Definitionen
Als monoklonale Antikörper (mAb) sind Antikörper
bezeichnet, die von Hybrid-Zellinien (sog. Hybridomen)
produziert werden, die typischerweise durch Fusion
einer Antikörper produzierenden B-Zelle tierischer
oder menschlicher Herkunft mit einer geeigneten Myelom
Tumorzelle entstanden sind.
Die Aminosäuresequenz von Human CD28 ist unter der
Accession No. NM_006139 bekannt.
Das C'-D Loop von CD28 umfaßt die Aminosäuren 52 bis
66 der vorstehenden CD28 Sequenz (zur Numerierung
siehe auch Ostrov, D. A., et al.; Science (2000),
290: 816-819). Unter dem Begriff des C'-D Loops sollen
im Folgenden auch beliebige Teilsequenzen hieraus
verstanden sein.
Ein Loop bzw. eine darin angeordnete Bindungsstelle
ist frei zugänglich, wenn für einen definierten
Bindungspartner für die Bindungsstelle im Loop keine
sterische Hinderung durch an das Loop anschließende
Sequenzen oder Moleküle vorliegt.
Regulatorische T-Zellen sind CD4+ T-Zellen, welche in
Mischung mit naiven CD4+ T-Zellen deren Aktivierung
inhibieren. Hierzu gehören insbesondere CD4+CD25+ T-Zellen. Ein
weiteres Merkmal regulatorischer T-Zellen ist eine
vergleichsweise zu anderen T-Zellen niedrige Expression der
hochmolekularen Isoformen von CD45 (human: RA). Für
regulatorische T-Zellen ist die konstitutive Expression von
CD152 typisch. CD4+CD8-SP Thymocyten sind eine der
wesentlichen Quellen für regulatorische T-Zellen. Für eine
weitergehende Charakterisierung von regulatorischen T-Zellen
wird auf die Literaturstelle K. J. Maloy et al., Nature
Immunology, Vol. 2, No. 9, Seiten 816 ff., 2001, verwiesen.
Mit Induktion regulatorischer T-Zellen ist die Vermehrung
der Stoffwechselaktivität, Vergrößerung des Zellvolumens,
Synthese immunologisch wichtiger Moleküle und Eintritt in
die Zellteilung (Proliferation) auf einen äußeren Reiz hin
bezeichnet. Im Ergebnis liegen nach der Induktion mehr
regulatorische T-Zellen vor als vorher.
Homologie bezeichnet eine zumindest 70%ige,
vorzugsweise zumindest 80%ige, höchstvorzugsweise zumindest
90%ige Sequenzidentität auf Proteinebene, wobei ein
homologes Protein oder Peptid einen definierten
Bindungspartner mit zumindest gleicher Affinität bindet.
Abweichungen in der Sequenz können Deletionen,
Substitutionen, Insertionen und Elongationen sein.
Eine Mimikriverbindung ist eine natürliche oder
synthetische chemische Struktur, die sich in einem
definierten Bindungsassay wie ein definierter mAb
verhält, welchen die Mimikriverbindung mimikriert.
Der Begriff der mAb umfaßt neben Strukturen des
üblichen Fab/Fc Aufbaus auch Strukturen, die
ausschließlich aus dem Fab-Fragment bestehen. Es ist auch
möglich, lediglich die variable Region zu nutzen, wobei
das Fragment der schweren Ketten mit dem Fragment der
leichten Kette auf geeignete Weise, beispielsweise
auch mittels synthetischer Brückenmoleküle, so
verbunden ist, daß die Bindungsregionen der Ketten das
Antikörperepitop bilden. Der Begriff der Antikörper umfaßt
auch (ggf. vollständige) chimäre sowie humanisierte
Antikörper.
Superagonistische Stimulation der Proliferation von CD28
spezifischen T-Zellen meint, daß keine Costimulation, i. e.
kein weiteres Bindungsereignis neben einer Bindung eines
mAb oder einer Mimikriverbindung an CD28 zur Stimulation
oder Inhibierung der Proliferation erforderlich ist.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Zum Verständnis der Erfindung ist zunächst folgender
technologischer Hintergrund wichtig. Die Aktivierung
ruhender T-Zellen zur Proliferation und funktionellen
Differenzierung erfordert zunächst die Besetzung zweier
Oberflächenstrukturen, sogenannter Rezeptoren: 1. des
Antigenrezeptors, der von Zelle zu Zelle eine
unterschiedliche Spezifität besitzt und für die Erkennung
von Antigenen, z. B. viralen Spaltprodukten, notwendig ist;
sowie 2. des auf allen ruhenden T-Zellen mit Ausnahme
einer Untergruppe der CD8 T-Zellen des Menschen
gleichermaßen exprimierten CD28 Moleküls, welches
natürlicherweise an Liganden auf der Oberfläche anderer
Zellen des Immunsystems bindet. Man spricht von der
Costimulation der antigenspezifischen Immunreaktion durch
CD28. In Zellkultur können diese Vorgänge nachgestellt
werden durch Besetzung des Antigenrezeptors sowie des
CD28-Moleküls mit geeigneten mAbs. Im klassischen System
der Costimulation führt weder die Besetzung des
Antigenrezeptors noch die des CD28-Moleküls allein zur
T-Zellproliferation, die Besetzung beider Rezeptoren ist
jedoch effektiv. Diese Beobachtung wurde an T-Zellen des
Menschen, der Maus und der Ratte gemacht.
Dagegen sind auch CD28-spezifische mAbs bekannt, die ohne
Costimulation die T-Zellproliferation einleiten können.
Eine solche superagonistische, d. h. von der Besetzung des
Antigenrezeptors unabhängige Aktivierung ruhender
T-Lymphozyten durch CD28-spezifische mAb ist aus der
Literaturstelle Tacke et al., Eur. J. Immunol., 1997,
27: 239-247 bekannt. Demnach wurden zwei Arten von
CD28-spezifischen monoklonalen Antikörpern mit
unterschiedlichen funktionellen Eigenschaften beschrieben:
costimulatorische mAb, die die Aktivierung ruhender
T-Zellen nur bei gleichzeitiger Besetzung des
Antigenrezeptors costimulieren; und superagonistische mAb,
die ohne Besetzung des Antigenrezeptors T-Lymphozyten
aller Klassen in vitro und im Versuchstier zur
Proliferation aktivieren können. Beide insofern bekannte
mAb rühren aus einer Immunisierung mit Zellen, auf denen
Ratten-CD28 exprimiert ist und sind durch auf ihre
jeweiligen beschriebenen Eigenschaften gerichtete
unterschiedliche Selektionen erhältlich.
