DE68904336T2 - Anti-humankrebsproteinkomplexe, deren herstellung und verwendung. - Google Patents

Anti-humankrebsproteinkomplexe, deren herstellung und verwendung.

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DE68904336T2 DE8989106024T DE68904336T DE68904336T2 DE 68904336 T2 DE68904336 T2 DE 68904336T2 DE 8989106024 T DE8989106024 T DE 8989106024T DE 68904336 T DE68904336 T DE 68904336T DE 68904336 T2 DE68904336 T2 DE 68904336T2
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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuen Proteinkomplex, welcher als ein therapeutischer Wirkstoff gut gegen Krebs wirkt, und insbesondere auf einen Anti-Human- Krebs-Protein-Komplex, welcher (a) einen Liganden, der zum Binden an menschliche Krebszellen befähigt ist, (b) einen Liganden, welcher zum Binden an Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A (nachfolgend auch PEA abgekürzt) befähigt ist, und (c) an den Liganden (b) gekuppeltes Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A (PEA) umfaßt, und auf ein Verfahren zur Herstellung des Protein-Komplexes.
  • Die Krebsbehandlung ist in verschiedenen Untersuchungen seit langem untersucht worden. Eine Anzahl von Verbindungen ist zur Verwendung als Chemotherapeutika mit dem Ziel der selektiven Zerstörung von Krebszellen vorgeschlagen worden. Diese Versuche haben zu Erfolgen in gewissem Ausmaß geführt, jedoch ist bei derartigen Verbindungen oft eine nichtspezifische Toxizität gegen normale, sich stark vermehrende Zellen, z.B. Blutstammzellen, beobachtet worden. Die Anwendbarkeit ist daher begrenzt gewesen; insbesondere sind diese Verbindungen für die Verwendung bei der Beseitigung von Krebszellen im Endstadium unbefriedigend gewesen.
  • Mit dem Ziel, eine derartige nichtspezifische Toxizität von Antikrebsmitteln gegenüber normalen Zellen, insbesondere Nebenwirkungen, abzuschwächen, sind Versuche unternommen worden, Antikörper zu verwenden, welche eine Richtfähigkeit auf Krebszellen als Antikrebsmittel-Trägermolekül zeigen, um das Antikrebsmittel auf den Zielzellen zu fixieren. Die für diesen Zweck verwendeten Antikrebsmittel sind cytotoxische Proteine (z.B. Ricin A-Kette, Diphtherietoxin A-Kette und PEA), aber ihre Anwendung ist aufgrund der nachstehend gezeigten Nachteile begrenzt.
  • Es ist bekannt, daß Ricin A- und Diphtherietoxin A-Ketten beide starke, die Proteinsynthese hemmende Wirksamkeiten besitzen, daß ihre Antikrebswirksamkeiten aber schwach sind, da sie nicht reibungslos auf Ribosomen transferieren, selbst wenn sie über Antikörper in die Zellen eingeführt werden. Auf der anderen Seite transferiert PEA leicht auf Ribosomen an der Zielstelle, nachdem es in die Zellen eingeführt wurde, und zeigt somit sowohl sehr starke cytotoxische Wirkungen als auch starke, die Proteinsynthese hemmende Wirkungen. Es wird erwartet, daß der Proteinkomplex aus dem Antikrebs-Antikörper und PEA aufgrund einer rezeptorvermittelten, nichtspezifischen Toxizität ernste nachteilige Nebenwirkungen besitzt, da er nicht nur eine antikörpervermittelte sondern auch eine PEA-rezeptorvermittelte Cytotoxizität besitzt. Außerdem exprimieren normale menschliche Zellen meistens einen PEA-Rezeptor. Angesichts dieser Situation sind auch Versuche unternommen worden, die Cytotoxizität gegenüber normalen menschlichen Zellen durch Modifizieren des PEA zu verringern [R. Pirker et al., Journal of Clinical Investigation, 76, 1261 (1985); R. Pirker et al., Cancer Research, 45, 751 (1985)], aber es sind keine befriedigenden Ergebnisse erhalten worden.
  • Ein weiterer bedeutender Nachteil bei Verwendung von Antikrebs- Antikörpern als Antikrebsmittel liegt in der Tatsache, daß diese Antikörper zum größten Teil monoklonale Maus- oder Ratten-Antikörper sind, d.h. Proteine, welche gegenüber Menschen heterogen sind. Der Transfer heterogener Proteine auf menschliche Körper wirft das Problem möglicher ernster nachteiliger Nebenwirkungen auf, wie etwa anaphylaktische und andere allergische Reaktionen.
  • Die WO-A-88 00703 bezieht sich auf ein immuntoxisches Konjugat, welches aus einem monoklonalen Anti-Human-Ovarkrebszellen-Antikörper und darauf chemisch gebundenem Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin besteht, und seine Verwendung als zellspezifische Krebstherapie.
  • Die US-A-4 545 985 bezieht sich auf ein immuntoxisches Konjugat, welches Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin umfaßt, das an ein Krebszellinien-Bindungsprotein, wie etwa einen monoklonalen Antikörper gegen menschliche Tumorzellen, gebunden ist.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
  • Fig. 1 zeigt die Cytotoxizität des in Beispiel 7 erhaltenen Anti-Human-Krebs-Proteinkomplexes.
  • Fig. 2 zeigt die Cytotoxizität des in Beispiel 8 erhaltenen Anti-Human-Krebs-Proteinkomplexes.
    • GENAUE BESCHREIBUNG
  • Mit diesem technischen Hintergrund stellten die vorliegenden Erfinder transformierte Epstein-Barr-Virus- (nachfolgend auch als EBV abgekürzt) -Zellen, welche einen monoklonalen Anti- Human-Krebs-Human-Antikörper oder einen monoklonalen Anti-PEA- Human-Antikörper sekretieren, und ein Hybridom aus diesen Zellen und Human B-Lymphoblast-Zellen her, untersuchten sie und fanden, daß der Protein-Komplex, welcher drei Bestandteile umfaßt, nämlich diese zwei monoklonalen Antikörper (nachfolgend auch als MoAb abgekürzt) und PEA, weder auf normalen Geweben noch normalen Zellen, sondern spezifisch auf dem Zielkrebsgewebe oder den -zellen wirksam ist.
  • Die vorliegenden Erfinder stellten durch Zellfusion der vorstehend erwähnten transformierten EBV-Zellinien, welche jeweils die vorstehenden zwei Typen Human-MoAb oder Hybridome der Zellinien und Human B-Lymphoblast-Zellen produzieren, auch ein Hybridom her, welches einen heteroaktiven, zweiwertigen Hydrid-Antikörper produziert, ein neuer Typ Antikörper, welcher auf Krebszellen an einer Antigen-Bindungsstelle reagiert, während er das PEA-Molekül an der anderen Antigen-Bindungsstelle neutralisiert und immobilisiert, und fanden, daß der Protein-Komplex, welcher den Hybrid-Antikörper und PEA umfaßt, als ein sehr hochselektives Antikrebsmittel wirken kann. Die vorliegenden Erfinder führten auf der Grundlage dieser Befunde weitere Untersuchungen durch und entwickelten die vorliegende Erfindung.
  • Dementsprechend umfaßt die vorliegende Erfindung einen Anti- Human-Krebs-Protein-Komplex, welcher (a) einen Liganden, welcher zum Binden an menschliche Krebszellen befähigt ist, (b) einen Liganden, welcher zum Binden an Pseudomonas aeruginosa- Exotoxin A (PEA) befähigt ist, und (c) an den Liganden (b) gekuppeltes Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A (PEA) umfaßt.
  • Beispiele des vorstehend erwähnten Anti-Human-Krebs-Protein- Komplexes schließen 1) den Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex, welcher einen Protein-Komplex umfaßt, der durch kovalentes Binden eines monoklonalen Anti-Human-Krebs-Human-Antikörpers und Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A und immunologisches Kuppeln eines monoklonalen Anti-Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A-Human-Antikörpers daran erhalten wurde, 2) den Anti-Human- Krebs-Protein-Komplex, welcher einen Protein-Komplex umfaßt, der durch kovalentes Binden eines monoklonalen Anti-Human- Krebs-Human-Antikörpers und monoklonalen Anti-Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A-Human-Antikörpers und immunologisches Kuppeln von Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A daran erhalten wurde, und 3) den Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex, welcher einen heteroaktiven, zweiwertigen, monoklonalen Hybrid-Human- Antikörper, welcher zum Binden sowohl an menschliche Krebszellen als auch an Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A auf jedem Molekül befähigt ist, und daran immunologisch gekuppeltes Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A umfaßt, ein.
  • Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A, wie in der vorliegenden Erfindung darauf Bezug genommen wird, schließt die durch das von Pseudomonas aeruginosa [M.L. Vasil, D. Kabat, B.H. Iglewski, Infection and Immunity, 16, 353 (1977); G.L. Gray et al., Proceedings of National Academy of Science, USA, 81, 2645 (1984)] produzierte Exotoxin A veranschaulichten Toxine ein.
  • Als Ligand, welcher an menschliche Krebszellen bindet, kann jeder Ligand verwendet werden, welcher zum spezifischen Binden an menschliche Krebszellen befähigt ist. Beispiele derartiger Liganden schließen monoklonale Anti-Human-Krebs-Human-Antikörper und ihre Fragmente ein, welche zum Binden an menschliche Krebszellen befähigt sind (z.B. Fab-, Fab'- und F(ab')&sub2;Fragmente). Monoklonale Anti-Human-Krebs-Human-Antikörper, welche zum Binden an Magenkrebszellen, Lungenkrebszellen oder Epidermiskarzinomzellen bef ähigt sind, sind bevorzugt. Ein repräsentatives Beispiel ist der in den nachstehend mitgeteilten Beispielen erhaltene monoklonale Anti-Human-Krebs-Human- Antikörper AGC-78.
