PT2171060E - Anticorpo anti-cd28 superagonista - Google Patents

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PT2171060E
PT2171060E PT58026501T PT05802650T PT2171060E PT 2171060 E PT2171060 E PT 2171060E PT 58026501 T PT58026501 T PT 58026501T PT 05802650 T PT05802650 T PT 05802650T PT 2171060 E PT2171060 E PT 2171060E
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Martin Trischler
Christine Guntermann
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Theramab Llc
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Description

DESCRIÇÃO "ANTICORPOS ANTI-CD28 SUPERAGONISTAS" A invenção refere-se a um ácido nucleico, codificador de uma molécula de ligação, que liga especificamente uma molécula CD28 humana, compreendendo (a) uma sequência de ácidos nucleicos codificadora de uma região VH e uma sequência de ácidos nucleicos codificadora de uma região VL compreendendo CDR numa estrutura de imunoglobulina humana e (b) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma região constante de um anticorpo IgGl ou IgG4 humano. A estimulação de linfócitos T inactivos para a activação, proliferação e diferenciação funcional requer a ocupação de duas estruturas de superfície, os assim designados receptores: 1. o receptor de antigénio que possui uma especificidade diferente de célula para célula e que é necessário para o reconhecimento de antigénios, p. ex. produtos de cisão virais; bem como 2. a molécula CD28 expressa de modo semelhante em todas as células T inactivas, com excepção de um subgrupo das células T CD8 do homem, que se liga naturalmente a ligandos sobre a superfície de outras células do sistema imunitário. Fala-se da coestimulação da reacção imunitária específica de antigénios através de CD28. Estes processos podem ser reconstruídos em cultura de células por ocupação do receptor de antigénio, bem como da molécula CD28, com anticorpos monoclonais adequados (mAb). No sistema clássico da coestimulação nem a ocupação do receptor de antigénio, nem a da molécula CD28 isoladamente conduz à proliferação de células T, no entanto a ocupação de ambos os 1 receptores é eficaz. Esta observação foi feita em células T de homem, murganho e rato.
No entanto também são conhecidos anticorpos monoclonais especificos de CD28 (mAb) que podem induzir a proliferação de células T sem coestimulação. Uma activação superagonista deste tipo, quer dizer, independente da ocupação do receptor de antigénio, de linfócitos T inactivos através de mAk especificos de CD2 8 é conhecida por exemplo de Tacke et al., Eur. J. Immunol., 1997, 27: 239 - 247. De acordo com isso foram descritos dois tipos de anticorpos monoclonais especificos de CD28 com diferentes propriedades funcionais: mAb coestimuladores que coestimulam a activação de células T inactivas apenas no caso de ocupação simultânea do receptor de antigénio, e mAb superagonistas que, sem ocupação do receptor de antigénio, podem activar para a proliferação linfócitos T de todas as classes, in vitro e em ratos. A partir do documento DE 10160516.1, bem como a partir de Liihder et al., J. Exp. Med., 2003, 197: 955 - 966, são além disso conhecidos mAk superagonistas com especificidade para a molécula CD28 de homem, que activam e expandem muito eficientemente células T in vitro, sem estimulação do receptor de antigénio de células T (TCR). Aqui, no entanto, empregam-se anticorpos imobilizados que, como mais abaixo se apresenta, não se adequam para a aplicação terapêutica.
Além disso, os anticorpos anti-CD28 superagonistas, anticorpos em modelos animais e em cultura de células, mostraram propriedades anti-inflamatórias pronunciadas. Assim, como demonstrado em Schmidt et al., J. Neuroimmunol., 2003, 140: 143 - 152, a aplicação de um mAk supergonista contra a molécula CD28 2 de rato pode, por exemplo, inibir o desenvolvimento de uma doença inflamatória dos nervos periféricos, a neurite autoimune experimental, ΕΑΝ. A partir do documento DE 10212108.7, bem como a partir de Lin et al.r Eur. J. Immunol., 2003, 33: 626 - 638, é conhecido que anticorpos anti-CD28 superagonistas podem provocar uma forte activação sobre-proporcional de células T reguladoras. A função de células T reguladoras é de controlar células T autoagressivas e, com isso, assegurar a que geralmente não se chegue a qualquer reacção inflamatória excessiva (Schwartz, Nature Immunol., 2005, 6: 327 - 330) . No entanto, uma intervenção na coestimulação mediada por CD28 pode alterar o equilíbrio de Thl/Th2 a favor do fenótipo Thl pro-inflamatório e envolve por conseguinte o perigo de exacerbar reacções autoimunes / inflamatórias (ver Schmidt et al., supra).
Para os candidatos a anticorpos terapêuticos é desejável, por razões óbvias, evitar a imunogenicidade, quer dizer, o desencadear de uma resposta imunitária contra a substância activa, com o objectivo de explorar por completo a eficácia farmacológica em humanos e simultaneamente reduzir efeitos secundários indesejados. Para evitar a imunogenicidade de anticorpos que não provêm de homem, a "humanização" de anticorpos por meio de métodos de tecnologia genética é, por exemplo, estado da técnica. Neste caso é conservado o local de ligação ao antigénio de um anticorpo que originalmente não provém de homem, enquanto o resto da molécula do anticorpo, em particular as partes constantes dos anticorpos (domínio constante ou fragmento Fc) , é trocado por uma variante estruturalmente análoga de um genótipo humano (Hwang et ai., Methods, 2005, 36: 3 - 10) . 3
Como é conhecido a partir do documento DE 10230223.5, a reticulação transversal (ou reticulação cruzada, "cross- linking") reforça a capacidade de anticorpos CD28 anti-humano superagonistas activarem linfócitos T numa suspensão de células. Por exemplo, a proliferação de linfócitos T purificados é reforçada em quatro vezes quando são utilizados anticorpos superagonistas na forma de complexos de moléculas imobilizadas sobre esferas paramagnéticas, em vez de estarem presentes na forma solúvel na suspensão de células T. Para a utilização galénica em humanos, não é, no entanto, possivel a aplicação de formas de administração complexadas deste modo de anticorpos anti-CD28 superagonistas, por razões óbvias. Além disso, no documento DE 10230223.5, chegaram à utilização anticorpos IgG anti-murganho imobilizados sobre esferas paramagnéticas como agente na forma de reticulação cruzada. Também a este respeito não se considera a preparação análoga para uma utilização terapêutica em humanos, uma vez que é proibida a utilização de anticorpos IgG anti-humano devido à amplitude das reacções cruzadas esperadas. Por último, a preparação descrita no documento DE 10230223.5 está limitada a um processo in vitro, em que chegam à utilização células T purificadas. Para o desenvolvimento de anticorpos anti-CD28 superagonistas terapêuticos estava, por conseguinte, por provar se existe um formato de anticorpo adequado que possibilite uma reticulação cruzada suficiente in vivo, sem alcançar efeitos indesejados. É conhecido que um reconhecimento natural e a reticulação transversal ou cruzada de dominios Fc de anticorpos no corpo humano é mediada por receptores Fc, que são distintos em diferentes tipos de células (Woof et al., Nature Reviews
Immunol., 2004, 1 - 11). No contexto fisiológico, o objectivo da ligação ao anticorpo mediada pelo receptor Fc é "retirar da 4 circulação" ou destruir células carregadas de anticorpo, uma vez que é presumível que apenas sejam formados anticorpos contra as células, que provêm de tecidos estranhos, que estão infectadas com bactérias ou virus, que são stressadas ou degeneradas malignas. Os mecanismos importantes mediados pelo receptor Fc da eliminação de células carregadas de anticorpos são a citotoxicidade dependente da complementaridade (CDC), a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e a opsonização, quer dizer, identificação da fagocitose através de fagócitos especializados.