Aus der Literaturstelle DE-197 22 888 ist es bekannt, daß
superagonistische mAb in der Lage sind, eine
Immundeviation TH1 zu TH2 zu bewirken und sich insofern zum
Einsatz gegen die Adjuvans Arthritis eignen. TH1 und TH2
Zellen sind CD4 exprimierende T-Zellen. TH1 Zellen werden
auch pro-inflammatorische T-Helfer-Zellen genannt und
sezernieren die Cytokine IL-2, TNF und IFN-γ. TH2 Zellen
unterstützen die Aktivierung von B-Zellen und sezernieren
die Cytokine IL-4, IL-5 und IL-10. Dabei wird die
Differenzierung von CD4 T-Zellen zu den vorstehenden
funktional unterschiedlichen Untergruppen nicht nur durch
die verfügbaren Cytokine kontrolliert, sondern sie wird
auch durch Costimulation über CD28 moduliert.
CD28-defiziente Mäuse zeigen normale TH1 aber reduzierte
TH2 abhängige Antworten und das Cytokinprofil von
TCR-transgenen CD4 Zellen wird durch CD28 Ligation in
Richtung TH2 verschoben. Dagegen verhindert ein starkes
TCR Signal CD28 vermittelte TH2 Differenzierung.
Aus der in der Literaturstelle K. J. Maloy et al., Nature
Immunology, Vo. 2, No. 9, Seiten 816 ff., 2001,
zusammengefaßten Primärliteratur ist bekannt, daß
regulatorische T-Zellen bei Autoimmunreaktionen wichtig
sind. So wurde z. B. in experimentellen Tiermodellen der
Multiplen Sklerose, des Typ I Diabetes und von
entzündlichen Darmerkrankungen die Fähigkeit dieser Zellen
gezeigt, die entsprechenden Krankheitsbilder zu
unterdrücken.
Guillain-Barré-Syndrom (GBS) ist eine akute
autoimmun-inflammatorische Erkrankung des peripheren
menschlichen Nervensystems. Die Inzidenz von GBS liegt bei
1-2 pro 100 000 Menschen. Die chronische Verlaufsform ist
die chronische demyelinisierende Polyneuropathie (CDP).
Die Inzidenz von CDP liegt bei 10-20 pro 100 000 Menschen.
mAb oder verwandte Substanzen zur Prävention und/oder
Behandlung dieser Krankheiten sind nicht bekannt.
Technisches Problem der Erfindung
Der Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, eine
pharmazeutische Zusammensetzung anzugeben, mittels welcher
sich regulatorische T-Zellen stimulieren lassen und welche
sich insbesondere zur Prävention und/oder Behandlung der
multiplen Sklerose, Typ I Diabetes, entzündlichen
Darmerkrankungen, GBS und/oder CDP eignet.
Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung
die Verwendung eines CD28-spezifischen superagonistischen
monoklonalen Antikörpers (mAb) oder einer
Mimikriverbindung hierzu, zur Herstellung einer
pharmazeutischen Zusammensetzung zur Induktion und/oder
Vermehrung regulatorischer T-Zellen.
Die Erfindung beruht zunächst auf der Erkenntnis, daß
mittels superagonistischer CD28 spezifischer
Wirksubstanzen, mAb oder Mimikriverbindungen hierzu,
CD4+CD25+ T-Zellen sich induzieren lassen, i. e. deren Zahl
nach Behandlung eines Organismus mit der Wirksubstanz
deutlich höher ist als in einem Organismus, welcher nicht
oder mit nicht-superagonistischen Wirksubstanzen behandelt
wurde.
Weiterhin beruht die Erfindung auf der Erkenntnis, daß die
erfindungsgemäß eingesetzten Wirksubstanzen offenbar ein
sehr gutes Mittel zur Behandlung des Guillian-Barré-
Syndroms und/oder der chronisch demyelinisierenden
Polyneuropathie sowie weiteren autoimmun-verbundenen
Krankheiten ist. Daher lehrt die Erfindung weiterhin die
erfindungsgemäße Verwendung zur Behandlung dieser
Krankheiten.
Erfindungsgemäß verwendete superagonistische CD28
spezifische Wirksubstanzen, i. e. mAb oder
Mimikriverbindungen hierzu, sind solche, die unabhängig
von der Besetzung des Antigenrezeptors mehrere bis alle
Untergruppen der T-Lymphozyten aktivieren.
Die Wirksubstanz bindet an CD28 oder an eine Teilsequenz
hieraus. Die Teilsequenz kann beispielsweise eine
Aminosäurensequenz Seq.-ID 1, oder 2-7, oder 17
enthalten, welche zumindest teilweise im Bereich des C'-D
Loops von CD28 liegen. An eine der Sequenzen mit Val am
5'-Ende kann eine oder mehrere Aminosäuren der Sequenz 8
in der dort definierten Reihenfolge angeschlossen sein.
Das Loop liegt im Bereich mit der Sequenz GNYSQQLQVYSKTGF.
Erfindungsgemäße Mimikriverbindungen lassen sich in einem
Screeningverfahren identifizieren, wobei eine prospektive
Mimikriverbindung oder eine Mischung von prospektiven
Mimikriverbindungen einem Bindungsassay mit CD28 oder
einer Teilsequenz hieraus, insbesondere dem C'-D-Loop,
unterworfen werden, und wobei an CD28 oder an die
Teilsequenz hieraus bindende Wirksubstanzen selektiert
werden, ggf. gefolgt von einem Assay zur Prüfung auf
superagonistische Stimulation von mehreren bis allen
Untergruppen der T-Lymphozyten. Im Falle einer Mischung
wird es zweckmäßig sein, eine Dekonvolution durchzuführen.
