KR20100135807A

KR20100135807A - 질병 치료제

Info

Publication number: KR20100135807A
Application number: KR1020107022911A
Authority: KR
Inventors: 마티아스 게메어; 프랑크 오스터로스; 실케 아이그너; 크리스토프 우헤렉; 엘마 크라우스; 안드레아 와르텐버그-디맨드; 다니엘레 울프; 시빌레 카이저; 위르겐 린드너; 크리스토프 브루에쉐어; 벤야민 다엘켄
Original assignee: 바이오테스트 아게
Priority date: 2008-03-13
Filing date: 2009-03-10
Publication date: 2010-12-27
Also published as: AU2009235622C1; CA2718191A1; MX2010010026A; RU2540013C2; ES2569217T3; AU2009235622A1; CA2718191C; JP2011515345A; CO6311006A2; EP2262838B1; HUE028962T2; WO2009124815A1; IL207890A0; US9512226B2; JP2014122224A; US20110059082A1; CN102027016A; JP5795167B2; EP2262838A1; ZA201007216B

Abstract

본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체 및 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 약물을 포함하는, 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 조성물은 10 mg 내지 200 mg의 약물 용량으로 개체에 투여되는 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

질병 치료제 {AGENT FOR TREATING DISEASE}

본 발명은 자가면역 질환의 치료에 관한 것이다. 본 발명은 이전에 기재된 것보다 고용량으로 환자에게 투여될 수 있는 인간화 모노클로날 항체와 같은 약물에 관한 것이다. 특히 질병을 앓고 있는 환자에 효과적이거나, 효율적인 치료를 위해 고용량이 필요한 것을 특징으로 한다. 본 발명은 유효 용량의 항체와 같은 약물을 포함하는 약제학적 조성물뿐 아니라, 그의 용도 및 상기 약물을 포함하는 조성물 및 치료제를 이용한 치료 방법에 관한 것이다.

자가 면역은 생체가 자기의 구성부를 (서브분자 수준까지) "그 자신"이라고 인식하지 못하여, 자신의 세포 및 조직에 대해 면역 반응을 일으키는 것이다. 그러한 비정상적인 면역 반응의 결과로 발생하는 임의의 질환을 자가면역 질환이라고 한다. 자가면역 질환은 다발성경화증 (MS), 류마티스성 관절염 (RA), 건선, 건선 관절염, 궤양성 대장염, 크론병, 중증근무력증(MG), 자가면역성 다선증후군 II형 (APS-II), 하시모토 갑상선염 (HT), 1형 당뇨병 (T1D), 전신홍반루푸스(SLE) 및 자가면역성 림프증식성 증후군 (ALS)을 포함한다.

자가면역 질환은 T 세포가 "자기" 분자, 즉, 숙주 세포에 의해 생성된 분자를 인식하고 반응할 때 발생한다. 항원 제시 세포 (APC)에 의해 자가항원이 제시되어 '자가반응성'T 세포가 활성화 되면, 특정 조직에 대한 클론 증식 및 이동이 일어나, 염증과 조직 파괴를 유도한다.

일반적으로 T 세포는 자가 조직에 대해서는 내성이며, 이종 유래의 구조가 제시되는 경우에만 반응한다. 중심 관용(Central tolerance) 및 말초 관용(말초 tolerance)은 2가지 기전을 포함하며, 이 기전에 의해 면역계는 자가 반응성 T 세포가 유해한 기능을 유도하는 것을 저지한다. 중심 관용은 음성 선택(negative selection)을 통해 조절된다. 이 과정은, 흉선에서 개체 발생 동안 자가반응성 T 세포의 클론을 제거하여, 사멸과정을 가지게 한다.

말초 관용은 중심 관용이 실패하여, 자가반응성 세포가 흉선을 벗어나는 경우에 보완 역할을 한다. 이 관용 기전은 면역 무시 (무반응), 말초 결실 및/또는 활성 억제을 통하여, 자가반응성세포를 제어하면서, 일생에 걸쳐 지속적으로 일어난다.

활성 억제부로서 T 조절 세포 (Treg, "억제 세포"라고도 지칭)는 말초 관용을 유지하고 자가면역을 조절한다 (Suri-Payer et al., J Immunol. 157: 1799-1805 (1996); Asano et al., J Exp. Med. 184:387-396 (1996); Bonomo et al., J. Immunol. 154: 6602-6611 (1995); Willerford et al., Immunity 3: 521-530 (1995); Takahashi et al., Int. Immunol. 10: 1969-1980 (1998); Salomon et al., Immunity 12: 431-440 (2000); Read et al., J Exp. Med. 192: 295-302 (2000). 통상 조절성 T 세포는 T 헬퍼 1형 (TH1) 및 TH2 작용(effector) 세포의 활성 및/또는 기능을 저해한다. 세포 빈도 또는 기능의 조절 곤란은 자가면역 질환을 무기력하게 만들 수 있다 (Baecher-Allan et al., Immunol. Review 212: 203-216 (2006); Shevach, Annu. Rev. Immunol. 18: 423-449 (2000); Salomon et al., Immunity 12: 431-440 (2000); Sakaguchi et al., Immunol. Rev. 182: 18- 32 (2001)).

조절성 T 세포의 일부 서브셋이 특성화되었다. Treg 패밀리는 2가지 중요 서브셋으로 구성된다: 천연적으로 발생하는 예로, CD4⁺CD25⁺ Treg 및 말초적으로 유도된 Tr1 및 Th3 Treg. 또한 NKTreg 및 CD8⁺ Treg는 인간 및 설치류에 대해 기술되어 있다 (Fehevari et al., J. Clin. Investigation 114: 1209-1217 (2004)).

흉선-유도 Treg 세포 (천연적으로 발생하는 CD4⁺CD25⁺Treg)는 자가면역 또는 병원성 면역 반응의 조절과 관련된 주요 조절 세포이다.

i) 이들은 CD4⁺ T 세포이며, 5-10%의 말초 CD4⁺ T 세포로 구성된다.

ii) 이들은 흉선에서 성숙한다.

iii) 이들은 일반적으로 IL-2 수용체 (CD25), 저분자량 아이소형의 CD45 분자, CD152 (CTLA-4) 및 전사 인자 FoxP3의 결합된 발현을 특징으로 한다.

Treg의 역할은 CD25⁺ 세포가 제거된 CD4⁺ 세포를 가지도록 재구성(reconstitution)된 면역결핍 누드 마우스 관련 실험을 예로 들 수 있다. CD4⁺CD25^- 재구성 누드 마우스에서 위염, 난소염, 고환염, 및 갑상선염 등의 다양한 기관 특이적 자가면역 질환이 발생한다 (Suri-Payeret al.; J. Immunol. 160: 1212-1218 (1998)).

CD4⁺CD25⁺ 서브셋을 누드 마우스를 이용한 재구성 실험에 포함시키면, 상기 질환의 개시가 예방된다 (Sakaguchi et al., J Immunol. 155: 1151-1164 (1995)). 또한 고 CD45RB, CD4⁺CD25^- T 세포로 SCID 마우스를 재구성할 때 발생하는 염증성 장질환 또는 생후 3일째 실시된 흉선절제술에 의해 발생하는 그외 자가 면역 질환(예로, 자가면역 위염, 전립선염, 난소염, 사구체신염, 부고환염 및 갑상선염) 모델에서, 기관 특이적 자가면역에 대한 CD4⁺CD25⁺ 세포의 보호적 가치가 확인되었다. 항-CD25 항체를 마우스에 생체내 투여하면, 기관-한정적 자가면역 질환이 유도된다.

전사 조절자 FoxP3가 마우스 CD4⁺CD25⁺ T 조절성 세포 기능에 중요한 역할을 한다는 발견과, IPEX 증후군 (면역 조절 곤란, 다내분비선 이상증(polyendocrinopathy), 장질환, 및 X-연관 유전병), CD4⁺CD25⁺ 조절성 세포 결손 마우스에서 나타나는 질환 (스컬피 신드롬:scurfy syndrome)과 유사한 몇몇 염증성 질환을 앓고 있는 환자들이 FoxP3에서 돌연변이를 가진다는 이전의 연구는, 자가면역동물 모델인 마우스 조절성 T 세포와 인간 자가면역질환 간의 직접적인 관련성을 제시하였다 (Sakaguchi et al., J Immunol. 155: 1151-1164 (1995)).

조절성 T 세포의 약제학적 기전은 충분히 밝혀지지 않고 있다. CD4⁺CD25⁺ Treg는 다클론 및 항원-특이적 T 세포 활성을 저해한다. TCR을 통한 CD4⁺CD25⁺ Treg의 활성화를 필요로 하는 세포 접촉 의존성 기전에 의해 저해가 조정되지만, Treg은 분열촉진(mitogenic) 항체 (무반응)에 의한 TCR 활성 또는 자극에 대해 증식 반응을 나타내지는 않는다 (Shevach, Nature Rev. Immunol 2 : 389 (2002)). 일단 자극이 일어나면, Treg은 항원 비의존적 방식으로 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 반응을 경쟁적으로 억제할 뿐만 아니라, B-세포 활성화 및 그의 클론 증식을 저해한다.

CD4⁺CD25⁺ Treg의 억제 활성이 TGF-β와 같은 항-염증성 사이토카인에 부분적으로 의존함을 보여주는 추가적인 데이터가 있다 (Kingsley et al., J Immunol. 168: 1080 (2002); Nakamura et al., J Exp. Med. 194: 629-644 (2001)). TGF-β 결손 마우스에서 자가면역 질환이 발생하고, 일부 모델에서 TGF-β에 대한 항체를 중화시키도록 투여한 경우에 CD4⁺ T 세포의 자가면역 또는 내성 유도 활성이 생체내에서 예방이 되지 않는다는 사실에 의해, TGF-β 분비의 기능적인 중요성이 뒷받침된다.

CD4⁺ T 세포 서브셋 내에는, 억제 기능을 가지는 적어도 2 이상의 상이한 형태의 세포가 존재할 수 있는데, 이들 세포들은 특이적인 외인성 항원 ('적응성 또는 유도성 조절 T 세포'라고 함): 1형 T 조절 (Tr1) 세포 및 Th3 세포에 노출된 후에 유도된다. 상기 세포 형태는 사이토카인 생성 특성 면에서 CD4⁺CD25⁺ Treg와는 구별될 수 있는 것처럼 보인다. 그러나 상기 상이한 형태 간의 관련성이 불분명하고, 작용기전이 중복된다.

Tr1 세포는 IL-10의 존재 하에서 반복적인 TCR 자극에 의해 유도되며, 적당한 양의 TGF-β와 함께 고농도의 IL-10 생성을 통해 면역 반응을 하향 조절하는 것으로 확인되었다 (Chen et al., J. Immunol. 171: 733-744 (2003)) .

Th3 세포 (항원의 경구 송달 후 EAE 모델에서 확인됨)는 다량의 TGF-β 및 변동량의 IL-4 및 IL-10을 생성한다. IL-4 자체는 IL-10과 구별되는 Tr1 세포와는 대조적으로 Th3 세포 분화에 주요한 인자인 것으로 밝혀졌다 (Chen et al., Science 265:1237-1240 (1994)).

면역억제제를 사용하여 T 세포 기능을 억제한 것이 자가면역 질환을 성공적으로 치료하기 위한 기본적인 치료 전략이다. 그러나 상기 약물은 선택성이 낮아 일반적인 면역억제를 유도하여, 면역계에 유해한 기능뿐만 아니라 유용한 기능까지 저해하는 결과를 초래한다. 결과적으로 감염, 암 및 약물 독성 등의 위험성이 발생할 수 있다.

T 세포 기능을 방해하는 물질은 다양한 자가면역 질환에 대한 주된 치료법이다.

자가면역 질환의 치료를 위해 조절성 T 세포의 활성화를 목적으로 하는 약물을 사용한 접근법은 현재까지 매우 다양한 것으로 확인되었다. 효능성(agonistic) 항-CD3 항체 OKT-3DMF를 이용한 TCR(Abramowicz et al, N Engl. J Med. 1992 Sep 3;327(10):736), 또는 고효능성(superagonistic) 항-CD28 항체 TGN 1412를 이용한 공동 자극 분자를 통하여, Treg의 활성화가 조절성 T 세포 집단 및 그외 통상의 T 세포를 완전히 제거하고, IFN-γ, TNF-α, IL-1 및 IL-2를 포함하는 과량의 전염증성 사이토카인을 전신적으로 유도 및 유리시켜, 인간에서 임상적으로 명백하게 사이토카인 유리 증후군(CRS)을 일으킨다 (Suntharalingam et al, N Engl. J Med. 2006 Sep 7;355(10):1018-28).

단클론 항체 OKT3 5 mg을 2-3회 최초 주입한 후, 신장 이식 수용자의 혈액에서 1-2hrs 이내에 나타나는, 고수준의 종양 괴사 인자-알파, 인터루킨-2, 및 감마-인터페론과 함께 사이토카인 유리 증후군이 대부분의 환자에서 발생한다 (Abramowicz et al , Transplantation. 1989 Apr;47(4):606-8). 이로 인해, 자가면역 질환의 치료에서 상기 항체의 유용성이 제한되어 치료창이 협소해지는 결과를 초래한다.

총량 5-10 mg의 TGN1412(체중(kg)당 0.1mg의 항-CD28)로 처리하면, TGN 1412의 1회 정맥내 주입 후 90분 이내에 다기관 부전을 동반하는 전신적인 염증 반응이 일어난다 (Suntharalingam et al, N Engl. J Med. 2006 Sep 7;355(10):1018-28).

