DE3888924T2

DE3888924T2 - Monoklonale Antikörper gegen Anthracycline.

Info

Publication number: DE3888924T2
Application number: DE3888924T
Authority: DE
Inventors: Andrea Balsari; Maria Ines Colnaghi; Mario Ghione
Original assignee: Istituto Nazionale per lo Studio e la Cura die Tumori
Current assignee: Istituto Nazionale per lo Studio e la Cura die Tumori
Priority date: 1987-11-17
Filing date: 1988-11-11
Publication date: 1994-08-11
Anticipated expiration: 2008-11-12
Also published as: ES2063017T3; US5286851A; JPH022394A; EP0316776A2; EP0316776A3; ATE103972T1; IT1223136B; IT8722661A0; DE3888924D1; EP0316776B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Hybridome, die monoclonale Antikörper sezernieren, die zur selektiven Bindung an Doxorubicin sowie an Analoga und Derivate davon fähig sind.
Die Erfindung betrifft auch die von den Hybridomen sezernierten monoclonalen Antikörper, die zur selektiven Bindung an Doxorubicin fähig sind. Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand wird durch die diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendungen der vorstehend erwähnten monoclonalen Antikörper bereitgestellt.
Die Entwicklung der somatischen Hybridisierungstechnik durch G. Köhler und C. Milstein (Nature, 256 (1975), 495-497) ermöglichte es, unbegrenzte Mengen monoclonaler Antikörper, d.h. Antikörper einer einzigen und bestimmten Spezifität, zu erhalten, die eine einzelne antigene Determinante erkennen.
Die Antikörper werden von Hybridzellen sezerniert, die aus der Fusion von Lymphocyten, die gegen das gewünschte Antigen sensibilisiert sind, mit einer Myelomzellinie mit spezifischen Eigenschaften stammen, wodurch den Antikörper-produzierenden Lymphocyten Unsterblichkeit verliehen wurde.
Tatsächlich zeigen die aus der Fusion stammenden Hybridzellen sowohl die Eigenschaften der Lymphocyten, Antikörper einer bestimmten Spezifität zu produzieren, als auch den unsterblichen Charakter der elterlichen Tumorzelle.
Die Hybridzellen werden dann cloniert, um Clone zu erhalten, die aus einer einzelnen Zelle stammen und nur eine Art von Antikörper produzieren. Der ausgewählte Clon, der den gewünschten Antikörper sezerniert, kann sowohl durch in-vivo-Transplantation in Mäuse ohne Thymus als auch durch in-vitro- Züchtung unbegrenzt lebensfähig gehalten werden. Auf diese Weise ist ein monospezifisches Reagenz, das zur Vermeidung von Kreuzreaktionen, die typisch für polyspezifische Seren sind, die zusätzlich zu dem gewünschten Reagenz zahlreiche Antikörperfamilien mit unterschiedlichen Spezifitäten enthalten, immer in praktisch unbegrenzten Mengen vorhanden.
Bisher sind monoclonale Antikörper beschrieben worden, die spezifisch für Antigene bakteriellen, viralen, humoralen (Hormone, Proteine) Ursprungs sind, oder solche, die aus Tumorgewebe stammen und die zum Beispiel für einen diagnostischen Zweck in immunoenzymatischen Systemen oder dergleichen, für einen präparativen Zweck, zum Beispiel zur Reinigung von Interferonen, Interleukinen, oder sogar für therapeutische Zwecke, zum Beispiel bei der extrakorporalen Behandlung von Knochenmark zur Entfernung neoplastischer Zellen oder als in-vivo-Träger cytotoxischer Mittel verwendet werden. Gemäß dem letzteren Aspekt ist die Verwendung von Antitumor-Wirkstoffen vorgeschlagen worden, die an gegen Tumorantigene gerichtete monoclonale Antikörper konjugiert sind. Es gibt sehr wenige Beispiele, wenn Überhaupt, für monoclonale Antikörper, die gegen niedermolekulare Verbindungen gerichtet sind, die schwach immunogen und insbesondere synthetischen, semi-synthetischen oder fermentativen (Antibiotika) Ursprungs sind.
Es ist ietzt überraschenderweise herausgefunden worden, daß es möglich ist, durch geeignete Modifikation der somatischen Hybridisierungstechnik gemäß der Erfindung Hybridome zu gewinnen, die Antikörper sezernieren, die fähig sind, selektiv an Doxorubicin sowie an Analoga und Derivate zu binden.
Doxorubicin, Daunomycin und das halb-synthetische Derivat Epirubicin sind Wirkstoffe, deren klinische Wirksamkeit allgemein bekannt ist und die zur chemischen Klasse der Anthracycline gehören; zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Stammverbindungen sind zahlreiche Verbindungen synthetisiert worden, mit dem Ziel, den therapeutischen Index zu erhöhen.
Die Verfügbarkeit von monoclonalen Antikörpern, die spezifisch für antigene Determinanten der Anthracyclinverbindungen sind, erlaubt unterschiedliche analytisch-diagnostische und/oder therapeutische Anwendungen.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit Doxorubicin oder einer anderen Anthracyclin- Verbindung, die mittels Carbodiimid an einen geeigneten Träger wie Rinderserumalbumin konjugiert wurde, erhalten worden (Hurxitz e coll., Cancer Res. 35 (1975), 1175).
Das Doxorubicin-Träger-Konjugat wurde nach Emulsion in komplettem Freundschem Adjuvans auf intramuskulärern subkutanem Weg subplantar in die Pfoten von BALB/c-Inzuchtmäusen verabreicht.
Die Immunisierung wurde am 14ten, 25ten, 26ten und 27ten Tag wiederholt.
Für die somatische Hybridisierung von Milzen, die aus den immunen Mäusen drei Tage nach der letzten Auffrischung entfernt worden waren, wurde eine zelluläre Suspension hergestellt, aus der die Erythrocyten durch zehnminütige Behandlung mit 0,17 M NH&sub4;Cl bei 4ºC entfernt wurden. 10&sup8; Milzzellen wurden nach dem Waschen mit einer mit Hank's-Salzlösung eingestellten Lösung zusammen mit 2 x 10&sup7; NS1-Mäusemyelomzellen in ein Teströhrchen gebracht. Diese Myelomlinie wurde auf RPMI-1640-Medium, das 10% fetales Kälberserum enthielt, gezüchtet.
Das Gemisch aus NS1- und Milzzellen wurde dann gemäß dem von Köhler und Milstein beschriebenen Verfahren behandelt. Nach der Hybridisierung wurden die Zellen, die in RPMI mit 20% fetalem Kälberserum resuspendiert waren, auf die Zellkultur-Mikroplatten mit 48 Vertiefungen (Costar, Cambridge, Mass. U.S.A.) in einer Menge von 400 000 Zellen pro Vertiefung, die mit 0,3 ml RPMI-Medium versetzt wurde, verteilt. Am darauffolgenden Tag wurden jeder Vertiefung 0,3 ml HAT-Lösung zugesetzt. Die Zellen wurden 15 Tage gezüchtet, wobei das Medium nach 7 Tagen gewechselt wurde.
Die Überstände jeder Vertiefung wurden dann mittels des immunoenzymatischen Tests (ELISA) auf die Produktion von Antikörpern gegen das Doxorubicin- Träger-Konjugat und den Träger allein getestet. Die in den Vertiefungen enthaltenen Hybridome, deren Überstand nur auf das Doxorubicin-Träger-Konjugat reagierte, wurden durch Reihenverdünnungen in Platten mit 96 Vertiefungen in Gegenwart von peritonealen Zellen von BALB/c-Mäusen als Nährmedium (Feeder-layer) cloniert.
Das RPMI-Medium, dem HAT und fetales Serum zugesetzt worden war, wurde 5 Tage durch RPMI + HT-Medium (J. W. Lifflefield, Science 145 (1964), 709-710) und fetales Serum, dann durch RPMI und fetales Serum ersetzt.
Die Produkte der auf diese Weise clonierten einzelnen Hybridome wurden weiter durch einen Radioisotop -Bindungstest unter Verwendung von Doxorubicin selbst und seiner Analoga und Derivate und einiger anderer chemotherapeutischer Mittel als Inhibitor charakterisiert.
In einer Reihe von monoclonalen Antikörpern, die positiv auf Doxorubicin sind, wurden durch die Analyse der Daten der Kreuzreaktion mit Doxorubicin- Analoga, die an einer oder mehreren Stellen modifiziert sind Antikörper identifiziert, die spezifisch gegen einige antigene Determinanten des Wirkstoffs gerichtet sind. Die ausgewählten Hybridome wurden
in vivo als peritoneales Transplantat in den zur Begünstigung der Ascitesbildung mit 2,6,10,14-Tetramethylpentadecan (Pristan) vorbehandelten BALB/c-Mäusen gehalten. Die erfindungsgemäß erhaltenen monoclonalen Antikörper können bei der Überwachung der chemotherapeutischen Behandlung oder als histopathologische Reagentien für die Bestimmung des Wirkstoffs in verschiedenen Geweben gemäß üblicher Verfahren verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper können auch verwendet werden, um die entweder systemische oder lokale Toxizität des Wirkstoffs zu modifizieren oder ihn zu den Zielzellen zu bringen oder als Reagentien in chemischen oder physikalischen Verfahren zur Gewinnung von Anthracyclinderivaten oder Komplexen davon.