  • Als Ligand, welcher an Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A bindet, kann jeder Ligand verwendet werden, welcher zum spezifischen Binden an Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A befähigt ist. Beispiele derartiger Liganden schließen monoklonale Anti- Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A-Human-Antikörper und ihre Fragmente ein (z.B. Fab-, Fab'- und F(ab')&sub2;-Fragmente usw.).
  • Monoklonale Anti-Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A-Human-Antikörper mit einer solchen Fähigkeit, daß 100 ng des Antikörpers mehr als 10 ng Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A neutralisieren können, sind bevorzugt. Repräsentative Beispiele sind die in den nachstehend mitgeteilten Beispielen erhaltenen monoklonalen Anti-Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin-Human-Antikörper P7E9C7 und PEA7-1-6D.
  • EBV-transformierte Zellinien oder Hybridome, welche die vorstehend erwähnten monoklonalen Anti-Human-Krebs-Human-Antikörper oder monoklonalen Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A-Human- Antikörper produzieren, können durch bekannte Verfahren hergestellt werden. Beispiele von Verfahren, welche verwendet werden können, schließen dasjenige ein, in welchem Antikörper produzierende Lymphzellen mit EBV infiziert werden, um sie in proliferierende Zellen zu transformieren, gefolgt vom Klonen, und dasjenige, in welchem eine auf diese Weise erhaltene EBV- transformierte Zellinie weiter der Zellfusion mit einer Human B-Lymphoblast-Zellinie unterzogen wird, gefolgt von der Selektion und dem Klonen des gewünschten, Antikörper produzierenden Human-Human-Hybridoms.
  • Die Antikörper produzierenden Lymphzellen für diese Verfahren können von jeglicher Herkunft sein, einschließlich menschlichem, peripherem Blut, Lymphknoten und Milz.
  • Beispiele der als Elternlinie verwendeten Human B-Lymphoblast- Zellinie schließen HAT- (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin) - sensitive, ouabainresistente TAW-925 (IFO 50095) [Y. Ichimori et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 142, 806 (1987)] ein.
  • Beispiele von durch die vorstehenden Verfahren erhaltenen EBV- transformierten Zellinien oder Hybridomen schließen das einen monoklonalen Anti-Human-Krebs-Human-Antikörper produzierende Human-Human-Hybridom AGC-78 (FERM BP-1812, IFO 50165), welches auf Magenkrebszellen (NUGC-4), Lungenkrebszellen (LU-134) oder Epidermiskarzinomzellen (A431) reagiert, die einen monoklonalen Anti-PEA-Human-Antikörper produzierende EBV-transformierte Zellinie PEA-7-1-6D (FERM BP-1809, IFO 50138) und das einen monoklonalen Anti-PEA-Human-Antikörper produzierende Human- Human-Hybridom P7E9C7 (FERM BP-1810, IFO 50139) ein, von denen alle in den nachstehend mitgeteilten Beispielen erhalten werden können.
  • Die erwünschten menschlichen monoklonalen Antikörper können durch Kultivieren dieser Zellinien oder Hybridome in vitro oder in vivo und darauffolgendes Reinigen der hergestellten menschlichen monoklonalen Antikörper durch bekannte Verfahren hergestellt werden.
  • Der monoklonale Anti-Human-Krebs-Human-Antikörper AGC-78 besitzt insofern Eigenschaften, welche für den Zweck der vorliegenden Erfindung geeignet sind, als daß er ein Antikörper des IgG-Typs ist, welcher eine Spezifität auf und eine sehr hohe Affinität gegenüber den vorstehend erwähnten Krebszellen besitzt. Ferner sind der monoklonale Anti-PEA-Human-Antikörper PEA7-1-6D und P7E9C7 beides Antikörper vom IgG-Typ, welche eine hohe Affinität gegenüber PEA besitzen und 100 ng von jedem sind befähigt, mehr als 10 ng PEA zu neutralisieren, wenn sie in dem Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex der vorliegenden Erfindung enthalten sind. Diese Antikörper hemmen die nichtspezifische Cytotoxizität von PEA völlig und wirken auf diese Weise wirksam beim Unterdrücken des Auftretens von nachteiligen Nebenwirkungen vor dem Erreichen des Zielorgans, -gewebes oder -zelle.
  • In der vorliegenden Erfindung können verschiedene bekannte Verfahren zum Bilden des Protein-Komplexes verwendet werden, welcher aus kovalent gebundenem monoklonalem Anti-Human- Krebs-Human-Antikörper und PEA und kovalent gebundenem monoklonalem Anti-Human-Krebs-Human-Antikörper und monoklonalem Anti-PEA-Human-Antikörper besteht [V.P. Butler, Pharmacological Review, 29, 103 (1978); T. Kitagawa, Yuki Gosei Kagaku, 42, 283 (1984) usw.]. Beispiele von Verfahren, welche verwendet werden können, schließen 1) das Verfahren, in welchem ein monoklonaler Anti-Human-Krebs-Human-Antikörper mit N-Succinimidyipyridyldithiopropionat (nachfolgend auch SPDP abgekürzt) modifiziert und reduziert wird, wonach er PEA oder einem Anti-PEA-Antikörper zugesetzt wird, welche jeweils zuvor ebenfalls mit SPDP modifiziert wurden, gefolgt von einer Thiol- Austauschreaktion unter Ergeben eines Protein-Komplexes, 2) das Verfahren, in welchem ein monoklonaler Anti-Human-Krebs- Human-Antikörper mit SPDP modifiziert und reduziert wird, wonach er PEA oder einem monoklonalen Anti-PEA-Human-Antikörper zugesetzt wird, welche jeweils zuvor mit N-(m-Maleimidobenzoyloxy)succinimid (nachfolgend auch MBS abgekürzt) maleimidiert wurden, gefolgt von einer Thioether-Verknüpfungsreaktion unter Ergeben eines Protein-Komplexes, 3) das Verfahren, in welchem ein monoklonaler Anti-Human-Krebs-Human-Antikörper pepsiniert und unter Ergeben von Fab'-SH reduziert wird, gefolgt von der Zugabe von PEA oder eines monoklonalen Anti- PEA-Human-Antikörpers, welche jeweils zuvor maleimidiert oder mit SPDP modifiziert wurden, unter Ergeben eines Protein-Komplexes und 4) das Verfahren, in welchem ein monoklonaler Anti- Human-Krebs-Human-Antikörper und PEA oder ein monoklonaler Anti-PEA-Human-Antikörper in Anwesenheit von Glutaraldehyd unter Ergeben eines Protein-Komplexes polymerisiert werden, ein. Außer dem vorstehend erwähnten MBS können N-(γ-Maleimidobutyryloxy)succinimid (nachfolgend auch GMBS abgekürzt), N- (ε-Maleimidocaproyloxy)succinimid und andere Maleimidierungsmittel ebenfalls verwendet werden. In den vorstehend erwähnten Verfahren können die Antikörper-Fragmente F(ab')&sub2;, Fab' und Fab" anstelle des Antikörpers IgG verwendet werden. Es ist auch möglich, Protein-Komplexe durch Behandeln von Kombinationen eines monoklonalen Anti-Human-Krebs-Human-Antikörpers und eines monoklonalen Anti-PEA-Human-Antikörpers in einer gänzlich reziproken Weise zu bilden.
  • Durch Zusatz eines Anti-PEA-Human-MoAb zu dem Protein-Komplex eines Anti-Human-Krebs-Human-MoAb und PEA oder von PEA zu dem Protein-Komplex eines Anti-Human-Krebs-Human-MoAb und Anti- PEA-Human-MoAb, gefolgt von der Reaktion bei 5 bis 37ºC über 30 Minuten bis 20 Stunden, vorzugsweise 2 Stunden bei 5 bis 20ºC, gebildete Immunkomplexe können als ein Anti-Human-Krebs- Protein-Komplex der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Da diese Reaktionen sehr hochspezifisch sind, ist es nicht immer notwendig, Anti-PEA-Human-MoAb oder PEA mit hoher Reinheit zu verwenden und außerdem kann der erwünschte Komplex einfach durch Mischen erhalten werden.
  • Das Hybridom der vorliegenden Erfindung, welches einen heteroaktiven, zweiwertigen monoklonalen Hybrid-Human-Antikörper produziert, kann durch Fusionieren einer Anti-Human-Krebs-Human-MoAb produzierenden Zelle und einer Anti-PEA-Human-MoAb produzierenden Zelle durch ein bekanntes Verfahren [G. Köhler und C. Milstein, Nature, 256, 495 (1975); J.T. Wang und R.B. Colvin, Journal of Immunology, 139, 1369 (1987)] erhalten werden. Zum Beispiel werden Lymphocyten aus menschlichem peripherem Blut oder Lymphocyten aus dem Lymphknoten eines Krebspatienten mit EBV transformiert, wonach sie mit der HAT- (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin) -sensitiven, ouabainresistenten Human B-Lymphoblast-Zellinie TAW-925 durch ein bekanntes Verfahren fusioniert werden. Die auf diese Weise erhaltenen Hybridom-Zellen werden in HAT-Ouabain enthaltendem Medium (HAT- O-Medium) kultiviert, gefolgt von der Selektion und dem Züchten Anti-Human-Krebs-Human-MoAb produzierender Klone. Getrennt werden Pseudomonas aeruginosa-sensibilisierte Lymphocyten aus menschlichem peripherem Blut mit EBV in proliferative Zellen transformiert, dann werden Anti-PEA-Human-MoAb produzierende Klone selektiert und gezüchtet. Um ein Hybrid-Hybridom herzustellen, welches einen monoklonalen Hybrid-Human-Antikörper produziert, wird die vorstehend erwähnte Anti-PEA-Human-MoAb produzierende, EBV-transformierte Zellinie stufenweise an ein Kulturmedium angepaßt, welches mit 8-Azaguanin (nachfolgend auch 8-AZG abgekürzt) ergänzt wurde, um sie erneut gegen HAT sensitiv zu machen, wonach sie mit der vorstehend erwähnten Anti-PEA-Human-MoAb produzierenden EBV-transformierten Zellinie fusioniert wird. Die Hybrid-Hybridom-Selektion wird an HAT-O-Medium ausgeführt, um das Hybridom zu selektieren und zu klonen, welches einen monoklonalen Hybrid-Human-Antikörper sekretiert, welcher sowohl eine Bindungsfähigkeit an menschliche Krebszellen als auch eine Bindungsfähigkeit an PEA besitzt.