Os receptores Fc, que são responsáveis pelo reconhecimento de dominios Fc de anticorpos humanos do isotipo IgG, podem classificar-se nos grupos CD64 (receptor Fc gama I; receptor de afinidade alta); CD32 (receptor Fc gama II; receptor de afinidade intermédia) e CD16 (receptor Fc gama III; receptor de afinidade baixa). As suas propriedades de ligação a anticorpos dos subgrupos IgG, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, bem como as funções efectoras desencadeadas através da ligação a estes anticorpos são amplamente conhecidas (Woof et al., Nature Reviews Immunol., 2004, 1 - 11) . Assim, a estimulação de receptoresFc, que se ligam a IgGl ou IgG4 (CD64 fortemente a IgGl, moderadamente a IgG4, fracamente a IgGl, não a IgG4; CD16b fortemente a IgGl, muito fracamente ou não a IgG4), provoca em regra também uma eliminação das células alvo através de ADCC ou CDC.
Em resumo, com isto é conhecido do estado da técnica que a reticulação transversal, quando é provocada por moléculas presentes no corpo humano, está predominantemente associada com uma eliminação das células carregadas de anticorpos. 5 0 documento DE 10230223 AI revela a preparação de um anticorpo monoclonal específico de CD28, hulgG-5.11, que é um mAb completamente humanizado do isotipo IgG4 e deriva de um mAb de DSM ACC2530. As sequências deste anticorpo não foram divulgadas.
Os documentos WO 03/078468A e WO 03/048194A divulgam a região VH e a região HL de um mAb humanizado que deriva de um mAb de DSM ACC2530.
Consequentemente persiste a tarefa, no caso do desenvolvimento de anticorpos anti-CD28 superagonistas terapêuticos, de encontrar um formato de anticorpo que se deixe, por um lado, reticular transversalmente no corpo por estruturas ou moléculas fisiologicamente presentes, por exemplo receptores Fc. Por outro lado, uma reticulação transversal deste tipo não deve, no entanto, conduzir a uma eliminação ou destruição (no essencial) da estrutura alvo própria do anticorpo, nomeadamente das células T CD28+. Esta tarefa é solucionada através das formas de realização disponibilizadas nas reivindicações.
De acordo com isto, a invenção refere-se a um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1. A expressão "ácido nucleico", no contexto da presente invenção, refere-se a uma molécula de ácido nucleico ou várias moléculas de ácido nucleico que na sua totalidade codificam para a molécula de ligação de acordo com a invenção. As regiões codificadoras para os componentes da molécula de ligação de acordo com a invenção podem com isso ser compreendidas por uma molécula de ácidos nucleicos ou encontrar-se em duas ou mais do que duas moléculas distintas de ácidos nucleicos. Em particular, 6 as áreas codificadoras paraa região VH e a região constante da cadeia pesada do IgGl ou IgG4 humano podem encontrar-se numa molécula de ácido nucleico e a região VL e a região constante da cadeia leve de IgGl ou IgG4 numa segunda molécula de ácido nucleico. A região constante da cadeia leve tanto pode corresponder à sequência de um gene IC como também de um gene λ que codificam para as regiões constantes de cadeias leves humanas. No que respeita à invenção, na molécula de ligação, que é codificada pelo(s) ácido(s) nucleico(s) de acordo com a invenção, a região VH ou região VL está funcionalmente ligada com a região constante, como é o caso, por exemplo, num anticorpo. Igualmente entende-se que a(s) cadeia(s) de (poli)péptidos codificada(s), após a sua síntese, enrolam-se ou montam-se de modo a que a região VH e a região VL fiquem em vizinhança espacial e formem um local de ligação ao antigénio. Também isto é exemplificado através de um anticorpo. 0 termo "compreende" significa por um lado "contém" (a par de outros objectos) e por outro lado "consiste em" (sem a exclusão de objectos adicionais).
Como descrito acima, a molécula CD28 é uma molécula transmembranar que é expressa como homodímero sobre a superfície de células T. A sequência de aminoácidos de CD28 humano pode ser obtida sob o GenBank Accession N° NM_006139.
No contexto da presente invenção, o termo "superagonista" descreve uma propriedade de moléculas de ligação de acordo com a invenção que, através da ligação específica a/interacção com um determinado epitopo da molécula CD28, possibilitam uma activação de linfócitos independente do receptor de antigénio. Com isso, 7 uma "estimulação superagonista" corresponde à activação de células T CD28+ sem ser necessária uma coestimulação, quer dizer uma ocorrência de ligação adicional a par de uma ligação/interacção do anticorpo especifico de CD28,para a estimulação da proliferação. Uma activação deste tipo pode ser comprovada, entre outros, através de uma detecção de marcadores de activação nas células, a indução de factores de transcrição, uma proliferação ou a expressão ou secreção de citocinas.
Com a activação e/ou expansão de células T é denotada, em particular, a proliferação da actividade metabólica, aumento do volume celular, sintese de moléculas imunologicamente importantes, como CD71 ou CD25, e entrada na divisão celular (proliferação) relativamente a um estimulo externo. De um modo preferido, após a activação ou expansão, encontram-se como resultado mais células T do que anteriormente.
As expressões "região VH" e "região VL" são na generalidade conhecidas do especialista da técnica e descrevem, no estado da técnica, o dominio aminoterminal de um anticorpo que se produz durante a maturação de linfócitos B por recombinação dos segmentos génicos V, D e J. As regiões variáveis da cadeia pesada e leve de anticorpos são responsáveis pela ligação/interacção especificade um anticorpo a/com o seu epitopo especifico (conferir Haseman e Capra "Immunoglobulins: Structure and Function", em "Fundamental Immunology" (ed. W. E. Paul), Raven Press, Nova Iorque, 2a edição 1989) . As regiões VH e VL podem também ser combinadas, através de processos recombinantes, com outras estruturas além das regiões C de ocorrência natural. 0 termo "CDR" (região determinante de complementaridade) descreve regiões determinantes de complementaridade dos receptores do sistema imunitário, em particular de anticorpos e receptores de células T. Estas são conhecidas do especialista da técnica como áreas de um receptor que entram em contacto com o ligando e que determinam a especificidade do receptor. As CDR são as partes mais variáveis dos receptores e são responsáveis pela sua multiplicidade. Exemplos para receptores deste tipo compreendem anticorpos. Respectivamente três dos enrolamentos encontram-se nas extremidades distais de ambos os domínios variáveis de anticorpos. Estes são, em geral, numerados consecutivamente como CDR-H1 até CDR-H3 na cadeia pesada e CDR-L1 até CDR-L3 na cadeia leve de anticorpos. A sequência de aminoácidos de uma CDR ou várias CDR pode ser determinada pelo especialista da técnica a partir de uma sequência de aminoácidos conhecida de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado. As CDR indicadas acima foram determinadas de acordo com o processo de Kabat modificado (AbM/Kabat-Kombi). Este resulta, entre outros, da regra "How to identify the CDR by looking at a sequence" na Homepage de Andrew C.R. Martin (http : //www .bioinf . org.uk/cLbs/) . Alternativamente podem ser utilizadas regras de acordo com a invenção para a determinação das CDR das moléculas de ligação descritas de acordo com Kabat (ver Kabat, E. A. et al. 1991; Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication N° 91-3242, bem como Johnson, G. and Wu, T. T. 2000, Nucleic Acids Research). Neste caso são válidas as sequências CDR realçadas nas formas de realização de acordo com a invenção que foram determinadas de acordo com Kabat, e representadas na figura 17, bem como nas figuras 2 e 6. Isto significa, além disso, que as regiões estruturais se alteram facilmente, sem que no entanto a sequência total da molécula de ligação se altere ou tenha que se alterar. Como mencionado: as CDR das moléculas de ligação de 9 acordo com a invenção, de acordo com o sistema de Kabat como também o sistema de AbM/Kabat-Kombi, estão representadas na figura 17. A titulo de exemplo, a sequência CDR-H1 é indicada de acordo com o sistema de Kabat modificado através da sequência GYTFTSYYIH, de acordo com o processo de Kabat convencional através de SYYIH. A expressão "estrutura de imunoglobulina humana" descreve a totalidade daquela secção da sequência de aminoácidos no estado enrolado que,na região variável de um anticorpo humanizado,se encontra entre as CDR, bem como na posição N e C terminal relativamente a estas, e determina a estrutura espacial (formação estérica) da imunoglobulina. A expressão região constante é conhecida do especialista da técnica, entre outros, a partir de Janeway e Travers (Immunologie, 2a edição, Spektrum Akademischer Verlag, ver também referência W. E. Paul, supra). Os anticorpos humanos do isotipo IgG compreendem as subclasses IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4.
