ES2437571T3

ES2437571T3 - Anticuerpos anti-CD28 superagonistas

Info

Publication number: ES2437571T3
Application number: ES05802650.1T
Authority: ES
Inventors: Thomas Hanke; Martin Trischler; Christine Guntermann
Original assignee: Theramab LLC
Current assignee: Theramab LLC
Priority date: 2004-11-11
Filing date: 2005-11-10
Publication date: 2014-01-13
Anticipated expiration: 2025-11-10
Also published as: EP2171060A2; WO2006050949A3; PT2171060E; EP2497829A1; DK2171060T3; WO2006050949A2; EP2171060B1

Abstract

Ácido nucleico, que codifica una molécula de unión, que se une específicamente a una molécula CD28 humana,que comprende a) una secuencia de ácido nucleico que codifica una región VH y una secuencia de ácido nucleico quecodifica una región VL, que comprenden unas CDRs en un armazón de inmunoglobulina humana,realizándose que i) la secuencia de ácido nucleico de la región VH comprende la SEQ ID No.: 33 y/o codifica un(poli)péptido, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 34; y ii) la secuencia de ácido nucleico de la región VL comprende la SEQ ID No.: 35 y/o codifica un(poli)péptido, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 36y b) una secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de un anticuerpo IgG1 o IgG4 humano.

Description

Anticuerpos anti-CD28 superagonistas

El invento se refiere a un ácido nucleico que codifica una molécula de unión, que se une específicamente a una molécula CD28 humana, que comprende

(a): una secuencia de ácido nucleico que codifica una región VH y una secuencia de ácido nucleico que codifica una región VL, que comprenden unas CDRs en un armazón de inmunoglobulina humana y

(b): una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de un anticuerpo IgG1 o IgG4 humano.

La estimulación de los linfocitos T en reposo para la activación, la proliferación y la diferenciación funcional requiere la ocupación de dos estructuras superficiales, a saber los denominados receptores: 1. del receptor de antígenos, que posee una especificidad diferente de una célula a otra, y es necesario para el reconocimiento de unos antígenos, p.ej. de productos víricos de disociación; así como 2. de la molécula CD28 expresada de igual manera en todas las células T en reposo con la excepción de un subconjunto de las células T de CD8 de seres humanos, que se une de un modo natural a unos ligandos situados sobre la superficie de otras células del sistema inmunitario,. Se habla de la estimulación concomitante de la reacción inmunológica específica para antígenos por medio de la CD28. En un cultivo de células se pueden recrear estos procesos mediante la ocupación del receptor de antígenos así como de la molécula CD28 con unos adecuados anticuerpos monoclonales (mAb’s). En el sistema clásico de la estimulación concomitante, ni la ocupación del receptor de antígenos ni la de la molécula CD28 a solas dan lugar a la proliferación de las células T, pero la ocupación de los dos receptores es no obstante eficaz. Esta observación se realizó en células T de un ser humano, de un ratón y de una rata.

No obstante, se conocen también unos mAb's específicos para la CD28, que pueden inducir la proliferación de las células T sin ninguna estimulación concomitante. Una tal activación superagonista, es decir independiente de la ocupación del receptor de antígenos, de los linfocitos T en reposo mediante unos mAb's específicos para la CD28, es conocida a partir de la cita bibliográfica de Tacke y colaboradores, Eur. J. Immunol., 1997, 27:239-247. Según esto, se describieron dos tipos de anticuerpos monoclonales específicos para la CD28 con diferentes propiedades funcionales: unos mAb's concomitantemente estimuladores, que estimulan concomitantemente la activación de células T en reposo solamente en el caso de una simultánea ocupación del receptor de antígenos; y unos mAb's superagonistas, que pueden activar la proliferación de linfocitos T de todas las clases in vitro y en ratas sin ninguna ocupación del receptor de antígenos.

A partir del documento de patente alemana DE 101 60 516.1 así como de la cita bibliográfica de Lühder y colaboradores, J. Exp. Med., 2003, 197: 955-966, se conocen asimismo unos mAb's superagonistas con una especificidad para la molécula CD28 de seres humanos, que activan y expanden muy eficazmente a los linfocitos T in vitro sin ninguna estimulación del receptor de antígenos de las células T (TCR). Aquí se hizo uso, sin embargo, unos anticuerpos inmovilizados, que, tal como se ilustra más abajo, no son apropiados para usos terapéuticos.

Por lo demás, los anticuerpos anti-CD28 superagonistas mostraron, en modelos de animales y en cultivos de células, unas pronunciadas propiedades anti-inflamatorias. Así, por ejemplo, tal como se explica en la cita de Schmidt y colaboradores, J. Neuroimmunol., 2003, 140: 143-152, la utilización de un mAb superagonista dirigido contra la molécula CD28 de una rata puede evitar la formación de una enfermedad neurológica periférica inflamatoria, la neuritis autoimmunológica experimental, EAN. A partir del documento DE 102 12 108.7 así como de la cita de Lin y colaboradores, Eur. J. Immunol., 2003, 33:626-638, se conoce que unos anticuerpos anti-CD28 superagonistas pueden dar lugar a una fuerte activación, superior a la proporcional, de las células T reguladoras. La función de las células T reguladoras consiste en controlar a las células T autoagresivas y procurar que, de un modo general, no se llegue a ninguna reacción inflamatoria excesiva (Schwartz, Nature Immunol., 2005, 6: 327-330) No obstante, una intervención en la estimulación concomitante mediada por la CD28 puede desplazar el equilibrio entre Th1 y Th2 en favor del fenotipo Th1 pro-inflamatorio y alberga por lo tanto el peligro de empeorar unas reacciones autoinmunológicas o inflamatorias (véase más arriba la cita de Schmidt y colaboradores) .

Para los candidatos a constituir unos anticuerpos terapéuticos es digno de pretenderse, por motivos evidentes, evitar la inmunogenicidad, es decir la provocación de una respuesta inmunitaria contra la sustancia activa, con la meta de aprovechar totalmente la eficacia farmacológica en seres humanos, y simultáneamente reducir unos efectos secundarios indeseados. Con el fin de evitar la inmunogenicidad de unos anticuerpos, que no proceden de seres humanos, constituye un estado de la técnica, por ejemplo, la "humanización" de anticuerpos por medio de unos métodos de tecnología genética. En este contexto, se conserva el sitio de unión con antígenos de un anticuerpo que originalmente no procede de seres humanos, mientras que el resto de la molécula de anticuerpo, en particular las porciones constantes del anticuerpo (el dominio constante o el fragmento Fc) se intercambian por una variante estructuralmente similar que procede del material genético humano (Hwang y colaboradores, Methods, 2005, 36:

3-10).

Tal como se conoce a partir del documento DE 102 30 223.5, la reticulación transversal (o reticulación cruzada, en inglés "cross-linking") de unos anticuerpos anti CD28 humana superagonistas refuerza su capacidad de activar a los linfocitos T en una suspensión de células. Por ejemplo, la proliferación de unos linfocitos T purificados es reforzada en un valor múltiplo, cuando se utilizan unos anticuerpos superagonistas en forma de unos complejos moleculares inmovilizados sobre unas bolitas paramagnéticas, en lugar de presentarse en una forma soluble en la suspensión de células T. Para el uso galénico en seres humanos, la aplicación de unas formas de presentación, convertidas en complejos de tal manera, de unos anticuerpos anti CD28 superagonistas no es posible por motivos evidentes. Por lo demás, en el documento DE 102 30 223.5 unos anticuerpos anti IgG de ratón inmovilizados sobre bolitas paramagnéticas pasaron a emplearse como un agente reticulador cruzado. También desde este punto de vista, no entra en cuestión el enfoque análogo para un uso terapéutico en seres humanos, puesto que se prohíbe la utilización de unos anticuerpos anti-IgG humana por causa de la gran cantidad de reacciones cruzadas que se deben de esperar. No en último término, el enfoque descrito en el documento DE 102 30 223.5 está restringido a un procedimiento in vitro, en cuyo caso pasan a emplearse unas células T purificadas. Para el desarrollo de unos anticuerpos anti-CD28 superagonistas terapéuticos se debería comprobar por consiguiente, si existe un adecuado formato de anticuerpo, que haga posible in vivo una reticulación cruzada suficiente, sin conseguir efectos indeseados de ningún tipo.

Es conocido el hecho de que un reconocimiento natural y una reticulación transversal o cruzada de unos dominios Fc de anticuerpos es mediada en el cuerpo humano por unos receptores Fc, que son expresados en diferentes tipos de células (Woof y colaboradores, Nature Reviews Immunol., 2004, 1-11). El objetivo de la unión con anticuerpos, mediada por el receptor Fc en el contexto fisiológico es “retirar de la circulación” o destruir a unas células cargadas con anticuerpos, puesto que se ha de partir del hecho de que los anticuerpos son formados solamente contra las células que proceden de un tejido ajeno, están infectadas por bacterias o virus, estresadas o degenerado malígnamente. Unos importantes mecanismos, mediados por receptores Fc para la eliminación de unas células cargadas con anticuerpos, son la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC acrónimo de Complement Dependent Cytotoxicity), la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC acrónimo de Antibody Dependent Cell Cytotoxicity) y la opsonización, es decir la caracterización para la fagocitosis por medio de unos macrófagos especializados.

