DE69020914T2 - Monoklonale Antikörper von Ratten gegen menschliche Antigene und Verfahren zu deren Herstellung. - Google Patents
Monoklonale Antikörper von Ratten gegen menschliche Antigene und Verfahren zu deren Herstellung.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von monoklonalen Antikörpern der Ratte. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein neues reproduzierbares Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern der Ratte, die an Human-T-Lymphocyten-Antigen-Epitope binden, die von denjenigen Epitopen verschieden sind, die durch von Mäusen abgeleitete monoklonale Antikörper definiert werden, welche gegen dasselbe Antigen gerichtet sind; und sie betrifft monoklonale Antikörper der Ratte, die an Human-CD4-Antigen binden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Hybridzellen, die mittels der neuartigen Verfahren hergestellt werden, und sie betrifft die monoklonalen Antikörper, die von den Hybridzellen ausgeschieden werden. Diese Antikörper sind zum Nachweis von Human-Antigenen in vitro nützlich und insbesondere von CD4, welches zur Feststellung der Prognose der AIDS-Infektion nützlich ist. Von den Antigenen wird erwartet, daß sie zur Behandlung von Krankheiten wie AIDS nützlich sind, da diese Antigene in den Krankheitsverlauf verwickelt sind. Von den Antikörpern wird auch erwartet, daß sie bei der Isolierung der Antigene nützlich sind.
- Die Entwicklung monoklonaler Antikörper (MAK) hat die Möglichkeit zum Studium der Verteilung, Struktur und Funktion der T-Lymphocyten-Membran-Antigene eröffnet. In den vergangenen Jahren wurde eine Reihe von Molekülen, die auf den T-Lymphocyten vorhanden sind, mittels monoklonaler Antikörper von Mäusen definiert; von einigen wurde gezeigt,daß sie mit der T- Lymphocyten-Funktion zusammenhängen. Z.B. wird der T-Zellen- Antigen-Rezeptorkomplex (Ti-T3) von monoklonalen CD3- Antikörpern (z.B. OKT3) und von WT311 (Kung P.C. et al., Science, 206, 347, 1979) erkannt; der Rezeptor für Interleukin-2 wird von monoklonalen CD25-Antikörpern (z.B. TAC) erkannt (Leonard W.J. et al., Nature, 300, 267, 1982) und der T- Lymphocyten-Rezeptor für Schaf-Erythrocyten (E-Rezeptor), der kürzlich als ein Ligand für LFA-3 vorgeschlagen wurde, wird von monoklonalen CD2-Antikörpern (z.B. OKT11) (Verbi W. et al., Eur. J. Immunol., 12, 81, 1982 und Selvaraj T. et al., Nature, 326, 400, 1987) erkannt. Einige Antikörper gegen T-Lymphocyten simulieren den Effekt von natürlichen Liganden oder der Antigen- Stimulation: OKT3 und WT31 aktivieren die T-Lymphocyten durch den T-Zellen-Antigen-Rezeptorkomplex (van Wauwe J.P. et al., J. Immunol., 124, 2708, 1980 und Meuer S.C. et al., J. Exp. Med., 158, 988, 1983). Gewisse Kombinationen von monoklonalen CD2- Antikörpern aktivieren T-Lymphocyten über einen Alternativmechanismus (Meuer S. et al., Cell, 36, 897, 1984) Die CD4- und CD8-monoklonalen Antikörper (z.B. OKT4 und OKT8) (Reinherz E.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4061, 1979 und Reinherz E.L. et al., J. Immunol., 124, 1301, 1980) definieren besondere Subpopulationen von T-Lymphocyten. Das Antigen, welches von monoklonalen CD4-Antikörpern definiert wird, wird hauptsächlich auf T-Helferzellen exprimiert und scheint MHC-Klasse-II-Genprodukte zu erkennen, während das Antigen, das von monoklonalen CD8-Antikörpern definiert wird, hauptsächlich auf T-Suppressor/cytotoxischen Zellen exprimiert ist und MHC-Klasse-I-Antigene zu erkennen scheint (Meuer S.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4395, 1982 und Biddison W.E. et al., J. Immunol., 131, 152, 1983).
- Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der Regulierung der Immunfunktion sind T-Zellen, die das CD4-Antigen (T-4-Zellen) tragen, bei der Diagnose von Krankheiten nützlich. Insbesondere das menschliche Immunschwächevirus (HIV) greift die T-4-Zellen an, was zu einem Rückgang der Anzahl der im Umlauf befindlichen T-4-Zellen führt. Ein Abfall der Anzahl der im Umlauf befindlichen T-4-Zellen ist eine Vorhersage für die Entwicklung des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) (Goedert J. et al., JAMA, 257, 331-334, 1987). Daher ist die Anzahlbestimmung der T- 4-Zellen bei der Behandlung von Patienten, die mit AIDS infiziert sind, medizinisch nützlich.
- Von den Antikörpern gegen das CD4-Antigen wird angenommen, daß sie zur Behandlung von Störungen des Immunsystems nützlich sind. Beispielsweise ergab bei Patienten mit rheumatoider Arthritis oder psoriatischer Arthritis die intravenöse Injektion von von Mäusen abgeleiteten monoklonalen anti-CD4-Antikörpern eine objektive Erleichterung für die Patienten (Herzog C. et al., The Lancet, 19.Dezember1987, 1461-1462).
- Von Mäusen abgeleitete monoklonale Antikörper, welche das CD4-Antigen erkennen, das für humane T-4-Zellen charakteristisch ist, wurden von Reinherz E. et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76(8), 4061-4065, 1979 beschrieben.
- Trotz der Entwicklung dieser monoklonalen Antikörper von Mäusen hat, aufgrund der Unterschiede im Immunrepertoire zwischen Ratte und Maus, ein Interesse daran bestanden, antihuman T-Lymphocyten und insbesondere monoklonale anti-human-CD4- Antikörper in einem Rattenmodell zu züchten. Darüberhinaus sind monoklonale Antikörper der Ratte attraktive Reagenzien für die klinische therapeutische Verwendung, da große Mengen von monoklonalen Antikörpern der Ratte einfach hergestellt und gereinigt werden können, und da gezeigt wurde, daß einige Isotypen von Ratten-Immunglobulinen humane Komplemente fixieren und humane Killerzellen aktivieren.
- Als technischer Hintergrund für die vorliegende Erfindung beschreibt Pierres A. et al., The Jounal of Immunology, 132(6), 2775-2782, 1984 die Herstellung von monoklonalen Antikörpern der Ratte.
- Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein reproduzierbares Verfahren zur Herstellung von neuartigen monoklonalen Antikörpern der Ratte gegen Human-T-Zellen- Lymphocyt-Antigen zur Verfügung zu stellen, welche an ein CD4- Antigen-Epitop binden, das von demjenigen Epitop weit genug abgesetzt ist, an das von Mäusen abgeleitete monoklonale Antikörper binden, so daß es zu keiner Kreuzblockierung kommt.
- Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Hybridzelle, die in der Lage ist, neuartige monoklonale Antikörper der Ratte zu produzieren, welche an Human-T-Zellen-Lymphocyt-Antigene an einem CD4-Antigen-Epitop binden, das weit genug von demjenigen Epitop abgesetzt ist, an das von Mäusen abgeleitete monoklonale Antikörper binden, so daß es zu keiner Kreuzblockierung kommt.
- Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuartigen monoklonalen Antikörpers der Ratte, der an Human-T-Zellen-Lymphocyten-Antigene an einem CD4- Antigen-Epitop bindet, das weit genug von demjenigen Epitop abgesetzt ist, an das von Mäusen abgeleitete monoklonale Antikörper binden, so daß es zu keiner Kreuzblockierung kommt.
- Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines monoklonalen Antikörpers der Ratte, der an Human-T-Zellen-Lymphocyten-Antigene an einem Human-CD4- Antigen-Epitop bindet, das von den Epitopen verschieden ist, die von den bekannten Anti-T4-Antikörpern von Mäusen, einschließlich der monoklonalen Antikörper der Maus OKT4 und Leu3a, definiert werden.
- Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung wurden durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern der Ratte, die an Human-CD4-Antigen binden, erzielt, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
- (1) Die Immunisierung einer Ratte oder von immunokompetenten Zellen der Ratte in vitro mit einer immunogenen Menge an Antigen, welches das CD4-Molekül umfaßt;
- (2) das Verschmelzen der immunisierten Zellen von der Ratte oder der immunisierten immunokompetenten Rattenzellen mit Immunocytomzellen;
- (3) Auswahl der Hybridzellen, die einen Antikörper produzieren, der an ein Human-CD4-Antigen-Epitop bindet, welches weit genug von demjenigen abgesetzt ist, an das monoklonale Antikörper von Mäusen binden, so daß es zu keiner Kreuzblockierung kommt;
- (4) Züchten der selektierten Hybridzellen; und
- (5) Isolieren des Antikörpers.
- In einer anderen Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung eine Hybridzelle, welche einen monoklonalen Antikörper der Ratte produziert, der an ein Human-CD4-Antigen-Epitop bindet, das von demjenigen Epitop weit genug abgesetzt ist, an das von Mäusen abgeleitete monoklonale Antikörper binden, so daß es zu keiner Kreuzblockierung kommt.
- In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper der Ratte bereit, der an ein Human-CD4-Antigen-Epitop bindet, welches von demjenigen Epitop weit genug abgesetzt ist, an das monoklonale Antikörper von Mäusen binden, so daß es zu keiner Kreuzblockierung kommt.
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform bindet der monoklonale Antikörper der Ratte an ein Human-CD4-Antigen- Epitop, das von denjenigen Epitopen verschieden ist, die von den von Mäusen abgeleiteten monoklonalen Antikörpern OKT4 und Leu3a definiert werden.
- In noch einer weiteren Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung ein Bindungsprotein, das die Bindungsspezifität des monoklonalen anti-CD4-Antikörpers der Ratte LO-CD4-a oder des monoklonalen anti-CD4-Antikörpers der Ratte LO-CD4-b aufweist, wobei diese jeweils von den Hybridzellen LO-CD4-a und LO-CD4-b produziert werden, die jeweils die ECACC-Hinterlegungsnummern 89012101 bezw. 89012102 aufweisen.
- Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers der Ratte, der gemäß der oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, zur Herstellung eines Präparates zur therapeutischen Verwendung zur Verfügung.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch eine diagnostische Methode in vitro zur Verfügung, die das In-Kontakt-Bringen eines monoklonalen Antikörpers der Ratte, der gemäß den oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, mit einer geeigneten Testprobe und die Durchführung eines Assays auf das Antigen umfaßt.
- Fig. 1a zeigt das Reaktivitätsmuster der monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b und der Bezugs-pan-T- oder untergeordneten T-spezifischen monoklonalen Antikörper OKT3, T11, T12, LO-CD5-a und OKT4 mit peripheren Blutlymphocyten (PBL) (linke Tafel) und mit Phytohämagglutinin-aktivierten (PHA) PBL (rechte Tafel). X-Achse: Fluoreszenzintensität; Y-Achse: Zellenanzahl.
- Fig. 1b zeigt das Reaktivitätsmuster der monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b und der Bezugs-pan-T oder untergeordneten T-spezifischen monoklonalen Antikörper OKT3, T11, T12, LO-CDS-a und OKT4 mit Mandelzellen (linke Tafel) und Thymocyten (rechte Tafel). X-Achse: Fluoreszenzintensität; y- Achse: Zellenanzahl.
- Fig. 2 zeigt Muster, erhalten durch Doppelmarkierung mit monoklonalen pan-T- oder pan-B-Antikörpern und monoklonalen Antikörpern der Ratte. Die Mandelzellen sind mit den monoklonalen LO-CD4-a-Antikörpern plus Fluorescein-konjugiertem Kaninchen-anti-Ratten-Immunglobulin-Antikörper-(Fab')&sub2;-Fragmenten (RARA-FITC) markiert, gefolgt von Maus-Anti-CD2-Phycoerythrin- Konjugat (T11PE) oder von Maus-Anti-CD19-Phycoerythrin-Konjugat (B4PE).
- Fig. 3 ist ein Doppelmarkierungsmuster, welches Unterordnungen von Lymphocyten zeigt, die von LO-CD4-a und LO- CD4-b erkannt werden. Einkernige periphere Blutzellen ("peripheral blood mononuclear cells", PBMN) wurden mit den monoklonalen Antikörpern LO-CD4-a oder LO-CD4-b der Ratte plus RARA-FITC, gefolgt von OKT4PE oder OKT8PE markiert.