De acordo com a invenção, nas moléculas de ligação, chega à utilização uma região constante de um anticorpo humano IgGl ou Ig4. A expressão "ligar a/interagir com" é definido, no contexto da presente invenção, como ligação/interacção de um "local de ligação do antigénio" com um epitopo. A expressão "local de ligação do antigénio" define, em conformidade com a presente invenção, um motivo de um polipéptido/molécula de ligação que é adequado para interagir com um antigénio especifico ou um grupo de antigénios. Uma ligação/interacção especifica deste tipo também é definida como um "reconhecimento especifico" de um antigénio. Um reconhecimento especifico de um antigénio é, de 10 acordo com a invenção, uma ligação especifica a/interacção com no mínimo dois, de um modo preferido três, de um modo mais preferido com no mínimo quatro aminoácidos de um antigénio. A parte do antigénio que entra na ligação/interacção com o local de ligação do antigénio é designada como epitopo. 0 antigénio é, para as moléculas de ligação de acordo com a invenção, a molécula CD28. 0 epitopo das moléculas de ligação de acordo com a invenção encontra-se na área designada como C'D-loop da molécula CD28. Esta ligação/interacção específica conduz à indução de um sinal superagonista (activação/estimulação) numa célula CD28+. Uma ligação/interacção específica também pode ser descrita com o "princípio chave - fechadura". Os motivos específicos numa sequência de aminoácidos do local de reconhecimento do antigénio e do antigénio ligam-se um ao outro devido à sua estrutura primária, secundária ou terciária. A expressão "interacção específica" é entendida, no contexto da presente invenção, por a molécula de ligação não reagir ou não reagirsignificativamente de forma cruzada com (poli)péptidos que têm uma estrutura análoga à do antigénio reconhecido especificamente e que são expressos nas mesmas células. A actividade cruzada de um grupo de moléculas de ligação pode ser pesquisada, p. ex., pela determinação das propriedades de ligação/forças de ligação sob condições usuais (ver, entre outros, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 e Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999). Pela definição de "se ligarem a/interagirem com" estão também explicitamente compreendidos epitopos de conformação, epitopos estruturais e epitopos descontinuados, que são compostos por duas ou várias áreas de um antigénio (resíduos de áreas diferentes de uma ou várias cadeias polipeptídicas) e 11 compõem um "epitopo natural" (ver Sela, (1969) Science 166, 1365 e Laver, (1990) Cell 61, 553 - 6) . A expressão "reticulação cruzada/reticulação transversal" descreve uma indução de uma proximidade espacial de várias moléculas de ligação, que estão ligadas ao antigénio especifico/interagem com o antigénio especifico, facto pelo qual se chega a uma ligação multivalente da molécula alvo (epitopo especifico) CD28. No caso das moléculas de ligação de acordo com a invenção, é preferida uma reticulação cruzada/reticulação transversal através do fragmento Fc do anticorpo IgG humanizado. Isto pode ser alcançado, p. ex. por ligação desse fragmento a receptoresFcem linfócitos ou outras células. As moléculas de ligação de acordo com a invenção (que são codificadas por ácidos nucleicos de acordo com a invenção) têm a propriedade surpreendente de puderem activar/estimular células CD28+ através de moléculas de ligação reticuladas de forma cruzada, sem serem eliminadas. A expressão "molécula de ligação" é utilizada no contexto da invenção para a descrição de um grupo de moléculas que podem ocorrer tanto como monómeros, como também como di, tri ou oligómeros. Os di, tri ou oligómeros podem ser tanto homómeros, como também heterómeros. De um modo preferido, as cadeias individuais de di, tri ou oligómeros estão covalentemente ligadas entre si. De um modo preferido em particular neste caso são ligações covalentes através de pontes dissulfureto. Em alternativa, os di, tri ou oligómeros também podem no entanto estar ligados entre si através de interacções não covalentes. As di, tri ou oligomerizações correspondentes podem alcançar-se, p. ex., através de interacções de motivos de sequências específicos nas moléculas individuais. Um exemplo para uma interacção 12 intrínseca deste tipo é a interacção de monómeros através de um "motivo de fecho de leucina", que conduz a uma dimerização.
Como ponto de partida para as moléculas de ligação CD28 superagonistas de acordo com a invenção serviu o anticorpo CD28 anti-humano de murganho 5.11A1 descrito em Luhder et al., J. Exp. Med., 2003, 197: 955 - 966. As regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo 5.11A1 foram humanizadas por tecnologia genética correspondente ao estado da técnica. Esta técnica é, entre outras, conhecida do especialista da técnica como "CDR-grafting" (ver P.T. Jones et al. 1986. Nature321: 522 - 525, bem como Ewert et al., 2004. Methods, 34: 184 - 199) . As regiões variáveis humanizadas foram fundidas com a região constante de anticorpos humanos do isotipo IgG.
Para a utilização terapêutica, é conhecido que são adequados, em princípio, todos os isotipos IgG (IgGl -4). Reconhecidamente, a grande maioria dos anticorpos que se encontram no desenvolvimento terapêutico possuem um princípio activo neutralizante, bloqueador ou destruidor (negativo) e com isso diferenciam-se fundamentalmente do princípio activo superagonista (positivo) aqui seguido. A selecção de acordo com a invenção dos isotipos IgGl e IgG4 como formatos terapêuticos de anticorpos anti-CD28 superagonistas baseia-se nas seguintes considerações e descobertas experimentais surpreendentes: a base do princípio inventivo é a selecção de fragmentos Fc do isotipo IgGl ou IgG4. Os anticorpos IgGl podem ser eficientemente reticulados transversalmente por meio de receptoresFc presentes no corpo. Isto deverá ser benéfico para o princípio activo superagonista (ver também Evans et al., Nature Immunol., 2005, 6: 271- 279) . No entanto, contra isso falou o facto de que era de esperar que uma reticulação transversal deste tipo vá 13 conduzir a uma eliminação das células T, o que contrariaria o princípio activo desejado, ou que era de esperar que o princípio activo desejado seria anulado através desta eliminação. No caso do isotipo IgG4 era de esperar, de acordo com o estado da técnica, que este isotipo contrariasse a eficácia desejada. Para este estava descrito, p. ex., um efeito desencadeado de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC); ver Isaac et al., Clin. Exp. Immunol., 106: 427 - 433. Além disso, devido à esperada ligação em falta ou muito diminuta ao receptor Fc, não era de assumir que este isotipofosse promover uma activação de células T por exemplo numa cultura de leucócitos de sangue periférico.
