KR102306493B1 - 접합을 위한 ｃｈｏ 세포 배양물로부터의 항체 제조 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 부분적으로는 CHO 세포 산화 효소, 특히, QSOX1이 외관상 엄격한 항체 정제 공정을 견뎌낼 수 있으며, 이로써, 후속되는 항체의 약물에의 접합 효율을 감소시킨다는 관찰 결과에 기초한다. 산화 효소가 정제 과정을 견뎌내는지 여부는 항체마다 달라질 수 있는, 사용되는 정제 기법에 의존한다. CHO 세포 산화 효소를 포함하는 오염이 후속되는 접합에 대해 잠재적인 문제가 된다는 지식하에, CHO 산화 효소(들)를 제거하거나, 또는 적어도 허용되는 수준으로까지 감소시키는, 임의의 항체를 위해 적합한 정제 방식이 고안될 수 있다.

Description

접합을 위한 ＣＨＯ 세포 배양물로부터의 항체 제조 {PREPARING ANTIBODIES FROM CHO CELL CULTURES FOR CONJUGATION}
본 출원은 2013년 11월 25일 출원된 미국 가출원 번호 61/908,568의 이익을 주장하고, 상기 가출원은 그 전문이 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
서열 목록
2014년 11월 21일 작성된 11 KB의 파일명이 3100-00111PC-ST25.txt인 서열 목록이 본원에서 참조로 포함된다.
수백 개의 임상 시험 후, 현재까지 약 30여 종의 모노클로날 항체가 암, 자가면역 질환 및 감염원을 비롯한 다양한 적응증 치료를 위한 것으로 FDA로부터 승인을 받았다. 더 많은 항체가 승인을 받지 못하는 한가지 이유는 항체 단독으로 제공하는 작용 기전, 예컨대, 이펙터 기능 또는 수용체-리간드 상호작용 차단이 상당한 치료학적 효과를 보일 정도로 충분히 강력하지 못할 수도 있기 때문이다. 항체-약물 접합체 (ADC)는 추가의 기전, 특히, 항체에 커플링된 독성 모이어티를 세포 내부로 전달하여 세포를 사멸시키거나, 또는 다르게는 그의 증식을 억제시키는 것과 같은 기전을 제공한다. 현재 2종의 ADC: 브렌툭시맙 베도틴 및 트라스투주맙 엠탄신이 시판되고 있다. 다른 ADC 다수가 다양한 개발 단계에 있다. ADC의 제조는 항체 발현 및 정제에 이어서, 보통은 링커를 통한 항체의 약물에의 화학적 접합을 포함한다.
도 1: 산화 불순물이 약물 로드에 미치는 영향. 명시된 시점에 샘플을 환원시키고, 접합시켰다. 시간이 경과함에 따라 접합 수준이 감소하는 경향은 산화 불순물이 존재한다는 것을 나타내는 것이다.
도 2a-2c: SEC 분리 이후의 분획 중 항체 제제 (로트 DEVNKB-1)에서의 산화 활성 (도 2a). 항-ALR (간 재생 활성인자) 및 항-QSOX1 항체로 염색된 SEC 분획의 웨스턴 블롯 (각각 도 2b 및 2c).
도 3a-c: 포로스 단백질 A(Poros Protein A) 칼럼 상에서의 항체 제제 (로트 DEVNKB-1)의 분별 (도 3a); 각 분획에서의 산화 활성 (도 3b); 및 풀링된 분획 3 및 4의 단백질 함량을 보여주는 SDS-PAGE 겔의 영상 (도 3c). 화살표는 70 kDa QSOX1 및 76 kDa QSOX2와 일치하는 분자량을 나타내는 것이다.
정의
단리된 항체 또는 ADC는 간섭 단백질 및 그의 생성 또는 정제로부터 발생하는 다른 오염물질에 대해 전형적으로 50% w/w 이상 순수하지만, 이는 모노클로날 항체가 그의 사용을 용이하게 하기 위한 과량의 제약상 허용되는 담체(들) 또는 다른 비히클과 조합될 수 있다는 가능성을 배제하는 것은 아니다. 종종, 모노클로날 항체 또는 ADC는 간섭 단백질, 및 생성 또는 정제로부터의 오염물질에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 95 또는 99% w/w 이상 순수하다.
단독의, 또는 ADC 성분으로서의 모노클로날 항체의 그의 표적 항원에의 특이적인 결합이란, 친화도가 106, 107, 108, 109, 또는 1010 M-1 이상인 것을 의미한다. 특이적인 결합은 1종 이상의 비관련 표적에 대하여 발생하는 비특이적인 결합보다 규모가 검출 가능할 정도로 더 높고, 그와 구별 가능하다. 특이적인 결합은 특정 관능기 또는 특정 공간 끼워맞춤(spatial fit) (예컨대, 자물쇠와 열쇠 유형) 사이의 결합 형성에 따른 결과일 수 있는 반면, 비특이적인 결합은 보통 반 데르 발스 힘의 결과이다. 그러나, 특이적인 결합이 반드시 모노클로날 항체가 하나의 유일한 한 표적에만 결합한다는 것을 의미하는 것은 아니다.
기본 항체 구조 단위는 서브유닛의 사량체이다. 각 사량체는, 각 쌍이 하나의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 가지는 것인, 2쌍의 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 각 쇄의 아미노 말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는, 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산으로 이루어진 가변 영역을 포함한다. 이러한 가변 영역은 초기에는 절단가능한 신호 펩티드에 연결된 상태로 발현된다. 신호 펩티드가 없는 가변 영역은 종종 성숙한 가변 영역으로 지칭된다. 따라서, 예를 들어, 경쇄 성숙한 가변 영역은 경쇄 신호 펩티드가 없는 경쇄 가변 영역이다. 각 쇄의 카르복시 말단 부분은 불변 영역을 정의한다. 중쇄 불변 영역은 주로 이펙터 기능을 담당한다.
경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되고, 이는 각각 항체의 이소형을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산으로 된 "J" 영역에 의해 연결되는데, 중쇄는 약 10개 이상의 아미노산으로 된 "D" 영역 또한 포함한다 (일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7] (상기 문헌은 그 전문이 모든 목적을 위해 참조로 포함된다) 참조).
각 경쇄/중쇄 쌍의 성숙한 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 무손상 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이관능성 또는 이중특이적 항체의 경우를 제외하면, 상기 두 결합 부위는 동일하다. 상기 쇄는 모두, 상보성 결정 영역 또는 CDR로 지칭되기도 하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어진 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2개 쇄로부터의 CDR은 이러한 프레임워크 영역에 의해 정렬되어 특이적 에피토프에 결합할 수 있게 된다. N-말단에서 C-말단까지, 경쇄와 중쇄 둘 모두 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 아미노산을 각 도메인에 배정하는 것은 문헌 [Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)], 또는 [Chothia & Lesk, J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987)]; [Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따른다. 카바트는 또한 상이한 중쇄 간의 상응하는 잔기 또는 상이한 경쇄 간의 상응하는 잔기에 동일한 번호를 배정하는, 널리 사용되는 넘버링 협정 (카바트 넘버링)을 제공한다.
"항체"라는 용어는 무손상 항체 및 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 전형적으로, 항체 단편은 표적에의 특이적인 결합을 위하여 그들의 유래 기원인 무손상 항체와 경쟁을 하며, 이러한 단편은 별개의 중쇄, 경쇄 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, 디아바디, Dab, 나노바디, 및 Fv를 포함한다. 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있거나, 또는 무손상 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분리에 의해 제조될 수 있다. "항체"라는 용어는 또한 디아바디 (동종이량체성 Fv 단편) 또는 미니바디 (VL-VH-CH3), 이중특이적 항체 등을 포함한다. 이중특이적 또는 이관능성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 가지는 인공 하이브리드 항체이다 (예컨대, 문헌 [Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990)]; [Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)] 참조). "항체"라는 용어는 항체 단독 (네이키드 항체) 또는 세포독성 독성 또는 세포 증식 억제 약물에 접합된 항체를 포함한다.
"에피토프"라는 용어는 항체가 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 연속되는 아미노산으로부터 형성될 수 있거나, 또는 하나 이상의 단백질의 3차 폴딩에 의해 병렬된 비연속 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 연속되는 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출시에도 보존되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매 처리시 손실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 입체형태 내에 3개 이상, 더욱 일반적으로 5개 이상 또는 8-10개 이상의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 입체형태를 결정하는 방법은 예를 들어, x선 결정학적 방법 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다 (예컨대, 문헌 [Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)]을 참조).
동일하거나 중복되는 에피토프를 인식하는 항체는 또 다른 항체의 표적 항원에의 결합과 경쟁할 수 있는 한 항체의 능력을 보여주는 간단한 면역검정법으로 확인할 수 있다. 항체의 에피토프는 또한 접촉 잔기를 확인하기 위해 그의 항원에 결합된 항체의 X선 결정학적 방법에 의해 정의될 수 있다. 별법으로, 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원 내의 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거한다면, 두 항체는 동일한 에피토프를 가지는 것이다. 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거한다면, 두 항체는 중복되는 에피토프를 가지는 것이다.
항체들 간의 경쟁은 시험 중인 항체가 참조 항체의 공통의 항원에의 특이적인 결합을 억제하는 검정법에 의해 측정된다 (예컨대, 문헌 [Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990]). 시험 항체는 과량의 시험 항체 (예컨대, 2x, 5x, 10x, 20x 또는 100x 이상)가, 경쟁적 결합 검정법으로 측정 시에 참조 항체의 결합을 적어도 50%, 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 99% 억제시켰다면, 참조 항체와 경쟁하는 것이다. 경쟁 검정법에 의해 확인된 항체 (경쟁 항체)는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 발생되는 입체 장애를 위해 참조 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
"환자"라는 용어는 예방적 또는 치료적 처치를 받는 인간 및 다른 포유동물 대상체를 포함한다.
아미노산 치환을 보존적 또는 비보존적인 것으로 분류하기 위한 목적으로, 아미노산은 하기와 같이 분류된다: I군 (소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; II군 (중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; III군 (산성 측쇄): asp, glu; IV군 (염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; V군 (쇄 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 VI군 (방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 같은 부류 중의 아미노산 사이의 치환을 포함한다. 비보존적 치환은 이들 부류 중 한 부류의 구성원이 또 다른 부류의 구성원 대신으로 치환되는 것으로 여겨진다.
서열 동일성(%)은 카바트 넘버링 협정에 의해 최대로 정렬된 항체 서열을 이용하여 측정된다. 정렬 후, 대상 항체 영역 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙한 가변 영역)이 참조 항체의 동일 영역과 비교되는 경우, 대상 항체 영역과 참조 항체 영역 간의 서열 서열 동일성(%)은 대상 항체 영역과 참조 항체 영역 둘 모두 내의 동일한 아미노산에 의해 점유된 위치 개수를 상기 두 영역의 정렬된 위치 총 개수로 나누고 (갭은 계산되지 않음), 100을 곱하여 비율(%)로 전환시킨 것이다.
하나 이상의 언급된 요소를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 언급되지 않은 다른 요소도 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체를 포함하는 조성물은 단독으로 또는 다른 성분과의 조합으로 항체를 함유할 수 있다.
값의 범위의 지정은 상기 범위 내에 포함되어 있거나, 상기 범위를 정의하는 모든 정수를 포함한다.
항체 이펙터 기능은 Ig의 Fc 도메인(들)이 기여하는 기능을 의미한다. 이러한 기능은, 예를 들어, 항체-의존성 세포성 세포독성, 항체-의존성 세포성 식세포 작용 또는 보체-의존성 세포독성일 수 있다. 이러한 기능은, 예를 들어, 식세포 또는 용해 활성을 가진 면역 세포 상의 Fc 수용체에의 Fc 이펙터 도메인(들)의 결합에 의해 수행될 수 있거나, 또는 보체계의 성분에의 Fc 이펙터 도메인(들)의 결합에 의해 수행될 수 있다. 전형적으로, Fc-결합성 세포 또는 보체 성분에 의해 매개된 상기 효과(들)로 인해 표적화된 세포는 억제되고/거나, 고갈된다. 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체 (FcR)-발현 세포를 동원할 수 있고, 이들을 항체-코팅된 표적 세포와 병렬시킬 수 있다. FcγRIII (CD16), FcγRII (CD32) 및 FcγRI (CD64)을 비롯한, IgG에 대한 표면 FcR을 발현하는 세포는 IgG-코팅된 세포를 파괴시키기 위한 이펙터 세포로서 작용할 수 있다. 이러한 이펙터 세포는 단핵구, 대식세포, 자연살 (NK) 세포, 호중구 및 호산구를 포함한다. IgG에 의한 FcγR의 진입은 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 또는 항체-의존성 세포성 식세포 작용 (ADCP)을 활성화시킨다. ADCC는 막 세공-형성 단백질 및 프로테아제의 분비를 통하여 CD16+ 이펙터 세포에 의해 매개되는 반면, 식세포 작용 CD32+ 및 CD64+ 이펙터에 의해 매개된다 (문헌 [Fundamental Immunology, 4th ed., Paul ed., Lippincott-Raven, N.Y., 1997, Chapters 3, 17 and 30]; [Uchida et al., 2004, J. Exp . Med . 199:1659-69]; [Akewanlop et al., 2001, Cancer Res. 61:4061-65]; [Watanabe et al., 1999, Breast Cancer Res. Treat. 53:199-207] 참조). ADCC 및 ADCP 이외에도, 세포-결합된 항체의 Fc 영역은 또한 보체 전통적 경로를 활성화시켜 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 유발시킬 수 있다. 보체계의 C1q는 항체의 Fc 영역이 항원과 복합체를 형성할 때 이러한 영역에 결합한다. C1q가 세포-결합된 항체에 결합하는 것이 C4 및 C2의 단백질분해적 활성화와 관련된 이벤트의 캐스케이드를 개시시켜 C3 전환효소를 발생시킬 수 있다. C3 전환효소에 의해 C3을 C3b로 절단시키면, C5b, C6, C7, C8 및 C9를 비롯한 말단 보체 성분이 활성화될 수 있다. 집합적으로, 이들 단백질은 항체-코팅된 세포 상에 막-공격 복합체 세공을 형성한다. 이들 세공은 세포막 완전성을 붕괴시켜 표적 세포를 사멸시킨다 (문헌 [Immunobiology, 6th ed., Janeway et al., Garland Science, N. Y., 2005, Chapter 2] 참조).
