PT2215117E - Purificação de anticorpo por cromatografia de troca de catiões - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

PURIFICAÇÃO DE ANTICORPO POR CROMATOGRAFIA DE TROCA DE

CATIÕES

Pedidos relacionados Antecedentes da invenção Campo da invenção

Esta invenção refere-se, em geral, à purificação de proteínas. Em particular, a invenção refere-se a um método para purificar anticorpo de uma composição que compreende o anticorpo e pelo menos um contaminante utilizando cromatografia de troca de catiões, em que é utilizada uma etapa de lavagem em pH elevado para remover contaminantes antes de eluir o anticorpo desejado utilizando um tampão de eluição com condutividade aumentada.

Descrição da arte relacionada A purificação económica a grande escala de proteínas é um problema crescentemente importante para a indústria da biotecnologia. Em geral, as proteínas são produzidas por cultivo celular, utilizando linhas de células eucarióticas ou procarióticas fabricadas por engenharia para produzir a proteína de interesse por inserção de um plasmídeo recombinante contendo o gene para essa proteína. Uma vez que as células tipicamente utilizadas são organismos vivos, têm de ser alimentadas com um meio de crescimento complexo, contendo açúcares, aminoácidos e fatores de crescimento, normalmente fornecidos a partir de preparação do soro animal. A separação da proteína desejada da mistura de compostos alimentada às células e dos sub-produtos das próprias células a uma pureza suficiente para utilização como um terapêutico humano constitui um desafio formidável.

Os procedimentos para purificação de proteínas a partir dos resíduos celulares inicialmente dependem do local de expressão da proteína. Algumas proteínas podem ser embaladas para serem segregadas diretamente a partir da célula para os meios de crescimento circundantes; outras são feitas por via intracelular. Para estas últimas, a primeira etapa de um processo de purificação envolve lise celular, que pode ser feita por uma variedade de métodos, incluindo corte mecânico, choque osmótico ou tratamentos enzimáticos. Tal rutura liberta os conteúdos inteiros da célula para o homogenado e, além disso, produz fragmentos subcelulares que são difíceis de remover por causa do seu pequeno tamanho. Estes são geralmente removidos por centrifugação diferencial ou por filtração. 0 mesmo problema coloca-se, apesar de a uma escala mais pequena, com proteínas segregadas diretamente devido à morte natural das células e libertação de proteínas da célula hospedeira intracelular ao longo da corrida de produção de proteínas.

Após ter sido obtida uma solução clarificada contendo a proteína de interesse, a sua separação das outras proteínas producidas pela célula é normalmente tentada utilizando uma combinação de diferentes técnicas cromatográficas. Estas técnicas separam misturas de proteínas com base na sua carga, grau de hidrofobicidade ou tamanho. Várias resinas cromatográficas diferentes estão disponíveis para cada uma destas técnicas, permitindo ajustar com precisão o esquema de purificação à proteína particular envolvida. A essência de cada um destes métodos de separação é que as proteínas podem ser causadas para descer a taxas diferentes por uma coluna longa, atingindo uma separação física que aumenta à medida que descem pela coluna, ou para aderir seletivamente ao meio de separação, sendo então eluídas diferencialmente por solventes diferentes. Nalguns casos, a proteína desejada é separada de impurezas quando as impurezas aderem especificamente à coluna e a proteína de interesse não, ou seja, a proteína de interesse está presente no "flux contínuo". A cromatográfia de troca de iões é uma técnica cromatográfica que é vulgarmente utilizada para a purificação de proteínas. Na cromatografia de troca de iões, os pedaços carregados na superfície do soluto são atraídos por cargas opostas anexas a uma matriz de cromatografia, desde que a força iónica do tampão circundante seja baixa. A eluição é geralmente conseguida aumentando a força iónica (isto é, condutividade) do tampão para competir com o soluto pelos locais carregados da matriz de troca iónica. Alterando o pH e alterando, assim, a carga do soluto é outra forma de conseguir a eluição do soluto. A alteração na condutividade ou pH pode ser gradual (eluição por gradiente) ou passo por passo (eluição por etapas). No passado, estas alterações foram progressivas; isto é, o pH ou condutividade é aumentada ou diminuída numa única direção

As Patentes U.S. N.°s 6 339 142 6 417 355 6 489 447 e 7 074 404 (Basey et al.) descrevem cromatograf ia de troca iónica para purificar polipeptídeos. As Patentes U.S. N.°s 6 127 526 6 333 398 e 6 797 814 (Blank, G.) descrevem purificar proteínas, tais como anticorpos anti-HER2, por cromatografia de proteína A. Métodos para purificar proteínas, tais como anticorpos, por cromatografia de troca de iões são descritos na Publicação do Pedido US N.° 2004/0082047 . A Patente U.S. N.° 5 110 913 refere-se a purificar um anticorpo numa solução aquosa ligando o anticorpo a uma resina de troca de iões num pH inicial de 4,6, lavando num pH secundário de 5,5 e eluindo o anticorpo a pH 6,5, em que a força iónica das soluções destas três etapas permanece constante. Zhang et al. referem-se à membrana Q, cromatografia de troca de aniões de um anticorpo humano (Zhang et al. "Q Membrane Chromatography Application for Human Antibody Purification Process," Poster apresentado na BioProduction, 26-27 de outubro de 2004, Munique, Alemanha). Outras publicações referentes a purificação de proteínas incluem: Barnthouse et al. J. Biotech. 66: 125- 136 (1998); Blank et al. Bioseparation 10: 65-71 (2001);

Follman e Fahrner J. Chromatog. 1024: 79-85 (2004); Iyer et al. BioPharm 15(1):14-16, 18, 20, 53 (2002); Documento US 2004/0082047A1; documento EP 333 574; documento EP 460 426 Bl; documento EP 556 083; documento WO 89/05157; documento WO 92/22653; documento WO 93/06217; documento WO 95/22389; documento WO 96/33208; documento WO 96/40883; documento US 4 753 894; documento US 4 966 851; documento US 5 110 913; documento US 5 112 951; documento US 5 115 101; documento US 5 118 796; documento US 5 169 774; documento US 5 196 323; documento US 5 256 769; documento US 5 279 823; documento US 5 429 746; documento US 5 451 662; documento US 5 525 338; documento US 5 677 171 ; documento US 6 005 081; documento US 6 054 561; documento US 6 127 526; documento US 6 2 67 958; documento US 6 339 142; documento US 6 417 335; documento US 6 489 447; Adachi et al.,

Journal of Chromatography. A. 763(1-2):57-63 (Feb 28, 1997); Gagnon, P., Purification Tools for Monoclonal

Antibodies, Tucson: Validated Biosystems, Inc., Capitulo 4, páginas 57-86 (1996); Graf et al., Bioseparation 4(1):7-20 (fevereiro de 1994); Mhatre et al. , Journal of

Chromatography A 707(2):225-231 (21 de julho de 1995);

Neidhardt et al. , Journal of Chromatography 590(2) :255-261 (1992); Protein Purification Applications - A Practical Approach, Harris e Angal, IRL Press páginas 151-156 (1995);

Sofer et al. Handbook of Process Chromatography: A Guide to Optimization, Scale-up, and Validation, San Diego: Academic Press páginas 65-80 (1997); Tishchenko et al. , Journal of

Chromatography B 706(1) :157-166 (27 de fevereiro de 1998) . Sumário da invenção A invenção aqui diz respeito a um método melhorado para cromatografia de troca de catiões de anticorpos no qual é utilizada uma etapa de lavagem com pH elevado para remover contaminantes antes de desarranjar o produto anticorpo desejado. 0 processo resulta, entre outras coisas, na remoção melhorada de contaminantes de Proteínas do ovário de Hamster Chinês (CHOP).

De acordo com um primeiro aspeto, a invenção providencia um método para purificar um anticorpo de uma composição que compreende o anticorpo e pelo menos um contaminante, cujo método compreende as etapas sequenciais de: (a) carregar a composição sobre um material de troca de catiões em que a composição tem como pH inicial de entre 4,0 a 6,0; (b) lavar o material de troca de catiões com um primeiro tampão de lavagem a um pH que é superior ao da composição em (a) , em que o pH do primeiro tampão de lavagem é de cerca de 6,8 a cerca de 9,0; (c) lavar o material de troca de catiões com um segundo tampão de lavagem a um pH que é inferior ao do primeiro tampão de lavagem: em que o pH do segundo tampão de lavagem é de 5,0 a 6,0 (d) eluir o anticorpo do material de troca de catiões com um tampão de eluição a uma condut ividade que é substancialmente superior à do segundo tampão de lavagem.

Preferencialmente o anticorpo liga-se a CD20 humana, tal como rituximab, ou liga-se a fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF), tal como bevacizumab.

De acordo com uma modalidade preferida, a invenção diz respeito a um método para purificar um anticorpo que liga CD20 humana de uma composição que compreende o anticorpo e um ou mais contaminantes selecionados do grupo que consiste em Proteínas do ovário de Hamster Chinês (CHOP), proteína A lixiviada, ADN e anticorpo CD20 agregado, cujo método compreende as etapas sequenciais de: (a) carregar a composição sobre um material de troca de catiões em que a composição tem um pH de cerca de 4.0 a cerca de 6,0; (b) lavar o material de troca de catiões com um primeiro tampão de lavagem a um pH de cerca de 6,8 a cerca de 9,0; (c) lavar o material de troca de catiões com um segundo tampão de lavagem a um pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,0; e (d) eluir o anticorpo do material de troca de catiões utilizando um tampão de eluição com um pH de cerca de 5.0 a cerca de 6,0 e uma condutividade de cerca de 10 a cerca de 100mS/cm. Preferencialmente o anticorpo CD20 é rituximab.

De acordo com outra modalidade preferida, a invenção refere-se a um método para purificar um anticorpo que liga o fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF) de uma composição que compreende o anticorpo e um ou mais contaminantes selecionados do grupo que consiste num componente dos meios de cultura celulares, garamicina,

Proteínas do ovário de Hamster Chinês (CHOP), ADN, contaminante virai e anticorpo VEGF agregado, cujo método compreende as etapas sequenciais de: (a) carregar a composição sobre um material de troca de catiões em que a composição tem um pH de cerca de 4.0 a cerca de 6,0; (b) lavar o material de troca de catiões com um primeiro tampão de lavagem a um pH de cerca de 6,8 a cerca de 8,0; (c) lavar o material de troca de catiões com um segundo tampão de lavagem a um pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,0; e (d) eluir o anticorpo do material de troca de catiões utilizando um tampão de eluição com um pH de cerca de 5.0 a cerca de 6,0 e uma condutividade de cerca de 10 a cerca de 100mS/cm. Preferencialmente, o anticorpo VEGF is bevacizumab.