Los receptores Fc, que son responsables del reconocimiento de unos dominios Fc de anticuerpos humanos del isotipo IgG, se pueden clasificar en los conjuntos de CD64 (el receptor Fc gamma I; un receptor altamente afín); CD32 (el receptor Fc gamma II; un receptor de afinidad intermedia) y CD16 (el receptor Fc gamma III; un receptor de baja afinidad). Sus propiedades de unión a anticuerpos de los subconjuntos de IgG, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 así como las funciones efectoras provocadas por la unión a estos anticuerpos, son ampliamente conocidas (Woof y colaboradores, Nature Reviews Immunol., 2004, 1-11). Así, la estimulación de unos receptores Fc, que se unen con la IgG1 o respectivamente la IgG4 (la CD64 se une fuertemente con la IgG1, y moderadamente con la IgG4; la CD32 se une débilmente con la IgG1, no se une con la IgG4; la CD16b se une fuertemente con IgG1, se une muy débilmente o no se une con la IgG4), da lugar por regla general también a una eliminación de las células diana a través de una ADCC o CDC.

Resumiendo, por consiguiente, a partir del estado de la técnica es conocido el hecho de que la reticulación cruzada, cuando ella es provocada por unas moléculas presentes en el cuerpo humano, va acompañada predominantemente por una eliminación de las células cargadas con anticuerpos.

El documento DE10230223 A1 divulga la producción de un anticuerpo monoclonal hulgG-5.11, específico para CD28, que es un mAb totalmente humanizado del isotipo IgG4, y se deriva de un mAb procedente de la DSM ACC2530. Las secuencias de estos anticuerpos no fueron divulgadas.

Los documentos de solicitudes de patentes internacionales WO 03/078468A y WO 03/048194A divulgan la región VH y la región VL de un mAb humanizado, que se deriva de un mAb procedente de la DSM ACC2530.

Conforme a ello, la misión en el caso del desarrollo de unos anticuerpos anti-CD8 superagonistas terapéuticos consistió en encontrar un formato de anticuerpo, que por una parte se pueda reticular de manera cruzada en el cuerpo por medio de unas estructuras o moléculas presentes fisiológicamente, por ejemplo unos receptores Fc. Por otra parte, una tal reticulación cruzada no debe de dar lugar a una eliminación o destrucción (esencial) de la estructura diana propiamente dicha del anticuerpo, a saber las células T CD28+. El problema planteado por esta misión es resuelto por las formas de realización puestas a disposición en las reivindicaciones.

De un modo correspondiente, el invento se refiere a un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

El concepto de "ácido nucleico", en conexión con el presente invento, se refiere a una molécula de ácido nucleico o a varias moléculas de ácidos nucleicos, que en su totalidad codifican la molécula de unión conforme al invento. Las

regiones codificadoras para los componentes de la molécula de unión conforme al invento pueden ser abarcadas por consiguiente por una molécula de ácido nucleico o pueden encontrarse en dos o más que dos distintas moléculas de ácidos nucleicos. En particular, las regiones codificadoras para la región VH y la región constante de la cadena pesada de la IgG1 o IgG4 pueden encontrarse en una molécula de ácido nucleico y la región VL y la región constante de la cadena ligera de la IgG1 o IgG4 puede encontrarse en una segunda molécula de ácido nucleico. La región constante de la cadena ligera puede corresponder tanto a la secuencia de un gen κ como también a la de un gen λ, que codifican las regiones constantes de unas cadenas ligeras humanas. De un modo correspondiente al invento, en la molécula de unión, que es codificada por el (los) ácido(s) nucleico(s) conforme(s) al invento, la región VH o respectivamente la región VL está unida funcionalmente con la región constante, tal como se da el caso, por ejemplo, en un anticuerpo. Asimismo, se da por entendido que la(s) cadena(s) codificada(s) de polipéptido(s), después de su síntesis, se pliegan o respectivamente se ensamblan de tal manera que la región VH y la región VL pasan a encontrarse en una vecindad espacial, y forman un sitio de unión con un antígeno. También esto es ejemplificado por un anticuerpo.

El concepto de "comprende" significa por una parte "contiene" (junto a otros objetos) y por otra "se compone de éstos (sin la inclusión de otros objetos). La molécula CD28 es, tal como se ha descrito más arriba, una molécula transmembranal, que es expresada como un homodímero sobre la superficie de las células T. La secuencia de aminoácidos de la CD28 humana puede ser consultada bajo el número de acceso al GenBank (banco de genes) NM_006139.

La expresión "superagonista" describe en el contexto del presente invento una propiedad de las moléculas de unión conformes al invento, que mediante una unión específica o una interacción con un epítopo determinado de la molécula CD28 hacen posible una activación de los linfocitos que es independiente del receptor de antígeno. Por consiguiente, una "estimulación superagonista" corresponde a la activación de las células T CD28+, sin que sea necesaria una estimulación concomitante de la proliferación, es decir otro suceso de unión junto a una unión o interacción del anticuerpo específico para CD28 para la estimulación de la proliferación. Una tal activación puede ser detectada, entre otras maneras, a través de una detección de unos marcadores de la activación sobre las células, la inducción de ciertos factores de la transcripción, a través de una proliferación o de la expresión o segregación de citocinas.

Por el concepto de la activación y/o expansión de las células T se entiende en particular la multiplicación de la actividad metabólica, el aumento del volumen celular, la síntesis de unas moléculas importantes inmunológicamente, tales como CD71 o CD25, y el comienzo de la división celular (la proliferación) como consecuencia de un estímulo externo. De manera preferida, como resultado, después la activación o respectivamente expansión están presentes más células T que antes de ella.

Los conceptos de "región VH" y "región VL" son conocidos por lo general para un experto en la especialidad y describen dentro del estado de la técnica el dominio situado en el extremo terminal de amino de un anticuerpo, que resulta durante la maduración de los linfocitos B mediante una recombinación de los segmentos génicos V, D y J. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos son responsables de la unión o interacción específica de un anticuerpo a o con su epítopo específico (compárese la cita de Haseman y Capra "Immunoglobulins: Structure and Function" [Inmunoglobulinas: estructura y función, en "Fundamental Immunology" (Inmunología fundamental) (compilador de edición W. E. Paul), Raven Press, Nueva York, 2a edición 1989). Las regiones VH y VL pueden ser combinadas mediante unos procedimientos recombinantes también con unas estructuras distintas de las regiones C que se presentan naturalmente.

El concepto de "CDR" (acrónimo de “complementarity determining regions” = regiones determinantes de complementariedad) describe unas regiones, que determinan la complementariedad de los receptores del sistema inmunitario, en particular de anticuerpos y receptores de células T. Éstas son conocidas para un experto en la especialidad como regiones de un receptor, que entran en contacto con el ligando y que determinan la especificidad del receptor. Las CDRs son las partes más variables de los receptores y son responsables de su diversidad. Ejemplos de tales receptores comprenden anticuerpos. En cada caso tres de los bucles se encuentran junto a los extremos distales de los dos dominios variables de anticuerpos. Éstos son numerados por regla general como CDR-H1 hasta CDR-H3 en la cadena pesada y CDR-L1 hasta CDR-L3 en la cadena ligera de los anticuerpos.

La secuencia de aminoácidos de una CDR o de varias CDRs puede ser determinada por un experto en la especialidad a partir de una conocida secuencia de aminoácidos de un anticuerpo, de un fragmento de anticuerpo o de un derivado. Las CDRs más arriba mencionadas han sido determinadas de modo correspondiente al procedimiento de Kabat modificado (combinación de AbM y Kabat). Esto resulta, entre otras, de las reglas "How to identify the CDRs by looking at a sequence" [Cómo identificar las CDRs observando una secuencia], expuestas en la página de internet de Andrew C.R. Martin (http://www.bioinf.org.uk/abs/). Alternativamente, conforme al invento, se pueden utilizar las reglas para la determinación de las CDRs de las moléculas de unión descritas de acuerdo con Kabat (véanse las citas de Kabat E. A., y colaboradores 1991: Sequences of Proteins of Immunological Interest [Secuencias de proteínas de interés inmunológico] (5a edición). Publicación del NIH N ° 91-3242, así como de Johnson, G. y Wu., T. T. 2000, Nucleic Acids Research). En este caso, en las formas de realización conformes al invento son válidas las secuencias de CDRs determinadas según Kabat y que han sido representadas en la Figura 17 así como resaltadas en las Figuras 2 y 6. Esto significa además, que las regiones de armazón (en inglés "framework") se modifican ligeramente, pero sin que se modifique o se deba de modificar la secuencia total de la

5 molécula de unión. Tal como se ha mencionado: las CDRs de las moléculas de unión conformes al invento de acuerdo con el sistema de Kabat, así como también del sistema combinado de AbM y Kabat se han representado en la Figura 17. Por ejemplo, la secuencia de la CDR -H1 de acuerdo con el sistema modificado de Kabat es establecida por la secuencia GYTFTSYYIH, y según el procedimiento habitual de Kabat por la secuencia SYYIH.

10 El concepto de "armazón de inmunoglobulina humana" (en inglés "Immunoglobulin-Framework") describe la totalidad de aquellos segmentos de la secuencia de aminoácidos en el estado plegado, que están situados en la región variable de un anticuerpo humano entre las CDRs así como en los extremos terminales de N y C de éstas, y que preestablecen el armazón espacial (conformación estérica) de la inmunoglobulina.

