MX2014013866A - Anticuerpos cd33 y su uso para tratar cancer. - Google Patents

Anticuerpos cd33 y su uso para tratar cancer.

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Abstract

La invención proporciona anticuerpo murinos, quiméricos y humanizados que enlazan específicamente a CD33. Los anticuerpos son útiles para el tratamiento y para diagnosticar diversos cánceres asi como para detectar CD33.

Description

ANTICUERPOS CD33 Y SU USO PARA TRATAR CÁNCER REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una continuación de la solicitud de patente de los E.U.A. No. de Serie 13/804,227 presentada en marzo 14, 2013 y reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de patente los E.U.A. No.61/649,110, presentada en mayo 18, 2012.
ANTECEDENTES El CD33 es una proteína de membrana de plasma de 67 kDa que se enlaza un ácido siálico y es un miembro de la familia de proteínas de lectina relacionada a Ig del enlace ácido siálico (SIGLEC). El CD33 se conoce que es expresado en células mieloides. La expresión de CD33 también se ha reportado en un número de células malignas. Aunque el CD33 se ha enfocado para tratamiento de cáncer, por ejemplo, leucemia mieloide aguda, no hay tratamientos efectivos enfocados a CD33 que existan actualmente en el mercado. La presente invención resuelve estos y otros problemas.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN RECLAMADA Proporcionados aquí se encuentran anticuerpos monoclonales que se enlazan específicamente a la proteína CD33 humana y métodos de usar esos anticuerpos para tratar cánceres que expresan la proteína CD33. Los anticuerpos monoclonales contienen regiones determinantes de la complementariedad (CDRs por sus siglas en inglés) de SEQ ID NOs:19, 20 y 21 en la región variable de cadena pesada y CDRs de SEQ ID NOs:22, 23, y 24 en la región variable de cadena ligera. En algunas modalidades, cuando menos un CDR tiene una substitución de aminoácido conservada. En algunas modalidades, cualesquier diferencias en CDRs de la región variable de cadena pesada madura y región variable ligera madura de SEQ ID NOS:18 y 8 residen respectivamente en las posiciones H60-H65.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser anticuerpos murinos, anticuerpos quiméricos o anticuerpos humanizados. Un anticuerpo humanizado preferido es el anticuerpo h2H12, como se describe aquí.
En un aspecto, La invención es un anticuerpo humanizado que incluye CDRs de SEQ ID NOs:19, 20 y 21 en la región variable de cadena pesada y CDRs de SEQ ID NOs:22, 23, y 24 en la región variable de cadena ligera y adicionalmente tiene una región variable de cadena pesada madura con cuando menos 90% de identidad a SEQ ID NO:18 y una región de cadena ligera madura con cuando menos 90% de identidad a SEQ ID NO:8. Además, los siguientes residuos de aminoácidos de la cadena pesada se mantienen: H48 es ocupada por I, la posición H66 es ocupada por K, la posición H67 es ocupada por A, la posición H69 es ocupada por L, la posición H71 es ocupada por A, y la posición H94 es ocupada por S; y los siguientes residuos de aminoácidos de la cadena ligera son mantenidos: L22 es ocupada por N, la posición L46 es ocupada por T, la posición L69 es ocupada por Q, y la posición L71 por Y. En una modalidad adicional, el anticuerpo humanizado que incluye CDRs de SEQ ID N0s:19, 20 y 21 en la región variable de cadena pesada y CDRs de SEQ ID NOs:22, 23, y 24 en la región variable de cadena ligera y adicionalmente tiene una región variable de cadena pesada madura con cuando menos 95% de identidad a SEQ ID NO:18 y una región de cadena ligera madura con cuando menos 95% de identidad a SEQ ID NO:8.
En otra modalidad, el anticuerpo 2H12 humanizado tiene una cadena pesada madura que es fusionada a una región constante de cadena pesada y una cadena ligera madura que es fusionada a una región constante de cadena ligera. En una modalidad adicional, la región constante de cadena pesada es una forma mutante de región constante humana natural y tiene enlace reducido a un receptor Fcy relativo a la región constante humana natural. En otra modalidad, la región constante de cadena pesada es de isotipo IgGl. Las secuencias de aminoácido de región constante de cadena pesada ejemplares incluyen SEQ ID N0:27 y SEQ ID NO:29, una región constante de cadena pesada con serina que substituye para cisteína en la posición 239, (S239C). Las secuencias de aminoácido de región constante de cadena ligera ejemplares incluyen SEQ ID NO:25.
En una modalidad, el anticuerpo humanizado incluye una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18 y una región variable de cadena ligera madura que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
En una modalidad, el anticuerpo humanizado es conjugado a agente citotóxico o citoestático. En una modalidad adicional, el anticuerpo humanizado es conjugado a un agente citotóxico. Un agente citotóxico puede ser, por ejemplo, un enlazador de unión al surco menor de ADN. Una pirrólo[1,4]benzodiazepina (PBD) es un ejemplo de un agente citotóxico que es un enlazador al surco menor de ADN que puede ser conjugado a los anticuerpos CD33 humanizados descritos aquí. En una modalidad, el PBD es conjugado al anticuerpo CD33 por medio de un enlazador escindible de enzima. En otra modalidad, el agente citotóxico tiene la fórmula donde la línea ondulada indica el sitio de acoplamiento al enlazador.
En una modalidad, el anticuerpo humanizado tiene una asociación constante para CD33 humana o de mono macaco cangrejero de 0.5 a 2 x 109 M1.
En un aspecto, la invención proporciona metodos de tratar un paciente que tiene o en riesgo de tener un cáncer que expresa CD33, al administrar al paciente un régimen efectivo de un anticuerpo humanizado CD33 como se describe aquí. Los cánceres que expresan CD33 incluyen leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (SMD), leucemia promielocitica aguda (LPA), leucemia mielogena crónica (LMC), leucemia mielomonocitica crónica (LMMC), un desorden mieloproliferativo crónico, leucemia linfoblástica aguda de célula B precursora (preB-ALL), leucemia linfoblástica aguda de célula T precursora (preT-ALL), mieloma múltiple (MM), enfermedad de mastocito, y Sarcoma mieloide.
En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humanizado o quimérico que contiene regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de SEQ ID NOs:19, 20 y 21 en la región variable de cadena pesada y CDRs de SEQ ID NOs:22, 23, y 24 en la región variable de cadena ligera.
En un aspecto la invención proporciona un anticuerpo humanizado con una región variable de cadena pesada madura cuando menos 90% idéntica a HI, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18, y una región variable de cadena ligera madura cuando menos 90% idéntica a LG, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En una modalidad adicional, el anticuerpo humanizado tiene una región variable de cadena pesada madura cuando menos 95% de identidad a SEQ ID NO:18, y una región variable de cadena ligera madura cuando menos 95% de identidad a SEQ ID NO:8. En otra modalidad, las posiciones H48, H66, H67, H69, H71 y H94 de la región variable de cadena pesada son ocupadas por I, K, A, L, A y S, y las posiciones L22, L46, L69 y L71 de la región variable de cadena ligera son ocupadas por N, T, Q y Y. En algunas modalidades, cualesquier diferencias en CDRs de la región variable de cadena pesada madura y región variable ligera madura de SEQ ID NOS. 18 y 8 residen respectivamente en las posiciones H60-H65.
En una modalidad adicional, el anticuerpo humanizado tiene CDRs de la región variable de cadena pesada madura que son identicas a aquellas de SEQ ID NO:18 y CDRs de la región variable de cadena ligera madura que son idénticas a aquellas de SEQ ID NO:8.
En una modalidad, el anticuerpo humanizado incluye una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18 y una región variable de cadena ligera madura que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
En una modalidad, el anticuerpo humanizado es conjugado a un agente citotóxico o citoestático. En una modalidad, el anticuerpo humanizado es conjugado a un agente citotóxico o citoestático. En una modalidad adicional, el anticuerpo humanizado es conjugado a un agente citotóxico. Un agente citotóxico puede ser, por ejemplo, un enlazador de unión al surco menor de ADN. Una pirrólo[1,4]benzodiazepina (PBD) es un ejemplo de un agente citotóxico that is un enlazador de unión al surco menor de ADN que puede ser conjugado a los anticuerpos CD33 humanizados descritos aquí. En una modalidad, el PBD es conjugado al anticuerpo CD33 por medio de un enlazador escindible de enzima. En otra modalidad, el agente citotóxico tiene la fórmula donde la línea ondulada indica el sitio de acoplamiento al enlazador.
En otra modalidad, el anticuerpo humanizado tiene una asociación constante para CD33 humana o de mono macaco cangrejero de 0.5 a 2 x 109 M1.
En otra modalidad, el anticuerpo humanizado tiene una cadena pesada madura que es fusionada a una región constante de cadena pesada y una cadena ligera madura que es fusionada a una región constante de cadena ligera. En una modalidad adicional, la región constante de cadena pesada es una forma mutante de región constante humana natural y tiene enlace reducido a un receptor Fcy relativo a la región constante humana natural. En otra modalidad, la región constante de cadena pesada es de isotipo IgGl. Las secuencias de aminoácido de región constante de cadena pesada ejemplares incluyen SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:29 (S239C). Las secuencias de aminoácido de región constante de cadena ligera ejemplares incluyen SEQ ID NO:25.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica cualquiera de las regiones variables de cadena pesada o ligera maduras descritas aquí. Los ácidos nucleicos ejemplares que codifican regiones variables de cadena pesada incluyen SEQ ID NOs:39-47; los ácidos nucleicos ejemplares que codifican regiones variables de cadena ligera incluyen SEQ ID NOs:32-38.
En un aspecto, la invención proporciona métodos de tratar un paciente que tiene o en riesgo de tener un cáncer que expresa CD33, al administrar al paciente un régimen efectivo de un anticuerpo humanizado CD33 como se describe aquí. Los cánceres que expresan CD33 incluyen leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia promielocitica aguda (LPA), leucemia mielogena crónica (LMC), leucemia mielomonocitica crónica (LMMC), un desorden mieloproliferativo crónicos, leucemia linfoblástica aguda de célula B precursora (preB-ALL), leucemia linfoblástica aguda de célula T precursora (preT-ALL), mieloma múltiple (MM), enfermedad de mastocitos, y Sarcoma mieloide.
Los anticuerpos humanizados son administrados preferiblemente en una composición apropiada farmacéuticamente. En algunas modalidades, el anticuerpo humanizado administrado es conjugado a un agente citotóxico o citoestático. En una modalidad, el anticuerpo humanizado administrado es conjugado a agente citotóxico o citoestático. En una modalidad adicional, el anticuerpo humanizado administrado es conjugado a un agente citotóxico. Un agente citotóxico puede ser, por ejemplo, un enlazador de unión al surco menor de ADN. Una pirrólo[1,4]benzodiazepina (PBD) es un ejemplo de un agente citotóxico que es un enlazador de unión al surco menor de ADN que puede ser conjugado a los anticuerpos CD33 humanizados administrados descritos aquí. En una modalidad, el PBD es conjugado al anticuerpo CD33 administrado por medio de un enlazador escindible de enzima. En otra modalidad, el agente citotóxico tiene la fórmula donde la línea ondulada indica el sitio de acoplamiento al enlazador.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A y IB muestras un alineamiento de las secuencias de aminoácido de del precursor murino mAb (referido como m2H12) con las regiones variables de cadena pesada 2H12 (Figura 1A) y cadena ligera (Figura 1A) humanizadas.
La figura 2 muestra los resultados de una prueba de evaluación de citotoxicidad in vitro de la actividad de los conjugados de medicamento-anticuerpo derivado 2H12 (ADC) contra las líneas de células LMA positivas de CD33 HL-60 y HEL 92.1.7. h2H12d fue conjugado a SGD-1910; m2H12 y h2H12 fueron conjugadas a SGD-1269. ADC de control sin enlace (h00d-SGD-1910 y hOO-SGD-1269) fueron probadas como un control de especificidad de antígeno. MYLOTARG ® (gemtuzumab ozogamicina) es un conjugado de medicamento-anticuerpo dirigido a CD33 descrito bien compuesto de un anticuerpo hP67.6 anti CD33 vinculado al medicamento citotóxico calicheamicina y fue también probado.
DEFINICIONES La invención proporciona, entre otras cosas, anticuerpos monoclonales que se enlazan específicamente a la proteína CD33 humana y conjugados de la misma. Los anticuerpos son útiles para el tratamiento y diagnosis de cánceres que expresan CD33 así como detectar la proteína CD33.
Un anticuerpo "aislado" se refiere a un anticuerpo que ha sido identificado y separado y/o recuperado de componentes de su entorno natural y/o un anticuerpo que es producido de manera recombinante. Un "anticuerpo purificado" es un anticuerpo que es típicamente cuando menos 50% p/p puro de proteínas que interfieren y otros contaminantes que surgen de su producción o purificación pero no excluye la posibilidad de que el anticuerpo monoclonal es combinado con un exceso de portador(es) aceptable(s) farmaceuticamente u otro vehículo con la intención de facilitar su uso. Las proteínas que interfieren y otros contaminantes pueden incluir, por ejemplo, componentes célulares de las células de las cuales un anticuerpo es aislado o producido de manera recombinante. A veces los anticuerpos monoclonales son cuando menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95 o 99% p/p puros de proteínas que interfieren y contaminantes de producción o purificación. Los anticuerpos descritos aquí, que incluyen anticuerpos murinos, quiméricos y humanizados pueden ser proporcionados en forma aislada y/o purificada.
El termino "anticuerpo monoclonal" como se usa aquí se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos homogéneos substancialmente, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que ocurren de manera natural que pueden estar presentes en cantidades mínimas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población homogénea substancialmente de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiere producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser usados de acuerdo con la presente invención pueden hacerse mediante el método de hibridoma descrito primero por Kohler et al . (1975) Nature 256:495, o pueden hacerse por métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la Patente de los E.U.A. No. 4816567). Los anticuerpos "monoclonales" pueden también ser aislados de las bibliotecas de anticuerpo fago al usar las téenicas descritas en Clackson et al . (1991) Nature, 352:624-628 y Marks et al . (1991) J. Mol . Biol . , 222:581-597, por ejemplo o pueden hacerse por otros métodos. Los anticuerpos descritos aquí son anticuerpos monoclonales.
El enlace especifico de un anticuerpo monoclonal a su antígeno objetivo significa una afinidad de cuando menos 106, 107, 108, 109, o 1010 M1. El enlace específico es detectablemente mas alto en magnitud y distinguible del enlace no específico que ocurre a cuando menos un objetivo no relacionado. El enlace especifico puede ser el resultado de formación de enlaces entre grupos particulares funcionales o ajuste espacial particular (por ejemplo, de tipo cerrojo y llave) mientras que el enlace no especifico es usualmente el resultado de fuerzas van der Waals.
La unidad estructural de anticuerpo básica es un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero incluye dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, cada par tiene una cadena "ligera" (de aproximadamente de 25 kDa) y una "pesada" (de aproximadamente de 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente de 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente de reconocimiento de antígeno. Esta región variable es expresada inicialmente vinculada a un péptido de señal escindible. La región variable sin el péptido de señal es a veces referida como una región variable madura. Así, por ejemplo, una región variable madura de cadena ligera, significa una región variable de cadena ligera sin el péptido de señal de cadena ligera. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente por la función de efector.
Las cadenas ligeras son clasificadas ya sea como kappa o lambda. Las cadenas pesadas son clasificadas como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD y IgE, respectivamente. Dentro de cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes son unidas por una región "J" de aproximadamente de 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que también incluye una región "D" de aproximadamente de 10 o más aminoácidos. (Ver de manera general, Fundamental I munology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7, incorporada por referencia en su totalidad para todos los propósitos).
Las regiones variables maduras de cada par de cadena ligera/pesada del sitio de enlace del anticuerpo. Así, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de enlace.
Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de enlace son el mismo. Las cadenas todas exhiben la misma estructura general de regiones de marco conservadas relativamente (FR) unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de la complementariedad o CDRs. Las CDRs de las dos cadenas de cada par son alineados por las regiones de marco, lo que permite enlace a un epítopo específico. De la N-terminal a la C-terminal, ambas cadenas ligeras y pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio en concordancia con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), o Chothia & Lesk, J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989). Kabat también proporciona una convención de numeración usada ampliamente (numeración Kabat) en la cual los residuos correspondientes entre diferentes cadenas pesadas o entre diferentes cadenas ligeras son asignados el mismo número.
El término "anticuerpo" incluye anticuerpos intactos y fragmentos de enlace de los mismos. Típicamente, los fragmentos de anticuerpo compiten con el anticuerpo intacto desde el cual son derivados por enlace específico al objetivo que incluye cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras Fab, Fab' , F(ab')2, F(ab)c, diacuerpos, Dabs, nanocuerpos, y Fv. Los fragmentos se pueden producir mediante téenicas de ADN recombinante, o mediante separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. El término "anticuerpo" también incluye un diacuerpo (fragmento Fv homodiamerico) o un minicuerpo (VL-VH-CH3), un anticuerpo biespecifico o similar. Un anticuerpo biespecifico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/ligera diferentes y dos sitios de enlace diferentes (ver, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)).
El término "anticuerpo" incluye un anticuerpo por sí mismo (anticuerpo desnudo) o un anticuerpo conjugado a un médicamente citotóxico o citostático.
El término "epítopo" se refiere a un sitio en un antígeno al cual un anticuerpo se enlaza. Un epítopo puede ser formado de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos juxtaposicionados por doblez terciario de una o más proteínas. Los epítopos formados de aminoácidos contiguos son típicamente retenidos en exposición a solventes adulterados mientras que los epítopos formados mediante doblez terciario son típicamente perdidos en tratamiento con solventes adulterados. Un epítopo típicamente incluye cuando menos 3, y más usualmente, cuando menos 5 o 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar conformación espacial de epítopos incluyen, por ejemplo cristalografía de rayos-x y resonancia magnética nuclear de 2 dimensiones. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol.66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).