Depois da disponibilização das moléculas de ligação de acordo com a invenção foi comprovado de um modo surpreendente que estas estimulavam células T de forma superagonista. Isto é mostrado para os anticorpos do isotipo IgGl (TGN1112) e do isotipo IgG4 (TGN1412) nos exemplos anexos e nos resultados experimentais representados nas figuras 1 a 8. As cadeias pesada e leve de TGN1412 estão representadas, respectivamente, nas SEQ ID. N° 14 e 16. As SEQ ID. N° 30 e 32 mostram as sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve de TGN1112. Como se pode deduzir das figuras 1 a 8, tanto as cadeias leves como também as cadeias pesadas dos anticorpos TGN1112 e TGN1412 são sintetizadas em primeiro lugar com péptido de sinal (referido na figura como péptido líder). O péptido de sinal determina o alvo no interior da célula e já não está presente na cadeia leve ou pesada madura. Relativamente à cadeia pesada de TGN1412 é ainda de notar que no caso da expressão em células CHO, foram observadas duas variantes do terminal C que se diferenciam por um resíduo de aminoácido adicional (Fig. 2). As sequências de ADN, incluindo intrões e UTR e a região codificadora para o 14 péptido de sinal estão representadas para as cadeias pesada e leve de TGN1412 nas SEQ ID. N° 41 e 43/ para as cadeias pesada e leve de TGN1112 nas SEQ ID. N° 45 e 47. As sequências de aminoácidos codificadas a partir dai estão representadas nas SEQ ID. N° 42, 44, 46 e 48.
Assim, numa forma de realização preferida, a presente invenção coloca à disposição os anticorpos anti-CD28 solúveis TGN1412 e TGN1112 para a estimulação policlonal de linfócitos T CD4 e CD8 humanos numa forma inovadora, independente de TCR. Foi inesperada a descoberta de que TGN1412 e TGN1112 na forma solúvel activam e expandem ex vivo linfócitos T, de forma muito eficiente. Esta descoberta foi surpreendente de um modo particular para TGN1412, uma vez que por um lado a reticulação transversal do anticorpo é necessária para o principio activo superagonista, no entanto, por outro lado, não foi observável qualquer ligação a receptoresFc de afinidade elevada ou intermédia. Para TGN1112 a descoberta foi surpreendente, uma vez que o anticorpo na cultura de células medeia uma citotoxicidade dependente dos anticorpos fortemente pronunciada contra células T (Fig. 16), no entanto, em simultâneo, induziu uma proliferação muito forte (Fig. 10A) . Face ao anticorpo de partida 5.11A1, tanto TGN1412 como TGN1112 caracterizam-se por estarem em condições de manter a morte celular induzida por activação (apoptose) de linfócitos T humanos em cultura de células muito diminuta (Fig. 15) . Este resultado perspectiva que também no homem, TGN1412 e TGN1112 devam estar em condições de activar e expandir linfócitos T muito eficazmente e cuidadosamente. 0 ácido nucleico de acordo com a invenção compreende além disso, de um modo preferido, uma sequência de ácidos nucleicos, em que a sequência de ácidos nucleicos 15 (i) é SEQ ID N°: 13, 29, 41 ou 45; e/ou (ii) codifica um (poli)péptido com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 14, 30, 42 ou 46. É igualmente preferido um ácido nucleico que compreende uma sequência de ácidos nucleicos, em que a sequência de ácidos nucleicos (iii) é SEQ ID N°: 15 ou 43; e/ou (iv) codifica um (poli)péptido com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 16 ou 44.
Além disso é um objectivo preferido da invenção que um ácido nucleico de acordo com a invenção compreenda adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codifique para um elemento de marcação ou tag. A expressão "elemento de marcação" ou "tag" descreve, no contexto da invenção, um elemento que medeia a capacidade para a interacção com um parceiro de ligação conhecido. Esta interacção por seu lado possibilita aplicações como purificação ou isolamento (facilitados), bem como a detecção ou comprovação.
Os elementos de marcação ou tag de acordo com a invenção podem ser seleccionados por exemplo a partir de um grupo constituído por His-tag, Flag-tag, Myc-tag, HA-tag, GST-tag, TI 0 0™, VSV-G, V5, S-tag™, HSV, CFP, RFP, YFP, GFP, BFP, domínio de ligação à celulose (CBD), proteína de ligação à maltose (MBP), NusA-tag, tioredoxina (Trx), DsbA, DabC e uma sequência de biotinilização. Em alternativa a isso ou em particular, o elemento de marcação pode ser uma marcação radioactiva, 16 fluorescente, fosforescente ou luminiscente. As marcações radioactivasincluem marcações com 32P (no caso de ácidos nucleicos) e 125I ou 132I (no caso de proteínas) .
Numa forma de realização alternativa, a presente invenção refere-se a um vector compreendendo um ou vários dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção acima descritos. São conhecidos uma multiplicidade de vectores adequados pelos biologistas moleculares como especialistas da técnica. A selecção de um vector depende, neste contexto, das propriedades desejadas e inclui plasmídeos, cosmídeos, vírus, bacteriófagos e outros vectores convencionais utilizados na tecnologia genética. Os processos conhecidos em geral podem ser utilizados para a preparação de diferentes vectores; ver, entre outros, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edição 1989 e 3a edição 2001; Gerhardt et al. ; Methods for General and Molecular Bacteriology; ASM Press, 1994; Lefkovits; Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis, Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002 e Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994).
As sequências de nucleótidos a expressar podem ser clonadas em vectores de expressão adequados. Os vectores de clonagem usuais compreendem pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 e pGBT9. Os vectores de expressão usuais compreendem, entre outros, pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT, pKNOH2 e pLNOK (Norderhaug et al., 1997. J. Immunol. Methods, 204: 77 - 87) . 17
Um vector de acordo com a invenção compreende habitualmente uma "sequência reguladora", que está funcionalmente ligada com a sequência de nucleótidos a exprimir. 0 termo "sequência reguladora" descreve sequências de ADN que são necessárias para iniciar a expressão de uma sequência codificada. As propriedades das sequências de controlo deste tipo diferenciam-se dependendo do organismo hospedeiro. 0 termo "funcionalmente ligado" descreve uma disposição em que os componentes indicados estão dispostos de maneira adequada para a expressão. A disposição adequada é conhecida do especialista da técnica.