CD4⁺ T 세포가 자가면역을 개시하고 유지하는데 중요한 역할을 한다는 점에는 이견이 없다. 따라서 면역억제제로서, CD4⁺ T 세포 표면 분자에 대한 mAbs, 특히 항-CD4 mAbs를 사용하는 것이 제안되고 있다. 다수의 임상 실험에서 이러한 접근법의 잠재적인 가능성이 확인되었으나, 보편적인 임상 실험에서 사용되기에 더욱 적합한 항-CD4 mAbs를 제작하는데 있어서 일부 문제점이 제기되고 있다.

CD4 mAbs 활성에 대한 다양한 메커니즘이 다음과 같이 제안되었다: (1) T 세포 활성화를 저해하는 CD4 및 MHC II 간 상호작용에 대한 길항 작용, (2) CD4의 세포 표면 발현의 감소에 의해 결정되는, CD4 수용체 조절, (3) 수반되는 T 세포 활성을 억제하고 CD4 T 세포 사멸을 유인할 수 있는, T 세포 수용체 교차결합 부재 시 CD4 수용체를 통한 부분 시그널링, (4) CD4 T 세포 제거를 유도하는, Fc-매개 보체 의존적 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC), 및 (5) 조절성 T 세포의 자극.

CD4 T 세포 제거를 유도하는 Fc-매개 보체 의존적 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC)이 주로 발견되는 기전이며, 특히 IgG1 서브클래스의 항체에 대해 확인된다. 단지 일부 CD4 항체들이 TRX-1(IgG1임), TNX-355, IDEC-151, OKTcdr4A와 같이 다른 기전과 관련이 있다 (Schulze-Koops et al., J Rheumatol. 25(11): 2065-76 (1998); Mason et al., J Rheumatol. 29(2): 220-9 (2002); Choy et al., Rheumatology 39(10): 1139-46 (2000); Herzyk et al., Infect Immun. 69(2): 1032-43 (2001); Kon et al., Eur Respir J. 18(1): 45-52 (2001); Mourad et al., Transplantation 65(5): 632-41 (1998); Skov et al., Arch Dermatol. 139(11): 1433-9 (2003); Jabado et al., J Immunol. 158(1): 94-103 (1997)).

"고" 용량에서 CD4⁺ T 세포의 용량 의존적인 제거 (용량 > 100mg의 복합 사이클) 및 "저" 용량에서 일시적인 분리(sequestration) (일시적인 제거) (용량 >10 mg의 복합 사이클)가 일부 CD4 항체에서 관찰된다 (Mason et al., J. Rheumatol. 29 (2): 220-229 (2002); Kon et al., Eur. Respir J. 18(1):45-52 (2001)) and HuMax-CD4 (Skov et al., Arch Dermatol. 139(11): 1433-1439 (2003), Choy et al., Rheumatology 41 (10):1142-8 (2002)). 그들의 제거 활성에도 불구하고, CD4에 대한 mAbs는 연구된 자가면역 질환, 예로 류마티스성 관절염에서 임상적 유용성 및 지속적인 효능을 제공하지 못하였다 (Strand et al., Nature Reviews 6: 75-92 (2007)). 또한 CD4⁺ T 세포의 제거는 일반적으로 심각한 면역억제를 야기할 수 있는 시나리오로 여겨진다.

다양한 자가면역 질환에서 B-F5 항체 (뮤린 IgG1 항-인간 CD4)가 시험되었다.

일부의 심각한 건선 환자가 뮤린 B-F5 항체로 치료되었고, 약간의 긍정적 효과가 기술되어 있다 (Robinet et al. Eur J Dermatol 1996; 6: 141-6, and Robinet et al., J Am Acad Dermatol 1997; 36: 582-8).

류마티스성 관절염 환자에서, 1일 용량의 B-F5으로 위약 통제 시험을 수행한 결과, 유의한 개선 효과는 나타나지 않았다 (Wendling et al. J Rheumato1; 25(8):1457-61, 1998).

다발성경화증 (MS) 환자에서, 재발성 완화성(relapsing-remitting) 양상의 환자를 10일간 치료한 결과 일부 긍정적인 효과가 관찰되었으며, 치료 6개월 후 일부 환자에서는 재발되지 않았다 (Racadot et al., J Autoimmun, 6(6):771-86, 1993). 유사한 효과가 문헌 Rumbach 등 (Mutt. Scler;1(4):207-12, 1996)에 의해 관찰되었다.

중증 크론병의 경우, 7일 연속 투여 B-F5를 투여받은 환자에서 유의한 개선 효과가 관찰되지 않았다 (Canva-Delcambre et al., Aliment Pharmacol Ther 10(5):721-7, 1996).

동종이식거부의 예방에서, B-F5의 생체이용률이 동종이식거부의 예방을 위해 사용하기에는 충분하지 않은 것으로 보고되었다 (Dantal et al. Transplantation, 27;62(10):1502-6, 1996).

상기 기재로부터, 해결되어야 할 첫번째 문제점은 임상적인 개선을 얻기 위하여 고용량의 mAb를 사용할 필요성에 있다. 이것은 특히 표적 조직에 있는 mAb에 대한 림프구의 부족한 접근성의 결과로서 일어난다. 고용량을 사용하면, 혈액 림프구에 과도한 활성을 일으켜, 원치 않는 부작용을 유도할 수 있다.

인간에서 단클론 항체 치료법의 그외 문제점은, 이들 항체가 주로 마우스 세포로부터 얻어지기 때문에, 인간 수용자에서 항마우스 반응을 유발한다는 점이다. 그 결과 마우스 단클론 항체를 이용한 치료, 심지어는 장래의 치료에 대한 효율이 감소되고, 과민증의 위험성이 증가하게 된다.

이론상으로는, 항원 결합 특이성을 결정하는, 마우스 단클론 항체의 상보성 결정 부위(complementarity-determining region: CDR)를 인간 면역글로불린 분자의 프레임워크 영역(framework region: FR)에 이식(grafting)하여 얻어지는, 인간화 항체를 이용함으로써, 상기 문제점을 해소할 수 있다. 인간화의 목적은 CDR 서열이 유래된 마우스 단클론 항체와 동일한 항원 결합 특성을 가지는 재조합 항체를 얻어서 인간에서 면역원성이 더욱 낮게 하는 것이다.

일부 경우, 마우스 항체 유래의 CDR을 인간 프레임워크 내 인간 CDR로 치환하는 것이, (항원에 대한 친화성뿐만 아니라 특이성을 포함하는) 항원 결합 특성을 부여하기에 충분하다. 그러나 많은 항체에서, 일부 FR 잔기는 항체-항원 복합체 에서 항원과 직접 접촉하거나, CDR의 입체형태에 영향을 미쳐 그들의 항원 결합력에까지 영향을 주기 때문에, FR 잔기가 항원 결합에 중요하다.

그래서 대부분의 경우에, 마우스 항체 유래의 하나 또는 몇몇 프레임워크 잔기를 이에 상응하는 인간 FR 잔기로 치환할 필요가 있다. 항-마우스 반응을 막기 위해서는 다수의 치환된 잔기가 가능한 한 작아야 하기 때문에, 어떠한 아미노산 잔기가 항원-결합 특성을 보유하는데 결정적인가를 결정하는 것이 쟁점이 된다. 더욱 적절한 치환 부위를 예측하기 위한 다양한 방법이 제안되고 있다. 이러한 방법들은 인간화의 제1 단계에 약간의 도움을 줄 수 있는 일반적인 원칙을 제공하지만, 최종 결과는 항체마다 다양하다. 따라서 주어진 항체에 대해, 어떠한 치환이 바람직한 결과를 가져오는지를 예상하는 것은 매우 어렵다.

이전에 마우스 B-F5의 인간화가 시도되어, 부모 마우스 B-F5와 유사한 CD4 결합 특성을 가지는 인간화 B-F5 (이하 "hB-F5"라고 함)를 제조하는데 성공하였다.

그래서 WO 2004/083247에서는, 인간화 항체 BT061 (인간화 B-F5, 또는 간략히 hB-F5)가 건선 및 류마티스성 관절염과 같은 자가면역 질환의 치료에 유용한 것으로 밝혀졌다. 상기 특허 출원은 0.1-10　mg, 바람직하게는 1-5　mg의 용량으로 투여되도록 제형화된, 비경구 투여 조성물을 개시하고 있다. 투여량 요법으로, 류마티스성 관절염 환자에게 10일에 걸쳐 매일 1　mg 및 격일로 5　mg을 정맥 투여한다. 따라서 상기 특허 출원에 개시된 최대 용량은 1회에 5mg이고 10일간에 걸쳐 25mg이다.

상기 연구는 또한 Wijdenes 등에 의해 EULAR 회의 (2005. 6)에서 발표된 요약 및 포스터에 기재되어 있다. 11명의 류마티스성 관절염 환자에 대한 치료가 개시되어 있다. 이틀에 한번 5 mg BT061의 5회 정맥내 주입을 150 mg 디클로페낙 치료와 병행하여 상기 환자를 치료하였다 (Wijdenes et al., Abstract and poster, EULAR conference, June 2005).

상기 연구에 기술된 항체는 고용량에서 사용하기 적절한 것으로 개시되어 있지 않으며, 따라서 고용량으로 더욱 많은 환자를 치료하기 위한 치료법을 찾는 것이 바람직하다.

상기 선행 기술과 관련하여, 본 발명의 목적은 기존의 치료에 만족할 만큼 반응하지 않는 자가면역 질환 환자를 치료하기 위한 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 현재 반응하지 않는 환자들의 치료 반응을 향상시키기 위하여, 고용량으로 환자에게 적용될 수 있는 자가면역 치료제를 찾는 것이다.

놀랍게도, 본 발명자들에 의해 수행된 시험에 의해 다른 CD4 mAbs와는 상반되게 IgG1 항체 BT061가 일단 표적 세포의 CD4에 결합하면, ADCC이나 CDC 또는 아포토시스를 유도하지 않는다는 것이 밝혀졌다.

따라서 본 발명은, 약제학적으로 허용되는 담체 및 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 약물을 포함하는, 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 약물이 10 mg 내지 200 mg의 용량으로 개체에 투여되는 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은, 약제학적으로 허용되는 담체 및 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 약물을 포함하는, 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 약물이 5 내지 60 mg/m²의 용량으로 개체에 투여되는 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은, 약제학적으로 허용되는 담체 및 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 약물을 포함하는, 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 약물이 1 내지 500 ㎍/kg의 용량으로 개체에 투여되는 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은, 약제학적으로 허용되는 담체 및 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 약물을 포함하는, 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 약물이 10 내지 150 mg/ml의 농도로 존재하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일면에서, 상기 약물은 인간화 항-CD4 항체 또는 그의 단편 또는 유도체이다.

본 발명은 또한 자가면역 질환의 치료용 의약의 제조에 사용되는 본 명세서에 정의된 약물의 용도를 제공하며, 이때 상기 약물은 본 명세서에 정의된 용량으로 개체에 투여된다. 또한 본 발명은 자가면역 질환의 치료에 사용되는 본 명세서에 정의된 약물을 제공하며, 이때 상기 약물은 본 명세서에 정의된 용량으로 개체에 투여된다.

상기 용량으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 인간화 항체 BT061 (인간화 B-F5, 또는 단순히 hB-F5)가 항-CD3 항체 등과 같은 다른 T 세포 상호작용 항체와 비교하여, 실질적으로 전염증성 사이토카인의 분비를 조절하거나 유도하지 않는다는 것을 발견하였다. 나아가 상기 항체는 CD4+ 림프구를 실질적으로 장기간 제거하지 않는다.

본 발명의 약물의 농도는, 공지된 농도에 비하여 높은 농도로 존재하는 한, 특별히 제한되지 않는다. 그러나 바람직하게는, 상기 약물의 농도는 10 (또는 10 초과) 내지 150　mg/ml, 15 내지 150　mg/ml, 15 내지 100　mg/ml, 15 (또는 15 초과) 내지 75　mg/ml, 또는 20 내지 60 mg/ml이다. 가장 바람직하게는, 약물의 농도는 (대략) 10　mg/ml, 12.5　mg/ml, 20　mg/ml, 25　mg/ml, 50　mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml 또는 100 mg/ml 중 어느 하나이다.

상기 조성물을 사용하여 개체에 적용되는 투여용적(dosage volume)은 이미 공지된 투여량에 비해 높은 전체 투여량을 전달하는 한, 특별히 제한되지 않으므로, 이에 제한되지 않는 질병력이 길거나 현재 치료에 대해 불충분한 반응을 보이는 등의 고용량을 필요로 하는 개체를 치료하는데 적합하다. 특히 본 명세서에 기재된 필요 용량을 제공하기 위하여, 투여용적 내 약물의 농도는 변경될 수 있다.

투여용적은 투여 방법에 따라 달라질 수 있다. 비경구 투여가 바람직하다. 비경구 투여의 예로는, 근육내 투여, 정맥내 투여 또는 피하 투여를 들 수 있다. 조성물이 정맥 주사되는 경우, 투여용적은 0.1 또는 0.5 ml 내지 500 ml, 바람직하게는 15 내지 25 ml, 일반적으로 약 20 ml일 수 있다. 조성물이 피하 또는 근육내 주입되는 경우, 투여용적은 0.1 내지 3 ml, 바람직하게는 0.5 내지 1.5 ml, 및 일반적으로 약 1 ml일 수 있다.