"항체-의존성 세포성 세포독성" 또는 ADCC라는 용어는 항체-코팅된 표적 세포와 용해 활성을 가진 면역 세포 (이는 또한 이펙터 세포로도 지칭된다)의 상호작용에 의존하는 세포 사멸을 유도하는 기전이다. 이러한 이펙터 세포는 자연살 세포, 단핵구/대식세포 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는 그의 항원-결합 부위를 통하여 표적 세포에 결합된 Ig의 Fc 이펙터 도메인(들)에 부착한다. 항체-코팅된 표적 세포의 사멸은 이펙터 세포 활성의 결과로서 일어난다.
"항체-의존성 세포성 식세포 작용" 또는 ADCP"라는 용어는 항체-코팅된 세포를 전부 또는 부분적으로 Ig의 Fc 이펙터 도메인(들)에 결합하는 식세포 면역 세포 (예컨대, 대식세포, 호중구 및 수지상 세포)에 의해 내재화시키는 과정을 의미한다.
"보체-의존성 세포독성" 또는 CDC라는 용어는 표적-결합된 항체의 Fc 이펙터 도메인(들)이 일련의 효소 반응을 활성화시켜 표적 세포 막 내에 구멍이 형성되도록 하는, 세포 사멸을 유도하는 기전을 의미한다. 전형적으로, 항원-항체 복합체, 예컨대, 항체-코팅된 표적 세포 상의 항원-항체 복합체는 보체 성분 C1q에 결합하여 이를 활성화시키고, 이로써 보체 캐스케이드를 활성화시킴으로써 결국에는 표적 세포 사멸을 유도한다. 보체를 활성화시키면, 백혈구 상에 보체 수용체 (예컨대, CR3)를 결합시킴으로써 ADCC를 촉진시키는 표적 세포 표면 상에 보체 성분이 침착될 수 있다.
"세포독성 효과"란 표적 세포의 고갈, 제거 및/또는 사멸을 의미한다. "세포독성제"란 세포에 대해 세포독성 효과를 미치는 작용제를 의미한다. 세포독성제는 항체에 접합될 수 있거나, 항체와 함께 조합되어 투여될 수 있다.
"세포 증식 억제 효과"란 세포 증식의 억제를 의미한다. "세포 증식 억제제"란 세포에 대해 세포 증식 억제 효과를 미침으로써 세포의 특정 서브세트의 성장 및/또는 확장을 억제시키는 작용제를 의미한다. 세포 증식 억제제는 항체에 접합될 수 있거나, 항체와 함께 조합되어 투여될 수 있다.
"제약상 허용되는"이라는 용어는 동물용으로, 및 더욱 특히 인간용으로, 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인을 받았거나, 승인을 받을 수 있는 것이거나, 또는 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정받은 약전에 열거된 것임을 의미한다. "제약상 상용성인 성분"이라는 용어는 항체 또는 ADC와 함께 조합되는 제약상 허용되는 희석제, 애주번트, 부형제 또는 비히클을 의미한다.
"제약상 허용되는 염"이라는 어구는 항체 또는 그의 접합체, 또는 항체와 함께 투여되는 작용제의 제약상 허용되는 유기 또는 무기 염을 의미한다. 예시되는 염은 술페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 니트레이트, 비술페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 및 파모에이트 (즉, 1,1' 메틸렌 비스-(2-히드록시 3 나프토에이트)) 염을 포함한다. 제약상 허용되는 염은 또 다른 분자, 예컨대, 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 다른 반대 이온의 봉입을 수반할 수 있다. 반대 이온은 모체 화합물 상의 전하를 안정화시켜 주는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 추가로, 제약상 허용되는 염은 그의 구조 내에 1개 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다수의 하전된 원자가 제약상 허용되는 염의 일부인 경우, 다수의 반대 이온을 가질 수 있다. 그러므로, 제약상 허용되는 염은 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 반대 이온을 가질 수 있다.
CHO 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포를 의미하고, 이는 예를 들어, DG44, Dxb11, CHO-K, CHO-K1 및 CHO-S를 비롯한, 다양한 균주를 포함한다.
"약물 로드" 또는 "접합비"라는 어구는 ADC 용액 또는 조성물 또는 반응 혼합물 중 항체 1개당 약물의 평균 개수를 의미한다.
문맥상 달리 명백하지 않는 한, "약"이라는 용어는 언급된 값의 표준 편차 내의 값을 포함한다.
상세한 설명
I. 일반적 설명
본 발명은 부분적으로는 CHO 세포 산화 효소, 특히, 퀴에신 Q6 술프히드릴 옥시다제 1 (QSOX1)이 외관상 엄격한 항체 정제 공정을 견뎌낼 수 있고, 후속된 항체의 약물에의 접합 로딩 효율을 낮출 정도의 충분한 양으로 항체 제제 중에 존재할 수 있다는 관찰 결과에 기초한다. 비록 정제 공정을 통해 허용가능하게 낮은 비율로 항체에 대한 배경 오염 물질/불순물을 가지는 항체를 얻을 수 있는 것으로 보일 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 충분한 양의 산화 효소가 존재함에 따라 항체 환원 이후 항체 상의 술프히드릴 기는 산화되고, 이로써, 약물에의 접합을 위해 이용할 수 없게 될 수 있다. 비록 본 발명의 실시가 기전을 이해하는 것에 의존하는 것은 아니지만, QSOX1이 정제된 항체 생성물까지 지속되는 것은 일부 정제 조건하에서의 항체와 QSOX1 사이의 상호작용의 결과일 수 있다. 산화 효소가 정제 과정을 견뎌내는지 여부는 항체마다 달라질 수 있는, 사용되는 정제 기법에 의존한다. 소량이지만 유의적인 양의 CHO 세포 산화 효소를 포함하는 외관상 순수한 항체의 존재 가능성을 확인하기 전에는, (항체에 대한 약물의 부적절한 평균비에 의해 반영되는) 불량한 접합 로딩 효율이, 다수의 원인들 중 어느 것이 원인이라고 부정확하게 보일 수 있다. 그러나, CHO 세포 산화 효소를 포함하는 오염이 후속되는 접합에 대해 잠재적인 문제가 된다는 지식하에, CHO 산화 효소(들)를 제거하거나, 또는 적어도 허용되는 수준으로까지 감소시키는, 임의의 항체를 위해 적합한 정제 방식이 고안될 수 있다.
II. CHO 세포 산화 효소
QSOX1은 인간 QSOX1, 스위스-프로트(Swiss-Prot) 000391의 차이니즈 햄스터 동족체이다. 상기 효소는 산소를 환원시키면서, 술프히드릴 기의 디술피드로의 산화를 촉매화시킨다. QSOX1을 언급하는 것은 전장의 (신호 펩티드를 포함하거나, 포함하지 않는) QSOX1 효소, 및 CHO 세포에 의해 자연적으로 유리되든, 또는 항체 정제 공정의 결과로서 유리되든 그에 상관없이, 술프히드릴 산화 능력을 유지하는 것인, 천연적으로 발생된 그의 변이체를 비롯한, 그의 임의의 단편을 지칭하는 것이다. CHO 세포 배양 배지 중의 QSOX1은 겉보기 크기 범위가 65-75 kDa, 또는 더욱 구체적으로, 68-72 kDa인 밴드를 나타낸다. 예시적인 QSOX1 단편은 세포외 도메인, 티오레독신 도메인 및/또는 ERV/ALR 술프히드릴 옥시다제 도메인을 포함할 수 있다. 예측 QSOX1 이소폼 X1 단백질 서열은 앞서 서열 1에 기재되고, 진뱅크 수탁 번호(GenBank Accession Number) XP_003500174.1로서 살펴볼 수 있는 것으로 확인되었다. QSOX1 예측 이소폼 X1 단백질 서열은 그 이후로 계속해서 업데이트되고 있다. 업데이트된 서열은 서열 2에 기재되어 있으며, 이는 진뱅크 수탁 번호 XP_007639037.1로서 살펴볼 수 있다. 일부 측면에서, QSOX1은 서열 2와 90% 이상 (91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 100%)의 서열 동일성을 가지고, 술프히드릴 산화 능력을 유지하는 CHO 세포 산화 효소를 의미한다. 일부 측면에서, QSOX1은 서열 2의 94번째 아미노산부터 571번째 아미노산까지 범위의 아미노산 서열을 포함하고, 술프히드릴 산화 능력을 유지하는 CHO 세포 산화 효소를 의미한다.
불순물로서 존재할 수 있는 다른 CHO 세포 효소로는 QSOX2 (인간 스위스-프로트 Q6ZRP7의 CHO 동족체), 및 ALR (간 재생 활성인자) 술프히드릴 옥시다제를 포함한다. 간결하게 하기 위해, 하기 기술 내용은 주로 QSOX1을 지칭하지만, 별법으로 또는 추가로는 QSOX2, ALR 또는 정제를 견뎌내는 다른 CHO 세포 산화 효소도 지칭하는 것으로 이해하여야 한다.
III. QSOX1 및 다른 CHO 세포 산화 효소를 제거하는 정제 방법
본 출원은 QSOX1 및 다른 CHO 세포 산화 효소, 예컨대, QSOX2 또는 ALR (더욱 상세한 설명을 위해 실시예 참조)을 제거하고, 확인하는 데 이용가능한 수개의 기법을 제공한다. 한 기법은 단백질 A 칼럼 상에 항체 제제를 로딩하고, 중간 정도 또는 높은 염 조건하 (예컨대, 적어도 150 mM NaCl, 또는 150-500 mM NaCl)에서 세척하는 것이다. QSOX1은 칼럼으로부터 용리되는 반면, 항체는 결합된 상태 그대로 남아있다. 또 다른 기법은 예컨대, 밀리포어(Millipore) X0HC 막을 사용하는 심층 여과이다. 항체는 필터를 통과하는 반면, QSOX1은 필터에 의해 포획된다. 또 다른 기법은 바람직하게, 4급 암모늄 기와 함께 강한 음이온 교환기를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피이다. GE 헬쓰케어(GE Healthcare)로부터의 캅토-Q(Capto-Q) 칼럼이 적합하다. 적절한 조건 (예컨대, pH 약 8 및 전도도 약 5-7 mS/cm)하에서 항체는 칼럼을 통해 통과하는 반면, QSOX1은 결합된 상태 그대로 남아있다. 추가의 기법은 페닐-막 여과이다. 이러한 유형의 막은 소수성 상호작용에 기초하여 분리한다. 적절한 조건 (예컨대, pH 6-8 및 시트르산나트륨 0.35-0.4 M)하에서 항체는 통과하고, QSOX1은 막에 결합한다.
IV. 제거에 대한 시험
QSOX1은, 실시예에 추가로 기술되는 바와 같이, QSOX1에 특이적인 항체를 이용하는 웨스턴 블롯을 비롯한, 다양한 검정법에 의해 검출될 수 있다. QSOX1은 또한 겔로부터 잘라낸, 적절한 분자량 (글리코실화 상태에 따라 약 65-70 kDa)의 밴드 상에서의 펩티드 서열 분석 또는 LC-MS/MS에 의해서도 검출될 수 있다. QSOX1은 또한 관능성 검정법에 의해서도 검출될 수 있다. QSOX1 활성으로 과산화수소가 생성되고, 이는 결국 크실레놀 오렌지의 존재하에서 Fe2+의 산화로부터 초래되는 간단한 색상 변화에 의해 검출될 수 있다. QSOX1의 특징적인 관능성 활성은 특이적으로 EDTA 및 다수의 다른 염 (KI, MnSO4, NaCl) 또는 우레아가 아닌, Zn2+에 의해 (예컨대, 90% 이상) 억제된다. QSOX1은 또한 실시예 2에서 입증된 바와 같이 DTNB 검정법에 의해 검출될 수 있다.
QSOX1은 하기 기술되는 검정법 중 임의의 것에서 또는 실시예에서 음성 대조군 수준을 초과 (실험 오차 초과)하는 것으로 검출가능할 경우, 존재하는 것으로 간주된다. 일부 측면에서, 1 ug/ml 또는 66 ppm 정도로 낮은 QSOX1 수준도 항체 약물 로딩 효율을 억제시킬 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 허용되는 수준은 0.5 ug/ml 또는 33 ppm 미만, 및 바람직하게, 0.1 ug/ml 또는 6 ppm 미만, 또는 0.01 ug/ml 또는 0.6 ppm 미만을 의미할 수 있다. 바람직하게, QSOX1 수준은 실시예에 기술된 검정 포맷 중 임의의 것에 의해 측정되는 바와 같은 음성 대조군 수준 범위 내에 포함되어 있다.