- Fig. 4 zeigt Fluß-Cytometerzählungen von fluoreszenzmarkierten PBLs. Die X-Achse in allen Tafeln stellt die grüne Fluoreszenz- (Fluoreszenz 1) oder die rote Fluoreszenz- (Fluoreszenz 2) intensität dar, und die Y-Achse in allen Tafeln zeigt die Zählimpulse im Originalmaßstab. Die Fign. 4(A) bis 4(G) zeigen die Werte für den monoklonalen Antikörper LO-CD4-a, und die Fign. 4(H) bis 4(N) zeigen die Werte für den monoklonalen Antikörper LC-CD4-b.
- Fign. 4(A) und 4(B) sind Blindwerte, die die grüne und rote Autofluoreszenz jeweils für PBLs in Abwesenheit von zugegebenem Antikörper-Konjugat zeigen.
- Fig. 4(C) ist ein Blindwert, der die Bindung des monoklonalen Antikörpers LO-CD4-a an die PBLs zeigt, was durch Fluorescein-konjugiertes Mäuse-anti-Ratten-Konjugat (MARFITC) nachgewiesen wird.
- Fig. 4(D) ist ein Blindwert, der die Fluoreszenzintensität der PBLs nach der Inkubation mit OKT4FITC alleine zeigt.
- Fig. 4(E) zeigt die Fluoreszenzintensität von PBLs, die mit OKT4FITC nach Vorinkubation mit LO-CD4-a inkubiert wurden.
- Fig. 4(F) ist ein Blindwert, der die Fluoreszenzintensität der PBLs nach der Inkubation lediglich mit Leu3aPE zeigt.
- Fig. 4(G) zeigt die Fluoreszenzintensität von PBLs, die mit Leu3aPE nach Vorinkubation mit LO-CD4-a inkubiert wurden.
- Fign. 4(H) bis 4(N) entsprechen den Fign. 4(A) bis 4(G) mit der Ausnahme, daß wo der monoklonale Antikörper LO-CD4-a bei den Fign. 4(A) bis 4(G) verwendet wurde, der monoklonale Antikörper LO-CD4-b in den Fign. 4(H) bis 4(N) eingesetzt wurde.
- Fig. 5 zeigt Fluß-Cytometerzählungen von Fluoreszenzmarkierten PBLs. Die X-Achse in allen Tafeln stellt die grüne Fluoreszenz- (Fluoreszenz 1) oder die rote Fluoreszenz- (Fluoreszenz 2) intensität dar, und die Y-Achse in allen Tafeln stellt die Zählimpulse im Vollmaßstab dar.
- Fign. 5(A) bis 5(H) zeigen die Werte für nicht-erschöpfte PBLs, und die Fign. 5(I) bis 5(P) zeigen die Werte für CD4- erschöpfte PBLs.
- Fign. 5(A) bis 5(B) sind Vergleichswerte, die die grüne bzw. rote Autofluoreszenz für PBLs in Abwesenheit von zugegebenem Antikörperkonjugat zeigen. Fign. 5(C) und 5(D) zeigen die Bindung der monoklonalen Antikörper LO-CD4-a bzw. LO- CD4-b an nicht-verarmte PBLs, was durch Phycoerythrinkonjugierte Ziegen-anti-Ratten-Antikörper (GARPE) nachgewiesen wird. Fig. 5(E) ist ein Blindwert, der die Immunfluoreszenz der PBLs nach der Inkubation mit GARPE anzeigt. Die Fign. 5(F), 5(G) und 5(H) zeigen die Fluoreszenzintensität von nicht-verarmten PBLs nach der Inkubation mit Leu3aPE, OKT4FITC bzw. OKT8FITC.
- Fign. 5(I) bis 5(P) entsprechen den Fig. 5(A) bis 5(H), mit der Ausnahme, daß verarmte PBLs anstelle von nicht-verarmten PBLs eingesetzt wurden.
- Fig. 6 zeigt Punktauf tragungs-Analysen der Fluß- Cytometriedaten von roter Fluoreszenz gegen grüne Fluoreszenz für die Fluoreszenz-markierten PBLs. Die X-Achse jeder Auf tragung stellt die grüne Fluoreszenz (Fluoreszenz 1) dar, die Y-Achse jeder Auftragung stellt die rote Fluoreszenz (Fluoreszenz 2) dar.
- Fign. 6(A) bis 6(D) zeigen die Werte für den monoklonalen Antikörper LO-CD4-b, und die Fign. 6(E) bis 6(I) zeigen die Werte für den monoklonalen Antikörper LO-CD4-a.
- Fig. 6(A) ist ein Blindwert, der die Punktauftragung für rote und grüne Autofluoreszenz von PBLs in Abwesenheit von zugegebenem Antikörperkonjugat zeigt. Fig. 6(B) zeigt die Punktauftragung für die Fluoreszenz von PBLs, die mit monoklonalem Antikörperkonjugat Leu3aPE inkubiert wurden. Fig. 6(C) zeigt die Punktauf tragung der Fluoreszenz von PBLs, die mit MARFITC nach Vorinkubation mit dem monoklonalen Antikörper LO- CD4-b inkubiert wurden. Fig. 6(D) zeigt die Punktauftragung der Fluoreszenz von PBLs, die mit den monoklonalen Antikörperkonjugaten Leu3aPE und dann MARFITC nach Vorinkubation mit LO-CD4-b inkubiert wurden.
- Fign. 6(E) bis 6(H) entsprechen den Fign. 6(A) bis 6(D), mit der Ausnahme, daß der monoklonale Antikörper LO-CD4-a anstelle des monoklonalen Antikörpers LO-CD4-b verwendet wurde. Fig. 6(I) zeigt die Punktauf tragung für die Fluoreszenz von PBLs, die mit MARFITC nach Vorinkubation mit Leu3a inkubiert wurden.
- Fig. 7 zeigt die Fluß-Cytometerzählungen von Fluoreszenzmarkierten PBLs. Die X-Achse auf allen Tafeln stellt die grüne Fluoreszenz- (Fluoreszenz 1) oder rote Fluoreszenz- (Fluoreszenz 2) Intensität dar, und die Y-Achse auf allen Tafeln stellt die Zählimpulse im vollen Maßstab dar.
- Fign. 7(A) und 7(B) sind Blindwerte, die jeweils die grüne und rote Autofluoreszenz für PBLs in Abwesenheit von zugegebenem Antikörperkonjugat zeigen. Fig. 7(C) ist ein Blindwert, der die Fluoreszenz für PBLs, die mit GARPE allein inkubiert wurden, zeigt. Fig. 7(D) zeigt die Fluoreszenzintensität von PBLs, die mit OKT8 inkubiert wurden, was mit Phycoerythrin-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-Antikörper (GAMPE) nachgewiesen wurde. Die Fign. 7(E) und 7(F) zeigen die Fluoreszenzintensität von PBLs, die mit OKT4 bzw. Leu3a inkubiert wurden, wie mit GAMPE nachgewiesen. Die Fign. 7(G) und 7(H) zeigen die Fluoreszenzintensität von PBLs, die mit LO- CD4-a bzw. LO-CD4-b inkubiert wurden, wie mit GARPE nachgewiesen.
- Für die Zwecke dieser Anmeldung haben die folgenden Abkürzungen die folgenden Bedeutungen: AET: 2-Aminoethylisothio- Harnstoff-Oniumsalz; ALL: akute lymphoblastische Leukämie; CALL: gemeine ALL; CLL: chronische lymphocytische Leukämie; conA: Concanavalin A; Ig: Immunglobulin; DMSO: Dimethylsulfoxid; E: Schaf-Erythrocyten-Rosette; GAM-FITC: Fluorescein-konjugierte Ziegen-anti-Maus-Ig-Antikörper; IL2: Interleukin-2; PE: Phycoerythrin; FITC: Fluorescein-Isothiocyanat; kDA: kiloDalton; MAK: monoklonaler Antikörper; MLR: gemischte Lymphocytenreaktion; NBCS: Serum neugeborenen Kalbes; NHL: Nicht-Hodgkin-Lymphom; PBS: 8mM phosphatgepufferte 0,15 NaCl- Lösung, pH 7,2; PHA: Phytohämagglutinin; PWM: Kermesbeeren- Mitogen; PAGE: Polyacrylamidgelelektrophorese; PBMN: einkernige Peripherblutzellen; PMSF: Phenylmethansulfonylfluorid; RARA- FITC: Fluorescein-konjugierte Kaninchen-anti-Ratten-Ig- Antikörper F(ab')2-Fragmente; SAC: Staphylococcus aureus Cowan I; SDS: Natriumdodecylsulfat; SRBC: rote Blutkörperchen von Schafen; TT: Tetanus toxoid; ECACC: Europäische Hinterlegungsstelle für tierische Zellkulturen; PHLS: Zentrum für angewandte Mikrobiologie und Forschung in Porton Down, Salisbury, Wilts. SP 4-OJG, Vereinigtes Königreich.
- Wie oben beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung, um monoklonale Antikörper der Ratte herzustellen, die an Human-CD4-Antigen binden, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
- (1) Immunisieren einer Ratte oder von immunokompetenten Zellen der Ratte in vitro mit einer immunogenen Menge eines Antigens, das das CD4-Molekül umfaßt;
- (2) Verschmelzen der immunisierten Zellen der Ratte oder der immunisierten immunokompetenten Rattenzellen mit Immunocytomzellen;
- (3) Auswählen der Hybridzellen, die einen Antikörper produzieren, der an ein Human-CD4-Antigen-Epitop bindet, das von demjenigen weit genug abgesetzt ist, an welches monoklonale Antikörper der Maus binden, so daß es zu keiner Kreuzblockierung kommt;
- (4) Züchten der selektierten Hybridzellen; und
- (5) Isolierung des Antikörpers.
- Eine Vielzahl von Ratten, welche für den forschenden Fachmann leicht erhältlich sind, wie Wistar-, Sprague-Dawley-, Lewis- und Louvain-Ratten, sind für die Verwendung als Quelle immunisierter Zellen zur Verschmelzung geeignet.
- LOU/C- oder LOU/M-Ratten sind eine bevorzugte Quelle für die immunisierten Zellen zur Verschmelzung. Diese Ratten sind syngenische Ratten. Diese beiden Rattenstämme wurden ursprünglichen von Bazin et al. (J. Natl. Cancer Inst. (US), 51, 1359, 1973) entwickelt. Die Stämme sind für den Fachmann leicht erhältlich.
- Die Verfahren zur Immunisierung der Ratten sind unten im Detail beschrieben.
- Alternativ kann die stimulierung von antigen-spezifischen B-Zellen auch in vitro vollzogen werden. Die immunokompetenten Rattenzellen werden von den lymphatischen Organen, die aus der Ratte entfernt worden sind, geerntet. Die Verfahren zum Ernten und zur in-vitro-Immunisierung sind dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt. (C.L. Reading, Methods in Enzymology, 121:18-27, 1986; D. Gratecos et al., J. Immunological Methods, 103, 169-178, 1985; B.B. Mishell, S.M. Shiigi, Selected Methods in Celluar Immunology, 1980).
- Das Immunogen kann von jedwedem T-Lymphocyten oder jedweder T-Zellinie abgeleitet werden. Humane Herkunft der Zellen wird bevorzugt. Bevorzugterweise wird das CD4 von umlaufenden Human- T-Lymphocyten erhalten. Auch gereinigtes Antigen kann verwendet werden.
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Methode darauf gerichtet, monoklonale Antikörper von Ratten gegen Human- CD4-Antigen herzustellen.
- CD4 wurde ursprünglich durch den OKT-4-Antikörper (Kung P. et al., Science, 206, 347, 1979) als ein Antigen auf der Oberfläche einer Subpopulation von T-Zellen definiert, die in umlaufenden Peripherblutlymphocyten vorkommen. Das CD4-Antigen wurde desweiteren als ein Glycoprotein von 55kDa mit strukturellen Beziehungen zu anderen Gliedern der Immunglobulinfamilie (Thompson J. and Zimmermann W., Tumor Biol., 9, 63-83, 1988) charakterisiert. Das Gen für CD4 ist geklont worden und das Antigen wurde auf Zellen, die von Human- T-Zellen verschieden sind, exprimiert (Maddon P. et al., Cell, 47, 333-348, 1986). Das CD4-Antigen wurde auch in löslicher Form exprimiert, so daß es zur Routine wurde, das Glycoprotein in reiner Form zu isolieren (Deen K. et al., Nature, 331, 82-84, 1988). Das CD4-Antigen wird auch auf T-Zellinien wie der CEM und der HPB-ALL exprimiert, wie auch auf anderen Nicht-T-Zellinien wie U937 von myeloider Herkunft.