15 El concepto de "región constante" es conocido para un experto en la especialidad, entre otras, a partir de la obra de Janeway y Travers (Immunologie [Inmunología], 2a edición, Spektrum Akademischer Verlag, véase también la referencia de W. E. Paul, más arriba). Los anticuerpos humanos del isotipo IgG comprenden las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Conforme al invento, en las moléculas de unión pasa a emplearse una región constante de un anticuerpo IgG1 o IgG4 humano. El concepto de "se unen o interactúan con" es definido en el contexto del presente

20 invento como una unión o interacción de un "sitio de unión con antígenos" con un epítopo. El concepto de "sitio de unión con antígenos" define, en coincidencia con el presente invento, un motivo de un polipéptido o de una molécula de unión, que es adecuado para interactuar con un antígeno específico de uno de los conjuntos de antígenos. Una tal unión o interacción específica es definida también como un "reconocimiento específico" de un antígeno. Un reconocimiento específico de un antígeno es, conforme al invento, una unión específica a, o una interacción

25 específica con, por lo menos dos, de manera preferida tres, de manera más preferida por lo menos cuatro, aminoácidos de un antígeno. La parte del antígeno, que se une o interactúa con el sitio de unión con antígenos, es designada como epítopo. El antígeno para las moléculas de unión conformes al invento es la molécula CD28. Esta unión o interacción específica da lugar a la inducción de una señal superagonista (una activación o estimulación) en una célula CD28+. Una unión o interacción específica puede ser descrita también con el "principio de llave y

30 cerradura". Unos motivos específicos en una secuencia de aminoácidos del sitio de reconocimiento de antígenos y del antígeno se unen unos a otros debido a su estructura primaria, secundaria o terciaria.

El concepto de "interacción específica", se entiende dentro del contexto del presente invento en el sentido de que la molécula de unión no reacciona de manera cruzada o no lo hace de un modo no significativo con unos 35 (poli)péptidos, que tienen una estructura similar a la del antígeno reconocido específicamente, y son expresados en las mismas células. La reactividad cruzada de un conjunto de moléculas de unión puede ser investigada p.ej. mediante la determinación de las propiedades de unión y de las fuerzas de unión en condiciones usuales (véanse, entre otras, las obras de Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual [Anticuerpos: un manual de laboratorio], Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; y Using Antibodies: A Laboratory Manual [Uso de anticuerpos: un

40 manual de laboratorio], Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999). Por la definición de "unión o interacción con" son abarcados explícitamente también los epítopos de conformación, los epítopos estructurales y los epítopos discontinuos, que se componen de dos o más regiones de un antígeno (los restos de diferentes regiones de una o varias cadenas de polipéptidos) y un "epítopo natural" (véanse las citas de Sela, (1969) Science, 166, 1365 y de Laver, (1990) Cell 61, 553-6).

45 El concepto de "reticulación cruzada o reticulación transversal" describe el establecimiento de una proximidad espacial entre varias moléculas de unión, que están unidas a, o interactúan con, el antígeno específico, con lo cual se llega a una unión multivalente con la molécula diana (epítopo específico) CD28. En el caso de las moléculas de unión conformes al invento se prefiere una reticulación cruzada o una reticulación transversal a través del fragmento

50 Fc del anticuerpo IgG humanizado. Esto se puede conseguir p.ej. mediante una unión de este fragmento con los receptores Fc en linfocitos u otras células. Las moléculas de unión conformes al invento (que son codificadas por los ácidos nucleicos conformes al invento) tienen la sorprendente propiedad de que las células CD28+ pueden ser activadas o estimuladas por unas moléculas de unión reticuladas de manera cruzada, sin ser eliminadas.

55 El concepto de "molécula de unión" se utiliza en conexión con el invento para la descripción de un conjunto de moléculas, que pueden aparecer tanto como unos monómeros, como también como unos di-, tri-u oligómeros. Los di-, tri- u oligómeros pueden ser tanto unos homómeros, como también unos heterómeros. De manera preferida, las cadenas individuales de los di-, tri-u oligómeros están unidas entre sí por enlaces covalentes. En particular, en este contexto se prefieren unos enlaces covalentes a través de unos puentes de disulfuro. Alternativamente, los di-, tri-u

60 oligómeros pueden ser unidos también a través de unas interacciones no covalentes. Unas correspondientes di-, triu oligomerizaciones pueden producirse p.ej. por medio de unas interacciones de unos motivos específicos de secuencias en las moléculas individuales. Un ejemplo de una tal interacción intrínseca es la interacción de monómeros a través de un "motivo cremallera de leucina", que da lugar a una dimerización.

Como punto de partida para las moléculas de unión CD28 superagonistas conformes al invento sirvió el anticuerpo anti CD28 humana de ratón 5.11A1, descrito en la cita de Luhder y colaboradores, J. Exp. Med., 2003, 197: 955-966. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 5.11A1 fueron humanizadas por tecnología genética de un modo correspondiente al estado de la técnica. Esta técnica es conocida para un experto en la especialidad, entre otras, como "injerto de CDR" (en inglés "CDR-grafting") (véanse las citas de P. T. Jones y colaboradores, 1986, Nature 321: 522-525 así como Ewert y colaboradores, 2004, Methods, 34: 184-199). Las regiones variables humanizadas fueron fusionadas con la región constante de unos anticuerpos humanos del isotipo IgG.

Es conocido el hecho de que para el empleo terapéutico se adecuan en principio todos los isotipos de IgG (IgG1-4). Como es conocido, la gran mayoría de los anticuerpos, que se encuentran en desarrollo terapéutico posee un principio de acción neutralizadora, bloqueadora o destructora (negativo), y se diferencian de este modo fundamentalmente del principio de acción superagonista (positivo) que se pretende conseguir aquí. La elección conforme al invento de los isotipos Ig1 e Ig4 como unos formatos terapéuticos de anticuerpos anti-CD28 superagonistas se basa en las siguientes consideraciones y en los siguientes hallazgos experimentales sorprendentes: la base del principio conforme al invento es la elección de unos fragmentos Fc del isotipo IgG1 o respectivamente IgG4. Los anticuerpos IgG1 se pueden reticular transversalmente de manera eficaz por medio de unos receptores Fc, que están presentes en el cuerpo. Esto debería ser propicio para el principio de acción superagonista (véase también la cita de Evans y colaboradores, Nature Immunol., 2005, 6: 271-279). En el sentido opuesto se manifestaba el hecho de que se podía esperar que una tal reticulación transversal condujese a una eliminación de las células T, lo que se opondría al deseado principio de acción, o respectivamente que se debería de esperar que el deseado principio de acción fuese desbaratado por esta eliminación. En el caso del isotipo IgG4, conforme al estado de la técnica, se podía esperar que este isotipo se opusiese a la actividad deseada. Para éste se describió p.ej. un efecto provocador de una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); véase la cita de Isaacs y colaboradores, Clin. Exp. Immunol., 106: 427-433. Además de ello, a causa de la ausencia de una unión

o de la muy pequeña unión con el receptor Fc, que era de esperar, no se podía partir del hecho de que este isotipo favoreciese una activación de células T, por ejemplo en un cultivo de leucocitos de sangre periférica.

Después de la puesta a disposición de las moléculas de unión conformes al invento se comprobó sorprendentemente que éstas estimulan de un modo superagonista a las células T. Este hecho se ha puesto de manifiesto para los anticuerpos de los isotipos IgG1 (TGN1112) e IgG4 (TGN1412) en los Ejemplos adjuntos y en los resultados experimentales representados en las Figuras 1 hasta 8. Las cadenas pesada y ligera de TGN1412 se han representado respectivamente en las SEQ ID No: 14 y 16. La SEQ ID No: 30 y 32 muestran las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de TGN1112. Tal como se puede deducir de las Figuras 1 hasta 8, tanto las cadenas ligeras como también las cadenas pesadas de los anticuerpos TGN1112 y TGN1412 son sintetizadas primeramente con un péptido de señal (que en las Figuras se designa como péptido director). El péptido de señal determina la dirección a un objetivo dentro de la célula y ya no está presente en la cadena ligera madura o respectivamente en la cadena pesada madura. En lo que respecta a la cadena pesada de TGN1412 se ha de señalar todavía, que en el caso de la expresión en células CHO se observaron dos variantes del extremo terminal de C, que se diferencian en un adicional resto de aminoácido (Fig. 2). Las secuencias de ADN, inclusive los intrones y las UTRs (acrónimo de "Untranslated Regions" = regiones no traducida) y la región que codifica el péptido de señal se han expuesto para las cadenas pesada y ligera de TGN1412 en las SEQ ID No.: 41 y 43; para las cadenas pesada y ligera de TGN1112 éstas se han expuesto en las SEQ ID No: 45 y 47. Las secuencias de aminoácidos codificadas por éstas se han representado en las SEQ ID No.: 42, 44, 46 y 48.