  • Verfahren, welche anstelle des vorstehenden Verfahrens auf die Herstellung Hybrid-Human-MoAb produzierender Hybridome anwendbar sind, schließen 1) das Verfahren, in welchem eine Anti-Human-Krebs-Human-MoAb produzierende EBV-transformierte Zellinie und eine Anti-PEA-Human-MoAb produzierende EBV-transformierte Zellinie fusioniert werden, 2) das Verfahren, in welchem eine Anti-Human-Krebs-Human-MoAb produzierende EBV-transformierte Zellinie und ein Anti-PEA-Human-MoAb produzierendes Human-Human-Hybridom fusioniert werden (Triom-Herstellung) und 3) das Verfahren, in welchem ein Anti-Human-Krebs-Human-MoAb produzierendes Human-Human-Hybridom und ein Anti-PEA-Human-MoAb produzierendes Human-Human-Hybridom fusioniert werden (Tetraom-Herstellung) ein.
  • Der vorstehend erwähnte monoklonale Hybrid-Human-Antikörper kann auch durch chemisches Binden eines monoklonalen Anti-Human-Krebs-Human-Antikörpers und eines monoklonalen Anti-PEA- Antikörper-Fragments (z.B. Fab-, Fab'-, F(ab')&sub2;-Fragmente) gemäß dem in M.J. Glennie et al., Journal of Immunology, 139, 2367 (1987) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Heteroaktive, zweiwertige Hybrid-Antikörper-Fragmente (z.B. F(ab')&sub2;-Fragment), welche sowohl zum Binden an menschliche Krebszellen als auch an Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A auf jedem Molekül befähigt sind, können anstelle des vorstehend erwähnten monoklonalen Hybrid-Human-Antikörpers für denselben Zweck verwendet werden.
  • Beispiele EBV-haltiger Materialien, welche für das vorstehend erwähnte Verfahren verwendet werden können, schließen den Kultur-Überstand der Krallenaffen-Zellinie B95-8 [Proceedings of National Academy of Science, USA, 70, 190 (1973)] ein. Die Transformation kann durch Zusatz einer geeigneten Menge des Kultur-Überstands der Krallenaffen-Zellinie B95-8 zu einer Suspension von 0,5 bis 5 x 10&sup7; Zellen/ml, vorzugsweise 1 x 10&sup7; Zellen/ml, Antikörper produzierenden Lymphzellen und Durchführen der Infektion durch leichtes Schütteln bei 37ºC über 1 Stunde, gefolgt von der Kultivierung über 5 bis 30 Tage durchgeführt werden.
  • Die Zellfusion der vorstehend erwähnten EBV-transformierten Zellinien, Human B-Lymphoblast-Zellinien, Antikörper produzierenden Human-Human-Hybridome usw. kann mittels eines Fusogens, wie etwa Sendai-Virus oder Polyethylenglykol (nachfolgend auch PEG abgekürzt), oder elektrischer Stimulation durchgeführt werden. PEG wird vorzugsweise verwendet; seine Verwendung wird nachstehend veranschaulicht, aber die vorliegende Erfindung ist nicht darauf beschränkt. Eine wirksame Fusion kann durch Halten der Zellen in Kontakt mit PEG mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 6000 bei einer Konzentration von 10 bis 80% über 0,5 bis 30 Minuten, vorzugsweise PEG 6000 zu 35 bis 55% über 4 bis 10 Minuten bei 37ºC, erreicht werden.
  • Die Hybridom-Selektion kann durch Verwenden von HAT-O-Medium erreicht werden. Zu diesem Zweck werden durch das chemische Anpassungsverfahren mittels 8-AZG, 6-Thioguanin (6-TG), 5- Bromdesoxyuridin oder Ouabain entsprechende chemikalienresistente Transformanten erhalten. Es werden verschiedene Selektionsmedien verwendet, da neue Marker in die Zellen eingeführt werden. Beispiele derartiger Medien schließen mit Neomycin oder Hygromycin B [B. Sugden et al., Nolecular and Cellular Biology, 5, 410 (1985)] ergänzte Medien ein.
  • Zum Screenen Antikörper produzierender Zellen können verschiedene Verfahren verwendet werden. Beispiele von Verfahren zur Bestimmung eines monoklonalen Anti-Human-Krebs-Human-Antikörpers schließen das gemischte Blutgerinnungsverfahren (nachfolgend auch MHA abgekürzt), in welchem der Antikörper durch die Adsorption von Indikator-Erythrocyten an Tumorzellen nachgewiesen wird, und das Zell-ELISA-Verfahren ein, in welchem ein an Tumor-Zellen gebundener Antikörper, welcher an einer Mikroplatte haftet, durch einen Enzym-Immunassay (nachfolgend auch ELISA abgekürzt) nachgewiesen wird. Um Anti-PEA-Human-MoAb zu bestimmen, ist ein ELISA mittels einer Mikroplatte, auf welcher PEA als das Festphasen-Antigen adsorbiert ist, bevorzugt.
  • Um den Hybrid-Antikörper zu bestimmen, kann als Abänderung des Zell-ELISA-Verfahrens ein System, in welchem der Antikörper in der Hybridom-Kultur-Überstandsprobe an Tumor-Zellen gekuppelt wird, welche an einer Mikroplatte haften, gefolgt von der Zugabe von enzymmarkiertem PEA, anstelle der zwei vorstehend erwähnten Verfahren verwendet werden.
  • Die EBV-transformierte Zellinie oder das Hybridom mit positiver Antikörper-Wirksamkeit werden unmittelbar dem Klonen unterzogen, welches leicht, gewöhnlich durch Grenzverdünnungsanalyse, durchgeführt werden kann. Der Kulturüberstand der geklonten EBV-transformierten Zellinie oder des Hybridoms wird durch irgendeines der vorstehend erwähnten Verfahren auf den Antikörper-Gehalt untersucht und eine EBV-transformierte Zelllinie oder ein Hybridom, welches beständig einen Antikörper mit einem hohen Gehalt produziert, wird ausgewählt, wobei die erwünschte monoklonale EBV-transformierte Zellinie oder das Hybridom erhalten werden können.
  • Die vorstehend erwähnte EBV-transformierte Zellinie oder das Hybridom können wie folgt kultiviert werden.
  • Die Kultivierung wird normalerweise in einem flüssigen Medium oder in der Bauchhöhle eines Tieres (üblicherweise einem Säuger, wie etwa einer nackten Maus) ausgeführt. Ein Beispiel einer Kultivierung in einem flüssigen Medium wird nachstehend beschrieben.
  • Beispiele für das Medium schließen ein mit fetalem Rinderserum ergänztes Grundmedium für die Tierzellenkultivierung [gemischtes Medium (I-H-Medium) aus Iscove-Medium - Ham F12-Medium 1:1, RPMI 1640-Medium, usw.] und GIT-Medium (im Handel von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan, erhältlich) (eine von einem Säugerserum stammende Zusammensetzung zur Tierzellenkultivierung, hergestellt durch Unterziehen von Säugerserum einer Reinigungsbehandlung einschließlich eines Inaktivierungsverfahrens für verunreinigende Mikroorganismen und eines Aussalz-/Entsalzungsverfahrens; vgl. die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 145088/1985) ein.
  • Die Kultivierung wird normalerweise bei 30 bis 38ºC, vorzugsweise bei 37ºC, über 3 bis 60 Tage, vorzugsweise 5 bis 10 Tage, durchgeführt.
  • Die Reinigung des Antikörpers in der Kulturbrühe kann durch Kombinieren bekannter biochemischer Techniken erreicht werden.
  • Zum Beispiel wird die Zellkulturbrühe zentrifugiert, um den Kulturüberstand abzutrennen, welcher darauf gesammelt wird und dem Aussalzen (üblicherweise mit Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat) unterzogen wird. Die auf diese Weise erhaltene Protein-Fällung wird in einer geeigneten Lösung gelöst und dialysiert, wonach sie der Säulenchromatographie (Ionenaustauschsäule, Gelfiltrationssäule, Protein A-Säule, Hydroxylapatit- Säule usw.) unterzogen wird, wodurch der erwünschte Antikörper abgetrennt und gereinigt werden kann. Zum Beispiel können nach dem vorstehenden Trenn- und Reinigungsverfahren 1 bis 30 mg monoklonaler Anti-Human-Krebs-Human-Antikörper, monoklonaler Anti-Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A-Human-Antikörper oder monoklonaler Hybrid-Human-Antikörper mit einer Reinheit von über 80%, als Proteingewichtsverhältnis berechnet, aus 6 l des Kulturüberstands erhalten werden. Außerdem umfaßt diese gereinigte Antikörper-Zubereitung weniger als 0,1% des Gehalts an Rinder-Serumalbumin und Rinder-Serumglobulin, beides fremde Proteine, und ist frei von der Möglichkeit der EBV-Kontamination. Diese Merkmale sind vorteilhaft, wenn die Zubereitung zum Beispiel als therapeutischer Wirkstoff verabreicht wird.