별법으로 또는 추가로, QSOX1의 허용되는 수준은 수득될 수 있는 항체에의 약물의 허용되는 접합비 수준 또는 그 아래인 것으로 정의될 수 있다. 허용되는 접합비는 바람직하게, 표적 접합비의 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 범위 내에 포함되어 있는 것이다. 접합비에 영향을 줄 수 있고, 표적 접합비를 달성하기 위해 조정될 수 있는 파라미터로는 예를 들어, 항체에 대한 환원 조건 (예컨대, 환원제 유형 및 항체 농도에 대한 상대적인 농도), 항체에 대해 상대적인 약물-링커의 농도, 접합 반응 시간, 및 접합 반응 온도를 포함한다. 바람직하게, QSOX1 수준은 (a) 항체 환원 반응 동안 정확한 반응 정도가 달성되지 못하도록 방해하지 않고/거나, (b) 환원 이후 즉시 그러나 접합 이전에, 환원된 티올을 재산화시키지 않도록 하는 정도인 것이다. 다시 말해, 바람직하게, QSOX1 수준은 항체의 환원, 또는 환원된 항체의 안정성을 방해하지 않도록 하는 정도인 것이다.
별법으로 또는 추가로, QSOX1의 허용되는 수준은 DTNB 검정법 또는 제1철 산화 크실레놀 오렌지 검정법에서 0.1 이하의 흡광도 단위 값을 산출하는 수준인 것으로 정의될 수 있다. 간략하면, DTNB 검정법은 대조군 샘플 및 시험 샘플에서 유리 티올기 사이의 반응을 측정하고, 비교하는 것이다. 예를 들어, 실시예 2를 참조할 수 있다. 제1철 산화 크실레놀 오렌지 검정법에서, 과산화수소가 활성 지표로서 측정된다. 예를 들어, 실시예 1을 참조할 수 있다.
V. 작업 흐름 방식
CHO 세포를 발현시키고자 하는 항체 쇄를 코딩하는 벡터(들)로 형질전환시키고, 배양하여 항체를 발현시킨다. 발현은 보통 정제 방식을 결정하는 데 충분한 항체를 제공하기 위한 목적으로, 먼저 비교적 소량의 배양 부피 (예컨대, 1-50 L)로 수행된다. 이어서, 발현된 항체를 함유하는 배양 배지에 대하여 항체 정제 방식 중 적어도 1개의 단계를 수행하여 화학적 접합 또는 제약 용도에 적합한 순도 수준 (예컨대, 거대분자 오염물질/불순물에 대해 90, 95, 97, 98 또는 99% w/w 이상의 항체)을 수득한다. 정제 방식은 보통 2개 이상의 칼럼 크로마토그래피 단계, 1개 이상 및 보통은 다중의 여과 단계, 바이러스 불활성화 단계, 및 농축 및 재현탁/희석 단계를 포함한다. 정제 단계 중 어느 하나 또는 그들 모두를 완료한 후, 항체 제제를 QSOX1의 존재에 대하여 시험할 수 있다. QSOX이 음성 대조군 검정법의 배경을 초과 (실험 오차를 초과)하는 것으로 검출되거나, 후속되는 접합에 대해 허용되지 않는 것으로 간주되는 수준을 초과하는 것으로 검출될 경우, 초기 배양물의 정제 (또는 불충분한 양의 초기 배양물이 이용될 경우, 또 다른 유사 배양물)는 제2 (상이한) 정제 단계 및/또는 방식으로 반복된다. 제2 정제 단계 및/또는 방식은 다른 변수들 중에서도 정제 유형 (예컨대, 음이온 대 양이온 교환 크로마토그래피, 여과에 사용되는 막 유형), 또는 로딩 또는 용리에 사용되는 완충제에 있어서 제1의 것과 상이할 수 있다.
제2 정제 단계/방식 수행 후, 또는 그동안에 생성된 항체 제제는 QSOX1에 대해 시험될 수 있다. QSOX1이 배경을 초과하거나, 또는 다르게는 허용되는 것으로 결정된 수준을 초과하는 것으로 검출될 경우, 이때는 QSOX1 효소에 대해 추가로 시험하면서, 또는 시험하지 않고, 추가의 정제 방식을 이용하여 정제를 수행하게 된다. 제1 정제 방식, 제2 또는 후속 정제 방식이든 상관없이, 결국에는 QSOX1이 배경을 초과하는 것으로 검출되지 않거나, 또는 허용되는 것으로 간주되는 수준으로만 검출되는 항체 제제를 수득하게 된다.
검출 한계를 초과하거나, 또는 적어도 허용되는 수준으로 QSOX1을 감소시키는 정제 방식을 결정하고 나면, 종종 제조 배양으로 지칭되기도 하는 제2 배양을 CHO 세포에 대하여 수행한다. 항체를 정제하고, QSOX1을 제거하는 데 효과적인 것으로 이미 결정된 정제 단계/방식을 배양 배지에 대해 수행한다. 생성된 정제된 항체를 환원시키고, 이어서, 작용제, 예컨대, 약물에 접합시킨다.
제2 또는 제조 배양물은 전형적으로 정제 방식을 결정하는 데 사용되는 제1 배양물보다 크다. 예를 들어, 제조 배양물은 제1 배양물보다 부피가 100배 또는 1,000배 이상 더 클 수 있다. 앞서 QSOX1 없이, 항체를 성공적으로 정제한 것으로 결정된 정제 방식에 의해 상기 배양물로부터 얻은 항체 제제인 바, 제조 배양은 전형적으로, 반복적으로 수행되거나 (회분식 배양), 또는 1년 이상인 기간에 걸쳐 (예컨대, 5년 이상인 기간에 걸쳐) 연속적으로 수행된다.
대안적 작업 흐름에서, QSOX1 효소에 대해 반드시 시험하지 않고도 CHO 세포로부터의 배양 배지에 대하여 항체 정제 방법을 수행하고, 정제된 제제에 대하여 약물에의 화학적 접합을 수행한다. 접합 로딩 효율 (평균 약물/항체)이 예상외로 낮을 경우 (즉, 항체에 대한 약물 분자의 개수가 표적보다 적을 경우), 이때 정제된 제제를 QSOX1 존재에 대해 시험한다. 효소가 배경 수준을 초과하거나, 또는 허용되는 것으로 간주되는 수준을 초과하는 것으로 존재할 경우, 이때 항체를 상이한 정제 방법에 의해 CHO 세포 배양 배지로부터 정제한 후, QSOX1 효소에 대해 시험한다. 이어서, 필요할 경우, 오염물질/불순물로부터 항체를 정제하여 일반적으로 허용되는 순도를 얻고, QSOX1을 배경 수준까지, 또는 다르게는 접합에 허용되는 것으로 간주되는 수준으로까지 제거하는 정제 방법을 찾을 때까지, 상이한 방법으로 정제한 후, 이어서, QSOX1에 대해 시험하는 것을 반복적으로 수행한다. 상기와 같은 정제 방법을 찾고 나면, 이를 사용하여 CHO 세포의 제2 배양물로부터 항체를 제조할 수 있다. 이어서, 정제된 항체를 하나 이상의 유리 술프히드릴 기를 통해 약물에 접합시킨다.
VI. 항체의 약물에의 접합
항체를 세포독성 또는 세포 증식 억제 모이어티 (그의 제약상 상용성인 염 포함)에 접합시켜 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성할 수 있다. 항체를 약물 이외의 다른 작용제, 예를 들어, 안정제 (예컨대, PEG 모이어티)에 접합시킬 수 있다. 항체에의 접합을 위해 특히 적합한 모이어티는 세포독성제 (예컨대, 화학약물), 전구약물 전환 효소, 방사성 동위원소 또는 화합물, 또는 독소이다 (이들 모이어티는 총칭하여 약물로서 지칭된다. 예를 들어, 항체를 세포독성제, 예컨대, 화학약물, 또는 독소 (예컨대, 세포 증식 억제제 또는 세포사멸제, 예컨대, 아브린, 리신 A, 슈도모나스(pseudomonas) 외독소 또는 디프테리아(diphtheria) 독소)에 접합시킬 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 약물은 항체 상의 술프히드릴 기를 통해 항체에 접합된다. 술프히드릴 기는 시스테인 측쇄 상의 술프히드릴 기일 수 있다. 시스테인 잔기는 항체 중에 자연적으로 존재할 수 있거나 (예컨대, 쇄간 디술피드), 또는 다른 수단, 예컨대, 돌연변이 유발에 의해 도입될 수 있다. 약물을 항체 상의 술프히드릴 기에 접합시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예컨대, 미국 특허 번호 7,659,241, 7,498,298, 및 국제 공보 번호 WO 2011/130613 참조). 술프히드릴 기를 접합체에 이용가능한 것으로 만들기 위해 항체를 접합 이전에 환원시킨다. 항체를 관련 기술분야에서 공지된 조건을 사용하여 환원시킬 수 있다. 환원 조건은 일반적으로 항체를 실질적으로 변성시키지 않고, 일반적으로 항체의 항원 결합 친화도에 영향을 미치지 않는 것이다. 한 측면에서, 환원 단계에서 사용되는 환원제는 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀)이고, TCEP는 실온에서 30분 동안 과량으로 첨가된다. 예를 들어, 250 uL의 10 mM TCEP 용액 (pH 7.4)은 실온에서 30분 경과 후 1 내지 100 ug의 항체의 쇄간 디술피드를 쉽게 환원시킬 것이다. 그러나, 다른 환원제 및 조건도 사용될 수 있다. 반응 조건의 예로는 pH 5 내지 8 범위의 5℃ 내지 37℃의 온도를 포함한다. 본 발명자들은 환원제에 의한 환원 이후에, 산화 효소, 예컨대, QSOX1에 의해 술프히드릴이 디술피드로 산화되면, 이는 술프히드릴 기를 접합에 이용될 수 없게 만든다는 것을 발견하게 되었다.
약물은 (예컨대, 가수분해에 의해, 항체 분해에 의해, 또는 절단제에 의해) 항체로부터 절단되지 않는다면, 그의 활성을 감소시키는 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 상기 약물은 표적 세포의 세포내 환경에서의 절단에 대해서는 감수성이지만, 세포외 환경에 대해서는 실질적으로 감수성이 아닌 절단가능한 링커를 이용하여 항체에 부착되며, 이로써, 약물은 ADC가 표적 세포에 의해 내재화되었을 때에는 (예컨대, 엔도솜 내에서, 또는 예를 들어, pH 감수성 또는 프로테아제 감수성에 의해, 리소좀 환경에서 또는 포낭 환경에서) 항체로부터 절단된다.
전형적으로, ADC는 약물과 항체 사이에 링커를 포함한다. 상기 언급한 바와 같이, 링커는 세포내 조건하에서 절단가능할 수 있는 바, 이에 링커가 절단되면, 약물은 세포내 환경에서 (예컨대, 리소좀 또는 엔도솜 또는 포낭 내에서) 항체로부터 유리된다. 링커는 예컨대, 리소좀 또는 엔도솜 프로테아제를 비롯한, 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 전형적으로, 펩티딜 링커의 길이는 2개 이상의 아미노산, 또는 3개 이상의 아미노산 길이이다. 절단제는 카텝신 B 및 D, 및 플라스민을 포함할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123] 참조). 표적 세포에 존재하는 효소에 의해 절단가능한 펩티딜 링커가 가장 전형적이다. 예를 들어, 암성 조직에서 고도로 발현되는 티올 의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단가능한 펩티딜 링커가 사용될 수 있다 (예컨대, Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly 펩티드를 포함하는 링커). 예컨대, US 6,214,345에 상기와 같은 링커가 기술되어 있다. 세포내 프로테아제에 의해 절단가능한 한 예시적인 펩티딜 링커로는 Val-Cit 링커 또는 Phe-Lys 디펩티드를 포함한다 (예컨대, Val-Cit를 이용하여 독소루비신을 합성하는 것이 기술되어 있는 US 6,214,345 참조). 약물의 세포내 단백질분해적 유리를 사용하는 것의 한 이점은 작용제는 전형적으로 접합되었을 때에는 약독화되어 있고, 접합체의 혈청 안정성은 고도로 높다는 점이다.
절단가능한 링커는 pH 감수성, 즉, 특정 pH 값에서의 가수분해에 감수성인 것일 수 있다. 전형적으로, pH 감수성 링커는 산성 조건하에서 가수분해성이다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해성인 산 불안정성 링커 (예컨대, 히드라존, 세미카르바존, 티오세미카르바존, 시스-아코니틱 아미드, 오르토에스테르, 아세탈, 케탈 등)가 사용될 수 있다. (예컨대, 미국 특허 번호 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; [Dubowchik and Walker, 1999, Pharm . Therapeutics 83:67-123]; [Neville et al., 1989, Biol . Chem . 264:14653-14661] 참조). 상기와 같은 링커는 중성 pH 조건하에서, 예컨대, 혈액 중의 pH 조건하에서는 비교적 안정적이지만, 리소좀 pH에 가까운 pH 5.5 또는 5.0 미만에서는 불안정하다.
다른 링커 (예컨대, 디술피드 링커)는 환원 조건하에서 절단가능하다. 디술피드 링커는 SATA (N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트), SPDP (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트) 및 SMPT (N-숙신이미딜-옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔), SPDB 및 SMPT를 사용하여 형성될 수 있는 것을 포함한다. (예컨대, [Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931]; [Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987)] 참조. 또한 미국 특허 번호 4,880,935 참조).