그러나 일부 구현예에서, 조성물은 농축된 형태로 제공되어, 개체가 필요로 하는 정도로 희석될 수 있다. 바람직하게는, 일부 경우에, 조성물은 약 1, 2, 3, 4 또는 5 ml의 상대적으로 소량으로 제공된다. 다른 구현예에서, 조성물은 필요로 하는 정도로 전술한 투여용적으로 (즉, 투여할 준비가 된 채로) 제공된다. 특정 구현예로서, 피하 투여용 약제학적 조성물은 투여할 준비가 된 형태로 제공되어, 비의료인에 의해서도 쉽게 투여될 수 있다.

전술한 바와 같이, 자가면역 질환을 치료할 수 있는 약물이 본 발명에 나타난 바와 같이 고용량에서 투여될 수 있다는 것은 종래에 알려지지 않았다. 자가면역 질환을 치료할 수 있는 약물의 공지된 용량이 일부 개인이나 일부 질환 형태에서 효과적이었지만, 본 발명에 의해 고용량에서 관용될 수 있음이 확인됨에 따라, 일부 자가면역 질환과 일부 환자 부류를 더욱 효과적으로 치료하기 위한 방법을 제시할 수 있게 되었다.

본 발명은 이하에서 더욱 상세히 설명될 것이다.

본 발명에 사용하기에 적절한 약물은 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 것이다. 상기 약물은 폴리펩티드, 단백질 또는 항체일 수 있다. 약물이 항체인 경우, 단클론 항체일 수 있다. 바람직하게는 항체는 단클론 항-CD4 항체이다. 항체는 또한 바람직하게는 IgG1 항체이고 비변형(unmodified) IgG1 항체일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일면에서, 상기 약물은 항-CD3 항체에 비하여, 투여 후 개체 혈장 내 전염증성 사이토카인의 수준을 실질적으로 증가시키지 않는다. 특히, 약물 투여 후 IFN-γ TNF-α IL-6 및/또는 IL-2의 수준은 건강한 개체에서 측정된 혈장 수준에 비해 실질적으로 증가되지 않는다 (도 A1 참조). 구체적으로, 표 A1에 주어진 특정 사이토카인에 대한 ULN을 X라고 하면, 본 발명의 약물을 투여한 후 96시간 이내에 X가 20배 미만으로 증가할 수 있다. 바람직하게는 X가 10배 미만으로 증가할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 농도는 투여 개시 후 10분 내지 투여 완료 후 96시간의 기간 동안의 농도이다.

건강한 개체에서 관찰되는 사이토카인 수준에 비해(표 A1에 ULN을 표시), 약물 투여 전 자가면역 환자에서의 사이토카인 수준이 이미 더 높은데, 그 이유는 예컨대 건강한 개체에서 세포의 활성 상태에 비하여 면역 세포는 변형된 활성 상태이기 때문이다. 이 경우, 약물의 투여 직전 특정 사이토카인에 대한 농도를 X라고 하면, 본 발명의 약물 투여 후 96시간 이내에 X가 20배 미만으로 증가할 수 있다. 바람직하게는 X가 10배 미만으로 증가할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 농도는 투여 개시 후 10분 내지 투여 완료 후 96시간의 기간 동안의 농도이다.

표 A1: 건강한 지원자의 혈장에서 측정한 사이토카인 수준. ULN (정상 최고치)은 39명의 개체에서 측정한 평균치 + 2 x 표준 편차로 산출한다.

본 발명의 바람직한 일면에서, 약물은 개체의 혈장 내 CD4+ 림프구 세포수를 실질적으로 장기간 지속적으로 감소시키지 않는다. 특히 투여 후 72 내지 96시간 동안 개체 혈장 내 CD4+ 림프구 세포수는 250 세포/㎕을 초과한다 (또는 250 세포/㎕ 이상임).

바람직하게는 전술한 사이토카인 및 CD4+ 림프구 효과는 치료 환자의 80% 이상에서 나타난다.

서브클래스 IgG1 항체는 높은 Fc 수용체 상호작용을 나타내기 때문에, 면역계에 대한 부정적인 영향, 예로, 림프구 세포수의 감소 또는 사이토카인 분비의 유도를 방지하기 위해서는, 서브클래스 IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체 (특히 T 세포와 상호작용하는 항체)를 사용하는 것이 당해 분야에 공지되어 있다. 또한 Fc 돌연변이, 탈당화(deglycosylation), 당변형(glycomodification) 또는 당조작(glycoengineering)에 의해 Fc 수용체 상호작용을 감소시켜, 항체 (특히 T 세포와 상호작용하는 항체)를 변형하는 방법이 당업계에 공지되어 있다.

본 명세서에 기재된 실험에서, 본 발명자들은 본 발명의 약물에는 서브클래스 IgG1 항체의 회피 및 변형이 필요하지 않다는 점을 확인하였다. 특히, 본 출원에서 제시된 데이터로부터, 본 발명의 약물이 항-CD3 항체에 비하여, 실질적으로 장기간 지속적으로 CD4+ 세포를 제거하지 않거나, 실질적인 사이토카인 분비를 유도하지 않음을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 바람직한 일면에서, 약물은 비변형 IgG1 항체, 즉, Fc 돌연변이를 포함하지 않으며, 탈당화, 당변형 또는 당조작에 의해 Fc 수용체 상호작용이 감소되지 않은 항체 또는 그의 단편 또는 유도체이다.

본 발명에 사용하기에 가장 적절한 항체는 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화시킬 수 있는, 인간화 항-CD4 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체이다. CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화시킬 수 있는 항체의 예는 문헌 [Becker et al., (European Journal of Immunology (2007), Vol. 37: pages 1217-1223)]에 개시되어 있다.

일반적으로 본 발명에 사용되는 항체는 인간 불변 영역 (Fc)을 추가로 포함한다. 이 불변 영역은 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 면역글로불린류 및 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4을 포함하는 임의의 아이소타입의 불변 도메인으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 불변 영역은 IgG, 특히 IgGl의 불변 도메인으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 V 영역을 포함하는 항체의 임의의 단편을 포함한다. 이것은 특히 Fab, Fab', F(ab)'₂, Fv 및 scFv 단편을 포함한다.

본 발명의 특히 바람직한 일면에서, 항체는 마우스 단클론 항-CD4 항체 B-F5로부터 유래된 인간화 항-CD4 항체 또는 그의 단편 또는 유도체이다. 그러한 항체의 예로는 BT061 항체를 들 수 있다.

BT061 항체, 그의 단편 및 유도체.

인간화 항체 BT061 (hB-F5)는 마우스 B-F5 mAb로부터 유래되며, 하기 폴리펩티드 서열로 정의되는 V 도메인을 가진다:

- H 쇄 V 도메인:

EEQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDCRMYWLRQAPGKGLEWIGVISVKSENYGANYAESVRGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCSASYYRYDVGAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호 1)

- L 쇄 V 도메인:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIYWYQQKPGQPPKLLIYLASILESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPWTFG QGTKVEIK (서열 번호 2).

상기 항체의 유도체 역시 본 발명에 사용하기에 적합하다. 이 유도체는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열로 정의되는 V 도메인을 가진 유도체를 포함한다.

특히 바람직한 항체는 마우스 B-F5 mAb의 상보성 결정 부위 (CDR)를 포함하고, CD4+ CD25+ 조절성 T 세포를 활성화시키는 hB-F5의 능력을 보유하고 있는 항체이다. V_H 및 V_K 도메인 내 CDR의 위치를 도 19 및 20에 나타낸다. 상기 항체는 결합의 특이성 및/또는 친화성에 실질적인 영향을 미치지 않는 CDR 서열에서 선택적으로 돌연변이를 가질 수 있다.

일반적으로 본 발명에 사용되는 hB-F5 항체는 인간 불변 영역 (Fc)을 추가로 포함한다. 전술한 바와 같이, 이 불변 영역은 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 면역글로불린류 및 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4을 포함하는 임의의 아이소타입 유래의 불변 도메인으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 불변 영역은 IgG, 특히 IgGl의 불변 도메인으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 그의 V 영역을 포함하는 BT061 항체의 임의의 단편을 포함한다. 이것은 특히 Fab, Fab', F(ab)'₂, Fv 및 scFv 단편을 포함한다.

완전한 H 및 L 쇄을 발현하기 위하여 BT061 항체의 H 쇄 또는 L 쇄의 V 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 인간 H 또는 L 쇄의 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 함께 융합되고; 또한 단백질을 분비시키는 신호 펩티드를 코딩하는 서열이 추가될 수 있다.

본 발명은 또한 전술한 폴리뉴클레오티드가 선택된 숙주 세포에서 전사 및 번역을 조절하는 적절한 조절 서열과 연결된 발현 카세트(expression cassette), 및 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 사용한다.

당해 분야에 공지된 재조합 DNA 및 유전 공학 기술을 이용하여, 상기 재조합 DNA 구조체를 제조하고 숙주 세포 내에 도입할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환된 숙주 세포를 사용한다. 본 발명의 범위 내에서 유용한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 적절한 진핵 세포 가운데, 예로 식물 세포, Saccharomyces 등의 효모 세포, Drosophila 또는 Spodoptera 등의 곤충 세포 및 HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS, 등의 포유류 세포를 들 수 있다.

본 발명에 사용되는 발현 벡터의 구축 및 숙주 세포의 형질전환은 분자생물학의 표준 기술에 의해 실시될 수 있다.

본 발명에 사용되는 BT061 (hB-F5) 항체는, 발현에 적절한 조건 하에서 상기 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터 함유 숙주 세포를 배양하고, 상기 숙주 세포 배양물로부터 상체 항체를 회수함으로써, 얻어질 수 있다.

인간화 B-F5의 구축

인간화 B-F5 V _H 및 V _K 영역의 고안

서열 번호 5 및 서열 번호 6으로 확인된, 마우스 B-F5 V_H 및 V_K 영역을 코딩하는 DNA 서열은 각각 도 3 및 도 4에 나타내었다. 오리지널 마우스 B-F5 V_H 및 V_K와 거의 유사한 인간 V_H에 대한 데이터베이스를 검색하여, 마우스 CDR이 이식된 인간 V_H 및 V_K를 선택하였다. 인간 항체의 V_H 영역(M26; 등록 번호 A36006)은 B-F5 V_H와 가장 높은 상동성을 가졌다. 다른 인간 항체의 VK 영역(FK-001; NAKATANI et al., Biotechnology , 7 (1989), 805-810))은 B-F5 V_K와 가장 높은 상동성을 가졌다.

4번째 잔기가 루신 또는 메티오닌으로 상이한 2가지 타입의 V_K를 구축하고, 각각 L4L 및 L4M로 명명하였다. 37번째 아미노산 잔기가 루신 또는 발린으로 상이한 2가지 타입의 VH를 구축하고, 각각 H37L 및 H37V로 명명하였다. B-F5, FK-001, L4L, 및 L4M의 폴리펩티드 서열 배열을 도 19에 나타내었다. B-F5, M26, H37L, 및 H37V의 폴리펩티드 서열 배열을 도 20에 나타내었다. CDR 패킹에 중요한 것으로 이전에 보고된 FR 잔기(Chothia et al., Nature 342(1989), 877; Foote et al., J. Mol. Biol., 224(1992), 487)가 박스로 표시되었다.

상기 V_H 및 V_K를 결합하여, 4가지 버전의 V 영역을 고안하였다.

인간화 B-F5의 발현

인간화 B-F5를 제작하기 위한 이후의 단계는 미국 특허 5,886,152에 개시된 인간화 B-B10에 대한 방법과 동일하다.

간략히 말하면, 인간화 B-F5의 H 쇄 (인간 y-1 쇄의 불변 영역에 융합된 V_H 인간화 영역 (TAKAHASHI et al ., Cell , 29 (1982), 671-679)) 및 L 쇄 (FK-001 K 쇄의 불변 영역에 융합된 VK 인간화 영역)에 대한 발현 플라스미드를 각각 구축하였다. 상기 플라스미드에서, 인간 단클론 IgM인 FK-001 유전자의 프로모터/인핸서에 의해, 인간화 B-F5가 발현되었다. 도 5 및 6는 각각 인간화 BF-5의 VH 및 V_K 영역을 코딩하는 플라스미드 단편을 보여준다. V 영역을 코딩하는 서열은 밑줄을 긋고, 이에 상응하는 폴리펩티드 서열은 뉴클레오티드 서열 아래에 나타낸다. 리포펙틴(Lipofectin)ⁿⁱ을 사용하여 플라스미드 및 pSV2neo 모두를 마우스 골수종 Sp2/0 (ATCC CRL-1581)에 도입하였다. 인간 IgG을 생성하는 트랜스팩토마(Transfectoma)를 항-인간 IgG (y 쇄) 항체 및 항-인간 Ig K 쇄 항체를 이용하여, ELISA에 의해 선택하였다.