Claims

1. Monoclonale Antikörper, die zur selektiven Bindung an Anthracyclinverbindungen fähig sind, erhältlich durch ein Verfahren, umfassend:

a) Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit einer Anthracyclinverbindung, die gegebenenfalls mit Hilfe von Carbodiimid mit Rinderserumalbuinin konjugiert wurde, wobei die Immunisierung am 14., 25., 26 und 27. Tag wiederholt wird;

b) Isolierung der Milzzellen aus der Milz der immunisierten Maus 3 Tage nach der letzten Auffrischung;

c) Fusion der Milzzellen, die gemäß b) erhalten wurden, mit NSI-Mäusemyelomzellen und Gewinnung von Hybridomen, die die gewünschten Antikörper sezernieren, gemäß üblicher Verfahren.

2. Monoclonale Antikörper nach Anspruch 1, die gegen Doxorubicin gerichtet sind.

3. Hybridome, die monoclonale Antikörper nach den Ansprüchen 1 oder 2 sezernieren.

4. Verfahren zur Herstellung von Hybridomen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß:

a) die Fusion von Milzzellen, die gegen die mit einem geeigneten Träger konjugierte Anthracyclinverbindung immun sind, mit NS1-Myelomzellen gemäß Anspruch 1 durchgeführt wird,

b) die Überstände der Kulturen der so erhaltenen Hybridome parallel gegen das Träger-Anthracyclin-Konjugat und gegen den Träger getestet werden, um Hybridome auszuscheiden, die gegen den Träger selbst reaktiv sind;

c) die so ausgewählten Hybridome weiterhin durch einen Hemmtest mit der Anthracyclinverbindung in einem Radioisotop-Bindungstest charakterisiert werden.