링커는 또한 말로네이트 링커 (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), 말레이미도벤조일 링커 (Lau et al., 1995, Bioorg - Med - Chem . 3(10):1299-1304), 또는 3'-N-아미드 유사체 (Lau et al., 1995, Bioorg - Med - Chem . 3(10):1305-12)일 수 있다.
링커는 또한 비-절단가능한 링커, 예컨대, 약물 (예컨대, 약물)에 직접적으로 부착되고, 항체의 분해에 의해 유리되는 말레이미도-알킬렌 링커 또는 말레이미드-아릴 링커일 수 있다.
링커는 항체 상에 존재하는 기에 대해 반응성인 작용기를 포함하는 것이다. 일부 측면에서, 링커는 링커의 황 원자와 항체의 황 원자 사이의 디술피드 결합을 통해 항체에 연결된다. 다른 측면에서, 링커는 링커의 말레이미드 기를 통해 항체의 황 원자와 결합을 형성한다. 일부 측면에서, 황 원자는 쇄간 디술피드의 시스테인 잔기로부터의 것 또는 항체 내로 도입된 시스테인 잔기로부터의 것 (예컨대, EU 인덱스에 따라 239번 위치의 것)이다.
항체에의 접합체에 대하여 유용한 세포독성제 부류로는 예를 들어, 항튜불린제, DNA 작은 홈 결합제, DNA 복제 억제제, 화학요법 증감제, 피롤로벤조디아제핀 이량체 등을 포함한다. 세포독성제의 다른 예시적인 부류로는 안트라시클린, 아우리스타틴, 캄프토테신, 듀오카르마이신, 에토포시드, 메이탄시노이드 및 빈카 알칼로이드를 포함한다. 일부 예시적인 세포독성제로는 아우리스타틴 (예컨대, 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE), DNA 작은 홈 결합제 (예컨대, 엔다이인 및 렉시트롭신), 듀오카르마이신, 탁산 (예컨대, 파클리탁셀 및 도세탁셀), 메이탄시노이드, 벤조디아제핀 (예컨대, 피롤로[1,4]벤조디아제핀, 인돌리노벤조디아제핀, 및 옥사졸리디벤조디아제핀), 빈카 알칼로이드, 독소루비신, 모르폴리노-독소루비신, 및 시아노모르폴리노-독소루비신을 포함한다.
세포독성제는 화학요법제, 예컨대, 예를 들어, 독소루비신, 파클리탁셀, 멜팔란, 빈카 알칼로이드, 메토트렉세이트, 미토마이신 C 또는 에토포시드일 수 있다. 작용제는 또한 CC-1065 유사체, 칼리키아미신, 메이탄신, 돌라스타틴 10의 유사체, 리족신, 또는 팔리톡신일 수 있다.
세포독성제는 또한 아우리스타틴일 수 있다. 아우리스타틴은 아우리스타틴 E 유도체, 예컨대, 아우리스타틴 E와 케토산 사이에 형성된 에스테르일 수 있다. 예를 들어, 아우리스타틴 E는 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응하여 각각 AEB 및 AEVB를 생성할 수 있다. 다른 아우리스타틴으로는 AFP, MMAF, 및 MMAE를 포함한다. 각종 아우리스타틴의 합성 및 구조는 예를 들어, US 2005-0238649 및 US2006-0074008에 기술되어 있다.
세포독성제는 DNA 작은 홈 결합제일 수 있다 (예컨대, US 6,130,237 참조). 예를 들어, 작은 홈 결합제는 CBI 화합물 또는 엔다이인 (예컨대, 칼리키아미신)일 수 있다.
세포독성제 또는 세포 증식 억제제는 항튜불린제일 수 있다. 항튜불린제의 예로는 탁산 (예컨대, 탁솔(Taxol)® (파클리탁셀), 탁소테레(Taxotere)® (도세탁셀)), T67 (투라릭(Tularik)), 빈카 알칼로이드 (예컨대, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 및 비노렐빈), 및 아우리스타틴 (예컨대, 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB)을 포함한다. 다른 적합한 항튜불린제로는 예를 들어, 바카틴 유도체, 탁산 유사체 (예컨대, 에포틸론 A 및 B), 노코다졸, 콜히친 및 콜시미드, 에스트라무스틴, 크립토피신, 세마도틴, 메이탄시노이드, 콤브레타스타틴, 디스코데르몰리드, 및 엘레우테로빈을 포함한다.
세포독성제는 항튜불린제의 또 다른 군인 메이탄시노이드일 수 있다. 예를 들어, 메이탄시노이드는 메이탄신, 또는 약물 링커를 함유하는 메이탄신, 예컨대, DM-1 또는 DM-4 (이뮤노겐, 인크.(ImmunoGen, Inc.); 또한 문헌 [Chari et al., 1992, 암 Res. 52:127-131] 참조)일 수 있다.
예시적인 항체 약물 접합체로는 하기와 같은 vcMMAE 및 mcMMAF 항체 약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다:
Figure 112016060171185-pct00001
vcMMAE
Figure 112016060171185-pct00002
mcMMAF
(여기서, p는 약물 로딩을 나타내고, 그 범위는 1 내지 20이며, Ab는 항체이다).
VII. 항체 정제 방법
CHO 상청액으로부터 단백질을 정제하기 위한 것으로 큰 레퍼토리의 기법이 공지되어 있다. 이러한 기법으로는 원심분리, 여과, 침전, 바이러스 불활성화 및 단백질-A, 단백질-G, 단백질-L을 비롯한, 많은 유형의 칼럼 크로마토그래피, 음이온 교환, 양이온 교환, 혼합 모드, 히드록시아파타이트, 크기 배제 크로마토그래피, 및 표적 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 크로마토그래피 단계는 보통 로딩을 위한 것 하나 및 용리를 위한 것 하나로, 2종 이상의 완충제를 사용한다. 완충제는 다른 인자들 중에서도 pH 및 이온 강도가 달라질 수 있다. 예시적인 항체 정제는 1개 이상의 여과 단계, 1 이상의 바이러스 불활성화 단계, 단백질-A 칼럼 및 1개 이상의 다른 칼럼을 포함한다. 로딩 및 용출액 중 완충제, pH 및 다른 부형제에 대한 상이한 기법 및 가능성의 수를 고려할 때, 상이한 정제 방법의 수는 매우 크다. 그러므로, 상이한 항체에 대해 적합한 정제 방법은 대개 (일반적으로 거대분자 오염물질/불순물에 대한 항체의 비에 의해 측정된) 제약 용도를 위해 허용되는 수준으로까지 항체를 정제시키고, QSOX1 및/또는 다른 CHO 세포 산화 효소가 검출가능한 수준 미만으로 또는 적어도 허용되는 수준으로까지 감소되는 방법을 확인하기 위해 실험적으로 결정된다.
혈청, 복수액 또는 세포 배양 상청액으로부터 항체를 강화 및 농축시키는 데 황산암모늄 침전이 사용될 수 있다. 샘플 중 상기 이액 염의 농도가 증가함에 따라, 단백질 및 다른 거대분자는 그가 침전할 때까지 계속해서 점점 더 가용성이 감소된다. 항체는 혈청의 대부분의 다른 단백질 및 성분들보다 더 낮은 농도의 황산암모늄에서 침전된다. 침전의 선택성, 수율, 순도, 및 재현성은 시간, 온도, pH 및 염 함량을 비롯한 수개의 인자에 의존한다.
항체의 세포 오염물질은 산성 또는 양이온 고분자 전해질을 사용하여 응집시킬 수 있다. 고분자 전해질은 보통 입자에 흡착되어 표면 상에 반대로 하전된 패치를 생성함으로써 작용한다. 이어서, 상기 패치는 정전기적 인력에 기인하여 반대 입자 표면 상의 베어(bare) 패치에 부착될 수 있다.
심층 필터는 막 필터 상의 용량을 유지시키기 위해 또는 크로마토그래피 칼럼 또는 바이러스 필터를 보호하기 위해 세포 배양 브로쓰의 정화에서 사용될 수 있다. 심층 필터는 전형적으로 셀룰로스, 다공성 필터 보조제, 예컨대, 규조토 및 이온 하전된 수지 결합제로 제조된다. 심층 필터는 분리를 수행하기 위해 크기 배제 및 흡착성 결합, 둘 모두를 사용한다.
막 크로마토그래피 또는 막 흡착기는 패킹된 크로마토그래피 칼럼과 유사하지만, 종래 여과 모듈의 포맷으로 작용한다. 막 크로마토그래피는 일반적으로 막 구조 전역에 걸쳐 내부 공극 표면에 부착된 관능성 리간드를 포함하는 다중층 중의 미공성 막을 이용한다. 상업적으로 이용가능한 Q 막으로는 크로마소브(ChromaSorb)™ (밀리포어), 무스탕(Mustang)® (폴(Pall)) 및 사르토바인드(Sartobind)® (사르토리우스(Sartorius))를 포함한다. 대략 중성 내지 약간 염기성인 pH 및 낮은 전도도에서, 바이러스, DNA, 내독소, 큰 집단의 숙주 세포 단백질 및 침출된 단백질 A는 Q 막에 결합하는 반면, 전형적으로, 기본 항체 분자는 결합하지 않고, 막 매트릭스를 통해 통과한다.
한외여과는 항체 농축 및 완충제 교환을 위해 널리 사용되는 압력 구동식 막 공정이다. 한외여과는, 막 공극보다 더 큰 종은 유지되고, 더 작은 종은 자유롭게 통과하는, 크기 기반 분리이다. 한외여과에서 분리는 주어진 압력 구동력하에서 막 간의 상이한 성분의 여과 속도 차이를 통해 달성된다. 완충제 교환은, 여액이 제거되는 속도와 동일한 속도로 보유액 시스템에 최종의 원하는 조성물의 완충제를 첨가하여 보유액 부피를 일정하게 유지시키는 정용여과 모드를 사용하여 달성된다. 막 공극 범위가 1 내지 20 nm인 한외여과는 분자량 범위가 500 달톤 내지 1,000 킬로달톤인 종을 분리할 수 있다.
고성능 접선 유동 여과 (HPTFF)는 정제 및 분리 목적으로 크기 및 전하 차이, 둘 모두를 이용하는 2차원 단위 조작이다. 단백질 농축 및 완충제 교환도 같은 단위 조작으로 달성될 수 있다.
바이러스는 낮은 pH에서의 처리에 의해 불활성화될 수 있고/거나, 여과를 비롯한 다양한 방법에 의해 제거될 수 있다. 현 바이러스-보유 필터는 한외필터 또는 매우 작은 공극이 있는 미세필터이다. 바이러스 여과 막은 친수성 폴리에테르술폰 (PES), 친수성 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 및 재생 셀룰로스로부터 제조된다.
이온 교환 크로마토그래피는 주어진 완충제 시스템 중 그의 순전하에 기반하여 단백질에 결합할 수 있도록 양으로 또는 음으로 하전된 수지를 이용한다. 고도의 특이성으로 표적 항체에 결합 및 그를 유리시키는 조건 (예컨대, pH 및 이온 강도)이 결정될 수 있다. 반대로, 항체 이외의 다른 거의 모든 샘플 성분에 결합하는 조건을 찾을 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피는 약한 염기성을 띨 수 있는, 양으로 하전된 기, 예컨대, 디에틸아미노 에틸 (DEAE) 또는 디메틸아미노 에틸 (DMAE), 또는 강한 염기성을 띨 수 있는 것, 예컨대, 트리메틸암모늄 에틸 (TMAE) 또는 4급 아미노에틸 (QAE)을 이용한다.
양이온 교환 크로마토그래피는 음으로 하전된 작용기로 개질된 수지를 이용한다. 양이온 및 음이온 크로마토그래프는 상보적인 기법으로서; 하나에 강하게 결합하는 분자는 나머지 다른 하나에 결합한다 하여도 약하게 결합하게 된다.
양이온 교환 칼럼은 강한 산성 리간드, 예컨대, 술포프로필, 술포에틸 및 술포이소부틸 기, 또는 약한 산성 리간드, 예컨대, 카르복실 기일 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피는 pI 값 범위가 대략 중성 또는 그보다 아주 조금 아래 (예컨대, 약 6)에서부터 염기성인 다수의 mAb에 대한 정제 공정에 적용되어 왔다. 대부분의 인간화된 IgG1 및 IgG2 하위부류는 양이온 교환 크로마토그래피에 대해 우수한 후보물질이 되는데, 여기서 항체는 로딩 단계 동안 수지 상에 결합하고, 용리 완충제 중에서 전도도 증가 또는 pH 증가를 통해 용리된다. 음으로 하전된 공정 관련 불순물, 예컨대 DNA, 일부 숙주 세포 단백질, 침출된 단백질 A 및 내독소는 로드 및 세척액 분획에서 제거된다. 양이온 교환 크로마토그래피 또한 탈아미드화된 생성물, 산화된 종 및 N-말단이 절단된 형태 뿐만 아니라, 원하는 항체로부터의 고분자량 종을 분리할 수 있다. 양이온 교환 수지 상의 항체 결합은 pH 및 전도도, 및 수지 유형에 의존한다. SP 세파로스(Sepharose) FF 및 SP 세파로스 XL은 보통 상업적으로 이용가능한 2종의 수지이다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)는 그의 소수성에 기반하여 단백질을 분리하는 유용한 도구이며, 이는 전하, 크기 또는 친화도에 기반하여 단백질을 분리하는 다른 기법과 상보적이다. 전형적으로, 샘플을 고염 완충제 중 HIC 칼럼 상에 로딩한다. 완충제 중의 염은 물 분자와 상호작용하여 용액 중의 단백질 분자의 용매화를 감소시키고, 이로써, 같은 단백질 분자 중의 소수성 영역이 노출되고, 이는 결과적으로 HIC 수지에 결합하게 된다. 분자의 소수성 성질이 클수록, 결합을 촉진시키는 데 필요한 염은 더 적다.