Los anticuerpos que pueden reconocer los mismos o epítopos sobrepuestos pueden ser identificados en una inmunoevaluación simple que muestra la habilidad de un anticuerpo para competir con el enlace de otro anticuerpo en un antígenoo objetivo. El epítopo de un anticuerpo puede también ser definido por cristalografía de rayos-X del anticuerpo enlazado a si antígeno para identificar residuos de contacto. De manera alternativa, dos anticuerpos pueden tener el mismo epítopo si todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan el enlace de un anticuerpo reducen o eliminan el enlace del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos sobrepuestos si algunas mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan el enlace de un anticuerpo, reducen o eliminan el enlace del otro. La competencia entre anticuerpos es determinada por una evaluación en la cual un anticuerpo bajo prueba inhibe enlace específico de un anticuerpo de referencia a un antígeno común (ver, por ejemplo, Junghans et al.. C ncer Res. 50:1495, 1990). Un anticuerpo de prueba compite con un anticuerpo de referencia si un exceso de un anticuerpo de prueba (por ejemplo, cuando menos 2x, 5x, IOc, 20x o lOOx) inhibe enlace del anticuerpo de referencia por cuando menos 50% pero preferiblemente 75%, 90% o 99% como se mide en una evaluación de enlace competitiva. Los anticuerpos definidos por la evaluación de competencia (anticuerpos que compiten) incluyen anticuerpos que se enlazan al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se enlazan a un epítopo adyacente proximal de manera suficiente al epítopo enlazado por el anticuerpo de referencia para que pueda ocurrir impedimento estérico. Los anticuerpos que compiten con el anticuerpo h2H12 por enlazarse a la proteína CD33 humana son incluidos en esta descripción.
Un anticuerpo 2H12 es un anticuerpo que se enlaza específicamente a la proteína CD33 humana, y que comprende tres regiones de cadena pesada determinantes complementarias (hCDRs): cadena pesada CDR1, por ejemplo, SEQ ID NO:19 o una secuencia que es substancialmente idéntica a SEQ ID NO:19, cadena pesada CDR2, por ejemplo, SEQ ID NO:20 o una secuencia que es substancialmente idéntica a SEQ ID NO:20, y cadena pesada CDR3, por ejemplo, SEQ ID NO:21 o una secuencia que es substancialmente idéntica a SEQ ID NO:21; y tres CDRs de cadena ligera: cadena ligera CDR1, por ejemplo, SEQ ID NO:22 o una secuencia que es substancialmente idéntica a SEQ ID NO:22, cadena ligera CDR2 , por ejemplo, SEQ ID NO:23 o una secuencia que es substancialmente idéntica a SEQ ID NO:23, y cadena ligera CDR3, por ejemplo, SEQ ID NO:24 o una secuencia que es substancialmente idéntica a SEQ ID NO:24. Los anticuerpos 2H12 incluyen el anticuerpo murino 2H12 (m2H12) y anticuerpos quiméricos u humanizados derivados del anticuerpo murino 2H12.
El término "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben ya sea el tratamiento profiláctico o terapéutico.
Para propósitos de clasificar substituciones de aminoácidos como conservadoras o no conservadoras, los aminoácidos son agrupados se la siguiente manera: Grupo I (cadenas laterales hidrofóbicas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrofílicas neutrales): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales acidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influencian orientación de cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Las substituciones conservadoras involucran substituciones entre aminoácidos en la misma clase. Las substituciones no conservadoras constituyen intercambiar un miembro de una de estas clases a un miembro de otra.
El porcentaje de identidades de secuencia se determina con secuencias de anticuerpos alineadas de manera maxima mediante la convención de numeración Kabat. Después del alineamiento, si una región de anticuerpo sujeto (por ejemplo, la región variable madura entera de una cadena pesada o ligera) se compara con la misma región de una anticuerpo de referencia, la identidad de secuencia de porcentaje entre las regiones del anticuerpo sujeto y de referencia es el número de las posiciones ocupadas por el mismo aminoácido en ambas regiones de anticuerpo sujeto y de referencia divididas por el número total de posiciones alineadas de las dos regiones, con brechas no contadas, multiplicadas por 100 para convertir a porcentaje.
Las composiciones o métodos "que comprenden" uno o mas elementos recitados pueden incluir otros elementos no recitados específicamente. Por ejemplo, una composición que comprende anticuerpo puede contener el anticuerpo solo o en combinación con otros ingredientes.
La designación de un rango de valores incluye todos los enteros dentro o que definen el rango.
Una funión efectora de anticuerpo se refiere a una función contribuida por un dominio(s) Fe de un Ig. Tales funciones pueden ser por ejemplo, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, fagogenesis celular depentiende de anticuerpo o citotoxicidad dependiente de complemento. Tal función puede ser afectada por, por ejemplo, enlace de dominio(s) efectores FC a un receptor Fe en una célula inmune con una actividad fagocítica o lítica o por enlace de dominio(s) efector de Fe a componentes del sistema de complemento. Típicamente, el/los efecto(s) mediado(s) por las células que enlazan Fe o componentes de complemento resultan en inhibición y/o agotamiento de la célula objetivo CD33. Las regiones Fe de anticuerpos pueden recrutar células que expresan (FcR) receptor de Fe y juxtaponerlas con celular objetivo recubiertas con anticuerpo. Las células que expresan FcR de superficie para IgGs que incluyen FcyRIII (CD16), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD64) pueden actuar como células efectoras para la destrucción de células recubiertas con IgG. Tales células efectoras incluyen monocitos, macrófagos, células asesinas naturales (NK), neutrófilos y eosinófilos. El acoplamiento de FcyR mediante citocicidad celular dependiente de anticuerpo de activados IgG (ADCC) o fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP). El ADCC es mediado por células efectoras CD16+ a través de la secreción de proteínas que forman poros de membrana y proteasas, mientras que la fagosíntesis es mediada por CD32+ y CD64+ células efectoras ( Ver Fundamental Immunology, 4th ed., Paul ed., Lippincott-Raven, N.Y., 1997, Capítulos 3, 17 y 30; Uchida et al . , 2004, J. Exp. Med. 199:1659-69; Akewanlop et al., 2001, Cáncer Res . 61:4061-65; Watanabe et al . , 1999, Breast Cáncer Res. Treat . 53:199-207). Además de ADCC y ADCP, las regiones de anticuerpos enlazadas a células pueden también activar el camino clásico de complemento una citotoxicidad dependiente de complemento obtenido (CDC). El Clq del sistema complementario se enlaza a las regiones de Fe de anticuerpos cuando son compuestas con antígenos. El enlace de Clq a anticuerpos enlazados a célula puede iniciar una cascada de eventos que involucran la activación proteolítica de C4 y C2 para generar la convertasa C3. La escisión de C3 a C3b por convertasa C3 permite la activación de componentes de complemento terminales que incluyen C5b, C6, C7, C8 y C9. De manera colectiva, estas proteínas forman poros complejos de ataque de membrana en las células recubiertas de anticuerpo. Estos poros interrumpen la integridad de membrana de célula, matando la célula objetivo (ver Immunobiology, 6th ed., Janeway et al., Garland Science, N. Y., 2005, Capítulo 2).
El término "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo", o ADCC, es un mecanismo para inducir muerte celular que depende de la interacción de células objetivos recubiertas de anticuerpo con células inmunes que poseen actividad lítica (también referidas como células efectoras).
Tales células efectoras incluyen células asesinas naturales monocitos/macrófagos y neutrófilos. Las células efectoras de acoplan a dominio(s) efector(es) de Fe de Ig enlazado células objetivo por medio de sus sitios de combinación de antígeno. La muerte de la célula objetivo recubierta con antígeno ocurre como un resultado de la actividad de la célula efectora.
El término "fagocitosis celular dependiente de anticuerpo", o ADCP, se refiere al proceso por el cual las células recubiertas de anticuerpo son internalizadas, ya sea en su totalidad o en parte, por células inmunes fagocíticas (por ejemplo, macrofagos, neutrófilos y células dendríticas) que se enlazan a dominio(s)efectores de Fe de Ig.
El término "citotoxicidad dependiente de complemento", o CDC, se refiere a un mecanismo para inducir muerte celular en la cual un dominio o dominios efectores de Fe de un anticuerpo enlazado a objetivo activan una serie de reacciones enzimáticas que culminan en la formación de orificios en la membrana de célula objetivo. Típicamente, los compuestos de anticuerpo - antígeno tal como aquellas en células objetivo recubiertas de anticuerpo se enlazan y activan un componente complementario activado a Clq el cual a cambio activa el complemento de cascada que lleva a la muerte de célula objetivo. La activación de complemento puede también resultar en deposición de componentes de complemento en la superficie de célula objetivo que facilita ADCC mediante receptores de complemento de enlace (por ejemplo, CR3) en leucocitos.
Un "efecto citotóxico" se refiere a la disminución, eliminación y/o el exterminio de una célula objetivo. Un "agente citotóxico" se refiere a un agente que tiene un efecto citotóxico en una célula.
Los agentes citotóxicos pueden ser conjugados a un anticuerpo o administrados en combinación con un anticuerpo.
Un "efecto citostático" se refiere a la inhibición de la proliferación de células. Un "agente citostático" se refiere a un agente que tiene un efecto citostático en una célula, lo que por consiguiente inhibe el crecimiento y/o expansión de un subconjunto específico de células. Los agentes citostáticos pueden ser conjugados en un anticuerpo o administrados en combinación con un anticuerpo.
El término "aceptable farmacéuticamente" significa aprobado o aprobable por una agencia regulatoria del gobierno Federal o de un estado o designado en la Farmacopea de los E.U.A. u otra Farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y más particularmente en humanos. El término "ingrediente compatible farmacéuticamente" se refiere a un diluyente aceptable farmacéuticamente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el cual un anticuerpo anti CD33 es administrado en un sujeto.
La frase "sal aceptable farmacéuticamente," se refiere sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un anticuerpo anti CD33-1 o conjugado del mismo o agente administrado con un anticuerpo anti CD33-1 o conjugado del mismo o agente administrado con anticuerpo anti CD33-1. Las sales ejemplares incluyen sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzonato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfato, benzensulfonato, p toluensulfonato, y pamoato (es decir, sales 1,1' metilen bis -(2 hidroxi 3 naftoato)) Una sal aceptable farmacéuticamente puede involucrar la inclusión de otra molécula tal como un ión de acetato, ión de succinato u otro contraión. El contraión puede ser cualquier grupo orgánico o inorgánico que estabiliza la carga del compuesto precursor. Además, una sal aceptable farmacéuticamente puede tener más de un átomo cargado en su estructur . Los casos donde múltiples átomos cargados son parte de la sal aceptable farmacéuticamente pueden tener múltiples contra iones. Por consiguiente una sal aceptable farmacéuticamente puede tener uno o más átomos cargados y/o uno o más contraiones.
Amenos que sea aparente de otro modo desde el contexto, el temrino "aproximadamente de" abarca valores dentro de una derivacioin estándar de un valor expresado.
DESCRIPCIÓN DETALLADA . General La invención proporciona anticuerpos monoclonales que se enlazan específicamente a CD33. Los anticuerpos son útiles para el tratamiento y diagnosis de varios cánceres así como detectar CD33.
II. Moleculas objetivo Amenos que se indique de otro modo, el CD33 significa una CD33 humana. Una secuencia humana ejemplar se le asigna el número de muestreo Swiss Prot P20138. El P20138 es incluido aquí como la SEQ ID NO:55. El P20138 incluye un péptido de señal, aminoácidos 1-17; un dominio extra celular con dominios similares de IgG, aminoácidos 18-259; un dominio de transmembrana, aminoácidos 260-282; y un dominio citoplásmico, aminoácidos 283-364. Amenos que sea aparente de otro modo del contexto la referencia CD33 significa cuando menos un dominio extracélular de la proteína y usualmente la proteína completa diferente que un péptido de señal escindible (aminoácidos 1-17 de P20138).
III. Anticuerpos de la invención A. A^_ especificidad de enlace y propiedades funcionales La invención proporciona un anticuerpo murino, ra2H12, y anticuerpos humanizados o quiméricos derivados de m2H12. Los anticuerpos murinos fueron seleccionados por su habilidad para enlazar ambas una proteína CD33 humana y una proteína de macaco cangrejero CD33. Las secuencias aminoácido CD33 de macaco cangrejero fueron proporcionadas como SEQ ID NOs:56 y 57.
La afinidad de formas humanizadas o quiméricas del anticuerpo murino 2H12 (es decir, Ka) puede ser mayor que la del anticuerpo 2H12, o dentro de un factor de cinco o un factor de dos (es decir, más que o menos que) la del anticuerpo murino m2H12 para CD33 humana. Un método de medir la afinidad de un anticuerpo para su antígeno objetivo es para determinar la constante de disociación aparente de un anticuerpo. La presente invención abarca anticuerpos. (Por ejemplo, formas quiméricas y humanizadas del anticuerpo de ratón 2H12) que tienen una disociación constante que es esencialmente la misma que la de 2H12 murino (es decir, dentro del error experimental) así como anticuerpos que tienen una constante de disociación menor o mayor que el anticuerpo murino para CD33 humano. En algunas modalidades, los anticuerpos de la presente invención (por ejemplo, formas quiméricas, humanizadas y humanas del anticuerpo de ratón 2H12) tienen una constante de disociación aparente dentro de un rango de 0.1 a 10 veces, o preferiblemente dentro de un rango de 0.1 a 5 veces, 0.1 a 2 veces, o incluso 0.5 a 2 veces que la de la constante de disociación aparente del anticuerpo murino 2H12 para CD33 humana. En algunos aspectos, la constante de disociación aparente (Kd) de los anticuerpos para CD33 humana es preferible dentro de un rango de 0.1 nM a 50 nM, incluso más preferiblemente dentro de un rango de 0.1 nM a 25 nM, incluso más preferiblemente dentro de un rango de 0.1 nM a 10 nM, 0.5 nM a 5 nM, o 0.5 nM a 2.5 nM. Los anticuerpos humanizados o quiméricos de m2H12 específicamente enlazan una CD33 humana en forma nativa y/o expresado de manera recombinante de células CHO como hace el anticuerpo murino 2H12 para enlazar un CD33 humana. En algunas modalidades, los anticuerpos humanizados o quiméricos m2H12 también se enlazan al cyno-homólogo de CD33, lo que permite así probarse de manera preclínica en primates no humanos.
Los anticuerpos preferidos (por ejemplo, anticuerpos humanizados o quiméricos m2H12) inhiben cáncer (por ejemplo, crecimiento de células, metástasis y/o letalidad de los organismos) como se muestra en células cancerosas que se propagan en cultivo, en un modelo animal o prueba clínica. Los modelos animales pueden ser formados al implantar líneas de células de tumor humanas que expresan CD33 o células de tumor de paciente primario en cepas de roedor inmunodeficientes apropiadas, por ejemplo, ratones desnudos atímicos, NSG, o ratones SCID. Estas líneas de células de tumor pueden ser establecidas en huéspedes de roedor inmunodeficientes ya sea como tumor solido mediante inyecciones subcutáneas o como tumores diseminados mediante inyecciones intravenosas. Una vez establecidos dentro de un huésped, estos modelos de tumores pueden ser aplicados para 5 evaluar las eficiencias terapéuticas de los anticuerpos anti CD33 o formas conjugadas de los mismos como se describe en los ejemplos.
B. B. Anticuerpos Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo 10 modificado genéticamente en el cual los CDRs forman un anticuerpo "donador" no humano son injertados en secuencias de anticuerpo "aceptor" humanas (ver , por ejemplo, Queen, patente de los E.U.A. No. 5,530,101 y 5,585,089; Winter, patente de los E.U.A. No. 5,225,539; Cárter, patente de los 15 E.U.A. No. 6,407,213; Adair, patente de los E.U.A. No. 5,859,205; y Foote, patente de los E.U.A. No. 6,881,557). Las secuencias de anticuerpo aceptoras pueden ser, por ejemplo una secuencia de anticuerpo humana madura, un compuesto de tales secuencias, una secuencia de consenso de 20 anticuerpo humano, o una secuencia de región germinal. Una secuencia aceptora preferida para la cadena pesada es la VH exon VH1-18 germinal y para la J exon (JH), exon JH-6. Para la cadena ligera, una secuencia aceptora preferida es exon VL1- 16 J exon JD-4. Así, un anticuerpo humanizado es un 25 anticuerpo que tiene algunas o todas sus CDRs enteramente o substancialmente de un anticuerpo donador humano y secuencias de marco variable de región y regiones constantes, si están presentes, entera o substancialmente de secuencias de anticuerpo humanas. De manera similar una cadena pesada humanizada tiene cuando menos una, dos y usualmente todas las tres CDRs enteras o substancialmente de una cadena pesada de anticuerpo donadora, y una secuencia de marco de región variable de cadena pesada, si está presente, substancialmente de un marco variable de región de cadena pesada humana y secuencias de región constante. De manera similar una cadena ligera humanizada tiene cuando menos uno, dos, y usualmente todas los tres CDRs entera o substancialmente de una cadena ligera de anticuerpo donador, y una secuencia de marco de región variable de cadena ligera y región constante de cadena ligera, si están presentes, substancialmente de marco de región variable de cadena ligera humana y secuencias de región variable. Diferentes a anticuerpos y cLAbs, un anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada humanizada y una cadena ligera humanizada. Una CDR en un anticuerpo humanizado o humano es substancialmente o substancialmente idéntico a una CRD correspondiente en un anticuerpo no humano cuando menos 60%, 85%, 90%, 95% o 100% de residuos correspondientes (como se define por Kabat) son idénticos entre las CDRs respectivas. En algunas modalidades, una CDR en un anticuerpo humanizado o anticuerpo humano es substancialmente o substancialmente idéntica a una CDR correspondiente en un anticuerpo no humano cuando no hay más de 3 substituciones de aminoácidos conservadoras en cada CDR. Las secuencias de marco de región variable de una cadena de anticuerpo son substancialmente de una secuencia de marco de región variable humana o región constante respectivamente cuando, cuando menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de residuos correspondientes definidos por Kabat son idénticos. En algunos anticuerpos humanizados de la presente invención, hay cuando menos una retromutación murina 2H12 en la región de marco variable de cadena pesada del anticuerpo. Aunque los anticuerpos humanizados a menudo incorporan todas las seis CDRs (preferiblemente como se define por Kabat) de un anticuerpo de ratón, cuando pueden también hacerse con menos que todas las CDRs (por ejemplo, cuando menos 3, 4, o 5) CDRs de un anticuerpo de ratón (por ejemplo, Pascalis et al., J. Inmuno 1. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol . Inmuno 1. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, Journal of Inmunology, 164:1432-1441, 2000).