다양한 버전의 인간화 B-F5의 특성화

CD4 결합 활성의 평가

4가지 버전의 hB-F5를 생성하는 트랜스팩토마의 배양 상청액을 수집하고, 농축시켰다. 단백질 A 세파로스(Sepharose)를 이용한 친화성 크로마토그래피로, 배양 상청액으로부터 다양한 항체를 정제하고, 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅된 가용성 CD4에 대한 비오티닐화 mB-F5의 결합을 억제하는 활성을 경쟁적 ELISA로 측정함으로써, 상기 항체들의 CD4 결합 활성을 평가하였다. 37℃에서 2시간, 4℃에서 밤새 인큐베이션 한다.

hB-F5의 상대적인 결합 활성 (mB-F5의 결합 활성을 100%로 함)은 하기 표 A에 나타낸다:

표 A

표 A의 결과에서, ³⁷Leu을 ³⁷Va1으로 변환하면 CD4 결합 활성이 몇 배 감소되었기 때문에, 37번째 잔기가 루신인 것이 hB-F5의 CD4 결합 활성을 유지하는데 결정적임을 알 수 있다. 반대로 V_K의 4번째 잔기는 CD4 결합 활성에 별로 중요하지 않은 것으로 밝혀졌다. V_H의 ³⁷Leu 및 ³⁷Val 간의 구조적 차이는 분자 모델링에 의해 명확히 밝혀지지 않았으며, CD4 결합 활성에 있어서 H37V에 대한 H37L의 우수성이 예측되지 않았다.

H37L/L4L 및 H37L/L4M가 평가를 위해 선택되었다.

인간화 B-F5의 시험관내 생물학적 활성에 대한 조사

마우스 B-F5 및 인간화 B-F5 (H37L/L4M IgG1 및 H37L/L4L IgG 1)의 시험관내 생물학적 활성을 평가하였다. IgG2 타입의 인간화 B-F5 (H37L/L4M IgG2 및 H37L/L4L IgG2)도 시험하였다.

건강한 도너 유래의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이용하여, mB-F5 및 4가지 타입의 hB-F5의 시험관내 생물학적 활성을 평가하였다. 뮤린 또는 hB-F5의 존재 하에서 PBMC를 ConA (2.5 pg/ml, 3 일) 또는 PPD (10 pg/ml, 4 일)로 활성화시키고, 3H-티미딘 결합(incorporation)에 의한 PBMC의 증식 반응을 모니터하였다.

뮤린 및 hB-F5는 ConA-유도 증식을 완만하게 저해하지만, 그 활성은 항체마다 및/또는 도너마다 상이하였다. 또한 뮤린 및 hB-F5는 PPD에 의해 유도된 Ag-특이적 PBMC 증식을 저해할 수 있었다.

IgG1 타입의 hB-F5는 PPD-유도 증식을 mB-F5보다 효과적으로 저해하였다 (70% 정도로 높게 저해함). IgG1 타입은 mB-F5와 거의 동일한 저해 활성을 보이는 IgG2 타입에 비해 더욱 효과적인 것으로 여겨졌다. IgGl 타입의 경우, H37L/L4M가 H37L/L4L보다 효과적이었다. IgG2 타입의 경우, H37L/L4M 및 H37L/L4L가 거의 동일한 억제 활성을 보였다. 요약하면, PPD-유도 PBMC 증식에 대한 B-F5이 저해 활성의 정도는 다음과 같다: H37L/L4M IgG1 > H37L/L4L IgG1 > H37L/L4M IgG2 = H37L/L4L IgG2 = mB-F5.

시험관내 생물학적 활성의 효능과 적은 수의 마우스 아미노산을 고려하여, H37L/L4M IgG1가 추가 평가를 위해 선택되어, BT061라고 명명하고, 본 명세서에서 제공된 실시예에서 본 발명을 설명하기 위하여 사용된다.

조성물 및 용도

전술한 바와 같이, 본 발명에 사용되는 약제학적 조성물 및 약제는 바람직하게는 고용량을 필요로 하는 자가면역 질환 환자를 치료할 수 있다. 상기 환자는 긴 질병력을 가진 심각한 경우를 포함하나, 이에 제한하지 않는다.

일면에서, 본 발명은 자가면역 질환에 효과적인 의약의 제조에 사용되는, CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 인간화 항-CD4 항체 또는 그의 단편 또는 유도체의 용도를 제공하며, 이때 상기 의약은 10　mg/ml 내지 150 mg/ml, 바람직하게는 0.5 mg/ml 내지 75 mg/ml, 가장 바람직하게는 20 내지 60 mg/ml 농도의 항체를 포함한다.

본 발명은 또한 자가면역 질환에 효과적인 의약의 제조에 사용되는, CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 인간화 항-CD4 항체 또는 그의 단편 또는 유도체의 용도를 제공하며, 이때 상기 의약은 개체에 투여당 10 내지 200 mg의 항체 용량을 1회 또는 복수회 투여한다.

본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 담체 및 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 약물을 포함하는 자가면역 질환 치료용 약제학적 조성물을 제공하며, 이때 조성물은 개체에 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 80 mg, 15 mg 내지 80 mg, 20 mg 내지 75 mg, 바람직하게는 20 mg 초과-60 mg 이하, 가장 바람직하게는 25 mg 내지 60 mg의 약물 용량이 투여된다.

본 발명의 일면에서, 개체는 상기 용량을 복수회 투여받는다. 이 경우 10일간 투여량은 25 mg 초과-200 mg 이하, 더욱 바람직하게는 28 mg-100 mg, 가장 바람직하게는 30 mg-100 mg이다. 또한, 5일간 투여량은 15 mg 초과-100 mg 이하, 더욱 바람직하게는 18 mg-100 mg, 및 가장 바람직하게는 20 mg-100 mg이다. 본 발명의 일면에서 상기 용량이 피하 투여되는 것이 특히 바람직하다.

투여량은 개체의 체표면적(BSA)을 기초로 산출할 수 있다. 체표면적(BSA)은 공지된 방법에 따라 산출될 수 있다. BSA 계산법의 예는 다음과 같다:

모스텔러 공식(Mosteller formula): (BSA(m²) = ([키(cm) x 체중(kg)]/ 3600)^1/2

(Mosteller RD: Simplified Calculation of Body Surface Area. N Engl J Med 1987 Oct 22;317(17):1098)　　　　

두보이스 및 두보이스 공식(DuBois and DuBois formula): BSA(m²) = 0.20247 x 키(m)^0.725 x 체중(kg)^0.425

(DuBois D; DuBois EF: A formul to estimate the approximate surface area if height and weight be known. Arch Int Med 1916 17:863-71)

헤이콕 공식(Haycock formula): BSA(m²) = 0.024265 x 키(cm)⁰ ^.3964 x 체중(kg)^0.5378

(Haycock G.B., Schwartz G.J.,Wisotsky D.H.　 Geometric method for measuring body surface area: A height weight formula validated in infants, children and adults. 　 The Journal of Pediatrics 1978　 93:1:62-66)

게한 및 조지 공식(Gehan and George formula): BSA(m²) = 0.0235 x 키(cm)⁰ ^.42246 x 체중(kg)⁰ ^.51456

(Gehan EA, George SL, Estimation of human body surface area from height and weight. Cancer Chemother Rep 1970 54:225-35)

보이드 공식(Boyd formula): BSA(m²) = 0.0003207 x 키(cm)⁰ ^.3x 체중(g)^{(0.7285 - ( 0.0188 x} ^LOG ^{(g) )}

본 발명에 따른 개체에 대한 약물의 용량은 환자의 체표면적당 5 내지 60 mg/m², 바람직하게는 6 내지 50 mg/m², 및 가장 바람직하게는 8 내지 40 mg/m²이다

또한 용량은 개체의 체중을 기초로 산출할 수 있다. 본 발명에 따른 개체에 대한 약물의 용량은 0.1 내지 2 mg/kg, 바람직하게는 0.15 내지 1.5 mg/kg, 및 가장 바람직하게는 0.2 내지 1 mg/kg이다.

개체의 체표면적 또는 체중을 기초로 용량을 결정하는데 있어, 10일간 용량은 10 mg/m² 내지 120 mg/m², 더욱 바람직하게는 16 mg/m² 내지 120 mg/m², 또는 0.2 mg/kg 내지 4 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.4 mg/kg 내지 4 mg/kg인 것이 바람직하다. 상기 용량이 피하 투여되는 것이 특히 바람직하다.

투여 빈도는 치료 효율을 방해하지 않는 한, 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에서, 적어도 다음의 기준으로 용량을 복수회 투여하는 것이 바람직하다: 매일, 격일마다, 매주, 4주마다, 6주마다, 12주마다, 24주마다, 1개월마다, 3개월마다, 6개월마다 또는 매년. 그래서 용량은 1일 이상 또는 1주 이상 또는 1개월 이상 또는 3개월 이상 또는 6 개월 이상 또는 1년 이상으로 (적어도 매일, 매주, 매달, 6개월마다 또는 매년 투여됨을 의미) 나뉠 수 있다. 또한, 1 내지 31일마다, 또는 1-12 개월마다 용량이 복수회 투여된다.

치료 길이는 특별히 한정되지 않으며, 자가면역 질환 치료의 경우 통상 무기한 또는 환자에 대해 처리가능한 수준으로 증상이 감소될 때까지, 치료가 지속된다. 일반적으로 상기 용량을 1개월 이상 개체에 투여한다.

본 발명은 또한 상기 정의된 용도로 사용되는 키트를 제공하며, 이때 키트는 개체에 동시적, 순차적 또는 개별적으로 투여되는 상기 정의된 복수의 의약을 포함한다.

또한 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환의 치료 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 약물을 포함하는 의약을 전술한 용량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환의 치료 방법을 제공한다.

상기 약물은 마우스 단클론 항-CD4 항체 B-F5 유래의 인간화 항-CD4 항체 또는 그의 단편 또는 유도체인 것이 바람직하다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 사용되는 약제학적 조성물 및 의약은 바람직하게는 고용량을 필요로 하는 환자에서 자가면역 질환을 치료할 수 있다. 상기 환자는 긴 질병력을 가진 심각한 경우를 포함하나 이에 제한하지 않는다.

바람직하게는 자가면역 질환은 건선, 류마티스성 관절염, 다발성경화증, 1형 당뇨병, 염증성 장질환, 크론병, 자가면역 갑상선염(thyreoiditis), 자가면역 중증근무력증, 전신홍반루푸스, 궤양성 대장염, 아토피성 피부염, 심근염 및 이식편 대 숙주(graft-versus-host) 또는 숙주 대 이식편(host-versus-graft) 반응 또는 일반적인 기관 내성 문제 등의 이식 관련 질환으로부터 선택된다.

특히 본 발명의 바람직한 일면에서, 약제학적 조성물은 자가면역 질환인 건선을 치료하는데 사용된다. 특히 상기 약제학적 조성물은 상기 특정된 용량으로 정맥내 또는 피하 투여된다.

건선은 환자의 피부에 건선성 병변 또는 플라크를 일으키는 질환이다.

건선 부위 및 중증도 지수 (PASI)의 스코어가 환자에 나타나는 건선 수준을 평가하고 기록하는데 일반적으로 사용된다. PASI 스코어는 홍반 (E), 침윤 (I), 및 표피탈락(desquamation) (D)의 평가, 및 4군데의 인체 영역 (머리 (h), 몸통 (t), 상지 (u) 및 하지 (l))에 걸친 체표면적 (A)을 포함한다. 하기 표 B는 스코어 시스템의 방법을 보여준다.

표 B: PASI 스코어 시스템

머리, 상지, 몸통 및 하지는 각각 최표면적의 약 10, 20, 30, 및 40%에 상당하므로, PASI 스코어는 하기 식에 의해 산출된다:

PASI = 0.1(E _h + I _h + D _h )A _h + 0.2(E _u + I _u + D _u )A _u + 0.3(E _t + I _t + D _t )A _t + 0.4 (E _l + I _l + D _l )A _l

PASI 스코어는 0-72 범위이다. 스코어 0은 건선이 없음을 의미하며, 스코어 72는 가장 심각한 건선을 나타낸다.

바람직한 구현예로서, 본 발명의 약제학적 조성물은 환자의 PASI 스코어의 개선율이 40 % 이상, 바람직하게는 50 % 이상이면 건선을 치료할 수 있다. 바람직하게는 개체는 치료 전에 10 이상의 PASI 스코어를 갖는다. 이러한 효과는 투여 후 적어도 56 일, 더욱 바람직하게는 적어도 75 일째에 나타날 수 있다. 특히, 이러한 효과는 치료되는 환자의 적어도 80%에서 나타날 수 있다.

본 발명의 추가적 면에서, 약제학적 조성물은 류마티스성 관절염을 치료하기 위한 것이다.

류마티스성 관절염은 관절 및 주변 조직에 만성적인 염증을 유발하는 자가면역 질환으로, 다른 조직 및 신체 기관에도 영향을 줄 수 있다.

치료 환자에서 나타나는 류마티스성 관절염의 개선도는 통상 미국 류마티스 학회(ACR)의 파라미터 코어 세트를 사용하여 평가한다 (Felson et al., Arthritis & Rheumatism, 1995, 38(6), 727-735). 이 시스템에서, ACR 20 값은 압통 및 부종 관절수의 20% 개선, 및 환자 및 의사의 종합 평가, 통증, 장애 및 C-반응성 단백질 (CRP)과 같은 급성기 반응 물질(acute phase reactant)을 측정하여 남아있는 5개의 ACR 코어 세트 중 3개가 20% 개선된 것으로 정의된다.

특히, 류마티스성 관절염 치료용 약제학적 조성물은 바람직하게는 본 명세서에 특정된 투여량으로 근육내 또는 피하 투여된다.

본 발명의 관절염 치료법은 예로, 아스피린, 이부프로펜, 나프록센 등의 비스테로이드성 항염증제 (NSAID)로 분류되는 통증 및 염증을 조절하기 위한 일차 치료제를 포함한다. 관절염의 이차 치료제는 코르티코스테로이드 (예로, 프로드니손 및 덱사메타손), 지속성 항류마티스제 (slow acting antirheumatic drug: SAARD) 또는 질환 완화 항류마티스제 (DMARD), 예로, 메토트렉세이트, 페니실린아민, 사이클로포스파미드, 금염(gold salt), 아조티오포프린(azothipoprine), 레플루노마이드(leflunomide) 등을 포함한다.