  • Der auf diese Weise erhaltene MoAb kann einer Behandlung mit einem proteolytischen Enzym (z.B. Papain, Pepsin) oder einer Behandlung mit einem Reduktionsmittel unterzogen werden und dadurch ein Fab-, Fab'- oder F(ab')&sub2;-Fragment ergeben, welche eine Bindungswirksamkeit gegenüber menschlichen Krebszellen und/oder PEA besitzen, von denen alle für denselben Zweck wie der menschliche MoAb der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
  • Der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Anti-Human- Krebs-Human-MoAb erkennt spezifisch das mit dem Tumor verbundene Antigen auf der Oberfläche von Tumorzellen und bindet an diese Zellen, aber nicht an normale Zellen. Ferner erkennt der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Anti-PEA-Human- MoAb spezifisch die Antigen-Determinante des PEA-Moleküls, wodurch er eine starke Bindungsaktivität gegenüber PEA zeigt. Der Hybrid-Human-NoAb besitzt die Antikörpereigenschaften der zwei vorstehenden Antikörper. Diese Antikörper sind zur Verwendung als biochemische Zubereitungen sehr geeignet, da sie homogen und wirkungsvoll sind.
  • Wenn der Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex der vorliegenden Erfindung sowohl einen monoklonalen Anti-Human-Krebs-Human-Antikörper oder sein Fragment, welche zum Binden an menschliche Krebszellen befähigt sind, und einen monoklonalen Anti- Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A-Human-Antikörper oder sein Fragment enthält, welche zum Binden an Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A befähigt sind, ist es bevorzugt, daß das Molverhältnis im Bereich von 4:1 bis 1:4, bevorzugter 2:1 bis 1:2, und idealerweise 1:1, liegt. Es ist ebenfalls bevorzugt, daß das letztere Fragment mit 1 bis 8 Molekülen, bevorzugter 1 bis 2 Molekülen, Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A gekuppelt ist.
  • Der Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel als solcher oder als durch Mischen des Komplexes mit einem geeigneten Träger, Exzipienten oder Verdünner, welcher für Säuger (Mäuse Ratten, Katzen, Hunde, Schwein, Rind, Affen und Menschen) annehmbar ist, hergestellte Injektion nach Keimentfernung durch Filtration über ein Membranfilter verabreicht werden.
  • Mit den cytotoxischen Wirkungen von PEA erlaubt der Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex der vorliegenden Erfindung die Behandlung verschiedener Krebse einschließlich Magenkrebs und Krebs von Lunge, Leber, Dickdarm, Gebärmutter, Bauchspeicheldrüse, Niere, Gallenblase, Prostata und Haut; falls erwünscht, kann er weiter mit anderen Antikrebsmitteln als PEA (z.B. Antikrebs-Chemotherapeutika, wie etwa Methotrexat, Daunomycin, Vincristin und Cisplatin; cytotoxische Proteine, wie etwa Ricin, Abrin, Diphtherie-Toxin und Neocarzinostatin, und Cytokinen, wie etwa Interferon und Interleukin) gekuppelt werden.
  • Die Dosishöhe des Anti-Human-Krebs-Protein-Komplexes der vorliegenden Erfindung schwankt in Abhängigkeit vom Typ des zu behandelnden Krebses, den Symptomen und dem Verabreichungsweg. Wenn er zum Beispiel intravenös an Lungenkrebspatienten verabreicht wird, beträgt die Dosishöhe normalerweise 0,01 bis 5 mg/kg, vorzugsweise 0,03 bis 0,5 mg/kg täglich, berechnet als Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A.
  • Der auf diese Weise erhaltene Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex verwendet einen Liganden, welcher an menschliche Krebszellen bindet, die nachteiligen Nebenwirkungen von PEA mittels eines anderen Liganden, welcher an PEA bindet, neutralisiert und als therapeutischer Wirkstoff bei Krebs wirkt, der auf die Weise hochselektiv ist, daß er spezifisch an der Zieltumorstelle wirkt. Anders als herkömmliche Chemotherapeutika und Immunotoxine ist der Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex darin auffallend einzigartig, daß die starke Cytotoxizität von PEA völlig neutralisiert wird, bevor es die Zielstelle erreicht. Weiterhin ist der Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex sowohl auf metastasierten Krebs als auch Krebs im Endstadium anwendbar, da er merkliche therapeutische Wirkungen in niedrigeren Dosishöhen bietet.
    • BEISPIELE
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend in größerer Einzelheit mittels der Referenzbeispiele und Ausführungsbeispiele beschrieben.
  • Es ist anzumerken, daß in Beispiel 1 offenbartes Human-Human- Hybridom AGC-78 und in Beispiel 4 offenbartes Hybrid-Hybridom HH-1 beim Institut für Fermentation, Osaka (IFO) unter den jeweiligen Zugangsnummern IFO 50165 und 50162 seit dem 4. März 1988 und dem 2. März 1988 hinterlegt worden sind. Sie sind ebenfalls beim Fermentationsforschungsinstitut (FRI), Amt für industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für internationalen Handel und Industrie, Japan, unter den jeweiligen Zugangsnummern FERN BP-1812 und FERM BP-1811 seit dem 23. März 1988 hinterlegt. Die in Beispiel 2 offenbarte EBV-transformierte Zellinie PEA7-1-6D und das in Beispiel 3 offenbarte Human-Human-Hybridom P7E9C7 sind beim IFO unter den jeweiligen Zugangsnummern IFO 50138 und 50139 seit dem 6. August 1987 hinterlegt. Sie sind auch beim FRI unter den jeweiligen Zugangsnummern FERM BP-1809 und FERM BP-1810 seit dem 23. März 1988 hinterlegt.
    • Referenzbeispiel 1 (gemischte Blutgerinnung (MHA))
  • (1) Herstellung von Indikatorzellen mittels menschlicher Erythrocyten
  • Im Fall des IgG-Antikörpernachweises wurden Anti-D-Antikörper einer 2%igen Suspension menschlicher Erythrocyten in einer Phosphatpufferlösung (nachfolgend auch PBS abgekürzt) zugesetzt, gefolgt von 3 h Inkubation bei Raumtemperatur. Das Gemisch wurde mit PBS gewaschen und erneut in einer 2%igen Suspension suspendiert. Dieser Suspension wurden Ziegen-Anti-Human-IgG-Antikörper zugesetzt, gefolgt von der Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht. Das Gemisch wurde darauf dreimal mit PBS gewaschen und die Zellen wurden als Indikatorzellen verwendet.
  • Im Fall des IgM-Antikörpernachweises wurden getrocknete Meerschweinchen-Komplemente einer 2%igen Suspension menschlicher Erythrocyten in PBS zugesetzt und die Zellen wurden unmittelbar als Indikatorzellen verwendet.
  • (2) Zieltumorzellen wurden auf einer Nunc-Terasaki-Platte zu 1000 bis 2000 Zellen je Näpfchen angeimpft, gefolgt von einem Tag Kultivierung bei 37ºC in einem Kohlendioxid-Inkubator. Nach dem Waschen der Platte mit PBS, welches mit 2% fetalem Kälberserum (nachfolgend auch FCS abgekürzt) ergänzt war, wurde der Zielkulturüberstand des Hybridoms zugesetzt, gefolgt von 1 bis 2 h Inkubation bei Raumtemperatur. Die Platte wurde darauf mit PBS gewaschen, welche mit 2% FCS ergänzt war. Eine 0,2%ige Suspension der vorstehend in (1) hergestellten Indikatorzellen wurde darauf der Platte in der Menge von einem Tropfen je Näpfchen zugesetzt. Die Reaktion wurde weiter 1,5 bis 2 h bei Raumtemperatur ausgeführt, wonach die Platte erneut mit PBS gewaschen wurde, welche mit 2% FCS ergänzt war. Die Hämadsorption an die Tumorzellen wurde darauf mikroskopisch ausgewertet.
    • Referenzbeispiel 2 (Zell-ELISA mittels Tumorzellen)
  • Zieltumorzellen wurden auf einer Nunc-Terasaki-Platte mit 96 Näpfchen zu 10000 bis 40000 Zellen je Näpfchen angeimpft, gefolgt von einem Tag Kultivierung bei 37ºC in einem Kohlendioxid-Inkubator. Nach Entfernen des Kulturüberstands wurde ein weiterer Kulturüberstand des einen Anti-Krebs-Antikörper produzierenden Hybridoms zugesetzt. Die Reaktion wurde darauf 2 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach dem Waschen der Mikroplatte mit einem mit 0,2% Rinderserumalbumin (im folgenden auch BSA abgekürzt) ergänzten Medium, wurden mit Meerrettich-Peroxidase (nachfolgend auch HRP abgekürzt) markierte Ziege-Anti-Human-Ig-Antikörper zugesetzt. Die Reaktion wurde weiter 2 h bei Raumtemperatur ausgeführt. Nach dem Waschen der Mikroplatte wurden jedem Näpfchen eine Orthophenylendiamin (als Enzymsubstrat) enthaltende 0,1 M Citratpufferlösung und H&sub2;O&sub2; zugesetzt. Die Enzymreaktion wurde danach bei Raumtemperatur durchgeführt. Auf die Beendigung durch 1 N Schwefelsäure folgend, wurde die Menge an färbenden Pigmenten bei einer Wellenlänge von 492 nm mittels eines Multiscans (Flow Co.) bestimmt.