Ciertos aminoácidos de los residuos marco de región variable humana pueden ser seleccionados para sustitución basada en su posible influencia en conformación de CDR y/o enlace a un antígeno. La investigación de tales influencias posibles es mediante exámen de modelaje de las características de los aminoácidos en ubicaciones particulares, u observación empírica de los efectos de sustitución o mutagénesis de aminoácidos particulares.
Por ejemplo, cuando un aminoácido difiere entre un residuo de marco de región variable murina y un residuo de marco de región variable humana seleccionado, el aminoácido de marco humano puede ser substituido por el aminoácido de marco equivalente del anticuerpo de ratón cuando se espera de manera razonable que el aminoácido: (1) se enlaza de manera no covalente al antígeno directamente, (2) es adyacente a una región CDR, (3) interactúa de otro modo con una región CDR (por ejemplo está dentro de aproximadamente de 6 Á de una región CDR); o (4) media la interacción entre las cadenas pesadas y ligeras.
La invención proporciona formas humanizadas del anticuerpo de ratón 2H12 que incluyen nueve regiones variables maduras de cadena pesada humanizadas ejemplificadas (HA-HI) y siete regiones variables maduras de cadena ligera humanizada ejemplificada (LA-LG). Las permutaciones de estas cadenas que tienen el enlace mas fuerte (el menor EC50) son HCLA, HCLE, HCLG, HILA, HILE y HILG. De estas permutaciones, HILG (también conocido como h2H12) es preferido porque tiene el enlace mas fuerte.
La invención proporciona anticuerpos 2H12 en los cuales la región variable de cadena pesada muestra cuando menos 90% de identidad a HA (SEQ ID NO:10) y una región variable de cadena ligera cuando menos 90% idéntica a LA (SEQ ID NO:2). En algunos aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y hay cuando menos una retromutación 2H12 murina en la región de marco variable de cadena pesada. En otros aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y hay cuando menos una retromutación 2H12 murina en la región de marco variable de cadena ligera. De manera adicional, la invención proporciona anticuerpos 2H12 en los cuales la región variable de cadena pesada humanizada muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NOS:10-18 y la región variable de cadena ligera humanizada muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NOS: 2-8 (y cualesquiera combinaciones de la misma (es decir, el anticuerpo puede comprender cualquiera de las regiones variables de cadena pesada emparejadas con cualquiera de las de las regiones variables de cadena ligera). Por ejemplo, la invención proporciona anticuerpos en los cuales la región variable de cadena pesada muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a SEQ ID NOS: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o 18, y la región variable de cadena ligera humanizada muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8. En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos en los cuales la región variable de cadena pesada muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a SEQ ID NOS: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o 18, y la región variable de cadena ligera muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a SEQ ID NO:2. En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos en los cuales la región variable de cadena pesada muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a SEQ ID NOS:10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o 18, y la región variable de cadena ligera muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a SEQ ID NO:3. En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos en los cuales la región variable de cadena pesada muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%. 99% o 100% de identidad de secuencia a SEQ ID NOS:10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o 18, y la región variable de cadena ligera muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a SEQ ID NO:4. En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos en los cuales la región variable de cadena pesada muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a SEQ ID NOS:10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o 18, y la región variable de cadena ligera muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a SEQ ID NO:5. En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos en los cuales la región variable de cadena pesada muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a SEQ ID NOS:10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o 18, y la región variable de cadena ligera muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a SEQ ID NO:6. En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos en los cuales la región variable de cadena pesada muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a SEQ ID NOS:10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o 18, y la región variable de cadena ligera muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a SEQ ID NO:7. En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos en los cuales la región variable de cadena pesada muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a SEQ ID NOS:10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o 18, y la región variable de cadena ligera muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a SEQ ID NO:8.
En algunos aspectos, estos anticuerpos son anticuerpos humanizados y algunas o todas las retromutaciones en los respectivos anticuerpos son retenidas. En algunos anticuerpos la posición H94 es ocupada por S. En algunos anticuerpos, preferiblemente, cuando menos una de las posiciones H48, H66, H67, H69, H71, y H94 es ocupada por el aminoácido de la posición correspondiente del anticuerpo murino 2H12. Opcionalmente, en cualquier tal anticuerpo, la posición H48 es ocupada por I; la posición H66 es ocupada por K; la posición H67 es ocupada por A; la posición H69 es ocupada por L; la posición H71 es ocupada por A; la posición H94 es ocupada por S. En otras modalidades en tales anticuerpos, preferiblemente, cuando menos una de las posiciones L22, L46, L69, y L71 es ocupada por el aminoácido de la posición correspondiente del anticuerpo murino 2H12. Opcionalmente, en cualquier tal anticuerpo, la posición L22 es ocupada por N; la posición L46 es ocupada por T; la posición L69 es ocupada por Q; y la posición L71 es ocupada por Y.
Preferiblemente, en cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente, por ejemplo, anticuerpos humanizados 2H12 en los cuales la región variable de cadena pesada muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identidad de secuencia a SEQ ID NOS:10-18 y la región variable de cadena ligera muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identidad de secuencia a SEQ ID NOS:2-8, las regiones CDR son idénticas o substancialmente idénticas a las regiones CDR del anticuerpo donador de ratón, es decir, anticuerpo murino 2H12 (SEQ ID NOS:19-24). Las regiones CDR son definidas por Kabat. Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos HCLA, HCLE, HCLG, HILA, HILE, y HILG.
La invención proporciona variantes del anticuerpo humanizado HILG en las cuales la región variable madura de cadena pesada humanizada muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO:18 y la región variable madura de cadena ligera humanizada muestra cuando menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identidad de secuencia a SEQ ID NO:8. En algunos tales anticuerpos, la posición H94 es ocupada por S. Preferiblemente, en tales anticuerpos algunas o todas las retromutaciones en HILG son retenidas. En otras palabras, cuando menos 1, 2, 3, 4, 5, o preferiblemente todas las 6 posiciones de cadena pesada H48, H66, H67, H69, H71, y H94 son ocupadas por Iy K y A y L y A y S, respectivamente. También, cuando menos 1, 2, 3, o preferiblemente todas las 4 posiciones de cadena ligera L22, L46, L69, y L71 son ocupadas por N y T y Q y Y respectivamente. Las regiones CDR de tales anticuerpos humanizados son de preferencia substancialmente idénticas a las regiones CDR de HILG, las cuales son las mismas que las del anticuerpo donador de ratón. Las regiones CDR pueden ser definidas por cualquier definición convencional (por ejemplo, Chothia) pero son preferidas como se definen por Kabat. En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada que comprende las tres CDRs de SEQ ID NO:18 y marcos de región variable con cuando menos 95% de identidad a los marcos de región variable de SEQ ID NO:18. En otra modalidad, el anticuerpo humanizado comprende una cadena ligera que comprende las tres CDRs de SEQ ID NO:8 y marcos de región variable con cuando menos 95% de identidad a marcos de región variable de SEQ ID NO:8. En una modalidad adicional, el anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada que comprende las tres CDRs de SEQ ID NO:18 y marcos de región variable con cuando menos 95% de identidad a los marcos de región variable de SEQ ID NO:18, y una cadena ligera que comprende las tres CDRs de SEQ ID NO:8, y marcos de región variable con cuando menos 95% de identidad a los marcos de región variable de SEQ ID NO:8.
En tanto que los anticuerpos humanizados muestran cualquier variación del anticuerpo humanizado HILG ejemplificado, una posibilidad para tal variación adicional es retromutaciones adicionales en los marcos de región variable. Cualquiera o todas de las posiciones retromutadas en otras regiones variables maduras de cadena pesada o ligera humanizadas ejemplificadas se pueden hacer también (es decir, 1, 2, 3, 4, o todas las 5 de H38 ocupadas por N, H40 ocupadas por R, H73 ocupadas por K, H82A ocupadas por S, y H83 ocupadas por T en la cadena pesada y 1 o ambas la L3 ocupada por K, y L20 ocupada por I en la cadena ligera. Sin embargo tales retromutaciones adicionales no son preferidas por que ellas en general no mejoran la afinidad e introducir más residuos de ratón puede dar riesgo incrementado de inmunogenicidad.
Otra posible variación es substituir ciertos residios en los CDRs del anticuerpo de ratón con residuos correspondientes de secuencias de CDRs humanas, típicamente de CDRs de secuencias aceptoras humanas usadas en diseñar los anticuerpos humanos ejemplificados. En algunos anticuerpos solo parte de las CDRs, específicamente el subconjunto de residuos de CDR requeridos para enlace, conocidos con el termino SDRs pueden ser identificados basados en estudios previos (por ejemplo los residuos H60-H65 en CDR H2 son a menudo no requeridos), de regiones de CDRs Kabat que yacen fueran de bucles hípervariables Chothia (Chothia, J. Mol . Biol . 196:901, 1987), por moldeo molecular y/o empíricamente, o como se describe Gonzales et al., Mol. Immunol.41: 863 (2004). En tales anticuerpos humanizados en las posiciones en las cuales uno o más residuos de CDR donadores son ausentes o en los cuales el CDR donador es omitido, el aminoácido que ocupa la posición puede ser un aminoácido que ocupa la posición correspondiente (por numeración Kabat) en la secuencia de anticuerpo aceptora. El número de tales substituciones de aminoácidos donadores aceptores en los CDRs a incluir refleja un balance de consideraciones competentes.
Tales substituciones son potencialmente ventajosas en disminuir el número de aminoácidos de ratón en un anticuerpo humanizado y consecuentemente disminuir inmunogenicidad potencial. Sin embargo, las substituciones pueden también causar cambios de afinidad y reducciones significativas en la afinidad son preferiblemente evitadas. Las posiciones para sustitución en CDRs y aminoácidos para substituir pueden también ser seleccionadas empíricamente.
Aunque no se prefiere se pueden hacer otras substituciones de aminoácidos, por ejemplo, en residuos de marco que no están en contacto con los CDRs, o incluso algunos aminoácidos de residuos de contacto con CDR potenciales dentro de CDRs. A menudo los reemplazos hechos en las secuencias humanizadas variantes son conservadoras con respecto a los aminoácidos HILG reemplazados en el caso de anticuerpos humanizados 2H12. Preferiblemente, los remplazos relativos a HILG (ya sean o no conservativos) no tienen efecto substancial en la afinidad de enlace o potencia el mAb humanizado, esto es, su habilidad para enlazar CD33 humana e inhibir el crecimiento de células cancerígenas.
Las variantes difieren típicamente de las secuencias de región variable maduras de cadena pesada y ligera de HILG (h2H12) por un pequeño número (por ejemplo, típicamente no más que 1, 2, 3, 5 o 10 en cualquiera de las regiones variables maduras de cadena ligera o cadena pesada, o ambas) de remplazos, supresiones o inserciones.
En algunas modalidades, los anticuerpos humanizados o quiméricos tienen un CDR H2 con hasta 1, 2, 3, 4, 5 o 6 substituciones, supresiones o inserciones relativas a CDR H2 de cadena pesada HI, y CDRs Hl, H3, L1, L2 y L3, cada una tienen hasta 1, 2, 3 o 4 substituciones, supresiones o inserciones relativas al CDR correspondiente de cadena pesada HI o cadena ligera LG. En algunas modalidades, los anticuerpos humanizados o quiméricos de la invención tiene uno o cuando más dos substituciones de aminoácidos conservadas en aminoácido(s) que son identificadas como parte de un CDR. Ejemplos de substituciones de aminoácidos preferidas incluyen las siguientes. En CDR1 de la cadena ligera, un residuo R puede ser substituido por un K en la posición 24; G, S, o T puede ser substituida por A en la posición 25; M puede ser substituida por L en la posición 33; y T puede ser substituida por S en la posición 34. En CDR2 de la cadena ligera, un residuo K puede ser substituida por un residuo R en la posición 53; un residuo M puede ser substituido por un residuo L en la posición 54; un residuo I puede ser substituido por un residuo V en la posición 55; y un residuo E puede ser substituido por un residuo D en la posición 56. En CDR2 de la cadena pesada, un residuo D puede ser substituido por un residuo E en la posición 61; un residuo R puede ser substituido por un residuo K en la posición 62; un residuo Y puede ser substituido por un residuo F en la posición 63; un residuo R puede ser substituido por un residuo K en la posición 64; y un residuo G puede ser substituido por un residuo A en la posición 65.
En algunas modalidades, los anticuerpos humanizados de la invención comprenden una región variable de cadena pesada madura de SEQ ID NO:18, con una dos o tres substituciones conservadoras en una secuencia CDR como se enlistan anteriormente. En algunas modalidades, los anticuerpos humanizados de la invención comprenden una región variable de cadena ligera madura de SEQ ID NO:8, con una dos o tres substituciones conservadoras en una secuencia CDR como se enlistan anteriormente.
C. Selección de región constante Las regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos humanizados pueden vincularse a cuando menos una porción de una región constante humana. La elección de la región constante, depende, en parte, en si la citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo la fagocitosis celular dependiente de anticuerpo y/o la citotoxicidad dependiente de complemento es deseada. Por ejemplo, los isotipos humanos IgGl y IgG3 tienen una fuerte citotoxicidad dependiente de complemento, el isotipo IgG2 débil citotoxicidad dependiente de complemento y human el lgG4 carece de citotoxicidad dependiente de complemento. El IgGl y IgG3 humanos también inducen funciones efectoras mediadas de célula más fuertes que el IgG2 y IgG4 humanos. Las regiones constantes de cadena ligera pueden ser lambda o kappa. Los anticuerpos pueden expresarse como tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y pesadas, como cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, como Fab, Fab', F(ab')2, y Fv, o como anticuerpos de cadena única en los cuales los dominios variables de cadena pesada y ligera son unidos a través de un espaciador.
Las regiones constantes humanas muestran variación alotípica y variación isoalotípica entre individuos diferentes, esto es, las regiones constantes pueden diferir en individuos diferentes en una o más posiciones polimórficas. Los isoalotípos difieren de los alotípos en que el suero que reconoce un isoalotípo enlaza una región polimórfica de un uno o más otros isotipos.
Uno o varios aminoácidos en el terminus amino o carboxi de la cadena ligera y/o pesada, tal como U sina C-terminal de la cadena pesada, puede no estar presente o ser el punto de partida en una proporción de o todas las moléculas. Las substituciones se pueden hacer en las regiones constantes para reducir o incrementar función efectora tal como citotoxicidad mediada de complemento o ADCC (ver, por ejemplo, Winter et al., Patente de los E.U.A No.5,624,821; Tso et al., Patente de los E.U.A No.5,834,597; y Lazar et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), o para prolongar vida media en humanos (ver, por ejemplo, Hinton et al., J. Biol. Chem.279:6213, 2004).
La sustitución ejemplar incluye la sustitución de aminoácido del aminoácido nativo a un residuo de cisteína es introducido en la posición de aminoácido 234, 235, 237, 239, 267, 298, 299, 326, 330, o 332, preferiblemente una mutación S239c en un isotipo IgGl humano (la numeración es de acuerdo al índice EU (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991); ver E.U.A 20100158909, la cual es incorporada aquí por referencia). La presencia de un residuo de cisteína adicional permite formación de enlace de disulfuro intercadena. Tal formación de enlace de disulfuro intercadena puede causar obstáculo estérico, que por consiguiente reduce la afinidad de la interacción de enlace de la región-FcyR. El/los residuo(s) de cisteína(s) introducidos dentro o en la proximidad de una región Fe de una región constante de IgG pueden también servir como sitios para conjugación para agentes terapéuticos (es decir, acoplar medicamentos citotóxicos al usar reactivos específicos de tiol tales como derivados de maleimida de medicamentos. La presencia de un agente terapéutico causa obstáculo estérico, que por consiguiente reduce aún más la afinidad de la interacción de enlace de región Fc-Fcy. Otras substituciones en cualquiera de las posiciones 234, 235, 236 y/o 237 reducen afinidad para los receptores Fcy, particularmente receptor FcyRI (ver, por ejemplo, E.U.A.6,624,821, E.U.A.5,624,821.) La vida media in vivo de un anticuerpo también puede impactar sus funciones efectoras. La vida media de un anticuerpo puede ser incrementada o disminuida para modificar sus actividades terapéuticas. El FcRn es un receptor que es similar estructuralmente a antígeno MHC Clase I que se asocia de manera no covalente con microglobulina b2. El FcRn regula el catabolismo de IgGs y su transcitosis a través de tejidos (Ghetie and Ward, 2000, Annu. Rev. Immunol . 18:739-766; Ghetie and Ward, 2002, Immunol . Res. 25:97-113). La interacción IgG-FcRn toma lugar en pH 6.0 (pH de vesículas intracélulares) pero no en pH 7.4 (pH de sangre); esta interacción permite a los IgGs a recielarse de vuelta a la circulación (Ghetie and Ward, 2000, Ann. Rev. Immunol . 18:739-766; Ghetie and Ward, 2002, Immunol . Res. 25:97-113). La región en IgGl humano involucrada en enlace a FcRn se ha mapeado (Shields et al . , 2001, J. Biol . Chem. 276:6591-604). Las substituciones alaninas en las posiciones Pro238, Thr256, Thr307, Gln311, Asp312, Glu380, Glu382, o Asn434 de IgGl humano mejoran el enlace a FcRn (Shields et al . , 2001, J. Biol . Chem. 276:6591-604). Las moléculas IgGl que albergan estas substituciones tienen vidas medias de suero más largas. Consecuentemente, estas moléculas de IgGl modificadas pueden permitir llevar a cabo sus funciones efectoras, y por consiguiente, estas moléculas IgGl modificadas pueden poder llevar acabo sus funciones efectoras, y por consiguiente ejercer sus eficacias terapéuticas, sobre un periodo más largo de tiempo comparado a un IgGl no modificado. Otras substituciones ejemplares para incrementar enlace a FcRn incluyen un Gln en la posición 250 y/o a Leu en la posición 428. La numeración EU es usada para toda la posición en la región constante.