En una forma preferida de realización, el presente invento pone a disposición por consiguiente los anticuerpos anti-CD28 solubles TGN1412 y TGN1112 para la estimulación policlonal de los linfocitos T, CD4 y CD8 humanos, de un modo nuevo e independiente del TCR. Fue inesperado el hallazgo de que los TGN1412 y TGN1112, en una forma soluble, activan y expanden ex vivo a los linfocitos T de una manera muy eficiente. Este hallazgo fue sorprendente en particular para el TGN1412, puesto que, por una parte, la reticulación transversal del anticuerpo es necesaria para el principio de acción superagonista, pero, por otra parte, no era detectable ninguna unión a receptores Fc con una afinidad alta o intermedia. Para el TGN1112 este hallazgo fue sorprendente, puesto que el anticuerpo media en un cultivo de células por una citotoxicidad dependiente de anticuerpos fuertemente pronunciada frente a las células T (Fig. 16), pero simultáneamente, induce una proliferación muy fuerte (Fig. 10A). Frente al anticuerpo de partida 5.11A1, tanto el TGN1412 como también el TGN1112 se distinguen por el hecho de que ellos están en situación de mantener la muerte celular (apoptosis) inducida por la activación de los linfocitos T humanos a un nivel muy bajo en un cultivo de células (Fig. 15). Este resultado pone en consideración que, también en un ser humano, los TGN1412 y TGN1112 deberían de estar en situación de activar y expandir a los linfocitos T de un modo muy efectivo y moderado.

El ácido nucleico conforme al invento comprende además de manera preferida una secuencia de ácido nucleico, siendo la secuencia de ácido nucleico

(i): la SEQ ID No.: 13, 29, 41 o 45; y/o siendo copiado

(ii): un polipéptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 13, 30, 42 o 46.

Asimismo, se prefiere un ácido nucleico, que comprende una secuencia de ácido nucleico, siendo la secuencia de ácido nucleico

(i): la SEQ ID No.: 15 ó 43; y/o siendo copiado

(ii): un polipéptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 16 o 44.

Además de ello, un objeto preferido del invento que un ácido nucleico conforme al invento consiste en que una secuencia de ácido nucleico ha de comprender adicionalmente una secuencia de ácido nucleico, que codifica un elemento marcador o una marca (en inglés "Tag").

El concepto de "elemento marcador" o "marca" describe, en conexión con el invento, un elemento, que media en la capacidad para la interacción con un conocido partícipe en la unión. Esta interacción, por su parte, abre nuevos usos tales como una purificación (facilitada) o un aislamiento así como una detección o comprobación.

Los elementos marcadores o las marcas conformes al invento se pueden escoger, a modo de ejemplo, entre un conjunto, que se compone de las His-tag, Flag-tag, Myc-tag, HA-tag, GST-tag, T100TM, VSV-G, V5, S-tagTM, HSV, CFP, RFP, YFP, GFP, BFP, el dominio de fijación de celulosa (CBD, acrónimo de "Cellulose binding domain"), la proteína de fijación de maltosa (MBP, acrónimo de "Maltose binding protein"), NusA-tag, tiorredoxina (Trx), DsbA, DabC y una secuencia de biotinilación. Alternativamente a esto o respectivamente en particular el elemento marcador puede ser una marcación radiactiva, fluorescente, fosforescente o luminiscente. Las marcaciones radiactivas incluyen unas marcaciones con 32P (en el caso de ácidos nucleicos) y con 125I ó 132I (en el caso de proteínas).

En una forma alternativa de realización, el presente invento se refiere a un vector que comprende uno o varios de los ácidos nucleicos conformes al invento más arriba descritos.

Para un biólogo molecular como experto en la especialidad son conocidos un gran número de vectores adecuados. La elección de un vector depende en este contexto de las propiedades deseadas e incluye plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores utilizados convencionalmente en la tecnología genética. Para la producción de diferentes vectores se pueden utilizar unos procedimientos conocidos de un modo general; véanse, entre otras, las citas de Sambrook y colaboradores Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación molecular: un manual de laboratorio]; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edición de 1989 y 3a edición de 2001; Gerhardt y colaboradores; Methods for General and Molecular Bacteriology [Métodos de bacteriología general y molecular]; ASM Press, 1994; Lefkovits; Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques [Manual de métodos de inmunol.ogía: El libro fuente amplio de técnicas]; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual [Interacciones de proteína con proteína: Un manual de clonación molecular]; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002 y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos usuales en la biología molecular], Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994).

Las secuencias de nucleótidos que deben de ser expresadas pueden ser clonadas en unos adecuados vectores de expresión. Unos usuales vectores de clonación comprenden los pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 y pGBT9. Unos usuales vectores de expresión comprenden, entre otros, los pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT, pKNOH2 y pLNOK (Norderhaug y colaboradores, 1997. J. Immunol. Methods, 204: 77-87).

Un vector conforme al invento comprende usualmente una "secuencia reguladora", que está unida funcionalmente con las secuencias de nucleótidos que deben de ser expresadas. El concepto de "secuencia reguladora" describe a unas secuencias de ADN, que son necesarias para iniciar la expresión de una secuencia codificada. Las propiedades de tales secuencias de control se diferencian en dependencia de un organismo anfitrión. El concepto de "unidas funcionalmente" describe una disposición, en la que los mencionados componentes están dispuestos de un modo adecuado para la expresión. La disposición adecuada es conocida para un experto en la especialidad.

De manera preferida, el vector descrito es un vector de expresión. Un vector de expresión es una construcción artificial, que es apropiada para la transformación de un anfitrión escogido y que hace posible una expresión de la secuencia codificada en el anfitrión. Los vectores de expresión pueden ser de un modo correspondiente unos vectores de clonación, unos vectores binarios o unos vectores integrados. La expresión comprende la transcripción del ácido nucleico, de manera preferida en un ARNm traducible. Unos elementos reguladores, que garantizan una expresión en células procarióticas y/o eucarióticas, son conocidos para un experto en la especialidad. Las secuencias de control para los procariotas comprenden por lo general un promotor, un sitio de unión ribosómico y un terminador. Unos posibles elementos reguladores para anfitriones procarióticos comprenden p.ej. los promotores de PL, lac, trp o tac procedentes de E. coli. Unas secuencias de control para células eucarióticas comprenden por lo general unos promotores y terminadores y en determinadas circunstancias unos intensificadores, transactivadores o sitios de unión para factores de la transcripción. Los promotores garantizan una iniciación de la transcripción. Los terminadores, tales como unas señales de poliA, garantizan una terminación de la transcripción y una estabilización del transcrito. Unos ejemplos de elementos reguladores para células anfitrionas eucarióticas son p.ej. el promotor de

AOX1 o GAL1 para levaduras, o los promotores de CMV, de SV40, de RSV (acrónimo de "Rous Sarcoma Virus"), el intensificador de CMV, el intensificador de SV40 o un intrón de globina para células de mamíferos u otras células de animales. En este contexto, unos vectores de expresión conocidos a partir del estado de la técnica comprenden, entre otros, unos vectores tales como el vector de expresión de ADNc de Okayama-Berg pcDV1 (de Pharmacia), los pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (de InVitrogen), pEF- DHFR y pEF-ADA (Raum y colaboradores Cancer Immunol Immunother (2001) 50 (3), 141- 150) , pSPORT1 (GIBCO BRL), así como pKNOH2 y pLNOK (Norderhaug y colaboradores, 1997. J. Immunol. Methods, 204: 77- 87) .

El concepto de "secuencia de control" se utiliza como una descripción de todas las secuencias necesarias para una expresión en un anfitrión escogido y puede comprender por consiguiente otros componentes.

Con el invento, un anfitrión puede ser producido, transformado o transfectado con un vector más arriba descrito.

Este anfitrión puede ser un procariota o de manera preferida una célula eucariótica. El concepto de "anfitriones procarióticos" comprende en el contexto del invento todas las eubacterias y arqueobacterias, que pueden ser transformadas con los ácidos nucleicos. Este conjunto comprende por consiguiente unas bacterias gram-negativas así como unas bacterias gram-positivas, tales como p.ej. E. coli., S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. Las células eucarióticas comprenden, entre otras, las de levaduras, células de plantas superiores, insectos y, de manera preferida, células de mamíferos, tales como las células CHO, COS-7, NS0 y Per.C6.

El invento se refiere además a un procedimiento para la producción de esta molécula de unión, que es codificada por uno o varios de los ácidos nucleicos más arriba descritos, el cual comprende la cultivación del anfitrión en unas condiciones adecuadas; y el aislamiento de la molécula de unión a partir del cultivo.

El anfitrión transformado o transfectado puede ser cultivado en un fermentador. Los protocolos para una cría o cultivación de diferentes anfitriones son conocidos para un experto en la especialidad. Éstos pueden ser determinados y optimizados sin otra actividad inventiva. Asimismo, un experto en la especialidad conoce unos procedimientos para el aislamiento de un (poli)péptido recombinante tal como de la molécula de unión conforme al invento a partir de un cultivo o respectivamente de un material sobrenadante del cultivo. Tales procedimientos de aislamiento comprenden entre otros procesos, una precipitación con sulfato de amonio, unas purificaciones por afinidad (p.ej. con ayuda de unas columnas de cromatografía), una electroforesis en gel y otros similares: véanse, entre otras, las obras de Scopes, "Protein Purification" [Purificación de proteínas], editorial Springer, N.Y. (1982) o Rehm, "Der Experimentator: Proteinbiochemie/Proteomics" [El experimentador: bioquímica de proteínas/proteómica], Spektrum, Akademischer Verlag. Unas preparaciones esencialmente puras de moléculas de unión con una homogeneidad de 90 a 95 %, de manera preferida de 98 a 99 %, o todavía más alta, son preferidas para las utilizaciones farmacéuticas.

En otra forma de realización, el invento se refiere a una molécula de unión, que ha sido codificada por un ácido nucleico conforme al invento o por varios ácidos nucleicos conformes al invento, o que ha sido producida con el procedimiento conforme al invento.