Breve descrição dos desenhos

As Figuras IA e 1B providenciam as sequências de aminoácidos da cadeia pesada (SEQ. ID N.° 1) e da cadeia leve (SEQ. ID N.° 2) do anticorpo rituximab. São identificadas cada uma das regiões estrutura (FR1-4) e cada uma das regiões CDR (CDR1-3) em cada região variável, tal como o são a sequência constante da cadeia pesada gama 1 humana e a sequência constante da cadeia leve kapa humana. A região pesada variável (VH) está na SEQ. ID N.° 3. A região leve variável (VL)

está na SEQ. ID N.° 4. Os identificadores de sequência para as CDRs são: CDR Hl (SEQ. ID N.° 5), CDR H2 (SEQ. ID N.° 6), CDR H3 (SEQ. ID N.° 7), CDR LI (SEQ. ID N.° 8), CDR L2 (SEQ. ID N.° 9) e CDR L3 (SEQ. ID N.° 10). As Figuras 2A e 2B providenciam as sequências de aminoácidos da cadeia pesada (SEQ. ID N.° 11) e cadeia leve (SEQ. ID N.° 12) do anticorpo bevacizumab. A extremidade de cada região variável está indicada com i. A região pesada variável (VH) está na SEQ. ID N.° 13. A região leve variável (VL) está na SEQ. ID N.° 14. Cada uma das três CDRs em cada região variável

está sublinhada. Os identificadores de sequência para as CDRs são: CDR Hl (SEQ. ID N.° 15), CDR H2 (SEQ. ID N.° 16), CDR H3 (SEQ. ID N.° 17), CDR LI (SEQ. ID N.° 18), CDR L2 (SEQ. ID N.° 19) e CDR L3 (SEQ. ID N.° 20) . A Figure 3 providencia uma comparação lado a lado da remoção das proteínas da célula hospedeira pelo processo de cromatografia de troca de catiões do processo de rituximab melhorado comparado com o processo original. Foi conseguida uma remoção superior de CHOP com o novo processo.

Descrição detalhada da modalidade preferida Definições:

Aqui, intervalos numéricos ou quantidades prefaciadas pelo termo "cerca de" incluem expressamente o intervalo exato ou quantidade numérica exata. A "composição" a ser purificada aqui compreende o anticorpo de interesse e um ou mais contaminantes. A composição pode ser "parcialmente purificada" (isto é, tendo sido sujeita a uma ou mais etapas de purificação) ou pode ser obtida diretamente a a partir de uma célula hospedeira ou organism que produz o anticorpo (por exemplo, a composição pode compreender fluído da cultura de células colhidas).

Conforme utilizado aqui, "polipeptídeo" refere-se geralmente a péptidos e proteínas com mais de cerca de dez aminoácidos. Preferencialmente, o polipeptídeo é uma proteína de mamífero, exemplos dos quais incluem: renina; uma hormona de crescimento, incluindo hormona de crescimento humana e hormona de crescimento bovina; fator de libertação da hormona de crescimento; hormona paratiróide; hormona estimulante da tiróide; lipoproteínas; alfa-l-antitripsina; cadeia-A da insulina; cadeia-B da insulina; proinsulina; hormona estimulante do foliculo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; fatores de coagulação, tais como fator VIIIC, fator IX, fator de tecido e fator von Willebrands; fatores anticoagulantes, tais como Proteína C; fator natriurético atrial; tensoativo pulmonar; um ativador plasminogénio, tal como uroquinase ou urina humana ou ativador plasminogénio tipo tecido (t-PA); bombesina; trombina; fator de crescimento hemopoiético; fator-alfa e -beta de necrose tumoral; encefalinase; RANTES (regulado na ativação normalmente células T expressas e segregadas); proteína inflamatória de macrófago humano (MIP-1-alfa); uma albumina do soro, tal como albumina do soro humana; substância inibidora Mulleriana; cadeia-A da relaxina; cadeia-B da relaxina; prorelaxina; péptido associado à gonadotropina de ratinho; uma proteína microbiana, tal como beta-lactamase; ADNase; IgE; um antígeno associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); recetores para hormonas de fatores de crescimento; Proteína A ou D; fatores reumatóides; um fator neurotrófico, tal como fator neurotrófico derivado de osso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5 ou NT-6) ou um fator de crescimento do nervo, tal como NGF-β; fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF); fator de crescimento de fibroblasto, tal como aFGF e bFGF; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento transformador (TGF) tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-β, ΤΌΕ-β2, TGF-β3, ΤΌΕ-β4 ou ΤΌΕ-β5; fator de crescimento tipo insulina-] e -II (IGF-I e IGF-II): des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de ligação do fator de crescimento tipo insulina (IGFBPs); proteínas CD, tais como CD3, CD4, CD8, CD 19 e CD20; eritropoietina; fatores osteoindutores; imunotoxinas; uma proteína morfogenética do osso (BMP); um interferão, tal como interferão-alfa, -beta e - gama; fatores estimulantes de colónia (CSFs), por exemplo,, M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas (ILs), por exemplo,, IL-1 a IL-10; superóxido dismutase; recetores de células T; proteínas da membrana da superfície; fator acelerador da degradação; antígeno virai, tal como, por exemplo, uma porção do envelope da SIDA; proteínas de transporte; recetores de endereçamento; adressinas; proteínas reguladoras; integrinas, tais como CDlla, CDllb, CDllc, CD18, um ICAM, VLA-4 e VCAM; um antígeno associado a tumor, tal como recetor HER2, HER3 ou HER4; e fragmentos e/ou variantes de qualquer um dos polipeptídeos anteriormente listados, bem como anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpo, ligando a qualquer um dos polipeptídeos anteriormente listados. Um polipeptídeo preferido é um anticorpo intacto ou um fragmento de anticorpo que se liga à CD20 humana, por exemplo, rituximab; ou um anticorpo intacto ou um fragmento de anticorpo que se liga ao fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF), por exemplo bevacizumab.

Um "contaminante" é um material que é diferente do produto anticorpo desejado. 0 contaminante inclui, sem limitação: materiais da célula hospedeira, tais como

Proteínas do ovário de Hamster Chinês (CHOP); proteína A lixiviada; ácido nucleico; uma variante, fragmento, agregado ou derivado do anticorpo desejado; outro polipeptídeo; endotoxina; contaminante virai; componente dos meios de cultura celulares (por exemplo, garamicina; GENTAMYCIN®) etc. A frase "material de troca de catiões" refere-se a uma fase sólida que está carregada negativamente e tem catiões livres para troca com catiões numa solução aquosa passada pela ou através da fase sólida. A carga pode ser providenciada anexando um ou mais ligandos carregados à fase sólida, por exemplo, por ligação covalente. Em alternativa, ou além disso, a carga pode ser uma propriedade inerente da fase sólida (por exemplo, como no caso da sílica, que tem uma carga global negativa).

Materiais de troca de catiões comercialmente disponíveis incluem carboximetilcelulose, BAKERBOND ABX™, sulfopropilo (SP) imobilizado em agarose (por exemplo, SP-SEPHAROSE FAST FLOW™, SP-SEPHAROSE FAST FLOW XL™ ou SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™, da GE Healthcare) , CAPTO S™ (GE Healthcare), FRACT0GEL-S03™, FRACTOGEL-SE HICAP™ e FRACTOPREP™ (EMD Merck), sulfonilo imobilizado em agarose (por exemplo, S-SEPHAROSE FAST FLOW™ da GE Healthcare) e SUPER SP™ (Tosoh Biosciences). Urn material de troca de catiões preferido aqui compreende partículas de fluxo contínuo de poli(estireno-divinilbenzeno) reticuladas (fase sólida) revestidas com um polímero polihidroxilado funcionalizado com grupos sulfopropilo (por exemplo, resina de cromatografia POROS 50 HS®).

Por "fase sólida" entende-se uma matriz não aquosa à qual um ou mais ligandos carregados podem aderir. A fase sólida pode ser uma coluna de purificação (incluindo, sem limitação, colunas de leito expandido e de leito acumulado), uma fase descontínua de partículas discretas, uma membrana ou filtro etc. Exemplos de materiais para formar a fase sólida incluem polissacarídeos (tais como agarose e celulose) e outras matrizes mecanicamente estáveis, tais como silica (por exemplo, vidro de poro controlado), poli(estireno-divinilbenzeno), poliacrilamida, partículas de cerâmica e derivados de qualquer um dos anteriores. 0 termo "carga" aqui refere-se a uma composição carregada sobre o material de troca de catiões. Preferencialmente, o material de troca de catiões é equilibrado com um tampão de equilíbrio antes de carregar a composição que é para ser purificada.

Um "tampão" é uma solução que resiste a alterações no pH pela ação dos seus componentes conjugados ácido-base. Vários tampões que podem ser empregues dependendo, por exemplo, do pH desejado do tampão estão descritos em Buffers. A Guide for the Reparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., Ed. Calbiochem Corporation (1975).

Um "tampão de equilíbrio" é um tampão que é utilizado para equilibrar o material de troca de catiões, antes de carregar a composição compreendendo o anticorpo de interesse e um ou mais contaminantes sobre o material de troca de catiões. Preferencialmente o pH do tampão de equilíbrio aqui está no intervalo de cerca de 5,0 a cerca de 6,0, preferencialmente cerca de 5,5. Preferencialmente, a condutividade do tampão de equilíbrio aqui está no intervalo de cerca de 1 a cerca de 8mS/cm, preferencialmente de cerca de 4 a cerca de 8mS/cm e mais preferencialmente de cerca de 5 a cerca de 8mS/cm. Opcionalmente, o tampão de equilíbrio compreende um sal, tal como NaCl, por exemplo, numa quantidade de cerca de 40mM a cerca de 80mM, preferencialmente cerca de 60mM NaCl. 0 termo "tampão de lavagem" é utilizado aqui para se referir ao tampão que é passado sobre o material de troca de catiões seguido do carregamento de uma composição e antes da eluição da proteína de interesse. 0 tampão de lavagem pode server para remover um ou mais contaminantes do material de troca de catiões, sem eluição substancial do produto anticorpo desejado. De acordo com a modalidade preferida da invenção são utilizados aqui um "primeiro tampão de lavagem" e um "segundo tampão de lavagem".

Aqui, a expressão "primeiro tampão de lavagem" refere-se a um tampão de lavagem com um pH aumentado relativo ao pH da carga e/ou do tampão de equilíbrio. 0 primeiro tampão de lavagem pode ser utilizado aqui para eluir um ou mais contaminantes do material de troca de catiões, sem eluir substancialmente o produto anticorpo de interesse do mesmo. 0 termo "primeiro" não deveria ser interpretado como excluindo a utilização de um ou mais tampões de lavagem adicionais ou de outros tampões entre a carga e o primeiro tampão de lavagem. 0 pH do primeiro tampão de lavagem aqui está no intervalo de cerca de 6,8 a cerca de 9,0, preferencialmente de cerca de 7,0 a cerca de 8,0 e mais preferencialmente pH cerca de 7,0 or pH cerca de 7,8. Preferencialmente, a condutividade do primeiro tampão de lavagem aqui está no intervalo de cerca de 0,01 a cerca de 5mS/cm, preferencialmente de cerca de 0,1 a cerca de 3mS/cm e mais preferencialmente de cerca de 0,2 a cerca de 2mS/cm. Opcionalmente, o primeiro tampão de lavagem é substancialmente livre de um sal (tal como NaCl) nele. A expressão "segundo tampão de lavagem" para os fins deste pedido refere-se a um tampão de lavagem utilizado após o primeiro tampão de lavagem para preparar o material de troca de catiões para eluição do anticorpo de interesse. O termo "segundo" não deveria ser interpretado como excluindo a utilização de um ou mais tampões de lavagem adicionais ou outros tampões entre o primeiro tampão de lavagem e o segundo tampão de lavagem. 0 pH do segundo tampão de lavagem aqui está no intervalo de cerca de 5,0 a cerca de 6,0, preferencialmente cerca de 5,5 e mais preferencialmente pH 5,5. Preferencialmente, a condutividade do segundo tampão de lavagem aqui está no intervalo de cerca de 0,01 a cerca de 5 mS/cm, preferencialmente cerca de 0,1 a cerca de 3 mS/cm e mais preferencialmente de cerca de 0,5 a cerca de 3,0mS/cm. "Tampão de eluição" é utilizado para eluir o anticorpo de interesse da fase sólida. Aqui, o tampão de eluição tem uma condutividade substancialmente aumentada em relação à do segundo tampão de lavagem, de tal modo que o produto anticorpo desejado é eluído a partir do material de troca de catiões. A condutividade do tampão de eluição é substancialmente superior à da carga e de cada dos tampões anteriores, nomeadamente do tampão de equilíbrio, primeiro tampão de lavagem e segundo tampão de lavagem. Por condutividade "substancialmente superior" entende-se, por exemplo, que o tampão tem uma condut ividade que é pelo menos 2, 3, 4, 5 ou 6 unidades de condut ividade (mS/cm) superiores às de uma composição ou tampão ao qual está a ser comparado. Numa modalidade, o pH do tampão de eluição é substancialmente o mesmo que para o tampão de equilíbrio e/ou segundo tampão de lavagem. Preferencialmente, o pH do tampão de eluição aqui está no intervalo de cerca de 5,0 a cerca de 6,0, preferencialmente cerca de 5,5 e mais preferencialmente pH 5,5. Preferencialmente, a condutividade do tampão de eluição aqui está no intervalo de cerca de 10mS/cm a cerca de 100mS/cm, preferencialmente de cerca de 12mS/cm a cerca de 30mS/cm e mais preferencialmente de cerca de 12 a cerca de 20mS/cm. Uma condutividade aumentada pode ser conseguida pela adição de um sal, tal como cloreto de sódio, acetato de sódio, cloreto de potássio ao tampão de eluição. Preferencialmente, o tampão de eluição compreende cerca de 100 a cerca de 300mM NaCl, preferencialmente de cerca de 150mM a cerca de 200mM NaCl, por exemplo cerca de 175mM NaCl ou cerca de 160mM NaCl.