Los oligosacaridos acoplados de manera covalente al Asn297 conservada son involucrados en la abilidad de la región Fe de un IgG para enlazar FcyR (Lund et al . , 1996, J. Inmuno 1. 157:4963-69; Wright and Morrison, 1997, Trends Biotechnol . 15:26-31). La ingeniería de esta glicoforma en IgG puede mejorar de manera significativa el ADCC mediado de IgG. Además de bisectar modificaciones de N-acetilglucosamina (Umana et al., 1999, Nat . Biotechnol . 17:176-180; Davies et al . , 2001, Biotech. Bioeng. 74:288-94) a esta glicoforma o eliminación de fucosa (Shields et al . , 2002, J. Biol . Chem. 277:26733-40; Shinkawa et al . , 2003, J. Biol . Chem. 278:6591-604; Niwa et al . , 2004, Cáncer Res . 64:2127-33) de esta glicoforma son dos ejemplos de ingeniería de Fe IgG que mejora el enlace entre IgG Fe y FcyR, que mejora por consiguiente la actividad ADCC mediada por Ig.
Una sustitución sistemática de aminoácidos expuestos a solvente de región Fe de IgGl humano ha generado variantes de IgG con afinidades de enlace a FcyR alteradas (Shields et al . , 2001, J. Biol . Chem. 276:6591-604). Cuando se comparan a IgGl precursor, un subconjunto de estas variantes que involucran substituciones en Thr256/Ser298, Ser298/Glu333, Ser298/Lys334, o Ser298/Glu333/Lys334 a Ala demuestran incremento en ambos el nivel de afinidad de enlace hacia FcyR y la actividad de ADCC (Shields et al., 2001, J. Biol . Chem. 276:6591-604; Okazaki et al . , 2004, J. Mol . Biol . 336:1239-49).
La actividad de fijación de complemento de anticuerpos (ambos el enlace a Clq y la actividad CDC) pueden ser mejorados mediante substituciones en Lys326 y Glu333 (Idusogie et al . , 2001, J. Immunol . 166:2571-2575). Las mismas substituciones en estructura principal humana pueden convertir un isotipo de anticuerpo que se enlaza pobremente a Clq y que es deficiente de manera severa en complementar la actividad de activación a uno que puede enlazar ambos el Clq y mediar el CDC (Idusogie et al . , 2001, J. Immunol . 166:2571-75). Varios otros métodos también se han aplicado para mejorar la actividad de fijación de complemento de anticuerpos. Por ejemplo, el injerto de una pieza de cola de 18 aminoácidos carboxilo terminal de IgM al carboxilo terminal de IgG mejora enormemente su actividad CDC. Esto es observado incluso con IgG4, el cual normalmente no tiene actividad CDC detectable (Smith et al . , 1995, J. Immunol . 154:2226-36). Tambien, substituir el Ser444 ubicado cerca al carboxi terminal de cadena pesada IgGl con dimerización cola a cola inducida Cys de IgGl con un incremento de 200 veces en actividad CDC sobre IgGl monomérico (Shopes et al., 1992, J. Inmuno 1. 148:2918-22). Además, una construcción de diacuerpo biespecifico con especificidad para Clq también confiere actividad CDC (Kontermann et al . , 1997, Nat . Biotech. 15:629-31).
La actividad complementaria puede ser reducida al mutar cuando menos uno de los residuos de aminoácidos 318, 320, y 322 de la cadena pesada a un residuo que tiene una cadena de lado diferente, tal como un Ala. Otros residuos no iónicos de substituido alquilo, tales como Gly, lie, Leu, o Val, o tales residuos no polares aromáticos tal como Phe, Tyr, Trp y Pro en lugar de cualquiera de los tres residuos también reduce o suprimir el enlace Clq. los Ser, Thr, Cys, y Met pueden ser usados en los residuos 320 y 322, pero no 318, para reducir o suprimir actividad de enlace Clq. el reemplazo de residuos 318 (Glu) mediante un residuo polar puede modificar pero no abolir la actividad de enlace a Clq. reemplazar el residuo 297 (Asn) con Ala resulta en eliminación de actividad lítica pero únicamente reduce ligeramente (aproximadamente de tres veces más débil) la afinidad para Clq. Esta alteración destruye el sitio de glicosilación y la presencia de carbohidrato que es requerido para complementar activación. Cualquier otra sustitución en este sitio tambien destruye el sitio de glicosilación. Las siguientes mutaciones y cualquier combinación de las mismas 5 también reduce el enlace Clq: D270A, K322A, P329A, y P311S (ver WO 06/036291). La referencia a una región constante humana incluye una región constante con cualquier alotipo natural o cualquier permutación de residuos que ocupan las posiciones polimórficas en alotipos naturales. También hasta 10 1, 2, 5 o 10 mutaciones pueden estar presentes relativas a una región constante humana natural, tal como las indicadas anteriormente para reducir enlace de receptor gamma Fe o incrementar enlace para FcRN.
D. D. Expresión de anticuerpos recombinantes 15 Los anticuerpos humanizados o quiméricos son típicamente producidos mediante expresión recombinante. Las construcciones de polinucleótidos recombinantes típicamente incluyen una secuencia de control de expresión enlazada de manera operable a las secuencias de codificación de cadenas 20 de anticuerpo que incluyen regiones promotoras asociadas naturalmente o heterólogas. Preferiblemente, las secuencias de control de expresión son sistemas promotores eucarióticos en vectores capaces de transformar o transfectar células huéspedes eucarióticas. Una vez que el vector se ha 25 incorporado en el huésped apropiado, el huésped se mantiene bajo condiciones apropiadas para expresión de alto nivel de expresión de las secuencias de nucleótidos, y la recolección y purificación de los anticuerpos de reacción cruzada.
Las células de mamífero son un huésped preferido para expresar segmentos de nucleótidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas. Ver Winnacker, From Genes t o Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Un número de líneas de célula huésped apropiado capases de secretar proteínas heterólogas intactas se ha desarrollado en la téenica, e incluyen líneas de células CHO (Por ejemplo DG44), varias líneas de células COS, células HeLa, células HEK293, células L, y mielomas que no producen anticuerpos incluyendo Sp2/0 y NSO. Preferiblemente, las células no son humanas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen et al., Immunol . Rev. 89:49 (1986)), y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de enlace de ribosoma, sitios de empalme de RNA, sitios de poliadenilación, y secuencias terminadoras transcripcionales. Las secuencias de control de expresión preferidas son promotores derivados de genes endógenos, citomegalovirus, SV40, adenovirus, papilomavirus bovino, y similares. Ver Co et al., J. Immunol . 148:1149 (1992).
Los anticuerpos humanos contra la proteína CD33 pueden ser proporcionados por una variedad de téenicas descritas más adelante. Los métodos para producir anticuerpos humanos incluyen el método trioma de Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, Patente de los E.U.A. No. 4,634,664; y Engleman et al., Patente de los E.U.A. 4,634,666; uso de ratones transgénicos que incluyen genes de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, Lonberg et al., W093/12227 (1993); Patente de los E.U.A.5,877,397, Patente de los E.U.A. Patente de los E.U.A.5,874,299, Patente de los E.U.A. 5,814,318, Patente de los E.U.A.5,789,650, Patente de los E.U.A. 5,770,429, Patente de los E.U.A. 5,661,016, Patente de los E.U.A. 5,633,425, Patente de los E.U.A. 5,625,126, Patente de los E.U.A.5,569,825, Patente de los E.U.A. 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) y métodos de muestra de fago (ver, por ejemplo Dower et al., WO 91/17271 y McCafferty et al., WO 92/01047, Patente de los E.U.A. 5,877,218, Patente de los E.U.A. 5,871,907, Patente de los E.U.A. 5,858,657, Patente de los E.U.A. 5,837,242, Patente de los E.U.A.5,733,743 y Patente de los E.U.A. 5,565,332.
Una vez expresados, los anticuerpos pueden ser purificados de acuerdo a procedimientos estándar de la técnica, que incluyen purificación HPLC, cromatografía de columna, electroforesis de gel y similares (ver generalmente, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).
IV. Ácidos Nucleicos La invención además proporciona ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las cadenas pesadas y ligeras humanizadas descritas anteriormente. Típicamente, los ácidos nucleicos también codifican un péptido de señal fusionado a las cadenas maduras pesadas y ligeras. Las secuencias de codificación en ácidos nucleicos pueden ser vinculaciones operables con secuencias regulatorias para asegurar expresión de las secuencias codificadoras, tales como un promotor, potenciador, sitio de enlace de ribosoma, señal de terminación de transcripción y similares. Los ácidos nucleídos que codifican las cadenas pesadas y ligeras pueden correr en forma aislada o pueden ser clonadas en uno o más vectores. Los ácidos nucleicos pueden ser sintetizados por por ejemplo, síntesis de estado sólido o PCR de oligonucleótidos sobrepuestos. Los ácidos nucleicos que codifican cadenas pesadas y ligeras pueden ser unidos como un ácido nucleico contiguo, por ejemplo, dentro de un vector de expresión, o pueden ser separados, por ejemplo, cada uno clonado en su propio vector de expresión.
En una modalidad, esta descripción proporciona un polinucleótido aislado que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18. Este polinucleótido aislado puede además codificar una región constante de cadena pesada de IgG humano. El isotipo de región constante de IgG es, por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4. En una modalidad, el isotipo de la región constante de IgG es IgGl. En otra modalidad, la región constante de IgGl codificada tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución en el residuo 239, de acuerdo al sistema de numeración Kabat, es decir, S239C. La descripción también proporciona un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado que codifica la región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18, y además, una célula huésped que comprende ese vector de expresión. En algunas modalidades, la célula huésped es una célula huésped de mamífero, por ejemplo una célula CHO.
En otra modalidad, esta descripción provee un polinucleótido aislado que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. Este polinucleótido aislado puede codificar aún más una región constante de cadena ligera de IgG humana. El isotipo de región constante de cadena ligera de IgG es, por ejemplo una región constante kappa. La descripción también proporciona un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado que codifica la región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:8, y además, una célula huésped que comprende el vector de expresión. En algunas modalidades, la célula huésped es una célula huésped de mamífero, por ejemplo, una célula CHO. En otra modalidad, esta descripción proporciona un polinucleótido aislado o polinucleótidos que codifican una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18 y una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera forman un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno que se enlaza específicamente a CD33 humana. Esta descripción también proporciona un vector de expresión que comprende el polinucleótido o polinucleótidos aislados que codifican la región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18 y la región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. Una célula huésped que comprende el vector o vectores de expresión también se proporciona. La célula huésped es preferiblemente una célula de mamífero, por ejemplo, una célula CHO.
En otra modalidad, esta descripción proporciona primeros y segundos vectores que comprenden un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18 y un polinucleótido que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera que forman un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno que se enlazan específicamente a CD33 humana. Se proporcionan células huésped que comprenden los vectores. Preferiblemente células huésped de mamífero, tales como una célula CHO.
V. Conjugados de medicamento-anticuerpo s Los anticuerpos anti CD33 pueden ser conjugados a fracciones citotoxicas para formar conjugados de medicamento-anticuerpo (ADCs). Fracciones apropiadas particularmente para conjugación a anticuerpos son agentes citotóxicos (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos), enzimas que convierten promedicamento, isotipos radioactivos o compuestos, o toxinas (estas fracciones son referidas de manera colectiva como agentes o medicamentos terapéuticos). Por ejemplo, un anticuerpo anti cd33 puede ser conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, o una toxina, (por ejemplo, un agente citoestático o citocida tal como, por ejemplo, abrina, ricina A, exotoxina pseudomonas, o toxina diftérica). Ejemplos de clases útiles de agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, enlazadors de unión al surco menor de ADNs, agentes alquilantes de ADN, y inhibidores de tubulina. Los agentes citotóxicos ejemplares incluyen, por ejemplo, auristatinas, camptotecinas, duocarmicinas, etoposidas, maitansines y maitansinoides (por ejemplo, DM1 y DM4), taxanos, benzodiazepinas (por ejemplo, pirrólo[1,4]benzodiazepinas (PBDs), indolinobenzodiazepinas, y oxazolidinobenzodiazepinas) y vinca alcaloides. Las téenicas para conjugar agentes terapéuticos a proteínas, y en particular a anticuerpos, son bien conocidas. (Ver, por ejemplo, Allcy et al., Curren t Opinión in Chemical Biology 2010 14:1-9; Senter, C ncer J. , 2008, 14(3):154-169.) El agente terapéutico (por ejemplo, agente citotóxico) puede ser conjugado al anticuerpo en una forma que reduce su actividad a menos que sea desacoplado del anticuerpo (por ejemplo, mediante hidrólisis, mediante degradación de anticuerpo, o mediante un agente escindible). Tal agente terapéutico puede ser acoplado al anticuerpo por medio de un enlazador. Un agente terapéutico conjugado a un enlazador es también referido aquí como un enlazador de medicamento. La naturaleza del enlazador puede variar ampliamente. Los componentes que constituyen el enlazador son elegidos en base a sus características, las cuales pueden ser dictadas en parte, por las condiciones en el sitio al cual el conjugado es entregado.
El agente terapéutico puede ser acoplado al anticuerpo con un enlazador escindible que es sensitivo a escindido en el ambiente intracélular de la célula cancerígena que expresa anti CD33 pero no es substancialmente sensible al ambiente extracélular, de modo que el conjugado es escindido del anticuerpo cuando es internalizado por la célula cancerígena que expresa anti CD33 (por ejemplo, en el endosoma o, por ejemplo por virtud de sensibilidad a pH o sensibilidad a proteasa, en el ambiente lisosomal o en el ambiente caveolear). El agente terapéutico puede también ser acoplado al anticuerpo con un enlazador no escindible. Como se indica, el enlazador puede comprender una unidad escindible. En algunas de tales modalidades, la estructura y/o secuencia de la unidad escindible es seleccionada de modo que es escindido por la acción de las enzimas presentes en la ubicación objetivo (por ejemplo, una célula objetivo). En otras modalidades, las unidades escindibles que son escindibles mediante cambios en pH (por ejemplo ácido o base lábil), la temperatura o ante irradiación (por ejemplo, fotolábil) puede también ser usada.
En algunas modalidades, la unidad escindible puede comprender un amino acido o una secuencia contigua de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos puede ser de substrato objetivo para una enzima.
En algunos aspectos, la unidad escindible es una unidad de peptidilo y tiene una longitud de cuando menos dos aminoácidos. Los agentes escindibles pueden incluir catepsinas B y D y plasmina (ver, por ejemplo, Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). La unidad escindible más típica que es escindible mediante enzimas que están presentes en celulas que expresan anti CD33, es decir, un enlazador escindible de enzima. De manera acorde, el enlazador puede ser escindido por una peptidasa intracelular o enzima de proteasa, que incluye una proteasa lisosomal o endosoma. Por ejemplo, un enlazador que es escindible mediante el proteasa catepsina dependiente de tiol, el cual es expresado mayormente en tejido canceroso, puede ser usada, (por ejemplo, un enlazador que comprende un péptido Phe-Leu o un peptido Val-Cit o un péptido Val-Ala).
En algunas modalidades, el enlazador comprenderá una unidad escindible (por ejemplo, una unidad de peptidil) y la unidad escindible será conjugada directamente al agente terapéutico. En otras modalidades, la unidad escindible será conjugada al agente terapéutico por medio de una unidad funcional adicional, por ejemplo, una unidad espaciadora auto inmolativa o una unidad espaciadora no auto inmolativa. Una unidad espaciadora no autoinmolativa es una en la cual parte o toda la unidad espaciadora permanece enlazada a la unidad de medicamento después de la acción de escindir una unidad escindible (por ejemplo, aminoácido) del conjugado de medicamento-anticuerpo . Para liberar el medicamento, una reacción de hidrólisis independiente toma lugar dentro de la célula objetivo para escindir la unidad espaciadora del medicamento.
Con una unidad espaciadora auto inmolativa, el medicamento es liberado sin la necesidad del medicamento de un paso de hidrólisis separado. En una modalidad, donde el enlazador comprende una unidad escindible y un grupo auto inmolativo, la unidad escindible es escindible por la acción de una enzima y después de la acción de escindir de la unidad escindible, el/los grupo(s) auto inmolativos liberan el agente terapéutico. En algunas modalidades, la unidad escindible del enlazador se conjugará directa o indirectamente al agente terapéutico en un extremo y en el otro extremo será conjugada directa o indirectamente al anticuerpo. En algunas tales modalidades, la unidad escindible será directa o indirectamente (por ejemplo, por medio de una unidad espaciadora auto inmolativa o no autoinmolativa conjugado al agente terapéutico en un extremo y en el otro extremo será conjugada al anticuerpo por medio de una unidad estiradora. Una unidad estiradora vincula el anticuerpo al resto del medicamento y/o enlazador de medicamento. En una modalidad, la conexión entre el anticuerpo y el resto del medicamento o enlazador de medicamento es por medio de un grupo de maleimida, por ejemplo por medio de un enlazador de maleimidocaproil. En algunas modalidades, el anticuerpo se vinculará al medicamento por medio de un disulfuro, por ejemplo los conjugados maitansinoides enlazador de disulfuro SPDB-DM4 y SPP-DM1.