- Der Hinweis auf das CD4-Antigen bezieht sich auf das Glycoprotein von 55kDa oder auf Fragmente desselben, unbeachtet seiner Form oder Expressionsart. Dies umfaßt das CD4 auf umlaufenden T-Zellen, wie auch auf umlaufenden Nicht-T-Zellen, wie myeloiden Zellen. Ebenfalls umfaßt ist das CD4 von anderen Arten, welches zu Ratten-Antikörpern führen würde, welche mit Human-CD4 kreuzreagieren. Weiterhin ist rekombinantes CD4 umfaßt, sowohl wenn es in einer humanen als auch in einer nichthumanen Zelle exprimiert wird. Zusätzlich ist gereinigtes CD4 umfaßt, und zwar natürlicher wie auch rekombinanter Herkunft.
- Ein bevorzugtes Beispiel einer geeigneten T-Zellinie, die als Immunogen geeignet ist, ist die T-ALL-Linie und ihre Derivate, welche öffentlich zugänglich sind. Insbesondere bevorzugt ist HPB-ALL (Morikawa S. et al., Int. J. Cancer, 21, 166, 1978).
- Die T-Zellstämme werden mittels bekannter Verfahren gezüchtet, welche für die besondere verwendete T-Zellinie geeignet sind.
- HPB-ALL kann bei 37 ºC in Gegenwart von 5% CO2 in RPMI- 1640-Medium, welches 10%iges fetales Kälberserum, 2mM Glutamin und Streptomycin (PS) enthält, gezüchtet werden.
- Die gereinigten T-Lymphocyten sind wie folgt erhältlich.
- Einkernige Peripherblutzellen (PBMN) von normalen Spendern werden durch Zentrifugation auf Ficoll -Hypaque isoliert (Dichte: 1,077). Die T-Lymphocyten werden dann durch Rosettieren gemäß bekannten Verfahren mit 2-Aminoethylisothio-Harnstoff- Oniumsalz behandelten roten Blutkörperchen von Schafen (SRBC- AET) gereinigt. PBMN in einer Konzentration von 5 x 10&sup6;/ml werden dann mit 1/10 Volumen SRBC-AET bei einer Konzentration von etwa 1,0x10&sup9;/ml vermischt und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert. Die Inkubationsmischung wird bei 100g 5 Minuten lang inkubiert, und nach dem Resuspendieren des Pellets in einem physiologischen Puffer wird die Suspension bei 4ºC 1 bis 2 Stunden inkubiert. Die rosettierten Zellen (mehr als 95% an T- Lymphocyten) werden von den nicht-rosettierten Zellen (weniger als 5% an T-Lymphocyten) durch Zentrifugation auf Ficoll - Hypaque getrennt. Die T-Zellen werden von der Rosette durch Lyse des SRBC mit 0,83%igem NH&sub4;CL und durch nachfolgendes Auswaschen mit physiologischem Puffer abgetrennt.
- Die Immunisierungsvorschriften für die Ratten hängen vom Antigen ab und können vom Fachmann schnell bestimmt werden.
- Allgemein besteht ein geeignetes Immunisierungsverfahren aus zwei intraperitonealen Injektionen, die zweite nach einem drei- bis vierwöchigen Intervall und wahlweise einer intraperitonealen Stoßinjektion sechs bis acht Wochen später.
- Die Konzentrationen der Antigene, die zum Immunisieren der Ratten geeignet sind, sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt (J. J. Langone und H.V. Vunakis, Methods in Enzymology, 1986; Frontiers in Biology, 25, F. Borex, 1981)
- Das Immunogen kann zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger wie Freund'schem Adjuvanz oder physiologischer Kochsalzlösung verabreicht werden.
- Wie hierin verwendet bezieht sich "immunisierte Zellen" auf sensitivierte Milzzellen der immunisierten Ratte. Die sensitivierten Milzzellen werden mittels herkömmlicher Methoden aus der Ratte isoliert. Zusätzlich bezieht sich "immunisierte Zellen" auf in-vitro-immunisierte immunokompetente Zellen. Die immunisierten immunokompetenten Zellen werden mittels herkömmlicher Verfahren von den Immunorganen geerntet.
- Zur Herstellung der Hybridzelle werden die immunisierten Zellen oder die immunisierten immunokompetenten Rattenzellen mit Immunocytomzellen verschmolzen.
- Zur Verschmelzung mit immunisierten Zellen von LOU-Ratten werden vorzugsweise nicht-sezernierende IR983F Ratten- Immunocytomzellen verwendet. Die IR983F-Verschmelzungs-Zellinie (manchmal als die "983er-Zellinie" bezeichnet) ist eine permanente Azaquanin-resistente in-vitro-Zellinie. (Bazin H., in Protides of the Biological Fluids, H. Pecters. ed. 615, Pergamon, Oxford, 1982) und ist öffentlich zugänglich. IR983F- Zellen können auch als Fusionspartner für immunisierte immunokompetente Rattenzellen verwendet werden.
- Andere Verschmelzungspartner für immunisierte Rattenzellen oder immunisierte immunokompetente Rattenzellen sind die Y3-AG 1.2.3, YB2/3HL.B2.G11.16AG.20 und YB2/3.0.AG.20-Zellinien, welche alle ebenfalls öffentlich erhältlich sind. Die Fusionspartner für immunokompetente Rattenzellen können von einer anderen Spezies, wie von der Maus, stammen.
- Die Zellen werden bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; gezüchtet. Der Fachmann kann die geeigneten Zuchtbedingungen für andere Zellinien schnell ermitteln (J.J. Langone und H.V. Vanakis, Methods in Enzymology, supra).
- Die Verschmelzung wird ungefähr vier Tage nach der letzten Immunogeninjektion durchgeführt. Die Fusion kann gemäß vieler bekannter Verfahren, wie z.B. PEG, Elektrofusion und gemäß immunochemischen und biochemischen Verfahren, durchgeführt werden (J. Immunological Methods, 101, 153-170, 1987, S.R. Samoilovich et al.).
- Wenn allgemein ungefähr am siebten Tag nach der Verschmelzung Hybridklone beobachtet werden, werden sie in 24er- Vertiefungs-Titerplatten überführt. Wenn die Überstände in den Vertiefungen gelb werden, kann das Screening auf spezifische Antikörper-sezernierende Hybridklone mittels jeder geeigneten Methode wie der indirekten Immunfluoreszenz unter Verwendung der immunisierenden Zellen als Zielzellen durchgeführt werden. Nach einem zweiten Screening des Vollblutes werden die Hybridklone ausgewählt, welche Antikörper sezernieren, die mit Lymphocyten, nicht aber mit Granulocyten und/oder Monocyten reagieren. Die Hybridlinien werden dann mittels Einschränkung der Verdünnung zweifach geklont. Die Hybridzellen werden entweder im Kulturmedium aufgezogen, d.h. in vollständigem DMEM, sie werden in vollständigem DMEM - 7,5% DMSO tiefgefroren und in flüssigem Stickstoff nach bekannten Verfahren aufbewahrt (Soding J. W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 86, Academic Press, London, 1984), oder sie werden subkutan in LOU-Ratten oder in LOU/C.IGK-1b(OKA)-Ratten injiziert, um heftige Tumore zu induzieren.
- Die LOU/C.IGK-1b(OKA)-Ratten sind eine zum LOU/C-Stamm kogene Linie mit dem Ort der leichten Kappa-Kette des OKA- Stammes im LOU/C-Hintergrund (Bazin H. et al., J. Immunol. Methods, 71, 9, 1984). Die Tumorzellen können in PBS-10%ig FCS- 7,5%ig DMSO gefroren und nach bekannten Verfahren in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden (Bazin H. et al., Int. J. Cancer, 10, 568, 1972). Die Tumorzellen können auch intraperitoneal injiziert werden, um einen Ascites-Tumor hervorzurufen. Die Zellen können aus der Ascitesflüssigkeit erhalten und bei -80ºC aufbewahrt werden.
- Die monoklonalen Antikörper der Ratte können mittels bekannter Verfahren in großen Mengen hergestellt werden, entweder in vitro (siehe z.B. Bodeus M. et al., Immunol. Meth., 79, 1, 1985) oder in vivo (siehe z.B. Bazin H. et al., Int. J. Cancer, 10, 568, 1972 und Bazin H. Adv. Cancer Res., 50, 279, 1987)
- Die Reinigung der monoklonalen Antikörper der Ratte kann ebenfalls mittels bekannten Verfahren durchgeführt werden (siehe z.B. Bazin H., J. Immunol. Meth., 71, 9, 1984).
- Nach dem oben beschriebenen Verfahren können Hybridzellen hergestellt werden, die monoklonale Antikörper der Ratte produzieren, die an das Human-CD4-Antigen-Epitop binden, das weit genug von demjenigen abgesetzt ist, an das monoklonale Antikörper von Mäusen binden, so daß es zu keiner Kreuzblockierung kommt. Darüberhinaus ist es möglich, Hybridzellen herzustellen, die monoklonale Antikörper produzieren, die an ein Human-CD4-Antigen-Epitop binden, das von denjenigen Epitopen verschieden ist, die durch die gut bekannten monoklonalen Antikörper der Maus OKT4 und Leu3a definiert werden.
- Diese letztgenannten monoklonalen Antikörper können mittels Durchführung herkömmlicher Inhibitionsassays identifiziert werden. Eine Beschreibung eines geeigneten Assays ist im Detail in Beispiel 5 unten gegeben.
- Zwei bevorzugte monoklonale Antikörper der Ratte, die die kennzeichnenden Eigenschaften haben, daß sie (1) an Human-CD4- Antigen binden, und daß sie (2) nicht an die gleichen CD4- Antigen-Epitope binden, die von den monoklonalen Antikörpern der Maus OKT4 und Leu3a definiert werden, wurden gemäß des oben genannten Verfahrens isoliert.
- Einer dieser bevorzugten monoklonalen Antikörper, der LO- CD4-a genannt wurde, wurde nach der Immunisierung der T-ALL- Linie HPB-ALL erhalten. Dieser monoklonale Antikörper wird von der Hybridzelle LO-CD4-a produziert, welche am EPACC hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummer 89012101 trägt.
- Der andere der bevorzugten monoklonalen Antikörper wurde LO-CD4-b genannt und nach Immunisierung mit gereinigten T- Lymphocyten erhalten. Dieser monoklonale Antikörper wird von der Hybridzelle LO-CD4-b produziert, welche am EPACC hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummer 89012102 trägt.
- Eine eingehende Beschreibung der Herstellung der Hybridzellen, die diese Antikörper produzieren und weitergehende kennzeichnende Eigenschaften dieser Antikörper werden weiter unten in den Durchführungsbeispielen aufgezeigt.
- Es folgt eine kurze Zusammenfassung der weiteren kennzeichnenden Eigenschaften der monoklonalen Antikörper LO- CD4-a und LO-CD4-b.
- (1) Reaktion mit:
- (a) ungefähr 50% oder weniger der Peripherblutlymphocyten
- (b) ungefähr 70% der PHA-aktivierten Lymphocyten
- (c) ungefähr 60% der Mandelzellen
- (d) ungefähr 60% der Thymocyten.
- (2) Im wesentlichen keine Reaktion mit:
- (a) Monocyten
- (b) Granulocyten
- (c) roten Blutkörperchen
- (d) Blutplättchen
- (e)B-Lymphocyten-angereicherter Suspension von PBL mit vermindertem T-Lymphocytengehalt
- (f) B-Lymphocyten-angereicherter Suspension von Mandelzellen mit vermindertem T-Lymphocytengehalt.
- (1) T-Lymphocyten-spezifisch.
- (2) Sie erkennen die gleiche Subpopulation von T- Lymphocyten, die auch von den monoklonalen Antikörpern der Maus OKT4 und Leu3a erkannt wird.
- (3) Sie erkennen eine andere Subpopulation von T- Lymphocyten als die, die von dem monoklonalen Antikörper der Maus OKT8 erkannt wird.
- (1) Sie kreuzreagieren mit dem Nicht-T-Zellenstamm U937 (er exprimiert das T4-Antigen) (Tabelle 3).
- (2) Sie reagieren im wesentlichen nicht mit Nicht-T- und Nicht-B-Lymphoblasten (Tabelle 2).
- (3) Sie reagieren mit T-ALL-Zellinien (Tabelle 2).
- (4) Sie reagieren mit den CEM- und HPB-ALL-T-Zellinien (Tabelle 4).
- (5) Sie reagieren schwach mit der MOLT-4-T-Zellinie (Tabelle 4)
- (6) Sie reagieren nicht mit der JURKAT-T-Zellinie (Tabelle 4).
