden und ein Subklon wird erhalten, der stabil und mit guter Ausbeute die entsprechenden Antikörper sezerniert. Dieses Hybridom erhält die Bezeichnung H-BL-lgM/1. Es kann nach an sich bekanner Weise eingefroren werden und auf flüssigem Stickstoff gelagert werden.

Zur Herstellung des Antikörpers BL-lgM/1 wird das Hybridom H-BL-lgM/1 in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen werden. Nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SCU versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten. Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographie o. dgl. möglich. Der derart erzeugte monoklonaie Antikörper BL-lgM/1 gehört der lgG2a-Klasse an und ist potentiell in der Lage, Komplement zu binden.

Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle; Duibeccos MEM, RPM! o. dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640, das in einer bevorzugten Ausfühfungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5 · 10"⁵M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin versetzt ist.

Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20%. Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35⁰C und 38°C. Vorteilhaft ist es, bei 37°C zu arbeiten.

DerCCVGehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen sollte.

Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen. Anschließend wird ein Teii des Kulturmediums erneuert. Dabei ist die optimale Zelldichte wieder neu einzustellen. ' ·

In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird das Hybridom H-BL-lgM/1 in histokompatible A χ Balb/c-F_rMäuse i.p.

injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl.

vorbehandelt worden sind.

Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-lgM/1 enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen,z.B. durch Punktion.

Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z.B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen desHybridoms H-BL-lgM/1. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-lgM/1 enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o.

dgl. in Frage, die den Isotyp des BL-lgM/1 (lgG2a) spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die den Antikörper BL-lgM/1 antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10 mg BL-lgM/1 pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20mg/ml.

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z.B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO4-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH₄HCO₃-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei +4⁰C haltbar ist. Der monoklonal Antikörper besitzt das in der Tabejle 1 dokumentierte Bindungsmuster mit humanen Immunglobulinen.

Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

1. Ausführungsbeispiel ~ ~ ~~~~

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzellen H-BL-lgM/1 werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 χ 10⁵ Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und ingeeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert. Das Kulturmedium besteht aus RPMI-1640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l), Mercaptoethanol (5 χ 10"⁵M), Gentamycin (100mg/l) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird. Dieses Medium wird mit

a) fetalem Kälberserum oder

b) Pferdenormalserum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37⁰C in einer wassergesättigten 5%igen CCV Atmosphäre bebrütet werden.

Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenden Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussat in neue Kulturgefäße verwendet werden.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den monoklonalen Antikörper BL-lgM/1. Die Konzentration des Antikörpers BL-lgM/1 ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren von humanem IgM (wie z. B. enzymimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).

Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik (z. B. indirekte Radiobindungstechnik) bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.

Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.

Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobin-Antikörpervon den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begieitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 M KSCN oder Glycin/HCI-Puffer pH 2.8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.

2. Ausführungsbeispiel:

Eingesetzt werden Zellen des Hybridoms H-BL-lgM/1, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10⁵ bis 5 · 10⁷ lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatibie Mäuse werden FrHybride der Stämme A und Balb/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5 ml Paraffinum subliquidum i.p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung wurden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den monoklonalen Antikörper BL-lgM/1 enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.

Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des Hybridoms H-BL-lgM/1. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i.p.

injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.

Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH₄HCO₃-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophiiisierung. Der Antikörper BL-lgM/1 ist lyophilisiert bei +4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.

Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik bestimmt.

Tabelle 1

Reaktion des monoklonalen Antikörpers BL-lgM/1 mit humanen Immunglobulinen bzw. Polypeptidketten mittels indirekter Radiobindungstechnik.

Antigen l¹⁾

lgM(A)_Pra ²⁾ ' · +++

lgM{K)_Loh + + +

lgM(K)_Rom IgG³¹

I Sri

igG2_Bu

lgG2wai lgG3_Tök IgA

Yu IgE(X) _ND

/(-Kette⁴¹ A-Kette⁴

1) Zur Testung des monoklonalen Antikörpers BL-lgM/1 auf seine Reaktion mit den entsprechenden Antigenen wurden die Antikörper in PVC-Mikrotiterplatten, die mit den entsprechenden Antigenen beschichtet worden waren, inkubiert. Die gebundenen monoklonalen Antikörper wurden dann durch ¹²⁵J-markierte Anti-Maus-immunglobulin-Antikörper nachgewiesen. Der Bindungsindex I entspricht dem Verhältnis der Zählrate des gebundenen Antikörpers BL-lgM/1 zu der des monoklonalen Antikörpers BL-DNP/II, der als Kontrolle für die unspezifische Bindung dient, nach Entwicklung mit ¹²⁵J-markierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpem.

2) Die Indizes geben die Herkunft der Myelomproteine von entsprechenden Patienten an.

3) Humangammaglobulin der Firma SERVA, Heidelberg

4) Standard-A-bzw.-K-Präparationen der Behring-Werke AG, Marburg. Mischungen von mehreren Bence-Jones-Proteinen.