Um "tampão de regeneração" pode ser utilizado para regenerar o material de troca de catiões de modo que pode ser reutilizado. O tampão de regeneração tem uma condutividade e/ou pH conforme necessário para remover substancialmente todos os contaminantes e o anticorpo de interesse do material de troca de catiões. O termo "condutividade" refere-se à capacidade de uma solução aquosa de conduzir uma corrente elétrica entre dois elétrodos. Em solução, a corrente flui por transporte de iões. Portanto, com uma quantidade crescente de iões presente na solução aquosa, a solução terá uma condutividade superior. A unidade básica de medida para condutividade é o Siemen (ou mho) , mho (mS/cm) e pode ser medida utilizando um medidor de condutividade, tal como vários modelos de medidores de condutividade Orion. Uma vez que a condutividade eletrolítica é a capacidade de iões numa solução para transporter corrente elétrica, a condutividade de uma solução pode ser alterada alterando a concentração de iões nela. Por exemplo, a concentração de um agente tamponante e/ou a concentração de um sal (por exemplo, cloreto de sódio, acetato de sódio ou cloreto de potássio) na solução pode ser alterada para atingir a condutividade desejada. Preferencialmente, a concentração de sal dos vários tampões é modificada para atingir a condutividade desejada.

Por "purificar" um anticorpo de uma composição que compreende o anticorpo e um ou mais contaminantes entende-se aumentar o grau de pureza do anticorpo numa composição removendo (completamente ou parcialmente) pelo menos um contaminante da composição. Uma "etapa de purificação" pode ser parte de um processo de purificação global resultando numa composição "homogénea". "Homogénea" é utilizada aqui para se referir a uma composição que compreende pelo menos cerca de 70% por peso do anticorpo de interesse, com base no peso total da composição, preferencialmente pelo menos cerca de 80% por peso, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% por peso, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% por peso.

Por "ligar" uma molécula a um material de troca de catiões entede-se expor a molécula ao material de troca de catiões em condições apropriadas (pH e/ou condutividade) de tal modo que a molécula é reversivelmente imobilizada num ou sobre o material de troca de catiões em virtude das interações iónicas entre a molécula e um grupo carregado ou grupos carregados do material de troca de catiões

Por "lavar" o material de troca de catiões entende-se passer um tampão apropriado por ou sobre o material de troca de catiões.

Por "eluir" uma molécula (por exemplo, anticorpo ou contaminante) de um material de troca de catiões entende-se remover a molécula do mesmo.

Em modalidades preferidas da invenção, o anticorpo a ser purificado aqui é um anticorpo recombinante. Um "anticorpo recombinante" é um que foi produzido numa célula hospedeira que foi transformada ou transfetada com ácido nucleico que codifica o anticorpo ou produz o anticorpo como um resultado de recombinação homóloga. "Transformação" e "tranfeção" são utilizados alternadamente para referir ao processo de introduzir ácido nucleico numa célula. Após a transformação ou transfeção, o ácido nucleico pode integrar no genoma da célula hospedeira ou pode existir como um elemento extracromossómico. A "célula hospedeira" inclui uma célula no cultivo de células in vitro bem como uma célula dentro de um animal hospedeiro. Métodos para produção recombinante de polipeptideos são descritos na

Patente U.S. N.° 5 534 615, por exemplo.

Uma "variante" ou "variante da sequência de aminoácidos" de um polipeptídeo de partida é um polipeptideo que compreende uma sequência de aminoácidos diferentes da do polipeptideo de partida. Geralmente, uma variante possuirá pelo menos 80% de identidade de sequência, preferencialmente pelo menos 90% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência e mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade de sequência com o polipeptideo nativo. A percentagem de identidade de sequência é determinada, por exemplo, por Fitch et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:1382-1386 (1983), versão do algoritmo descrita por Needleman et al. , J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), após alinhar as sequências para providenciar homologia máxima. Variantes de sequência de aminoácidos de um polipeptideo podem ser preparadas introduzindo alterações nucleotidicas apropriadas no ADN que codifica o polipeptideo ou por síntese peptídica. Tais variantes incluem, por exemplo, deleções de, e/ou inserções em e/ou substituições de, resíduos dentro da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de interesse. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos também podem alterar o processamento pós-translacional do polipeptídeo, tal como alterando o número ou posição dos locais de glicosilação. Outrs modificações pós-translacionais incluem hidroxilação de prolina e lisina, foforilação de grupos hidroxilo de resíduos serilo, treonilo ou tirosilo, metilação dos grupos α-amino das cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and

Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86 (1983)) . Métodos para gerar variantes de sequências de aminoácidos dos polipeptídeos são descritos na Patente U.S. N.° 5 534 615, por exemplo. O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento inteiro), anticorpos policlonais, anticorpos multispecificos (por exemplo, anticorpos bispecificos) e fragmentos de anticorpo desde que exibam a especificidade de ligação desejada. 0 anticorpo aqui é dirigido contra um "antígeno" de interesse. Preferencialmente, o antígeno é um polipeptideo biologicamente importante e a administração do anticorpo a um mamífero que padece de uma doença ou distúrbio pode resultar num benefício terapêutico nesse mamífero. Contudo, anticorpos dirigidos contra antígenos não-polipeptídicos (tais como antígenos glicolipídicos associados a tumor; ver Patente U.S. N.° 5 091 178) também estão contemplados. Onde o antígeno é um polipeptideo, pode ser uma molécula transmembranar (por exemplo, recetor) ou ligando, tal como um fator de crescimento. Antígenos exemplars incluem aqueles polipeptídeos discutidos anteriormente. Alvos moleculares preferidos para anticorpos incluem polipept ídeos CD, tais como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 e CD34; membros da família do recetor HER, tais como o recetor EGF (HER1), HER2, HER3 ou recetor HER4; moléculas de adesão à célula, tais como LFA-1, Macl, pl50,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e integrina av/b3 incluindo as subunidades a ou b da mesma (por exemplo, anticorpos anti-CDlla, anti-CD18 ou anti-CDllb); fatores de crescimento, tais como VEGF; IgE; antígenos de grupo sanguíneo; recetor flk2/flt3; recetor da obesidade (OB); recetor mpl; CTLA-4; polipeptideo C etc. Antígenos solúveis ou fragmentos dos mesmos, opcionalmente conjugados com outras moléculas, podem ser utilizados como imunogenes para gerar anticorpos. Para as moléculas transmembranares, tais como recetores, fragmentos dos mesmos (por exemplo, o domínio extracelular de um recetor) podem ser utilizados como o imunogene. Em alternativa, as células que expressam a molécula transmembranar podem ser utilizados como o imunogene. Tais células podem ser derivadas de uma fonte natural (por exemplo, linhas celulares cancerígenas) ou podem ser células que foram transformadas por técnicas recombinantes para expressarem a molécula transmembranar.