Se prefieren unos anticuerpos o fragmentos o derivados de un anticuerpo, que corresponden a una molécula de unión conforme al invento o que pueden contener a ésta.

Los fragmentos de anticuerpos abarcan, en el sentido del invento, unos fragmentos de los anticuerpos precedentemente descritos, que a la vez comprenden las propiedades específicas de unión de las regiones variables definidas, así como también disponen de una parte de la región constante de un anticuerpo IgG1 o IgG4, que hace posible una reticulación cruzada.

Los derivados de anticuerpos conformes al invento abarcan, pero no están restringidos a, unos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos marcados, así como también unos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos modificados químicamente. La marcación o modificación de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos puede efectuarse posteriormente a la traducción o mediante una modificación química o bioquímica o de biología molecular. Estas modificaciones comprenden p.ej. una modificación de la glicosilación (Umana y colaboradores, 1999, Nature Biotech.

17: 176-180) y una PEGilación (Delgado y colaboradores, 1996. J. Drug Target. 3: 321-340).

De manera preferida, el anticuerpo conforme al invento es un anticuerpo monoclonal.

En una forma alternativa de realización, el invento se refiere a una composición, que comprende el ácido nucleico conforme al invento, un vector conforme al invento, un anfitrión, una molécula de unión y/o el anticuerpo o un fragmento o derivado de un anticuerpo.

Se prefiere que la composición conforme al invento sea una composición farmacéutica. Eventualmente, ésta puede contener, además de ello, un vehículo farmacéuticamente compatible, un excipiente farmacéuticamente compatible

o un agente de dilución farmacéuticamente compatible:

Una composición farmacéutica conforme al invento comprende, entre otras cosas, unos medicamentos y unas formulaciones medicamentosas. Ejemplos de unos adecuados vehículos o excipientes y agentes de dilución compatibles desde el punto de vista farmacéutico o farmacológico son conocidos para un experto en la especialidad. Éstos comprenden unas soluciones tamponadas de cloruro de sodio, agua, unas emulsiones tales como p.ej. emulsiones del tipo de aceite y agua, diferentes tipos de detergentes, soluciones estériles, etc. Unos medicamentos, que comprenden tales vehículos, pueden ser formulados mediante unos métodos convencionales conocidos. La composición farmacéutica conforme al invento puede ser administrada a un individuo en una dosis adecuada. La administración se puede efectuar por vía parenteral, p.ej. por vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, local, intranasal, intrabronquial o intradérmica, o a través de un catéter en un cierto lugar en una arteria. El modo de la dosificación es determinado por el médico que efectúa el tratamiento de un modo correspondiente a los factores clínicos. Para un experto en la especialidad es conocido el hecho de que el tipo de la dosificación depende de diferentes factores, tales como p.ej. el tamaño corporal o respectivamente el peso, la superficie corporal, la edad, el sexo o la salud en general del paciente, pero también del agente que debe de ser administrado especialmente, de la duración y del tipo de la administración, y de otros medicamentos, que posiblemente pueden ser administrados en paralelo. Una dosis típica puede estar situada p.ej. en un intervalo comprendido entre 0,001 y 500.000 μg, siendo concebibles unas dosis situadas por debajo o por encima de este intervalo ejemplificativo, sobre todo tomando en consideración los factores más arriba mencionados. Por lo general, en el caso de una administración regular de la composición conforme al invento, la dosis se debería encontrar en un intervalo comprendido entre unas unidades de 10 ng y 10 mg por día o respectivamente por intervalo de aplicación. Si la composición debiese de ser administrada por vía intravenosa, la dosis debería encontrarse en un intervalo comprendido entre unas unidades de 1 ng y 1 mg por kilogramo de peso corporal por minuto.

La composición farmacéutica conforme al invento puede ser administrada por vía local o sistémica. Las formulaciones para una administración por vía parenteral comprenden unas soluciones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas, estériles. Ejemplos de unos disolventes no acuosos son propilenglicol, un poli(etilenglicol), unos aceites vegetales tales como p.ej. aceite de oliva, y unos compuestos de ésteres orgánicos tales como p.ej. oleato de etilo, que son adecuados para inyecciones. Unos vehículos acuosos comprenden agua, unas soluciones acuoso-alcohólicas, unas emulsiones, unas suspensiones, unas soluciones salinas y unos medios tamponados. Los vehículos parenterales comprenden soluciones de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato de Ringer y aceites fijados. Unos vehículos intravenosos comprenden p.ej. agentes de complemento líquidos, nutritivos y de electrólitos (tales como p.ej. los que se basan en la dextrosa de Ringer). La composición conforme al invento puede comprender además de ello unos agentes conservantes y otros aditivos, tales como p.ej. unos compuestos antimicrobianos, antioxidantes, agentes formadores de complejos y gases inertes, y/o unas sustancias que favorecen la solubilidad, tales como por ejemplo el Tween. Por lo demás, en dependencia de la utilización pretendida, pueden estar contenidos unos compuestos tales como p.ej. interleucinas, factores de crecimiento, factores de la diferenciación, interferones, proteínas quimiotácticas o un agente inmunomodulador inespecífico.

Alternativamente, se prefiere que la composición conforme al invento sea una composición de diagnóstico.

Asimismo, se prefiere que la composición conforme al invento sea un estuche, que comprende el/los ácido(s) nucleico(s), el vector, el anfitrión, la molécula de unión y/o el anticuerpo o un fragmento o un derivado de un anticuerpo, en uno o varios recipientes. De manera aún más preferida, este estuche comprende un folleto informativo. Éste puede comprender una descripción del estuche, de sus componentes y/o de su utilización. La descripción de la utilización puede comprender además de ello unas instrucciones de dosificación para un médico.

En una forma de realización, el invento se refiere a la utilización del/de los ácido(s) nucleico(s) conforme(s) al invento, del vector conforme al invento, del anfitrión conforme al invento, de la molécula de unión conforme al invento y/o del anticuerpo conforme al invento o de un fragmento o derivado de un anticuerpo conforme al invento para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de enfermedades, que van acompañadas por una estimulabilidad concomitante, una funcionalidad o un número de células T errónea/o o deficiente, de enfermedades inflamatorias y/o enfermedades autoinmunitarias.

El invento se adecua para un procedimiento destinado al tratamiento de unas enfermedades, que van acompañadas por una estimulabilidad concomitante, una funcionalidad o un número de células T errónea/o, de enfermedades inflamatorias, y/o de enfermedades autoinmunológicas, que comprende la administración del/de los ácido(s) nucleico(s) conforme(s) al invento, del vector conforme al invento, del anfitrión conforme al invento, de la molécula de unión conforme al invento, y/o del anticuerpo conforme al invento o de un fragmento o derivado de un anticuerpo conforme al invento.

Se prefieren las utilizaciones y los procedimientos en el caso de que las enfermedades, que van acompañadas por una estimulación concomitante, una funcionalidad o un número de células T errónea/o, se escogen entre el conjunto que se compone de la leucemia crónicamente linfocitaria del tipo de células B (B-CLL), la leucemia linfoblástica aguda (ALL), la linfopenia T, unos tumores sólidos, una infección causada por el HIV (virus de la inmunodeficiencia humana) y una infección causada por el HLTV (virus linfotrópico de células T humanas). Los tumores sólidos se escogen de manera preferida entre los carcinomas de riñón, los carcinomas de pulmón y los melanomas.

5 Se prefieren alternativamente ciertas/os utilizaciones y procedimientos, escogiéndose las enfermedades inflamatorias y autoinmunológicas entre el conjunto que se compone de artritis reumatoide (RA), diabetes mellitus del tipo I, esclerosis múltiple, psoriasis, síndrome de Guillain -Barré, enfermedad de Crohn, y unas enfermedades, que se deben de atribuir a unas reacciones indeseadas de activación de las células T tales como la enfermedad del injerto frente al anfitrión (GvHD, acrónimo de "graft versus host disease") o la enfermedad del anfitrión frente al

10 injerto (HvGD, acrónimo de "host versus graft disease"). En el caso de las HvGDs, se toma especialmente en consideración el rechazo de unos trasplantes de órganos sólidos, tales como los de hígado, pulmón, corazón y riñón.

En otra forma alternativa de realización, el invento se refiere a la utilización del/de los ácido(s) nucleico(s) conforme(s) al invento, del vector conforme al invento, del anfitrión conforme al invento, de la molécula de unión

15 conforme al invento y/o del anticuerpo conforme al invento o de un fragmento o derivado de un anticuerpo para la preparación de una composición de diagnóstico destinada al análisis in-vitro de la capacidad de respuesta de un paciente a una terapia con una composición farmacéutica.

Un análisis realizable in-vitro con esta composición de diagnóstico comprende por ejemplo las siguientes etapas: 20

(a) el aislamiento de células sanguíneas a partir de una muestra de sangre (p.ej. de PBMCs, acrónimo de “peripheral blood monocellular cells” = células mononucleares procedentes de sangre periférica", y/o linfocitos);

(b) la incubación de células sanguíneas con un anticuerpo conforme al invento y eventualmente la adición 25 de un reactivo exógeno de reticulación cruzada;

(c) la detección de una estimulación dependiente de anticuerpos de las células T en la muestra. Si se detecta una estimulación dependiente de anticuerpos de las células T en la muestra, entonces el paciente, del que procede la muestra, es capaz de responder a una terapia con una composición farmacéutica conforme al invento.