신체의 코르티손 호르몬의 합성 보전인 코르티코스테로이드가 RA 진행을 저해하는데 사용된다 (예로, 프로드니손 및 덱사메타손).

또한 생물학적 반응 조절 물질 (biological-response modifier: BRM)로 불리는 그외 약물이, 수용체에 결합하거나, TNF-α 단백질에 직접 결합하여 작용하는 TNF-α 길항제(아달리무맵(adalimumab), 인플릭시맵(infliximab), 에타너셉트(etanercept))를 포함하여, RA 치료를 위해 개발되었다.

본 발명의 일 구현예로서, 조성물은 류마티스성 관절염을 치료하는데 현재 사용되는 약물과 결합하여 투여된다. 특히, 조성물은 전술한 약물 중 하나, 바람직하게는 메토트렉세이트와 함께 투여된다.

메토트렉세이트 등의 공지된 약물, 및 본 발명의 약제학적 조성물은 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 투여될 수 있다.

본 발명은 단지 예시적 목적으로 하기 도면을 참고하여 상세히 설명될 것이다.
도 1은 건강한 3명의 도너 유래의 전혈(whole-blood) 배양액의 사이토카인 합성에 미치는 BT061의 영향을 나타낸 것이다. 배양액은 별개의 시험에서 4개의 상이한 형태의 활성제로 자극되었다: CD3=항-CD3 항체; LPS 지질다당류; PHA=파이토헤마글루티닌 + 항-CD28 항체; SEB=포도상구균 장독소 B(staphylococcal enterotoxin B) + 항-CD28 항체. 다양한 백혈구 아집단에 대한 효과를 측정하기 위하여 상이한 사이토카인이 선택되었다: Treg 세포 (CD3: TGF-β, IL-10); 단핵구/마크로파지 (LPS: IL-10, TNFα, IL-1β); Th2 세포 (PHA: IL-4, IL-5, IL-13); Th1 세포 (SEB: IL-2, IFNγ);
도 2는 상이한 자극제에 의해 유발된 사이토카인 합성에 미치는 인간 전혈 배양액 (류마티스성 관절염이 있는 도너) 내 BT061의 영향을 나타낸 것이다.
도 3은 마우스 B-F5 V_H 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 5)을 나타낸 것이다.
도 4는 마우스 B-F5 V_k 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 6)을 나타낸 것이다.
도 5는 인간화 BF-5의 V_H 영역을 코딩하는 플라스미드 단편의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 3)을 나타낸 것이다. V 영역을 코딩하는 서열은 밑줄을 긋고, 이에 상응하는 폴리펩티드 서열 (서열 번호 17)은 뉴클레오티드 서열 아래에 나타낸다.
도 6은 인간화 BF-5의 V_K 영역을 코딩하는 플라스미드 단편의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 4)을 나타낸 것이다. V 영역을 코딩하는 서열은 밑줄을 긋고, 이에 상응하는 폴리펩티드 서열 (서열 번호 2)은 뉴클레오티드 서열 아래에 나타낸다.
도 7A 및 7B는 각각 항-CD3 단클론 항체를 이용한 시험에서 보고된 수준과 비교하여, 건강한 지원자에게 BT061를 투여한 임상 시험에서 관찰된 TFNα 및 IL-6의 분비 수준을 나타낸 것이다. 용량 수준 및 회복 시간이 도면에 포함되어 있다. 문헌 [Keymeulen et al., 2005 N. Engl. J. Med. Type 1 Diabetes patients]에서 보고된, TRX4에 대한 결과는 도면에 "2)"로서 나타내었다. 문헌 [Herold et al., 2002 N. Engl. J. Med. Type I Diabetes patients]에서 보고된 테플리주맵(Teplizumab)에 대한 결과는 도면에 "3)"으로 나타내었다. 문헌 [Straub et al., 2007, Athr. & Rheumat]에서 보고된, 정상치는 도면에 "4)"로서 나타내었다. "*)"는 1회 용량을 나타내고, "**)"는 피크 농도에 도달할 때까지 주입된 누적 용량을 나타낸다.
도 8은 건강한 지원자에 BT061의 단일 용량을 정맥 또는 피하 투여한 후의 IL-2 및 IFN-γ 혈장 농도를 나타낸 것이다. ULN = 정상 상한치; LLN = 정상 하한치.
도 9는 BT061의 단일 용량을 정맥 투여한 지원자에서 CD4 세포수(혈장(ml)당 세포수)의 키네틱을 나타낸 것이다. 투여군 당 3명의 환자의 평균치를 보여준다. 점선은 정상 상한치(ULN) 및 정상 하한치(LLN)를 의미한다.
도 10은 BT061의 1회 용량을 피하 투여한 지원자에서 CD4 세포수(혈장(ml)당 세포수)의 키네틱을 나타낸 것이다. 투여군 당 3명의 환자의 평균치를 보여준다. 점선은 정상 상한치(ULN) 및 정상 하한치(LLN)를 의미한다.
도 11의 A 내지 H는 BT061 0.5 mg 또는 위약을 정맥 주사한, 실시예 7에 기재된 투여군 I의 건선 환자들에 대한 임상 시험 데이터를 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 도 11의 A 내지 H는 투여군 I의 환자 1 내지 8 각각의 PASI 점수를 제공한다.
도 12의 A 내지 H는 BT061 2.5 mg 또는 위약을 정맥 주사한, 실시예 7에 기재된 투여군 II의 건선 환자들에 대한 임상 시험 데이터를 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 도 12의 A 내지 H는 투여군 II의 환자 1 내지 8 각각의 PASI 점수를 제공한다.
도 13의 A 및 B는 실시예 7에 기재된 건선 환자를 대상으로 한 임상 시험에서 얻은 사진을 제공한다. 사진은 투여군 II의 일원으로 동일한 환자의 것이다. A에 나타난 도면은 치료 전에 촬영한 것이다. B에 나타난 도면은 치료 후 28일째 촬영한 것이다.
도 14는 실시예 8에 기재된 류마티스성 관절염 환자들에 대한 임상 시험으로부터 얻은 결과를 나타낸 것이다. 도면은 적어도 ACR20 반응을 이루어낸 BT061 1.25 mg, 6.25 mg, 12.5 mg 및 25 mg를 피하 주입받은 투여군 환자의 비율을 나타낸 막내 그래프를 보여준다. 각 그룹에서 6명의 환자는 항체 투여를 받았지만, 2명의 환자는 위약을 받았다.
도 15A 및 15B는 실시예 8에 기재된 류마티스성 관절염 환자들에 대한 임상 시험으로부터 얻은 결과를 나타낸 것이다. 도 15A는 25 mg의 BT061을 피하 주입받은 투여군 환자 중 압통 관절수를 나타낸 막내 그래프를 보여준다. 도 15B는 동일한 투여군 환자에서 부종 관절수를 나타낸 막내 그래프를 보여준다. 각 그룹에서 6명의 환자는 항체 투여를 받았지만, 2명은 위약을 받았다.
도 16A 및 16B는 실시예 8에 기재된 류마티스성 관절염 환자들에 대한 임상 시험으로부터 얻은 결과를 나타낸 것이다. 도면은 25 mg 피하 투여에서, 반응 환자 (도 16A) 및 비반응 환자 (도 16B)에 대한 개별 파라미터 변화(%)를 보여준다. 도면에서 "Pat's GA" 및 "Phys's GA"는 각각 환자의 종합 평가(global assessment) 및 임상의의 종합 평가를 의미한다. 용어 "PA of pain"은 환자의 통증 평가를 의미한다.
도 17A 및 17B는 실시예 8에 기재된 류마티스성 관절염 환자들에 대한 임상 시험으로부터 추가로 얻은 결과를 나타낸 것이다. 도면은 1.25 mg 피하 투여군(도 17A) 및 6.25 mg 피하 투여군(도 17B) 환자에서 압통 관절수를 보여준다.
도 18A 및 18B는 실시예 8에 기재된 류마티스성 관절염 환자들에 대한 임상 시험으로부터 추가로 얻은 결과를 나타낸 것이다. 도면은 50 mg 피하 투여군(도 18A) 및 6.25 mg 정맥 투여군(도 18B) 환자에서 압통 관절수를 보여준다.
도 19은 B-F5의 인간화 형태로 고안된 (즉, BT061), 뮤린 B-F5 V_K (서열 번호 8), FK-001 (서열 번호 9, 10, 11 및 12), L4L (서열 번호 18), 및 L4M (서열 번호 2)의 폴리펩티드 서열 배열을 나타낸 것이다.
도 20은 B-F5의 인간화 형태로 고안된, 뮤린 B-F5 V_H (서열 번호 7), M26 (서열 번호 13, 14, 15 및 16), H37L (서열 번호 1), 및 H37V (서열 번호 17)의 폴리펩티드 서열 배열을 나타낸 것이다.

본 발명은 하기 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명될 것이다.

실시예 1 - T 세포 증식과 관련된 BT061 의 면역 조절 능력에 관한 조사

방법

19G 바늘을 이용하여 신선한 말초 혈액으로부터 채취하여 전혈(Whole-blood) 배양하고, 3명의 건강한 지원자들 유래의 혈액을 헤파린이 첨가된(heparinised) 시린지에 수집하였다. 기증 후 60분 이내에 혈액을 96웰 배양 플레이트에 시딩하였다.

5가지 상이한 농도(하기 "시험 물질" 참조)로 백혈구를 자극하기에 앞서 본 발명에 사용되는 항체 (BT061, 로트 40588, 또는 로트 70A0013B)를 배양액에 가하였다. 상기 세포를 37℃, 5　% CO₂의 습윤 분위기하에서 90분간 항체와 반응시킨 후, 4가지 상이한 자극제를 가하여 배양액을 분리하였다:

(a) 항-CD3 항체 (R&D 시스템: 50 ng/m1)

(b) 항-CD28 항체 (Becton-Dickinson; 1 ㎍/m1)와 함께 파이토헤마글루티닌(phytohaemagglutinin) (PHA, Biochrom KG; 3 pa/ml);

(c) 지질다당류 (LPS, Sigma Aldrich제 서브타입 ^.055:B15; 1 ㎍/m1);

(d) 항-CD28 항체 (Becton-Dickinson; 1 ㎍/ml)와 함께 SE-B (Bernhard-Nocht-Institut; 25 ng/m1).

모든 전혈 배양액을 24시간동안 37 ℃, 5% CO₂ (습윤 분위기)에서 인큐베이션 하였다. 그 후, 배양 상청액을 수집하여 사이토카인 종료점(endpoint)을 확인하였으며, 예외적으로 PHA/항CD28 자극된 배양물만은 48시간 인큐베이션하여, Th2 세포의 충분한 자극을 이끌어냈다.

그 결과는 도 1에 나타낸다.

결과

BT061는 건강한 지원자 유래의 전혈 배양액 내 Th1 및 Th2 활성과 단핵구/마크로파지의 주요 활성에 유의한 효과를 나타내지 않았다. 세포에 대한 농도 의존적인 효과가 확인되었다 (TGF-베타 유리 증가로 입증됨).

특히, 상기 결과는 다음 사항을 확인시켜 준다:

- 환자에서 150mg 이하의 고용량에 상당하는 50　㎍/ml 이하의 농도에서 염증성 사이토카인 IL-2의 조절 효과가 없음

- 환자에서 150mg 이하의 고용량에 상당하는 50　㎍/ml 이하의 농도에서 염증성 사이토카인 IFN-감마의 조절 효과가 없음

- 환자에서 고용량에 상당하는 50　㎍/ml 이하의 농도에서 Th1/Th2 사이토카인의 조절 효과가 없음

- 근소한 증가로 매우 산발적으로 IL-6의 상향 조절이 관찰되나, 그 의미에 관해서는 논란의 여지가 있음

- TGF-베타 유래의 증가 (Treg 세포)

- 단핵구/마크로파지의 주요 조절 활성 및 Th1 및 Th2 활성에 미치는 유의한 효과가 없음

실시예 2 - 항-파상풍 톡소이드 반응 및 사이토카인 분석을 위해 준비된 배양된 인간 PBMC 에 미치는 BT061 의 영향에 관한 시험

방법

증식 시험

신선하게 분리된 PBMC를 200　㎕/웰 (4 x 10⁵ 세포/웰) 부피로 96웰 평면 바닥 마이크로타이터 플레이트에서 배양하였다. 시험물(항 CD4 AK BT061)을 20　㎍/ml, 4　㎍/ml 및 0.8　㎍/ml (예비 시험에서 추가로 40　㎍/ml) 농도로 사용하고; 파상풍 톡소이드를 25　㎍/ml, 5　㎍/ml 및 1　㎍/ml 농도로 사용하였다. 음성 대조군으로, 세포 배양 배지를 취하였다. 모든 배양물은 3배로 준비하였다.

ConA-자극을 위해, 농도 2.5　㎍/ml과 용적 200　㎕/웰을 사용하였다. PBMC은 1 x 10⁶/ml의 밀도로 조정하고, 각 웰당 100　㎕의 용적으로 분배하였다.