Exemplos de anticorpos a serem purificados aqui incluem, mas não se limitam a: anticorpos HER2 incluindo trastuzumab (HERCEPTIN®) (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285-4289 (1992), Patente U.S. N.° 5 725 856) e pertuzumab (OMNITARG™) (W001/00245); anticorpos CD20 (ver abaixo); anticorpos IL-8 (St John et al., Chest, 103:932 (1993) e Publicação Internacional N.° WO 95/23865); anticorpos do recetor VEGF ou VEGF incluindo anticorpos VEGF maduros humanizados e/ou de afinidade, tais como o anticorpo VEGF humanizado huA4.6.1 bevacizumab (AVASTIN®) e ranibizumab (LUCENTIS®) (Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992), Publicação Internacional N.° WO 96/30046 e documento WO 98/45331, publicado a 15 de outubro de 1998); anticorpos PSCA (documento W001/40309); anticorpos CDlla incluindo efalizumab (RAPTIVA®) (Patente U.S. N.° 5 622 700, documento WO 98/23761, Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991) e Hourmant et al. , Transplantation 58:377-380 (1994) ); anticorpos que ligam IgE incluindo omalizumab (XOLAIR®) (Presta et al. , J. Immunol. 151:2 623-2 632 (1993) e Publicação Internacional N.° WO 95/19181; Patente U.S. N.° 5 714 338, emitida a 3 de fevereiro de 1998 ou Patente U.S. N.° 5 091 313, emitida a 25 de fevereiro de 1992, documento WO 93/04173 publicado a 4 de março de 1993 ou Publicação Internacional N.° WO99/01556 arquivada a 30 de junho de 1998, Patente U.S. N.° 5 714 338); anticorpos CD18 (Patente U.S. N.° 5 622 700, emitida a 22 de abril de 1997 ou como no documento WO 97/26912, publicado a 31 de julho de 1997); anticorpos do anticorpo do recetor Apo-2 (documento WO 98/51793 publicado a 19 de novembro de 1998); anticorpos do Fator de Tecido (TF) (Patente Europeia N.° 0 420 937 BI concedida a 9 de novembro de 1994); anticorpos de integrina oq-oq (documento WO 98/06248 publicado a 19 de fevereiro de 1998); anticorpos EGFR (por exemplo, anticorpo 225 quimerizado ou humanizado, cetuximab, ERBUTIX®as no documento WO 96/40210 publicado a 19 de dezembro de 1996); anticorpos CD3, tais como OKT3 (Patente U.S. N.° 4 515 893 emitida a 7 de maio de 1985); anticorpos CD25 ou Tac, tais como CHI-621 (SIMULECT®) e ZENAPAX® (Ver Patente U.S. N.° 5 693 762 emitida a 2 de dezembro de 1997); anticorpos CD4, tais como o anticorpo cM-7412 (Choy et al. Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)); anticorpos CD52, tais como CAMPATH-1H (ILEX/Berlex) (Riechmann et al. Nature 332:323-337 (1988)); anticorpos do recetor Fc, tais como o anticorpo M22 dirigido contra FcyRI, conforme em Graziano et al. J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995); anticorpos do antigeno carcinoembriónico (CEA), tais como hMN-14 (Sharkey et al. Cancer Res. 55 (23Suppl) : 5935s-5945s (1995)); anticorpos dirigidos contra células mamárias epiteliais incluindo huBrE-3, hu-Mc 3 e CHL6 (Ceriani et al. Cancer Res. 55(23) : 5852s-5856s (1995); e Richman et al. Cancer Res. 55(Suplemento 23): 5916s-5920s (1995)); anticorpos que se ligam a células do carcinoma do cólon, tais como C242 (Litton et al. Eur J. I mmunol. 26 ( 1): 1-9 (1996)); anticorpos CD38, por exemplo, AT 13/5 (Ellis et al. J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)); anticorpos CD33, tais como Hu M195 (Jurcic et al. Cancer Res 55(23 Suppl) :5908s-5910s (1995)) e CMA-676 ou CDP771; anticorpos EpCAM, tais como 17-1A (PANOREX®); anticorpos GpIIb/IIIa, tais como abciximab ou c7E3 Fab (REOPRO®) ; anticorpos RSV, tais como MED1-4 93 (SYNAGIS®); anticorpos CMV, tais como PROTOVIR®; anticorpos HIV, tais como PR0542; anticorpos da hepatite, tais como anticorpo da Hep B OSTAVIR®; anticorpo CA 125 OvaRex; epitopo GD3 idiotipico do anticorpo BEC2; anticorpo ανβ3 (por exemplo, VITAXIN®; Medimmune); anticorpo do carcinoma das células renais humanas, tal como ch-G250; ING-1; Um anticorpo 17-1 anti-humano (3622W94); anticorpo do tumor colorretal anti-human (A33); anticorpo R24 do melanoma anti-humano dirigido contra gangliosideo GD3; carcinoma das células escamosas anti-humano (SF-25); anticorpo do antigeno do leucócito humano (HLA), tal como Smart ID10 e o anticorpo anti-HLA DR Oncolym (Lym-1); anticorpo CD37, tal como TRU 016 (Trubion); anticorpo IL-21 (Zymogenetics/Novo Nordisk); anticorpo da célula anti-B (Impheron); alvo da célula B MAb (Immunogen/Aventis); 1D09C3 (Morphosys/GPC); LymphoRad 131 (HGS); anticorpo Lym-1, tal como Lym -1Y-90 (USC) ou anti-Lym-1 Oncolym (USC/Peregrine); LIF 226 (Enhanced Lifesci.); anticorpo BAFF (por exemplo, documento WO 03/33658); anticorpo do recetor BAFF (ver por exemplo, documento WO 02/24909); anticorpo BR3; anticorpo Blys, tal como belimumab; LYMPHOSTAT - B™; ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen) ; gomilixima (Idec 152; Biogen Idec) ; anticorpo do recetor IL-6, tal como atlizumab (ACTEMRA™; Chugai/Roche); anticorpo IL-15, tal como HuMax-Il-15 (Genmab/Amgen); anticorpo do recetor da quimiocina, tal como um anticorpo CCR2 (por exemplo, MLN1202; Millieneum) ; anticorpo anti-complemento, tal como anticorpo C5 (por exemplo, eculizumab, 5G1.1; Alexion); formulação oral de imunoglobulina humana (por exemplo, IgPO; Protein Therapeutics); anticorpo IL-12, tal como ABT-874 (CAT/Ab-bott); Teneliximab (BMS-224818; BMS) ; anticorpos CD40, incluindo S2C6 e variantes humanizadas do mesmo (documento WOOO/75348) e TNX 100 (Chiron/Tanox); anticorpos TNF-α incluindo cA2 ou infliximab (REMICADE®), CDP571, MAK-195, adalimumab (HUMIRA™), fragmento do anticorpo TNF-α peguilado, tal como CDP-870 (Celltech), D2E7 (Knoll), anticorpo policlonal anti-TNF-α (por exemplo, PassTNF; Verigen); anticorpos CD22, tais como LL2 ou epratuzumab (LYMPHOCIDE®; Immunomedics), incluindo epratuzumab Y-90 e epratzumab 1-131, anticorpo CD22 da

Abiogen (Abiogen, Itália), CMC 544 (Wyeth/Celltech), combotox (UT Soutwestern) , BL22 (NIH) e LympoScan Tc99 (Immunomedics). Preferencialmente, o anticorpo que é purificado aqui é um anticorpo nú, intacto que se liga à CD20 humana ou um anticorpo nú, intacto que se liga à VEGF humana. 0 antígeno "CD20" humano, ou "CD20," é uma fosfoproteína não glicosilada com cerca de 35-kDa, encontrada na superfície de mais de 90% das células B do sangue periférico ou orgãos linfóides. CD20 está presente e mambas células B normais, bem como em células B malignas, mas não é expresso em células estaminais. Outros nomes para CD20 na literatura incluem "antígeno restrito a linfócito B" e "Bp35". O antígeno CD20 é descrito em Clark et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82:1766 (1985), por exemplo.

Um "antagonista do anticorpo CD20" aqui é um anticorpo que, no momento da ligação a CD20 nas células B, destrói ou deplete células B num sujeito e/ou interfere com uma ou mais funções da célula B, por exemplo, reduzindo ou prevenindo uma resposta humoral despoletada pela célula B. O antagonista do anticorpo preferencialmente é capaz de depletar células B (isto é, reduz os níveis circulantes de células B) num sujeito tratado com ele. Tal depleção pode ser conseguida através de vários mecanismos tais como citotoxicidade mediada pela célula dependente de anticorpo (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC), inibição da proliferação de células B e/ou indução da morte das células B (por exemplo, por apoptose).

Conforme utilizado aqui, "depleção das células B" refere-se a uma redução nos níveis de células B num animal ou humano geralmente após tratamento com fármaco ou anticorpo, quando comparados com o nível antes do tratamento. A depleção das células B pode ser parcial ou completa. Os níveis de células B são mensuráveis utilizando técnicas bem conhecidas, tais como aquelas descritas em

Reff et al., Blood 83: 435-445 (1994) ou na Patente U.S. N.° 5 736 137 (Anderson et al. ) . A título de exemplo, um mamífero (por exemplo, um primata normal) pode ser tratado com várias dosagens do anticorpo ou imunoadesina e podem ser determinadas as concentrações das células B periféricas, por exemplo, por um método FACS que conta células B.

Exemplos de anticorpos CD20 incluem: "C2B8," que é agora designada "rituximab" ("RITUXAN®") (Patente U.S. N.° 5 736 137); o anticorpo murino 2B8 rotulado com ítrio-[90] designado "Y2B8" ou "Ibritumomab Tiuxetan" (ZEVALIN®) comercialmente disponível de IDEC Pharmaceuticals, Inc. (Patente U.S. N.° 5 736 137; 2B8 depositado na ATCC sob o acesso N.° HB11388 a 22 de junho de 1993); IgG2a murina "Bl," também designada "Tositumomab," opcionalmente rotulada com 131I para gerar o anticorpo "131I-B1" ou "iodo 1131 tositumomab" (BEXXAR™) comercialmente disponível de Corixa (ver, também, Patente U.S. N.° 5 595 721); anticorpo monoclonal murino "1F5" (Press et al. Blood 69(2):584-591 (1987) e variantes do mesmo incluindo 1F5 "remendo estrutura" ou humanizado (documento WO 2003/002607, Leung, S.; ATCC depósito HB-96450); anticorpo 2H7 murino e 2H7 quimérico (Patente U.S. N.° 5 677 180); 2H7 humanizado (documento WO 2004/056312, Lowman et al., e conforme apresentado abaixo); 2F2 (HuMax-CD20), um anticorpo totalmente humano de alta afinidade dirigido à molécula CD20 na membrana celular das células B (Genmab, Dinamarca; ver, por exemplo, Glennie e van de Winkel. Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) e Cragg et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); documento WO 2004/035607; documento US2004/0167319); os anticorpos monoclonais humanos apresentados no documento WO 2004/035607 e documento US2004/0167319 (Teeling et al.); os anticorpos com cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo complexas ligadas à região Fc descritas no documento US 2004/0093621 (Shitara et al.); anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação ao antigeno que se ligam a CD20 (documento WO 2005/000901, Tedder et al. ) , tais como HB20-3, HB20-4, HB20-25 e MB20-11; moléculas de ligação a CD20, tais como as séries AME de anticorpos, por exemplo, anticorpos AME 33 conforme apresentados no documento WO 2004/103404 e documento US2005/00257 64 (Watkins et al. , Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME); moléculas de ligação a CD20, tais como aquelas descritas no documento US 2005/0025764 (Watkins et al.); anticorpo A20 ou variantes do mesmo, tais como anticorpo A20 quimérico ou humanizado (cA20, hA20, respetivamente) ou IMMU-106 (documento US 2003/0219433, Immunomedics); anticorpos de ligação a CD20, incluindo Leu-16 depletado de epítopo, 1H4, ou 2B8, opcionalmente conjugados com IL-2, como nos documentos US 2005/0069545A1 e WO 2005/16969 (Carr et al. ); anticorpo bispecifico que se liga a CD22 e CD20, por exemplo, hLL2xhA20 (documento W02005/14618, Chang et al.); anticorpos monoclonais L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl ou NU-B2 disponíveis do Workshop Internacional de Classificação de Leucócitos (Valentine et al. , Em: Leukocyte Typing III (McMichael, Editor, página 440, Oxford University Press (1987)); 1H4 (Haisma et al. Blood 92:184 (1998)); conjugado auristatina E anti-CD20 (Seattle Genetics); anti-CD20-IL2 (EMD/Biovation/City of Hope); terapêutica com MAb anti-CD20 (EpiCyte); anticorpo anti-CD20 TRU 015 (Trubion). Os anticorpos CD20 preferidos aqui são anticorpos CD20 quiméricos, humanizados ou humanos, mais preferencialmente rituximab, 2H7 humanizado, 2F2 (Hu-Max-CD20) anticorpo CD20 humano (Genmab) e A20 humanizado ou anticorpo IMMUN-106 (Immunomedics).

Para os fins aqui, os termos "rituximab," "RITUXAN®," e "C2B8" aqui referem-se a um anticorpo quimérico recombinante que se liga ao antigeno CD20 humano conforme descrito na Patente U.S. N.° 5 736 137, Anderson et al. Tal anticorpo compreende preferencialmente uma cadeia pesada que compreende CDR Hl (SEQ. ID N.° 5), CDR H2 (SEQ. ID N.° 6), CDR H3 (SEQ. ID N.° 7) e um a cadeia leve, em que a cadeia leve preferencialmente compreende CDR LI (SEQ. ID N.° 8), CDR L2 (SEQ. ID N.° 9) e CDR L3 (SEQ. ID N.° 10); preferencialmente a cadeia pesada compreende uma região pesada variável (VH) que compreende a SEQ. ID N.° 3 e uma região leve variável (VL) que compreende a SEQ. ID N.° 4; e mais preferencialmente compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ. ID N.° 1 (com ou sem um resíduo de lisina no C-terminal) e uma cadeia leve, em que a cadeia leve preferencialmente compreende a SEQ. ID N.° 2. Os termos incluem expressamente formas variantes, tais como os descritos em Moorhouse et al. J. Pharm Biomed. Anal. 16:593-603 (1997) . O termo " VEGF humano", conforme utilizado aqui, refere-se ao aminoácido 165 do fator de crescimento das células endoteliais vasculares humanas e aminoácidos 121-, 189- e 206 relacionados dos fatores de crescimento das células endoteliais vasculares, conforme descrito por Leung et al., Science 246:1306 (1989) e Houck et al., Mol. Endocrin. 5:1806 (1991) juntamente com as formas processadas e alélicas que ocorrem naturalmente daqueles fatores de crescimento.