    • Referenzbeispiel 3 (ELISA zum Bestimmen des PEA-Antikörpers) (PEA-ELISA))
  • Eine Lösung von 2,5 ug/ml PEA wurde auf einer Mikroplatte mit 96 Näpfchen zu 100 ul je Näpfchen verteilt. Die Mikroplatte wurde darauf einen Tag bei 4ºC gehalten. 2% Casein enthaltende PBS wurde danach zugesetzt, um eine Sensibilisierungsplatte herzustellen. Zum Zeitpunkt der ELISA-Bestimmung wurde die vorstehend erwähnte Lösung entfernt und die Mikroplatte wurde mit PBS gewaschen. Der Kulturüberstand der EBV-transformierten Zellinie oder des Hybridoms wurde darauf zugesetzt und die Reaktion wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach dem Waschen der Mikroplatte mit PBS wurden HRP-markierte Ziege-Anti-Human-Ig-Antikörper zugesetzt und die weitere Reaktion wurde 2 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Enzymreaktion wurde darauf nach dem im Referenzbeispiel 2 beschriebenen Verfahren durchgeführt und der Antikörpergehalt wurde bestimmt.
    • Referenzbeispiel 4 (ELISA zum Bestimmen des Hybrid-Antikörpers (Hybrid-ELISA))
  • Der Kulturüberstand des einen Hybrid-Antikörper produzierenden Hybridoms wurde einer Mikroplatte zugesetzt, auf welcher Tumorzellen wie in Referenzbeispiel 2 beschrieben adsorbiert waren, gefolgt von 2 h Reaktion bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen der Mikroplatte mit einem mit 0,2% BSA ergänzten Nedium wurde HRP-markiertes PEA zugesetzt. Die weitere Reaktion wurde 2 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Enzymreaktion wurde darauf nach dem in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Verfahren durchgeführt und der Antikörpergehalt wurde bestimmt.
    • Referenzbeispiel 5 (Test des PEA-Antikörpers auf PEA neutralisierende Wirksamkeit)
  • Zellen der Human B-Lymphoblastzellinie BALL-1 wurden zu 5 x 10&sup5; Zellen/ml in einem 10% FCS enthaltenden I-H-Medium suspendiert. Diese Suspension wurde auf eine Mikroplatte mit 96 Näpfchen zu 100 ul je Näpfchen angeimpft und die Zellen wurden als PEA-Zielzellen verwendet.
  • Der Kulturüberstand der Anti-PEA-Antikörper produzierenden Zellen und 0,4 ug/ml PEA wurden den Näpfchen zu jeweils 50 ul je Näpfchen zugesetzt, gefolgt vom Vermischen. Nach 5 Tagen Kultivierung bei 37ºC in einem Kohlendioxidinkubator wurden je Näpfchen 100 ul Überstand entnommen. 20 ul einer 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-diphenyltetrazoliumbromid (5 mg/ml) enthaltenden Phosphatpufferlösung wurden darauf zugesetzt, gefolgt von 4 h Reaktion bei 37ºC in einem Kohlendioxidinkubator. 100 ul 10%iges Dodecylsulfat-0,01 N Salzsäure wurden darauf zugesetzt. 24 Stunden später wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 590 nm mittels eines Multiscan bestimmt, um die Zahl der wachstumsfähigen Zellen zu erhalten [MTT-Verfahren; H. Tada et al., Journal of Immunological Methods, 93, 157 (1986)].
    • Referenzbeispiel 6 (EBV-transformierte Zellinie)
  • Lymphocyten (nachfolgend auch PBL abgekürzt) wurden von menschlichem peripherem Blut durch ein Zentrifugationsverfahren der spezifischen Dichte nach mittels Ficoll-Hypaque getrennt und in einem 20% FCS (I-H-20F) enthaltenden Iscove-Ham- Medium in einer Dichte von 1 x 10&sup7; Lymphocyten/ml suspendiert. Dieser Suspension wurde ein EBV-haltiger Kulturüberstand von B95-8-Zellen in einem Volumenverhältnis von 10 zu 1 zur Suspension zugesetzt. Die Infektion wurde 1 h bei 37ºC durchgeführt, während das Gemisch gelinde geschüttelt wurde. Nach der Infektion wurden die Lymphocyten auf einer Mikroplatte mit 96 Näpfchen zu 2 x 10&sup4; Lymphocyten je Näpfchen angeimpft, gefolgt von 2 bis 4 Wochen Kultivieren bei 37ºC in einem Kohlendioxidinkubator,um eine proliferative, transformante Zellinie zu ergeben.
    • Referenzbeispiel 7 (Human-Human-Hybridom)
  • Die Zellfusion wurde an der im Referenzbeispiel 6 erhaltenen EBV-transformierten Zellinie und an der Human B-Lymphoblast- Zellinie TAW-925 durchgeführt.
  • Zellen dieser Linien wurden in einem Zahlenverhältnis von 1:1 gemischt. Das Gemisch wurde mit 45% PEG 6000 (hergestellt von Koch-Light Ltd.) 7 Minuten zur Zellfusion behandelt. Nach der Zellfusion wurden die fusionierten Zellen in einem 10% FCS enthaltenden I-H-Medium suspendiert. Diese Suspension wurde auf eine Mikroplatte mit 96 Näpfchen zu 2 x 10&sup4; EBV-transformierten Zellen je Näpfchen geimpft, gefolgt von der Kultivierung bei 37ºC in einem Kohlendioxidinkubator. 24 Stunden nach Beginn der Kultivierung wurde die HAT-O-Selektionskultivierung durch Zusatz einer gleichen Menge eines sowohl HAT + Ouabain (1 x 10 &supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 4 x 10&supmin;&sup7; M Aminopterin, 1,6 x 10&supmin;&sup5; M Thymidin, 5 x 10&supmin;&sup6; M Ouabain) als auch 10% FCS (HAT-O-Medium) enthaltenden I-H-Mediums begonnen. 3, 5 und 7 Tage nach dem ersten Zusatz von HAT-O-Medium wurden 100 ul der alten Brühe verworfen und 100 ul frisches HAT-O-Medium wurden zum Fortsetzen der HAT-O-Selektionskultivierung zugesetzt. Das Hybridomwachstum trat 10 bis 14 Tage nach der Zellfusion auf. Der Antikörpergehalt des Kulturüberstandes wurde nach einem der in den Referenzbeispielen 1, 2 und 3 beschriebenen Verfahren bestimmt.
    • Beispiel 1 (Erhalt und Klonen eines einen Anti-Krebs-Antikörper produzierenden Hybridoms)
  • Human-PBL wurden nach dem in Referenzbeispiel 6 beschriebenen Verfahren transformiert. Die auf diese Weise erhaltene EBV- transformierte Zellinie TAW-925 wurde der Zellfusion mit der Human B-Lymphoblast-Zellinie nach dem in Referenzbeispiel 7 beschriebenen Verfahren unterzogen und die fusionierten Zellen wurden der HAT-O-Selektionskultivierung unterzogen. Nach der Zellfusion wurden die fusionierten Zellen auf eine Mikroplatte in einer Dichte von 4 bis 6 x 10&sup4; Zellen/ml geeimpft. Der Kulturüberstand wurde von jedem der Näpfchen, in welchem Human- Human-Hybridom-Wachstum in 12 bis 14 Tagen auftrat, gesammelt und den in Beispiel 1 und 2 beschriebenen MHA beziehungsweise Zell-ELISA unterzogen.
  • Die in den Näpfchen enthaltenen Hybridome mit positiver Antikörperaktivität wurden dem Klonen durch Grenzverdünnungsanalyse unterzogen. Beim Klonen wurden BALB/c-Mäusethymocyten als Freßzellen zu 5 x 10&sup5; Zellen je Näpfchen zugesetzt. Etwa 10 bis 15 Tage später trat Zellwachstum auf. Der Überstand wurde erneut den in Referenzbeispiel 1 und 2 beschriebenen MHA beziehungsweise Zell-ELISA unterzogen. Das Human-Human-Hybridom AGC-78 (FERM BP-1812, IFO 50165), welches einen Anti-Krebs-Antikörper produziert, der eine Bindungsaktivität auf Magenkrebszellen (NUGC-4), Lungenkrebszellen (LU-134) und Epidermiskarzinomzellen (A 431) zeigt, wurde auf diese Weise erhalten.
  • Der durch das vorstehende Hybridom produzierte monoklonale Anti-Human-Krebs-Human-Antikörper AGC-78 wurde als der Human- IgG&sub2;-Klasse zugehörig identifiziert.
  • Die Ergebnisse der Bestimmung seiner Bindungsaktivität auf verschiedene Tumorzellinien, wie sie durch die im Referenzbeispiel 1 oder 2 beschriebene Methode bestimmt wurde, werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Reaktivität des Anti-Krebs-Antikörpers AGC-78 Zielzelle Abstammung Magenkrebs Antikörperaktivität Alexander Hepatom Gallengangkrebs Dickdarmkrebs Lungenadenokarzinom Lungenplattenepithelkarzinom Epidermiskarzinom Lungenkleinzellenkarzinom Lungengroßzellenkarzinom Leukämie Sarkom Halskarzinom Andere
    • Beispiel 2 (Erhalt und Klonen einer einen Anti-PEA-Antikörper produzierenden EBV-transformierten Zellinie)
  • Aus normalen Menschen gesammelte Blutserumproben wurden mittels ELISA auf Anti-Pseudomonas aeruginosa A-Antikörper untersucht. Lymphocyten aus menschlichem peripherem Blut (PBL) mit einem hohem Antikörpergehalt wurden darauf abgetrennt. Die auf diese Weise erhaltenen Lymphocyten wurden gemäß dem in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Verfahren mit EBV transformiert; wachstumsfähige Zellen wurden gezüchtet und selektiert. Wenn das Zellwachstum nach 2 bis 4 Wochen wahrnehmbar wurde, wurde der Kulturüberstand gesammelt und mittels ELISA wie in Referenzbeispiel 3 auf den Anti-PEA-Antikörper-Gehalt untersucht. Der Antikörpergehalt wurde in einem Näpfchen festgestellt, welches darauf dem Klonen auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 unterzogen wurde. Die transformante Zellinie PEA7-1-6D (FERM BP-1809, IFO 50138) mit ausgezeichneter Wachstumsfähigkeit und Antikörperproduktivität wurde erhalten.