배양이 끝나면, 16시간 동안 웰당 0.4　μCi의 ³H-티미딘을 가하여, 세포 증식을 검출하였다. 배양이 끝나면, 세포를 EDTA 용액으로 표면으로부터 분리하고, 스케이트론 세포 수확기(scatron cell harvester)로 유리 섬유 필터 상에서 수확하였다. 각 웰의 DNA에 포함된 방사능 양을 섬광계수기(scintillation counter)로 측정하였는데, 이 양은 증식 세포수에 비례하며, 결국 세포 주기의 S기에 진입하도록 자극된 백혈구 수와 함수 관계에 있다. cpm_compound / cpm_blank로 정의된 각 농도에 대해 자극 지수(SI) 및 분당 수(cmp)의 파라미터가 도출되었다.

사이토카인 분석

제조자의 개별 지시에 따라 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트를 이용하여 배양 상청액 내 모든 사이토카인을 정량하였다. 사용된 시약은 하기 표 1에 나타낸다:

표 1

* 인터루킨-1 ELISA에 필요한 추가 물질

제조자의 지시에 따라 인간 IL-1 ELISA 세트 A (Bender)를 사용하여 배양 상청액 내 인터루킨 (IL)-1 수준을 측정하였다. 키트를 사용하여 정해진 표준 물질로 미리 정해진 시험 범위는 비희석 샘플에 대해 1.3 내지 130　pg/ml으로 특정하였다.

제조자의 지시에 따라 OptEIA (BD 바이오사이언스) 시험 키트를 사용하여 전환 성장 인자 (TGF) β1 및 종양 괴사 인자 (TNF) α뿐만 아니라 배양 상청액 내 IL-4, 5, 6 및 10 수준을 측정하였다. 키트를 사용하여 정해진 표준 물질로 미리 정해진 시험 범위는 비희석 샘플을 사용한 경우 IFN-γ에 대해 3.8 내지 330　pg/ml, IL-4, 5, 10 및 TNF에 대해 6,3 내지 616　pg/ml, 및 샘플의 2배 희석물을 사용한 경우 IL-6에 대해 7.6 내지 660　pg/ml로 특정하였다.

독립적인 마이크로 배양액으로부터 2개 (단핵구 배양) 또는 8개 (PBMC 배양) 사이토카인를 ELISA로 결정하는 것은 평균 및 표준 편차 계산시 포함시켰다. 시험의 상위 범위를 초과하는 역가 (예로, TNF의 경우 616　pg/ml)를 계산치로 설정하였다. 시험의 하위 범위는 계산 전 각 평균치로부터 공제하였다.

결과

BT061 (인간화 B-F5, 또는 간략히 hB-F5라고도 함)는 파상풍 톡소이드 특이적 T 세포 증식을 용량 의존적으로 저해할 수 있으며; T 세포의 총수에는 아무런 영향이 없었다. 사이토카인 분비의 전반적인 억제가 확인되었다.

하기 표 2는 3회 측정된 파상풍 톡소이드 특이적 T 세포 증식에 미치는 항 CD4 mAb BT061의 영향을 보여준다.

각 농도에 대한 3회 측정된 ³H-Tdr-삽입(incorporation)의 평균 및 SD뿐만 아니라 자극 지수 (SI, cpm_compound / cpm _nil로 정의) 및 매질 대조군에 대한 독립 표본 양측 t-검정(unpaired, two sided t-test) 시 유의성 수준(n.s.: 유의하지 않음; *: p< 0,05; **: p< 0,01; ***: p< 0,001)을 나타내었다.

표 2

표 3

이 표는 파상풍 톡소이드 자극된 PBMC 배양액에서의 사이토카인 생성에 미치는 항 CD 4 mAb BT061의 영향을 보여준다. 8개의 개별 마이크로 배양액의 평균 및 SD를 나타내었다.

표 4

이 표는 LPS-자극된 단핵구 배양액에서의 염증성 사이토카인 생성에 미치는 항 CD4 mAb BT061의 영향을 보여준다. 2개의 개별 마이크로 배양액의 평균 및 SD를 나타내었다.

표 2-4의 데이터는 다음 사항을 확인시켜 준다:

- 고용량의 BT061에서도 파상풍 톡소이드-유도 T 세포 증식의 용량 의존적인 억제 (리콜 반응)가 확인되었으며, 이는 BT061가 모든 면역 반응을 중단시키지는 않음을 보여준다. 사용된 용량은 이에 상당하는 60mg 이하의 고용량으로 환자에서 적용한다.

- Th1/Th2 밸런스에 영향을 미치지 않고, 사이토카인 분비가 전반적으로 저해됨 (IL-1, IL-4, IL-6, IL-10는 변화 없이, IFN-감마, IL-5 및 TNF-알파의 용량 의존적인 감소)

- TGF-베타 분비가 증가됨

실시예 3 - BT061 (항 CD4 mAb ) 유도된 ADCC (항체 의존적 세포 매개 세포독성)에 대한 유세포 분석

HuT 78 표적 세포를 BT061 (hB-F5)로 표지하고, 작동 세포로서 PBMC 세포로 인큐베이션 하였다. 30분간 인큐베이션 후 DNA 염료 프로피디움 아이오딘(propidium iodine)의 업테이크로 사멸한 세포가 분리될 수 있다. 그 결과는 표 5에 나타낸다.

표 5

상기 표의 데이터는 고농도에서도 BT061 (hB-F5)에 의한 ADCC 유도가 없었음을 확인시켜 준다.

실시예 4 - 아포토시스

BT061 (항 CD4 mAb ) 유도된 아포토시스에 대한 유세포 분석을 위해, 전혈 유래의 PBMC를 BT061 또는 양성 대조군으로 인큐베이션하였다.

7일간의 인큐베이션 후, 아넥신-V-플루오레세인으로 아포토시스 세포를 염색하여, 아포토시스 세포를 검출하였다. 결과를 표 6에 나타낸다.

표 6

상기 데이터는 BT061가 고농도인 경우에도 아포토시스가 유도되지 않았음을 보여준다.

실시예 5 - 보체 결합

보체 인자의 결합에 대한 유세포 분석을 위해, C1qPBMCs를 분리하고, BT061 (항 CD4 mAb )로 인큐베이션한 후, 정제된 재조합 C1q로 인큐베이션 하였다.

ATG (테셀락(Tecelac))을 양성 대조군으로 사용하였다.

C1q에 대한 FITC 표지된 검출 항체를 검출하였다. 결과는 하기 7에 나타낸다.

표 7

상기 데이터는 고농도에서도 보체 결합이 나타나지 않았음을 확인시켜 준다.

실시예 6 - BT061 의 상승 용량의 안전성 및 내성

18세 이상 내지 75세 이하의 건강한 남성 및 여성 지원자에서 상승 용량의 항체를 사용하여, BT061의 안정성 및 내성을 모니터하기 위하여 시험을 수행하였다.

30명의 지원자가 그룹당 3명의 지원자로 나누어 10개의 투여군으로 BT061을 정맥내 투여받아다. 또한 15명의 지원자가 그룹당 3명의 지원자로 나누어 5개의 투여군으로 BT061을 피하 투여 받았다. BT061의 정맥내 투여는 하기 표 8에 나타낸다:

표 8 - BT061의 정맥내 투여량

각 용량은 총 용적이 20 ml가 될 때까지 0.9% 염화나트륨 주사액으로 희석한다. 각 용량은 2시간에 걸쳐 1회 정맥내 연속 주입된다.

BT061 피하 투여는 하기 표 9에 나타낸다:

표 9 - BT061의 피하 투여량

각 용량은 1회 일시 주사(single bolus injection)로 주입된다.

주사 후 3개월에 걸쳐 지원자들을 평가하였다.

피하 적용의 경우, 투여 전, 투여 후 3, 6, 12, 24, 36, 48, 56, 72, 88, 96, 120, 144 및 168 시간 및 75일째 혈장 샘플을 취하였다.

정맥내 적용의 경우, 투여 전, 투여 후 30분, 1, 2, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144 및 168 시간에 혈장 샘플을 취하였다.

표준 ELISA 방법으로 사이토카인 수준을 정하여, 혈장 샘플을 분석하였다. 분석된 관련 사이토카인은 IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-2를 포함하였다.

표준 유세포 분석법으로 CD4+ 림프구의 수를 측정하여, 혈장 샘플을 분석하였다.

결과

정맥내 및 피하 투여량이 60 mg이 될 때까지 전반적으로 관용(tolerlated)된 것으로 확인되었다.

사이토카인 수준

사이토카인 분비의 유도는 ATG, OKT3, CAMPATH-1H 및 인간화 항-CD3 mAbs (TRX4, 바이실리주맵(Visilizumab) 및 테플리주맵(Teplizumab))과 같은 T 세포와 상호작용하는 치료 항체를 사용할 때 일반적으로 발생하는 즉각적인 합병증이다. 그 증상은 주로 미열, 두통 및 자기제어성 위장 증상(self-limiting gastrointestinal manifestation)을 포함한다. 항체 투여 후 사이토카인 유도와 관련된 부작용은 항히스타민제인 디펜하이드라민 하이드로클로라이드 및/또는 항염증제인 이부프로펜과 같은 추가 약물의 적용을 필요로 한다.

뮤린 CD3 특이적 치료 단클론 항체인 OKT3 (뮤로모나브-CD3)를 사용한 경우, 치사한 사례가 보고되었으며, 이러한 심각한 부작용은 상기 항체를 면역억제 환자에게 임상적으로 사용하는 것을 제한한다.

현재 자가면역 질환 치료용 임상에서 사용되고 있는 FcR-비 결합성 CD3-특이적 인간화 단클론 항체(테플리주맵 및 TRX4)는, OKT3와 같은 FcR-결합성 CD3-특이적 항체에 비하여, 1회 투여 후 T-세포 활성화 및/또는 Fc 수용체 발현 세포의 활성화에 의해 유도되는 부작용을 감소시키는 것으로 나타났지만, 약간의 T-세포 활성화 및 Fc 수용체 발현 세포의 활성화가 여전히 관찰되어, 사이토카인 의존적 부작용과 연관된 사이토카인 분비를 일으킨다.

본 연구에서는, BT061의 정맥내 또는 피하 적용 후 건강한 지원자들에서 관찰된 사이토카인 유도가, 항-CD3 항체에 비해 비교적 낮으며 일시적이라는 것을 놀랍게도 발견하였다. 사이토카인 유도는 일반적으로 고용량에서 증가한다. 그러나 40 내지 60 mg의 고용량에서도, 사이토카인 유도가 T 세포와 상호작용하는 다른 단클론 항체에 나타나는 것에 비하여 현저히 낮았다.(도 7A 및 B)

고용량 (40 mg 내지 60 mg의 BT061) 투여 후 96시간 이내에 임의의 시점에서 관찰되는 사이토카인에 대한 중간 피크 농도(median peak concentration)를 도 7 및 8에 나타낸다.

각 사이토카인에 대한 중간 피크 농도는 다음과 같이 산출된다: 항체 투여 후 관찰되는 최대 사이토카인 농도의 중간값.

도 7 A 및 B는 항-CD3 단클론 항체인 테플리주맵 및 TRX4 투여 후 분비되는 TNFα 및 IL-6 수준과 비교하여, BT061의 정맥내 또는 피하 투여 후 건강한 지원자에서 관찰되는 TNFα 및 IL-6 분비 수준을 보여준다. 상기 사이토카인의 정상치는 Straub et al., (2007, Arthr. & Rheumat.)에 기재된 수치를 사용하였다. 도 8은 BT061의 정맥내 또는 피하 투여 후, IL-2 및 IFN-γ의 혈장 수준을 보여준다. 중간 피크 수준은 항체 주입 후 4일 이내에 측정된 40 및 60 mg 투여군으로부터 산출하였다. 정상 최고치 (ULN)는 39명의 건강한 개체에서 측정된 사이토카인 수준을 기초로 산출하며, 그 식은 ULN = 평균값 + 2 x 표준 편차이다.

테플리주맵 및 TRX4와 비교하여 (결과는 각각 Herold et al., 2002, New Engl. J. Med, 및 Keymeulen et al., 2005 New Engl. J. Med에 기재된 것을 사용함), BT061은 단지 최저의 일시적인 사이토카인 분비만을 유도한다. TNF-α 및 IL-6 수준이 약간 증가하였다. 도 7은, BT061 (40 및 60 mg) 적용 후 혈장에서 검출되는 IL-6 및 TNFa 사이토카인 수준의 중간 피크값이 특이적 치료 항체인 테플리주맵 및 TRX4으로 치료 후 나타나는 값에 비해 낮다는 것을 보여준다.

또한 항-CD3 mAbs와는 대조적으로, BT061는 TRX4 적용 시 보고된 것과 같은 (Keymeulen et al., 2005), IFN-γ 및 IL-2의 실질적인 수준 증가를 일으키지 않았다 (도 8).

CD4+ 림프구

추가로, 상기 시험은 수집된 혈장 샘플 내 CD4-양성 림프구 수에 대한 연구를 포함하였다.

정맥내 투여 결과는 하기 표 9, 10 및 11에 나타낸다. 표 12은 피하 투여에 따른 시험 결과를 보여준다. 그 결과는 도 9 및 10에 그래프로 나타내었다.