- Sie sind nur für CD4-positive Peripherblutlymphocyten spezifisch.
- (a) Die Vermehrung von Lymphocyten, die durch Tetanustoxoid oder allogenes Antigen induziert wird, wird um ungefähr 40 bis 60% gehemmt.
- (b) Die Vermehrung von Lymphocyten, die von Conconavalin A, Kermesbeerenmitogen oder von T3-induzierter Vermehrung ausgelöst wird, wird nicht wesentlich gehemmt.
- (c) Die Vermehrung von Lymphocyten, die von Phytohämagglutinin ausgelöst wird, wird nicht gehemmt.
- (a) Die Vermehrung von Lymphocyten, die von Tetanustoxoid oder allogenem Antigen ausgelöst wird, wird zu ungefähr 70% gehemmt.
- (b) Die Lymphocytenvermehrung, die durch Conconavalin A, Kermesbeerenmitogen oder von T3-induzierter Vermehrung ausgelöst wird, wird schwach inhibiert, d.h. ungefähr zu 30 bis 40%.
- (c) Die Lymphocytenvermehrung, die von Phytohämagglutinin ausgelöst wird, wird nicht gehemmt.
- Bei Anwendung des ersten Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann man vorwegnehmen, daß andere monoklonale Antikörper der Ratte entwickelt werden können, welche Epitope auf Human-T- Zellen-Lymphocytenantigenen erkennen, die von denjenigen Epitopen abgesetzt sind, welche von den monoklonalen Antikörpern der Maus, die gegen dieselben Antigene gerichtet sind, erkannt werden. Z.B. waren die Forscher bisher nur in der Lage, monoklonale Antikörper der Ratte gegen humane CD8- Markierung zu identifizieren, die das gleiche Epitop wie dasjenige erkennen, das von den monoklonalen Antikörpern der Maus wie OKT8 erkannt wird. Das vorliegende Verfahren sollte zu der Entwicklung monoklonaler Antikörper führen, die einen breiteren Bereich von Epitopen als die derzeitig verwendeten Verfahren erkennen, wenn sie vom Fachmann durchgeführt werden.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls ein Bindungsprotein, welches die kennzeichnenden Eigenschaften der monoklonalen Antikörper LO-CD4-a, hergestellt von der Hybridzelle LO-CD4-a mit der ECACC-Hinterlegungsnummer 89012101, und ein Bindungsprotein, welches die kennzeichnenden Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers LO-CD4-b aufweist, hergestellt von der Hybridzelle LO-CD4-b mit der ECACC- Hinterlegungsnummer 89012102.
- Rekombinante DNA-Techniken ermöglichen das Maßschneidern von Antikörpern, welche Bindungseigenschaften eines Antikörpers in der Rahmenumgebung eines Antikörpers einer anderen Klasse oder gar einer anderen Art haben. Solche Techniken sind im Fachgebiet gut bekannt. (Morrison S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, 1984 und Jones P. et al., Nature, 321, 522-525, 1986). Ebenfalls umfaßt sind die sogenannten "einkettigen" Antikörper, bei denen die Bindungsspezifität eines verwandten Antikörpers in einem Bindungsprotein von ungefähr 2skda reproduziert ist (Bird R. et al., Science, 242, 423-426, 1988). Alle Bindungsproteine, welche die Bindungseigenschaften von LO-CD4-a und LO-CD4-b haben, sind, ungeachtet ihrer Herkunft aus natürlicher oder rekombinanter Quelle, von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers der Ratte gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Präparats für die in-vivo- therapeutische Behandlung zu Verfügung.
- Der monoklonale Antikörper der Ratte wird allgemein zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht. Der pharmazeutisch verträgliche Träger, der verwendet wird, ist für das Verfahren nicht kritisch und der Fachmann kann geeignete Träger ohne Schwierigkeiten bestimmen.
- Ein pharmazeutisch verträglicher Verdünner kann ebenfalls beim therapeutischen Präparat der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Der besondere pharmazeutisch verträgliche Verdünner, der eingesetzt wird, ist nicht kritisch. Beispiele für solche Verdünner umfassen physiologische Kochsalzlösung, Rincfer-Lösung, Vitamin-Cocktail und Aminosäure-Vitamincocktail.
- Die Antikörper können intravenös oder mittels eines jeden Verfahrens, das vom Fachmann als für die besondere Therapie geeignet erachtet wird, verabreicht werden.
- Die pharmazeutisch wirksame Menge der Antikörper der vorliegenden Erfindung, welche zu verabreichen ist, hängt von dem Alter, dem Gewicht und dem Geschlecht des Patienten ab und kann ohne weiteres vom Fachmann bestimmt werden.
- Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein in-vitro- diagnostisches Verfahren zur Verfügung, welches das In -Kontakt- Bringen eines monoklonalen Antikörpers der Ratte nach vorliegender Erfindung mit einer geeigneten Testprobe umfaßt, und die Durchführung eines Assays für das Antigen.
- Der Ausdruck "Testprobe" bedeutet z.B. Gewebebiopsien, Serum, Ascitesflüssigkeit und Rückenmarksflüssigkeit.
- Der in-vitro-Nachweis kann geführt werden, indem jede der gut bekannten in-vitro-immunologischen Assaymethoden durchgeführt wird, wie die, die bei Young W.W. et al., J. Exp. Med., 150, 1008-1019, 1979 und Kannagi R. et al., Cancer Res., 43, 4997-5005, 1983) beschrieben sind.
- Die Erfindung wird jetzt unter Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele beschrieben, welche nur der Veranschaulichung dienen und nicht als Einschränkung der vorliegenden Erfindung zu verstehen sind.
- Einkernige Peripherblutzellen (PBMN) von normalen Spendern wurden mittels Zentrifugation auf Ficoll -Hypaque (d: 1,077) isoliert. Die T-Lymphocyten wurden durch Rosettieren mit mit 2- Aminoethylisothio-Harnstoff-Oniumsalz behandelten roten Blutkörperchen von Schafen (SRBC-AET) wie folgt gereinigt PBMN von 5x10&sup6;/ml wurden mit 1/10 Volumen AET-SRBC von ungefähr 1,0x10&sup9;/ml gemischt und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert. Nach Zentrifugation bei 100 g für 5 Minuten und erneuter ein- oder zweistündiger Inkubation bei 4ºC wurden die rosettierten Zellen 095% an T-Lymphocyten) von den nicht- rosettierten Zellen ((5% an T-Lymphocyten) durch Zentrifugation auf Ficoll -Hypaque getrennt. Die SRBC wurden mit 0,83%igem NH&sub4;Cl lysiert.
- Für die Immunisierung wurden sowohl die T-Zellinie HPB-ALL (Morikawa S. et al., Int. J. Cancer, 21, 166, 1978) als auch gereinigte T-Lymphocyten verwendet. Für den ersten Versuch wurden 2 x10&sup7; HPB-ALL-Zellen, die in Freund'schem vollständigem Adjuvanz suspendiert waren, intraperitoneal (i.p.) in eine LOU/C-Ratte injiziert. Einen Monat später wurden 2x10&sup7; Zellen, und sieben Wochen später wurden 5x10&sup7; Zellen intraperitoneal injiziert. Bei den zweiten beiden Immunogeninjektionen wurde kein Adjuvanz verwendet. Beim zweiten Versuch wurden 5x10&sup7; gereinigte T-Lymphocyten zweimal innerhalb eines dreiwöchigen Zeitraums intraperitoneal in eine erste LOU/C-Ratte injiziert. Bei der ersten Injektion wurden die T-Lymphocyten im Freund'schen vollständigen Adjuvanz suspendiert. Für die zweite Injektion wurde kein Adjuvanz verwendet.
- Die HPB-ALL wurden bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; in RPMI-1640-Medium, enthaltend 10%iges fetales Kälberserum, 2mM Glutamin und PS aufgezogen.
- Für die Fusion wurden IR983F (983) nicht-sezernierende Ratten-Immuncytomzellen (Bazin H., "Production of rat monoclonal antibodies with LOU rat non-secreting IR983F myeloma cell line"' in Prot. Biol. Fluids, Peeters H., ed., Pergamon Press, Oxford and N.Y., 1982, 615) verwendet. Die Zellen wurden in DMEM-Medium (Gibco) aufgezogen, welches mit 15% Pferdeserum (HS), 2mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin (PS) und nicht-essentiellen Aminosäuren versetzt worden war (komplettes DMEM-Medium). Die 983er-Zellen wurden bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; kultiviert.
- Die Verschmelzung wurde vier Tage nach der letzten Injektion durchgeführt.
- Für die Verschmelzung als solche wurde Eagle's minimalessentielles Medium oder MEM (REGA 3) ohne L-Glutamin (GIBCO) verwendet, gepuffert mit lomm HEPES (GIBCO) und versetzt mit 50mg Gentamicin/l (GIBCO).
- Die 983er-Zellen wachsen in DMEM ohne HEPES (Dulbecco's modified Eagle's medium; GIBCO), das mit 5% hitzeinaktiviertem (30 Minuten bei 56ºC) fetalem Kälberserum (GIBCO), 5% hitzeinaktiviertem Pferdeserum (Flow), 1% nicht-essentiellen Aminosäuren (GIBCO), 1% Natriumpyruvat 100mM (GIBCO) und 0,1% Gentamicinsulfat 50mg/ml (GIBCO) versetzt ist, gut an.
- Alle Serumchargen, die für Kulturzwecke verwendet wurden, wurden 3 Wochen lang auf ihre Wirksamkeit für das Wachstum der 983er Zellinie untersucht. Eine optimale Verdopplungszeit von ungefähr 17 Stunden oder weniger ist verlangt.
- Für die Hybridzellen-Selektionsmedien wurden Hypoxanthin- Aminopterin-Thymidin (HAT) (50X) und Hypoxanthin-Thymidin (HT) (50X) verwendet. Die Konzentrationen von Aminopterin (Sigma), Hypoxanthin (Sigma) und Thymidin (Sigma) betragen jeweils 20, 5 und 0,8mM.
- Die Verschmelzung wurde unter Verwendung von PEG (Polyethylenglykol) durchgeführt.
- Die Konzentration der PEG-Lösung, die für die Fusion verwendet wurde, betrug 41,6% im Fusionsmedium, welches 8,75ml Dimethylsulfoxid (Merck) enthielt und welches zu 100g der anfänglichen PEG-Lösung zur Verbesserung der Fusionseffizienz zugegeben worden war. PEG-Lösung-Endportionen 2ml wurden durch Autoklavieren oder Filtrieren sterilisiert und für eine Maximaldauer von 3 Monaten bei 37ºC in einem Inkubator aufbewahrt.
- Die Nährrasen aus Peritoneumszellen der Ratte wurden am Tage vor der Verschmelzung im HAT-Medium oder 1 bis 4 Tage vor der Entwicklung oder dem Klonen in HT-Medium vorbereitet. Die Zellen wurden bei einer Konzentration von 2 x10&sup5; Zellen/ml, bezogen auf 0,1ml/Mikrovertiefung (96er-Mikrotiterplatten) oder bezogen auf 1ml/Makrovertiefung (24er-Titerplatten) ausgesät. In keinem späteren Stadium, wie z.B. während der Massenkultur oder dem zusätzlichen Klonen, werden Peritonealzellen zugesetzt. Der Ursprung der Ratten, die als Quelle für die Nährrasen verwendet werden, ist nicht wichtig, und daher wurden ausgewachsene Wistar-Ratten verwendet.
- Die Fusionsfähigkeit der 983er-Zellen hängt von den wachstumsbedingungen ab. Um eine hohe Ausbeute an Hybriden sicherzustellen, müssen die zur Fusion verwendeten IR983F-Zellen seit wenigstens einer Woche in einer streng exponentiellen Wachstumsphase sein. Die verschiedenen Möglichkeiten, um diese Bedingungen einzustellen, bestehen entweder in der täglichen Zugabe von Medium zu dem Kulturgefäß ("Spinner" oder Plastikkolben) zum Einstellen der Zellkonzentration auf 5x10&sup5; Zellen/ml (A. M. Lebacq-Verheyden et al., Hybridoma, 2, 355, 1983) oder in der Rückstellung der Zellkonzentration auf 10&sup5; Zellen/ml an den Tagen 0, 3 und 5.
- Nach der Betäubung wurde den immunisierten LOU-Ratten an der Arteria Carotis Blut entnommen. Ihre Milz wurde entfernt und unter EMEM ohne Serum gesetzt. Das Organ wurde unter sterilen Bedingungen mit einem Metallgitterstampfer in einem Becherglas zerkleinert. Die Zellsuspension wurde 10 Minuten lang stehengelassen und die großen Bruchstücke, die sich absetzten, wurden verworfen.