Unter den selektierten Mimikriverbindungen kann gleichsam
ein Ranking nach Maßgabe der Selektivität und/oder
Affinität erfolgen, wobei hochaffine Wirksubstanzen
bevorzugt sind. Zusätzlich oder anstelle eines solchen
Rankings kann ein Ranking anhand einer Quantifizierung der
Induktion der Regulator T-Zellen erfolgen bzw. anhand der
Hemmung der Erkrankung beispielsweise im Tierversuch
anhand von Krankheitsmodellen.
Ein Beispiel einer erfindungsgemäß verwendeten
Wirksubstanz ist ein superagonistischer CD28 spezifischer
mAb. Er ist beispielsweise herstellbar, indem ein
nichtmenschliches Säugetier mit CD28 oder einem Peptid mit
einer Teilsequenz hieraus, beispielsweise wie vorstehend
angegeben oder Homologen hierzu, immunisiert wird, wobei
aus dem nichtmenschlichen Säugetier Zellen entnommen und
aus den Zellen Hybridomzellen hergestellt werden, und
wobei die so erhaltenen Hybridomzellen mit der Maßgabe
selektiert werden, daß in deren Kulturüberstand mAb
enthalten sind, die an CD28 binden. Mit üblichen Verfahren
kann eine Humanisierung durchgeführt werden. Geeignete mAb
lassen sich alternativ dadurch herstellen, daß
B-Lymphozyten selektiert werden, welche an das Loop
binden, und deren exprimierte Immunglobulingene kloniert
werden. Auch ist eine Isolierung geeigneter mAb aus
Phagenbibliotheken möglich.
Im Einzelnen kann es sich um einen mAb handeln, welcher
mit Hybridomzellen, wie hinterlegt unter den DSM Nummern
DSM ACC2531 (mAb: 9D7 bzw. 9D7G3H11) oder DSM ACC2530
(mAb: 5.11A bzw. 5.11A1C2H3), erhältlich ist. Der mAb kann
eine oder mehrere der Sequenzen Seq.-ID 9, 11, 13 und/oder
15, oder eine oder mehrere Sequenzen Seq.-ID 10, 12, 14,
16, 18 und/oder 19 oder hierzu homologe Sequenzen
enthalten bzw. dadurch (teilweise) codiert sein. In SEQ-ID
13 ist die Nukleinsäuresequenz der variablen Region der
schweren Kette eines erfindungsgemäßen mAb 5.11A
wiedergegeben. SEQ-ID 14 zeigt das hierdurch codierte
Peptid. SEQ-ID 15 zeigt die Nukleinsäuresequenz der
variable Region der leichten Kette dieses mAb. SEQ-ID 16
ist das hierdurch codierte Peptid. SEQ-ID 9 zeigt die
Nukleinsäuresequenz der variablen Region der leichten
Kette eines erfindungsgemäßen mAb 9D7 wiedergegeben.
SEQ-ID 10 zeigt das hierdurch codierte Peptid. SEQ-ID 11
zeigt die Nukleinsäuresequenz der variable Region der
schweren Kette dieses mAb. SEQ-ID 12 ist das hierdurch
codierte Peptid. SEQ-ID 18 und 19 zeigen
Aminosäurensequenzen der variablen Region eines
humanisierten mAb 5.11A, und zwar der leichten Kette und
der schweren Kette, respektive.
Die Erfindung betrifft schließlich auch Heilverfahren, bei
welchen einer auf niedrige Regulator T-Zellzahlen bzw.
hohe T-Lyphozyten-Infiltration in Organen oder Gewebe
beruhenden Erkrankung, beispielsweise einer an GBS
und/oder CDP leidenden Person, eine erfindungsgemäße
pharmazeutische Zusammensetzung in pharmakologisch
wirksamer Dosierung und in für die Verabreichung
geeigneter galenischer Herrichtung verabreicht wird.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich
Ausführungsformen darstellenden Beispielen näher
erläutert. Hierbei sind in den Fig. 1 bis 9 sowie den
begleitenden Textteilen hierzu Verfahrensweisen und
Ergebnisse gezeigt, die einerseits Zielstrukturen für die
Findung geigneter Wirksubstanzen darstellen und
andererseits erfindungsgemäß einsetzbare Wirksubstanzen
beschreiben. In den Fig. 10 bis 15 sind Ergebnisse
dargestellt, die die Induktion regulatorischer T-Zellen
durch erfindungsgemäß eingesetzte Wirksubstanzen belegen.
In den Fig. 16 bis 21 sind Ergebnisse dargestellt, die
die Wirkung erfindungsgemäßer Wirksubstanzen in einem
Tiermodell, der experimentellen allergischen Neuritis der
LEW-Ratte (EAN) belegen. Bei der EAN handelt es sich um
ein Modell für das humane GBS und der CDP (auch CIDP bzw.
chronische inflammatorische demyelinisierende
Polyradikulonneuropathie genannt). Es zeigen:
Fig. 1 Stimulation von T-Lymphozyten der Ratte mit
verschiedenen CD28 spezifischen mAb (a:
Costimulation, b: superagonistische Stimulation),
Fig. 2 einen Sequenzvergleich zwischen Maus, Ratte und
Human CD28 im Bereich des C'-D Loops
(eingekastelt),
Fig. 3 experimentelle Ergebnisse zur Lokalisierung der
Bindungsstelle superagonistischer mAb am CD28
Moleküle der Ratte,
Fig. 4 Bindung von verschiedenen human CD28 spezifischen
mAb an CD28 (a) sowie costimulatorische (b) und
superagonistische (c) Aktivität der mAb aus Fig.