표 9: 3.5 ㎍ 내지 2.5 mg의 BT061을 정맥내 투여 후, 건강한 지원자에서의 CD4+ 세포수

표 10: 2.5 mg 내지 20 mg의 BT061을 정맥내 투여 후, 건강한 지원자에서의 CD4+ 세포수

특히, 도 9는 BT061을 1회 정맥내 투여한 지원자에서의 CD4 세포수(혈장(ml)당 세포수)를 나타낸 것이다. 데이터 포인트는 각 투여군에서 3명의 환자의 평균값을 나타낸다. 점선은 정상 상한치 (ULN) 및 정상 하한치 (LLN)를 가리킨다. ULN 및 LLN (평균값 + (또는 -) 표준 편차)은, ㎕당 CD4 세포수 443 (정상 하한치; LLN) 및 ㎕당 CD4 세포수 1324 (정상 상한치; ULN)인 건강한 지원자의 세포수를 기초로, 산출하였다.

도 10은 BT061를 1회 피하 투여한 지원자에서의 CD4 세포수(혈장(ml)당 세포수)를 나타낸 것이다. 도 9에서와 같이, 데이터 포인트는 각 투여군에서 3명의 환자의 평균값을 나타낸다. 점선은 정상 상한치 (ULN) 및 정상 하한치 (LLN)를 가리킨다.

표 11: 20 mg 내지 60 mg의 BT061을 정맥내 투여 후, 건강한 지원자에서의 CD4+ 세포수

표 12: BT061을 피하 적용 후, 건강한 지원자에서의 CD4+ 세포수

당해 분야에 공지된 다수의 CD4 특이적 단클론 항체 (Strand et al., 2007에서 리뷰됨)는 CD4-양성 림프구를 제거하여 면역 억제를 달성한다. 이들 항체의 단점은 치료받은 개체가 면역약화(immuno-compromised)되고, 다른 감염에 취약해진다는 것이다.

이와는 대조적으로 본 발명의 연구는, BT061가 CD4-양성 세포의 대량의 장기간 지속적인 제거를 유도하지 않음을 보여주었다. 그러나 항체 투여 후 72시간 이내에 말초 혈액에서 정상치로 회복하면서 CD4-양성 림프구의 일시적인 감소가 관찰되었다.

BT061 적용 후 72 h째, 정맥내 투여군의 4명의 지원자에서의 CD4 세포수가 다음과 같이 정상치보다 낮은 CD4 수준인 것으로 나타났다: 100 ㎍ 정맥내 투여군에서 1명의 지원자: ㎕당 CD4 세포수 400; 5 mg 투여군에서 1명의 지원자: ㎕당 CD4 세포수 419; 10 mg 투여군에서 1명의 지원자: ㎕당 CD4 세포수 440; 및 20 mg 투여군에서 1명의 지원자: ㎕당 CD4 세포수 392.

그러나 상기 값은 정상치보다 약간 낮은 정도이다. BT061 투여 후 72 시간째 정맥내 투여군의 남아있는 26명의 지원자에서의 CD4 세포수는 정상치 범위 내였다.

피하 투여군의 경우, 72 h 후, 단지 15명의 지원자 중 한명만이 정상치보다 낮은 CD4 세포수를 보였다.

결론적으로, BT061는 CD4 특이적 mAbs를 제거하지 않고, 고용량에서도 단지 CD4-양성 세포의 일시적인 감소를 유도한 후, 일반적으로 회복시킨다. 일시적인 감소와 정상치로의 일반적인 회복으로부터, CD4-양성 세포의 제거보다는 일시적인 재분포가 일어난다.

실시예 7 - 중등증 내지 중증 만성 건성 환자에서 BT061 의 임상 시험

hB-F5 BT061의 자가면역 질환을 치료 능력을 중등증 내지 중증 만성 건선 환자 56명을 대상으로 시험하였다. 본 시험은 hB-F5의 안전성 및 효능을 평가하기 위한 1회 용량 증가 시험(single dose escalation study)을 포함한다.

시험 조건은 다음과 같다:

56명의 환자를 8명씩 7개의 투여군으로 나눈다. 5개의 투여군 (투여군 I 내지 V)은 정맥내 투여로 항체 또는 위약을 투여받고, 2개의 투여군 (투여군 VI 및 VII)은 피하 투여로 항체 또는 위약을 투여받는다. 각 투여군 중 2명의 환자가 위약을 투여받고, 각 투여군의 나머지 6명의 환자가 BT061을 투여받는다. 투여군 I에서 6명의 환자가 0.5 mg의 BT061을 정맥내 투여받는다. 투여군 II 내지 V에서, 6명의 환자가 각각 2.5 mg, 5 mg, 10 mg, 또는 20 mg의 BT061를 투여받는다. 투여군 VI 및 VII에서, 6명의 환자가 각각 12.5 mg 또는 25 mg의 BT061를 피하 투여받는다.

정맥내 투여의 경우, 항체/위약은 의약적으로 허용되는 방법으로 아래팔 정맥에 주입된다. 이 경우, 총 용적이 주입 조절기(perfusor)를 통해 2시간에 걸쳐 1회 정맥내 연속 주입된다 (Fresenius Pilot C, Fresenius AG, Germany). 항체의 각 용량은 총 용적이 20 ml이 될 때까지 0.9% 염화나트륨 주사액으로 희석한다 (B. Braun Melsungen AG, Germany).

피하 투여의 경우, 항체는 1회 피하 주사로 투여된다. 위약에 대해서도 동일한 과정이 적용된다.

각 환자에서 나타나는 건선 정도는 건선 부위 및 중증도 지수 (PASI) 스코어를 사용하여 기록된다. 전술한 바와 같이, PASI 스코어가 높을수록 건선 정도가 높은 것이다. 시험에 참가한 환자들은 중등증 내지 중증 만선 건선을 가진, 즉, PASI 스코어가 10 이상인 환자들이다.

시험 전에 환자의 PASI 스코어를 평가하여, 0일째 "기준치"를 제공하고, 시험 5, 7, 14, 21, 28, 42, 56 및 75일째에 반복적으로 스코어를 평가한다 .

투여군 I

투여군 I 중 6명의 환자는 0.5 mg의 BT061를 정맥내 1회 투여받았으나, 투여군 I 중 2명의 환자는 위약을 투여받았다. 각 환자에 대한 체중당 투여량 및 체표면적당 투여량 (BSA)을 표 13에 나타낸다. 본 명세서에 기재된 모스텔러 공식에 따라 체표면적을 계산하였다.

투여군 I 환자에 대한 PASI 스코어는 기준치로부터 PASI 스코어의 개선율과 함께 표 13에 나타낸다.

투여군 II

투여군 II 중 6명의 환자는 2.5mg의 BT061를 정맥내 1회 주사받았으나, 투여군 II 중 2명의 환자는 위약을 주사받았다. 각 환자에 대한 체중당 투여량 및 체표면적당 투여량 (BSA)을 표 14에 나타낸다.

투여군 II 환자에 대한 PASI 스코어는 기준치로부터 PASI 스코어의 개선율과 함께 표 14에 나타낸다.

투여군 III

투여군 III 중 6명의 환자는 5.0 mg의 BT061를 정맥내 1회 주사받았으나, 투여군 III 중 2명의 환자는 위약을 주사받았다. 각 환자에 대한 체중당 투여량 및 체표면적당 투여량 (BSA)을 표 14B에 나타낸다.

투여군 III 환자에 대한 PASI 스코어는 기준치로부터 PASI 스코어의 개선율과 함께 표 14B에 나타낸다.

투여군 IV

투여군 IV 중 6명의 환자는 10.0 mg의 BT061를 정맥내 1회 주사받았으나, 투여군 IV 중 2명의 환자는 위약을 주사받았다. 각 환자에 대한 체중당 투여량 및 체표면적당 투여량 (BSA)을 표 14C에 나타낸다.

투여군 IV 환자에 대한 PASI 스코어는 기준치로부터 PASI 스코어의 개선율과 함께 표 14C에 나타낸다.

표 13 - 시험 과정 중 투여군 I (0.5mg 정맥내 투여)의 환자에 대한 PASI 스코어

표 14A - 시험 과정 중 투여군 II (2.5mg 정맥내 투여)의 환자에 대한 PASI 스코어

표 14B - 시험 과정 중 투여군 III (5.0 mg 정맥내 투여)의 환자에 대한 PASI 스코어

표 14C - 시험 과정 중 투여군 IV (10.0 mg 정맥내 투여)의 환자에 대한 PASI 스코어

또한, 개별 환자에서 시간에 따른 PASI 스코어를 그래프 형태로 도 11A 내지 11H 및 도 12A 내지 12H에 나타내었다. 도 11A 내지 11H의 그래프는 투여군 I 환자에 대한 PASI 스코어를 나타내는 반면, 도 12A 내지 12H의 그래프는 투여군 II 환자에 대한 PASI 스코어를 나타낸다.

표 13 및 14에 나타난 결과로부터 알 수 있듯이, 투여군 I 및 투여군 II의 환자의 75%에서 PASI 스코어가 명백히 개선, 즉, 1회 투여 후 기준치에 비해 적어도 40% 개선된 것으로 나타났다. 투여군 I 및 투여군 II의 환자의 25%가 위약을 투여받았다는 점에 주목해야 한다.

실제로 양 투여군의 환자의 50%에서 PASI 스코어가 적어도 50% 개선된 것으로 나타났으며, 투여군 II 중 한명의 환자는 56일째 PASI 스코어가 88% 개선된 것으로 나타났다 (즉, 표 14의 환자 3). 또한 투여 후 75일째인 시험의 종반부에서도 다수의 환자에서 여전히 개선 효과가 나타나, 이러한 저용량에서 치료 효과가 장기간 지속된다.

투여군 III의 환자들에서도 PASI 스코어가 개선된 것으로 나타났는데, 치료 후 8명 환자 중 6명의 개선율이 20%를 초과하고, 이들 6명 중 2명이 30%를 초과하는 개선 효과를 보였다. 그러나 개선 효과가 저용량의 항체를 투여받은 투여군 I 및 투여군 II의 환자에서 나타난 것만큼 유의하지는 않았다. 투여군 IV의 환자에서도 약간의 효과가 나타났다. 투여군 I 내지 III의 환자와 비교하여 제한되기는 하지만, 특히 이 투여군의 환자 1, 4, 5 및 8 (표 14C에 나타냄)에서 PASI 스코어가 명백히 개선된 것으로 나타났다.

PASI 스코어가 적어도 40%, 50%, 60% 및 75% 개선된 것으로 나타난 환자수를 표 15에 나타내었다.

표 15 - 투여군 I 내지 III의 결과 요약

투여군마다 *: 환자의 75%가 BT061를 투여받고, 환자의 25%가 위약을 투여 받음.

도 13 A 및 13 B는 치료 전 후의 건선 수준의 개선을 보여주는 사진 증거를 제공한다. 도 13 A는 투여 전 투여군 II 환자의 피부 상의 건선 부위를 보여준다. 도 13 B는 투여 후 28일째 동일한 건선 부위를 나타낸 것이다. 개선된 부위는 도 13 B에 검은 박스 안에 표시하였다.

이러한 결과로부터, BT061가 중등증 및 중증 만선 건선에 효과적인 치료를 제공한다는 것을 명백히 확인할 수 있다.

본 연구 결과는 상기 실시예 6에 기재된 결과와 함께, 본 발명에 따른 고용량의 항체가 인간에서 전반적으로 관용(tolerlated)되었음을 보여주며, 이로부터 본 발명의 약제학적 조성물이 본 명세서에 기재된 용량으로 자가면역 질환에 유효한 치료 효과를 제공한다는 것이 확인되었다.

실시예 8 - 류마티스성 관절염 환자에서 BT061 의 임상 시험

BT061의 류마티스성 관절염에 대한 치료 능력을 이 질환을 앓고 있는 환자에서 시험하였다. 본 시험은 12 그룹으로 나누어 96명의 환자를 대상으로 한 반복 투여 시험을 포함한다. 각 그룹에서 2명의 환자가 위약을 투여받았고, 6명의 환자가 BT061을 투여받았다. 환자들은 6주간에 걸쳐 매주 1회 투여받았다.

환자는 항체를 피하 투여받는 그룹과 정맥내 투여받는 그룹으로 나뉜다. 피하 투여군은 1.25 mg, 6.25 mg, 12.5 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg 및 100 mg을 투여받는다. 정맥내 투여군은 0.5 mg, 2 mg, 6.25 mg, 12.5 mg 및 25 mg을 투여받는다.

1.25 mg 피하 투여군에서, 환자는 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107 및 108로 번호를 매긴다. 6.25 mg 피하 투여군에서는, 환자는 201-208으로 번호를 매긴다. 12.5 mg 피하 투여군에서 환자는 301-308로 번호를 매긴다. 25 mg 피하 투여군에서 환자는 401-408로 번호를 매긴다. 50 mg 피하 투여군에서 환자는 501-508로 번호를 매긴다. 6.25 mg 정맥내 투여군에서 환자는 601-608로 번호를 매긴다.

정맥내 및 피하 투여 과정은 건선 시험에 대해 실시예 7에서 기재한 것과 동일하였다.

류마티스성 관절염의 정도는 매주 ACR 파라미터를 평가하여 기록하고, 특히 압통 및 부종 관절수, 이후에 C-반응성 단백질 (CRP) 수준 및 적혈구 침강 속도 (ESR)를 조사하여 기록한다. 시험 전에 상기 파라미터를 평가하여, 0일째 "기준치"를 제공하고, 시험 기간 중 및 투여 기간이 종결된 후 8, 22 및 43 일째(즉, 추적 조사 (follow up: FU) 8일, FU 22일 및 FU 43일)에 반복적으로 파라미터를 평가한다.

하기 표는 시험으로부터 얻은 데이터를 제공한다. 특히 표 16 내지 21은 시험 과정 중에 압통 및 부종 관절수를 제공한다.