De um modo preferido, o vector descrito é um vector de expressão. Um vector de expressão é uma construção que é adequada para a transformação de um hospedeiro seleccionado e que possibilita uma expressão da sequência codificada no hospedeiro. Os vectores de expressão podem ser respectivamente vectores de clonagem, vectores binários ou vectores integrados. A expressão compreende a transcrição do ácido nucleico, de um modo preferido em ARNm traduzivel. Os elementos reguladores, que asseguram uma expressão em procariotas e/ou em células eucariotas, são conhecidos do especialista da técnica. As sequências de controlo para procariotas compreendem em geral um promotor, um local de ligação ribossomal e um terminador. Os elementos reguladores possíveis para hospedeiros procariotas compreendem, p. ex., promotores PL, lac, trp ou tac de E. coli. As sequências de controlo para células eucariotas compreendem em geral promotores e terminadores e, nalguns casos, amplificadores, transactivadores ou locais de ligação do factor de transcrição. Os promotores asseguram uma iniciação da transcrição. Os terminadores, como sinais poli-A, asseguram uma terminação da transcrição e uma estabilização do transcrito. Exemplos para elementos reguladores para células hospedeiras 18 eucariotas são, por ex., o promotor A0X1 ou GAL1 para leveduras ou o promotor CMV, o promotor SV40, o promotor RSV (Rous Sarcoma Vírus) , o amplificador CMV, o amplificador SV40 ou um intrão de globina para células de mamífero ou outras células animais. Neste contexto, a partir do estado da técnica, os vectores de expressão conhecidos compreendem, entre outros, vectores como o vector de expressão de ADNc Okayama-Berg pcDVl (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (InVitrogen), pEF-DHFR e pEF-ADA (Raum et al. Câncer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141 - 150), pSPORTl (GIBCO BRL), bem como pKNOH2 e pLNOK (Norderhaug et al., 1997. J. Immunol. Methods, 204: 77 - 87) . O termo "sequência de controlo" é utilizado como descrição de todas as sequências necessárias no mínimo para uma expressão num hospedeiro seleccionado e pode com isso compreender elementos adicionais.
Com a invenção é passível de produzir um hospedeiro transformado ou transfectado com um vector descrito acima.
Este hospedeiro pode ser um procariota ou, de um modo preferido, uma célula eucariota. O hospedeiro procariota compreende, no contexto da invenção, todas as eubactérias e arqueobactérias que possam ser transformadas com os ácidos nucleicos.Este grupo compreende com isso bactérias Gram-negativo, bem como Gram-positivo, como, p. ex., E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens e Bacillus subtilis. As células eucariotas compreendem, entre outras, leveduras, plantas superiores, insectos e, de um modo preferido, células de mamífero, como células CHO, COS-7, NS0 e Per.C6. 19 além disso A invenção refere-se, além disso, a um processo para a preparação de uma molécula de ligação que é codificada por um ou vários dos ácidos nucleicos descritos acima, compreendendo a cultura do hospedeiro sob condições adequadas; e isolamento da molécula de ligação a partir da cultura. 0 hospedeiro transformado/transfectado pode ser cultivado num fermentador. Os protocolos para uma criação/cultura de diferentes hospedeiros são conhecidos do especialista da técnica. Estes podem ser determinados e optimizados sem actividadeinventiva adicional. Da mesma forma, o especialista da técnica conhece processos para o isolamento de um (poli)péptido recombinante, como da molécula de ligação de acordo com a invenção, a partir de uma cultura ou um sobrenadante de cultura. Os processos de isolamento deste tipo compreendem, entre outros, precipitação por sulfato de amónio, purificações de afinidade (p. ex., com auxilio de colunas cromatográficas), electroforese em gel e análogos; ver, entre outros, Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N.Y. (1982) ou Rehm, "Der Exerimentator: Proteinbiochemie/Proteomics", Spektrum, Akademischer Verlag. São preferidas para a utilização farmacêutica preparações, no essencial, puras de moléculas de ligação com 90 até 95% de homogeneidade, de um modo preferido com 98 até 99% de homogeneidade ou ainda mais alta.
Numa forma de realização adicional, a invenção refere-se a uma molécula de ligação, codificada por um ácido nucleico de acordo com a invenção ou vários ácidos nucleicos de acordo com a invenção, ou preparada com o processo de acordo com a invenção. 20 São preferidos os anticorpos ou fragmentos ou derivados de um anticorpo que correspondam a uma molécula de ligação de acordo com a invenção ou que a contenham.
Os fragmentos de anticorpo no sentido da invenção compreendem fragmentos dos anticorpos previamente descritos, que compreendem tanto as propriedades de ligação especificas das regiões variáveis definidas, como também dispõem de uma parte da região constante de um anticorpo IgGl ou IgG4, que possibilita uma reticulação cruzada.
Os derivados de anticorpo de acordo com a invenção compreendem, no entanto não estão limitados a, anticorpos/fragmentos de anticorpos marcados, como também anticorpos/fragmentos de anticorpos quimicamente modificados. A marcação/modificação dos anticorpos/fragmentos de anticorpos pode efectuar-se por pós-tradução ou por modificação química/bioquimica ou por biologia molecular. Estas modificações compreendem, p. ex., uma modificação da glicosilação (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17: 176 - 180) e uma PEGilação (Delgado et al., 1996. J. Drug Target. 3: 321 - 340).
De um modo preferido, o anticorpo de acordo com a invenção é um anticorpo monoclonal.
Numa forma de realização alternativa, a invenção refere-se a uma composição que compreende o ácido nucleico de acordo com a invenção, um vector de acordo com a invenção, hospedeiro, molécula de ligação e/ou o anticorpo ou fragmento ou derivado de um anticorpo. 21 É preferido que a composição de acordo com a invenção seja uma composição farmacêutica. Esta poderá eventualmente conter além disso um suporte farmaceuticamente aceitável, um excipiente farmaceuticamente aceitável ou um agente de diluição farmaceuticamente aceitável.
Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção compreende, entre outros, medicamentos e preparações medicamentosas. Exemplos para suportes/excipientes e agentes de diluição farmaceuticamente/farmacologicamente aceitáveis particularmente adequados são conhecidos do especialista da técnica. Estes compreendem soluções tamponadas de sais, água, emulsões como, p. ex., emulsões óleo/água, diferentes tipos de detergentes, soluções estéreis, etc. Os medicamentos que compreendem suportes deste tipo podem ser formulados por meio de métodos convencionais conhecidos. A composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser administrada a um indivíduo numa dose adequada. A administração pode efectuar-se por via parentérica, p. ex., intravenosa, intraperitonial, subcutânea, intramuscular, local, intranasal, intrabronquial ou intradérmica, ou através de um cateter num local de uma artéria. 0 tipo de dosagem é determinado pelo médico assistente em correspondência com os factores clínicos. É conhecido do especialista da técnica que o tipo e dosagem estão dependentes de diversos factores, como, p. ex., o tamanho corporal ou o peso, a superfície corporal, a idade, o género ou a saúde geral do doente, mas também do agente especial a administrar, da duração e do tipo de administração, e de outros medicamentos que possam ser possivelmente administrados em paralelo. Uma dose típica pode encontrar-se, p. ex., na gama entre 0,001 e 500000 yg, em que são concebíveis doses abaixo ou acima desta gama a título de exemplo, sobretudo considerando os factores 22 indicados acima. Em geral, no caso da administração regular da composição de acordo com a invenção, a dose deverá encontrar-se numa gama entre unidades de 10 ng e 10 mg por dia ou por intervalo de aplicação. Caso a composição seja administrada por via intravenosa, a dose deverá encontrar-se numa gama entre unidades de 1 ng e 1 mg por guilograma de peso corporal por minuto. A composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser administrada local ou sistemicamente. Os preparados para uma administração parentérica compreendem soluções aguosas ou não aquosas estéreis, suspensões e emulsões. Exemplos para solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais como, p. ex., azeite, e compostos éster orgânicos, como, p. ex., oleato de etilo, que são adequados para injecções. Os suportes aquosos compreendem água, soluções aquosasalcoólicas, emulsões, suspensões, soluções de sais e meios tamponados. Os suportes parentéricos compreendem soluções de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, lactato de Ringer e óleos ligados. Os suportes intravenosos compreendem, p. ex., suplementos de liquidos, nutrientes e electrólitos (como, p. ex., aqueles que se baseiam em dextrose de Ringer). A composição de acordo com a invenção pode compreender além disso agentes de conservação e outros aditivos, como, p. ex., compostos antimicrobianos, antioxidantes, formadores de complexos e gases inertes, e/ou substâncias que promovam a solubilidade, como por exemplo Tween. Além disso, dependendo da utilização pretendida, podem estar contidos compostos como, p. ex., interleucina, factores de crescimento, factores de diferenciação, interferonas, proteínas quimiotáticas ou um agente imunomodeladorinespecifico. 23
Em alternativa é preferido que a composição de acordo com a invenção seja uma composição de diagnóstico. É igualmente preferido que a composição de acordo com a invenção seja um kit que compreenda o(s) ácido(s) nucleico(s), o vector, o hospedeiro, a molécula de ligação, e/ou o anticorpo ou fragmento ou derivado de um anticorpo, em um ou vários recipientes. De um modo adicionalmente preferido, este kit compreende um folheto informativo. Este pode compreender uma descrição do kit, dos seus componentes e/ou da sua utilização. A descrição da utilização pode compreender além disso instruções de dosagem para o médico.