Claims

_!_ 546 Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Hersteilung monoklonaler Antikörper für Human-lgM, dadurch gekennzeichnet, daß Mäuse mit humanem IgM immunisiert werden, die Milzlymphozyten der hyperimmunen Mäuse mit Myelomzellen hybridisiert werden, Hybridomzellen H-BL-lgM/1 selektioniert werden, die selektionierten Hybridomzellen kultiviert oder in Mäuse injiziert, die Aszitesflüssigkeit gewonnen und der Antikörper BL-lgM/1 isoliert wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet werden.

3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Myelomzellen solche der Linie P3-X-63Ag8.653 eingesetzt wurden.

4. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunisierung der Mäuse durch eine Reihe von Injektionen mit dem humanen IgM erfolgt.

5. Verfahren nach Punkt 1,2,4, dadurch gekennzeichnet, daß die letzte Immunisierung 4 Tage vor der Isolierung derfürdie Hybridisierung bestimmten B-Lymphozyten vorgenommen wird.

6. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Myelomzellen und B-Lymphoblasten, die zur Fusion bestimmt sind, etwa 1:1 beträgt.

7. Verfahren nach Punkt 1,3,6, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt der Abtrennung der nicht hybridisierten Myelomzellen von den Hybridzellen das verwendete Kulurmedium Milzzellen von nicht immunisierten A χ Balb/c-F_r Hybridmäusen enthält.

8. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Prüfung der Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen auf die Anwesenheit von Antikörpern.die mit der/n-Kette reagieren, und damit die Auswahl geeigneter Hybridome H-BL-IgM bestimmt, durch indirekte Radiobindungstechnik öder monoklonale PAP-Technik bei Verwendung von IgM-Myelomproteinen und IgM, präpariert aus normalem Serum, erfolgt und der Nachweis des Nichtreagierens mit einer Serie von humanen Immunglobulinen der Isotypen IgG, IgA, IgD und IgE wird.

9. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Hybridom H-BL-lgM/1 selektioniert, kloniert, rekloniertwird und daß ein Subklon selektioniert wird, der stabil Antikörper BL-lgM/1 produziert.

10. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß antikörperproduzierende Hybridomzellen des Hybridoms H-BL-lgM/1 in einem Kulturmedium in Massenkultur angezogen werden, wobei dem Kulturmedium ein Serum zugesetzt wird, nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haltiger Atmosphäre das nunmehr antikörperhaltige Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten wird, aus der nach weiterer Aufarbeitung in an sich bekannterWeise der monoklonale Antikörper isoliert wird.

11. Verfahren nach Punkt 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o. dgl. eingesetzt wird.

12. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium RPMI-1640 verwendet wird.

13. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium 1OmM HEPES, 5 · 10"⁵M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin zugesetzt werden.

14. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Serum fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum eingesetzt werden.

15. Verfahren nach Punkt 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil des fetalen Kälberserums am Kulturmedium ca. 10%, der des Pferdenormalserums ebenfalls ca. 10% beträgt.

16. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierungstemperatur 35 bis 38°C beträgt.

17. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß bei 37°C kultiviert wird.

18. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der CCVGehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium 2 bis 10% beträgt. "~

19. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der CO₂-Gehalt über dem Kulturmedium 5% beträgt.

20. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß über dem Kulturmedium hohe Luftfeuchtigkeit herrscht, die bis zur Sättigung der Atmosphäre mit Wasserdampf reichen kann.

21. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß 3 bis 4 Tage kultiviert wird.

22. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Hybridom H-BL-lgM/1 in histokompatible A χ BALB/c-F_rMäuse i.p. injiziert wird, nach der Aszitesbildung die Aszitesflüssigkeit entnommen wird, die zellulären Bestandteile abgetrennt werden, der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-lgM/1 enthält, entweder direkt weiter verwendet wird oder Reinigungs- und Anreicherungsoperationen unterzogen wird oder durch Ausfällen der Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit z. B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung, Aufnehmen des Präzipitats in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, dialysieren gegen verdünnte NH₄HCO3-Lösung und anschließende Lyophilisierung in eine dauerhafte Aufbewahrungsform überführt wird.

23. Verfahren nach Punkt 1 und 22, dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennten zellulären Bestandteile, die hauptsächlich aus Zellen des Hybridoms H-BL-lgM/1 bestehen, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und erneut histokompatiblen Mäusen injiziert werden können·.

24. Verfahren nach Punkt 1 und 22, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl. vorbehandelt werden.

25. Verfahren nach Punkt 1 und 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß ein entsprechender Tumorstimulator-3 Tage bis 6 Wochen vor der Hybridominjekttion gegeben wird.

26. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der lyophilisierte Antikörper BL-lgM/1 bei +4⁰C aufbewahrt wird.