표 16 - 1.25 mg 피하 투여군에서 압통 및 부종 관절수

표 17 - 6.25 mg 피하 투여군에서 압통 및 부종 관절수

표 18 - 12.5 mg 피하 투여군에서 압통 및 부종 관절수

표 19 - 25 mg 피하 투여군에서 압통 및 부종 관절수

표 20 - 50 mg 피하 투여군에서 압통 및 부종 관절수

표 21 - 6.25 mg 정맥내 투여군에서 압통 및 부종 관절수

도 14는 시험 과정에서 관련 ACR 파라미터의 적어도 20% 개선을 달성한 BT061 1.25 mg, 6.25 mg, 12.5 mg 및 25 mg 피하 투여군의 환자 비율 및 7주째 적어도 ACR20 반응을 이루어낸 환자 비율을 보여준다.

특히, 25 mg 피하 투여군 중 50%의 환자 (즉, 2명의 환자가 위약을 투여받은 경우 8명 중 4명의 환자)에서 6주째에 관련 ACR 파라미터가 적어도 20% 개선된 것으로 볼 수 있다. 7주째에는 8명의 환자 중 5명으로 증가하였는데, 즉, 8명 중 5명의 환자가 적어도 ACR20을 달성하였다. 이 투여군의 한명의 환자는 5주 및 6주째에 관련 ACR 파라미터의 개선율이 50%를 초과하였다 (전체 데이터는 나타내지 않음).

다른 투여군 환자에서도 긍정적인 결과가 얻어졌다. 6.25 mg 피하 투여군 중 한명의 환자는 4주째에 관련 ACR 파라미터의 개선율이 50% 이상이었지만, 다른 환자는 3주째에 ACR 파라미터의 개선율이 70% 이상이었다 (전체 데이터는 나타내지 않음).

도 15 A 및 15 B는 6주간에 걸쳐 25 mg 피하 BT061 투여군 환자에서 나타난 압통 및 부종 관절수의 결과를 나타낸 것이다. 일부 환자에서 치료 기간 중에 압통 및 부종 관절수가 감소된 것으로 나타났다. 이 투여군으로부터 한명의 반응 환자와 한명의 비반응 환자에 대한 결과를 각각 도 16A 및 16B에 나타냈다. 반응 환자는 압통 및 부종 관절수 및 통증 수준에서 유의성 있는 개선 효과를 보였다.

또한 압통 및 부종 관절수의 감소가 다른 투여군의 환자에서 나타났다. 도 17A, 17B, 18A 및 18B는 시험 기간 중 및 그 이후의 수주간 각각 1.25 mg 피하, 6.25 mg 피하, 50 mg 피하 및 6.25 mg 정맥내 투여군에서의 압통 및 부종 관절수를 나타낸 것이다.

상기 결과는 전술한 용량 범위 내에서 류마티스성 관절염의 치료에 대한 본 발명의 약물의 효능을 확인시켜 준다.

SEQUENCE LISTING <110> Biotest AG <120> Agent for Treating Disease <130> 313680.WO/JND/CJS <160> 18 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of H chain of humanized antibody hB-F5H37L <400> 1 Glu Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp Cys 20 25 30 Arg Met Tyr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Val Lys Ser Glu Asn Tyr Gly Ala Asn Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Ala Ser Tyr Tyr Arg Tyr Asp Val Gly Ala Trp Phe Ala 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of K chain of humanized antibody hB-F5L4M <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 3 <211> 550 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Part of plasmid encoding V domain of H chain of humanized antibody hB-F5 <400> 3 gaggagctcc agacaatgtc tgtctccttc ctcatcttcc tgcccgtgct gggcctccca 60 tggggtcagt gtcagggaga tgccgtattc acagcagcat tcacagactg aggggtgttt 120 cactttgctg tttccttttg tctccaggtg tcctgtcaga ggaacagctt gtggagtctg 180 ggggaggctt ggtgaaaccc ggaggttctc tgaggctctc ctgtgcagcc tcgggtttca 240 gtttcagtga ctgccggatg tactgggttc gccaggctcc agggaagggg ctggagtgga 300 ttggtgtgat ttcagtcaaa tctgagaatt 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<211> 372 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 caggaatacc ttgtggagac cgggggaggc ttggtgaggc ctggaaattc tctgaaactc 60 tcctgtgtca cctcgggttt cagtttcagt gactgccgga tgtactggct tcgccagcct 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggtgtg atttcagtca aatctgagaa ttatggagca 180 aattatgcag agtctgtgag gggcagattc actatttcaa gagatgattc aaaaagcagt 240 gtctatctgc agatgagcag attgagagag gaagacactg ccacttatta ttgtagtgcc 300 tcctattata ggtacgacgt gggggcctgg tttgcttact ggggccaagg gactctggtc 360 actgtctctg ca 372 <210> 6 <211> 383 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 gacattgtgc tgacacagtc tccttcttcc ttagttgtat ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct acagttatat atattggtac 120 caacagatcc caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccat cctagaatct 180 ggggtccctg gcaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga acttccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggagatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 360 atcttcccac catccagtga gca 383 <210> 7 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gln Glu Tyr Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp Cys 20 25 30 Arg Met Tyr Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Val Lys Ser Glu Asn Tyr Gly Ala Asn Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Ser Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Ala Ser Tyr Tyr Arg Tyr Asp Val Gly Ala Trp Phe Ala 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Val Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Gly 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 20 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 11 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 14 <211> 14 <212> 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Tyr Tyr Arg Tyr Asp Val Gly Ala Trp Phe Ala 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of K chain of humanized antibody hB-F5L4L <400> 18 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

Claims

약제학적으로 허용되는 담체 및 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 약물을 포함하는, 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물로서,
상기 조성물은 10 mg 내지 200 mg의 약물 용량으로 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약물은 15 mg 내지 80 mg의 용량으로 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 약물은 20 mg 내지 60 mg의 용량으로 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용되는 담체 및 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 약물을 포함하는, 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물로서,
상기 조성물은 개체의 체표면적당 5 내지 60 mg/m²의 약물 용량으로 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제4항에 있어서,
상기 조성물은 6 내지 50 mg/m²의 약물 용량으로 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 조성물은 8 내지 40 mg/m²의 약물 용량으로 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용되는 담체 및 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 약물을 포함하는, 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물로서,
상기 조성물은 0.1 내지 2 mg/kg의 약물 용량으로 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 조성물은 0.15 내지 1.5 mg/kg의 약물 용량으로 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 0.2 내지 1 mg/kg의 약물 용량으로 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 자가면역 질환은 건선, 류마티스성 관절염, 다발성경화증, 1형 당뇨병, 염증성 장질환, 크론병, 자가면역 갑상선염, 자가면역 중증근무력증, 전신홍반루푸스 및 이식편 대 숙주(graft-versus-host) 또는 일반적인 기관 내성 문제(general organ tolerance issue)와 같은 이식 관련 질환으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제10항에 있어서,
상기 질환은 건선인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제11항에 있어서,
상기 조성물은 환자의 건선 부위 및 중증도 지수 (Psoriasis Area and Severity Index: PASI) 스코어를 40% 이상 개선하여, 건선을 치료할 수 있는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제12항에 있어서,
상기 조성물은 환자의 건선 부위 및 중증도 지수 (Psoriasis Area and Severity Index: PASI) 스코어를 50% 이상 개선하여, 건선을 치료할 수 있는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제10항에 있어서,
상기 질환은 류마티스성 관절염인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 비경구 투여용인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제15항에 있어서,
상기 조성물은 근육내 투여, 정맥내 투여 또는 피하 투여용인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제16항에 있어서,
상기 조성물은 정맥내 투여용이며, 0.5 내지 500 ml의 투여 용적(dosage volume)으로 또는 0.5 내지 500 ml의 투여 용적에 대한 희석 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제17항에 있어서,
상기 투여 용적은 15 내지 25 ml인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제16항에 있어서,
상기 조성물은 피하 투여용이며, 0.1 내지 3 ml의 투여 용적으로 제공되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제19항에 있어서,
상기 투여 용적은 0.5 내지 1.5ml인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제16항에 있어서,
상기 조성물은 근육내 투여용이며, 0.1 내지 3 ml의 투여 용적으로 제공되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제21항에 있어서,
상기 투여 용적은 0.5 내지 1.5 ml인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
1회 투여로서 또는 복수회 투여의 일부로서 사용되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제21항에 있어서,
상기 조성물은 복수회 투여의 일부로서 사용되며, 각 용량이 매일, 격일마다, 매주, 2주마다, 4주마다, 8주마다, 12주마다, 24주마다, 48주마다, 6개월마다 또는 매년 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제24항에 있어서,
상기 자가면역 질환은 건선이고, 상기 용량이 2주마다 1회 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제24항에 있어서,
상기 자가면역 질환은 건선이고, 상기 용량이 4주마다 1회 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제24항에 있어서,
상기 자가면역 질환은 류마티스성 관절염이고, 상기 용량이 2주마다 1회 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제24항에 있어서,
상기 자가면역 질환은 류마티스성 관절염이고, 상기 용량이 4주마다 1회 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용되는 담체 및 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 약물을 포함하는 약제학적 조성물로서,
상기 약물은 10 내지 150 mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제29항에 있어서,
상기 약물은 15 내지 75 mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제30항에 있어서,
상기 약물은 20 내지 60 mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물의 용적은 0.5 내지 500 ml인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제32항에 있어서,
상기 조성물의 용적은 15 내지 25 ml인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물의 용적은 0.5 내지 3 ml인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제34항에 있어서,
상기 조성물의 용적은 1 내지 1.5 ml인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
투여 개시 후 10분 내지 투여 종결 후 96시간의 기간 이내에, 개체의 혈장 내 사이토카인 농도가 투여 직전의 사이토카인 농도보다 20배 미만으로 증가하고, 상기 사이토카인은 IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-2로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
투여 개시 후 10분 내지 투여 종결 후 96시간의 기간 이내에, 개체의 혈장 내 사이토카인 농도가 정상 상한치 (ULN)보다 20배 미만으로 증가하고, 상기 사이토카인은 IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-2로부터 선택되며, 상기 ULN 값은 각각 3.8, 2.8, 4.4, 및 19.4 pg/ml인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
투여 후 72시간 내지 96시간 이내에 개체의 혈장 내 CD4+ 림프구의 세포수가 200 세포/㎕ 이상인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제38항에 있어서,
상기 세포수가 250 세포/㎕ 이상인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제38항 또는 제39항에 있어서,
상기 약물은 피하 투여되고, 약물의 용량이 39.5 mg 이하인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약물은 피하 투여되고, 약물 용량이 39.5 mg 이하이며, 투여 후 0 내지 72시간의 기간 동안 개체의 혈장 내 CD4+ 림프구의 세포수가 300 세포/㎕ 이상인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
투여 후 72시간 내지 30일의 기간 동안 개체의 혈장 내 CD4+ 림프구의 세포수가 300 세포/㎕ 이상인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약물은 인간화 단클론 항체 또는 그의 단편 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제43항에 있어서,
상기 약물은 항-CD4 항체 또는 그의 단편 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약물은 하기 폴리펩티드 서열로 정의되는 V 도메인 또는 서열 번호 1 및 서열 번호 2와 80% 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 V 도메인을 가지는, 인간화 항-CD4 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물:
- H 쇄 V 도메인:
EEQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDCRMYWLRQAPGKGLEWIGVISVKSENYGANYAESVRGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCSASYYRYDVGAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호 1)
- L 쇄 V 도메인:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIYWYQQKPGQPPKLLIYLASILESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPWTFGQGTKVEIK (서열 번호 2).
제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약물은 마우스 단클론 항-CD4 항체 B-F5로부터 유래된 인간화 항-CD4 항체인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
약제학적 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환의 치료 방법으로서,
상기 조성물은 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 약물을 포함하고, 상기 약물은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 용량으로 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제47항에 있어서,
상기 자가면역 질환은 제10항, 제11항 또는 제14항 중 어느 한 항에 정의된 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제47항 또는 제48항에 있어서,
상기 약물은 마우스 단클론 항-CD4 항체 B-F5로부터 유래된 인간화 항-CD4 항체 또는 그의 단편 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제47항 또는 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약물은 하기 폴리펩티드 서열로 정의되는 V 도메인 또는 서열 번호 1 및 서열 번호 2와 80% 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 V 도메인을 가지는, 인간화 항-CD4 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 치료 방법:
- H 쇄 V 도메인:
EEQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDCRMYWLRQAPGKGLEWIGVISVKSENYGANYAESVRGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCSASYYRYDVGAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호 1)
- L 쇄 V 도메인:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIYWYQQKPGQPPKLLIYLASILESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPWTFGQGTKVEIK (서열 번호 2).
제24항에 있어서,
상기 자가면역 질환은 건선이고 상기 용량이 매주 1회 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제24항에 있어서,
상기 자가면역 질환은 류마티스성 관절염이고, 상기 용량이 매주 1회 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
투여 후 3시간 내지 6시간 이내에 개체의 혈장 내 CD4+ 림프구의 세포수가 250 세포/㎕ 미만인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
투여 후 72시간 내지 96시간 이내에 개체의 혈장 내 CD4+ 림프구의 세포수가 투여 직전 개체의 세포수의 50%와 동일하거나 더 많은 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 조성물의 1회 용량 투여 후 56일째에 개선이 나타나는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 조성물의 1회 용량 투여 후 75일째에 개선이 나타나는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.