- Die 983er-Zellen und die Milzzellen wurden 5 Minuten bei g zentrifugiert. Der Niederschlag wurde zweimal mit Fusionsmedium EMEM ohne Serum gewaschen. Die Zellen wurden in einem Verhältnis von einer 983er-Zelle auf je fünf Milzzellen vermischt. Nach Zentrifugation (5 Minuten bei 250 g) wurde der Überstand verworfen und der verdichtete Zellniederschlag wurde durch leichtes Schütteln aufgelockert. 1 ml angewärmte PEG- Lösung (37ºC) wurde tropfenweise zu 2 x10&sup7; Zellen im Zeitraum von 90 Sekunden leichten Schüttelns hinzugefügt. Nach weiteren 30 Sekunden Schütteln wurden während des folgenden Zeitraums von 90 Sekunden 2ml EMEN zu der Zellmischung hinzugegeben. Zuletzt wurden 20ml EMEM fortschreitend zur Verdünnung der PEG-Lösung hinzugegeben. Eine 5-minütige Zentrifugation bei 180 g wurde vor der Resuspension aller Zellen in dem der Selektion dienenden serumreichen HAT-Kulturmedium ausgeführt. Die Zelldichte wurde auf 10&sup6; Zellen/ml eingestellt, und die Zellsuspension wurde auf 24-(1ml)- und 96-(0,1ml)-Titerplatten verteilt, welche Peritonealzellen in Selektions-HAT-Medium enthielten. Das Medium wurde vor dem Beginn des Screeningverfahrens viermal ausgetauscht.
- Ab dem siebenten Tag nach der Verschmelzung wurden Hybridklone beobachtet und auf 24er-Titerplatten übertragen. Sowie sich die Überstände in den Vertiefungen gelb verfärbten, wurde mittels indirekter Immunfluoreszenz ein Screening auf spezifische Antikörper-sezernierende Hybridklone durchgeführt, wobei immunisierende Zellen als Zielzellen verwendet wurden. Nach einem zweiten Screening des Vollblutes wurden solche Hybridklone, welche Antikörper ausschieden, die mit Lymphocyten, nicht aber mit Granulocyten und/oder Monocyten reagierten, ausgewählt. Die Hybridlinien wurden zweimal durch einschränkende Verdünnung geklont. Die Hybridzellen wurden gezüchtet und entweder in vollständigen DMEM mit 7,5% DMSO eingefroren und unter flüssigem Stickstoff aufbewahrt, oder subkutan in LOU- Ratten injiziert, was feste Tumore hervorruft. Die Tumorzellen wurden in PBS, 10%ig FCS, 7,5%ig DMSO eingefroren und unter flüssigem Stickstoff aufbewahrt, oder, falls nötig, wurden die Tumorzellen mittels bekannter Verfahren intraperitoneal zur Induktion von Ascitestumoren injiziert (Bazin H. et al., Immunol. Methods, 71, 9, 1984). Die Seren oder die Ascitesflüssigkeit von tumorbefallenen Ratten wurden gesammelt und bei -80ºC aufbewahrt.
- Von den Hybridklonen, welche Antikörper gegen die immunisierenden Zellen ausschieden, wiesen die meisten gegenüber Granulocyten und/oder Monocyten Kreuzreaktivität auf und wurden nicht weiter analysiert. Fünf sezernierten einen monoklonalen Antikörper, der selektiv mit Lymphocyten reagierte und deren zwei, die mit LO-CD4-a und LO-CD4-b bezeichnet wurden, sezernierten einen monoklonalen Antikörper, der mit CD4 reagierte. Der monoklonale Antikörper LO-CD4-a wurde nach Immunisierung mit der T-ALL-Zellinie (HPB-ALLI4) und der monoklonale Antikörper LO-CD4-b nach Immunisierung mit gereinigten T-Lymphocyten erhalten.
- Die monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b wurden entweder in vitro oder in vivo in größeren Mengen hergestellt.
- Für die in-vitro-Herstellung der monoklonalen Antikörper wurden die Hybridzellen LO-CD4-a oder LO-CD4-b unter Standardbedingungen aufgezogen, die für die Fusion von IR983F- Zellstämmen im wesentlichen nach der Methode von Bazin H. beschrieben sind ("Production of rat monoclonal antibodies with the LOU rat non-secreting 983F myeloma cell line" in Prot. Biol. Fluids, 1982, Peeters E. ed., 9th colloquium, 1981, Pergarnon Press, Oxford and N.Y. 55. 615-618). Die in-vitro-Herstellung der monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b auf Platten, in Kolben oder in Rollflaschen, wurde im wesentlichen nach dem Verfahren durchgeführt, das von Bodeus M. et al.,in Immunol. Meth., 79, 1, 1985 beschrieben ist.
- Für die in-vivo-Herstellung der monoklonalen Antikörper wurden Ratten des LOU/C- oder des LOU/C.IgK-lb(OKA)-Stammes (Bekers A. et al., Immunochemistry, 11, 605, 1974) verwendet. Die Ratten sind mit den Hybridzellen LO-CD4-a und LO-CD4-b, welche LOU/C-Hybridzellen sind, gänzlich histokompatibel. Die Ratten des LOU/C.IgK-1b-Stammes wurden zur Erleichterung der Reinigung der monoklonalen Antikörper bevorzugt; dies kommt daher, daß die LOU/C.IgK-1b-Ratten leichte Kappaketten des Kappa-1b-Allotyps produzieren, und daß die monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b Immunoglobuline mit den IgK-1a- Allotyp leichten Ketten sind. Daher können verseuchende IgK-1b- Immunoglobuline vom Wirt mittels Standardverfahren einfach durch Immunadsorption von Anti-IgK-1b-Antikörpern eliminiert werden.
- Um die Hybridzellen an die in-vivo-Aufzucht anzupassen, wurde die erste Übertragung der in-vitro-aufgezogenen Hybridzellen subkutan durchgeführt. Dieser Verabreichungsweg ist erfolgreicher als andere Wege und verwendet eine geringere Anzahl von Zellen, als sie für den intraperitonealen Verabreichungsweg vonnöten sind.
- Die Ratte wurde betäubt, und 5 x10&sup6; Hybridzellen wurden subkutan in die rechte Flanke injiziert (vorteilhafterweise). Die Ratte wurde dreimal pro Woche auf Tumorwachstum untersucht. Der Tumor erscheint allgemein nach 2 bis 3 Wochen, aber bis zu 3 Monate können verstreichen, bevor sich die Hybridzellen zu vermehren beginnen.
- Nach geeignetem Tumorwachstum wurde die Ratte betäubt, und ihr wurde eine Blutprobe entnommen, um die Ausscheidung monoklonalen Antikörpers zu überprüfen. Danach wurde die Ratte getötet, der Pelz mit 70%igem Ethanol abgetupft und ein Stück- Tumor entfernt und in PBS (0,15M phosphatgepufferte Kochsalzlösung; pH 7,2) mit einem Potter-Homogenisator zerkleinert.
- Diese Zellen wurden dann für die Ascitesherstellung verwendet.
- Die LOU/C-Ratte bildet nach intraperitonealer Injektion von syngenischen Immunocytomzellen oder Hybridzellen ohne jede Initialisierung leicht Ascites (Bazin H. et al., Int. J. Cancer, 10, 568, 1972 und Bazin H., Adv. Cancer Res., 50, 279, 1987). Jedoch kann die Ausbeute an Ascitesflüssigkeit wesentlich gesteigert werden, wenn man mit einer 1:1 (Volumen/Volumen)- Mischung von 2,6, 10-14-Tetramethylpentadecan (Pristan ) und unvollständigem Freund'schem Adjuvanz (IFA) vorbehandelt. Daher kann die Ascitesproduktion auch mittels intraperitonealer Injektion von 2ml der Mischung, genannt PIFA oder von IFA, zum Zeitpunkt der Tumorübertragung erzielt werden (Kints J.-P. et al., Enhancement of ascites production by intraperitoneal injection of Pristane and incomplete Freund adjuvant. Joint meeting of Contact Group Monoclonal Antibodies and Belgian Immunological Society, ULB-VUB, Brussels, 19.Februar 1988).
- Das Verfahren zur Herstellung von Ascites war wie folgt.Das Öl (PIFA oder IFA) und die Zellen wurden in getrennten Spritzen angesetzt, um die Tötung der Zellen durch die Emulsion auszuschließen. Nach der Betäubung wurden 2ml Adjuvanz intraperitoneal durch die rechte Flanke injiziert, und auch die Zellen wurden intraperitoneal injiziert, aber durch die linke Flanke, um zufällige Animpfung innerhalb der Milz zu vermeiden. Das Abdomen wurde leicht massiert, um die Zellen und das Öl innerhalb der gesamten Peritonealhöhle zu verteilen. Die Ratten wurden unter Standardbedingungen bei Ernährung und Wasser nach Bedarf gehalten. Sie wurden dreimal die Woche auf das Wachstum eines ascitischen Tumors untersucht.
- Die Ascitesflüssigkeit wurde entnommen, als der Tumor seine maximale Entwicklung erreichte. Die Ratte wurde unter der Ätherglocke getötet und mit einer 18G-Nadel gestochen. Die Ascitesflüssigkeit wurde in einem sauberen Kolben gesammelt. Nach dem Abtupfen mit Alkohol wurde die peritoneale Höhlung auf der linken Seite des Abdomens geöffnet. Als keine Flüssigkeit mehr durch die Nadel hindurchtrat, wurde die verbleibende Ascitesflüssigkeit auf der Leberseite mit einer 20-ml-Spritze ohne Nadel angesaugt.
- Die monoklonalen Antikörper wurden mittels Standard- Ammoniumsulfat-Verfahren aus der in-vitro-Kultur oder aus der Ascitesflüssigkeit gereinigt erhalten. Alternativ wurden die monoklonalen Antikörper durch Immunadsorption auf Anti-IgK-1b- Antikörpern bis zur Homogenität gemäß Standardverfahren gereinigt erhalten (siehe z.B. Bazin H. et al., J. Immunol. Meth., 71, 9, 1984, für den Erhalt aus Ascitesflüssigkeit).
- Die Hybridzellen, die die monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b produzieren und jeweils mit LO-CD4-a und LO-CD4-b bezeichnet sind, wurden bei der European Collection of Animal Cell Cultures hinterlegt und tragen die ECACC- Hinterlegungsnummer 89012101 bzw. 89012102.
- In allen Beispielen unten wurde monoklonaler Antikörper LO- CD4-a aus einem Ascites-Niederschlag verwendet, der mit 50%ig gesättigter Ammoniumsulfatlösung erhalten worden war. Der monoklonale Antikörper LO-CD4-b wurde bis zur Homogenität gereinigt.
- 5x10&sup5; Zellen in 100ul PBS -2%ig an neugeborenem Kälberserum (NBCS) -0,2% NaN&sub3; oder 100 ul Vollblut wurden 45 Minuten lang bei 4ºC mit 100ul Antikörper-enthaltendem Überstand oder Serum (in 1/200-facher Verdünnung) inkubiert. Normal-Rattenserum wurde als Blindwert verwendet. Die roten Blutkörperchen wurden lysiert, wenn Vollblut verwendet wurde. Die Zellen wurden einmal gewaschen und 45 Minuten bei 4ºC mit 100ul Kaninchen-anti- Ratten-Immunglobulin (Ig)-AntikörperF(ab')&sub2;-Fragmenten, die mit Fluoresceinisothiocyanat (RARA-FITC) markiert waren, oder mit Ziegen-anti-Maus-Ig, das an FITC (GAM-FITC) konjugiert war, inkubiert. Die Zellen wurden einmal gewaschen. Die Immunfluoreszenzintensität wurde entweder in einem Mikroskop oder in einem EPICS-Cytofluorographen (Coulter) überprüft.
- Die Peripherblutlymphocyten wurden mittels einer Einschritt-1,077-Dichte-Ficoll -Hypaque-Trennung aus dem Blut normaler Spender isoliert. Die Lymphocyten wurden nach bekannten Methoden mit PHA aktiviert. Die Mandelzellen und Thymocyten wurden mittels bekannter Methoden erhalten. Durch die Verarmung der Suspensionen an T-Lymphocyten durch SRBC-Rosettieren nach bekannten Verfahren wurden B-Lymphocyt-angereicherte Suspensionen von PBL und Mandelzellen erhalten.