  • Der durch diese Transformante produzierte monoklonale Anti- PEA-Human-Antikörper PEA7-1-6D wurde als der Human-IgG&sub2;-Klasse zugehörig identifiziert. Der in Referenzbeispiel 5 beschriebene Neutralisationsaktivitätstest zeigte, daß dieser Antikörper ein derart starkes Neutralisationsvermögen besitzt, daß jedes Molekül davon 1 bis 2 Moleküle PEA neutralisieren kann.
    • Beispiel 3 (Erhalt und Klonen eines Anti-PEA-Antikörper produzierenden Human-Human-Hybridoms)
  • Die Zellfusion wurde an der in Beispiel 2 erhaltenen, einen monoklonalen Anti-Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A-Human-Antikörper produzierenden, EBV-transformierten Zellinie PEA7- 1-6D und der Human B-Lymphoblast-Zellinie TAW-925 gemäß dem in Referenzbeispiel 7 beschriebenen Verfahren ausgeführt.
  • Das Hybridomwachstum trat etwa 2 Wochen nach der Zellfusion auf. Die Hybridome, welche sich vermehrt hatten, wurden einem in Referenzbeispiel 3 beschriebenen PEA-ELISA unterzogen. Das Klonen wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 in dem Näpfchen ausgeführt, welches die höchste Antikörperaktivität zeigte. Das Human-Human-Hybridom P7E9C7 (FERM BP-1810, IFO 50139), welches beständig einen monoklonalen Anti-PEA-Human-Antikörper produziert, wurde erhalten.
  • Der von diesem Hybridom produzierte monoklonale Anti-PEA-Human-Antikörper P7E9C7 wurde als der Human-IgG&sub2;-Klasse angehörig identifiziert. Der in Referenzbeispiel 5 beschriebene Neutralisierungsaktivitätstest zeigte, daß dieser Antikörper insofern ein ausgezeichneter neutralisierender Antikörper ist, als daß jedes Molekül 1 bis 2 Moleküle PEA, wie etwa den in Beispiel 2 beschriebenen Antikörper PEA7-1-6D, neutralisieren kann.
    • Beispiel 4 (Erhalt und Klonen eines Hybrid-Antikörper produzierenden Hybridoms) (1) Erhalt eines HAT-sensitiven Human-Human-Hybridoms
  • Das in Beispiel 1 erhaltene, Antikrebs-Antikörper produzierende Human-Human-Hybridom AGC-78 wurde in einem mit 6-Thioguanin (6-TG) ergänzten Medium kultiviert und akklimatisiert, um es genüber HAT zu sensibilisieren. Die Kultivierung wurde mit einem l uM 6-TG enthaltendem I-H-10F-Medium begonnen. Die Kultivierung wurde fortgesetzt, während die 6-TG-Konzentration von l uM in 2- bis 3-fachen Stufen erhöht wurde. Die Transformanten, welche gegen 100 uM 6-TG resistent wurden, wurden auf HAT-Empfindlichkeit untersucht. Eine einen Antikrebs-Antikörper produzierende und HAT-empfindliche Transformante AGC-78r wurde erhalten.
    • (2) Zellfusion eines HAT-sensitiven Human-Human-Hybridoms und einer EBV-transformierten Zellinie
  • Vorstehend in (1) erwähnte AGC-78r wurde der in Beispiel 2 erhaltenen, einen Anti-PEA-Antikörper produzierenden Zellinie PEA7-1-6D in einem Verhältnis von 1 zu 1 zugesetzt. Die Zellfusion wurde wie in Referenzbeispiel 7 beschrieben ausgeführt. Das auf diese Weise erhaltene Hybrid-Hybridom wurde der Selektionskultivierung mittels des HAT-Mediums unterzogen. Das Hybrid-Hybridom-Wachstum trat 12 bis 17 Tage nach der Zellfusion auf.
  • Der Antikörpergehalt des Kulturüberstandes wurde nach den drei Methoden der Referenzbeispiele 1, 3 und 4 bestimmt. 10 Näpfchen erwiesen sich in allen drei Methoden als positiv. Diese Näpfchen wurden darauf dem Klonen durch Grenzverdünnungsanalyse wie in Beispiel 1 unterzogen. Das Hybrid-Hybridom HH-1 (FERM BP-1811, IFO 50162) wurde auf diese Weise erhalten, welches wie im in Referenzbeispiel 4 beschriebenen ELISA die höchste Hybrid-Antikörper-Aktivität zeigte.
  • Der von diesem Hybrid-Hybridom produzierte monoklonale Hybrid- Human-Antikörper HH-1 wurde als zur Human-Ig&sub2;-Klasse angehörig identifiziert. Tabelle 2 zeigt die nach den in den Referenzbeispielen 1, 3 und 4 beschriebenen Methoden bestimmten Antikörpergehalte. Der Kulturüberstand des Hybrid-Hybridoms HH-1, welcher den monoklonalen Hybrid-Human-Antikörper HH-1 produziert, zeigte gegenüber beiden Antigenen der Magenkrebs-Zellinien NUGC-4 und PEA Bindungsaktivität. Tabelle 2 Reaktivität des Hybrid-Antikörpers Zell-Kultivierungs-Überstand Antikörpergehalt MHA-Test¹) PEA-ELISA²) Hybrid-ELISA³)Anmerkung: 1) Bestimmt gemäß der Methode von Referenzbeispiel 1 mittels der Magenkrebs-Zellinie NUGC-4. 2) Bestimmt gemäß der Methode von Referenzbeispiel 3. 3) Bestimmt gemäß der Methode von Referenzbeispiel 4 mittels der Magenkrebs- Zellinie NUGC-4.
    • Beispiel 5 (Herstellung eines monoklonalen Antikörpers) (1) Erhalt eines Antikrebs-Antikörpers und eines Anti-PEA-Antikörpers
  • Die in Beispiel 1 beziehungsweise 3 erhaltenen Human-Human- Hybridome AGC-78 und P7E9C7 wurden jeweils in GIT-Medium suspendiert. Die Kultivierung wurde bei 37ºC fortgesetzt, während das Kultivierungsvolumen Schritt für Schritt erhöht wurde. 6 l des auf diese Weise erhaltenen Kulturüberstandes wurde Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 47% zugesetzt. Diese Lösung wurde dem Aussalzen bei 4ºC über 60 Minuten unter Rühren unterworfen, gefolgt vom Zentrifugieren (10000 Upm, 15 Minuten). Die auf diese Weise erhaltene Fällung wurde in 20 mM Tris-Pufferlösung (pH 7,9), welche 50 mM NaCl enthielt, gelöst. Diese Lösung wurde gegen 1 l der gleichen Pufferlösung dialysiert. Zwei Stunden später wurde die Dialyselösung durch eine neue ersetzt und die weitere Dialyse wurde 15 h ausgeführt, gefolgt von 15 Minuten Zentrifugieren bei 10 000 Upm.
  • Der Überstand wurde auf eine Säule aus 10 ml DEAE-Cellulose (Whatman DE52) aufgebracht, welche mit einer ausreichenden Menge Tris-Pufferlösung, die 50 mM NaCl enthielt, äquilibriert war. Die Fraktion, welche beim Fraktionieren mit einer weiteren Tris-Pufferlösung, die 50 mM NaCl enthielt, durch die Säule hindurchging, wurde eingeengt. Die auf diese Weise erhaltene Proteinfraktion wurde weiter auf eine Protein A-Säule aufgebracht. Nach gründlichem Säulenwaschen mit einer 50 mM NaCl enthaltenden Phosphatpufferlösung (pH 8,0) wurden mit einer 0,1 N Acetatpufferlösung (pH 3,0) IgG-Antikörper eluiert, um den monoklonalen Anti-Human-Krebs-Human-Antikörper AGC-78 und den monoklonalen Anti-PEA-Human-Antikörper P7E9C7 zu liefern. Jeder auf diese Weise erhaltene Antikörper wurde unmittelbar mit einer 0,5 M Carbonatpufferlösung (pH 10) neutralisiert, wonach er gegen PBS dialysiert wurde und zum Herstellen eines Anti-Human-Krebs-Protein-Komplexes verwendet wurde. Diese Antikörper wurden auf Antikörperreinheit mittels der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophoresemethode von Laemli et al. [Nature, 227, 680 (1970)] untersucht; ihre Reinheit wurde als zu über 95% bestätigt.
    • (2) Erhalt eines Hybrid-Antikörpers
  • Das in Beispiel 4 hergestellte Hybrid-Hybridom HH-1 wurde in GIT-Medium auf dieselbe Weise wie vorstehend in (1) kultiviert. 6 l des Kulturüberstandes wurden dem Aussalzen mit Ammoniumsulfat unterzogen, gefolgt von der Dialyse, wonach er auf eine Protein A-Säule aufgebracht wurde. Die Elution wurde mittels einer 0,1 M Acetatpufferlösung, pH 3,0, auf dieselbe Weise wie in (1) ausgeführt. Die eluierte IgG-Antikörper-Fraktion wurde gesammelt und neutralisiert, wonach sie dialysiert und mittels eines Kollodiumbeutels eingeengt wurde.