고정화된 금속 킬레이트 크로마토그래피는 연속되는 3개의 이상의 히스티딘 잔기로 이루어진 클러스터를 함유하는 단백질 또는 펩티드에 결합할 수 있도록 하기 위해 킬레이트-고정화된 2가 금속 이온 (예컨대, 구리, 코발트, 또는 니켈)을 이용한다. 본 전략법은 말단 6xHis 융합 태그를 함유하도록 조작된 재조합 단백질을 정제하는 데 가장 흔하게 사용된다. IgG는 고정화된 니켈에 의해 결합될 수 있는 히스티딘 클러스터를 가지는, 혈청 (또는 모노클로날 하이브리도마 세포 배양물 상청액) 중의 몇 안되는 풍부한 단백질 중의 하나이다. 결합 및 용리를 위한 조건은 온화하게 및 용이하게 항체 정제를 수행할 수 있도록 특정 샘플을 위해 최적화될 수 있다.
단백질 A, 단백질 G 및 단백질 L (그의 재조합 버전 포함)은 다양한 종으로부터 중요한 항체 유형의 친화도 정제를 위해 통상 사용되는 예시적인 단백질이다. 단백질 A 크로마토그래피는 전형적으로, 항체는 결합하고, 원치않는 성분, 예컨대, 숙주 세포 단백질 및 세포 배양 배지 성분 및 바이러스는 칼럼을 통해 통과하는 조건하에 pH 6-8에서 칼럼 상에서 정화된 세포 배양물 상청액을 통과시키는 것을 포함한다. 임의적인 중간 세척 단계는 칼럼으로부터 비-특이적으로 결합된 불순물을 제거하기 위해 수행될 수 있으며, 이어서, pH 2.5-4에서 생성물을 용리시킬 수 있다. 현재 단백질 A 수지는 그의 수지 골격 조성에 기반하여 3개의 주요 단백질 A 수지 유형: 유리 또는 실리카 기반인 것, 예컨대, 프로셉 vA(Prosep vA), 프로셉 vA 울트라(Prosep vA Ultra) (밀리포어); 아가로스 기반인 것, 예컨대, 단백질 A 세파로스 패스트 플로우(Protein A Sepharose Fast Flow), 맙셀렉트(MabSelect) (GE 헬쓰케어); 및 유기 중합체 기반인 것, 예컨대, 폴리스티렌-디비닐벤젠 포로스 A 및 맙캡쳐(MabCapture) (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))로 분류되어 있다. 여러 용리 완충제 성분, 예컨대, 아세트산, 시트르산, 인산, 아르기닌 HCl 및 글리신 HCl은 항체에 따라 사용될 수 있다. 용리 pH 선택 또한 항체의 수진에의 결합 친화도, 결합 친화도가 더 높은 항체, 더 낮은 용리 pH 요구에 의존한다.
세라믹 히드록시아파타이트 (Ca5(PO4)3OH)2는 다른 오염물질 중에서도 이량체, 응집체, 및 침출된 단백질 A로부터 항체를 분리하기 위해 인산나트륨 구배 용리와 함께 흔히 사용될 수 있는 인산칼슘 형태이다.
QSOX1을 제거하는 기법은 특히 본원 및 실시예 섹션에 기술되어 있으며, 상기 방법 중 임의의 것 이외의 것으로, 또는 그와 함께 조합하여 사용될 수 있다.
VIII. 예시적인 항체
기술된 정제 방법 및 작업 흐름은 비-인간, 인간화된, 인간, 키메라, 베니어드(veneered), 나노바디, dAb, scFV', Fab 등을 비롯한, 임의의 항체를 위해 사용될 수 있다. 본 방법은 진단 또는 치료 용도로 항체를 작용제에 접합시키는 데 가장 유용하다. 예를 들어, 본 방법은 치료 용도로 항체를 약물에 접합시키는 데 유용하다. 상기와 같은 일부 항체는 암 세포 항원, 바람직하게, 항체 결합시 세포내 내재화가능한 세포 표면 상의 것에 대해 면역특이적인 것이다. 항체가 그에 대해 지시될 수 있는 표적으로는 암 세포 상의 수용체 및 그의 리간드 또는 반대-수용체 (예컨대, CD3, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD40, CD44, CD52 CD70, CD79a, Her-2, VEGF 또는 VEGFR, CTLA-4, LIV-1, 및 넥틴-4)를 포함한다.
본 방법은 또한 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 ADC를 제조하는 데 사용되는 항체를 정제하는 데 유용하다.
본 방법은 또한 활성화된 림프구 상에서 발현된 수용체 또는 수용체 복합체에 결합하는 항체를 정제하는 데 유용하다.
본 방법은 또한 바이러스 또는 미생물 항원에 특이적인 항체를 정제하는 데 유용하다.
본 방법을 적용하는 데 적합한 상업적 항체 및 그의 표적의 일부 예로는 알렘투주맙, CD52, 리툭시맙, CD20, 트라스투주맙 Her/neu, 니모투주맙, 세툭시맙, EGFR, 베바시주맙, VEGF, 팔리비주맙, RSV, 압식시맙, GpIIb/IIIa, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙, 골리무맙 TNF-알파, 바실릭시맙, 다클리주맙, IL-2, 오말리주맙, IgE, 젬투주맙, CD33, 나탈리주맙, VLA-4, 베돌리주맙 알파4베타7, 벨리무맙, BAFF, 오테릭시주맙, 테플리주맙 CD3, 오파투무맙, 오크렐리주맙 CD20, 에프라투주맙 CD22, 알렘투주맙 CD52, 에쿨리주맙 C5, 카나키누맙 IL-1베타, 메폴리주맙 IL-5, 레슬리주맙, 토실리주맙 IL-6R, 우스테키누맙, 및 브리아키누맙 IL-12를 포함한다. 임의적으로, 항체는 브렌툭시맙은 아니다.
IX. 치료 방법 및 제약 조성물
치료하고자 하는 질환, 예컨대, 암, 자가면역 질환 또는 감염 (상기 논의된 적응증 중 임의의 것 포함)의 발병을 지연시키고/거나, 그의 중증도를 감소시키고/거나, 그의 추가적인 악화를 억제시키고/거나, 그의 1개 이상의 징후 또는 증상을 호전시키는, 투여량, 투여 경로 및 투여 빈도를 의미하는 유효 요법으로 상기 기술된 방법에 따라 제조된 ADC를 투여한다. 환자가 이미 상기 질환을 앓고 있다면, 요법은 치료학상 유효 요법을 지칭할 수 있다. 환자가 일반 집단에 비하여 질환의 위험이 상승되어 있지만, 아직 증상은 경험하지 않은 경우라면, 요법은 예방학상 유효 요법을 지칭할 수 있다. 일부 경우에서, 치료학적 또는 예방학적 효능은 같은 환자에서의 병력 대조군 또는 과거 경험과의 비교로 개별 환자에서 관찰될 수 있다. 다른 경우에서, 치료학적 또는 예방학적 효능은 비처리 환자로 이루어진 대조군 집단과의 비교로 처리된 환자 집단에서의 임상전 또는 임상 시험으로 입증될 수 있다.
ADC 투여량은 전형적으로 ADC의 약물 성분에 의존하여 달라진다. 예시적인 용량은 예를 들어, 1.0 ㎍/kg 내지 7.5 mg/kg, 또는 2 mg/kg 내지 7.5 mg/kg 또는 3 mg/kg 내지 7.5 mg/kg (대상체의 체중), 또는 0.1-20, 또는 0.5-5 mg/kg (체중) (예컨대, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/kg) 또는 고정 투여량으로서 10-1,500 또는 200-1,500 mg을 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 환자는 1.5 mg/kg 이상, 2 mg/kg 이상, 또는 3 mg/kg 이상의 용량으로 투여받게 되며, 매 3주마다 1회 또는 그 초과로 투여받게 된다. 투여량은 다른 인자들 중에서도 투여 빈도, 환자 상태 및 이전 치료법에 대한 반응, 존재할 경우, 처치가 예방적 처치인지 여부 또는 치료적 처치인지 여부, 및 장애가 급성인지 또는 만성인지 여부에 의존한다.
투여는 비경구적, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 경막내, 복강내, 국부, 비내 또는 근육내 투여일 수 있다. 투여는 예컨대, 종양 내로 직접 국재화될 수 있다. 정맥내 또는 피하 투여에 의한 전신 순환으로의 투여가 바람직하다. 정맥내 투여는 예를 들어, 일정 기간, 예컨대, 30-90 min 동안에 걸친 주입에 의해, 또는 단일 볼루스 주사에 의해 이루어질 수 있다.
투여 빈도는 다른 인자들 중에서도 순환 중 ADC의 반감기, 환자 상태 및 투여 경로에 의존한다. 빈도는 매일, 매주, 매월, 분기별로, 또는 환자 상태의 변화 또는 치료되는 암 진행에 대한 반응으로 불규칙적인 간격일 수 있다. 정맥내 투여인 경우, 비록 더 빈번하게 또는 덜 빈번하게도 투약이 이루어질 수 있지만, 예시적인 빈도는 연속된 치료 과정 동안 주 2회 내지 분기별이다. 정맥내 투여인 경우, 비록 더 빈번하게 또는 덜 빈번하게도 투약이 이루어질 수 있지만, 다른 예시적인 빈도는 연속된 치료 과정 동안 매주 또는 4주 중 3주이다. 피하 투여인 경우, 비록 더 빈번하게 또는 덜 빈번하게도 투약이 이루어질 수 있지만, 예시적인 투약 빈도는 매일 내지 매월이다.
투여되는 투약 횟수는 질환의 성질 (예컨대, 급성 또는 만성 증상을 나타내는지 여부), 및 치료법에 대한 장애의 반응에 의존한다. 급성 장애인 경우, 또는 만성 장애의 급성 악화인 경우, 대개는 1 내지 10회 투약이 충분하다. 때때로, 단일 볼루스 투약, 임의적으로, 분할된 형태인 것은 급성 장애, 또는 만성 장애의 급성 악화에 충분하다. 치료는 급성 장애, 또는 급성 악화의 재발에 대해서 반복될 수 있다. 만성 장애인 경우, 항체는 1, 5 또는 10년 이상 동안, 또는 환자 일생 동안 일정한 간격으로, 예컨대, 매주, 격주로, 매월, 분기별로, 6개월마다 투여될 수 있다.
비경구적 투여용의제약 조성물은 바람직하게 멸균성이고, 실질적으로 등장성 (240-360 mOsm/kg)이며, GMP 조건하에 제조된다. 제약 조성물은 단위 투여 형태 (즉, 단일 투여를 위한 투여량)로 제공될 수 있다. 제약 조성물은 하나 이상의 생리학상 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 제제화될 수 있다. 제제화는 선택된 투여 경로에 의존한다. 주사용인 경우, ADC는 수성 용액 중에서, 바람직하게, 생리학상 상용성인 완충제, 예컨대, 행크스 용액(Hank's solution), 링거액(Ringer's solution), 또는 생리 식염수 또는 아세테이트 완충제 (주사 부위에의 가벼운 통증을 감소시키기 위해) 중에서 제제화될 수 있다. 용액은 제제화 작용제, 예컨대, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 별법으로, 항체는 사용 전, 적합한 비히클, 예컨대, 멸균 발열성 물질 무함유 물과의 구성을 위해 동결된 형태일 수 있다. 액체 제제 중 항체의 농도는 예컨대, 1-100 mg/ml, 예컨대, 10 mg/ml일 수 있다.
본 발명의 ADC를 이용한 치료는 화학요법, 방사선 치료, 줄기 세포 치료, 수술, 항바이러스제, 항생제, 면역억제제 또는 자극제, 또는 치료받는 장애에 대해 효과적인 다른 치료법과 조합될 수 있다. 암 또는 자가면역 질환 치료를 위해 ADC와 함께 투여될 수 있는 유용한 다른 작용제 부류로는 예를 들어, 암성 세포 상에서 발현되는 다른 수용체에 대한 항체, 항튜불린제 (예컨대, 아우리스타틴), DNA 작은 홈 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제 (예컨대, 백금 착체, 예컨대, 시스플라틴, 단핵(백금), 이핵(백금) 및 삼핵 백금 착체 및 카르보플라틴), 안트라시클린, 항생제, 항폴레이트제, 항대사물, 화학요법 증감제, 듀오카르마이신, 에토포시드, 플루오르화된 피리미딘, 이오노포어, 렉시트롭신, 니트로소우레아, 플라티놀, 예비-형성성 화합물, 퓨린 항대사물, 퓨로마이신, 방사선 증감제, 스테로이드제, 탁산, 토포이소머라제 억제제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다.