4a,
Fig. 5 Bindungsversuche, die belegen, daß
superagonistische mAb spezifisch an das C'-D Loop
binden,
Fig. 6 eine dreidimensionale Darstellung von CD28 mit
Markierung des C'-D Loop,
Fig. 7 Experimente zur Aktivierung von Zellen mittels
erfindungsgemäßer mAb,
Fig. 8 Darstellung der Sequenzen SEQ-ID 9-16 (a-h),
sowie der humanisierten variablen Domäne des
Antikörpers 5.11A (leichte Kette: VLC5.11, i;
schwere Kette: VHC5.11, j), SEQ-ID 18-19,
Fig. 9 Frequenz der CD4+CD25+ Zellen an der
Gesamtpopulation der CD4 Zellen einer Ratte, im
Vergleich nach Behandlung mit einem
superagonistischen CD28 spezifischen mAb und einem
costimulatorischen mAb,
Fig. 10 phänotypische Charakterisierung von durch
superagonistische CD28 spezifische mAb
induzierten CD4+CD25+ Zellen und Vergleich mit
CD4+CD25- und CD4+CD25+ Zellen aus unbehandelten
Kontrolltieren,
Fig. 11 Induktion der Proliferation von CD4+CD25+
T-Zellen durch superagonistische CD28 spezifische
mAb in Zellkultur,
Fig. 12 weitere Phänotypisierung der gemäß Fig. 11
erhaltenen CD4+CD25+ T-Zellen,
Fig. 13 inhibitorische Funktion der regulatorischen
T-Zellen,
Fig. 14 Experimente entsprechend Fig. 11 mit menschlichen
T-Zellen und Einsatz superagonistischer
human-CD28 spezifischer mAb,
Fig. 15 Krankheitsverlauf der aktiven EAN unter
Behandlung mittels superagonistischer CD28
spezifischer mAb im Vergleich mit
costimulatorischen mAb,
Fig. 16 Wirkung gegen EAN durch Gabe superagonistischer
CD28 spezifischer mAb vor der Immunisierung mit
dem EAN induzierenden Autoantigen,
Fig. 17 Behandlung entsprechend Fig. 15, jedoch mit
abweichendem Behandlungsplan,
Fig. 18 Behandlung entsprechend Fig. 15, jedoch für den
Fall der passiven bzw. adoptiv-Transfer EAN.
Fig. 1 zeigt die Stimulation frisch isolierter
T-Lymphozyten der Ratte in Form eines 3H-Thymidin-Einbaus.
Die Methodik entspricht jener, wie in der Literaturstelle
WO 98/54225 beschrieben, auf welche hier und folgend
vollumfänglich Bezug genommen wird und deren
Offenbarungsinhalt hiermit in den vorliegenden Text
inkorporiert wird. In der Fig. 1a ist die Costimulation
gezeigt, d. h. in allen Näpfen waren T-Zellrezeptor
(TCR)-spezifische mAb an die Plastikoberfläche gebunden.
Mangels Costimulation zeigt die Negativkontrolle (oberste
Reihe) keinen Einbau. Costimulation wird sodann durch die
Zugabe CD28-spezifischer mAb in löslicher Form gegeben.
Zum Einsatz kam die gesamte gezeigte Palette
CD28-spezifischer mAb. Diese Serie von verschiedenen
CD28-spezifischen mAb stammt aus einem in WO 98/54225
bereits beschriebenen Ansatz der Immunisierung und
Herstellung von Hybridom-Zelllinien. Es handelt sich um
Kulturüberstände, die genug CD28-spezifische mAb für eine
sättigende Bindung an 2 × 10and5 T-Zellen enthielten. Der
Fig. 1a ist entnehmbar, daß sämtliche dieser mAb in der
Lage sind, costimulierend zu aktivieren, d. h. in
Anwesenheit der anti-TCR mAb den Thymidin-Einbau
anzuregen. In Fig. 1b ist die Stimulation in Abwesenheit
TCR-spezifischer mAb gezeigt. Auch dieses Experiment wurde
so durchgeführt, wie in der Literaturstelle WO 98/54225
beschrieben. Man erkennt, daß nur zwei mAb in der Lage
sind, in Abwesenheit eines TCR-Signals die T-Lymphozyten
zu stimulieren. Diese mAb besitzen also superagonistische
Aktivität.
Im Weiteren wurde untersucht, ob costimulatorische und
superagonistische CD28-spezifische mAb an unterschiedliche
Bereiche des CD28-Moleküls binden. Die mAb wurden durch
Immunisierung von Mäusen mit CD28 der Ratte hergestellt;
erwartungsgemäß reagieren sie deshalb alle nicht mit Maus
CD28 (nicht gezeigt). Da die mAb also nur solche Bereiche
des Ratten CD28-Moleküls erkennen können, die sich von dem
der Maus unterscheiden, wurde zunächst ein
Sequenzvergleich zwischen CD28 der Maus und der Ratte
vorgenommen (siehe Fig. 2, oberer Teil). Die Unterschiede
zwischen beiden Spezies sind hervorgehoben. Zur Benennung
der Aminosäuren wurde der Ein-Buchstaben-Code verwendet.
Als Prototypen für einen konventionellen
Ratten-CD28-spezifischen mAb wurde JJ319, für einen
superagonistischen mAb wurde JJ316 verwendet (siehe
WO 98/54225).
In Fig. 3 ist die Kartierung der Bindung gezeigt. Es
wurden Expressionsplasmide konstruiert, in denen ein Teil
der extrazellulären Domäne von CD28 aus der Maus, ein
anderer aus der Ratte stammt. Dies ist jeweils symbolisch
durch Balken bzw. Striche dargestellt; rechts daneben ist
die Bindung der mAb JJ316 und JJ319 an Maus-Fibroblasten
(L929-Zellen) gezeigt, die mit diesen Expressionsplasmiden
transfiziert worden waren. In den ersten beiden Zeilen der
Abb. 3 (m/r und r/m 1-37) wird die Bindung beider
Antikörper zur "rechten" Hälfte der Sequenz kartiert:
Beide binden, wenn diese aus der Ratte stammt; Im
umgekehrten Konstrukt (rm CD28 1-37, links Ratte, rechts
Maus) findet keine Bindung statt. In der dritten Zeile
(m/r CD28 1-66) wird gezeigt, dass JJ316 nicht mehr
bindet, während der noch vorhandene Teil der Rattensequenz
("rechts") für die Erkennung durch JJ319 noch ausreicht.
Demnach erkennen die beiden mAb unterschiedliche Epitope
auf dem CD28-Molekül, und die Bindung des Superagonisten
JJ316 muss folglich in dem Bereich zu suchen sein, der in
dem Konstrukt der ersten Zeile, nicht aber in dem
Konstrukt der dritten Zeile aus der Ratte stammte. Klarer
Kandidat dafür ist der in Fig. 2 eingekastelte Bereich.