  • Diese IgG-Antikörper-Fraktion wurde anschließend auf eine Hydroxylapatit-Säule (0,5 x 10 cm, hergestellt von Bio-Rad Co.) aufgebracht, welche mit einer 10 mM Phosphatpufferlösung (PB, pH 6,8) [s. L.H. Stanker et al., Journal of Immunological Methods, 76, 157 (1985)] äquilibriert war. Nach Waschen der Säule mit 20 ml desselben 10 mM PB wurde eine lineare Gradientenelution mit einem Dichtegradienten von 10 mM bis 200 mM PB (40 ml für jede Dichte) ausgeführt; der gewünschte monoklonale Hybrid-Human-Antikörper HH-1 wurde darauf isoliert.
  • Die Hybrid-Antikörper-Identifizierung wurde durch die in (1) beschriebene SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophoresemethode von Laemli et al. und die Celluloseacetat-Membranelektrophoresemethode [M.R. Suresh et al., Methods of Enzymology, 121, 210 (1968)] ausgeführt. Es wurde bestätigt, daß dieser Antikörper eine Reinheit von über 80% besitzt. Er wurde dazu verwendet, einen Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex herzustellen.
    • Beispiel 6 (Herstellung des Anti-Human-Krebs-Protein-Komplexes (1)) (1) Dithiopyridylierung des Anti-Krebs-Antikörpers
  • 5 mg des in Beispiel 5-(1) erhaltenen Anti-Human-Krebs-Human- MoAb AGC-78 wurden in 1 ml PBS gelöst. Dieser Lösung wurden 50 ul einer Lösung von 1,04 mg/ml SPDP in Ethanol zugesetzt, gefolgt von 1 h Reaktion bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wurde durch eine mit einer 5 mM EDTA enthaltenden 0,1 N Phosphatpufferlösung (pH 6,8) äquilibrierte Sephadex G-25- Säule hindurchgeleitet, um den Reagenzüberschuß zu entfernen. Die auf diese Weise abgetrennte Proteinfraktion wurde mittels eines Kollodiumbeutels eingeengt.
    • (2) Maleimidierung von PEA
  • 2 mg PEA (im Handel von Seikagaku Kogyo K.K., Japan) wurden in 1 ml PBS gelöst. 50 ul einer Lösung von 0,85 mg/ml GMBS in Dimethylformamid wurden dieser Lösung zugesetzt, gefolgt von 1 h Reaktion bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wurde durch eine mit einer 5 mM EDTA enthaltenden 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 6,8) äquilibrierte Sephadex G-25-Säule hindurchgeleitet, um den Reagenzüberschuß zu entfernen. Die auf diese Weise abgetrennte Proteinfraktion wurde mittels eines Kollodiumbeutels eingeengt.
    • (3) Herstellung des Anti-Krebs-Antikörper-PEA-Protein-Komplexes
  • 1 ml des in (1) erhaltenen dithiopyridylierten Antikörpers mit 2 mg/ml wurden 150 ul einer 1% Dithiotreit (nachfolgend auch DTT abgekürzt) enthaltenden 0,2 M Acetatpufferlösung (pH 4,5) zugesetzt. Die Reaktion wurde 1 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch auf eine Sephadex G-25-Säule aufgebracht, um den Reagenzüberschuß zu entfernen. Die auf diese Weise abgetrennte Proteinfraktion wurde mittels eines Kollodiumbeutels auf ein Volumen von etwa 1 ml eingeengt. Diesem Konzentrat wurde langsam 1 ml der in (2) erhaltenen Lösung von 2 mg/ml maleimidierten PEA zugesetzt, gefolgt von der Reaktion über Nacht bei 5ºC. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch auf eine Säule aus mit PBS äquilibriertem Ultrogel AcA34 aufgebracht, um den Anti-Human-Krebs-Human-MoAb-PEA-Protein-Komplex von dem unkonjugierten Anti-Human-Krebs-Human- MoAb und PEA abzutrennen.
    • (4) Immunkomplex des Anti-Krebs-Antikörper-PEA-Protein-Komplexes und Anti-PEA-Antikörpers
  • 1 ml der in (3) erhaltenen Proteinfraktion, welche dem Anti- Human-Krebs-Human-MoAb-Protein-Komplex entspricht, wurden 0,5 mg des in Beispiel 5-(1) erhaltenen Anti-PEA-Human-MoAb P7E9C7 zugesetzt. Die Reaktion wurde 3 h bei 5ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Säule aus mit PBS äquilibriertem Ultrogel AcA34 aufgebracht, um den Immunkomplex (Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex) von dem unkonjugierten Anti-PEA-Human-NoAb abzutrennen.
  • Tabelle 3 zeigt die Cytotoxizität des auf diese Weise erhaltenen Immunkomplexes aus dem Anti-Human-Krebs-MoAb-PEA-Pro tein-Komplex und dem Anti-PEA-Human-MoAb. Es wurde gefunden, daß der Anti-Human-Krebs-MoAb-PEA-Protein-Komplex nicht nur auf der Zielzelle NUGC-4, sondern auch der Nicht-Zielzelle HEP-G2 wirkt, während der zwischen dem vorstehenden Proteinkomplex und dem Anti-PEA-Human-MoAb gebildete Immunkomplex (Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex) nur gegenüber der Zielzelle NUGC-4 Cytotoxizität zeigt. Tabelle 3 Cytotoxizität des Immunkomplexes aus Anti-Krebs- Antikörper-PEA-Protein-Komplex und Anti-PEA-Antikörper % Cytotoxizität cytotoxische Substanz (6 ng/ml) Anti-PEA-Antikörper¹) Zielzelle Nichtzielzelle Anti-Krebs-Antikörper²) PEA-Protein-Komplex Anmerkung: 1) gegen PEA (100 ng/ml) neutralisierender Antikörper P7E9C7. 2) AGC-78, ein gegenüber Magenkrebszellen (NUGC-4) reaktiver und gegenüber Hepatomzellen (HEP-G2) nichtreaktiver Antikörper. 3) als PEA berechnet.
    • Beispiel 7 (Herstellung des Anti-Human-Krebs-Protein-Komplexes (2)) (1) Dithiopyridylierung des Anti-Krebs-Antikörpers
  • Ein dithiopyridylierter Anti-Human-Krebs-Human-MoAb wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 6-1 hergestellt.
    • (2) Maleimidierung des Anti-PEA-Antikörpers
  • 5 mg des in Beispiel 5-(1) erhaltenen Anti-PEA-Human-MoAb P7E9C7 wurden in 1 ml PBS gelöst. Dieser Lösung wurden 50 ul einer Lösung von 0,93 mg/ml GMBS in Dimethylformamid zugesetzt. Ein maleimidierter Anti-PEA-Human-MoAb wurde auf dieselbe Weise wie Beispiel 6-(2) hergestellt.
    • (3) Herstellung des Anti-Krebs-Antikörper-Anti-PEA-Antikörper- Protein-Komplexes
  • Der dithiopyridylierte Anti-Human-Krebs-Human-MoAb wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 6-(3) reduziert und gereinigt. Der in (2) erhaltene maleimidierte Anti-PEA-Human-MoAb wurde dazugegeben. Der auf diese Weise erhaltene Proteinkomplex wurde mittels einer Ultrogel AcA34-Säule gereinigt.
    • (4) Immunkomplex aus dem Anti-Krebs-Antikörper-Anti-PEA-Antikörper-Protein-Komplex und PEA
  • 0,5 mg PEA wurden dem Anti-Human-Krebs-Human-MoAb-Anti-PEA- Human-MoAb-Protein-Komplex zugesetzt. Es folgte dasselbe Verfahren wie in Beispiel 6-(4), um den Immunkomplex (Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex) herzustellen und zu reinigen.
  • Fig. 1 zeigt die Cytotoxizität des auf diese Weise erhaltenen Immunkomplexes des Anti-Human-Krebs-Human-MoAb-Anti-PEA-Human-MoAb-Protein-Komplexes.
  • In Fig. 1 zeigt die Cytotoxizität gegenüber der Zielzelle NUGC-4; zeigt die Cytotoxizität gegenüber der Nicht-Zielzelle HEP-3B. Die Ordinate zeigt die % Cytotoxizität und die Abszisse die Menge (ng/ml) des Immunkomplexes (Anti- Human-Krebs-Protein-Komplex).
    • Beispiel 8 (Herstellung des Anti-Human-Krebs-Protein-Komplexes (3)) (1) Herstellung des Anti-Krebs-Antikörper-Anti-PEA-Antikörper- Protein-Komplexes
  • 1 mg des in Beispiel 5-(1) erhaltenen Anti-Human-Krebs-Human- MoAb AGC-78 und 1 mg des Anti-PEA-Human-MoAb P7E9C7 wurden in 1 ml PBS gelöst. Dieser Lösung wurden 50 ul einer 2%igen wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd zugesetzt. Die Reaktion wurde 1 h bei 5ºC durchgeführt. Der Vervollständigung der Reaktion folgend wurde das Reaktionsgemisch auf eine Säule aus mit PBS äguilibriertem Ultrogel AcA34 aufgebracht, um den Anti-Human- Krebs-Human-MoAb-Anti-PEA-Human-MoAb-Protein-Komplex von den unumgesetzten Antikörpern abzutrennen.
    • (2) Immunkomplex aus Anti-Krebs-Antikörper-Anti-PEA-Antikörer-Protein-Komplex und PEA
  • Unter Verwendung desselben Verfahrens wie in Beispiel 6-(4) wurden 0,5 mg PEA dem vorstehend in (1) erhaltenen Anti-Human-Krebs-Human-MoAb-Anti-PEA-Human-MoAb-Protein-Komplex zugesetzt, um den Immunkomplex (Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex) zu bilden und zu reinigen.