Numa forma de realização, a invenção refere-se à utilização do(s) ácido(s) nucleico(s) de acordo com a invenção, do vector de acordo com a invenção, do hospedeiro de acordo com a invenção, da molécula de ligação de acordo com a invenção e/ou do anticorpo de acordo com a invenção ou fragmento ou derivado de um anticorpo de acordo com a invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de doenças que acompanham uma capacidade de coestimulação, funcionalidade ou número de células T deficitárias ou insuficientes, de doenças inflamatórias e/ou de doenças autoimunes. A invenção é adequada para um processo para o tratamento de doenças que acompanham uma capacidade de coestimulação, funcionalidade ou número de células T deficitárias, de doenças inflamatórias e/ou de doenças autoimunes, compreendendo a administração do (s) ácido(s) nucleico(s) de acordo com a invenção,do vector de acordo com a invenção, do hospedeiro de acordo com a invenção, da molécula de ligação de acordo com a 24 invenção e/ou do anticorpo de acordo com a invenção ou fragmento ou derivado de um anticorpo de acordo com a invenção. São preferidas utilizações e processos quando as doenças que acompanham uma capacidade de coestimulação, funcionalidade ou número de células T deficitárias são seleccionadas do grupo composto por leucemia linfocitica crónica do tipo de células B (B-CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfopenia T, tumores sólidos, infecção por VIH e infecção por HTLV. Os tumores sólidos são de um modo preferido seleccionados de carcinoma dos rins, carcinoma dos pulmões e melanomas.
Em alternativa são preferidas utilizações e processos em que as doenças inflamatórias e autoimunes são seleccionadas do grupo composto por artrite reumatóide (RA), Diabetes mellitus de tipo I, esclerose múltipla, psoríase, sindrome de Guillain-Barre, doença de Crohn, e doenças que são atribuídas a reacções indesejadas de activação de células T, como "doença de enxerto vs hospedeiro" (GvHD) ou "doença de hospedeiro vs enxerto" (HvGD) . No caso de HvGDs, é contemplada de um modo particular a rejeição de transplantados de órgãos sólidos, como figado, pulmões, coração e rins.
Numa forma de realização alternativa adicional, a invenção refere-se à utilização do(s) ácido(s) nucleico(s) de acordo com a invenção,do vector de acordo com a invenção, do hospedeiro de acordo com a invenção, da molécula de ligação de acordo com a invenção e/ou do anticorpo de acordo com a invenção ou fragmento ou derivado de um anticorpo para a preparação de uma composição de diagnóstico para a análise in vitro da resposta de um doente a uma terapia com uma composição farmacêutica. 25
Uma análise in vitro realizável com esta composição de diagnóstico compreende por exemplo os passos seguintes: (a) isolamento de células do sangue a partir de uma amostra de sangue (p. ex., PBMC (células mononucleares periféricas de sangue) e/ou linfócitos); (b) incubação das células do sangue com um anticorpo de acordo com a invenção e eventualmente adição de um reagente exógeno de reticulação cruzada; (c) detecção de uma estimulação dependente de anticorpos de células T na amostra.
Caso na amostra seja detectada uma estimulação de células T dependente de anticorpos, então o doente do qual provém a amostra responde a uma terapia com uma composição farmacêutica de acordo com a invenção.
As figuras mostram:
Figuras 1-8: mostram as sequências de nucleótidos ou aminoácidos das cadeias leves e pesadas de TGN1412 e TGN1112.
Figura 9: especificidade de ligação dos anticorpos TGN1412 e 5.11A1 para CD28 em células Jurkat transfectadas e em células T humanas primárias.
Para a coloração de imunofluorescência e citometria de fluxo foram incubadas respectivamente 1 - 2 x 106 células/mL em tampão FACS (PBS, BSA, azida de Na) com quantidades saturantes dos anticorpos 5.11A1, irrelevantes de TGN1412, anticorpos de 26 controlo específicos do isotipo durante 40 minutos a 4 °C. As colorações foram lavadas para eliminar anticorpo em excesso e antes da análise foram incubadas com quantidades saturantes de IgG anti-ratinho conjugado com PE (para 5.11A1) ou IgG anti-humano conjugado com PE (para TGN1412) durante 15 minutos. As células foram em seguida coradas com anticorpo anti-CD4. A análise por citometria de fluxo efectuou-se num FACSCalibur™ com auxílio do software CellQuest™ (Becton Dickinson). Os sinais de fluorescência e sinais de side-scatter (ssc) foram registados logaritmicamente, os sinais de forward-scatter (fsc) foram registados linearmente. Os histogramas mostram sinais consistentes de células que se encontram num "life-gate" empírico, definido por ssc e fsc. Eles mostram a ligação de 5.11A1 ou TGN1412 (curvas cheias) em comparação aos anticorpos de controlo do isotipo (curvas abertas) em células Jurkat, que não expressam qualquer CD28 (gráfico à esquerda) ou que foram transfectadas com CD28 (gráficos do meio), bem como células mononucleares de sangue periférico positivas para CD4 (PBMC, gráfico à direita).
Figura 10: obtenção de células e testes de proliferação.
As PBMC foram isoladas por centrifugação de densidade de Ficol a partir de sangue periférico obtidode fresco ou a partir de Buffy Coats, foram lavadas e colocadas em cultura numa concentração de 2 x 205 células por 200 pL de poço em placas de 96 poços de fundo redondo. De acordo com a identificação, elas foram cultivadas com anticorpos solúveis TGN1112, TGN1412, 5.11A1 ou anticorpos de controlo do isotipo numa concentração de 1 pg/mL (A) ou correspondente à identificação nas abcissas (B) . Após 48 horas foi determinada a taxa relativa de proliferação 27 celular - representada como média cpm ± SD = valor médio de contagens por minuto ± desvio padrão - por intermédio de incorporação de timidina [metil-3H] durante um intervalo de tempo de 18 horas e subsequente medição de cintilação líquida. Os resultados são representativos para múltiplas determinações com diversos dadores.
Figura 11: obtenção de células, estimulação de PBMC e representação foram como descrito para a figura 10. A estimulação de TGN1112 foi comparada com aquela dos fragmentos TGN1112(Fab)2, cuja qualidade bioquímica e ligação específica a transfectantes de CD28 foi mostrada anteriormente.