일부 측면에서, ADC를 이용한 치료는 동일한 치료 (예컨대, 화학요법)이되, ADC를 사용하지 않는 것과 비교하였을 때, 종양을 앓는 환자, 특히, 재발성 또는 난치성 환자를 앓는 경우에 환자의 무진행 생존 기간 중앙값 또는 전체 생존 기간 중앙값을 적어도 30% 또는 40%만큼, 그러나, 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100% 이상만큼 연장시킬 수 있다. 일부 측면에서, 치료 (예컨대, 표준 화학요법)는 동일한 치료 (예컨대, 화학요법)이되, ADC를 사용하지 않는 것과 비교하였을 때, 종양을 앓는 환자의 완전 관해율, 부분 관해율, 또는 객관적 관해율 (완전 + 부분)을 적어도 30% 또는 40%만큼, 그러나, 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100% 이상만큼 증가시킬 수 있다.
전형적으로, 임상 시험 (예컨대, II상, II/III상 또는 III상 시험)에서, 표준 요법만을 단독으로 받은 (또는 위약을 함께 받은) 환자로 이루어진 대조군과 비교하였을 때, 상기 언급된 바와 같은, 표준 요법과 함께 ADC로 치료받은 환자의 무진행 생존 기간의 정중값의 연장 및/또는 관해율 증가는 예를 들어, p = 0.05 또는 0.01 또는 심지어 0.001 수준으로 통계학상 유의적이다. 완전 및 부분 관해율은 예컨대, 국립 암 연구소(National Cancer Institute) 및/또는 미국 식품 의약국(Food and Drug Administration)에 의해 열거되거나, 또는 그에 의해 승인받은 바와 같이, 암에 대한 임상 시험에서 보편적으로 사용되는 객관적 기준에 의해 측정된다.
실시예
실시예 1: QSOX1이 CHO 세포 배양물로부터 정제된 항체 제제 중에 존재한다는 증거
CHO 세포에서 발현된 항체의 정제로부터 생성된 것인 로트 DEVNKB-1은 예상 밖으로 불량한 약물 접합을 보였다. 그에 반해, 로트 L22042/E는 바람직한 수준의 약물 접합을 보였다. 항체에의 약물 접합은 유리 술프히드릴 기에 의해 매개되기 때문에, 로트 DEVNKB-1 중에 산화 활성을 가지는 불순물이 존재하는 것으로 의심되었다. 도 1은 산화 불순물이, 항체에의 약물 접합의 효능에 미치는 영향을 보여주는 것이다. 로트 DEVNKB-1로부터의 항체 (마름모꼴 기호 표시)는 50분 동안에 걸쳐 환원 시간이 증가함에 따라 약물 로드는 감소되는 것으로 나타난 반면, 로트 L22042/E로부터의 항체 (정사각형 기호 표시)는 환원 과정 동안 일관되고, 예상된 수준의 약물 로딩을 보였다.
CHO 세포에서 생산된 다른 항체로 이루어진 특정 제제가 로트 DEVNKB-1의 것과 유사한 산화 활성을 가지는 것으로 관찰되었는 바, 산화 활성의 근원이 관심 물질이 되었다. 산화 활성의 근원을 확인하기 위해, 로트 DEVNKB-1을 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅, 및 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)에 의해 술프히드릴 옥시다제의 존재에 대하여 분석하였다.
겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅
SDS-PAGE에 의한 분리 및 은 염색법을 수행한 후, 로트 DEVNKB-1 및 L22042/E를 비교하였을 때, 명백하게 산화 활성에 상응하는 어떤 단백질 밴드도 나타나지 않았다 (데이터 나타내지 않음). 더욱 잘 분리하기 위하여, 로트 DEVNKB-1을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분별하였다. 실시예 2에 기술되는 바와 같이 분획을 산화 활성에 대하여 검정하였다. 도 2a를 참조할 수 있다. 피크 활성에 상응하는 분획을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 불롯팅한 후, QSOX1, QSOX2, 및 ALR (간 재생의 촉진인자(Augmenter of Liver Regeneration))을 비롯한, 후보 술프히드릴 옥시다제 단백질에 대한 항체로 염색하였다. 도 2b 및 2c는 각각 항-ALR 및 항-QSOX1 1차 항체를 사용한 후, 토끼 항-염소 IgG 2차 항체를 사용하여 수행된 웨스턴 블롯 분석의 결과를 보여주는 것이다. 블롯은 2차 항체와 다수의 생성물 관련된 종 사이의 광범위한 교차 반응성을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, 분자량 65 kD 내지 70 kD에 상응하는 피크 활성 분획 27-29의 밴드가 항-QSOX1 블롯에서 검출되었는데 (도 2c), 이는 햄스터 QSOX1의 예측 분자량 (70,356 달톤)과 일치하는 것이다.
LC-MS/MS 분석
항-QSOX1 웨스턴 블롯에서 검출된 65-70 kD 단백질을 확인하기 위해, 포로스 단백질 A 칼럼 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 로트 DEVNKB-1을 분별하였다. 도 3a를 참조할 수 있다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 분획을 산화 활성에 대하여 검정하였다. 도 3b를 참조할 수 있다. 본질적으로 모든 산화 활성은 분획 3 및 4에서 나타났다. 일련의 3개의 런으로부터의 분획 3 및 4를 풀링하고, SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 도 3c를 참조할 수 있다. 가장 두드러진 밴드는 65-70 kD 범위에 있었고, 확산형의 단일 밴드 또는 이중선을 형성하였으며, 이는 웨스턴 블롯과 일치하는 것이었다. 겔 분해 및 LC-MS/MS를 사용하였을 때, 밴드는 QSOX1로서 양성인 것으로 확인되었다.
산화제 특징 규명
로트 DEVNKB-1에서의 산화 활성을 추가로 특징 규명하기 위해, 제1철 산화 크실레놀 오렌지 (FOX) 검정법을 이용하여 로트를 술프히드릴 산화 활성에 대하여 시험하였다. 술프히드릴 옥시다제는 하기 반응을 촉매화시킨다:
2 R-SH + O2 → R-S-S-R + H2O2
반응이 진행됨에 따라, 산소는 소모되고, 과산화수소가 생성된다. 과산화수소 부산물이 쉽게 및 신뢰할 수 있게 검출될 수 있으며, 따라서, 이는 술프히드릴 옥시다제 활성에 대한 대용물로서의 역할을 한다. FOX 검정법에서, 과산화수소는 제1철 (Fe2 +)을 산화시켜 제2철 (Fe3 +)을 생성한다. 이어서, 제1철은 크실레놀 오렌지와 착화하여 560 nm 광을 흡수하는 화합물을 형성한다. 따라서, (예컨대, 분광 광도계를 사용하여) 560 nm 광의 흡수를 모니터링함으로써, 샘플 중 술프히드릴 산화 활성 양을 측정할 수 있다. 560 nm 판독치의 차이를 측정함으로써 대조군의 값을 시험 샘플의 값과 비교한다. 생성된 값이 0.1 흡광도 단위보다 클 경우, 이때 샘플은 산화 불순물에 대해 양성인 것이다. 하기 표 1에 제시된 바와 같이, DEVNKB-1 존재시, 560 nm 흡광도는 0.70-0.80이었다. 그러나, DEVNKB-1 및 1 mM Zn2+, 둘 모두를 첨가하였을 때에는 단지 0.008에 불과하였다. 본 데이터는 1 mM Zn2+가 로트 DEVNKB-1에서 산화 활성을 본질적으로 제거할 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 플라빈-의존성 술프히드릴 옥시다제 도메인을 가지는 산화제, 예컨대, QSOX1과 일치하는 것이다.
<표 1>
Figure 112016060171185-pct00003
로트 DEVNKB-1에서 EDTA가 Zn2 +-의존성의 산화 활성 제거를 역전시킬 수 있는지 여부를 알아보기 위해 추가 검정법을 수행하였다. 본 실험에서는 Zn2 +를 EDTA와 함께 또는 그를 포함하지 않고, 검정용 완충제에 첨가하였다. 추가로, EDTA를 포함하는 검정용 완충제를 평가하였다. 표 2에 제시된 바와 같이, 추가의 EDTA를 함유한 검정용 완충제와 비교하였을 때, 로트 DEVNKB-1과 관련된 산화 활성은 Zn2 +의 존재에 의하여 95% 감소되었다. 그러나, Zn2 + 및 추가의 EDTA, 둘 모두를 첨가하였을 때에는 산화 활성이 단지 6%만큼만 감소되었다. 따라서, EDTA는 Zn2 +-의존성의 산화 활성 억제를 효과적으로 역전시켰다. 또한, 이는 플라빈-의존성 술프히드릴 옥시다제 도메인을 가지는 산화제, 예컨대, QSOX1에 대해서 예상되는 것이다.
<표 2>
Figure 112016060171185-pct00004
웨스턴 블롯 데이터, LC-MS/MS 데이터 (나타내지 않음), 및 산화 활성의 특징 규명에 기초하여, 로트 DEVNKB-1에서의 산화 활성은 QSOX1 술프히드릴 옥시다제인 것으로 확인되었다.
실시예 2: CHO 세포 배양물 중 QSOX1을 검출하기 위한 검정법
(예컨대, 항체가 약물에의 접합을 위한 것으로 의도될 때) 항체 제제 중의 산화 활성을 검출하기 위하여, 부분적으로 환원된 SGN-30 (cAC10 항체, 이는 브렌툭시맙 베도틴의 항체 성분이다)을 기질로서 사용하는 검정법이 개발되었다. cAC10 항체가 QSOX1 오염 없이 일관되게 정제되었는 바, 이에 SGN-30을 기질로서 선택하였다. 특징이 잘 규명된, 유리 티올이 있는 다른 기질이 SGN-30 대신 사용될 수 있다.
본 검정법은 고정된 시간량 동안 시험 샘플과 함께 기질 (예컨대, SGN-30)을 인큐베이션시킨 후, DTNB (5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산), 이는 또한 엘만 시약(Ellmans' reagent)으로도 공지)를 이용하여 기질 중의 유리 술프히드릴 기의 양을 검출하는 것을 포함한다.
Figure 112016060171185-pct00005
기질 중의 유리 티올 기는 DTNB와 반응하여 디술피드 결합을 절단하고, 2-니트로-5-티오벤조에이트 (NTB-)를 생성하고, 이는 중성 및 알칼리성 pH에서 물 중에서 NTB2 -로 이온화된다. NTB2 -는 황색이고, 이는 분광 광도계를 사용하여 412 nm에서의 가시 광선의 흡광도를 측정함으로써 빠르게 정량화될 수 있다. 산화 불순물이 시험 샘플 중에 존재한다면, 기질 상의 유리 술프히드릴 기 (예컨대, 디술피드 결합에 관여하지 않은 시스테인 잔기 중의 것)는 디술피드 결합으로 산화됨에 따라 유리 티올은 감소된다. 따라서, 기질과 DTNB 사이의 반응은 줄어들게 되고, 이로써 황색 색상의 발색은 감소되고, 이에 상응하여 샘플에 의한 412 nm 광 흡수는 감소된다.
DTNB와 유리 티올 기 사이의 반응은 빠르고, 화학량론적이다. 따라서, 원하는 경우, 기질 중 유리 술프히드릴 기의 양은 (묽은 완충제 용액에 적합한) 14,150M-1cm-1의 몰 흡광 계수를 사용하여 정량화될 수 있다.
검정법에서 사용된 물질로는 분광 광도계 (예컨대, 애질런트(Agilent) 모델 8453); 석영 큐벳 (예컨대, 스타나(Starna), 16.50-Q-10/Z15); 1 M 트리스 HCl (pH 7.4); 0.5 M EDTA (pH 8.0); 제1인산칼륨; 제2인산칼륨; 폴리소르베이트 80; DTNB (예컨대, 시그마(Sigma) D218200)를 포함한다.
본 검정법은 1종 이상의 음성 대조군 샘플, 양성 대조군, 시험 샘플, 및 분광 광도계 블랭크의 분광 광도 분석을 포함한다. 필요에 따라 추가의 대조군 및/또는 시험 샘플을 분석할 수 있다. 대조군 및 시험 샘플의 조성물은 하기 표 3에 제시되어 있다. 검정법에서 사용된 완충제는 10 mM 인산칼륨, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80 (pH 6.0)이다. 그러나, 분석하고자 하는 시험 샘플의 완충제에 따라 다른 묽은 완충제 또한 적합하다. 검정하고자 하는 샘플의 최종 부피는 150 ㎕이지만, 필요에 따라 이는 또한 조정될 수 있다. 검정법을 간소화시키기 위해, 완충제, EDTA, 물 및 기질 (예컨대, 부분적으로 환원된 cAC10)을 함유하는 마스터믹스 칵테일을 제조할 수 있으며, 검정은 50 ㎕의 샘플을 100 ㎕의 마스터믹스 칵테일에 첨가할 때 개시된다.