In den Zeilen 4 und 5 der Fig. 3 wurden deshalb zunächst
zwei und dann drei Aminosäuren in diesem Bereich des Maus
CD28-Moleküls so verändert, dass sie nun die Rattensequenz
darstellen. Durch diese "Transplantation" von nur drei
Aminosäuren konnte die Bindungsfähigkeit für mAb JJ316,
nicht aber (wie erwartet) die von JJ319 übertragen werden.
In Tab. 1 sind die Bindungsdaten für die ganze Palette
CD28-spezifischer mAb zusammengefasst. Es ergibt sich eine
eindeutige Korrelation: Die beiden mAb, die auch ohne
TCR-Stimulation funktionieren (Superagonisten) erkennen
das besagte ("eingekastelte", Fig. 2) Epitop, die
konventionellen (nur costimulatorischen) mAb dagegen
nicht. Ein costimulatorischer mab (5S35) erkennt das
eingekastelte Epitop sehr schwach und bindet sehr stark an
das "konventionelle" Epitop.
Die nächsten Figuren beschäftigen sich mit
superagonistischen human-spezifischen mAb. Auch diese
wurden in Mäusen hergestellt, reagieren also nicht mit dem
CD28-Molekül der Maus. Die Mäuse wurden mit
human-CD28-transfizierten A20/J Maus B-Lymphomzellen
immunisiert (siehe WO 98/54225) und zusätzlich vor der
Fusion mit käuflich erhältlichem human CD28-FC
Fusionsprotein geboostert (von R und D Systems gekauft).
In einer Serie von Fusionsexperimenten wurden aus mehreren
Tausend Zelllinien ca. 20 identifiziert, die human-CD28
spezifische mAb produzieren (Bindung an Maus L929 Zellen,
die human-CD28 exprimieren, aber nicht an untransfizierte
L929 Zellen), analog zum Screen in der Literaturstelle
WO 98/54225. Von diesen zeigten zwei die gesuchte
superagonistische Aktivität (9D7 und 5.11A), während alle
neuen mAb konventionelle costimulatorische Aktivität
besitzen. Im Weiteren werden insbesondere die beiden
superagonistischen mAb beschrieben. Als Beispiel für einen
konventionellen human-CD28-spezifischen mAb wird der
ebenfalls neu generierte mAb 7.3B6 verwendet.
Fig. 4a zeigt, dass die verwendeten Präparate der drei
neuen mAb vergleichbar gut und auch mit vergleichbarem
Titer an menschliche T-Lymphozyten binden. Gezeigt ist ein
Experiment, in dem frisch isolierte mononukleäre Zellen
aus dem menschlichen Blut (sog. PBMC) zunächst mit
verschiedenen Verdünnungsstufen der eingesetzten mAb auf
Eis behandelt wurden; dann wurde gewaschen und der
gebundene mAb durch einen Fluoreszenz-Farbstoff markierten
Sekundärantikörper sichtbar gemacht, der spezifisch die
gebundenen Maus mAb erkennt. Durch Verwendung eines
weiteren mAb, der menschliche CD4 T-Zellen detektiert und
an den ein zweiter Fluoreszenz-Farbstoff gebunden war,
konnte die Bindung der titrierten mAb durch elektronisches
gating selektiv für CD4 T-Lymphozyten bestimmt werden.
Angegeben ist mit "MFI" die durchschnittliche
Fluoreszenzintensität, die ein Maß für die Menge des
gebundenen CD28-spezifischen mAb darstellt. Die
Konzentrationen stellen 3-fach Verdünnungen eines
standardisierten Ausgangspräparats dar. Es ist durchaus
normal, dass bei diesem Test die höchste Konzentration ein
schwächeres Signal gibt als die folgenden
Titrationsschritte; dies hat mit der Avidität (bivalente
Bindung) von mAb zu tun und spielt in den hier
diskutierten Zusammenhängen keinerlei Rolle.
Die Fig. 4b und c vergleichen die Fähigkeiten
superagonistischer human-CD28-spezifischen mAb mit jenen
konventioneller CD28-spezifischer mAb - in An- und
Abwesenheit eines TCR-Signals - frisch isolierte
menschliche T-Zellen zum Wachstum zu stimulieren. Gezeigt
ist wiederum ein 3H-Thymidin Einbau, wie vorstehend für
die Ratte beschrieben. Für Fig. 4b waren die Näpfe mit
einem mAb beschichtet, der mit dem menschlichen
TCR/CD3-Komplex reagiert. Es wurde also Costimulation
gemessen. Man erkennt, daß die Proliferation ohne
Costimulation mit einem der mAb ausbleibt
(Negativkontrolle), alle drei Antikörper sind jedoch in
der Lage, die Zellteilung zu stimulieren. Für Fig. 4c
wurde in Abwesenheit eines TCR/CD3-spezifischen mAb
gearbeitet. Nur die Antikörper 9D7 und 5.11A konnten
superagonistisch stimulieren.
Nachdem das Epitop für superagonistische mAb bei der Ratte
definiert ist und zwei neue superagonistische mAb mit
Spezifität für menschliches CD28 isoliert worden waren,
wurde überprüft, ob diese mAb an die entsprechende Stelle
des menschlichen CD28-Moleküls binden. Wie aus Fig. 2
ersichtlich, unterscheiden sich die CD28-Moleküle der Maus
und des Menschen in zahlreichen Positionen. Aufbauend auf
der Kartierung des superagonistischen Epitops bei der
Ratte wurde deshalb direkt geprüft, ob sich die
Bindungsstelle für das superagonistische Epitop auf
menschlichem CD28 auf das CD28-Molekül der Maus durch
"Transplantation" der fünf Aminosäuren dieses homologen
Bereiches erreichen lässt. Die Ergebnisse sind in der
Fig. 5 gezeigt. Vor dem Hintergrund der homogen
dargestellten Maus-Sequenz für die extrazelluläre Domäne
des CD28Moleküls (Mitte) sind als Striche die
ausgetauschten (Maus zu human) Aminosäurepositionen
dargestellt (unten). Die Zahlen an der Seite geben
zusätzlich noch die einzelnen Positionen und Mutationen an
(F60V bedeutet z. B., dass an Position 60 das Phenylalanin
der Maus durch ein Valin der menschlichen Sequenz ersetzt
wurde). Daneben ist die Bindung der drei untersuchten mAb
dargestellt. Wie die Abbildung zeigt, erkennen zwar alle
drei mAb menschliches CD28, nur die beiden mab 9D7 und
5.11A reagieren jedoch mit dem Maus CD28-Molekül, dem die
fünf Aminosäuren des menschlichen CD28 an der
entscheidenden Stelle transplantiert worden waren.