30 Las Figuras muestran:

Las Figuras 1-8: muestran las secuencias de nucleótidos o respectivamente de aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas de TGN1412 y TGN1112. 35

En la Figura 9: la especificidad de unión de los anticuerpos TGN1412 y 5.11A1 para la CD28 en células Jurkat transfectadas y en células T primarias humanas. Para las tinciones de inmunofluorescencia y la citometría de flujo pasante se incubaron en cada caso 1 -2 x 106 células/ml en un tampón para FACS (acrónimo de "Fluorescence Activated Cell Sorting" = clasificación de células activada por

40 fluorescencia) (PBS, BSA, aziduro de Na) con unas cantidades saturadoras de los anticuerpos 5.11A1 y TGN1412 unas cantidades irrelevantes de unos anticuerpos testigos específicos para un isotipo, durante 40 minutos a 4°C. Las tinciones se lavaron, con el fin de eliminar los anticuerpos en exceso, y antes del análisis se incubaron durante 15 minutos con unas cantidades saturadoras de una IgG anti-ratón conjugada con PE (para el 5.11A1) o respectivamente de una IgG anti

45 humano conjugada con PE (para el TGN1412). Las células se contratiñeron a continuación con anticuerpos anti-CD4. El análisis por citometría de flujo pasante se efectuó en un FACSCaliburTM con ayuda del software Cell QuestTM (de Becton Dickinson). Las señales de fluorescencia y de disipación lateral (ssc, acrónimo de “side-scatter”) se registraron logarítmicamente, y las señales de disipación hacia adelante (fsc, acrónimo de "forward scatter") se registraron linealmente. Los

50 histogramas muestran sin excepción unas señales de células, que están situadas en una puerta vital (en inglés "life-gate") empírica, definida por ssc y fsc. Ellas muestran la unión del 5.11A1 o del TGN1412 (curvas rellenadas) en comparación con los anticuerpos testigos de isotipo (curvas abiertas) en células Jurkat, que no expresan ninguna CD28 (gráfico izquierdo) o que respectivamente habían sido transfectadas con CD28 (gráficos centrales), así como en células

55 mononucleares procedentes de sangre periférica, positivas en cuanto a CD4 (PMBC, gráfico derecho).

En la Figura 10: la obtención de células y los ensayos de proliferación. Unas PBMC se aislaron mediante una centrifugación por densidades de Ficoll a partir de una sangre periférica recientemente obtenida o 60 respectivamente a partir de unos revestimientos leucocitarios anteados (en inglés "buffy coats"), se lavaron y se llevaron a cultivo en una concentración de 2 x 105 células por cada pocillo con una capacidad de 200 μl en unas placas de fondo redondo de 96 pocillos. De un modo correspondiente a las leyendas, ellas fueron cultivadas con un TGN1112, un TGN1412, un 5.11A1 o unos anticuerpos testigo de isotipo todos ellos solubles, en una concentración de 1 μg/ml (A) o de un

modo correspondiente a la leyenda situada junto a las abscisas (B). Después de 48 horas se

determinó la velocidad relativa de proliferación celular -representada como el valor medio en

cómputos por minuto ± la desviación típica ("mean cpm ± SD") -mediante una incorporación de [metil3H]timidina a lo largo de un período de tiempo de 18 horas y una subsiguiente medición de la

5: escintilación en un líquido. Los resultados son representativos para múltiples determinaciones con

diversos donantes.

La Figura 11:: la obtención de las células, la estimulación de las PBMC y la preparación fueron tal como se ha

descrito para la Figura 10. La estimulación por el TGN1112 se comparó con la de unos fragmentos

10: F(ab)2 de TGN1112, cuya calidad bioquímica y cuya unión específica a unos transfectantes de

CD28 se habían mostrado previamente.

La Figura 12:: la estimulación de unas células T CD4 y CD8 por el TGN1412. (A) Unas PBMC (acerca de la

obtención y de las condiciones de cultivo véase la Figura 10) fueron estimuladas con el TGN 1412

15: (1 μg/ml) o respectivamente con un anticuerpo testigo de isotipo durante los períodos de tiempo

indicados. El estado del ciclo celular para las células CD4 o respectivamente CD8 fue determinado

por tinción intracelular por medio de un anticuerpo anti-Ki-67 marcado con FITC. Para esto, unas

20: células fueron incubadas con unos anticuerpos anti-CD4 PE humana o respectivamente anti-CD8 PE humana durante 15 minutos, lavadas e incubadas en el tampón Cytofix/CytopermTM (de Becton Dickinson) durante 20 minutos a 4°C. Después de un lavado con el tampón Perm/WashTM (de

Becton Dickinson), las células fueron teñidas durante otros 30 minutos a 4°C con anti-K-67-FITC,

lavadas y ensayadas por citometría de flujo pasante tal como se ha descrito para la Figura 9.

(B) Unas células T CD4+ o respectivamente CD8+ fueron obtenidas a partir de una suspensión de

25: PBMC con ayuda de un adecuado estuche de aislamiento de células T y una subsiguiente separación con el AutoMACSTM (los dos de Miltenyl). La pureza comprobada por citometría de flujo

pasante fue de 93-98 % para las células T CD4+ y de 81-95 % para las células T CD8+. Unas

placas de fondo plano de 96 pocillos fueron revestidas con una Ig anti-humana (40 μg/ml en PBS)

durante 3 h a la temperatura ambiente y a continuación lavadas. Las células fueron cultivadas a continuación en una densidad de 1 x 105 / pocillo en común con el TGN1412 o con un anticuerpo

30: de referencia. Como testigo positivo de la proliferación celular sirvió la adición de PHA (5 μg/ml) y

de IL-2 (200 U/ml). La proliferación se determinó después de 48 horas tal como se ha descrito para

la Figura 10 y constituye un resultado representativo para diversos donantes.

La Figura 13: el análisis del repertorio TCR de unas PBMC estimuladas con el TGN1412. El análisis del

35: repertorio TCR V [beta] de unas PBMC, que habían sido cultivadas durante 96 horas con el

TGN1412 (1 μg/ml) o respectivamente con un anticuerpo testigo IgG4, se efectuó con ayuda del repertorio V [beta] de IOTest® Beta Mark TCR, KitTM (de Beckman Coulter) según los datos del

fabricante. Las muestras fueron contrateñidas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD4 tal como se ha

descrito para la Figura 9. Se representa un resultado representativo de tres determinaciones, en

40: cuyos casos la ventana de análisis se ajustó a unas células CD3+ CD4+.

La Figura 14: la medición de la apoptosis de células T mediada por anti-CD28. Unas PBMC (2 x 105/ml) fueron

incubadas con 5.11A1, TGN1412, TG1112 o anticuerpo testigo de isotipo, todos ellos solubles (1

μg/ml) durante 72 horas. A continuación, las células fueron teñidas durante 15 minutos con APC

45: anti-CD3 y fueron lavadas con un tampón para FACS. Las PBMC fueron resuspendidas en un

tampón de fijación de anexina V (de BD Pharmingen) e incubadas con anti-anexina V y 7AAD

durante 15 minutos. La apoptosis en el sentido de las células T (ventana CD3+), que eran

positivas en cuanto a anexina V y permeables para 7AAD, se determinó mediante una citometría

de flujo pasante en el transcurso de 1 hora.

50

La Figura 15:: la inducción del receptor pro-apoptótico CD95 mediante unos anticuerpos anti-CD28. La estructura

del ensayo corresponde a la que se ha descrito en la Figura 14. En lugar de la tinción con anexina

V y 7AAD, unas PBMC se tiñeron con anti-CD3 FITC y CD95-PE, y se determinó la expresión de

CD95 en células T CD3+ mediante una citometría de flujo pasante. Se muestra un resultado

55: ejemplificativo para dos donantes diferentes.

La Figura 16:: la inducción de una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, ADCC. La ADCC de diversos anticuerpos anti-CD28 se determinó mediante una citometría de flujo pasante. Para esto, 5x104

células Jurkat CD28+ marcadas con calceína-AM se cultivaron concomitantemente con unas

60: PBMC recientemente aisladas en presencia de 6 μg/ml de los anticuerpos indicados en el caso de

las representadas relaciones de efector : células diana (E : T) durante 3,5 horas. Las células se

recogieron en el tampón para FACS con 0,5 μg/ml de yoduro de propidio y se midieron por una

citometría de flujo pasante. La relación de las células negativas para calceína o de las células

débilmente positivas para calceína a las células positivas para yoduro de propidio (x100) 1 / a las

células positivas para calceína totales se determinó como la proporción porcentual de citotoxicidad. Se muestra un resultado representativo de unas determinaciones con células de diferentes donantes.

5 La Figura 17: muestra las CDRs de las moléculas de unión conformes al invento según el sistema Kabat y el sistema combinado de AbM y Kabat.

Los Ejemplos ilustran el invento. Los Ejemplos no deben de ser considerados como una restricción del invento. Los Ejemplos se adjuntan solamente para la ilustración del invento y el invento es restringido solamente por las 10 reivindicaciones.

Ejemplo 1: Propiedades de unión de los anticuerpos conformes al invento con CD28, CD16b, CD32 y CD64

Se investigó si en el caso del proceso de humanización permaneció conservada la unión con la molécula CD28 de 15 seres humanos. Tal como se ha mostrado para el TGN1412 a modo de ejemplo en la Fig. 9, éste era el caso para los dos isotipos.