  • Fig. 2 zeigt die Cytotoxizität des auf diese Weise erhaltenen Immunkomplexes aus dem Anti-Human-Krebs-Human-MoAb-Anti-PEA- Human-MoAb-Protein-Komplex und PEA.
  • In Fig. 2 zeigt die Cytotoxizität gegenüber der Zielzelle NUGC-4; zeigt die Cytotoxizität gegenüber der Nicht-Zielzelle HEP-3B. Die Ordinate zeigt die % Cytotoxizität und die Abszisse die Menge (ng/ml) des Immunkomplexes (Anti- Human-Krebs-Protein-Komplex).
    • Beispiel 9 (Herstellung des Anti-Human-Krebs-Protein-Komplexes (4))
  • 0,5 mg PEA wurden 1 mg des in Beispiel 5-(2) erhaltenen monoklonalen Hybrid-Human-Antikörpers HH-1 zugesetzt. Es folgte dasselbe Verfahren wie in Beispiel 6-(4), um den Immunkomplex (Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex) zu bilden und zu reinigen.
    • Beispiel 10 (Cytotoxizität des Anti-Human-Krebs-Protein-Komplexes (1))
  • Eine mit 1 x 10&sup4; in Tabelle 4 gezeigten Tumorzellen/100 ul/Näpfchen beimpfte Mikroplatte mit 96 Näpfchen wurde bei 37ºC über Nacht inkubiert. Die in Tabelle 4 gezeigten monoklonalen Antikörper wurden darauf zu 0 bis 50 ng/100 ul/Näpfchen zugesetzt, gefolgt von 2 h Reaktion bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen der Mikroplatte wurde der Mikroplatte PEA zu 0 bis 2,55 ng/100 ul/Näpfchen zugesetzt, gefolgt von 2 h Reaktion bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen der Mikroplatte wurde ein Kultiviermedium zugesetzt und die Kultivierung wurde 3 Tage bei 37ºC ausgeführt. Nach Beendigung der Kultivierung wurden lebensfähige Zellen nach der in Referenzbeispiel 5 beschriebenen Methode gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
  • Weder AGC-78 noch P7E9C7 (Eltern-Antikörper) zeigten selbst in Anwesenheit von PEA eine bemerkenswerte Cytotoxizität gegenüber der Antikörper-reaktiven Tumorzelle A431, während der Hybrid-Antikörper HH-1 eine starke Cytotoxizität gegenüber der Zielzelle A431 in Konzentrationen von 1/100 bis 1/10, bezogen auf diejenigen der vorstehenden Eltern-Antikörper, zeigte. Ferner zeigte der Hybrid-Antikörper HH-1 keine Cytotoxizität gegenüber der nichtreaktiven Tumorzelle HEP-3B selbst bei einer Konzentration von 500 ng/ml, dem 10fachen der für A431- Zellen verwendeten Höchstkonzentration. Tabelle 4 Potenzierung der PEA-Cytotoxizität durch den Hybrid-Antikörper % Cytotoxizität Hybrid-Antikorper HH-1(ng/ml) Anti-Krebs-Antikörper AGC-78 (ng/ml) Anti-PEA-Antikörper P7E9C7 (ng/ml) PEA (ng/ml) A431-Zielzellen HEP-3B-Nicht-Zielzellen Anmerkung 1) nicht getestet
    • Beispiel 11 (Cytotoxizität des Anti-Human-Krebs-Protein-Komplexes (2))
  • Eine mit 1 x 10&sup4; in Tabelle 5 gezeigten Tumorzellen/100 ul/Näpfchen beimpfte Mikroplatte mit 96 Näpfchen wurde bei 37ºC über Nacht inkubiert. Der in Beispiel 9 erhaltene, den Hybrid-Human- MoAb HH-1 und PEA umfassende Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex wurde zugesetzt, gefolgt von 3 Tagen Kultivierung bei 37ºC. Nach Vervollständigung der Kultivierung wurden lebensfähige Zellen nach dem in Referenzbeispiel 5 beschriebenen Verfahren gezählt. Die Cytotoxizität wurde zwischen dem Komplex und der unkonjugierten Substanz PEA verglichen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Cytotoxizität des Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex % Cytotoxizität cytotoxische Substanz A431-Zellen HEP-3B-Zellen Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex Anmerkung 1) berechnet als PEA 2) nicht getestet

Claims (15)

1. Anti-Human-Krebs-Protein-Komplex, welcher (a) einen Liganden, welcher zum Binden an menschliche Krebszellen befähigt ist, (b) einen Liganden, welcher zum Binden an Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A befähigt ist, und (c) an den Liganden (b) gekuppeltes Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A umfaßt.
2. Komplex wie in Anspruch 1 beansprucht, welcher einen Protein-Komplex umfaßt, der durch kovalentes Binden eines monoklonalen Anti-Human-Krebs-Human-Antikörpers und Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A erhalten wurde, worin ein monoklonaler Anti-Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A-Human-Antikörper immunologisch an den Protein-Komplex gekuppelt ist.
3. Komplex wie in Anspruch 1 beansprucht, welcher einen Protein-Komplex umfaßt, der durch kovalentes Binden eines monoklonalen Anti-Human-Krebs-Human-Antikörpers und monoklonalen Anti-Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A-Human-Antikörpers erhalten wurde, worin Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A an den Protein-Komplex gekuppelt ist.
4. Komplex wie in Anspruch 1 beansprucht, welcher einen heteroreaktiven, zweiwertigen, monoklonalen Hybrid-Human-Antikörper, welcher zum Binden sowohl an menschliche Krebszellen als auch an Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A auf jedem Molekül befähigt ist, und immunologisch an den monoklonalen Antikörper gebundenes Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A umfaßt.
5. Komplex wie in Anspruch 4 beansprucht, bei welchem der monoklonale Hybrid-Human-Antikörper durch ein Hybridom produziert wird, welches durch Fusionieren einer Zelle, welche einen monoklonalen Anti-Human-Krebs-Human-Antikörper produziert und einer weiteren Zelle, welche einen monoklonalen Anti-Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A-Human-Antikörper produziert, erhalten wird.
6. Komplex wie in Anspruch 2, 3 oder 5 beansprucht, bei welchem der monoklonale Anti-Human-Krebs-Human-Antikörper befähigt ist, an Magenkrebszellen, Lungenkrebszellen oder Epidermiskarzinomzellen zu binden.
7. Komplex wie in Anspruch 2, 3 oder 5 beansprucht, bei welchem der monoklonale Anti-Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A-Human-Antikörper befähigt ist, Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A zu neutralisieren, sodaß 100 ng des Antikörpers mehr als 10 ng Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A neutralisieren.
8. Komplex wie in Anspruch 2, 3 oder 5 beansprucht, bei welchem der monoklonale Anti-Human-Krebs-Human-Antikörper durch eine Zellinie einer transformierten Epstein-Barr Virus- Zellinie oder ein zwischen einer transformierten Epstein-Barr Virus-Zellinie und einer Human B-Lymphoblast-Zellinie gebildetes Human-Human-Hybridom produziert wird.
9. Komplex wie in Anspruch 8 beansprucht, bei welchem die Human B-Lymphoblast-Zellinie die Human B-Lymphoblast-Zellinie TAW-925 ist.
10. Komplex wie in Anspruch 2, 3 oder 5 beansprucht, bei welchem der monoklonale Anti-Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A-Human-Antikörper durch eine Zellinie einer transformierten Epstein-Barr Virus-Zellinie oder ein zwischen einer transformierten Epstein-Barr Virus-Zellinie und einer Human B-Lymphoblast-Zellinie gebildetes Human-Human-Hybridom produziert wird.
11. Komplex wie in Anspruch 10 beansprucht, bei welchem die Human B-Lymphoblast-Zellinie die Human B-Lymphoblast-Zellinie TAW-925 ist.
12. Komplex wie in Anspruch 8 beansprucht, bei welchem die Zellinie, welche den monoklonalen Anti-Human-Krebs-Human-Antikörper produziert, das Human-Human-Hybridom AGC-78 ist.
13. Komplex wie in Anspruch 10 beansprucht, bei welchem die Zellinie, welche den monoklonalen Anti-Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A-Human-Antikörper produziert, die transformierte Epstein-Barr Virus-Zellinie PEA7-1-6D ist.
14. Komplex wie in Anspruch 10 beansprucht, bei welchem die Zellinie, welche den monoklonalen Anti-Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A-Human-Antikörper produziert, das Human-Hybridom P7E9C7 ist.
15. Komplex wie in Anspruch 5 beansprucht, bei welchem das Hybridom das Hybrid-Hybridom HH-1 ist, welches durch Fusionieren des Human-Human-Hybridoms AGC-78 und der transformierten Epstein-Barr Virus-Zellinie PEA7-1-6D ist.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8907310D0 (en) * 1989-03-31 1989-05-17 Medical Res Council Heteroconjugates
US5858363A (en) * 1990-07-20 1999-01-12 Pharmacia & Upjohn Ab Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation
EP0610179B1 (de) * 1990-07-20 1996-10-16 Pharmacia AB (reg.number 556131-9608) Zielgerichtete spezifische antikörper-superantigen konjugate und ihre präparation
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Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1213229A (en) * 1982-04-12 1986-10-28 Gary S. David Antibodies having dual specificities, their preparation and uses therefor
US4545985A (en) * 1984-01-26 1985-10-08 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins
US4689311A (en) * 1985-09-30 1987-08-25 Rhode Island Hospital Screening antibodies for capacity to deliver toxin to target cells
US4806494A (en) * 1986-07-24 1989-02-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Monoclonal antibody against ovarian cancer cells (OVB-3)
JPS6463374A (en) * 1987-09-03 1989-03-09 Agency Ind Science Techn Human monoclonal antibody, antibody-forming cell, antibody-forming hybridoma and production of antibody

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