Angesichts der Vielfalt von Unterschieden ist diese
gezielte Herstellung der Reaktivität überraschend und
bestätigt in vollem Maße die aus den Experimenten mit
Ratten CD28 abgeleitete Erkenntnis, dass superagonistische
mAb an eine bestimmte, nämlich diese Stelle des Moleküls
binden müssen.
In Fig. 6 ist ein dreidimensionales Modell des
CD28-Moleküls gezeigt. Die neu identifizierte
Bindungsregion ist hervorgehoben. Sie entspricht der
eingekastelten Sequenz in Fig. 2. Die extrazelluläre
Domäne von CD28 gehört strukturell zur sog.
Immunglobulin-Superfamilie, die sich durch zwei
übereinanderliegende β-Faltblätter als Grundstruktur
auszeichnet. Die Beschriftung dieser Bänder erfolgt nach
einem in der Literatur vorgegebenen Muster. Wichtig für
die hier gezeigte Darstellung ist, dass die als Epitop für
superagonistische CD28-spezifische mAb in Ratte und Maus
identifizierte Region als "C'-D loop" bezeichnet wird.
Es wurde also gezeigt, dass mAb mit Spezifität für den
C'-D Loop des CD28-Moleküls superagonistische Aktivität
besitzen, also im Sinne der Literaturstelle WO 98/54225 zur
Aktivierung von T-Lymphozyten eingesetzt werden können.
Die superagonistische Aktivität C'-D Loop spezifischer mAb
in Ratte und Mensch zeigt, dass es dabei nicht auf die
Sequenz des Epitops, sondern auf seine Lage bzw. Form
ankommt.
In den Experimenten der Fig. 7 wurde untersucht, ob
erfindungsgemäße mAb nicht nur binden (siehe Fig. 3 und
5), sondern ob auch tatsächlich eine Aktivierung erfolgt.
Hierfür wurden T-Tumorzellen der Maus, BW, entweder mit
dem Konstrukt der Fig. 3, Zeile 5, (Ratten C'-D Loop
Übertragung) oder mit dem Konstrukt der Fig. 5, Zeile 3,
(human C'-D Loop) transfiziert. Die Aktivierung dieser
Zellen wird nicht durch Zellteilung gemssen (sie
proliferieren ohnehin), sondern durch die Produktion des
Zytokins IL-2. Fig. 7 zeigt, daß ohne Stimulation keine
IL-2 Produktion erfolgt (Negativkontrolle). Stimulation
mit einem T-Zellrezeptor-spezifischen mAb induziert IL-2
Produktion (Positivkontrolle). Fig. 7a zeigt zeigt die
Ergebnisse bei Einsatz des superagonistischen mAb JJ316
der Ratte, während Fig. 7b Ergebnisse für den human C'-D
Loop spezifischen mAb 5.11A zeigt. In beiden Fällen werden
die jeweiligen Zelllinien zur IL-2 Produktion stimuliert.
Erwartungsgemäß erfolgt die Stimulierung jedoch nicht
mittels "konventioneller" CD28 spezifischer mAb, da diese
nicht nur nicht an das C'-D Loop bindet, sondern das
Kontrukt überhaupt nicht erkennen können, weil sie für
ratten- nzw. humanspezifische Sequenzen spezifisch sind,
die in dem Konstrukt nicht enthalten sind.
In der Fig. 9 sind Dot Plots gezeigt, bei denen jede
gemessene Zelle durch einen Punkt dargestellt ist. Die
phänotypische Charakterisierung der regulatorischen
T-Zellen erfolgte dabei durch Kombination der
Zelloberflächenmoleküle CD4 und CD25. Hierzu werden die
Zellsuspensionen mit entsprechend
Fluoreszenzfarbstoffmarkierten monoklonalen Antikörpern gegen CD4 bzw. CD25
inkubiert, gewaschen und in einem Durchflußzytophotometer
auf Bindung dieser Antikörper untersucht. Die gezeigten
Ergebnisse wurden drei Tage nach i. p. Injektion eines
costimulatorischen (Fig. 9a, JJ319) oder
superagonistischen CD28 spezifischen mAb (Fig. 9b, JJ316) erhalten.
Im Falle von JJ319 sind etwa 7% der CD4 T-Zellen auch CD25
positiv (4/(50 + 4)), was nicht gezeigten Ergebnissen in
unbehandelten Tieren entspricht. Dagegen sind nach
Behandlung mit JJ316 ca. 20% CD4+CD25+ (10/(10 + 40)). Zudem
ist das Niveau der CD25 Expression weitaus höher als im
Kontrolltier. Ein solch hohes Niveau ist charakteristisch
für regulatorische T-Zellen.
Die Fig. 10 zeigt eine phänotypische Charakterisierung in
Darstellung als Histogramm. Dabei wurde in den Fig. 10a
bis 10c der Marker CD45RC detektiert, eine hochmolekulare
Isoform des CD45 Moleküls, welche auf naiven CD4 T-Zellen
stark, auf stimulierten CD4 T-Zellen jedoch niedrig
exprimiert wird. Eine niedrige Expression ist für
regulatorische T-Zellen typisch. Fig. 10a zeigt, daß
CD4+CD25- Zellen aus unbehandelten Tieren CD45RC
mehrheitlich stark exprimieren. Dagegen findet im Falle
von CD4+CD25+ Zellen aus unbehandelten Tieren starke
Expression nur in einer deutlichen Minderheit aller Zellen
statt (Fig. 10b). Im Falle der Behandlung mit dem
superagonistischen CD28 spezifischen mAb (Fig. 10c) ist
die Herunterregulierung von CD45CD45RC noch weitaus
stärker ausgeprägt als im Falle der Fig. 10b. Im Falle
der Fig. 10d bis 10e das von regulatorischen T-Zellen
konstitutiv exprimierte CD152 (CTLA-4) durch Anfärbung
detektiert. Diese Anfärbung muß aufgrund der
intrazellulären Lokalisation von CD152 nach
Permeabilisierung fixierter Zellen durchgeführt werden und
ist deshalb mit einem unspezifischen Hintergrund behaftet.