- Die monoklonalen Bezugs-Antikörper OKT3 (CD3) und OKT4 (CD4) wurden von Ortho Diagnostics erhalten. Die monoklonalen Bezugs- Antikörper T11 (CD2) und T12 (CD6) wurden von Coulter geliefert. Der monoklonale Bezugs-Antikörper LO-CDS-a (CD5) wurde von den Erfindern hergestellt.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und Fig. 1 gezeigt. TABELLE 1 REAKTIVITÄT MIT NORMALEN HÄMATOPOIETISCHEN ZELLEN Zellen Blut Lymphozyten Gesamt Monocyten Granulocyten Blutplättchen Mandelzellen Thymocyten
- Die monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b reagierten nur mit T-Lymphocyten (Tabelle 1). Keine Reaktion wurde mit Monocyten, Granulocyten, roten Blutkörperchen, Blutplättchen oder mit einer B-Lymphocyten-angereicherten Suspension, die aus PBL- und Mandelzellen durch Verarmung an T- Lymphocyten mittels SREC-Rosettieren hergestellt worden war, festgestellt. Die monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b reagierten heftig mit ungefähr 55% der PBL und mit ungefähr 70% der T-Lymphocyten- angereichterten PBL. Daher sind diese beiden monoklonalen Antikörper für eine Untergruppe von T-Lymphocyten spezifisch.
- Die typischen Reaktivitätsmuster der monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b und der pan-T- oder Untergruppen-T-spezifische monoklonale Bezugs-Antikörper OKT3, T11, Tl2, LO-CD5-a und OKT4 sind in Fig. 1 gezeigt.
- In Fig. 1a zeigt die linke Tafel das Reaktivitätsmuster mit PBLs und die rechte Tafel zeigt das Reaktivitätsmuster mit PHA- aktivierten PBLs. In Fig. 1b zeigt die linke Tafel das Reaktivitätsmuster mit Mandelzellen und die rechte Tafel zeigt das Reaktivitätsmuster mit dem Thymocyten. Die X-Achse stellt die Fluoreszenzintensität und die Y-Achse die Zellenanzahl dar.
- Die Profile der monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO- CD4-b waren mit demjenigen des monoklonalen CD4-Antikörpers OKT4 identisch, welche Zellenart auch immer betroffen war. Die monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b reagierten heftig mit ungefähr 65% der Thymocyten.
- Für die doppelte Immunfluoreszenz wurden Mandelzellen oder PBMNS mit monoklonalen Antikörpern der Ratte und RARA-FITC wie im Beispiel 2 oben markiert. Dann wurden die Zellen mit Phycoerythrin-konjugierten monoklonalen Antikörpern 45 Minuten bei 4ºC inkubiert.
- Die Mandelzellen wurden nach bekannten Verfahren erhalten.
- PBMNS von normalen Spendern wurden durchs Zentrifügation auf Ficollo -Hypaque (Dichte: 1,077) isoliert, wie in Beispiel 1 beschrieben.
- Die monoklonalen Bezugs-Antikörper T11 (CD4) und B4 (CD19) wurden von Coulter geliefert und die monoklonalen Bezugs- Antikörper OKT4 (CD4) und OKT8 (CD8) von Ortho Diagnostics.
- Um zu bestätigen, daß LO-CD4-a und LO-CD4-b T-Lymphocytenspezifisch sind, und um herauszufinden, ob die von den monoklonalen Antikörpern LO-CD4-a und LO-CD4-b erkannte T- Lymphocyten-Subpopulation tatsächlich die von OKT4 erkannte ist, wurden Mandelzellen (Fig. 2) oder PBMN (Fig. 3) zunächst mit den monoklonalen Antikörpern der Ratte LO-CD4-a und LO-CD4-b und RARA-FITC, gefolgt von den Phycoerythrin-konjugierten monoklonalen Bezugs-Antikörpern der Maus T11 (CD2), B4 (CDLg) (Fig. 2), OKT4 (CD4) oder OKTS (CD8) (Fig. 3) markiert. Die Zellen, die mit dem monoklonalen Antikörper LO-CD4-a markiert waren, machten ungefähr 78% der T11+-Lymphocyten aus (Fig. 2). Im Gegensatz dazu war der Prozentsatz an Lymphocyten, die mit B4 und dem monoklonalen Antikörper der Ratte LO-CD4-a doppelrnarkiert waren, niedrig (4 bis 6%) (Fig. 2). Diese schwache Positivreaktion könnte auf einer spezifischen Bindung an die Fc-Rezeptoren auf den B-Zellen beruhen. Hinsichtlich der Untergruppen peripherer T-Lymphocyten, wurden mehr als 99% der T4+-Lymphocyten auch mit LO-CD4-a oder LO-CD4-b, und weniger als 2% an PBL wurden allein mit OKT4 oder allein mit dem monoklonalen Antikörper der Ratte markiert (Fig. 3). Weniger als 6% PBL-Zellen waren mit OKT8 und LO-CD4-a oder LO-CD4-b doppelmarkiert (Fig. 3). Daher sind die monoklonalen Antikörper der Ratte LO-CD4-a und LO-CD4-b T-Lymphocyten-spezifisch. Darüberhinaus ist die Subpopulation an T-Lymphocyten, die von LO-CD4-a und LO-CD4-b erkannt wird, genau diejenige, die von OKT4, nicht aber von OKT8 (T4+, T8-) erkannt wird.
- Um die Kreuzreaktionen mit unreifen B- oder myeloiden Zellen nachzuweisen und um abzugrenzen, in welchem Stadium der Differenzierung die verschiedenen T-Antigene erscheinen oder verschwinden, wurden Leukämie-Zellen, Lymphom-Zellen (Tabelle 2) und Leukämie-abgeleitete Zellinien (Tabellen 3 und 4) untersucht.
- Die indirekte Immunofluoreszenz wurde wie im Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.
- Die Leukämie- und Lymphomzellen T-ALL, T-CLL, B-CLL, B-NHL und CALL wurden nach bekannten Verfahren von Leukämie-Patienten erhalten. Leukämie-abgeleitete Zellinien der B-Linie (Nalm-1, KM3, Nalm-6, Raji and Daudi), die Myelomlinie (U937, HL-60 und K562) und CCRF-CEM, HPB-ALL, MOLT-4 und JURKAT sind alle öffentlich zugänglich.
- HPB-ALL, CCRF-CEM, MOLT-4, JURKAT, Raji, Daudi, Nalm-1, Nalm-6, KM3, U937, K562 und HL-60 wurden bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO in RPMI-1640-Medium, enthaltend 10%iges fetales Kälberserum, 2mM Glutamin und PS, gezüchtet.
- Die monoklonalen Antikörper OKT3 (CD3) und OKT4 (CD4) wurden von Ortho Diagnostics geliefert. Die monoklonalen Antikörper T11 (CD2) und T12 (CD6) wurden von Coulter geliefert. Der monoklonale Antikörper Leu3a wurde von Becton-Dickenson geliefert. Der monoklonale Antikörper LO-CDS-a (CDS) wurde von den Erfindern hergestellt und als Vertreter für einen monoklonalen anti-CDS-Antikörper verwendet. TABELLE 2 REAKTIVITÄT MIT LEUKAMIEZELLEN Zellen TABELLE 3 REAKTIVITÄT MIT NICHT-T-ZELLINIEN Zellen B-Linien Nalm Raji Daudi Myeloide Linien TABELLE REAKTIVITÄT MIT T-ZELLINIEN Monoklonale Antikörper
- Es wurde keine Kreuzreaktion der monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b mit den in Tabelle 3 aufgelisteten Nicht- T-Zellstämmen gefunden, mit Ausnahme der Kreuzreaktivität mit U937, wie sie auch OKT4 und Leu3a aufwiesen (die Daten sind nicht gezeigt). Diese Zellinie exprimiert bekanntermaßen das T4- Antigen.
- Nicht-T-nicht-B-Lymphoplasten wurden von den monoklonalen Antikörpern LO-CD4-a oder LO-CD4-b nicht markiert (Tabelle 2). Der Nachweis von 2 bis 12% positiven Zellen kann mit der Anwesenheit verbleibender Normallymphocyten begründet werden. Die 2 bis 10% an Zellen, die deutlich mit LO-CD4-a und LO-CD4-b markiert wurden, beruhten wahrscheinlich auf verbleibenden Normalzellen. LO-CD4-a und LO-CD4-b färbten alle T-ALL- Zellstämme, die getestet wurden (Tabelle 2), mit wechselnder Intensität an, wie es auch der OKT4 tat (Werte nicht gezeigt).
- Tabelle 4 zeigt, daß das LO-CD4-a- und das LO-CD4-b-Antigen auf CEM und HPB-ALL-T-Zellinien vorhanden sind und schwach auf den MOLT-4-T-Zellinien exprimiert werden, nicht aber auf der JURKAT-T-Zellinie. Das ist das gleiche Muster, wie es die monoklonalen Antikörper Leu3a und OKT4 zeigen.
- Die monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b erkannten genau die gleiche Untergruppe an T-Lymphocyten wie der OKT4 (Fig. 3). Daher wurde untersucht, ob die Blockierung der Bindung von monoklonalen CD4-Antikörpern der Maus durch LO-CD4-a und LO- CD4-b dadurch bestimmt war, daß LO-CD4-a und LO-CD4-b um dieselben Epitope wie OKT4 oder Leu3a konkurrieren.
- Die Lymphocyten wurden mittels einer Einschritt-1,077er- Dichte-Ficoll -Hypaque-Trennung aus dem Peripherblut isoliert (PBLs). Der monoklonale Antikörper der Maus OKT4 (CD4) wurde von Ortho Diagnostics geliefert und der monoklonale Antikörper Leu3a (CD4) von Becton-Dickinson. Der monoklonale Mäuse-anti-Ratten- Antikörper der Ratte wurde von Jackson Immunoresearch Laboratories erhalten. Das Mäuse-Anti-CD4 - OKT4-FITC-Konjugat (OKT4FITC) wurde von Ortho Diagnostics geliefert, das Mäuse- anti-CD4 - Leu3a-Phycoerythrin-Konjugat (Leu3aPE) von Becton- Dickenson und das Mäuse-anti-Ratten-FITC-Konjugat (MARFITC) von Jackson Immunoresearch Laboratories.
- Die PBL-Konzentration wurde in Assaypuffer (AB) (1% BSA, 0,1% NaN&sub3;, 6uM Colchicin in PBS, pH 7,4) auf 1 x 10&sup7; Zellen/ml eingestellt. Die monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b wurden auf 100 ug/ml Protein in AB verdünnt. Dann wurden 100 ul der Zellsuspension mit 10 ul von ebenfalls verdünntem monoklonalem Antikörper der Ratte LO-CD4-a oder LO-CD4-b 30 Minuten lang bei 4ºC unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden durch Resuspension in 2,0 ml AB gewaschen und dann bei 400 g 5 Minuten lang zentrifugiert. Das Waschen und das Zentrifugieren wurden noch zweimal wiederholt. Als nächstes wurden die gewaschenen Zellen in 100ul AB mit 10ul (100 mg/ml Protein) von MARFITC, OKT4FITC oder Leu3aPE 30 Minuten bei 4ºC unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Alternativ wurden die Zellen mit 10ul von OKT4FITC oder Leu3aPE ohne Vorinkubation mit den monoklonalen Antikörpern LO-CD4-a oder LO-CD4-b inkubiert. Die Zellen wurden zweimal gewaschen, wie dies oben beschrieben ist, und in 0,8ml Formalin in PBS fixiert. Die Zellen wurden auf einem Becton-Dickinson FACScan Flow-Cytometer analysiert.
- Die Werte sind in Fig. 4 gezeigt.
- In Fig. 4 zeigt die X-Achse in allen Tafeln grüne Fluoreszenz (Fluoreszenz 1) oder rote Fluoreszenz (Fluoreszenz 2) und die Y-Achse auf allen Tafeln die Zählimpulse im Originalmaßstab. Fign. 4(A) bis 4(G) zeigen die Werte für den monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und die Fign. 4(A) bis 4(N) zeigen die Werte für die monoklonalen Antikörper LO-CD4-b.