La conexión entre el anticuerpo y el enlazador puede ser por medio de un numero de diferentes rutas, por ejemplo, a través de un enlace tioéter, a través de un enlace disulfuro, a través de un enlace de amida, o a través de un enlace éster. En una modalidad, la conexión entre el anticuerpo anti CD33 y enlazador es formada entre un grupo de tíol de un residuo de cisteína del anticuerpo y un grupo de aleimida del enlazador. En algunas modalidades, los enlaces de intercadena del anticuerpo son convertidos a grupos tioles libres previo a reacción con el grupo funcional del enlazador. En algunas modalidades, un residuo de cisteína es introducido en la cadena pesada o ligera de un anticuerpo y reaccionada con el enlazador. Las posiciones para inserción de cisteína mediante sustitución en cadenas de pesadas o ligeras de anticuerpos incluyen aquellas descritas en la Solicitud de los E.U.A Publicada No. 2007-0092940 y la Publicación de Patente Internacional W02008070593, cada una de las cuales son incorporadas aquí por referencia en su totalidad y para todos los propósitos.
En algunas modalidades, los conjugados de medicamento-anticuerpo tienen la siguiente fórmula I: L - (LU-D)p (I) en donde L es un anticuerpo anti CD33, LU es una unidad enlazadora y D es una unidad de medicamento (es decir, el agente terapéutico). El subíndice p varía de 1 a 20. Tales conjugados comprenden un anticuerpo anti CD33 vinculado de manera covalente a cuando menos un medicamento por medio de un enlazador. La unidad enlazadora es conectada en un extremo al anticuerpo y en el otro extremo al medicamento.
La carga de medicamento es representada por p, el número de moléculas de medicamento por anticuerpo. El artesano con destreza apreciará que en algunos aspectos, el subíndice p variará de 1 a 20 (es decir, ambos valores enteros y no enteros de 1 a 20). El artesano con destreza apreciará que en algunos aspectos, el subíndice p será un entero de 1 a 20, y representará el número de enlazadores de medicamento en un anticuerpo singular. En otro aspecto, p representa el número promedio de moléculas enlazadoras por anticuerpo, por ejemplo, el número promedio de enlazadores de medicamento por anticuerpo en una mezcla de reacción o composición (por ejemplo, composición farmacéutica), y pueden ser un valor entero o no entero. De manera acorde, en algunos aspectos, para composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) p representa la carga de medicamento promedio de los conjugados de medicamento-anticuerpo en la composición, y p varía de 1 a 20.
En algunas modalidades, p es de aproximadamente de 1 a aproximadamente de 8 medicamentos por anticuerpo. En algunas modalidades, p es 1. En algunas modalidades, p es 2. En algunas modalidades, p es de aproximadamente de 2 a aproximadamente de 8 medicamentos por anticuerpo. En algunas modalidades, p es de aproximadamente de 2 a aproximadamente de 6, 2 a aproximadamente de 5, o 2 a aproximadamente de 4 medicamentos por anticuerpo. En algunas modalidades, p es aproximadamente de 2, aproximadamente de 4, aproximadamente de 6 o aproximadamente de 8 medicamentos por anticuerpo.
El numero promedio de medicamentos por unidad de anticuerpo en una preparación de una reacción de conjugación puede ser caracterizado por medios convencionales tales como espectroscopia de masa, evaluación ELISA, HIC y HPLC. La distribución cuantitativa de conjugados en términos de P puede también ser determinada.
Los conjugados de medicamento-anticuerpo ejemplares incluyen conjugados de medicamento-anticuerpo basados en auristatina, es decir, conjugados donde el componente de medicamento es un medicamento de auristatina. Las auristatinas enlazan tubulina, se ha mostrado que interfiere con dinámicas de microtúbulo y división nuclear y celular, y tiene actividad anti cáncer. Típicamente el conjugado de medicamento-anticuerpo basado en auristatina comprende un enlazador entre el medicamento de auristatina y el y el anticuerpo anti CD33. Las auristatinas pueden ser vinculadas al anticuerpo anti CD33 en cualquier posición apropiada para conjugación a un enlazador. El enlazador puede ser, por ejemplo, un enlazador escindible (por ejemplo, enlazador a peptidil o un enlazador no escindible (por ejemplo, un enlazador liberado mediante degradación del anticuerpo). La auristatina puede ser auristatina E o un derivado de la misma. La auristatina puede ser, por ejemplo, un éster formado entre auristatina E y un ceto ácido. Por ejemplo, la auristatina E puede ser reaccionada con un ácido benzoico paracetil o ácido bezoilvalerico para producir AEB y AEVB respectivamente. Otras auristatinas típicas incluyen MMAF (monometilo auristatina F), y MMAE (monometilo auristatina E). La síntesis y estructura de las auristatinas ejemplares son descritas en la publicaciones de los E.U.A. NOS. 7,659,241, 7,498,298, 2009-0111756, 2009-0018086, y 7,968, 687 cada una de las cuales es incorporada aquí por referencia en su totalidad y para todos los propósitos.
Los conjugados de medicamento - anticuerpo basados en auristatina incluyen conjugados de medicamento anticuerpo vcMMAE, vcMMAF y mcMMAF como se muestra más adelante donde Ab es un anticuerpo como se describe aquí y val-cit representa el dipéptido de valina-citrulina: - .
. Ab-vcMMAE - Ab-vcMMAF Ab-mcMMAF o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo. La carga de medicamento es representada por p, el número de moléculas enlazadoras de medicamento por anticuerpo. Dependiendo del contexto, p puede representar el número promedio de moléculas enlazadoras de medicamento por anticuerpo, también referido como la carga de medicamento promedio. La variable p varía de 1 a 20 y es preferiblemente de 1 a 8. En algunas modalidades preferidas, cuando p representa la carga de medicamento promedio, p varia de aproximadamente de 2 a aproximadamente de 5. En algunas modalidades, p es aproximadamente de 2, aproximadamente de 3, aproximadamente de 4, o aproximadamente de 5. En algunos aspectos, el anticuerpo es conjugado al enlazador por medio de un átomo de sulfuro de un residuo de cisteína. En algunos aspectos, el residuo de cisteína es uno que es adaptado en el anticuerpo. En otros aspectos, el residuo de cisteína es un residuo de cisteína disulfuro intercadena.
Los conjugados de medicamento-anticuerpo ejemplares incluyen conjugados de medicamento-anticuerpo basados en PBD; es decir, un conjugado de medicamento-anticuerpo donde el componente de medicamento es un medicamento PBD.
Los PBDs son de la estructura general: Ellos difieren en el numero, tipo y la posición de sustituyentes, en ambos sus anillos A aromáticos y anillos pirrólo C, y en el grado de saturación del anillo C. en el anillo B hay ya sea una imina (N=C), a carbinolamina (NH-CH(OH)), o a carbinolamina methyl ether (NH-CH(O e)) en la posición N10-C11, la cual es el centro electrofílico responsable de ADN alquilante. Todos los productos naturales conocidos tienen una configuración (S)- en la posición quiral Clla la posición la cual les provee con un giro de mano derecha cuando se ve desde el anillo C hacia el anillo A. esto les da una forma tridimensional apropiada para isohelicidad con el surco menor de ADN de forma-B, que lleva a un ajuste completo en la ubicación de vinculación. La habilidad de los PBDs para formar un aducto en el surco menor les permite interferir con procesamiento de ADN, de ahí su uso como agentes antirumor.
La actividad biológica de estas moleculas puede ser potenciada al unir dos unidades PBD juntas a travez de sus funcionalidades C8/C'-hidroxil por medio de un enlazador alquileno flexible. Los dímeros de PDB se les enseña a formar lecciones de ADN de secuencia selectiva tales como entrelazamiento interhebras 5'-Pu-GATC-Py-3' al cual se le considera que responsable principalmente de su actividad biológica.
En algunas modalidades, los conjugados de medicamento-anticuerpo basados en PBD comprenden un dímero vinculado a un anticuerpo anti CD33. Los monómeros que forman el dímero PBD pueden ser el mismo o diferentes, es decir, simétricos o asimétricos. El dímero de PBD puede ser vinculado al anticuerpo anti CD33 en cualquier posición apropiada para conjugación a un enlazador. Por ejemplo, en algunas modalidades, el dímero de PBD tendrá un sustituyente en la posición C2 que proporciona un anclaje para vincular el compuesto al anticuerpo anti CD33. En modalidades alternativas, la posición N10 del dímero de PBD proporcionará el anclaje para vincular el compuesto al anticuerpo anti CD33.
Típicamente el PBD basado en conjugado de medicamento-anticuerpo comprende una unión entre el medicamento PBD y el anticuerpo anti CD33. El enlazador puede comprender una unidad escindible (por ejemplo, un aminoácido o una secuencia contigua de aminoácidos que es un substrato objetivo para una enzima) o un enlazador no escindible (por ejemplo, enlazador liberado mediante degradación del anticuerpo). El enlazador puede comprender además un grupo de maleimida para vinculación al anticuerpo, por ejemplo, maleimidocaproil. El enlazador puede, en algunas modalidades, comprender además un grupo auto inmolativo, tal como, por ejemplo, una unidad de alcohol p-aminobenzil (PAB).
Un PBD ejemplar para uso como un conjugado es descrito en la Solicitud Internacional No. WO 2011/130613 y es de la siguiente manera donde la línea ondulada indica el sitio de acoplamiento al enlazador 0 una sal aceptable farmacéuticamente del mismo. Un enlazador ejemplar es de la siguiente forma donde la línea ondulada indica el sitio de acoplamiento para el medicamento y el anticuerpo es vinculado por medio del grupo de maleimida.
Los PBDs ejemplares basados en conjugados de medicamento-anticuerpo incluyen conjugados de medicamento-anticuerpo como se muestra debajo donde Ab es un anticuerpo como se describe aquí: 0 una sal aceptable farmacéuticamente del mismo. La carga de medicamento es representada por p, el número de moléculas enlazadoras - medicamento por anticuerpo. Dependiendo en el contexto, p puede representar el número promedio de moléculas enlazadoras de medicamento por anticuerpo, también referidas como la carga de medicamento promedio. La variable p varía de 1 a 20 y es preferiblemente de 1 a 8. En algunas modalidades preferidas, cuando p representa la carga de medicamento promedio, p varia de aproximadamente de 2 a aproximadamente de 5. En algunas modalidades preferidas, cuando p representa la carga de medicamento promedio, p varia de aproximadamente de 2 a aproximadamente de 5. En algunas modalidades, p es aproximadamente de 2, aproximadamente de 3, aproximadamente de 4, o aproximadamente de 5. En algunos aspectos, el anticuerpo es conjugado al enlazador de medicamento por medio de un átomo de sulfuro de un residuo de cisterna que es adaptado al en el anticuerpo. En algunos aspectos, el residuo de cisteína es adaptado en el anticuerpo en la posición 239 (IgGl) como se determina por el índice EU (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991).
VII. Otros anticuerpos para CD33 Así como las formas humanizadas de los anticuerpos 2H12 descritos anteriormente, otros anticuerpos que se enlazan aun dominio extracélular de CD33 pueden ser usados en algunos de los métodos de la invención particularmente el tratamiento de cáncer. Las formas quiméricas o revestidas de estos anticuerpos se pueden hacer mediante métodos convencionales resumidos más adelante.
Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo en el cual las regiones variables maduras de cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo no humano (por ejemplo, un ratón) son combinados con regiones constantes de cadena ligera y pesada humanas. Tales anticuerpos retienen substancial o completamente la especificidad de enlace del anticuerpo de ratón, y son aproximadamente de dos tercios secuencia humana.
Un anticuerpo revestido es un tipo de anticuerpo humanizado que retiene algo y usualmente todo los CDRs y algo de los residuos marco de región variable no humana de un anticuerpo no humano pero reemplaza otros residuos de marco variable de región que pueden contribuir a epítopos de célula T o B, por ejemplo residuos expuestos (Padlan, Mol . Immunol . 28:489, 1991) con residuos de las posiciones correspondientes de una secuencia de anticuerpo humana. El resultado es un anticuerpo en el cual los CDRs son entera o sustancialmente de un anticuerpo no humano y los marcos de región variable del anticuerpo no humano se hacen más humanas mediante las substituciones.
Cualquiera de los anticuerpos puede ser seleccionado para tener la misma especificidad de epítopo o sobrepuesto como un anticuerpo ejemplar, tal como el anticuerpo m2H12, mediante una evaluación de enlace competitiva, tal como se describe en los ejemplos, o de otro modo. Los anticuerpos preferidos tienen la misma especificidad de epítopo que el anticuerpo 2H12. Aquellos con destreza podrán identificar un epítopo enlazado mediante un anticuerpo al usar una variedad de métodos. Por ejemplo, los escaneos oligopéptidos basados en despliegues o análisis de escaneos de péptidos usan una biblioteca de secuencias de oligo péptido de segmentos sobrepuestos y no sobrepuestos de un antígeno objetivo y pruebas para su habilidad para enlazar el anticuerpo de interés. Ver, por ejemplo, Gcysen et al., PNAS 81:3998-4002 (1984). Los epítopos no lineares pueden ser identificados al usar, por ejemplo teenología CLIPS™, una variación de escaneo de oligopéptido basado en disposición. Ver, por ejemplo, Timmerman et al., Open Vaccine J. 2:56-67 (2009). La proteína de antígeno puede también ser mutagenizada y entonces usar una evaluación de enlace por el anticuerpo de interés. La mutagénesis sitio dirigida sistemática puede ser usada o una biblioteca de mutaciones se puede hacer y usarse una exploración para enlace de anticuerpo. Las bibliotecas de mutación pueden ser compradas de, por ejemplo. Integral Molecular. El intercambio de hidrogeno/deuterio de amida MS se puede usar para identificar epítopos. Los antígenos de interés son colocados en agua deuterizada y etiquetados con deuterones. La proteína es entonces digerida con una proteasa y los fragmentos resultantes de péptido son sometidos a análisis de especificaciones de masa. El antígeno es también evaluado en la presencia de un anticuerpo y las diferencias en etiquetamiento de fragmentos de péptido indican áreas de enlace de anticuerpo.
VII. Aplicaciones Terapéuticas Los anticuerpos derivados del anticuerpo murino 2H12, por ejemplo, anticuerpos humanizados o quiméricos, solos o como conjugados de medicamento-anticuerpo CD33 del mismo, pueden ser usados para tratar cáncer. Algunos tales cánceres muestran niveles detectables de CD33 medido en cualquier de las dos proteínas (por ejemplo, mediante inmunoevaluación al usar uno de los anticuerpos ejemplificados) o nivel de mRNA. Algunos de los cánceres muestran niveles elevados de CD33 relativos al tejido no canceroso del mismo tipo, preferiblemente del mismo paciente. Un nivel ejemplar de CD33 en células cancerígenas dispuesto a tratamiento es 5000-150000 moléculas de CD33 por célula, aunque mayores o menores niveles pueden ser tratados. Opcionalmente, un nivel de CD33 en un cáncer es medido antes de realizar el tratamiento.
Ejemplos de cánceres asociados con expresión CD33 y disupuestos a tratamiento incluyen enfermedades meloides tales como, leucemia mieloide aguda (LMA), leuceimia mieloide crónica (LMC), otros desordener mieloide proliferativos, que incluyen leucemia mielomonocitica crónica y desordenes mieloide proliferativos, leucemia promielocitica aguda (LPA), leucemia trombocitica, un síndrome mielodisplástico, leucemia linfoblástica aguda de celula B precursora (preB-ALL), leucemia linfoblástica aguda de célula T precursora (preT-ALL), mieloma múltiple (MM), enfermedad de mastocitos que incluye leucemia de mastocito y sarcoma de mastocitoss, sarcomas mieloides, anemia refractoria, un síndrome de preleucemia, una leucemia linfoide, o una leucemia indiferenciada. El tratamiento puede también ser aplicado a pacientes sin tratamiento previo, quienes son refractarios a tratamientos convencionales (por ejemplo, quimioterapia o MYLOTARG® (gemtuzumab ozogamicina), o quienes han recaído después de una respuesta a tales tratamientos.
Los anticuerpos CD33 derivados del anticuerpo murino 2H12, que incluyen anticuerpos quiméricos o anticuerpos humanizados tales como anticuerpos h2H12, pueden ser usados para tratar cánceres que expresan la proteína CD33. En una modalidad, un anticuerpo humanizado derivado de anticuerpo murino 2H12 es usado para tratar un sujeto con leucemia mieloide aguda (LMA) positiva a CD33. En una modalidad adicional, el anticuerpo h2H12 es usado para tratar al sujeto con LMA positiva a CD33. En otra modalidad, un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo murino 2H12 es usado para tratar un sujeto con leucemia mieloide crónica (LMC) positiva a CD33. En una modalidad adicional, el anticuerpo h2H12 es usado para tratar un sujeto con LMC positiva a CD33. En otra modalidad, un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo murino 2H12 es usado para tratar un sujeto con leucemia mielomonocitica crónica (LMMC) positiva a CD33. En una modalidad adicional, el anticuerpo h2H12 es usado para tratar un sujeto con LMMC. En otra modalidad, un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo murino 2H12 es usado para tratar un sujeto con leucemia tiroidea positiva a CD33. En una modalidad adicional, el anticuerpo h2H12 es usado para tratar un sujeto con leucemia tiroidea positiva a CD33. En otra modalidad, un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo murino 2H12 es usado para tratar un sujeto con síndrome mielodisplásico positivo a CD33. En una modalidad adicional, el anticuerpo h2H12 es usado para tratar a un sujeto con síndrome mielodisplásico positivo a CD33. En otra modalidad, un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo murino 2H12 es usado para tratar un sujeto con desorden mieloproliferativo positivo a CD33. En una modalidad adicional, el anticuerpo h2H12 es usado para tratar un sujeto con desorden mieloproliferativo positivo a CD33. En otra modalidad, un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo murino 2H12 es usado para tratar un sujeto con anemia refractiva positiva a CD33. En una modalidad adicional, el anticuerpo h2H12 es usado para tratar un sujeto con anemia refractora positiva CD33. En otra modalidad, un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo murino 2H12 es usado para tratar un sujeto con síndrome de preleucemia positiva a CD33. En una modalidad adicional, el anticuerpo h2H12 es usado para tratar un sujeto con síndrome de preleucemia positiva a CD33. En otra modalidad, un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo murino 2H12 es usado para tratar un sujeto con leucemia linfoide positiva a CD33. En una modalidad adicional, el anticuerpo h2H12 es usado para tratar un sujeto con leucemia linfoide positiva a CD33. En otra modalidad, un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo murino 2H12 es usado para tratar un sujeto con leucemia indiferenciada positiva a CD33. En una modalidad adicional, el anticuerpo h2H12 es usado para tratar un sujeto con leucemia no diferenciada positiva a CD33. En una modalidad, un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo murino 2H12 es usado para tratar un sujeto con leucemia linfoblástica aguda de celula B precursora (preB-ALL) positiva a CD33. En una modalidad adicional, el anticuerpo h2H12 es usado para tratar un sujeto con pre-B-ALL positiva a CD33. En una modalidad, un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo murino 2H12 es usado para tratar un sujeto con leucemia linfoblástica aguda de célula T precursora (preT-ALL) positiva a CD33. En una modalidad adicional, el anticuerpo h2H12 es usado para tratar un sujeto con preT-ALL positiva a CD33. En una modalidad, un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo murino 2H12 es usado para tratar un sujeto con mieloma múltiple (MM) positivo a CD33. En una modalidad adicional, el anticuerpo h2H12 es usado para tratar un sujeto con MM positivo a CD33. En una modalidad, un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo murino 2H12 es usado para tratar un sujeto con enfermedad de mastocitos positivos a CD33 que incluye leucemia de mastocito y sarcoma de mastocitos. En una modalidad adicional, el anticuerpo h2H12 es usado para tratar un sujeto con enfermedad de mastocitos positivos a CD33 que incluye leucemia de mastocito y sarcoma de mastocitos.