Zur Kontrolle hierauf wurde eine sogenannte
Isotypenkontrolle mitgefahren, i. e. es wurde eine
intrazelluläre Anfärbung mit einem mAb der gleichen
Immunglobulinklasse, welcher jedoch nichts spezifisch
erkennen kann, durchgeführt. Der spezifische CD152
Nachweis ergibt sich dabei als Verschiebung des CD152
Histogramms gegenüber dem Isotyp-Kontrollhistogramm. Man
erkennt in Fig. 10d keine Verschiebung und folglich keine
CD152 Expression in den CD4+CD25- Zellen. In den
unbehandelten CD4+CD25+ Zellen ist eine schwache
Verschiebung (Fig. 10e) und in den JJ316
(superagonistischer CD28 spezifischer mAb) behandelten
Zellen eine stärkere Verschiebung erkennbar in
Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Fig. 10a bis
10c.
Im Ergebnis ist mit den Fig. 9 und 10 phänotypisch
gezeigt, wie regulatorische T-Zellen identifizierbar sind,
und daß superagonistische CD28 spezifische mAb in vivo
regulatorische CD4 T-Zellen präferentiell vermehren bzw.
induzieren.
In der Fig. 11 wurden CD4+CD25+ Zellen durch
elektronische Zellsortierung entweder aus unbehandelten
Ratten (Fig. 11a) oder aus mit JJ316 behandelten Ratten
(Fig. 11b) isoliert und in 96 Napfplatten gemäß dem Stand
der Technik kultiviert. Zellvermehrung wurde durch 3H
Thymidineinbau zwischen Tag 2 und 3 der Kultivierung
gemessen. "(-)" bedeutet keine Stimulierung, Kostimulation
bedeutet Stimulation mit einem nicht-superagonistischen
CD28 spezifischen mAb (JJ319) sowie mit dem
TCR-spezifischen R73, und JJ316 zeigt die
superagonistische Stimulation. Sowohl Fig. 11a als auch
11b zeigen, daß regulatorische T-Zellen schlecht auf
Kostimulation, jedoch gut auf Stimulation mit einem
superagonistischen CD28 spezifischen mAb reagieren.
Stimulation mit erfindungsgemäß eingesetzten mAb zeigt
also auch in Zellkultur eine beachtliche Vermehrung
regulatorischer T-Zellen.
Fig. 13 zeigt eine Darstellung entsprechend Fig. 10f,
jedoch nach in vitro Stimulation mit superagonistischen
CD28 spezifischen mAb (JJ316). Man erkennt eine noch
stärker nachweisbare CD152 Expression.
In der Fig. 13 ist die inhibitorische Funktion
regulatorischer T-Zellen auf CD4+CD25- T-Zellen, welche
als Indikatorzellen für den suppressorischen Effekt
dienen, dargestellt. Als Stimulus für die CD4+CD25-
T-Zellen wurde Kostimulation (R73 + JJ319) verwendet.
Gemessen wurde der 3H Thymidineinbau zwischen Tag 2 und 3
der Kultivierung. CD25+ bedeutet elektronisch sortierte
CD4+CD25+ T-Zellen aus drei Tage zuvor mit
superagonistischen CD28 spezifischen mAb (JJ316)
behandelten Tieren. CD25- steht für die Indikatorzellen.
CD25+/CD25- bedeutet in Fig. 13a, daß beide
Zellpopulationen zu gleichen Teilen miteinader gemischt
wurden. Man erkennt, daß die CD25+ Zellen auf
Kostimulation nicht mit Proliferation reagieren. Zudem
wird zusätzlich die Proliferation von Indikatorzellen
unterdrückt. In der Fig. 13b ist eine Titration der
regulatorischen T-Zellen durch Mischung mit
Indikatorzellen in verschiedenen Mengenverhältnissen
dargestellt. Man erkennt, daß selbst bei einem Verhältnis
regulatorischer zu Indikatorzellen von 1 : 16 noch
Suppression zu beobachten ist. Dies zeigt die hohe
Effektivität der mit erfindungsgemäß verwendeten mAb
stimulierten regulatorischen Zellen.
Fig. 14 zeigt einen Vergleich der Reaktionen humaner
CD4+CD25- T-Zellen (naive Zellen) zu CD4+CD25+ T-Zellen
(regulatorische Zellen) in Antwort auf Kostimulation
(anti-CD3 + konventionelle anti-CD28 mAb) bzw. auf
human-spezifische superagonistische CD28 spezifische mAb
(9D7 und 5.11A). Die Versuche entsprechen jenen, wie
vorstehend für die Ratte beschrieben. Von links beginnend
zeigen die ersten drei Gruppen unstimulierte Kontrollen
(kein 3H Thymidineinbau). Es handelt sich dabei um die
gesamten CD4+ T-Zellen, dann die durch Sortierung
gewonnene CD25- Fraktion und schließlich die durch
Sortierung gewonnene CD25+ Fraktion. "med" bedeutet
Medium. Hieran schließen sich zwei Gruppen an, bei welchen
superagonistisch stimuliert wurde (9D7 und 5.11A). Man
erkennt, daß die regulatorischen T-Zellen auf die
Stimulation mit superagonistischen CD28 spezifischen mAb
im Vergleich zur Gesamtpopulation der CD4+ Zellen und
ihrer CD25- Fraktion besser reagieren. Die letzte
Dreiergruppe zeigt die Ergebnisse der konventionellen
Kostimulation. Hier ist demgegenüber die Reaktion der
ungetrennten T-Zellen sowie der CD25- Fraktion eher
besser.