- Die Fig. 4(A) und 4(B) sind Blindwerte, die jeweils die grüne und rote Autofluoreszenz für PBLs in Abwesenheit von zugegebenem Antikörperkonjugat zeigen. Fig. 4(C) ist ein Vergleichswert, der die Bindung des monoklonalen Antikörpers LO- CD4-a an PBLs zeigt, wie mittels MARFITC nachgewiesen wird. Fig. 4(D) ist ein Vergleichswert, der die Fluoreszenzintensität von PBLs nach Inkubation allein mit OKTA4FITC zeigt. Fig. 4(E) zeigt die Fluoreszenzintensität von PBLs, die mit OKT4FITC nach Vorinkubation mit LO-CD4-a inkubiert wurden. Fig. 4(F) ist ein Blindwert, der die Fluoreszenzintensität von PBLs nach Inkubation allein mit Leu3a zeigt. Fig. 4(G) zeigt Fluoreszenzintensität von PBLs, die mit Leu3aPE nach Vorinkubation mit LO-CD4-a inkubiert wurden.
- Die Fign. 4(H) bis 4(N) entsprechen den Fign. 4(A) bis 4(G), außer daß, wo der monoklonale Antikörper LO-CD4-a in den Fign. 4(A) bis 4(G) eingesetzt wurde, der monoklonale Antikörper LO-CD4-b in den Fign. 4(H) bis 4(N) verwendet wurde.
- Die Werte in Fig. 4 sind in der Tabelle 5 unten zusammengefaßt. TABELLE 5 WIRKUNG DER MONOKLONALEN ANTIKÖRPER LO-CD4-a UND LO-CD4-b AUF DIE BINDUNG VON OKT4 UND Leu3a AN PBLS Relative Fluoreszenzintensität OKT4 FITC allein OKT4 FITC nach Vorinkubabation mit LO-CD4-a Leu3aPE allein Leu3aPE nach Vorinkubabation mit LO-CD4-a OKT4 FITC nach Vorinkubabation mit LO-CD4-b Leu3aPE nach Vorinkubbation mit LO-CD4-b
- Aus den Fig. 4 und der Tabelle 5 ist offensichtlich, daß die Vorinkubation entweder mit LO-CD4-a oder LO-CD4-b die relative Fluoreszenzintensität sowohl für OKT4FITC als auch für Leu3aPE nicht vermindert. Daher konkurrieren LO-CD4-a und LO- CD4-b um keines der Epitope, auf die OKT4 und Leu3a spezifisch sind.
- Dieses Beispiel zeigt, daß die monoklonalen Antikörper LO- CD4-a und LO-CD4-b an die gleiche Lymphocyten-Subpopulation wie OKT4 binden.
- Die Lymphocyten wurden mittels einer Einschritt-1,077er- Dichte-Ficoll -Hypaque-Trennung (PBLs) aus dem Peripherblut erhalten.
- Der monoklonale Ziegen-anti-Ratten-Antikörper wurde von Jackson Research Laboratories erhalten. Die monoklonalen Antikörper der Maus OKT4 (CD4) und OKT8 (CD8) wurde von Ortho Diagnostics geliefert. Die monoklonalen Antikörper der Maus Leu3a (CD4) wurde von Becton-Dickinson geliefert. Das Ziegen- anti-Ratten-Phycoerythrin-Konjugat (GARPE), die monoklonalen Antikörper OKT4FITC, OKT8FITC und Leu3aPE wurden gemäß herkömmlichen Verfahren hergestellt. Schaf-anti-Maus- beschichtete magnetische Mikropartikel (SAM-Perlen) wurden von Dynal Inc. erhalten.
- Die PBL-Konzentration wurde auf 1x10&sup7; Zellen/ml mit AB (siehe Beispiel 5) eingestellt. 2x10&sup7; Zellen wurden mit 200ul (100ug/ml) OKT4 30 Minuten bei 4ºC unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden durch Resuspension in 2ml AB gewaschen und dann bei 400 g 5 Minuten zentrifugiert. Das Waschen und Zentrifugieren wurde zweimal wiederholt. Die Zellen wurden in 1ml AB suspendiert und mit SAM-Perlen (40:1 Perlen pro Zelle) 30 Minuten bei 4ºC inkubiert, wobei alle 5 Minuten umgeschüttelt wurde. Ein magnetisches Feld wurde dann 1 Minute lang angelegt und die nicht-anhaftenden Zellen wurden entfernt. Die nicht-anhaftenden Zellen wurden zweimal mit AB gewaschen und die Konzentration wurde mit AB auf 1x10&sup7; Zellen/ml eingestellt.
- Die an CD4 verarmte Zellpopulation wurde dann mittels herkömmlicher Verfahren immunfluoreszierend zum Nachweis von OKT4, Leu3a, OKTG, LO-CD4-a und LO-CD4-b angefärbt und auf einem Becton-Dickinson FACScan Flow-Cytometer analysiert.
- Alternativ wurden nicht-verarmte Zellen mit AB auf 1x10&sup7; Zellen/ml eingestellt, gewaschen, wie dies in Beispiel 5 beschrieben ist, und mittels herkömmlicher Verfahren immunfluoreszierend zum Nachweis von OKT4, Leu3a, OKT8, LO-CD4-a und LO-CD4-b angefärbt und dann auf einem Becton-Dickinson FACScan Flow-Cytometer analysiert.
- Die Werte sind in Fig. 5 gezeigt.
- In Fig. 5 stellt die X-Achse in allen Tafeln die grüne Fluoreszenz (Fluoreszenz 1) oder die rote Fluoreszenz (Fluoreszenz 2) und die Y-Achse in allen Platten die Zählimpulse im Originalmaßstab dar. Fign. 5(A) bis 5(H) zeigen die Werte für nicht-verarmte PBLs und die Fign. 5(I) bis 5(P) die Werte für CD4-verarmte PBLs.
- Die Fign. 5(A) und 5(B) sind Blindwerte, die jeweils die rote und grüne Autofluoreszenz zeigen, und zwar jeweils für PBLs in Abwesenheit von zugegebenem Antikörperkonjugat. Die Fig. 5(C) und 5(D) zeigen die Bindung der monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b jeweils an nicht-verarmte PBLs, die mittels GARPE nachgewiesen wurden. Die Fig. 5(E) ist ein Blindwert, der die Immunfluoreszenz der PBLs nach der Inkubation mit GARPE zeigt. Die Fign. 5(F), 5(G) und 5(H) zeigen die Fluoreszenzintensität nicht-verarmter PBLs nach der Inkubation mit Leu3aPE, OKT4FITC bzw. OKT8FITC.
- Die Fign. 5(I) bis 5(P) entsprechen den Fign. 5(A) bis 5(H) mit der Ausnahme, daß verarmte PBLs anstelle von nicht-verarmten PBLs eingesetzt wurden.
- Die Werte in Fig. 5 sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. TABELLE 6 BINDUNG DER MONOKLONALEN ANTIKÖRPER LO-CD4-a UND LO-CD4-b AN NICHT-VERARMTE UND VERARMTE PBLs % markierte PBLs nicht-verarmte PBLs OKT4 positiv Leu3a positiv OKT8 positiv LO-CD4-a positiv LO CD4 b positiv CD4-verarmte PBLs
- Aus den Fign. 5 und der Tabelle 6 ist ersichtlich, daß die Verarmung der PBLs an CD4-positiven Lymphocyten fast vollständig war, da nur 2% OKT4-positive Zellen und 5% Leu3a-positive Zellen verblieben. Auch wurden sowohl die LO-CD4-a- als auch die LO- CD4-b- positiven Lymphocyten in der verarmten PBL-Population wesentlich vermindert. Diese Werte weisen darauf hin, daß sowohl der monoklonale Antikörper der Ratte LO-CD4-a als auch LO-CD4-b in der Tat für dieselbe Lymphocyten-Subpopulation wie OKT4 spezifisch sind.
- Dieses Beispiel zeigt, daß die monoklonalen Antikörper LO- CD4-a und LO-CD4-b ausschließlich an CD4-positive Lymphocyten binden.
- Die Lymphocyten wurden mittels einer Einschritt-1,077er- Dichte-Ficoll -Hypaque-Trennung aus Peripherblut isoliert (PBLs).
- Leu3a (CD4) der Maus wurde von Becton-Dickenson geliefert. Der monoklonale Mäuse-anti-Ratten-Antikörper wurde von Jackson Immunoresearch Laboratories erhalten. Leu3aPE wurde von Becton- Dickenson und MARFITC von Jackson Immunoresearch Laboratories geliefert.
- Die PBL-Konzentration wurde in AB auf 1x10&sup7; Zellen/ml eingestellt (siehe Beispiel 5). 100 ul der Zellsuspension wurden mit 10ul (100ug/ml) an Leu3aPE 30 Minuten lang bei 4ºC unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden mittels Resuspension in 2 ml AB gewaschen und dann bei 400 g 5 Minuten lang zentrifugiert. Das Auswaschen und Zentrifugieren wurde zweimal wiederholt. Die Zellen wurden in 100 ul AB resuspendiert. Die monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b wurden in 100 ug/ml AB verdünnt. Die gewaschenen Zellen wurden in 100 ul AB resuspendiert und mit 10ul verdünntem Antikörper 30 Minuten bei 4ºC unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit AB gewaschen und in 100 ul AB mit MARFITC resuspendiert, welches dann 1:10 (Volumen:Volumen) (100 ug/ml) in AB verdünnt wurde. 10 ul an verdünntem MARFITC wurden dann zu 100 ul der gewaschenen Zellen hinzugegeben und 20 Minuten bei 4ºC unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Alternativ wurden die Zellen (1x10&sup7; in 100ul AB) vor der Zugabe von MARFITC mit Leu3aPE 10 ul (100 ug/ml) inkubiert und wie oben beschrieben gewaschen. Die Inkubationsmischung wurde zentrifugiert und zweimal mit AB (wie oben beschrieben) gewaschen und in 0,8ml 1%igem Formalin in PBS fixiert. Die Zellen wurden auf einem Becton-Dickinson FACScan Flow-Cytometer analysiert.
- Es wurden dann Punktauftragungsanalysen der flußcytometrischen Daten der roten gegen die grüne Fluoreszenz durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt, wo die X- Achse jeder Auftragung die grüne Fluoreszenz (Fluoreszenz 1) darstellt und die y-Achse jeder Auftragung die rote Fluoreszenz (Fluoreszenz 2) darstellt.
- Bei der Punktauftragungsanalyse sind die Zellen, die sowohl von Leu3a als auch von den monoklonalen LO-CD4-Antikörpern der Ratte ungebunden verbleiben, im dritten Quadranten (siehe Fig. 6(A) und 6(F)) dargestellt. Diese Zellen haben den geringsten Anteil an Fluoreszenzcharakter. Die Zellen, die von Leu3aPE gebunden werden, sind im ersten Quadranten dargestellt und weisen roten Fluoreszenzcharakter auf, und diejenigen Zellen, die von beiden monoklonalen anti-CD4 Antikörpern der Ratte gebunden werden, sind im vierten Quadranten dargestellt und weisen grünen Fluoreszenzcharakter auf. Die besondere Zellpopulation, die sowohl Leu3a als auch die monoklonalen CD4- Antikörper der Ratte bindet, ist im zweiten Quadranten dargestellt und hat sowohl grünen als auch roten Fluoreszenzcharakter. Wenn beide monoklonalen LO-CD4-Antikörper der Ratte ausschließlich CD4-positive Zellen binden, sind nur die Quadranten 2 und 3 besetzt. Wenn die Quadranten 1 und/oder 4 beide besetzt sind, wie auch Quadrant 2, so zeigt dies, daß das Immunglobulin nicht ausschließlich für CD4 spezifisch ist.
- Die Fign. 6(A) bis 6(D) zeigen die Werte für den monoklonalen Antikörper LO-CD4-b und die Fign. 6(E) bis 6(I) zeigen die Werte für den monoklonalen Antikörper LO-CD4-a.
- Fig. 6(A) ist ein Blindwert, der die Punktauftragung für rote und grüne Autofluoreszenz von PBLs in Abwesenheit von zugegebenen Antikörperkonjugat zeigt. Fig. 6(B) zeigt die Punktauftragung für die Fluoreszenz von PBLs, die mit dem monoklonalen Antikörper Leu3a inkubiert wurden. Fig. 6(C) zeigt die Punktauftragung für die Fluoreszenz von PBLs, die mit MARFITC nach Vorinkubation mit dem monoklonalen Antikörper LO- CD4-b inkubiert wurden. Fig. 6(D) zeigt die Punktauf tragung der Fluoreszenz von PBLs, die mit dem monoklonalen Antikörper Leu3aPE und dann mit MARFITC nach Vorinkubation mit LO-CD4-b inkubiert wurden.
- Die Fign. 6(E) bis 6(H) entsprechen den Fig. 6(A) bis 6(D) mit der Ausnahme, daß der monoklonale Antikörper LO-CD4-a anstelle des monoklonalen Antikörpers LO-CD4-b verwendet wurde. Die Fig. 6(I) zeigt die Punktauftragung für die Fluoreszenz von PBLs, die mit MARFITC nach Vorinkubation mit Leu3a inkubiert wurden.