Anticorpos antagonistas anti-VEGF são capazes de inbiir uma ou mais das atividades biológicas do VEGF, por exemplo, a sua atividade mitogénica ou angiogénica. Antagonistas de VEGF atuam inteferindo com a ligação de VEGF a um recetor celular, incapacitando ou matando células que foram ativadas por VEGF, ou interferindo com a ativação das células endoteliais vasculares após a ligação de VEGF a um recetor celular. Todos estes pontos de intervenção por um antagonista de VEGF serão considerados equivalentes.

Para os fins aqui, os termos "bevacizumab," "AVASTIN®," "F(ab)-12," e "rhuMAb VEGF" aqui referem-se a um anticorpo monoclonal humanizado recombinante que liga antígeno do fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF) (rhuMAb VEGF), conforme descrito na Patente U.S. N.° 7 169 901, Presta et al. Tal anticorpo compreende preferencialmente uma cadeia pesada que compreende CDR Hl (SEQ. ID N.° 15), CDR H2 (SEQ. ID N.° 16), CDR H3 (SEQ. ID N.° 17) e uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende preferencialmente CDR LI (SEQ. ID N.° 18), CDR L2 (SEQ. ID N.° 19) e CDR L3 (SEQ. ID N.° 20); mais preferencialmente a cadeia pesada compreende uma região pesada variável (VH) que compreende a SEQ. ID N.° 13 e uma região leve variável (VL) que compreende a SEQ. ID N.° 14; e preferencialmente compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ. ID N.° 11 (com ou sem um resíduo de lisina no C-terminal) e uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende preferencialmente a SEQ. ID N.° 12. Os termos incluem expressamente formas variantes que se formam durante a produção do produto anticorpo recombinante. O termo "anticorpo monoclonal", conforme utilizado aqui, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, com a exceção de possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Além disso, em contraste com preparações de anticorpo (policlonal) convencionais que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogénea e não é para ser interpretado como requerendo produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método do hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975) ou podem ser feitos por métodos de ADN recombinante (ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 4 816 567) . Numa modalidade adicional, "anticorpos monoclonais" podem ser isolados a partir de bibliotecas de fago anticorpo geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respetivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (intervalo dos nM) por embaralhamento de cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), bem como infeção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construer bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al. , Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Assim, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas de hibridoma de anticorpo monoclonal tradicionais para isolamento de anticorpos monoclonais. Em alternativa, éagora possível produzir animais transgénicos (por exemplo, ratinhos) que são capazes, na imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de junção (JH) da cadeia pesada do anticorpo em ratinhos mutantes da linha germinativa e quiméricos resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferência da coleção de genes de imunoglobulina da linha germinativa humana em tais ratinhos mutantes da linha germinativa resultará na produção de anticorpos humanos no desfio antigénico. Ver, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al. , Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al. , Year in Immuno., 7:33 (1993); e Duchosal et al. Nature 355:258 (1992) .

Os anticorpos monoclonais aqui incluem especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica com ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, ao passo que o resto da(s) cadeia(s) é idêntico com ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo particular, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Patente U.S. N.° 4 816 567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984)). 0 termo "região hipervariável" quando utilizado aqui refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (isto é, resíduos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Rabat et al., Sequences of Polypeptides of Immunological Interest, 5a Edição, Serviço de Saúde Público, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resíduos de um "loop hipervariável" (isto é, resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 26- 32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Resíduos "estrutura" ou "FR" são aqueles resíduos do domínio variável sem serem os resíduos da região hipervariável conforme aqui definidos,

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm sequência minima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recetor) nos quais resíduos de uma região hipervariável do recetor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) , tal como ratinho, ratazana, Coelho ou primate não humano com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalgumas ocasiões, os resíduos da região estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recetor ou no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todo de pelo menos um, e tipicmente dois, domínios variáveis nos quais todos ou substancialmente todos os loops hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. A escolha dos domínios variáveis humanos, ambos leve e pesado, a serem utilizados no fabrico dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método de "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é classificado contra a biblioteca completa de sequências de domínio variável humano conhecidas. A sequência humana mais parecida com a de roedor é depois aceite como a estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al. , J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)).

Outro método utiliza uma estrutura particular derivada da sequência consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leve ou pesada. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151:2623 (1993)) . É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de elevada afinidade pelo antigeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados concetuais utilizando modelos tridimensionais das sequências parental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais estão normalmente disponíveis e são familiares daqueles habilitados na arte. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e apresentam as estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas exposições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de se ligar ao seu antigeno. Desta forma, os resíduos FR podem ser selecionados e combinados do recetor e importar sequências para que a característica do anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada pelo antigeno(s) alvo(s) seja conseguida. Em geral, os resíduos CDR estão diretamente e mais substancialmente envolvidos em influenciar a ligação ao antigeno. "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo de comprimento inteiro, geralmente a ligação ao antigeno ou região variável do msmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única e anticorpos multispecificos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo,, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) e Brennan et al. , Science, 229:81 (1985)). Contudo, estes fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir das bibliotecas de fago anticorpo discutidas anteriormente. Em alternativa, fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al. , Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Noutra modalidade, o F(ab')2 é formado utilizando o zíper leucina GCN4 para promover a montagem da molécula F(ab')2· De acordo com outra abordagem, os fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir do cultivo de células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão aparentes ao professional habilitado.

Noutras modalidads, o anticorpo de eleição é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Ver documento WO 93/16185. "Fv de cadeia única" ou fragmentos de anticorpo "sFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios estão presents numa única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, o polipeptídeo Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite o sFv de formar a estrutura desejada para a ligação ao antígeno. Para uma revisão de sFv ver Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, volume 113, Rosenburg e Moore editors. Springer-Verlag, Nova Iorque, páginas 269-315 (1994). 0 termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação ao antigeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH - VL). Ao utilizer um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação ao antigeno. Os diacorpos são descritos com mais detalhe, por exemplo, no documento EP 404,097; documento WO 93/11161; e Hollinger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993) . A expressão "anticorpos lineares" quando utilizados ao longo deste pedido refere-se aos anticorpos descritos em Zapata et ai. Polypeptide Eng. 8(10) :1057-1062 (1995) . Em suma, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em tandem (Vh-Ch1-Vh-Ch1 ) que formam um par de regiões de ligação ao antigeno. Os anticorpos lineares podem ser bispecíficos ou monospecíficos. "Anticorpos multispecíficos" têm especificidades de ligação por, pelo menos dois epítopos diferentes, onde os epítopos são normalmente de antígenos diferentes. Ao passo que tais moléculas normalmente só ligarão dois antígenos (isto é, anticorpos bispecíficos, BsAbs), anticorpos com especificidades adicionais, tais como anticorpos trispecíficos são abrangidos por esta expressão quando utilizados aqui. Exemplos de BsAbs incluem aqueles com um braço dirigido contra um antigeno da célula tumoral e o outro braço dirigido contra uma molécula gatilho citotóxica, tal como anti-FcYRI/anti-CD15, anti-pl85HER2/FcyRin (CD16), anti-CD3/célula B ant i-maligna (1D10), anti-CD3/anti-pl85HER2, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/carcinoma anti-célula renal, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-Dl (carcinoma anti-colon), anti-CD3/análogo da hormona estimulante anti-melanócitos, anti-recetor EGF /anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMAl, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, molécula de adesão a célula anti-nervosa (NCAM)/anti-CD3, proteína de ligação anti-folato (FBP)/anti—CD3, antígeno associado a carcinoma anti-pan (AMOC-31)/anti-CD3; BsAbs com um braço que se liga especificamente a um antígeno tumoral e um braço que se liga a uma toxina, tal como anti-saporina/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, anti-CEA/cadeia A da anti-ricina, anti-interferão-α(IFN-α)/idiotipo anti-hibridoma, anti-CEA/anti-vinca alcaloide; BsAbs para converter pró-fármacos ativados por enzima, tais como anti-CD30/anti-fosfatase alcalina (que catalisa a conversão do pró-fármaco fosfato de mitomicina em álcool mitomicínico); BsAbs que podem ser utilizados como agentes fibrinolíticos, tais como anti-fibrina/ativador plasminogénio anti-tecido (tPA), anti-fibrina/ ativador plasminogénio anti-tipo-uroquinase (uPA); BsAbs para dirigir complexos imunes para recetores da superfície celular, tais como lipoproteina anti-densidade baixa (LDL)/recetor anti-Fc (por exemplo, FcyRI ou FcyRIII); BsAbs para utilização na terapêutica de doenças infeciosas, tais como anti-CD3/anti-vírus herpes simplex (HSV), recetor anti-células T:complexo CD3/anti-influenza, anti-FcyR/anti-HIV; BsAbs para deteção de tumor in vitro ou in vivo, tal como anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-pl85HER2/anti-hapteno; BsAbs como adjuvantes de vacina; e BsAbs como ferramentas diagnósticas, tais como IgG anti-coelho/anti-ferritina, anti-peroxidase de raiz forte (HRP)/anti-hormona, anti-somatostatina/anti-substância P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/antί-β-galactosidase. Exemplos de anticorpos trispecíficos incluem anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 e anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Anticorpos bispecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento inteiro ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos bispecificos F(ab')2)·

Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos trispecificos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) .

Um "anticorpo nú", para os fins aqui, é um anticorpo que não é conjugado com uma fração citotóxica ou radio-rótulo.

Um "anticorpo intacto" aqui é um que compreende duas regiões de ligação ao antigeno e uma região Fc. Preferencialmente, o anticorpo intacto tem uma região Fc funcional. "Tratamento" refere-se a ambos tratamento terapêutico e profilático ou medidas preventativas. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles já com o distúrbio, bem como aqueles nos quais o distúrbio é para ser prevenido.

Um "distúrbio" é qualquer condição patológica que beneficiaria de tratamento com o anticorpo purificado, conforme descrito aqui. Isto inclui distúrbios e doenças ambos crónicas e agudas e aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. A palavra "rótulo", quando utilizada aqui, refere-se a um composto ou composição detetável que é conjugada diretamente ou indiretamente com o anticorpo. O rótulo pode ser ele próprio detetável (por exemplo, rótulos de radioisótopo ou rótulos fluorescentes) ou, no caso de um rótulo enzimático, podem catalisar alteração aquímica de um composto ou composição substrato que é detetável. O termo "agente citotóxico", conforme utilizado aqui, refere-se a uma substância que inibe ou previne a função das células e/ou causa destruição das células. Pretende-se que o termo inclua isótopos radioativos (por exemplo, At211, -1-131 t 125 τ90 „186 „188 0 153 „.212 „32 ^ ___ I , I , I , Re , Re , Sm , Bi , P e isotopos radioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos e toxinas, tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos das mesmas.

Modos de realizar a invenção A invenção providencia aqui métodos para purificar um anticorpo e uma composição (por exemplo, uma solução aquosa) compreendendo o anticorpo e um ou mais contaminantes. A composição é geralmente um resultante da produção recombinante do anticorpo, mas pode ser uma resultante da produção do anticorpo por síntese peptídica (ou outro meio de síntese) ou o anticorpo pode ser purificado a partir de uma fonte nativa do anticorpo.

Preferencialmente o anticorpo liga-se ao antígeno CD20 humano, tal como rituximab, ou liga-se ao antígeno VEGF humano, tal como bevacizumab.

Produção recombinante de anticorpos

Para a produção recombinante do anticorpo, o ácido nucleico que o codifica é isolado e inserido num vetor replicável para clonagem adicional (amplificação do ADN) ou para expressão. 0 ADN que codifica o anticorpo é prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas que são capazes de ligar-se especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo). Existem muitos vetores disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não se limitam a, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição (por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. N.° 5 534 615). Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ADN nos vetores aqui são as células procariontes, de levedura ou eucariontes superiores.