El anticuerpo CD33 puede ser, por ejemplo, un anticuerpo no conjugado o conjugado, por ejemplo, un conjugado de medicamento-anticuerpo CD33. En algunas modalidades, el anticuerpo anti CD33 puede ser anticuerpo 2H12 humanizado o quimérico. En algunas modalidades, el anticuerpo anti CD33 puede ser un anticuerpo que compite con anticuerpo 2H12 murino, humanizado o quimérico para enlace especifico a CD33.
Los anticuerpos CD33 derivados del anticuerpo murino 2H12, incluyen anticuerpos quiméricos o anticuerpos humanizados tales como h2H12, pueden ser conjugados a un agente terapeutico y usados para tratar sujetos con cánceres positivos a CD33. Ejemplos de los agentes terapéuticos son proporcionados aquí, que incluyen agentes terapéuticos activos, por ejemplo auristatinas y agentes terapéuticos altamente activos, por ejemplo PBDs. Un anticuerpo h2H12 conjugado en un agente terapéutico activo, es decir, un conjugado de anticuerpo - medicamento h2H12 (ADC), puede ser usado para tratar un sujeto con cáncer positivo a CD33. Un anticuerpo h2H12 conjugado a una auristatina puede ser usado para tratar al sujeto con cáncer positivo a CD33. Un anticuerpo h2H12 conjugado a un agente terapéutico altamente activo puede ser usado para tratar a un sujeto con cáncer positivo a CD33. Un anticuerpo h2H12 conjugado a un PBD puede ser usado para tratar a un sujeto con cáncer positivo a CD33.
Algunas células cancerígenas desarrollan resistencia a un agente terapéutico después de incrementar la expresión de una proteína incrementa el eflujo del agente terapéutico fuera de la célula cancerígena. Tales proteínas incluyen glicopoteina-P, proteína asociada a resistencia a multimedicamentos, proteína relacionada a resistencia a cáncer de pulmón, y proteína de resistencia a cáncer de mama. La detección de la resistencia de medicamento en células cancerígenas se puede realizar por aquellos con destreza. Los anticuerpos o evaluaciones que detectan proteínas de eflujo son disponibles comercialmente de, por ejemplo, Promega, Millipore, Abcam, y Sigma-Aldrich. En una modalidad, un anticuerpo derivado de un anticuerpo murino 2H12 es usado para tratar un sujeto con un cáncer resistente a multimedicamento, por ejemplo, un cáncer positivo a CD33 resistente a multimedicamentos. En otra modalidad un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo murino 2H12 es usado para tratar un sujeto con un cáncer resistente a multimedicamentos, por ejemplo, un cáncer positivo a CD33 resistente a multimedicamentos. En una modalidad, un anticuerpo h2H12 es usado para tratar un sujeto con un cáncer resistente a multimedicamentos, por ejemplo, un cáncer positivo a CD33 resistente a multimedicamento. En una modalidad adicional, un h2H12 ADC es usado para tratar un sujeto con un cáncer resistente a multimedicamento, por ejemplo, un cáncer positivo a CD33 resistente a multimedicamento. En otra modalidad, un anticuerpo h2H12 conjugado con un agente terapéutico altamente activo es usado para tratar un sujeto con un cáncer resistente a multimedicamentos, por ejemplo, un cáncer positivo a CD33 resistente a multimedicamentos. En otra modalidad, un anticuerpo h2H12 conjugado a un PBD es usado para tratar un sujeto con un cáncer resistente a multimedicamentos, por ejemplo, un cáncer positivo a CD33 resistente a multimedicamentos. En una modalidad adicional, un anticuerpo h2H12 conjugado a un PBD es usado para tratar un sujeto con leucemia mieloide aguda (LMA) positiva a CD33, resistente a multimedicamentos.
Los anticuerpos humanizados o quimericos derivados del anticuerpo murino 2H12, solos o como conjugados de medicamento de los mismos, son administrados en un régimen efectivo que significa una dosis, ruta de administración y frecuencia de administración que retrasa el comienzo, reduce la severidad, inhibe deterioro adicional y/o mejora cuando menos una señal o síntoma de cáncer. Si un paciente ya sufre de cáncer, el régimen puede ser referido como un régimen efectivo terapéuticamente. Si el paciente tiene un riesgo elevado de cáncer relativo a la población general pero aún no está experimentando síntomas, el régimen puede ser referido como un régimen efectivo profilácticamente. En algunas instancias, la eficiencia terapéutica o profiláctica puede ser observada en un paciente individual relativo a controles históricos o experiencia pasada en el mismo paciente. En otras instancias, la eficiencia terapéutica o profiláctica puede ser demostrada en una prueba preclínica o clínica en una población de pacientes tratados relativa a una población de control de pacientes no tratados.
Las dosis ejemplares para un anticuerpo monoclonal son 0.1 mg/kg a 50 mg/kg del peso corporal del paciente, más típicamente 1 mg/kg a 30 mg/kg, 1 mg/kg a 20 mg/kg, 1 mg/kg a 15 mg/kg, 1 mg/kg a 12 mg/kg, o 1 mg/kg a 10 mg/kgl, o 2 mg/kg a 30 mg/kg, 2 mg/kg a 20 mg/kg, 2 mg/kg a 15 mg/kg, 2 mg/kg a 12 mg/kg, o 2 mg/kg a 10 mg/kg, o 3 mg/kg a 30 mg/kg, 3 mg/kg a 20 mg/kg, 3 mg/kg a 15 mg/kg, 3 mg/kg a 12 mg/kg, o 3 mg/kg a 10 mg/kg. Las dosis ejemplares para conjugados de medicamento monoclonal de anticuerpo activo del mismo, por ejemplo, auristinas, son 1 mg/kg a 7.5 mg/kg, o 2 mg/kg a 7.5 mg/kg o 3 mg/kg a 7.5 mg/kg de el peso corporal del sujeto, o 0.1-20, o 0.5-5 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/kg) o 10-1500 o 200-1500 mg como una dosis fija. Las dosis ejemplares para conjugados de medicamento monoclonal de anticuerpo altamente activo del mismo, por ejemplo, PBDs, son 1.0 mg/kg a 1.0 mg/kg, o 1.0 pg/kg a 500.0 pg/kg del peso corporal del sujeto. En algunos métodos, el paciente es administrado con anticuerpo o ADC cada dos, tres, o cuatro semanas. La dosis depende en la frecuencia de administración, condición del paciente, y respuesta previa a tratamiento, si alguna, ya sea si el tratamiento es profiláctico o terapéutico y ya sea si el desorden es agudo o crónico, entre otros fctores.
La administración puede ser parental, intravenosa, oral, subcutánea, intra arterial, intracraneal, intratecal, intraperitoneal, tópica, intra nasal o intramuscular. La administración puede también ser localizada directamente en un tumor. Se prefiere la administración en la circulación sistemática mediante administración intravenosa o subcutánea.
La administración en la circulación sistemática mediante administración intravenosa o subcutánea puede ser por ejemplo, mediante infusión sobre un periodo tal como, de SO SO min o mediante una sola inyección de bolo.
La frecuencia de administración depende de la vida media del conjugado de anticuerpo o medicamento-anticuerpo en la circulación, la condición del paciente y la ruta de administración entre otros factores. La frecuencia puede ser diaria, semanal, mensual, o trimestral, o en intervalos irregulares en respuesta a cambios en la condición del paciente o progresión del cáncer que es tratado. Una frecuencia ejemplar para administración intravenosa es entre dos veces a la semana y trimestralmente a lo largo del curso continuo de tratamiento, aunque dosis más o menos frecuentes también son posibles. Otras frecuencias ejemplares para administración intravenosa son entre una vez a la semana o una vez al mes a lo largo de un curso continuo de tratamiento, aunque dosis más o menos frecuentes también son posibles. Para administración subcutánea, una frecuencia de dosis ejemplar es de diaria a mensual, aunque dosis más o menos frecuentas también son posibles.
El número de dosis administradas depende de la naturaleza del cáncer (por ejemplo, si se presentan síntomas agudos o crónicos) y la respuesta del desorden al tratamiento. Para desordenes agudos o exacerbaciones agudas de un desorden crónico entre 1 y 10 dosis son a menudo suficientes. A veces una única dosis en bolo, opcionalmente en forma dividida, es suficiente para un desorden agudo o exacerbación aguda de un desorden crónico. El tratamiento puede ser repetido por recurrencia de un desorden agudo o exacerbación aguda. Para desordenes agudos, un anticuerpo puede ser administrado en intervalos regulares, por ejemplo, semanalmente, quincenalmente, mensualmente, trimestralmente, o cada seis meses durante cuando menos 1, 5 o 10 años, o la vida del paciente. Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral son estériles preferiblemente y substancialmente isotónicas y fabricadas bajo condiciones GMP. Las composiciones farmacéuticas pueden ser proporcionadas en una forma de dosis de unidad (es decir, la dosis para una administración única). Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas al usar una o más transportadores aceptables, diluyentes, excipientes o auxiliares. La formulación depende en la ruta de administración elegida. Para inyección, los anticuerpos pueden ser formulados en soluciones acuosas, preferiblemente en amortiguadores compatibles fisiológicamente tales como solución de Hank, solución de Ringer, o amortiguador fisiológicamente salino o de acetato (un malestar reducido en el sitio de la inyección). La solución puede contener agentes fórmula torios tales como agentes suspensores, estabilizantes y/o dispersantes. De manera alternativa los anticuerpos pueden ser en forma liofilizada para constitución con un vehículo apropiado, por ejemplo, agua libre de pirógeno estéril, antes de su uso. La concentración de anticuerpo en una formulación liquida puede ser por ejemplo, .01-10 mg/ml, tal como 1.0 mg/ml.
El tratamiento con los anticuerpos de la invención puede ser combinado con quimioterapia, radiación, tratamiento de células madre, cirugia, u otros tratamientos efectivos contra el desorden a ser tratado. Las clases útiles de otros agentes que pueden ser administrados con anticuerpos humanizados a CD33 incluyen, por ejemplo, anticuerpos a otros receptores expresados en células cancerígenas, agentes antitubulina (por ejemplo, auristatinas), enlazador de unión al surco menor de ADNs (por ejemplo, PBDs), inhibidores de replicación de ADN, agentes alquilantes, (por ejemplo, complejos de platino tales como platino-cis, mono(platino), bis(platino), y complejos de platino tri nuclear y carboplatino), antracielinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizantes de quimioterapia, duimicinas, etoposidas, pirimidinas fluoradas, onoforas, lexitropisinas, nitrosoureas, platinóles, compuestos pre formantes, antimetabolitos purinos, puromicinas, sensibilizantes de radiación, esteroides, taxanos, inhibidores de topoisomerasa, vinca alcaloides, y similares El tratamiento con un anticuerpo derivado del anticuerpo murino 2H12, por ejemplo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, o el anticuerpo h2H12, opcionalmente en combinación con cualquiera de los otros agentes o regímenes descritos anteriormente solos o como un conjugado de medicamento-anticuerpo, pueden incrementar la supervivencia libre de progresión media o el tiempo de supervivencia promedio de pacientes con cáncer (por ejemplo, (por ejemplo, ALL, LMC, LMMC), especialmente cuando se recae o es refractario, por cuando menos 30% o 40% pero preferiblemente 50%, 60% a 70% o incluso 100% o más tiempo, comparado al mismo tratamiento (por ejemplo, quimioterapia) pero sin el anticuerpo derivado del anticuerpo murino 2H12, solo o como un conjugado de medicamento-anticuerpo. Además o alternativamente, el tratamiento (por ejemplo, quimioterapia estándar) que incluye el anticuerpo derivado del anticuerpo murino 2H12, solo o como un conjugado de medicamento-anticuerpo , puede incrementar el índice de respuesta completo, el índice de respuesta parcial, o el índice de respuesta objetiva (completo + parcial) de pacientes con tumores por cuando menos 30% o 40% pero preferiblemente 50%, 60% a 70% o incluso 100% comparado al mismo tratamiento (por ejemplo, quimioterapia) pero sin el anticuerpo derivado del anticuerpo murino 2H12.
Típicamente, en una prueba clínica (por ejemplo, una prueba de fase II, fase II/III o fase III), los incrementos anteriormente mencionados en la supervivencia libre de progresión media y/o índice de respuesta de pacientes tratados con terapia estándar mas el anticuerpo derivado del anticuerpo murino 2H12, relativo al grupo de control de pacientes que reciben únicamente terapia estándar (o más un placebo), son significantes estadísticamente, por ejemplo en el p = 0.05 o 0.01 o incluso en el nivel 0.001. Los índices de respuesta completa y parcial son determinados mediante criterios objetivos usados comúnmente en pruebas clínicas para cáncer, por ejemplo, como se enlista o se acepta por el National Cáncer Institute and/or Food and Drug Administration.
VII. Otras aplicaciones Los anticuerpos anti CD33 descritos aquí pueden ser usados para detectar CD33 en el contexto de diagnosis clínico o tratamiento en investigación. La expresión de CD33 en un cáncer proporciona una indicación de que el cáncer es susceptible a tratamiento con los anticuerpos de la presente invención. Los anticuerpos pueden tambien ser vendidos como reactivos de investigación para investigación en laboratorio para detectar células que tienen CD33 y su respuesta a varios estímulos. En tales usos, los anticuerpos monoclonales pueden ser etiquetados con moléculas fluorescentes, moléculas etiquetadas con espín, enzimas o radioisótopos, y pueden ser proporcionados en la forma de conjunto con todos los reactivos necesarios para realizar la evaluación para CD33. Los anticuerpos descritos aquí, m2hl2 y versiones quimericas o humanizadas de los mismos, por ejemplo, h2H12, pueden ser usados para detectar expresión de proteína CD33 y determinar si un cáncer es tratable con tratamiento con ADCs de CD33. Como un ejemplo, las versiones de murina 2H12 y quiméricas o humanizadas de los mismos, por ejemplo, h2H12, pueden ser usados para detectar expresión de CD33 en linfocitos, linfoblastos, monocitos, mielomonocitos y otras células que expresan CD33. Los anticuerpos pueden también ser usados para purificar una proteína CD33, por ejemplo, mediante afinidad a cromatografía. Cualquier característica, paso, elemento, modalidad, o aspecto de la invención puede ser usado en combinación con cualquier otra amenos que se indique específicamente de otro modo. Aunque la presente invención se ha descrito en detalle por medio de ilustración y ejemmplo para propósitos de claridad y entendmiento, sera aparente que ciertos cambios y modificaciones pueden ser practicados dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
EJEMPLOS I. Generación de anticuerpos anti CD33 Materiales Las lineas de células descritas en los siguientes ejemplos fueron mantenidos en cultivo de acuerdo a las doncidiones especificadas por la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) o la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), (Braunschweig, Germany). Las células LMA primarias fueron mantenidas en medio Dulbecco Modificado con (IMDM) que contiene 20% de FBS activado por calor, suplementado con 25 ng/ml cada uno de factor de estimulo de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor de estímulo de colonia de granulocitos (G-CSF), interleucina-3 (IL-3) y factor de células madre (SCF). Los reactivos de cultivo de células fueron obtenidos de Invitrogen Corp (Carlsbad, CA) y las citoquinas fueron compradas de PeproTech (Rocky Hill, NJ).
Metodologías: Evaluaciones de enlace de saturación Cien mil células positivas a CD33 (HL-60, HEL 92.1.7, y células HEK-293F transfectadas a CD33 de mono macaco cangrejero o humano) fueron transferidas a 96 placas de pozo. AlexaFluor-647 etiquetado CD33 mAb fue añadido en concentraciones que varían de 50 nM a 0.85 pM y las células incubadas en hielo durante 30 minutos. Las células fueron granuladas mediante centrifugación, lavadas 3 veces con una solución de PBS + 1% BSA, y re suspendidas en 125 mL de PBS + 1% BSA. La fluorescencia fue analizada al usar un citómetro de flujo, y el porcentaje de señal fluorescente saturada fue usado para determinar el porcentaje de enlace y para calcular de manera subsecuente el Kd aparente.
Evaluaciones de enlace de competencia Cien mil células positivas a CD33 fueron transferidas a 96 placas de pozo e incubadas durante 1 hora en hielo con AlexaFluor-647 etiquetado m2H12 1 nM y concentraciones incrementantes (de 0.03 nM a 600 nM) de mAb humanizado o quimérico, híbrido no etiquetado. Las células fueron centrifugadas, lavadas 3 veces con PBS, y re suspendidas en 125 mL de una PBS+ solución BSA 1%. La fluorescencia fue analizada al usar un citometro de flujo, y el porcentaje de señal fluorescente saturada fue usada para determinar el porcentaje de mAb 2H12 etiquetado enlazado.