A continuación, se determinaron las propiedades de unión de los TGN1412 y TGN112 con las CD16b, CD32 y CD64. Los resultados se han recopilado en la Tabla 1. Como era de esperar se puso de manifiesto que el TGN1112 20 se une con una afinidad bien detectable con las CD16 y CD64, pero no con la CD32, mientras que el TGN1412 interactuaba sólo débilmente y de manera exclusiva con la CD64.

Tabla 1: Propiedades de unión de los TGN1412 y TGN1112 con receptores Fc gamma humanos.

FCγR: TGN1112 TGN1412

CD16b: + -

CD32: - -

CD64: ++ +

Leyenda: - no detectable + unión media + unión fuerte

25 Tabla 1: La unión de los TGN1412 y TGN1112 con el FcγRIIIb (CD16b) se midió mediante un ELISA (= ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas), sirviendo una CD16b recombinante humana (de R&D Systems) como "antígeno de captura" (en inglés "capture antigen"). La interacción entre la CD16b y el TGN1112 se detectó mediante una cadena ligera del anticuerpo Ig kappa antihumana conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP). Para la detección de la unión de TGN112 o respectivamente TGN1412 con las CD32 y CD64, unos linajes de células

30 negativas con respecto a la CD28, que expresan de manera constitutiva la CD32 y/o la CD64, se incubaron con el TGN1112 o TGN1412 durante 40 minutos, se lavaron y se contratiñeron con el anticuerpo IgG antihumano conjugado con PE (peroxidasa), que reconoce a la cadena kappa. Las células se lavaron y la unión de TGN1112 y TGN1412 con FcγR se detectó mediante una citometría de flujo pasante. La especificidad para la CD64 se determinó en el caso de unos linajes de células, que expresan tanto la CD32 como también la CD64, mediante unos

35 experimentos de competición con el anticuerpo anti-CD64 bloqueador.

Ejemplo 2: Estimulación de las células T por medio de los anticuerpos conformes al invento

Seguidamente se ilustran unos hallazgos experimentales, que muestran que, de manera sorprendente, tanto el

40 TGN1112 como también el TGN1412 están en situación, sin ninguna reticulación transversal artificial, de activar ex vivo a los linfocitos T humanos. A causa del hecho de que el TGN1412 sólo se une débilmente con el receptor Fc CD64, esto no se podía esperar en particular para el TGN1412.

Se investigó primeramente si las propiedades activadoras de las células T de los anticuerpos humanizados

45 permanecieron conservadas frente al anticuerpo de partida 5.11A1. El sorprendente resultado se ha representado ejemplificativamente en la Fig. 10. En la Fig. 10A se muestra que tanto el TGN1112 como también e l TGN1412 en una forma soluble están en situación de estimular eficazmente para la proliferación en una suspensión celular a las células mononucleares procedentes de sangre periférica (PBMC). En la Fig. 10B se muestra, que la inducción de la proliferación de las células T por el TGN1412 se efectúa de un modo similarmente fuerte que la inducción de la

50 proliferación por el anticuerpo de partida 5.11A1, pero que sin embargo, unos anticuerpos anti-CD28 convencionales, es decir no superagonistas, tales como, por ejemplo, los anticuerpos 28.2 o 152-2E10, no están en situación de hacer esto.

Ejemplo 3: Relevancia del dominio Fc para las propiedades estimuladoras

A continuación se investigó si el dominio Fc es necesario para las propiedades estimuladoras frente a las células T humanas en un cultivo de PBMC. Para esto, se produjeron unos fragmentos F(ab)2 del TGN1112 y éstos se compararon en un cultivo de células con un anticuerpo intacto en lo que respecta a la activación de las PMBC. El resultado se ha representado en la Fig. 11. Se muestra que los fragmentos F(ab)2 del TGN1112 no inducían ninguna proliferación, mientras que el anticuerpo intacto provocaba de una manera dependiente de la dosis una fuerte proliferación de las PMBC.

Ejemplo 4: Las células T son las células diana de la actividad estimuladora de los anticuerpos conformes alinvento

Con el fin de mostrar que, en el caso de las células que proliferan debido a la estimulación por el TGN1412 en el cultivo de PBMC, se trata de unas células T, el análisis del marcador del ciclo celular Ki-67 se vinculó con el análisis de los marcadores superficiales CD4 y CD8. La expresión de CD4 o respectivamente CD8 caracteriza a los dos grupos principales de células T, las células T ayudadoras (que expresan la CD4) o respectivamente las células T citotóxicas (que expresan la CD8). En la Fig. 12 A se muestra que el TGN1412 soluble estimula manifiestamente la proliferación de los dos subconjuntos en una suspensión de PBMC. En la Fig. 12B se muestra que también unos linfocitos T CD4 o respectivamente CD8 purificados son estimulados manifiestamente para la proliferación mediante una estimulación con TGN1412, pero no obstante, en este sistema no es necesaria la presencia de un agente de reticulación transversal.

En la Fig. 13 se muestra que mediante la expansión, mediada por el TGN1412, de las células T CD4 en un cultivo de células permanece conservado el repertorio de la expresión de TCRVB. Esto constituye un hallazgo importante en el sentido de que en la inmunoterapia pretendida es provechoso conservar la diversidad, que se presenta en la naturaleza del repertorio de TCR, con el fin de obtener una inmunotolerancia y garantizar la reactividad frente a un amplio espectro de posibles agentes patógenos.

Resumiendo, estos resultados muestran sorprendentemente que tanto el TGN1412 como también el TGN111 en una forma disuelta están en situación de estimular a las células T humanas en un cultivo de células.

Ejemplo 5: Elevado efecto estimulador junto con un pequeño efecto pro-apoptótico de los anticuerpos conformes al invento

A continuación, se investigó más detalladamente la activación de las células T, que había sido mediada por los TGN1412, TGN1112 y el anticuerpo de partida 5.11A1, en lo que respecta a la inducción de la muerte celular programada (apoptosis). En las Figs. 14 y 15 se han recopilado los resultados representativos.

En la Fig. 14 se representa que la proporción de las células T apoptóticas en un cultivo de PBMC, que eran estimuladas con los anticuerpos anti-CD28 5.11A1, TGN1412 y TGN1112 en una forma soluble, estaba pronunciada con la mayor frecuencia en el caso de los cultivos estimulados con el 5.11A1, de una manera intermedia en el caso de los cultivos estimulados con el TGN1112 y de manera mínima en el caso de los cultivos estimulados con el TGN1412. En consonancia con estos resultados, la Fig. 15 muestra que la expresión del receptor CD95, que provoca la apoptosis en unas células T, que habían sido estimuladas con el 5.11A1, era la más frecuente, mientras que las células estimuladas con TGN1112 manifestaron una frecuencia intermedia y las células estimuladas con TGN1412 manifestaron una frecuencia pequeña de las células positivas para la CD95.

Bibliografía

Delgado y colaboradores, 1996. J. Drug Target. 3: 321-340 Evans y colaboradores, Nature Immunol., 2005, 6: 271-279 Ewert y colaboradores, 2004. Methods, 34: 184-199 Hwang y colaboradores, Methods, 2005, 36: 3-10 Isaacs y colaboradores, Clin. Exp. Immunol., 106: 427-433 Johnson, G. y Wu, T. T. 2000, Nucleic Acids Research Jones y colaboradores 1986. Nature 321: 522-525 Kabat, E. A. y colaboradores 1991; Sequences of Proteins of lmmunological Interest [Secuencias de proteínas de interés inmunológico], Quinta edición. NIH Publication No. 91-3242 Lin y colaboradores, Eur. J. lmmunol., 2003, 33:626-638 Luhder y colaboradores, J. Exp. Med., 2003, 197: 955-966 Norderhaug y colaboradores, 1997. J. Immunol. Methods, 204: 77-87 Schmidt y colaboradores, J. Neuroimmunol., 2003, 140: 143-152 Schwarz, Nature lmmunol., 2005, 6: 327-330 Tacke y colaboradores, Eur. J. lmmunol., 1997, 27:239-247 Umana y colaboradores, 1999, Nature Biotech. 17: 176-180 Woof y colaboradores, Nature Reviews Immunol., 2004, 1-11

LISTA DE SECUENCIAS

5 <110> TeGenero AG

<120> Anticuerpos anti-CD28 superagonistas

<130> L 1701 PCT

<160> 48

10 <170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 33

<212> ADN 15 <213> secuencia artificial

<220>

<223> CDR

20 <400> 1 tcacactacg gcctcgactg gaacttcgat gtc 33

<210> 2

<211> 11 25 <212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> CDR 30 <400> 2

35: <210> 3 <211> 51 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> CDR

40: <400> 3 tgtatttatc ctggaaatgt caatactaac tataatgaga agttcaagga c 51

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> secuencia artificial

5

<220>

<223> CDR

<400> 4

10

15: <210> 5 <211> 30 <212> ADN <213> secuencia artificial

20: <220> <223> CDR <400> 5 ggatacacct tcaccagcta ctatatacac 30

25: <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> secuencia artificial

30: <220> <223> CDR

<400> 6

35: <210> 7 <211> 27 <212> ADN <213> secuencia artificial

40: <220> <223> CDR

<400> 7 caacagggtc aaacttatcc gtacacg: 27

45: <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> secuencia artificial

50: <220> <223> CDR

<400> 8

<210> 9

<211> 21

<212> ADN

<213> secuencia artificial

5

<220>

<223> CDR

<400> 9

aaggcttcca acctgcacac a: 21

10

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> secuencia artificial

15

<220>

<223> CDR

<400> 10

25: <210> 11 <211> 33 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> CDR

30: <400> 11 catgccagtc aaaacattta tgtttggtta aac 33

35: <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> secuencia artificial

<220> <223> CDR

40: <400> 12

<210> 13

<211> 2178 45 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> HC (acrónimo de "heavy chain" = cadena pesada) 50