Procariontes adequados para este fim incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo,, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans e Shigella, bem como Bacilli tal como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P revelado no documento DD 266 710 publicado a 12 de abril de 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem preferido de E. coli é E. coli 294 (ATCC 31 446), apesar de outrs estirpes, tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 537) e E. coli W3110 (ATCC 27 325) serem adequadas. Estes exemplos são ilustrativos e não limitantes.

Além dos procariontes, micróbios eucariontes, tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou de expressão adequados para vetores que codificam anticorpo. Saccharomyces cerevisiae, ou a levedura vulgar de padaria, é o mais vulgarmente utilizado entre os microorganismos hospedeiros eucariontes inferiores. Contudo, um número de outros géneros, espécies e estirpes estão vulgarmente disponíveis e são úteis aqui, tal como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros Kluyveromyces, tais como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC 16 045), K. wickeramii (ATCC 24 178), K. waltii (ATCC 56 500), K. drosophilarum (ATCC 36 906), K. thermotolerans e K. marxianus; yarrowia (documento EP 402 226); Pichia pastoris (documento EP 183 070); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos tais como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e hospedeiros Aspergillus, tais como A. nidulans e A. niger. Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas estirpes e variantes baculovirais e células hospedeiras de insetos permissivas correspondents de hospedeiros, tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bomhyx mori. Uma variedade de estirpes virais para transfeção estão disponíveis publicamente, por exemplo, a variante L-l de NPV de Autographa californica e a estirpe Bm-5 de NPV de Bombyx mori e tais vírus podem ser utilizados aqui de acordo com a presente invenção, particularmente para transfeção de células de Spodoptera frugiperda. Também podem ser utilizadas como hospedeiros culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco.

Contudo, o interesse tem sido maior em células de vertebrados e a propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tornou-se num procedimento de rotina. Exemplos de linhas celulares de hospedeiro de mamífero úteis incluem, mas não se limitam a, células CV1 de rim de macaco transpformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); células do rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster Chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); células sertoli de ratinho (TM4,

Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células do carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de ratazana búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células do pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); células mamárias de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e células de hepatoma humano (Hep G2) . Com frequência, células CHO são preferidas para a expressão de anticorpos e podem ser utilizadas com vantagem para produzir os anticorpos purificados de acordo com a presente invenção. Células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou clonagem previamente descritos para produção de anticorpo e cultivadas em meios de nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas.

As células hospedeiras utilizadas para produzir anticorpo podem ser cultivadas numa variedade de meios. Meio comercialmente disponíveis, tais como FIO de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultivar as células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Patentes U.S. N.°s 4 767 704; 4 657 866; 4 927 762; 4 560 655; ou 5 122 469; documento WO 90/03430; documento WO 87/00195; ou patente U.S. Referência 30 985 podem ser utilizados como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormonas e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tal como adenosina e timidina), antibióticos (tais como garamicina; GENTAMYCIN®), elementos residuais (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais no intervalo dos micromolares) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidas daqueles habilitados na arte. As condições de cultivo, tais como temperatura, pH e afins são aquelas previamente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão aparentes do artesão vulgarmente habilitado.

Ao utilizar técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático, ou segregado diretamente para o meio. Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os resíduos particulados, sejam células hospedeiras ou células lisadas (por exemplo, resultantes da homogenização) são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultra-filtração. Onde o anticorpo é segregado para o meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão podem ser concentrados utilizando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultra-filtração Amicon ou Millipore Pellicon. O método de cromatografia de troca de catiões da invenção

Na modalidade preferida da invenção, a composição a ser sujeita ao método de purificação aqui é um anticorpo produzido de forma recombinante, preferencialmente um anticorpo intacto, expresso por uma cultura de células hospedeiras recombinantes de ovário de Hamster Chinês (CHO). Opcionalmente, a composição foi sujeita a pelo menos uma etapa de purificação antes da cromatografia de troca de catiões. A composição contém o anticorpo de interesse e um ou mais contaminantes, tais como Proteínas do ovário de Hamster Chinês (CHOP); proteína A lixiviada; ácido nucleico; uma variante, fragmento, agregado ou derivado do anticorpo desejado; outro polipeptídeo; endotoxina; contaminante virai; componente dos meios de cultura celulares (por exemplo, garamicina; GENTAMYCIN®), etc.

Exemplos de procedimentos de purificação adicionais que podem ser realizados antes de, durante ou depois do método de cromatografia de troca de catiões incluem fracionamento em cromatografia por interação hidrofóbica (por exemplo, em PHENYL-SEPHAROSE™) , precipitação por etanol, focagem isoelétrica, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em HEPARIN SEPHAROSE™, cromatografia de troca de aniões, ainda cromatograf ia de troca de catiões, troca de iões em modo misturado, cromatofocagem, SDS-PAGE, precipitação por sulfato de amónio, cromatografia por hidroxiapatite, eletroforese em gel, diálise, cromatografia por indução de carga hidrófica e cromatografia por afinidade (por exemplo, utilizando proteína A, proteína G, um anticorpo ou um substrato específico, ligando ou antígeno como o reagente de captura).

De acordo com a presente invenção, o esquema de purificação por troca de catiões inclui tipicamente as seguintes etapas realizadas sequencialmente: (1) equilíbrio do material de troca de catiões; (2) carregar a composição a ser purificada sobre o material de troca de catiões, (3) uma primeira etapa de lavagem; (4) uma segunda etapa de lavagem e (5) eluição do anticorpo de interesse.

Ao incluir pelo menos duas etapas de lavagem no esquema de purificação por troca de catiões, pelo menos a primeira das quais é conduzida a pH elevado (cerca de pH 6,8 ou superior), a eficácia da purificação pode ser melhorada significativamente. Em particular, realizar a primeira etapa de lavagem utilizando um tampão de lavagem com um pH no intervalo de cerca de 6,8 a cerca de 9,0 (por exemplo, de cerca de 7,0 a 8,0), tal como, por exemplo, cerca de pH 7,8 ou cerca de pH 7,0, os contaminantes, conforme descrito anteriormente, são removidos mais eficazmente do que utilizando o intervalo de pH mais baixo convencional de cerca de 5,0 a cerca de 5,5. Como resultado, o conteúdo proteico da célula hospedeira da composição que compreende o anticorpo eluído do material de troca de catiões é tipicamente inferior a cerca de 200 ppm, o que está abaixo do nível de aproximadamente 500 ppm atingido utilizando uma etapa de lavagem a um pH de cerca de 5 a 5,5.

Na modalidade preferida da invenção, o material de troca de catiões compreende partículas de fluxo contínuo de poli(estireno-divinilbenzeno) reticuladas (fase sólida) revestidas com um polímero polihidroxilado funcionalizado com grupos sulfopropilo, por exemplo, uma coluna POROS 50 HS® disponível de Applied Biosystems.

Normalmente, um tampão de equilíbrio é passado sobre ou através do material de troca de catiões antes de carregar a composição que compreende o anticorpo de interesse e um ou mais contaminantes no material. Na modalidade preferida da invenção, o tampão de equilíbrio tem um pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,0, por exemplo cerca de pH 5,5. Um tampão de equilíbrio exemplar compreende 19mM MES, 60mM NaCl, pH 5,50. Outro tampão de equilíbrio exemplar compreende 23mM MES, 60mM NaCl, pH 5,50.

Após o equilíbrio, uma solução aquosa que compreende o anticorpo de interesse e um ou mais contaminantes é carregada no material de troca de catiões. O pH da carga está no intervalo de cerca de 4,0 a cerca de 6,0, por exemplo cerca de pH 5,0 ou cerca de pH 5,5. Numa modalidade preferida, é carregado um pool de produto condicionado de uma etapa de purificação anterior. Numa modalidade, é carregado um pool de Proteína A de uma purificação por cromatografia com Proteína A anterior, pH 5,0 no material de troca de catiões. Noutra modalidade, é carregado um pool de Q-SEPHAROSE® condicionado, pH 5,5 para o material de troca de catiões. Densidades de carga exemplares estão no intervalo de cerca de 10 a cerca de 100 g/L resina, preferencialmente de cerca de 10 a cerca de 60g/L resina, mais preferencialmente de cerca de 15 a cerca de 45 g/L resina. O anticorpo de interesse é ligado ao material de troca de catiões como resultado desta etapa de carga.

Após a carga, o material de troca de catiões é lavado numa primeira etapa de lavagem com um primeiro tampão de lavagem. Durante o processo de lavagem, o tampão de lavagem é passado sobre o material de troca de catiões. A composição do tampão de lavagem é tipicamente escolhida para eluir tantos contaminantes quanto possível da resins sem eluir uma quantidade substancial do anticorpo de interesse. 0 pH do primeiro tampão de lavagem é geralmente superior ao do tampão de equilíbrio e/ou da composição carregada, por exemplo cerca de 2 a cerca de 3 unidades de pH superior. Preferencialmente o pH do primeiro tampão de lavagem está no intervalo de cerca de pH 6,8 a cerca de

9.0, preferencialmente de cerca de pH 6,8 a cerca de 8,0, por exemplo cerca de pH 7,8 ou cerca de pH 7,0. Exemplos de tampões cujo tampão está neste intervalo de pH incluem, mas não se limitam a, HEPES, MES, acetato de sódio, TRIS/HC1, cloridrato de trietanolamina/NaOH, Bicina/HCl, Tricina/HCl etc. O primeiro tampão de lavagem preferido compreende ou consiste de: (1) 25mM HEPES, pH 7,8 ou (2) 25mM MOPS, pH 7.0. A este respeito, a presente revelação providencia uma composição que compreende um anticorpo CD20 quimérico recombinante, tal como rituximab, em 25mM HEPES, pH 7,8. A revelação também providencia um anticorpo VEGF humanizado recombinante, tal como bevacizumab, em 25mM MOPS, pH 7,0. Tais composições são úteis, entre outras coisas, como composições intermediárias utilizadas na purificação destes produtos.

A invenção aqui geralmente envolve pelo menos uma etapa de lavagem adicional, ou uma segunda, utilizando um segundo tampão de lavagem. O pH do segundo tampão de lavagem é preferencialmente inferior ao do primeiro tampão de lavagem, por exemplo de cerca de 2 a cerca de 3 unidades de pH inferiores. Portanto, por exemplo, o pH do segundo tampão de lavagem pode estar no intervalo de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,0. Preferencialmente, o pH do segundo tampão de lavagem é cerca de 5,5. Exemplos de tampões cujo tampão está neste intervalo de pH incluem, mas não se limitam a, MES, ácido acético/acetato de sódio ou NaOH, NaH2P03/Na2HP04, Bis. Tris/HCl. MES, pH 5,5 é o tampão preferido para a segunda lavagem. Numa modalidade, o segundo tampão de lavagem compreende ou consiste de: 19mM MES, lOmM NaCl, pH 5,50. Noutra modalidade, o segundo tampão de lavagem compreende ou consiste de 23mM MES, lOmM NaCl, pH 5,50.

Apesar de poderem ser empregues etapas de lavagem adicionais, preferencialmente apenas são realizadas uma primeira e segunda etapas de lavagem, antes de eluir o anticorpo desejado. Os contaminantes, tais como aqueles discutidos anteriormente, são removidos do material de troca de catiões durante a primeira e/ou segunda etapa de lavagem. Preferencialmente, a primeira etapa de lavagem remove a maioria dos contaminantes.