El EC50 fue extrapolado mediante ajuste de los datos a una curva de respuesta de dosis sigmoidea con pendiente variable.
Evaluación de citotoxicidad Las lineas de células LMA o células LMA primarias son tratadas con mAb especifico CD33 y cojugados de medicamento-anticuerpo (ADC) durante 96 horas a 37°C. En algunos experimentos, ADC de enlace no antígeno fue incluido como controles negativos. La viabilidad de celia para las líneas de célula fue medida al usar CelltiterGlo (Promega Corporation, Madison, WI) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las células fueron incubadas durante 25 minutos a temperatura ambiente con reactivos CelltiterGlo y la luminiscencia fue medida en un lector de placa fluorescente HT de fusión (Perkin Elmer, Waltham, MA). Para las células LMA primarias, la viabilidad fue medida mediante citometría de flujo al usar Anexina V y tinción de yoduro de propidio. Los resultados fueron reportados como IC50, la concentración de compuesto necesito una producción a 50% de reducción en viabilidad comparada a células tratadas con vehículo (control = 100%).
Producción de conjugados de medicamento-anticuerpo Los conjugados de medicamento-anticuerpo de los anticuerpos CD33 fueron preparados como se describe en US20050238649 y W02011/130613 al usar los anticuerpos anti CD33 descritos aquí. El enlazador de medicamento SGD-1269 (mcMMAF) es descrito en US20050238649 y el enlazador de medicamento SGD-1910 es descrito en W02011/130613. La preparación de mutantes de cisterna de IgGl mAb es generalmente descrita en US20100158909. El enlazador de medicamento SGD-1269 fue conjugado al anticuerpo anti CD33 h2H12 por medio de un grupo de tiol de un residuo de cisterna de un enlace de disulfuro intercadena y la carga de medicamento promedio fue de aproximadamente de 4 medicamentos por anticuerpo. El enlazador de medicamento SGD-1910 fue conjugado al anticuerpo anti CD33 por medio de un grupo de tiol de un residuo de cisterna introducido en la posición 239 de la cadena de IgGl del anticuerpo y la carga de medicamento promedio fue aproximadamente de 2 medicamentos por anticuerpo. Los anticuerpos con cisteína en la posición 239 llevan la designación EC, por ejemplo, por ejemplo, h2H12EC o hOOEC Estudio de actividad in Vivo Modelos de LMA diseminado Ratones CB-17/lcrHsd-PrkdcSCID (SCID) fueron inoculados de manera intravenosa con 5x1O6 HL-60 células de tumor en la vena de la cola. Un día después de la inoculación de tumor, los ratones (n= 8/grupo) fueron no tratados o dosificados de manera intraperitoneal cada cuatro días para un total de dos dosis con mAb de CD33 y ADC o mAb de control sin enlace y ADC. Mylotarg dosificado intraperitonealmente cada siete días para un total de dos dosis fue incluido como un control positivo en este modelo LMA sensible a Mylotarg. Se les aplicó eutanasia a los animales cuando la pérdida de peso corporal fue ³20%, o cuando los ratones mostraron signos de enfermedad manifestada como síntomas de sistema nervioso central que incluyen inflamación craneal y/o parálisis de miembros posteriores, o desarrollo de una masa de tumor diseminada palpable.
Modelos LMA subcutáneos Los ratones SCID fueron inoculados de manera subcutánea con 5x10s HL-60 o células de tumor TFl-P LMA. El crecimiento de tumor fue monitoreado con calibradores y el volumen de tumor promedio fue calculado al usar la fórmula (0.5 x [longitud x ancho2]). Cuando el volumen de tumor promedio alcanzo aproximadamente 100 mm3, los ratones (n=6-7/grupo) fueron no tratados o dosificados intraperitonealmente con una dosis única de ADC de CD33 o ADC de control sin enlace. Para el modelo HL-60, los ratones fueron tratados con IVIg humano (inyección intraperitoneal única de 10 mg/kg) aproximadamente cuatro horas previo a administración del anticuerpo terapéutico para minimizar interacción del ADC de prueba con receptores Fe en células LMA. Se les aplicó eutanasia a los ratones cuando los volúmenes de tumor alcanzaron aproximadamente 1000 mm3. Todos los procedimientos en animales fueron realizados bajo un protocolo aprobado por el Animal Care and Use Committee en una instalación acreditada por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care.
Resultados 1. Generación de mAb CD33 murino Los anticuerpos dirijidos al antigeno humano CD33 fueron generados en ratón Balb/c mediante inmunización con proteína de fusión CD33 humana FC recombinante. El mAb murino 2hl2 (m2H12) fue seleccionado basado en la afinidad de enlace para CD33 humana y CD33 macaco cangrejero para permitir pruebas preclínicas en primates no humanos. 2. Diseño y pruebas de anticuerpos humanizados Los anticuerpos humanizados fueron derivados del anticuerpo murino 2hl23. Nueve cadenas pesadas humanizadas (HA-HI) y siete cadenas ligeras humanizadas (LA-LG) fueron incorporando de vuelta muraciones en diferentes posiciones. Ver, Figuras 1A, IB un alineamiento de secuencia y Tablas 1- 4.
Tabla 1 Mutaciones humanizantes en variantes de cadena pesada Tabla 2 Mutaciones humanizantes en Variantes de Cadena Ligera Tabla 3 Mutaciones Específicas en Variantes de Cadena Pesada 2H12 Variante H38 H40 H48 H66 H67 H69 HA R A M R V M HB R A M R V M HC R A M R V M HD R A M R V M HE R A I* R V M HF N* R* M R V M HG R A M K* A* L* HH R A M R V M HI R A I* K* A* L* (continúa) Variante H71 H73 H82A H83 H94 HA T T R R R HB A* T R R R HC T T R R S* HD T K* R R R HE T T R R R HF T T R R R HG T T R R R HH T t S* t* R HI A* t R R S* *Residuos de ratón Tabla 4 mutaciones especificas en variantes de cadena ligera 2H12 Variante L3 L20 L22 L46 L69 L71 LA Q T T S T F LB K* T T S T F LC Q T T T* T F LD Q T T S Q* F LE Q T T S T Y* LF Q I* N* S T F ¨Residuos de ratón Las cadenas pesadas y ligeras humanizadas fueron emparejadas con cadenas ligeras y pesadas quimericas (cadenas quiméricas compuestas de regiones variables murinas y regiones constantes humanas) respectivamente. Las variantes híbridas humanizadas/quiméricas de CD33 mAb son probadas para enlace a CD33 humana expresada en la superficie de las células LMA HEL 92.1.7 (Tabla 5). Las cadenas pesadas HC y HI son seleccionadas para estudio adicional. Los anticuerpos humanizados fueron expresados al representar permutaciones de cadenas pesadas humanizadas HC y HI y cadenas ligeras humanizadas LA, LE y LG y enlazar a células que expresan CD33 humana o de macaco cangrejero (cyno) fue determinado (Tabla 6). El anticuerpo HILG (2H12 HILG) fue seleccionado como el anticuerpo humanizado que se asemejaba más a las características del CD33 murino CD33 mAb m2H12. El anticuerpo HILG es referido como el anticuerpo h2H12 (anticuerpo humano 2H12). El KD para m2H12, h2H12, y h2H12 con una mutación S239C (numeración EU) en la cadena pesada IgGl (referido como h2H12EC, para cisterna adaptada), fue determinado para CD33 humana expresada como una proteína endógena en dos líneas de células de LMA o como una proteína recombinante en una línea de células HEK293F. El KD para estos anticuerpos fue también determinado para CD33 macaco cangrejero expresado como una proteína recombinante en una línea de célula HEK293F (Tabla 7).
Tabla 5 EC50 Determinaciones de enlace para variantes de CD33 mAb Hibrido Quimérico-Humanizado en CD33 que expresa Células LMA HEL9217 El DNB, no enlazó; m, murina; cH, cadena pesada quimérica; cL, cadena ligera quimérica Tabla 6 Determinaciones de Enlace EC50 para Variantes mAb CD33 humanizado en células CD33 humanas y Células que expresan CD33 de macaco cangrejero Tabla 7 Mediciones de Afinidad de mAbs CD33 Humanizadas y Células que Expresan CD33 de Macaco cangrejero ND, no hecho Actividad anti tumor la Vitro de h2H12 ADC La actividad citotóxica de conjugados de medicamento-anticuerpo h2Hl2 fue probada al usar dos sistemas enlazadores de medicamento, SGD-1269 (enlazador de medicamento de auristatina) y SGD-1910 (enlazador de medicamento dímero pirrolobenzodiazepina). Una evaluación de citotoxicidad fue realizada contra dos líneas de células LMA positivas a CD33, HL-60 y HEL 92.1.7, al usar anticuerpo no conjugado, h2H12- ADCs y ADCs de control que no enlazan a CD33. Como se muestra en la Figura 2, h2H12 y h2H12EC (también referido como h2H12d) los anticuerpos no conjugados no tenían actividad contra ninguna línea de células. De manera similar, los ADCs de control sin enlace (hOOEC-SGD-1910 y h.00-SGD-1269) no fueron citotóxicos. En contraste, h2H12EC-SGD-1910 fue citotóxico hacia HL-60 (IC50 ~ 1.6 ng/mL) y HEL 92.1.7 (IC50 -12.9 ng/mL). La actividad del h2H12EC-SGD-1910 fue similar a la del Mylotarg, un conjugado de medicamento-anticuerpo dirigido anti CD33 bien descrito, en las células HL-60 y más potente cuando se probó contra HEL 92.1.7 (una línea de células (MDR) resistente a multi medicamentos (MDR)), donde el Mylotarg es inefectivo. m2H12-SGD-1269 y h2H12-SGD-1269 fueron activos contra las células HL-60 (IC50 de 1.3 ng/mL y 5.3 ng/mL, respectivamente) y en un grado menor a HEL 92.1.7 (Figura 2). En experimentos separados, h2H12-SGD-1269 y h2H12EC-SGD-1910 fueron probados adicionalmente contra un panel expandido de líneas de células LMA positivo a CD33. Como se muestra en la tabla 8, h2H12-SGD-1269 fue inactivo contra 4 de 7 líneas de células LMA (IC50 promedio para líneas de células responsivas, 72.8 mg/mL), y h2H12EC-SGD-1910 tuvo actividad potente contra 7 de 7 líneas de células probadas (IC50 promedio, 20.4 ng/mL). h2H12EC-SGD-1910 fue más potente que Mylotarg, el cual fue activo en 3 de 8 líneas de células LMA positivas a CD33. Ninguna actividad fue observada cuando los ADCs fueron probados contra tres líneas de células que no fueron de origen LMA y no expresaron CD33 (Tabla 8). En general, estos datos demuestran que los conjugados de medicamento-anticuerpo h2H12 y h2H12EC seleccionan de manera selectiva células positivas a CD33 y muestran actividad citotóxica hacia esas células.
Tabla 8 Actividad In vi tro de conjugados de medicamento h2H12 y Mylotarg contra lineas de células AML (continúa) MDR, resistencia a multi medicamentos; +, eflujo de tinte > 2-veces sobre fondo, NT, no probado En Vivo Actividad Anti-Tumor de h2H12 ADC La actividad de h2H12-SGD-1269 fue probada en un modelo en el cual la línea de celulas LMA HL-60 se introdujo en ratones SCID una enfermedad diseminada de iniciación. Los ratones fueron tratados el día siguiente con anticuerpo h2H12, anticuerpo de control negativo IVIg no específico, h2H12-SGD-1269, un ADC de control sin enlace (hBU12-SGD-1269) o Mylotarg de acuerdo a los niveles de dosis y itinerario descrito en la Tabla 9. La supervivencia media de ratones inoculados con HL-60 incrementó de 22 días en los grupos no tratados o grupos tratados con IVIg humanos a 29 días (p=0.007), 41 días (p=0.001) y 52 días (p< 0.001) en grupos que reciben h2H12 (3 mg/kg) y 1 o 3 mg/kg de h2H12-SGD-1269 respectivamente (Tabla 9). h2H12EC-SGD-1269 prolongó supervivencia similar a la del ratón que recibió dosis de h2H12-SGD-1269 (supervivencia media de 50 y 52 días respectivamente). El Mylotard también fue activo en este modelo negativo a MDR; del 50% de ratones tratados con Mylotarg sobrevivieron al final del estudio en el día 99. La supervivencia de ratones tratados con el anticuerpo no conjugado h2H12 o el ADC de control sin enlace (hBU12-SGD-1269) se prolongó 6-7 comparado a ratones de control no tratados, pero en un grado mucho menor que en ratones tratados con ADC que selecciona CD33.
Tabla 9 Actividad de conjugado de medicamento h2H12-SGD-1269 en modelo de xenoinjerto HL-60 LMA diseminado 1 Prueba contra no tratado 2 Prueba contra hlVIg 3 Prueba contra hBU12-SGD-1269 (ADC de control sin enlace) NS, no significante; NR, no alcanzado; - , no aplicable; hlVIG, inmunoglobulina intravenosa humana; hBU12-SGD-1269, ADC de control sin enlace.
La actividad de h2H12EC-SGD-1910 fue probada en dos modelos de xenoinjerto LA subcutáneos, HL-60 y TFl-G. Los ratones SCID que llevaban tumores establecidos (~ 100mm3) fueron dosificados con h2H12EC-SGD-1910 o ADC de control sin enlace (h00EC-SGD-1910) como se describe en la Tabla 10 para el modelo HL-60 y en la Tabla 11 para el modelo TFl-Olfa tumor. El tratamiento con h2H12EC-SGD-1910 disminuyo de manera significativa el crecimiento de tumor comparado a ratones tratados con ADC de control sin enlace y no tratados como9 se midió por el tiempo medio para tumores en un volumen cuádruple (Tablas 10 y 11). La actividad anti tumor observada con ADC objetivo a CD33 fue dependiente de dosis. Para tumores HL-60, una única dosis de 0.1 mg/kg resultó en una regresión de tumor completa y durable en 6 de 6 ratones tratados. Una dosis menos de 0.03 mg/kg resultó en regresión completa en 1 de 6 ratones tratados y extender el tiempo para cuadruplicación del tumor a 20 días comparado a 15 días para ratones no tratados y aquellos dosificados de manera similar con el ADC de control sin enlace (h00d-SGD-1910). En el modelo positivo a modelo MDR TFl-Dlfa tumor (Tabla 11), una única dosis de 0.3 mg/kg de h2H12EC-SGD-1910 resultó en regresión de tumor completa y durable en 5 de 7 ratones tratados. El día medio a la cuadruplicación de tumo no se alcanzó al final del estudio en el día 117. En contraste, los tumores en ratones dosificados de manera similar con ADC de control sin enlace (h00EC-SGD-1910) cuadruplicaron en volumen por 27 días. De manera similar, el tiempo medio para tumores para cuadruplicarse en ratones dosificados con 0.1 mg/kg o 0.03 mg/kg de h2H12EC-SGD-1910 fue significativamente más largo (p=0.0001) que el de ratones no tratados o tratados con hOOEC-SGD-1910. Mylotarg no fue activo en el modelo de tumor TF1-C3; el crecimiento de tumor de ratones tratados Myelotarg no fue diferente que ratones no tratados. Tomados juntos, los datos demuestran que ADC h2H12 muestra actividad anti tumor en modelos de xenoinjerto LMA que es dependiente de dosis y significativamente mayor que ADC sin objetivo.