- Die Werte aus den Fig. 6(A) bis 6(D) und von den Fig. 6(E) bis 6(I) sind in den Tabellen 7 und 8 jeweils unten zusammengefaßt. TABELLE 7 LO-CD4-b ZWEIFARB-ASSAY Quad 1 (rot) Quad 2 (grün) Quad 3 (auto) Quad 4 (rot & grün) zweifarbig TABELLE 8 LO-CD4-a ZWEIFARB-ASSAY Quad 1 (rot) Quad 2 (grün) Quad 3 (auto) Quad 4 (rot & grün) zweifarbig
- Die Werte dieses Beispiels zeigen an, daß sowohl LO-CD4-a als auch LO-CD4-b nur für CD4-positive PBLs spezifisch sind. Mehr als 96% der Leu3a-positiven Lymphocyten wurden entweder von LO-CD4-a oder von LO-CD4-b doppelmarkiert. Keine andere PBL- Population wurde von LO-CD4-a oder LO-CD4-b doppelmarkiert.
- Dieses Beispiel stellt Bindungsmuster der monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b an Peripherblutlymphocyten (PBLs) auf.
- Die Lymphocytpopulation wurde mittels einer Einschritt-1,077er-Dichte-Ficoll -Hypaque-Trennung aus venösem Peripherblut erhalten.Die monoklonalen Antikörper OKT4 (CD4) und OKT8 (CD8) wurden von Ortho Diagnostics und Leu3a (CD4) von Becton- Dickinson geliefert. Ziegen-anti-Ratte-Phycoerythrin-Konjugat (GARPE) und Ziegen-anti-Maus-Phycoreythrin-Konjugat (GAMPE) wurde von Jackson Research Laboratories erhalten.
- Die PBL-Konzentration wurde auflx 10 Zellen/ml in AB eingestellt (Siehe Beispiel 5). Die monoklonalen Antikörper der Ratte LO-CD4-a und LO-CD4-b und die monoklonalen Antikörper der Maul OKT4, OKT8 und Leu3a wurden wie vom Händler erhalten verwendet. loul der monoklonalen Antikörper wurden zu 100ul der Zellsuspension hinzugefügt und 30 Minuten bei 4ºC unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden durch Resuspension in 2ml AB gewaschen und dann bei 400 g 5 Minuten lang inkubiert. Das Waschen und Inkubieren wurde zweimal wiederholt. Die Zellen wurden in 100ul AB resuspendiert. Das Konjugat GARPE oder GAMPE wurde 1:10 (Volumen:Volumen) (100ug/ml) in AB verdünnt. 10ul des geeignet verdünnten Konjugats wurden zu 100ul gewaschener Zellen hinzugegeben und 20 Minuten bei 4ºC unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden zweimal gewaschen, wie dies oben beschrieben ist, und in 0,8ml 1%igem Formalin in PBS fixiert. Die Zellen wurden auf einem Becton-Dickinson-Facscan-Flow-Cytometer analysiert.
- Die Werte sind in Fig. 7 gezeigt.
- In Fig. 7 stellt die X-Achse in allen Tafeln die grüne Fluoreszenz (Fluoreszenz 1) oder die rote Fluoreszenz (Fluoreszenz 2) dar, und die Y-Achse in allen Tafeln stellt die Zählimpulse im Originalmaßstab dar. Die Fign. 7(A) und 7(B) sind Blindwerte, die die grüne und rote Autofluoreszenz jeweils für Peripherblut-Lymphocyten in Abwesenheit von zugegebenem Antikörperkonjugat aufzeigen. Fig. 4(C) ist ein Blindwert, der die Fluoreszenz von PBLs zeigt die nur mit GARPE inkubiert wurden. Fig. 7(D) zeigt die Fluoreszenzintensität von PBLs, die mit OKT - wie durch GAMPE nachgewiesen - inkubiert wurden. Die Fig. 7(E) und 7(F) zeigen die Fluoreszenzintensität von PBLs, die jewils mit OKT4 und Leu3a inkubiert wurden, wie mittels GAMPE nachgewiesen. Die Fig. 7(G) und 7(H) zeigen die Fluoreszenzintensität von PBLs, die mit LO-CD4-a bzw. LO-CD4-b inkubiert wurden, was mittels GARPE nachgewiesen wurde.
- Die Werte in Fig. 7 sind in Tabelle 9 unten zusammengefaßt. TABELLE 9 INDIREKTES BINDUNGSASSAY VON LO-CD-4-a UND LO-CD4-b AN PBLs % gebundene PBLs
- Aus den Ergebnissen in Fig. 7 und Tabelle 9 ist offensichtlich, daß LO-CD4-a und LO-CD4-b keine "pan- Lymphocyten"-Antikörper sind, weil sie beide weniger als 50% einer PBL-Population binden.
- Um herauszufinden, ob die Antigene, die von LO-CD4-a und LO-CD4-b definiert werden, eine funktionelle Bedeutung bei der Immunantwort besitzen, wurde die Wirkung dieser monoklonalen Antikörper auf die Lymphocytenvermehrung, die von Lektinen, Antigenen oder OKT3 induziert wird, beobachtet.
- Bei allen Experimenten wurden die Zellen bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; in 96er-Mikrotiterplatten, enthaltend 200ul RPMI-1640-Medium, versetzt mit 20% Human-AB-Serum, 2mM Glutamin, Einheiten/ml Penicillin, 100ug/ml Streptomycin und 25mM Hepes aufgezogen. 10&sup5; einkernige Peripherblutzellen (PBMN) wurden mit 2 ug/ml PHA, 20 ug/ml ConA, 0,5 ug/ml T3 oder 10 ug/ml Kerrnesbeerenmitogen (PWM) oder 20 Einheiten/ml Tetanustoxoid (TT) in Abwesenheit oder in Gegenwart von monoklonalem Antikörperserum der Ratte auf 1:500 verdünnt aufgezogen. Die PBMNS wurden, wie im Beispiel 1 beschrieben, isoliert. Für die allogene Lymphocyten-Mischreaktion wurden 10&sup5; PBMN von zwei einzelnen Spendern gemeinsam in Anwesenheit oder Abwesenheit von monoklonalem Antikörper der Ratte gezüchtet. ³H-Thymidin (³H-TDR, 6,5 Ci/mmol, New England Nuclear) wurde zu jeder Vertiefung (5uCi/Vertiefung) 3 Tage nach der Stimulierung mit ConA, PHA, PWM oder T3 oder aber 5 Tage nach der Stimulierung mit TT oder in MLR hinzugegeben, und die Inkubation wurde über Nacht fortgesetzt. Die Zellen wurden mit einem Zellernter (SKATRON) geerntet und die ³H-Tdr-Inkorporation wurde in einem Szintillationszähler gemessen.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 unten gezeigt. TABELLE 10 WIRKUNG DER MONOKLONALEN ANTIKÖRPER LO-CD4-a UND LO-CD4-b AUF DIE LYMPHOCYTENVERMEHRUNG WIE SIE DURCH LEKTINE, OKT3 ODER ANTIGENE INDUZIERT WIRD Prozente des Vergleichswerts Monoklonaler Antikörper Lösemittelvergleichswert
- Die Ergebnisse sind als Durchschnittswert + Standardabweichung dargestellt.
- Aus der Tabelle 10 ist ersichtlich, daß die Wirkung der monoklonalen Antikörper LO-CD4-a und LO-CD4-b auf die Lymphocytenvermehrung quantitativ unterschiedlich ist, wobei LO- CD4-b immer einen stärkeren Inhibitionseffekt als LO-CD4-a aufweist. Die monoklonalen Antikörper interferierten heftig mit der Vermehrung von Lymphocyten, die durch das lösliche Tetanustoxoid-Antigen (TT) und durch das zellgebundene Antigen (MLR) induziert war: Ungefähr 70% Inhibition durch LO-CD4-b und 40 bis 60% Inhibition durch LO-CD4-a wurde beobachtet. Die Inhibition durch LO-CD4-b von ConA-, PWM- und T3-induzierter Vermehrung war schwach (30 bis 40 %) und die durch LO-CD4-a nicht signifikant. Keiner der beiden monoklonalen Antikörper zeigte einen hemmenden Einfluß auf die PHA-induzierte Vermehrung.
Claims (15)
1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper der
Ratte, die an Human-CD4-Antigen binden, welches folgende
Schritte umfaßt:
(1) Immunisieren einer Ratte oder von immunokompetenten
Rattenzellen in vitro mit einem Immunogen, welches CD4-Antigen
umfaßt,
(2) Verschmelzen der immunisierten Zellen der Ratte oder
der immunisierten immunokompetenten Rattenzellen mit
Immunocytomzellen,
(3) Selektieren der Hybridzellen, die Antikörper
produzieren, die an ein Human-CD4-Antigenepitop binden, welches
ausreichend von demjenigen Epitop abgesetzt ist, an das von
Mäusen abgeleitete monoklonale Antikörper binden, so daß es
nicht zu Kreuzblockierung kommt,
(4) Züchten der selektierten Hybridzellen, und
(5) Gewinnen des Antikörpers.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Immunogen eine T-
Zellinie ist, die CD4-Antigen exprimiert, oder gereinigte T-
Lymphozyten.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Immunocytomzellen
solche von Ratten oder Mäusen sind.
4. Hybridzelle, die einen monoklonalen Antikörper der Ratte
produziert, der an ein Human-CD4-Antigen-Epitop bindet, welches
ausreichend von demjenigen Epitop abgesetzt ist, an das
monoklonale Antikörper der Maus binden, so daß es nicht zu
Kreuzblockierung kommt.
5. Hybridzelle nach Anspruch 4, wobei der monoklonale
Antikörper der Ratte an ein Human-CD4-Antigen-Epitop bindet, das
von den Epitopen, die von den monoklonalen Antikörpern OKT4 und
Leu3a der Maus definiert werden, verschieden ist.
6. Hybridzelle, die Antikörper produziert, welche die
Bindungsspezifität von Antikörpern besitzen, die von der
Hybridzelle LO-CD4-a mit der ECACC-Hinterlegungssnr. 89012101
produziert werden.
7. Hybridzelle, die Antikörper produziert, welche die
Bindungsspezifität von Antikörpern besitzen, die von der
Hybridzelle LO-CD4-b mit der ECACC-Hinterlegungsnr. 89012102
produziert werden.
Monoklonaler Antikörper der Ratte, der an ein Human-CD4-
Antigen-Epitop bindet, welches ausreichend von demjenigen Epitop
abgesetzt ist, an das von Mäusen abgeleitete monoklonale
Antikörper binden, so daß es nicht zu Kreuzblockierung kommt.
9. Monoklonaler Antikörper der Ratte nach Anspruch 8, wobei
der monoklonale Antikörper an ein Human-CD4-Antigen-Epitop
bindet, das von den Epitopen, die von den monoklonalen
Antikörpern OKT4 und Leu3a der Maus definiert werden,
verschieden ist.
10. Monoklonaler Antikörper der Ratte, der die
Bindungsspezif ität des monoklonalen Antikörpers LO-CD4-a
besitzt, der von der Hybridzelle LO-CD4-a mit der ECACC-
Hinterlegungsnr. 89012101 produziert wird.
11. Monoklonaler Antikörper der Ratte, der die
Bindungsspezifität des monoklonalen Antikörpers LO-CD4-b
besitzt der von der Hybridzelle LO-CD4-b mit der ECACC-
Hinterlegungsnr. 89012102 produziert wird.
12. Bindungsprotein, welches die Bindungsspezifität des
monoklonalen Antikörpers LO-CD4-a besitzt, der von der
Hybridzelle LO-CD4-a mit der ECACC-Hinterlegungsnr. 89012101
produziert wird.
13. Bindungsprotein, welches die Bindungsspezifität des
monoklonalen Antikörpers LO-CD4-b besitzt, der von der
Hybridzelle LO-CD4-b mit der ECACC-Hinterlegungsnr. 89012102
produziert wird.
14. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers der Ratte nach
einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 13 zur Herstellung eines
Präparats für ein in vivo therapeutisches Verfahren.
15. In vitro diagnostisches Verfahren, das das In-Kontakt-
Bringen eines monoklonalen Antikörpers der Ratte, der gemäß
einem oder mehreren der Ansprüche 1-13 hergestellt worden ist,
rnit einer geeigneten Testprobe und die Durchführung eines Assays
auf das CD4-Antigen umfaßt.
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