<표 3>
Figure 112016060171185-pct00006
샘플 제조 및 분석은 하기와 같이 수행된다. 분석하고자 하는 샘플 및 대조군에 상응하는 미세원심분리 튜브를 표지한다. 100 ㎕의 마스터믹스 칵테일을 각 튜브에 넣는다. 50 ㎕의 각 샘플을 상응하는 대조군/시험 샘플 튜브에 첨가한다. 와동시켜 튜브를 혼합한다. 튜브를 37℃ 수조 또는 인큐베이터에 배치하고, 2 hr 동안 인큐베이션시킨다. 각 샘플에 대한 제2 미세원심분리 튜브를 표지하고, 100 ㎕의 1 mM DTNB를 각 튜브에 넣는다. 2 hr의 인큐베이션 종료시, 수조/인큐베이터로부터 샘플을 제거하고, 100 ㎕의 샘플을 100 ㎕의 DTNB를 함유하는 상응하는 미세원심분리 튜브로 옮겨 놓는다. 와동시켜 튜브를 혼합한다. 샘플을 실온에서 5분 이상 인큐베이션시킨 후, 흡광도를 측정한다. 412 nm에서 흡광도를 측정하고, 700 nm에서의 흡광도에 대한 것으로 보정한다 (즉, A412-A700 측정). 200 nm부터 700 nm까지의 스펙트럼을 수집할 수 있다.
시험 샘플 중 산화 불순물의 존재를 평가하기 위해, 412 nm 판독치의 차이를 측정함으로써 음성 대조군 (완충제)의 값 (412 nm-700 nm)을 시험 샘플의 값과 비교한다. 생성된 값이 0.1 흡광도 단위보다 클 경우, 이때 샘플은 산화 불순물에 대해 양성인 것이다.
항체 배양물로부터의 배양 배지를 시험할 때, 검정 결과, 전형적으로 높은 값 (~0.5 AU)이 산출되며, 이는 산화제 수준이 높다는 것을 제안한다. 그러나, 검정의 판독 결과는 색상에 기반하는 것이며, 세포 배양 배지의 색상은 검정 판독 결과를 방해하는 경향이 있다. 결과적으로, 본 검정법을 사용하여 정화된 수확물 중의 산화 불순물을 명확하게 측정하기는 어렵다. 산화 불순물은 바람직하게는 1개 이상의 정제 단계 이후에, 예컨대, 1개 이상의 크로마토그래피 단계 이후에 (예컨대, 단백질 A, 이온 교환, 또는 HIC 크로마토그래피 이후에) 측정된다.
본 검정법은 일반적으로 QSOX1, QSOX2, ALR, 및 다른 효소로부터 발생된 활성을 비롯한, 술프히드릴 옥시다제 활성을 측정한다. 예컨대, 실시예 1에 기술된 바와 같이, 특정 술프히드릴 옥시다제에 대한 더욱 구체적인 검정법 또한 사용될 수 있다.
실시예 3: QSOX1 제거 방법
단백질 A 상에서의 염 세척 실행에 의한 산화 불순물 감소
본원에서 항체 2로 지칭되는 제2 항체 제제는 (원심분리 및 여과를 통한 정화 이후에) 허용불가능하게 높은 수준의 산화 활성을 가지는 것으로 나타났다. 산화 불순물을 제거하기 위해, 다양한 강도의 염 세척액을 이용하여 단백질 A 크로마토그래피를 평가하였다.
3.2 cm 직경 x 23.2 cm 베드 높이 (193.2 mL 베드 부피) 맙셀렉트 슈어 단백질 A(MabSelect Sure Protein A) 칼럼을 25 mM 트리스, 50 mM NaCl (pH 7.5)로 평형화시킨 후, 25 g의 mAb/L (패킹된 베드)에 로딩하였다. 로딩한 후, 하기 표 4에 제시된 바와 같이 다양한 수준의 NaCl을 함유하는 50 mM 트리스 완충처리된 용액으로 칼럼을 세척하였다. 25 mM 아세테이트 (pH 3.4)를 이용하여 항체 용리를 수행하였다. 유속은 4분 체류 시간으로 일정하게 유지되었다.
실시예 2의 검정법을 이용하여 칼럼 용출액 중 산화 불순물의 수준을 분석하였다. 데이터 (표 4 참조)는 중간 농도 (150 mM NaCl) 또는 고농도 (500 mM NaCl)의 염을 이용하여 세척하였을 때, 단백질 A 용출액 중에는 산화 불순물이 함유되어 있지 않았다는 것을 나타낸다. 저농도의 염 (50 mM NaCl)을 함유하는 세척액은 산화 불순물 수준을 0.1 미만의 흡광도 역치로 감소시키는 데에는 비효과적이었다. 고농도의 염으로부터의 세척액이 고수준의 산화 불순물을 함유하였으며, 이는 고농도의 염 세척액이 칼럼 수지 또는 mAb로부터 불순물을 탈착시켰다는 것을 입증한다.
본 결과는 일반적으로 단백질 A 리간드, 수지 골격, 및/또는 mAb에 대한 산화 불순물의 친화도는 이온성 상호작용과 일관되게 고 이온 강도 용액에 의해 파괴된다는 것을 나타낸다.
<표 4>
Figure 112016060171185-pct00007
심층 여과
심층 여과를 또한 산화 불순물을 제거할 수 있는 그의 능력에 대하여 시험하였다. 심층 필터인 밀리포어 X0HC 필터를 50-100 L/㎡의 물로 습윤화시키고, 15 L/㎡ 이상의 평형 완충제 (예컨대, pH 7.5-8 및 NaCl 농도 50-100 mM)로 평형화시켰다. 20-60 L/㎡의 표적화된 로드율로 230 L/㎡/hr. (LMH)로 여과를 수행하였다. 생성물을 회수하기 위해, 확실하게 표적 피크 수집에 도달하도록 하는 데 충분한 부피의 평형 완충제로 필터를 플러싱하였다. 280 nm에서의 흡광도에 의해 여액을 수집하였다. 상기 조건을 사용하여, 산화 불순물을 제거하였다.
음이온 교환 - 캅토 Q
pH 8.0 및 전도도 < 8 mS/cm (예컨대, 5-7 mS/cm)의 완충제를 이용하여 유통형 모드로 작동되었을 때, 캅토 Q 강한 음이온 교환 칼럼 (GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈(GE Healthcare Life Sciences), 카탈로그 번호 17-5316) 결과, 산화 불순물은 제거된 것으로 관찰되었다. 상기 조건은 캅토 Q 칼럼을 사용한 산화 불순물의 제거를 평가하기 위한 출발점을 제공한다. 항체 1의 경우, 산화 불순물의 효과적인 제거를 위해서는 전도도가 낮고, pH가 높은 완충제가 요구되는 것으로 입증되었다. 캅토 Q 칼럼은 유통형 모드로 작동되었다. 적절한 조건에서, mAb는 수지에 의해 유지되지 않는 반면, 산화 불순물은 수지에 의해 흡착되었다. 추후, 산화 불순물을 고염 완충제를 사용하여 수지로부터 스트립핑하였다. 제2 항체인, 하기 표 5에 제시된 항체 2의 경우, 완충제의 전도도가 11 mS/cm라는 조건으로 (전도도는 11 이하여야 한다), 효과적인 제거는 pH 7.5 (7.5-8이 효과적이다)에서 이루어진 것으로 입증되었다. pH 7.5 및 전도도 15 mS/cm인 완충제와 같이, pH 7이고, 전도도 범위가 11 내지 15 mS/cm인 완충제는 유통형 모드로 mAb로부터 불순물을 분리시키는 데 비효과적이었다.
<표 5>
Figure 112016060171185-pct00008
페닐 막
유통형 모드로 작동된 사르토바인드 페닐®도 또한 CHO 세포에서 생산된 항체 제제로부터 산화 불순물을 효과적으로 제거한 것으로 나타났다. 적절한 조건에서, 산화 불순물은 막에 의해 유지되는 반면, mAb는 유지되지 않는다. 추후, 산화 불순물을 저염 완충제를 사용하여 수지로부터 스트립핑할 수 있다. 항체를 표적 시트레이트 몰 농도 (전형적으로, 0.3-0.4 M 시트르산나트륨) 및 pH (전형적으로, 6-8)로 희석시킴으로써 로드를 제조한다. 희석된 항체 로드에 매칭시키기 위해 선택된 5 막 부피 (MV)의 평형 완충제 중에서 막을 평형화시킨다. 이어서, 희석된 로드를 막을 적용시키고, 막을 10 MV의 평형 완충제로 세척한다. 산화 불순물을 함유하지 않는 항체 제제는 통과액 중에서 나타난다. 결합된 물질을 예컨대, 50 mM 트리스 (pH 8)로 용리시키고, 막을 예컨대, 5 MV의 25 mM 인산나트륨, 20% IPA (pH 6.5)로 재생시킨다. 본 공정은 10 mL/min 또는 3.3 MV/min으로 작동된다. 2 mm 유로를 사용하여 예컨대, 280 nm에서 0.1-0.1 AU인 통과액의 전체 피크를 수집한다.
하기 표 6은 페닐 막 상에서의 정제 단계로부터 얻은 데이터를 제공한다. 페닐 통과액에서 측정된 산화 불순물 수준의 범위는 0.1 내지 0.04 흡광도 단위였다.
<표 6>
Figure 112016060171185-pct00009
페닐 막을 사용하기 위한 조작상의 강인성을 측정하기 위해, 상이한 pH 및 시트레이트 몰 농도 조건에서 페닐 막 정제 단계를 적용시킨 후, 항체 2 제제 중에 존재하는 산화 불순물을 평가하였다. 하기 표 7을 참조할 수 있다. 통과액 중의 산화 불순물 수준을 감소시키기 위해서, 시트레이트의 몰 농도는 상한인 0.4 M에서 작동되는 것이 바람직하다.
<표 7>
Figure 112016060171185-pct00010
상기 또는 하기에 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 공개문헌, 등록 번호 등은 각 개별 항목이 참조로 포함된다고 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그의 전문이 참조로 포함된다. 만약 서열의 다른 버전이 다른 시점에 한 등록 번호와 관련이 있는 경우, 본 출원의 유효 출원일에 상기 등록 번호와 관련된 버전이 의도된다. 유효 출원일이란 실제 출원일 또는 적용 가능한 경우, 등록 번호를 언급하는 우선권 출원의 출원일 중 앞선 날짜를 의미한다. 유사하게, 만약 다른 버전의 공개문헌, 웹사이트 등이 다른 시점에 공개되었다면, 달리 명시되지 않는 한, 상기 버전이 출원의 유효 출원일에서 가장 최근에 공개된 것으로 의도된다. 본 발명의 임의의 특징, 단계, 요소, 실시양태 또는 측면도 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 임의의 다른 것과 함께 조합되어 사용될 수 있다. 비록 본 발명이 명료성 및 이해 목적으로 예시 및 실시예를 통하여 일부 상세하게 기술되었지만, 첨부된 청구범위의 범주 내에서 특정 변화 및 변형이 실시될 수 있다는 것은 명백할 것이다.