Após a(s) etapa(s) de lavagem indicada(s) anteriormente, o anticorpo desejado é eluido do material de troca de catiões. A eluição do anticorpo pode ser conseguida aumentando a condutividade ou força iónica. De forma desejável, a condutividade do tampão de eluição é superior a cerca de 10mS/cm. Pode ser conseguida condutividade aumentada incluindo uma concentração de sal relativamente elevada no tampão de eluição. Sais exemplares para este fim incluem, sem limitação, acetato de sódio, cloreto de sódio (NaCl) e cloreto de potássio (KC1). Numa modalidade, o tampão de eluição compreende de cerca de 100 a cerca de 300mM NaCl. O tampão de eluição geralmente terá aproximadamente o mesmo pH que o segundo tampão de lavagem. Um tampão de eluição preferido compreende: 19mM MES, 160mM NaCl, pH 5,5. Outro tampão de eluição preferido compreende: 23mM MES, 175mM NaCl, pH 5,5. A eluição envolve preferencialmente eluição por etapas (ao contrário da eluição por gradiente).

Ao passo que a etapa de eluição é opcionalmente seguida de uma etapa de regeneração, tal não é necessário de acordo com a modalidade preferida da invenção.

Embora sejam contempladas etapas adicionais, preferencialmente o método de purificação por troca de catiões aqui consiste apenas nas seguintes etapas: equilíbrio (por exemplo, utilizando tampão de equilíbrio pH cerca de 5,5), carregar uma composição que compreende anticorpo e contaminante (s) (por exemplo, onde o pH da composição carregada é cerca de 5,0 ou cerca de 5,5), primeira etapa de lavagem para eluir contaminantes (por exemplo, utilizando o primeiro tampão de lavagem pH cerca de 7,8 ou primeiro tampão de lavagem pH cerca de 7,0), segunda etapa de lavagem (por exemplo, utilizando o segundo tampão de lavagem pH cerca de 5,5) e eluição (por exemplo, utilizando tampão de eluição pH cerca de 5,5 e condutividade aumentada em relação a cada uma das etapas anteriores para eluir anticorpo). A preparação do anticorpo obtido de acordo com o método de cromatografia de troca de catiões aqui pode estar sujeita a etapas de purificação adicionais, se necessário. Etapas de purificação adicionais exemplars foram discutidas anteriormente.

Opcionalmente, o anticoro é conjugado com uma ou mais moléculas heterólogas conforme desejado. A molécula heteróloga pode, por exemplo, ser uma que aumenta a meia-vida do anticorpo no soro (por exemplo, polietilenoglicol, PEG) , ou pode ser um rótulo (por exemplo, uma enzima, rótulo fluorescente e/ou radionuclídeo) ou uma molécula citotóxica (por exemplo, uma toxina, fármaco quimioterapêutico ou isótopo radioativo etc).

Uma formulação terapêutica que compreende o anticorpo, opcionalmente conjugado com uma molécula heteróloga, pode ser preparada misturando o anticorpo com o grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Pharmaceutical Sciences de Remington, 16a edição, Osol, A. Editores (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizadores "farmaceuticamente aceitáveis" são não tóxicos para os recetores nas dosagens e concentrações empregues e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como octadecildimetilbenzilo cloreto de amónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquilo parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeo de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatin ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginine ou lisina; monossacarideos, dissacarideos e outros carbohidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-iões formadores de sal, tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iónicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG) .

Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em microcápsula preparados, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsula de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsula de poli-(metil-metacilato), respetivamente, em sistemas de entrega de fármaco coloidais (por exemplo, lipossomas, microsferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Pharmaceutical Sciences de Remington, 16a edição, Osol, A. Editor (1980). A formulação a ser utilizada para administrção in vivo tem de ser estéril. Isto é rapidamente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis.

Preparações de libertação prolongada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de libertação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo a variante do anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsula. Exemplos de matrizes de de libertação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou poli(vinilálcool)), polilactidas (Patente U.S. N.° 3 773 919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, etileno-vinil acetato não degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis, tais como o LUPRON DEPOT™ (microsferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. O anticorpo purificado conforme revelado aqui ou uma composição que compreende o anticorpo e um veículo farmaceuticamente aceitável é depois utilizada para várias utilizações diagnósticas, terapêuticas ou outras conhecidas para tais anticorpos e composições. Por exemplo, o anticorpo pode ser utilizado para tratar um distúrbio num mamífero administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ao mamífero. No caso de um anticorpo CD20, tal como rituximab, pode ser utilizado para depletar células B, tratar linfoma (por exemplo, linfoma de não Hodgkin, NHL) ou leucemia (por exemplo, leukemia linfocítica crónica, CLL), bem como doenças autoimunes, tais como artrite reumatóide (RA), esclerose múltiplas (MS), lúpus etc. Para um anticorpo que se liga a VEGF, tal como bevacizumab, pode ser utilizado para inibir a angiogénese, tratar cancro e tratar degeneração macular, etc.

Os exemplos seguintes são oferecidos a título de ilustração e não a título de limitação. EXEMPLO 1: PURIFICAÇÃO DE UM ANTICORPO CD20

Este exemplo descreve um processo melhorado de cromatografia de troca de catiões para purificar um anticorpo CD20, rituximab. Rituximab é utilizado para terapêutica de NHL, CLL, RA, MS, etc. A estrutura da molécula Rituximab é revelada no documento 5 736 137,

Anderson et al., bem como nas Figuras 1A-1B aqui. Rituximab está comercialmente disponível de Genentech, Inc.

Cromatografia de troca de catiões é utilizada para reduzir ainda mais os níveis de CHOP, ADN, proteína A lixiviada, garamicina (GENTAMYCIN®), agregados de Rituximab e vírus potenciais. Rituximab liga-se à coluna nas condições de carregamento. A coluna é depois lavada, eluída, regenerada/desinfetada e armazenada até à utilização seguinte. Podem ser utilizados ciclos múltiplos para processor um lote inteiro de pool de afinidade. 0 pool de troca de catiões pode ser mantido à temperatura ambiente até 30°C até 3 dias ou a 5°C até 7 dias. A resina de troca de catiões (POROS 50 HS®, Applied Biosystems) é embalada numa coluna numa altura de leito de 17-33 cm. Antes do pool de afinidade ser carregado, a coluna de troca de catiões é purgada da solução de armazenamento com tampão de equilíbrio. Após o equilíbrio, o pool de afinidade é carregado para a coluna. O produto liga-se à coluna nestas condições. A coluna é depois lavada com tampão de lavagem 1, seguido do tampão de lavagem 2. Rituximab é eluido da coluna utilizando um tampão de eluição com força iónica elevada.

Uma comparação das condições para o processo da presente invenção comparado com o processo original (controlo) é providenciada no quadro seguinte.

Os intervalos desejados de pH, condutividade e molaridade para a carga e tampões no processo rituximab são providenciados no quadro seguinte.

0 processo exemplificado para purificação com Rituximab potenciou a robustez da remoção de proteínas da célula hospedeira permitindo uma remoção superior das proteínas da célula hospedeira nas fases de lavagem, resultando em níveis inferiores de proteínas da célula hospedeira no pool produto (pool de eluição) e facilitando a remoção das impurezas na etapa a jusante subsequente. A Figura 3 ilustra as vantagens do presente processo em termos da remoção de proteínas da célula hospedeira.

EXEMPLO 2: PURIFICAÇÃO DE UM ANTICORPO VEGF

Este exemplo descreve um proceso de cromatografia de troca de catiões para purificar um anticorpo de fator de crescimento endotelial vascular humanizado recombinante (rhuMAb VEGF), bevacizumab. A estrutura da molécula bevacizumab é revelada na Patente U.S. N.° 7 169 901, Presta et al., . Ver também as Figuras 2A-2B aqui. Bevacizumab está comercialmente disponível de Genentech, Inc.

Este exemplo sumariza os estudos de desenvolvimento realizados na etapa de troca de catiões para um processo de purificação de bevacizumab melhorado. Três resinas de troca de catiões foram avaliadas nestes estudos: CM SEPHAROSE FAST FLOW®, SP SEPHAROSE FAST FLOW® e POROS 50HS®. Os processos de purificação de troca de catiões que utilizam estas três resinas foram avaliados em relação a: desempenho do processo (remoção de impurezas, remoção de retrovirus e rendimento da etapa), qualidade do produto, robustez do processo e ajuste do processo em todos os locais de fabrico atuais. Com base nos dados gerados nestes estudos, a POROS 50HS® mostrou um desempenho e robustez do processo superior e foi selecionada como a resina de troca de catiões para o processo de purificação melhorado.

Cromatografia de troca de catiões é a etapa de cromatografia final no processo de purificação. Serve para removerr componentes dos meios de cultura celulares (garamicina), impurezas derivadas da célula hospedeira (CHOP e ADN) e formas agregadas de bevacizumab. Também funciona como uma etapa de remoção virai. A coluna é operada num modo ligar-e-eluir e é realizada à temperatura ambiente. A coluna utiliza uma resina de troca de catiões (POROS 50HS®). A resina consiste num suporte de leito de poliestireno-divinilbenzeno poroso acoplado a um grupo functional carregado negativamente. A coluna é removida do armazenamento lavando com tampão de equilíbrio. 0 pool filtrado virai será diluído com 0,3 volumes de água para injeção (WFI) para cumprir um limite de condutividade de d 5,5 mS/cm. O pool filtrado virai é depois carregado para a coluna equilibrada. O produto liga-se à resina. Depois do carregamento, a coluna é lavada com um tampão com pH elevado para descarregar o material carregado através da coluna e remover as impurezas CHOP. A coluna é depois lavada com um tampão com baixo sal para baixar o pH e preparer a coluna para eluição. O produto é eluido utilizando uma etapa de eluição de tampão com sal elevado com um máximo de 7 volumes de coluna. Depois da eluição, a coluna e deslize são desinfetados com solução de desinfeção (0,5 N NaOH) antes do armazenamento em solução de armazenamento (0,1 N NaOH) até à utilização seguinte. O quadro seguinte providencia uma descrição das condições para o processo bevacizumab da invenção aqui.

Os intervalos desejados de pH, condutividade e molaridade para a carga e tampões no processo bevacizumab são providenciados no quadro seguinte.

Verificou-se que o presente processo é superior ao processo bevacizumab original que utilizou um primeiro tampão de lavagem pH 5,5. 0 novo processo aqui foi capaz de conseguir pools com níveis de CHOP mais baixos, atingiu um rendimento da etapa superior e foi globalmente um processo mais robusto de correr no fabrico.