<400> 13

<210> 14

<211> 446

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> HC

<400> 14

<210> 15

<211> 1007

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> LC (acrónimo de "Light chain" = cadena ligera)

<400> 15

<210> 16

<211> 214

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> LC

<210> 17

<211> 33

<212> ADN

<213> secuencia artificial 5

<220>

<223> CDR

<400> 17 10 tcacactacg gcctcgactg gaacttcgat gtc 33

<210> 18

<211> 11

<212> PRT 15 <213> secuencia artificial

<220>

<223> CDR

20 <400> 18

25: <210> 19 <211> 51 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> CDR

30: <400> 19 tgtatttatc ctggaaatgt caatactaac tataatgaga agttcaagga c 51

35: <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> secuencia artificial

40: <220> <223> CDR <400> 20

<210> 21

<213> secuencia artificial

<220>

<223> CDR 50

<400> 21 ggatacacct tcaccagcta ctatatacac 30

<210> 22 55 <211> 10

<212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<223> CDR

10: <211> 27 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> CDR

15: <400> 23 caacagggtc aaacttatcc gtacacg 27

20: <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> secuencia artificial

<220> <223> CDR

25: <400> 24

<210> 25

<211> 21 30 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> CDR 35

<400> 25 aaggcttcca acctgcacac a

<210> 26 40 <211> 7

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220> 45 <223> CDR

<400> 26

50 <210> 27

<211> 33

<212> ADN

<213> secuencia artificial

55 <220>

<223> CDR

<400> 27

catgccagtc aaaacattta tgtttggtta aac 33

<210> 28

<211> 11

<212> PRT 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> CDR

10 <400> 28

<210> 29

<211> 2184

<212> ADN 15 <213> secuencia artificial

<220>

<223> HC

20 <400> 29 <210> 30

<211> 450

<212>: PRT 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> HC

<210> 31

<211> 1007

<212>: ADN 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> LC

<210> 32

<211> 214

<212>: PRT 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> LC

<210> 33

<211> 360

<212>: ADN 5 <213> secuencia artificial

10 <400> 30

10 <400> 31 10 <400> 32 <220>

<223> VHC

10 <400> 33

<210> 34

<211> 120

<212> PRT 15 <213> secuencia artificial

<220>

<223> VHC

20 <400> 34 <210> 35

<211> 321

<212> ADN 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> VLC

10 <400> 35

<210> 36

<213> secuencia artificial

<220>

<223> VLC 20

<400> 36 <210> 37

<211> 360 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223>: VHC 10

<400> 37

<210> 38

<213> secuencia artificial

<220>

<223>: VHC 20

<400> 38

<210> 39

<211> 321

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> VLC

<400> 39

<211> 107

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> VLC

<400> 40

<210> 41

<211> 2551

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> HC

<210> 42

<211> 466

<212>: PRT 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> HC

<210> 43

<211> 1721

<212>: ADN 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> LC

<210> 44

<211> 233

<212>: PRT 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> LC

<210> 45

<211> 2553

<212>: ADN 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> HC

<210> 46

<211> 469

<212>: PRT 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> HC

<210> 47

<211> 1721

<212>: ADN 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> LC

<210> 48

<211> 233

<212>: PRT 5 <213> secuencia artificial

10 <400> 42 10 <400> 43 10 <400> 44 10 <400> 45

10 <400> 46

10 <400> 47 <220>

<223> LC

10 <400> 48

Claims

REIVINDICACIONES

1. Ácido nucleico, que codifica una molécula de unión, que se une específicamente a una molécula CD28 humana, que comprende

5 a) una secuencia de ácido nucleico que codifica una región VH y una secuencia de ácido nucleico que codifica una región VL, que comprenden unas CDRs en un armazón de inmunoglobulina humana, realizándose que

i) la secuencia de ácido nucleico de la región VH comprende la SEQ ID No.: 33 y/o codifica un

10 (poli)péptido, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 34; y ii) la secuencia de ácido nucleico de la región VL comprende la SEQ ID No.: 35 y/o codifica un (poli)péptido, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 36

y

15 b) una secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de un anticuerpo IgG1 o IgG4 humano.
2. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de ácido nucleico, realizándose que la secuencia de ácido nucleico

20 i) es la SEQ ID No.: 13, 29, 41 o 45; y/o ii) codifica un (poli)péptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 14, 30, 42 o 46.
3. Ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende una secuencia de ácido nucleico, realizándose que la secuencia de ácido nucleico

25 i) es la SEQ ID No.: 15 o 43; y/o ii) codifica un (poli)péptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 16 o 44.
4. Ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 3, que comprende además de ello una 30 secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento marcador o una marca (Tag).
5. Vector, que comprende el ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4, o un anfitrión no humano, transformado o transfectado con un tal vector.

35 6. Procedimiento para la producción de una molécula de unión, que es codificada por un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4, que comprende la cultivación del anfitrión no humano de acuerdo con la reivindicación 5 en unas condiciones adecuadas, y el aislamiento de la molécula de unión a partir del cultivo.
7. Molécula de unión, codificada por un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4; o 40 producida con el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Anticuerpo o fragmento o derivado de un anticuerpo, que comprende por lo menos una molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 7, siendo el anticuerpo de manera preferida un anticuerpo monoclonal.

45 9. Composición, que comprende el ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4, el vector de acuerdo con la reivindicación 5, el anfitrión de acuerdo con la reivindicación 5, la molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 7, y/o el anticuerpo o fragmento o derivado de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8.
10. Composición de acuerdo con la reivindicación 9,

50 que es una composición farmacéutica y eventualmente, además de ello, contiene un vehículo farmacéuticamente compatible, un excipiente farmacéuticamente compatible o un diluyente farmacéuticamente compatible, o que es una composición de diagnóstico, o que es un estuche, que comprende el ácido nucleico, el vector, el anfitrión, la molécula de unión, y/o el anticuerpo o un fragmento o derivado de un anticuerpo, en uno o varios recipientes.
11. Ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4, vector de acuerdo con la reivindicación 5, anfitrión de acuerdo con la reivindicación 5, molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 7, y/o anticuerpo o fragmento o derivado de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8 para la utilización como un medicamento.

60 12. Utilización del ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4, del vector de acuerdo con la reivindicación 5, del anfitrión de acuerdo con la reivindicación 5, de la molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 7, y/o del anticuerpo o fragmento o derivado de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8 para la producción de una composición de diagnóstico para el análisis in-vitro de la capacidad de respuesta de un paciente a una terapia con una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10.

Secuencia de ADN de la HC de TGN1412 inclusive los intrones, las UTRs y un péptido director

15 FIGURA 1

Fig. 2: Secuencia de aminoácidos de la HC de TGN1412 inclusive un péptido director

Variantes observadas junto al extremo terminal de C en el caso de la expresión en células CHO

(...) SLGK ó (...) SLG

Secuencia de ADN de la LC de TGN1412 inclusive los intrones, las UTRs y un péptido director

5 Pos. 160 gac: 1.Codón de la VLR Pos. 478 aaa: último codón de la VLR Pos. 1164 tgt : último codón de kappa const. Pos. 2341 tag: STOP

FIGURA 3 Secuencia de aminoácidos de la LC de TGN1412 inclusive los péptidos directores

FIGURA 4 Secuencia de ADN de la HC de TGN1112 inclusive los intrones, las UTRs y un péptido director

Pos. 160 gac: 1.Codón de la VHR Pos. 517 tca: último codón de la VHR Pos. 2341 aaa : último codón de IgG1 cons.

10 Pos. 2341 tga: STOP

FIGURA 5

Fig. 6: Secuencia de aminoácidos de la HC de TGN1112 inclusive un péptido director Secuencia de ADN de la LC de TGN1112 inclusive los intrones, las UTRs y un péptido director

Pos. 160 gac: 1er codón de la VLR Pos. 478 aaa: último codón de la VLR Pos. 1164 tgt : último codón de kappa cons.

10 Pos. 2341 tga: STOP

FIGURA 7 Secuencia de aminoácidos de la LC de TGN1112 inclusive los péptidos directores

FIGURA 8

VRLC de TGN1113/TGN1412

Definición de CDR según

Combinación de ABM y Kabat Kabat

CDR-L1

HASQNTYVWLN HASQNTYVWLN

CDR-L2

KASNLHT KASNLHT

CDR-L3

QQGQTYPYT QQGQTYPYT

Para la VRLC se han definido de igual manera las CDRs según los dos sistemas

VRHC de TGN1113/TGN1412

Definición de CDR según

Combinación de ABM y Kabat Kabat

CDR-H1

GYTFTHYYIN HYYIN

CDR-H2

CTYPGNVNTNYNEKFKD CTYPGNVNTNYNEKFKD

CDR-H3

SHYGLDWNFDV SHYGLDWNFDV

FIGURA 17