서열 목록
Figure 112016060171185-pct00011
SEQUENCE LISTING <110> SEATTLE GENETICS, INC. <120> PREPARING ANTIBODIES FROM CHO CELL CELTURES FOR CONJUGATION <130> 3100-00111PC <150> 61/908,568 <151> 2013-11-25 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 690 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 1 Met Ala Thr Gly Leu Arg Arg Arg Glu Tyr Ile Trp Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Leu Thr Ile Thr Val Ser Tyr Leu Val Ala Leu Phe Ser His Leu Leu 20 25 30 Arg Ile Leu Thr Val Lys Lys Leu Gln Trp Arg Pro Val Leu Asn Leu 35 40 45 Ala Val Leu Asp Cys Ala Glu Glu Thr Asn Thr Ala Val Cys Arg Asp 50 55 60 Phe Asn Ile Ser Gly Phe Pro Thr Val Arg Phe Phe Lys Ala Phe Ser 65 70 75 80 Lys Asn Gly Ser Gly Ile Thr Leu Pro Val Ala Asp Ala Ser Val Glu 85 90 95 Thr Leu Arg Arg Lys Leu Ile Asp Ala Leu Glu Ser His Ser Asp Met 100 105 110 Trp Ser Ser Ser Arg Pro Lys Leu Lys Pro Ala Lys Leu Val Glu Ile 115 120 125 Asn Glu Phe Phe Ala Glu Thr Asn Glu Asp Tyr Leu Val Leu Ile Phe 130 135 140 Glu Asp Lys Asp Ser Tyr Val Gly Arg Glu Val Thr Leu Asp Leu Phe 145 150 155 160 Gln His His Ile Pro Val His Arg Val Leu Asn Thr Glu Arg Asn Ala 165 170 175 Val Ser Lys Phe Gly Val Val Glu Phe Pro Ser Cys Tyr Leu Leu Phe 180 185 190 Arg Asn Gly Ser Phe Ser Arg Val Pro Val Val Met Glu Ser Arg Leu 195 200 205 Phe Tyr Thr Ser Tyr Leu Lys Gly Met Ser Gly Pro Ile Leu Val Asp 210 215 220 Pro Pro Thr Thr Thr Ile Ser Thr Asp Ala Pro Val Thr Thr Asp Val 225 230 235 240 Val Pro Thr Val Trp Lys Val Ala Asn His Ala Arg Ile Tyr Met Ala 245 250 255 Asp Leu Glu Ser Ser Leu His Tyr Ile Phe Leu Val Glu Val Gly Lys 260 265 270 Phe Ser Val Leu Glu Gly Gln Arg Leu Leu Ala Leu Lys Lys Leu Val 275 280 285 Ala Val Leu Ala Lys Tyr Phe Pro Gly Arg Pro Leu Ala Gln Asn Phe 290 295 300 Leu His Ser Ile His Asp Trp Leu Gln Arg Gln Gln Arg Lys Lys Ile 305 310 315 320 Pro Tyr Lys Phe Phe Arg Ala Ala Leu Asp Asn Arg Lys Glu Gly Ile 325 330 335 Val Leu Thr Glu Lys Val Asn Trp Val Gly Cys Gln Gly Ser Lys Pro 340 345 350 His Phe Arg Gly Phe Pro Cys Ser Leu Trp Ile Leu Phe His Phe Leu 355 360 365 Thr Val Gln Ala Ser Arg Tyr Ser Glu Asn His Pro Gln Glu Pro Ala 370 375 380 Asp Gly Gln Glu Val Leu Gln Ala Met Arg Ser Tyr Val Gln Trp Phe 385 390 395 400 Phe Gly Cys Arg Asp Cys Ala Glu His Phe Glu Asn Met Ala Ala Ser 405 410 415 Thr Met His Arg Val Arg Ser Pro Thr Ser Ala Val Leu Trp Leu Trp 420 425 430 Thr Ser His Asn Lys Val Asn Ala Arg Leu Ser Gly Ala Pro Ser Glu 435 440 445 Asp Pro Tyr Phe Pro Lys Val Gln Trp Pro Leu Arg Glu Leu Cys Phe 450 455 460 Asp Cys His Asn Glu Ile Asn Gly Arg Glu Pro Val Trp Asp Leu Glu 465 470 475 480 Ala Thr Tyr Arg Phe Leu Lys Ala His Phe Ser Ser Glu Asn Ile Ile 485 490 495 Leu Asp Thr Pro Val Ala Gly Leu Ala Thr Gln Arg Asn Pro Gln Ile 500 505 510 Leu Gly Ala Thr Pro Glu Pro Val Met Asp Ala Leu Glu Leu Glu Thr 515 520 525 Arg Asn Ser Val Leu Gly His Glu Arg Ala Ala Ser Thr Glu Ser Pro 530 535 540 Gly Ala Thr Ala Leu Asn Val Pro Val Gly Lys Pro Glu Ala Ser Gly 545 550 555 560 Pro Gln Ala Leu Tyr Thr Gly Gln Gly Pro Pro Glu His Met Glu Glu 565 570 575 Pro Gln Arg Val Thr Gln Gly His Thr Gln Gly Gln Gln His Leu Ser 580 585 590 Lys Arg Asp Thr Glu Val Leu Thr Leu Pro Glu Val Asn His Leu Gln 595 600 605 Gly Pro Leu Glu Leu Arg Arg Gly Gly Arg Ser Pro Lys Gln Leu Val 610 615 620 Asn Ile Pro Glu Gly Glu Pro Glu Ala Pro Ala Ile Arg Gly Gln Gly 625 630 635 640 Pro Trp Leu Gln Val Leu Gly Arg Gly Phe Ser His Leu Asp Ile Ser 645 650 655 Leu Cys Val Gly Leu Tyr Ser Val Ser Phe Val Cys Leu Leu Ala Met 660 665 670 Tyr Thr Tyr Phe Arg Ala Arg Leu Arg Thr Pro Lys Gly His Leu Val 675 680 685 Thr Gln 690 <210> 2 <211> 571 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 2 Met Arg Arg Cys Gly Arg His Ser Gly Ser Pro Ser Gln Met Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Ala Val Pro Gly Ala Gly Ala Val 20 25 30 Gln Val Ser Val Leu Tyr Ser Ser Ser Asp Pro Val Thr Val Leu Asn 35 40 45 Ala Asn Thr Val Arg Ser Thr Val Leu Arg Ser Asn Gly Ala Trp Ala 50 55 60 Val Glu Phe Phe Ala Ser Trp Cys Gly His Cys Ile Ala Phe Ala Pro 65 70 75 80 Thr Trp Lys Glu Leu Ala Tyr Asp Val Arg Glu Trp Arg Pro Val Leu 85 90 95 Asn Leu Ala Val Leu Asp Cys Ala Glu Glu Thr Asn Thr Ala Val Cys 100 105 110 Arg Asp Phe Asn Ile Ser Gly Phe Pro Thr Val Arg Phe Phe Lys Ala 115 120 125 Phe Ser Lys Asn Gly Ser Gly Ile Thr Leu Pro Val Ala Asp Ala Ser 130 135 140 Val Glu Thr Leu Arg Arg Lys Leu Ile Asp Ala Leu Glu Ser His Ser 145 150 155 160 Asp Met Trp Ser Ser Ser Arg Pro Lys Leu Lys Pro Ala Lys Leu Val 165 170 175 Glu Ile Asn Glu Phe Phe Ala Glu Thr Asn Glu Asp Tyr Leu Val Leu 180 185 190 Ile Phe Glu Asp Lys Asp Ser Tyr Val Gly Arg Glu Val Thr Leu Asp 195 200 205 Leu Phe Gln His His Ile Pro Val His Arg Val Leu Asn Thr Glu Arg 210 215 220 Asn Ala Val Ser Lys Phe Gly Val Val Glu Phe Pro Ser Cys Tyr Leu 225 230 235 240 Leu Phe Arg Asn Gly Ser Phe Ser Arg Val Pro Val Val Met Glu Ser 245 250 255 Arg Leu Phe Tyr Thr Ser Tyr Leu Lys Gly Met Ser Gly Pro Ile Leu 260 265 270 Val Asp Pro Pro Thr Thr Thr Ile Ser Thr Asp Ala Pro Val Thr Thr 275 280 285 Asp Val Val Pro Thr Val Trp Lys Val Ala Asn His Ala Arg Ile Tyr 290 295 300 Met Ala Asp Leu Glu Ser Ser Leu His Tyr Ile Phe Leu Val Glu Val 305 310 315 320 Gly Lys Phe Ser Val Leu Glu Gly Gln Arg Leu Leu Ala Leu Lys Lys 325 330 335 Leu Val Ala Val Leu Ala Lys Tyr Phe Pro Gly Arg Pro Leu Ala Gln 340 345 350 Asn Phe Leu His Ser Ile His Asp Trp Leu Gln Arg Gln Gln Arg Lys 355 360 365 Lys Ile Pro Tyr Lys Phe Phe Arg Ala Ala Leu Asp Asn Arg Lys Glu 370 375 380 Gly Ile Val Leu Thr Glu Lys Val Asn Trp Val Gly Cys Gln Gly Ser 385 390 395 400 Lys Pro His Phe Arg Gly Phe Pro Cys Ser Leu Trp Ile Leu Phe His 405 410 415 Phe Leu Thr Val Gln Ala Ser Arg Tyr Ser Glu Asn His Pro Gln Glu 420 425 430 Pro Ala Asp Gly Gln Glu Val Leu Gln Ala Met Arg Ser Tyr Val Gln 435 440 445 Trp Phe Phe Gly Cys Arg Asp Cys Ala Glu His Phe Glu Asn Met Ala 450 455 460 Ala Ser Thr Met His Arg Val Arg Ser Pro Thr Ser Ala Val Leu Trp 465 470 475 480 Leu Trp Thr Ser His Asn Lys Val Asn Ala Arg Leu Ser Gly Ala Pro 485 490 495 Ser Glu Asp Pro Tyr Phe Pro Lys Val Gln Trp Pro Leu Arg Glu Leu 500 505 510 Cys Phe Asp Cys His Asn Glu Ile Asn Gly Arg Glu Pro Val Trp Asp 515 520 525 Leu Glu Ala Thr Tyr Arg Phe Leu Lys Ala His Phe Ser Ser Glu Asn 530 535 540 Ile Ile Leu Asp Thr Pro Val Ala Gly Leu Ala Thr Gln Arg Asn Pro 545 550 555 560 Gln Ile Leu Gly Ala Thr Pro Glu Pro His Met 565 570

Claims (32)

  1. (a) 정제 방식 중 1개 이상의 정제 단계를 수행하여, 항체를 발현하는 CHO 세포의 배양물로부터 적어도 부분적으로 정제된 항체 제제를 수득하는 단계;
    (b) CHO 세포 술프히드릴 산화 효소의 존재에 대하여 제제를 시험하는 단계;
    (c) 단계 (b)의 제제 중에 허용되지 않는 수준의 효소가 존재하는 것으로 검출되는 경우, 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계;
    (d) 단계 (b)의 제제 중에 허용되는 수준의 CHO 세포 술프히드릴 산화 효소가 존재하는 것으로 검출되거나, 어떤 CHO 세포 술프히드릴 산화 효소도 검출되지 않는 경우, 같은 배양물 또는 항체를 발현하는 CHO 세포의 제2 배양물 상에서 CHO 세포 술프히드릴 산화 효소가 허용되는 수준으로 검출되거나, 또는 어떤 CHO 세포 술프히드릴 산화 효소도 검출되지 않도록 하는 1개 이상의 정제 단계를 수행하여 적어도 부분적으로 정제된 항체 제제를 수득하는 단계, 및
    (e) 적어도 부분적으로 정제된 항체를 하나 이상의 술프히드릴 기를 통해 세포독성 약물에 접합시켜 접합된 항체를 생산하는 단계
    를 포함하는, 접합된 항체를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, CHO 세포 술프히드릴 산화 효소가 퀴에신 Q6 술프히드릴 옥시다제 1 (QSOX1), Q6 술프히드릴 옥시다제 2 (QSOX2), 및 간 재생 촉진인자 (ALR) 중 적어도 하나로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 허용되는 수준으로 효소가 검출되거나, 또는 어떤 효소도 검출되지 않도록 하는 정제 방식이 150-500 mM 농도의 NaCl의 염 세척액을 이용하여 단백질 A 칼럼을 세척하는 단계, 심층 여과를 사용하는 단계, 4급 암모늄 이온 칼럼을 이용하는 음이온 교환을 사용하는 단계, 또는 페닐 막 여과를 사용하는 단계 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 시험하는 단계가 겔 상에서 65-75 kDa의 밴드를 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 밴드를 웨스턴 블롯 또는 은 염색에 의해 확인하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 시험하는 단계가 QSOX1 활성에 대한 관능성 시험을 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 관능성 시험이 활성의 지표로서 과산화수소를 생성하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 활성이 아연 이온에 의해 억제되고, 억제는 EDTA에 의해 역전되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 항체가 브렌툭시맙이 아닌 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 세포독성 약물이 항튜불린제, DNA 작은 홈 결합제, DNA 복제 억제제, 화학요법 증감제 및 피롤로벤조디아제핀 이량체로부터 선택되는 것인 방법.
  11. (a) 정제 방법을 수행하여 항체를 발현하는 CHO 세포의 배양물로부터 적어도 부분적으로 정제된 항체 제제를 수득하는 단계;
    (b) CHO 효소 QSOX1의 존재에 대하여 제제를 시험하는 단계;
    (c) 단계 (b)의 제제 중에 허용되지 않는 수준의 효소가 존재하는 것으로 검출되는 경우, 상이한 정제 방법을 사용하여 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계
    를 포함하는, CHO 세포 배양물로부터 항체를 정제하는 방법.
  12. 25 - 100 mM 농도의 NaCl로 단백질 A 칼럼을 세척하는 단계, 심층 여과를 사용하는 단계, 4급 암모늄 이온 칼럼을 이용하는 음이온 교환을 사용하는 단계, 또는 페닐 막 여과를 사용하는 단계 중 적어도 하나를 포함하는 정제 방법에 의해 CHO 세포의 배양물로부터 항체를 정제하는 단계로서, 여기서 항체는 배양물 중 QSOX1 효소로부터 분리되는 것인 단계; 및
    정제된 항체를 하나 이상의 술프히드릴 기를 통해 세포독성 약물에 접합시켜 접합된 항체를 제조하는 단계
    를 포함하는, 접합된 항체를 제조하는 방법.
  13. CHO 세포 술프히드릴 산화 효소의 존재에 대하여 제제를 시험하는 단계;
    항체 제제 중에 허용되지 않는 수준의 효소가 존재하는 것으로 검출되는 경우, 제제를 접합을 위해 적합하지 않은 것으로 확인하고, 추가의 정제를 요구하는 단계; 및
    항체 제제 중에 허용되는 수준의 효소가 존재하는 것으로 검출되거나, 또는 어떤 수준의 효소도 검출되지 않는 경우, 제제를 접합을 위해 적합한 것으로 확인하는 단계
    를 포함하는, 약물에의 접합을 위한 항체 제제의 적합성을 결정하는 방법.
  14. 제1항, 제11항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 CHO 세포에서 생산된 항체인 방법.
  15. 제1항, 제11항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 제제에 이미 1개 이상의 정제 단계가 수행된 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 정제 단계가 크로마토그래피 정제 단계인 방법.
  17. 접합 전에 항체가 CHO 세포 술프히드릴 산화 효소의 존재에 대하여 시험된 것인, 항체 약물 접합체.
  18. 제11항 또는 제13항에 있어서, 시험하는 단계가 겔 상에서 65-75 kDa의 밴드를 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 밴드를 웨스턴 블롯 또는 은 염색에 의해 확인하는 것인 방법.
  20. 제11항 또는 제13항에 있어서, 시험하는 단계가 QSOX1 활성에 대한 관능성 시험을 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 관능성 시험이 활성의 지표로서 과산화수소를 생성하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 활성이 아연 이온에 의해 억제되고, 억제는 EDTA에 의해 역전되는 것인 방법.
  23. 제1항, 제11항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 시험하는 단계가 대조군 샘플 및 시험 샘플 중의 유리 티올 기와 DTNB 사이의 반응을 모니터링하고, 그 둘을 비교하는 것을 포함하는 것인 방법.
  24. 삭제
  25. 삭제
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