Tabla 10 Actividad de conjugado de medicamento h2H12EC-SGD-1910 en modelo de xenoinjerto HL-60 LMA subcutáneo NS, no significativo; NR, no alcanzado; - , no aplicable; hlVIg, inmunoglobulina intravenosa humana (administrada 4 horas previo a dosificación de ADC); hOOEC-SGD-1910, ADC de control sin enlace; DCR, respuesta completa durable (tumor no medible al final del estudio en el día 50) Tabla 11 Actividad del conjugado de medicamento h2H12EC-SGD-1910 en modelo de xenoinjerto TFl-DlfaMA subcutáneo NS, no significativa; NR, no alcanzada; no aplicable; h00EC-SGD-1910, ADC de control sin enlace; DCR, durable complete response (tumor no medible al final del estudio en el día 117) Listado de Secuencia SEQ ID NO:1, Cadena ligera 2H12 Murina DIKMTQSPSSMYASLGERVIINCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSR FSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK SEQ ID NO:2, 2H12 LA DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:3, 2H12 LB DIKMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:4, 2H12 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:5, 2H12 LD DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPS RFSGSGSGQDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:6, 2H12 LE DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:7, 2H12 LF DIQMTQSPSSLSASVGDRVIINCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:8, 2H12 LG DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPS RFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:9 Cadena pesada 2H12 Murina 1 QVQLQQSGPE LVRPGTFVKI SCKASGYTFT NYDINWVNQR PGQGLEWIGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKAKATL TADKSSSTAY LQLNNLTSEN SAVYFCASGY EDAMDYWGQG TSVTVSS SEQ ID NO:102H12 HA 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVRQA PGQGLEWMGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKARVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:112H12 HB 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVRQA PGQGLEWMGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKARVTM TADTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:12 2H12 HC 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVRQA PGQGLEWMGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKARVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCASGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO : 13 2H12 HD 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVRQA PGQGLEWMGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKARVTM TTDKSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:14 2H12 HE 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVRQA PGQGLEWIGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKARVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:15 2H12 HF 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVNQR PGQGLEWMGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKARVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:16 2H12 HG 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVRQA PGQGLEWMGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKAKATL TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:17 2H12 HH 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVRQA PGQGLEWMGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKARVTM TTDTSTSTAY MELSSLTSDD TAVYYCARGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:18 2H12 HI 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVRQA PGQGLEWIGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKAKATL TADTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCASGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:19 CDR1 cadena pesada 2H12 SEQ ID NO:21 CDR3 cadena pesada 2H12 GYEDAMDY SEQ ID NO:22 CDR1 cadena ligera 2H12 KASQDINSYLS SEQ ID NO:23 CDR2 cadena ligera 2H12 RANRLVD SEQ ID NO:24 CDR3 cadena ligera 2H12 LQYDEFPLT SEQ ID NO:25<Región constante de cadena ligera;PRT/l;homo sapiens> TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO:26<CH1-CH3;PRT/l;homo sapiens> ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO :27<cadena pesada CHl - CH3 (sin c-término K);PRT/1;homo sapiens> ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV F S C S VMHE ALHNH YTQ KSLSLSPG SEQ ID NO:28<S239C cadena pesada CHl - CH3;PRT/1;homo sapiens> ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPC VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:29<S239C cadena pesada CHl - CH3 (sin c-término K);PRT/1;homo sapiens> ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPC VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:30 <h2H12 mAb líder de cadena ligera > MDMRTPAQFLGILLLWFPGIKC SEQ ID NO:3l<h2H12 mAb líder de cadena pesada > MGWRWIFLFLLSGTAGVHC SEQ ID NO:32 > 2H12 LA gacatccagatgacccagtctccatcctcaetgtctgcatctgtaggagacagagtcacea tcacttgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaaccagg gaaagcccctaagtccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtcccatcaagg ttctctggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaag attttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttggaggagggac caaggtggagatcaaa SEQ ID NO:33 > 2H12 LB gacatcaagatgacccagtctccatcctcaetgtctgcatctgtaggagacagagtcacea tcacttgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaaccagg gaaagcccctaagtccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtcccatcaagg ttctctggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaag attttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttggaggagggac caaggtggagatcaaa SEQ ID NO:34 > 2H12 LC gacatccagatgacccagtctccatcctcaetgtctgcatctgtaggagacagagtcacea tcacttgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaaccagg gaaagcccctaagaccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtcccatcaagg ttctctggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaag attttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttggaggagggac caaggtggagatcaaa SEQ ID NO:35 > 2H12 LD gacatccagatgacccagtctccatcctcaetgtctgcatctgtaggagacagagtcacea tcacttgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaaccagg gaaagcccctaagtccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtcccatcaagg ttctctggcagtggatctgggcaagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaag attttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttggaggagggac caaggtggagatcaaa SEQ ID NO:36 > 2H12 LE gacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcacea tcacttgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaaccagg gaaagcccctaagtccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtcccatcaagg ttctctggcagtggatctgggacagattatactctcaccatcagcagcctgcagcctgaag attttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttggaggagggac caaggtggagatcaaa SEQ ID NO:37 > 2H12 LF gacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcatta tcaattgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaaccagg gaaagcccctaagtccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtcccatcaagg ttctctggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaag attttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttggaggagggac caaggtggagatcaaa SEQ ID NO:38> 2H12 LG gacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcacca tcaattgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaaccagg gaaagcccctaagaccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtcccatcaagg ttctctggcagtggatctgggcaagattatactctcaccatcagcagcctgcagcctgaag attttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttggaggagggac caaggtggagatcaaa SEQ ID NO:39 > 2H12 HA caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtct cctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacaggcccc tggacaagggcttgagtggatgggatggatttatcctggagatggtagtaccaaatataat gagaaattcaaggccagagtcaccatgaccacagacacatccaccagcacagcctacatgg agctgaggagcGtgagatGtgatgacacagctgtgtattactgtgc!tagaggatatgaaga tgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca SEQ ID NO:40 > 2H12 HB caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtct cctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacaggcccc tggacaagggcttgagtggatgggatggatttatcctggagatggtagtaccaaatataat gagaaattcaaggccagagtcaccatgacagctgacacatccaccagcacagcctacatgg agctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgctagaggatatgaaga tgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca SEQ ID NO:41 > 2H12 HC caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtct cctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacaggcccc tggaGaagggcttgagtggatgggatggatttateGtggagatggtagtaGGaaatataat gagaaattcaaggccagagtcaccatgaccacagacacatccaccagcacagcctacatgg agctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgcttctggatatgaaga tgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca SEQ ID NO : 42 > 2H12 HD caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtct cctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacaggcccc tggacaagggcttgagtggatgggatggatttatcctggagatggtagtaccaaatataat gagaaattcaaggccagagtcaccatgaccacagacaagtccaccagcacagcctacatgg agctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgctagaggatatgaaga tgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca SEQ ID NO:43 > 2H12 HE Caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtct cctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacaggcccc tggacaagggcttgagtggattggatggatttatcctggagatggtagtaccaaatataat gagaaattcaaggccagagtcaccatgaccacagacacatccaccagcacagcctacatgg agctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgctagaggatatgaaga tgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca SEQ ID NO:44> 2H12 HF caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtct cctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgaaccagaggcc tggacaagggcttgagtggatgggatggatttatcctggagatggtagtaccaaatataat gagaaattcaaggccagagtcaceatgaccacagacacatccaccagcacagcctacatgg agctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgctagaggatatgaaga tgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca SEQ ID NO:45 > 2H12 HG caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtct cctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacaggcccc tggacaagggcttgagtggatgggatggatttatcctggagatggtagtaccaaatataat gagaaattcaaggccaaggctaccctgaccacagacacatccaccagcacagcctacatgg agctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgctagaggatatgaaga tgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca SEQ ID NO:46 > 2H12 HH caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtct cctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacaggcccc tggacaagggcttgagtggatgggatggatttatcctggagatggtagtaccaaatataat gagaaattcaaggccagagtcaccatgaccacagacacatccaccagcacagcctacatgg agctgagcagcctgacctctgatgacacagctgtgtattactgtgctagaggatatgaaga tgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca SEQ ID NO:47 > 2H12 HI caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtct cctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacaggcccc tggacaagggcttgagtggattggatggatttatcctggagatggtagtaccaaatataat gagaaattcaaggccaaggctaccctgacagctgacacatccaccagcacagcctacatgg agctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgcttctggatatgaaga tgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca SEQ ID NO:48<región constante de cadena ligera;ADN; homo sapiens> acggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaa ctgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaa ggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaag gacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacaca aagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaa caggggagagtgt SEQ ID NO : 49<CH1-CH3 ;ADN;homo sapiens> gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggg gcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctg gaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcagga etctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctaca tctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatc ttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtca gtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtca catgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtgga cggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtac cgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagg gcagccccgagaaccacaggtgt caecetgcccccatcccgggatgagctgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtggg agagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacgg ctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtc ttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccc tgtctccgggtaaa SEQ ID NO:50<CH1-CH3 (s/c c-término K);ADN;homo sapiens> gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggg gcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctg gaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcagga ctctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctaca tctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatc ttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtca gtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtca catgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtgga cggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtac cgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagg gcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtggg agagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacgg ctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtc ttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccc tgtctccgggt SEQ ID NO:51<S239C CH1-CH3;ADN;artificial> gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggg gcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctg gaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcagga ctctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctaca tctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatc ttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtgt gtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtca catgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtgga cggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtac cgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagg gcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtggg agagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacgg ctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtc ttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccc tgtctccgggtaaa SEQ ID NO:52<S239C CH1-CH3 (s/c C-término K);ADN;artificial> Gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggg gcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctg gaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcagga ctctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctaca tctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatc ttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtgt gtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtca catgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtgga cggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtac cgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagg gcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtggg agagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacgg ctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtc ttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccc tgtctccgggt SEQ ID NO:53 <h2H12 mAb líder de cadena ligera> Atggacatgaggacccctgctcagtttcttggaatcttgttgctctggtttccaggtatca aatgt 129 H48, H66, H67, H69, H71 y H94 son ocupadas por I, K, A, L, A y S respectivamente, y una región variable de cadena ligera madura que comprende las 3 CDRs de SEQ ID NO:8, y donde las posiciones L22, L46, L69 y L71 son ocupadas por N, T, Q y Y, respectivamente. 40. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 39, en donde tiene una constante de asociación para CD33 humana o de mono macaco cangrejero de 0.5 a 2 x 109 M-l. 41. Un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada madura y/o una región variable de cadena ligera madura como se define por conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 o reivindicaciones 21-40. 42. Un método de tratar un paciente que tiene o en riesgo de cáncer, en donde comprende administrar al paciente un régimen efectivo de un anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-40. 43. El método de conformidad con la reivindicación 42, en donde el cáncer es leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia promielocitica aguda (LPA), leucemia mielogena crónica (LMC), leucemia mielomonocitica crónica (LMMC), un desorden mieloproliferativo crónicos, leucemia linfoblástica aguda de célula B precursora (preB-ALL), leucemia linfoblástica aguda egaivsldspvatnkldqevreetqgrfrllgdpsrnncslsivdarrrdngsyffrtnekg stkysykstqlsvhvtdlthrpqilipgaldpdhsknltcsvpwaceqgtppifswmsaap tslglrtthssvliitprpqdhgtnltcqvkfpgagvttertiqlnvsyasqnprtdiflg dgsgkqgw qgaiggagvtvllalclclifftykthrrkaartavgridthpatgptsskh qkksklhgatetsgcsgttltvemdeelhyaslnfhgmnpsedtstcysevrtq

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a la proteína CD33 humana, en donde el anticuerpo comprende tres regiones de cadena pesada determinantes complementarias (CDRs): cadena pesada CDR1 que consiste de SEQ ID NO:19, cadena pesada CDR2 que consiste de SEQ ID NO:20, y cadena pesada CDR3 que consiste de SEQ ID NO:21; y tres CDRs de cadena ligera: cadena pesada CDR1 que consiste de SEQ ID NO:22, cadena ligera CDR2 que consiste de SEQ ID NO:23, y cadena ligera CDR3 que consiste de SEQ ID NO:24. 2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es seleccionado de un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, y un anticuerpo humanizado. 3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado 2H12. 4. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 3, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de aminoácidos cuando menos 90% idéntica a SEQ ID NO:18 siempre que la posición H48 es ocupada por I, la posición H66 es ocupada por K, la posición H67 es ocupada por A, la posición H69 es ocupada por L, la posición H71 es ocupada por A, y la posición H94 es ocupada por S y una región variable de cadena ligera madura cuando menos 90% identica a SEQ ID NO:8 siempre que la posición L22 es ocupada por N, la posición L46 es ocupada por T, la posición L69 es ocupada por Q, y la posición L71 por Y, como se determina por el sistema de numeración Kabat. 5. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 3, en donde comprende una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de aminoácidos cuando menos 95% idéntica a SEQ ID NO:18 y una región variable de cadena ligera madura cuando menos 95% idéntica a SEQ ID NO:8. 6. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 3, en donde la región variable de cadena pesada madura es fusionada a una región constante de cadena pesada y la región variable de cadena ligera madura es fusionado a una región constante de cadena ligera. 7. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 3, en donde la región constante de cadena pesada es una forma mutante de región constante humana natural la cual tiene enlace reducido a un receptor Fcy relativo a la región constante humana natural. 8. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 2, en donde la región constante de cadena pesada es de isotipo IgGl. 9. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicaciones 3-6, en donde la región constante de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:27 y la región constante de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:25. 10. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 3, en donde la región constante de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:29 (S239C) y la región constante de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:25. 11. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 3, en donde la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO:18 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 8. 12. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo es conjugado a un agente citotóxico o citoestático. 13. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 12, en donde el anticuerpo es conjugado a un agente citotóxico. 14. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13, en donde el agente citotóxico es conjugado al anticuerpo por medio de un enlazador escindible de enzima. 15. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 o 14, en donde el agente citotóxico es un enlazador de unión al surco menor de ADN. 16. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde el agente citotóxico tiene la fórmula 17. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 en donde tiene una constante de asociación para humano o mono macaco cangrejero CD33 de 0.5 a 2 x 109 M~ i 18. Un método de tratar un paciente que tiene o en riesgo de tener un cáncer que expresa CD33, en donde comprende administrar al paciente un régimen efectivo de un anticuerpo humanizado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde el cáncer es leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia promielocitica aguda (LPA), leucemia mielogena crónica (LMC), leucemia mielomonocitica crónica (LMMC), un desorden mieloproliferativo crónicos, leucemia linfoblástica aguda de célula B precursora (preB-ALL), leucemia linfoblástica aguda de célula T precursora (preT-ALL), mieloma múltiple (MM), enfermedad de mastocito, o Sarcoma mieloide. 20. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo humanizado o quimérico de conformidad con la reivindicación 1. 21. Un anticuerpo humanizado en donde comprende una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de aminoácidos cuando menos 90% idéntica a HI (SEQ ID NO:18) y una región variable de cadena ligera madura cuando menos 90% idéntica a LG (SEQ ID NO:8). 22. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 21, en donde comprende una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de aminoácidos cuando menos 95% idéntica a HI y una región variable de cadena ligera madura cuando menos 95% idéntica a LG. 23. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 21 o 22, siempre que la posición H94 sea ocupada por S. 24. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 21 o 22, siempre que las posiciones H48, H66, H67, H69, H71 y H94 sean ocupadas por I, K, A, L, A y S, y L22, L46, L69 y L71 son ocupadas por N, T, Q y Y. 25. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-24, siempre que cualquier diferencia en los marcos de región variable de la región variable de cadena pesada madura y SEQ ID NO:18 son seleccionados del grupo que consiste de la posición H48 ocupada por I, la posición H66 ocupada por K, la posición H67 ocupada por A, la posición H69 ocupada por L, la posición H71 ocupada por A, la posición H94 ocupada por S; y que cualesquier diferencias en los marcos de región variable de la región variable de cadena ligera madura y SEQ ID NO:8 son seleccionados del grupo que consiste de la posición L22 ocupada por N, la posición L46 ocupada por T, la posición L69 ocupada por Q, y la posición L71 ocupada por Y. 26. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-25, en donde los 3 CDRs de la región variable de cadena pesada madura son aquellos de SEQ ID NO:18 y los 3 CDRs de la región variable de cadena ligera madura son aquellos de SEQ ID NO:8. 27. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-26, en donde la región variable de cadena pesada madura es fusionada a una región constante de cadena pesada y la región variable de cadena ligera madura es fusionado a una región constante de cadena ligera. 28. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-27, en donde la región constante de cadena pesada es una forma mutante de región constante humana natural la cual tiene enlace reducido a un receptor Fcy relativo a la región constante humana natural. 29. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-28, en donde la región constante de cadena pesada es de isotipo IgGl. 30. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-27 o 29, en donde la región constante de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:27 y la región constante de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:25. 31. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-27 o 29, en donde la región constante de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:29 (S239C) y la región constante de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:25. 32. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-31 siempre que cualesquier diferencias en CDRs de la región variable de cadena pesada madura de SEQ ID NO:18 reside en las posiciones H60-H65. 33. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-32, en donde la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:18 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:8. 3 . El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-33, en donde el anticuerpo es conjugado a agente citotóxico o citoestático. 35. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 34, en donde el anticuerpo es conjugado a un agente citotóxico. 36. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 35, en donde el agente citotóxico es conjugado al anticuerpo por medio de un enlazador escindible de enzima. 37. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 35 o 36, en donde el agente citotóxico es un enlazador de unión al surco menor de ADN. 38. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 34-37, en donde el agente citotóxico tiene la fórmula 39. Un anticuerpo humanizado en donde comprende una región variable de cadena pesada madura en donde comprende los 3 CDRs de SEQ ID NO:18 y donde las posiciones 119 SEQ ID NO:54 <h2H12 mAb líder de cadena pesada > Atgggatggagatggatctttcttttcctcctgtcgggaactgcaggtgtccattgc SEQ ID NO:55 proteína CD33 P20138, homo sapiens 1 mplllllpll wagalamdpn fwlqvqesvt vqeglcvlvp ctffhpipyy dknspvhgyw 61 fregaiisrd spvatnkldq evqeetqgrf rllgdpsrnn cslsivdarr rdngsyffrm 121 ergstkysyk spqlsvhvtd lthrpkilip gtlepghskn ltcsvswace qgtppifswl 181 saaptslgpr tthssvliit prpqdhgtnl tcqvkfagag vttertiqln vtyvpqnptt 241 gifpgdgsgk qetragw hg aiggagvtal lalclcliff ivkthrrkaa rtavgrndth 301 pttgsaspkh qkksklhgpt etsscsgaap tvemdeelhy aslnfhgmnp skdtstcyse 361 vrtq SEQ ID NO:56 proteína CD33, de macaco cangrejero mpl11Ipl1wagalamdprvrlevqesvtvqeglcvlpctffhpvpyhtrnspvhgywfr egaivsldspvatnkldqevqeetqgrfrllgdpsrnncslsivdarrrdngsyffrmekg stkysykstqlsvhvtdlthrpqilipgaldpdhsknltcsvpwaceqgtppifswmsaap tslglrtthssvliitprpqdhgtnltcqvkfpgagvttertiqlnvsyasqnprtdiflg dgsgkqgw qgaiggagvtvllalclclifftykthrrkaartavgridthpatgptsskh qkksklhgatetsgcsgttltvemdeelhyaslnfhgmnpsedtsteysevrtq SEQ ID NO:57 proteína CD33, de macaco cangrejero mpllllpllwagalamdprvrlevqesvtvqeglcvlvpctffhpvpyharnspvhgywfr de célula T precursora (preT-ALL), mieloma múltiple (MM), enfermedad de mastocito, o Sarcoma mieloide. 44. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo humanizado de conformidad con cualquier reivindicación precedente. 45. Un método de tratar un paciente que tiene o en riesgo de tener leucemia mieloide aguda (LMA), en donde comprende administrar al paciente un régimen efectivo de un anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, 21-33 o 39-40. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, en donde el anticuerpo es conjugado a agente citotóxico o citoestático. 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, en donde el anticuerpo es conjugado a un agente citotóxico. 48. El método de conformidad con la reivindicación 47, en donde el agente citotóxico es conjugado al anticuerpo por medio de un enlazador escindible de enzima. 49. El método de conformidad con la reivindicación 47 o 48, en donde el agente citotóxico es un enlazador de unión al surco menor de ADN. 50. El método de conformidad con las reivindicaciones 47-49, en donde el agente citotóxico tiene la fórmula
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