Im Ergebnis ist sowohl für Ratten T-Zellen als auch im
humanen System belegt, daß superagonistische CD28
spezifische mAb regulatorische T-Zellen besser induzieren
bzw. vermehren als konventionelle Kostimulation. Weiterhin
ist belegt, daß dies auch im intakten Organismus
verifiziert werden kann.
In Fig. 15 ist der Krankheitsverlauf der aktiven EAN
unter Behandlung mit verschiedenen mAb dargestellt.
Verwendet wurden 7-8 Wochen alte weibliche LEW Ratten
erhältlich vom Charles River Laboratories (Sulzfeld,
Deutschland). Die Tiere wurden mit einem synthetischen
Peptid immunisiert, welches einem Teil des Myelinproteins
P2, das periphere Nervenfasern umhüllt, entspricht
(Aminosäuren 53-78 des bovinen P2 Proteins, 504 einer
0,5 mg/ml Lösung, Inokulation in den Fußballen). Nach ca.
10 Tagen entwickelt sich eine progressive Lähmung, welche
nach einem standardisierten Scoring (King et al., Exp
Neurol, 87: 9-19 (1985) quantifiziert werden kann. Fig.
15a zeigt eine präventive Therapie mit superagonistischen
CD28 spezifischen mAb (JJ316) und Fig. 15b Behandlung mit
konventionellen mAb (JJ319). Die Applikation erfolgte in
1 mg/Tier Dosen i. p. entweder am Tag der P2 Immunisierung
(D0), am Tag 12 (D12), i. e. nach Beginn der Symptome, oder
an beiden Tagen. Die verschiedenen Gruppen umfaßten 3 bis
6 Tiere. Ein Vergleich der Fig. 15a und 15b zeigt, daß
die Behandlung mit superagonistischen CD28 spezifischen
mAb deutlich wirksamer ist ist als eine Behandlung mit
konventionellen mAb.
Fig. 16 zeigt Ergebnisse entsprechend der Fig. 15,
jedoch bei einer prophylaktischen Behandlung. d-7 ist
Behandlung 7 Tage vor der Immunisierung, d-21 21 Tage vor
der Immunisierung. Es ist erkennbar, daß ein resistenter
Status durch Vermehrung regulatorischer T-Zellen bei
Behandlung innerhalb einer Woche vor Immunisierung
ereichbar ist, jedoch nicht bei Behandlung 3 Wochen vor
der Immunisierung.
Fig. 17 beruht auf einer Vorgehensweise, wie bei Fig.
15, jedoch Behandlung mit JJ316 am Tage 0 sowie 4. Fig.
17a zeigt den Krankheitsverlauf entsprechend der
Darstellung der Fig. 15a. Die Fig. 17b zeigt
elekrophysikalische Eigenschaften, nämlich Geschwindigkeit
der Reizleitung als direkter klinischer Parameter für die
Schädigung des Ischiasnerves. Die Messungen wurden
entsprechend der Literaturstellen Adlkofer et al,. Nat
Genet, 11: 274-280 (1995) und Heininger et al., Ann Neurol,
19: 44-49 (1986) durchgeführt. Man erkennt den
pathologischen Befund anhand der Kontrollgruppen
insbesondere in der Verlängerung der N1 und F-Latenzen
(siehe Tage 0 und 12, offene Symbole). Demgegenüber
bleiben die Latenzen im Falle der mit superagonistischen
CD28 spezifischen mAb (JJ316) behandelten Tieren zwischen
Tag 0 und Tag 12 nahezu unverändert (gefüllte Symbole).
Nicht dargestellt sind ergänzende Untersuchungen, mit
histologischem Nachweis der T-Zellinfiltration in
Dünnschichten der Nerven. Der Nachweis der T-Zellen
erfolgt mit einem für diese Technik geeigneten mAb,
nämlich B115 und Färbung der T-Lymphozyten. Die Zellkerne
wurden andersfarbig gegengefärbt. In Vergleichsversuchen
wurde festgestellt, daß in der nicht behandelten
Kontrollgruppe eine höhere Zahl von T-Zellen infiltriert
waren als in der mit einem superagonistischen CD28
spezifischen mAb (JJ316) behandelten Gruppe, was auf eine
Suppression durch regulatorische T-Zellen durch Einsatz
erfindungsgemäßer mAb hindeutet.
Ebenfalls nicht gezeigt sind Experimente, in denen die
isolierenden Myelinscheiden angefärbt wurden. Behandlung
mit superagonistischen CD28 spezifischen mAb zeigte ein
gesundes Bild, während die Kontrollgruppe
Demyelinisierung, i. e. Zerstörung der isolierenden
Myelinschichten, zeigte.
Schließlich sind in der Fig. 18 Ergebnisse einer Therapie
der passiven oder adoptiv-Transfer EAN (AT-EAN)
dargestellt. Diese wird nicht durch Immunisierung mit dem
Nervenantigen, wie vorstehend beschrieben, induziert,
vielmehr erfolgt eine intravenöse Injektion eines
autoreaktiven CD4+ T-Zellklons mit Spezifität für das P2
Myelinantigen (8 × 10and6, Zelllinie G7) gemäß der
Literaturstelle Stienekemeier et al., Brain, 122: 523-535
(1999). Fig. 18a zeigt den Krankheitsverlauf einer
Kontrollgruppe, bei Behandlung mit JJ316 am Tag 1 (d1) und
bei Behandlung am Tag 3 (d3). Beachtlich ist, daß selbst
nach Beginn der Krankheitssymptome, i. e. Behandlung am Tag
3, die Krankheit gestoppt werden kann. In der Fig. 18b
ist für die drei Gruppen die Infiltration der Nerven mit
T-Zellen quantifiziert worden und man erkennt, daß in der
Kontrollgruppe dies zur Schädigung des Nerven führt.
Dagegen sind die T-Zellzahlen bei Behandlung mit
erfindungsgemäß eingesetzten mAb erheblich niedriger
aufgrund der Induktion regulatorischer T-Zellen.
Tabelle I
Bindung von anti-Ratten CD28 mAb an Maus- und Ratten CD28
und verschiedene CD28 Mutanten