Figura 12: estimulação de células T CD4 e CD8 através de TGN1412. (A) PBMC (obtenção e condições de cultura, ver figura 10) foram estimuladas com TGN1412 (1 yg/mL) ou um anticorpo de controlo do isotipo para os intervalos temporais indicados. O estado do ciclo celular para células CD4 ou CD8 foi determinado por coloração intracelular por meio de anticorpos anti-Ki-67 marcados com FITC. Para o efeito foram incubadas células com anticorpos PE CD4 anti-humano ou PE anti-CD8 durante 15 minutos, foram lavadas e incubadas em tampão Cytofix/Cytoperm™ (Becton Dickinson) durante 20 minutos a 4 °C. Após lavagem com tampão
Perm/Wash™ (Becton Dickinson) as células foram coradas durante 30 minutos adicionais a 4 °C com FITC anti-Ki-67, foram lavadas e medidas por citometria de fluxo como descrito na figura 9. 28 (B) Foram obtidas células T CD4+ ou CD8+ a partir de uma suspensão de PBMC com auxilio de kits adequados de isolamento de células T e subsequente separação por AutoMACS™ (ambos
Miltenyi). A pureza testada por citometria de fluxo perfez 93 -98% para células T CD4+ e 81 - 95% para células T CD8+. Revestiram-se placas de 96 poços de fundo plano com Ig anti-humano (40 yg/mL em PBS) durante 3 h à temperatura ambiente e lavaram-se em seguida. As células foram cultivadas a seguir numa densidade de 1 x 105/poço em conjunto com TGN1412 ou com um anticorpo de referência. A adição de PHA (5 yg/mL) e IL-2 (200 U/mL)serviu como controlo positivo para a proliferação das células. A proliferação foi determinada após 48 horas como descrito para a figura 10 e representa um resultado representativo para diferentes dadores.
Figura 13: análise do repertório TCR de PMBC estimuladas por TGN1412. A análise do repertório TCR V[beta] de PBMC, que foram cultivadas 96 horas com TGN1412 (1 yg/mL) ou um anticorpo de controlo IgG4, efectuou-se com o auxilio do IOTest® Beta Mark TCR V[beta] Repertoire kit™ (Beckman Coulter) de acordo com instruções do fabricante. As amostras foram coradas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD4 como descrito para a figura 9. Está representado um resultado representativo de três determinações, em que a janela de análise foi ajustada para células CD3+ CD4+. 29
Figura 14: medição da apoptose de células T mediada por CD28.
Incubaram-se PBMC (2 x 105/mL) com 5.11A1, TGN1412, TGN1112 ou anticorpo de controlo do isotipo solúveis (1 yg/mL) durante 72 horas. Em seguida as células foram coradas durante 15 minutos com APC anti-CD3 e lavadas com tampão FACS. As PBMC foram ressuspensas em tampão de ligação anexina V (BD Pharmingen) e incubadas com anti-anexina V e 7AAD durante 15 minutos. A apoptose no sentido de células T (janela CD3+), que eram positivas para anexina V e permeáveis a 7AAD, foi determinada por meio de citometria de fluxo no intervalo de 1 hora.
Figura 15: indução do receptor pro-apoptótico CD95 por anticorpo anti-CD28. A montagem da pesquisa corresponde à descrita na figura 14. Em lugar da anexina V/7AAD, as PBMC foram coradas com FITC anti-CD3 e CD95-PE e foi determinada a expressão de CD95 em células T CD3+ por meio de citometria de fluxo. É mostrado, a titulo de exemplo, um resultado para dois dadores diferentes.
Figura 16: indução de citotoxicidade celular dependente de anticorpos, ADCC.
A ADCC de diversos anticorpos anti-CD28 foi determinada por citometria de fluxo. Para o efeito 5 x 104 células Jurkat CD28 + marcadas com calceina-AM foram co-cultivadas com PBMC isoladas de fresco, na presença de 6 yg/mL dos anticorpos indicados nas razões representadas de efector: células alvo (E:T) durante 3,5 horas. As células foram recolhidas em tampão FACS com 0,5 yg/mL 30 de iodeto de propídio e medidas por citometria de fluxo. A razão de células calceína negativas ou calceina fracamente positivas/células positivas para iodeto de propidio (xlOO) relativamente à totalidade de células calceina positivas foi determinada como parte percentual em citotoxicidade. É mostrado um resultado representativo de determinações com células de dadores diferentes.
Figura 17: CDR das moléculas de ligação de acordo com a invenção de acordo com o sistema de Kabat e de acordo com o sistema de AbM/Kabat-Kombi.
Os exemplos esclarecem a invenção. Os exemplos não devem ser vistos como limitação da invenção. Os exemplos são anexados apenas para a ilustração da invenção e a invenção está simplesmente limitada através das reivindicações.
Exemplo 1: Propriedades de ligação dos anticorpos de acordo com a invenção a CD28, CD16b, CD32 e CD64
Foi pesquisado se, no caso do processo de humanização, a ligação a molécula CD28 de homem permaneciainalterada. Como mostrado na fig. 9 a titulo de exemplo para TGN1412, este foi o caso para ambos os isotipos.
Em seguida foram determinadas as propriedades de ligação de TGN1412 e TGN1112 a CD16b, CD32 e CD64. Os resultados estão resumidos na tabela 1. De acordo com o esperado, mostrou-se que TGN1112 liga-se com boa afinidade mensurável a CD16 e CD54, no entanto não a CD32, enquanto TGN1412 apenas interagiu fracamente e exclusivamente com CD64. 31
Tabela 1: Propriedades de ligação de TGN1412 e TGN1112 a receptores Fc gama humanos
FcyR TGN1112 T GN1412 CD16b + CD32 - - CD64 + + +
Legenda: não detectável + ligação média ++ ligação forte
Tabela 1: a ligação de TGN1412 e TGN1112 a FcYRIIIb (CD16b) foi determinada por meio de ELISA, em que CD16b humano, recombinante (R&D Systems) serviu como "antigénio de captura". A interacção entre CD16b e TGN1112 foi detectada por meio de Ig da cadeia leve kapa anti-humano conjugado com HRP. Para a detecção da ligação de TGN1112 ou TGN1412 a CD32 e CD64, linhas de células humanas, CD28 negativas, que expressamconstitutivamente CD32 e/ou CD64, foram incubadas com TGN1112ou TGN1412 durante 40 minutos, foram lavadas e coradas com anticorpo IgG anti-humano conjugado com PE, que reconhece a cadeia kappa. As células foram lavadas e a ligação de TGN1112e TGN1412 a FcyR foi detectada por meio de citometria de fluxo. A especificidade para CD64 foi alcançada, no caso das linhas de células que tanto expressam CD32 como também CD64, através de experiências de competição com anticorpo anti-CD64 bloqueado. 32
Exemplo 2: Estimulação de células T pelos anticorpos de acordo com a invenção
Em seguida são elucidadas descobertas experimentais que mostram que de um modo surpreendente tanto TGN1112 como também TGN1412 estão em condições, sem reticulação transversal sintética, de activar ex vivo linfócitos T humanos. Devido ao facto de TGN1412 apenas se ligar fracamente ao receptor Fc de CD64, isto não era de esperar em particular para TGN1412.
Foi em primeiro lugar pesquisado se as propriedades activadoras de células T dos anticorpos humanizados face ao anticorpo de partida 5.11A1 se mantinham inalteradas. 0 resultado surpreendente está representado a titulo de exemplo na fig. 10. Na fig. 10A é mostrado que tanto TGN1112 como também TGN1412 na forma solúvel estão em condições de estimular eficientemente para a proliferação células mononucleares do sangue periférico (PBMC) na suspensão de células. Na fig. 10B é mostrado que a indução da proliferação de células T através de TGN1412 efectua-se fortemente de modo análogo à indução da proliferação através do anticorpo de partida 5.11A1, que no entanto os anticorpos convencionais, quer dizer anticorpos superagonistas anti-CD28, como por exemplo o anticorpo 28.2 ou 152-2E10, não estão em condições de o fazer.
Exemplo 3: Relevância do domínio Fc para as propriedades estimuladoras
Em seguida foi pesquisado se o dominio Fc é necessário para as propriedades estimuladoras face a células T humanas numa cultura de PBMC. Para o efeito foram preparados fragmentos F(ab)2 33 de TGN1112 e estes foram comparados, em cultura de células, com anticorpo intacto relativamente à activação de PBMC. O resultado está representado na fig. 11. Mostra-se que fragmentos F(ab)2 de TGN1112 não induzem qualquer proliferação, enquanto o anticorpo intacto desencadeia uma forte proliferação das PBMC, dependente da dose.
Exemplo 4: As células T são as células alvo da actividade estimuladora dos anticorpos de acordo com a invenção
Para mostrar que no caso das células prolif eradoras por estimulação de TGN1412 na cultura de PBMC se tratam de células T, a análise do marcador de ciclo celular Ki-67 foi associada com a análise do marcador de superfície CD4 e CD8. A expressão de CD4 ou CD8 caracteriza ambos os grupos principais de células T, células T auxiliares (que expressam CD4) ou células T citotóxicas (que expressam CD8) . Na fig. 12A é mostrado que TGN1412 solúvel estimula claramente a proliferação de ambos os subgrupos numa suspensão de PBMC. Na fig. 12B é mostrado que também linfócitos T CD4 ou CD8 purificadossão claramente estimulados para a proliferação através de estimulação por TGN1412, no entanto neste sistema é necessária a presença de um agente de reticulação transversal.
Na fig. 13 é mostrado que através da expansão mediada por TGN1412 de células T CD4 em cultura de células mantém-se inalterado o repertório da expressão de TCRVB. Isto vai no sentido de uma descoberta importante, de que na imunoterapia pretendida é útil de se conservar a multiplicidade naturalmente presentedo repertório de TCR, para manter a imunotolerância e a 34 reactividade face a um espectro alargado de possíveis patogénicos.
Em resumo, estes resultados mostram de uma maneira surpreendente que tanto TGN1412 como também TGN1112 na forma solúvel estão em condições de estimular células T humanas em cultura de células.
Exemplo 5: Actividade altamente estimuladores com actividade pro-apoptótica diminuta dos anticorpos de acordo com a invenção
Em seguida foi pesquisada de forma precisa a activação de células T que foi mediada através de TGN1412, TGN1112 e o anticorpo de partida 5.11A1 relativamente à indução de morte celular programada (apoptose). Os resultados representativos estão resumidos na fig. 14 e fig. 15.
Na fig. 14 está representado que a parte de células T apoptóticas numa cultura de PBMC, que foram estimuladas com os anticorpos anti-CD28 5.11A1, TGN1412 e TGN1112 na forma solúvel, foi a mais frequente nas culturas estimuladas por 5.11A1, no caso das culturas estimuladas por TGN1112 foi a intermediariamente estimulada, e no caso das culturas estimuladas por TGN1412 foi a menos estimulada. De acordo com estes resultados, a fig. 15 mostra que a expressão do receptor CD95 desencadeador de apoptose sobre células T, que foram estimuladas com 5.11A1, foi a mais frequente, enquanto células estimuladas por TGN1112 apresentaram uma frequência média e células estimuladas por TGN1412 apresentaram uma frequência diminuta em células CD95 positivas. 35
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Lisboa, 7 de Novembro de 2013 67

Claims (12)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Ácido nucleico, codificador de uma molécula de ligação que liga especificamente uma molécula CD28 humana, compreendendo a) uma sequência de ácidos nucleicos codificadora de uma região VH e uma sequência de ácidos nucleicos codificadora de uma região VL compreendendo CDR numa estrutura de imunoglobulina humana, em que a sequência de ácidos nucleicos da região VH compreende a SEQ ID N°: 33 e/ou codifica um (poli)péptido, que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 34; e a sequência de ácidos nucleicos da região VH compreende a SEQ ID N°: 35 e/ou codifica um (poli)péptido, que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 36 e b) uma sequência de ácidos nucleicos, que codifica a região constante de um anticorpo IgGl ou IgG4 humano.
  2. 2. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos, em que a sequência de ácidos nucleicos i) é SEQ ID N°: 13, 29, 41 ou 45; e/ou 1 ii) codifica um (poli)péptido com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 14, 30, 42 ou 46.
  3. 3. Ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos, em que a sequência de ácidos nucleicos i) é SEQ ID N°: 15 ou 43; e/ou ii) codifica um (poli)péptido com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 16 ou 44.
  4. 4. Ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, compreendendo além disso uma sequência de ácidos nucleicos codificadora para um elemento de marcação ou Tag.
  5. 5. Vector, compreendendo o ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, ou hospedeiro não humano, transformado ou transfectado com um vector deste tipo.
  6. 6. Processo para a preparação de uma molécula de ligação, que é codificada por um ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo cultura do hospedeiro não humano de acordo com a reivindicação 5 sob condições adequadas; e isolamento da molécula de ligação a partir da cultura.
  7. 7. Molécula de ligação, codificada por um ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações 1 a 4; ou preparada com o processo de acordo com a reivindicação 6.
  8. 8. Anticorpo ou fragmento ou derivado de um anticorpo, compreendendo, pelo menos, uma molécula de ligação de 2 acordo com a reivindicação 7, em que o anticorpo é, de um modo preferido, um anticorpo monoclonal.
  9. 9. Composição, compreendendo o ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, o vector de acordo com a reivindicação 5, o hospedeiro de acordo com a reivindicação 5, a molécula de ligação de acordo com a reivindicação 7, e/ou o anticorpo ou fragmento ou derivado de um anticorpo de acordo com a reivindicação 8.
  10. 10. Composição de acordo com a reivindicação 9, que é uma composição farmacêutica e contém eventualmente além disso um suporte farmaceuticamente aceitável, um excipiente farmaceuticamente aceitável ou um agente de diluição farmaceuticamente aceitável, ou que é uma composição de diagnóstico, ou que é um kit, que compreende o ácido nucleico, o vector, o hospedeiro, a molécula de ligação, e/ou o anticorpo ou fragmento ou derivado de um anticorpo, num ou vários recipientes.
  11. 11. Ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, vector de acordo com a reivindicação 5, hospedeiro de acordo com a reivindicação 5, molécula de ligação de acordo com a reivindicação 7, e/ou anticorpo ou fragmento ou derivado de um anticorpo de acordo com a reivindicação 8 para a utilização como medicamento.
  12. 12. Utilização do ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, o vector de acordo com a reivindicação 5, o hospedeiro de acordo com a reivindicação 5, a molécula de ligação de acordo com a reivindicação 7, 3 e/ou o anticorpo ou fragmento ou derivado de um anticorpo de acordo com a reivindicação 8 para a preparação de uma composição de diagnóstico para a análise in vitro da responsividade de um doente relativamente a uma terapia com uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10 . Lisboa, 7 de Novembro de 2013 4
PT58026501T 2004-11-11 2005-11-10 Anticorpo anti-cd28 superagonista PT2171060E (pt)

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