Lista de sequências <110> GENENTECH, INC. Lebreton, Benedicte Andree O'Connor, Deborah Ann Safta, Aurelia Sharma, Mandakini

<120> PURIFICAÇÃO DE ANTICORPO POR CROMATOGRAFIA DE TROCA

DE CATIÕES

<130> P2280R1 WO <150> US 60/983.825 <151> 30-10-2007 <160> 20 <210> 1 <211> 432

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 Ο 0> 1

Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly Arg Gly Leu 35 40 45

Glu Trp lie Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 65 70 75

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp SO 85 90

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp 95 100 105

Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 110 115 120

Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 125 130 135

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 140 145 150

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 155 160 165

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 170 175 180

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser 185 190 195

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Vai Asn His Lys Pro 200 205 210

Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp 215 220 225

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Asp Gly Val Glu Val His 260 265 270

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 275 280 285

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 290 295 300

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 305 310 315

Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 320 325 330

Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 335 340 345

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 350 355 360

Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 365 370 375

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 380 385 390

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 395 400 405

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 410 415 420

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 425 430

<210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4Ο0> 2

Gin He Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala lie Leu Ser Ala Ser Pro 15 10 15

Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30

Tyr lie His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro 35 40 45

Trp He Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser 65 70 75

Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 80 85 90

Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie 95 100 105

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser 110 115 120

Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 125 130 135

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp 140 145 150

Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin 155 160 165

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 170 175 180

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 185 190 195

Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 200 205 210

Gly Glu Cys

<210> 3 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4Ο0> 3

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr phe Thr 20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly Arg Gly Leu 35 40 45

Glu Trp He Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 65 70 75

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp 95 100 105

Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 110 115 120

Ala

<210> 4 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <400> 4

Gin He Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala lie Leu Ser Ala Ser Pro 15 10 15

Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30

Tyr He His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro 35 40 45

Trp He Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He Ser 65 70 75

Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 80 85 90

Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie 95 100 105

Lys

<210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <400> 5

Ser Tyr Asn Met His 5

<210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4Ο0> 6

Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Gly

<210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <400> 7

Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val 5 10

<210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <400> 8

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr lie His 5 10

<210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4Ο0> 9

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 5

<210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 Ο 0> 10

Gin Gin Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 5

<210> 11 <211> 453 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 0 0> 11

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Vai Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60

Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser 95 100 105

Ser His Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 110 115 120

Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala 125 ' 130 135

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 140 145 150

Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn 155 160 165

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu 170 175 180

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro 185 190 195

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His 200 205 210

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser 215 220 225

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu leu 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255

Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 300

Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 320 325 330

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr He Ser Lys Ala 335 340 345

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 350 355 360

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 365 370 375

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 380 385 390

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 395 400 405

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 410 415 420

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 425 430 435

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 440 445 450

Pro Gly Lys

<210> 12 <211> 214 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 Ο 0> 12

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Ser Ala Ser Gin Asp He Ser 20 25 30

Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Val Leu He Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90

Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

He Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 110 115 120

Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 125 130 135

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val 140 145 150

Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu 155 160 165

Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 170 175 180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 185 190 195

Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 200 205 210

Arg Gly Glu Cys

<210> 13 <211> 123 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 Ο 0> 13

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Vai Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60

Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser 95 100 105

Ser His Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 110 115 120

Vai Ser Ser

<210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 Ο 0> 14

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Ser Ala Ser Gin Asp lie Ser 20 25 30

Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Val Leu lie Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Tie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90

Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 lie Lys Arg

<210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 0 0> 15

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn 5 10

<210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 Ο 0> 16

Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 15 10 15

Lys Arg

<210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 0 0> 17

Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 5 10

<210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 0 0> 18

Ser Ala Ser Gin Asp lie Ser Asn Tyr Leu Asn 5 10

<210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 Ο 0> 19

Phe Ihr Ser Ser Leu His Ser 5

<210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4Ο0> 20

Gin Gin Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr 5

Listado de Secuencias <110> GENENTECH, INC. Lebreton, Benedicte Andree O'Connor, Deborah Ann Safta, Aurelia Sharma, Mandakini

<120> PURIFICAÇÃO DE ANTICORPO POR CROMATOGRAFIA DE TROCA DE CATIÕES

<130> P2280R1 WO <15Ο> US 60/983.825 <151> 30-10-2007 <160> 20

<210> 1 <211> 432 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 0 0> 1

Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu lieu Val Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly Arg Gly Leu 35 40 45

Glu Trp lie Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr lieu Thr Ala Asp Lys Ser 65 70 75

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp 95 100 105

Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 110 115 120

Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 125 130 135

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 140 145 150

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 155 160 165

Ala lieu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val lieu Gin Ser 170 175 180

Ser Gly lieu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser 185 190 195

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Vai Asn His Lys Pro 200 205 210

Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp 215 220 225

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe lieu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr lieu 245 250 255

Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Asp Gly Val Glu Val His 260 265 270

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 275 280 285

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 290 295 300

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala lieu Pro Ala 305 310 315

Pro lie Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 320 325 330

Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 335 340 345

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 350 355 360

Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 365 370 375

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val lieu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 380 385 390

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 395 400 405

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 410 415 420

Tyr Thr Gin Lys Ser lieu Ser lieu Ser Pro Gly Lys 425 430

<210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4Ο0> 2

Gin lie Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala lie Leu Ser Ala Ser Pro 15 10 15

Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30

Tyr lie His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro 35 40 45

Trp lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser 65 70 75

Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 80 85 90

Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie 95 100 105

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser 110 115 120

Asp Glu Gin l>eu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys lieu lieu 125 130 135

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp 140 145 150

Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin 155 160 165

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser lieu Ser Ser Thr lieu Thr Leu 170 175 180

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 185 190 195

Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 200 205 210

Gly Glu Cys

<210> 3 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4Ο0> 3

Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly Arg Gly Leu 35 40 45

Glu Trp lie Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 65 70 75

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp 95 100 105

Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 110 115 120

Ala

<210> 4 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4Ο0> 4

Gin lie Val lieu Ser Gin Ser Pro Ala lie lieu Ser Ala Ser Pro 15 10 15

Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30

Tyr lie His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro 35 40 45

Trp lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser 65 70 75

Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 80 85 90

Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie 95 100 105

Lys

<210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <400> 5

Ser Tyr Asn Met His 5

<210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4Ο0> 6

Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Gly

<210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <400> 7

Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val 5 10

<210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <400> 8

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr lie His 5 10 <210> 9

<211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4Ο0> 9

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 5

<210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 Ο 0> 10

Gin Gin Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 5

<210> 11 <211> 453 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 0 0> 11

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Vai Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60

Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser 95 100 105

Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 110 115 120

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 125 130 135

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 140 145 150

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 155 160 165

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 170 175 180

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 185 190 195

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 200 205 210

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 215 220 225

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu val Lys Phe A$n Trp Tyr val 275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 300

Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val leu 305 310 315

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 320 325 330

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 335 340 345

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 350 355 360

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 365 370 375

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 380 385 390

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 395 400 405

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 410 415 420

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 425 430 435

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 440 445 450

Pro Gly Lys

<210> 12 <211> 214 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 0 0> 12

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser lieu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Ser Ala Ser Gin Asp lie Ser 20 25 30

Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Val lieu He Tyr Phe Thr Ser Ser lieu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr lieu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90

Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

He Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro 110 115 120

Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 125 130 135

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val 140 145 150

Asp Asn Ala lieu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu 155 160 165

Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser lieu Ser Ser Thr lieu Thr 170 175 180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 185 190 195

Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 200 205 210

Arg Gly Glu Cys

<210> 13 <211> 123 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 Ο 0> 13

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Vai Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60

Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser 95 100 105

Ser His Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 110 115 120

Vai Ser Ser

<210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 0 0> 14

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser lieu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Ser Ala Ser Gin Asp lie Ser 20 25 30

Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Val lieu He Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr lieu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90

Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

He Lys Arg

<210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 0 0> 15

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn 5 10

<210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 Ο 0> 16

Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 15 10 15

Lys Arg

<210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 0 0> 17

Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 5 10

<210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 0 0> 18

Ser Ala Ser Gin Asp lie Ser Asn Tyr Leu Asn 5 10

<210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4 Ο 0> 19

Phe Thr Ser Ser Leu His Ser 5

<210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> a sequência está sintetizada <4Ο0> 20

Gin Gin Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr 5

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 6339142 B [0006] [0007] • US 6417355 B [0006] • US 6489447 B [0006] [0007] • US 7074404 B, Basey [0006] • US 6127526 A [0006] [0007] • US 6333398 B [0006] • US 6797814 B, Blank, G. [0006] • US 20040082047 A [0006] • US 5110913 A [0007] • US 20040082047 AI [0007] • EP 333574 A [0007] • EP 460426 BI [0007] • EP 556083 A [0007] • WO 8905157 A [0007] • WO 9222653 A [0007] • WO 9306217 A [0007] • WO 9522389 A [0007] • WO 9633208 A [0007] • WO 9640883 A [0007] • US 4753894 A [0007] • US 4966851 A [0007] • US 5112951 A [0007] • US 5115101 A [0007] • US 5118796 A [0007] • US 5169774 A [0007] • US 5196323 A [0007] • US 5256769 A [0007] • US 5279823 A [0007] • US 5429746 A [0007] • US 5451662 A [0007] • US 5525338 A [0007] • US 5677171 A [0007] • US 6005081 A [0007] • US 6054561 A [0007] • US 6267958 B [0007] • US 6417335 B [0007] • US 5534615 A [0033] [0034] [0066] • US 5091178 A [0036] • US 5725856 A [0037] • WO 0100245 A [0037] • WO 9523865 A [0037] • WO 9630046 A [0037] • WO 9845331 A [0037] • WO 0140309 A [0037] • US 5622700 A [0037] • WO 9823761 A [0037] • WO 9519181 A [0037] • US 5714338 A [0037] • US 5091313 A [0037] • WO 9304173 A [0037] • WO 9901556 A [0037] • WO 9726912 A [0037] • WO 9851793 A [0037] • EP 0420937 B1 [0037] • WO 9806248 A [0037] • WO 9640210 A [0037] • US 4515893 A [0037] • US 5693762 A [0037] • WO 0333658 A [0037] • WO 0224909 A [0037] • WO 0075348 A [0037] • US 5736137 A, Anderson [0040] [0041] [0042] • US 5595721 A [0041] • WO 2003002607 A [0041] • US 5677180 A [0041] • WO 2004056312 A [0041] • WO 2004035607 A [0041] • US 20040167319 A [0041] • US 20040093621 A, Shitara [0041] • WO 2005000901 A, Tedder [0041] • WO 2004103404 A [0041] • US 20050025764 A [0041] • US 20030219433 A [0041] • US 20050069545 A1 [0041] • WO 200516969 A, Carr [0041] • WO 200514618 A, Chang [0041] • US 7169901 B, Presta [0045] [0102] • US 4816567 A [0046] [0047] • WO 9316185 A [0054] • EP 404097 A [0055] • WO 9311161 A [0055] • DD 266710 [0067] • EP 402226 A [0068] • EP 183070 A [0068] • EP 244234 A [0068] • US 4767704 A [0072] • US 4657866 A [0072] • US 4927762 A [0072] • US 4560655 A [0072] • US 5122469 A [0072] • WO 9003430 A [0072] • WO 8700195 A [0072] • US RE3 0 9 85 E [0072] • US 3773919 A [0093] • US 60983825 B [0109] [0110]

Documentos de não patente citados na descrição • ZHANG et al. Q Membrane Chromatography Application for Human Antibody Purification Process. BioProduction, 26 October 2004 [0007] • BARNTHOUSE et al. J. Biotech., 1998, vol. 66, 125-136 [0007] • BLANK et al. Bioseparation, 2001, vol. 10, 65-71 [0007] • FOLLMAN ; FAHRNER. J. Chromatog., 2004, vol. 1024, 79-85 [0007] • IYER et al. BioPharm, 2002, vol. 15 (1), 14-16, 18, , 20, , 53 [0007] • ADACHI et al. Journal of Chromatography. A., 28

February 1997, vol. 763 (1-2), 57-63 [0007] • GAGNON, P. Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Tucson. Validated Biosystems, Inc, 1996, 57-86 [0007] • GRAF et al. Bioseparation, February 1994, vol. 4 (1), 7-20 [0007] • MHATRE et al. Journal of Chromatography A, 21 July 1995, vol. 707 (2), 225-231 [0007] • NEIDHARDT et al. Journal of Chromatography, 1992, vol. 590 (2), 255-261 [0007] • HARRIS ; ANGAL. Protein Purification Applications - A Practical Approach. IRL Press, 151-156 [0007]

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Lisboa, 18 de Março de 2015

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método para purificar um anticorpo de uma composição que compreende o anticorpo e pelo menos um contaminante, cujo método compreende as etapas sequenciais de: (a) carregar a composição sobre um material de troca de catiões em que a composição tem como pH inicial de 4,0 a 6,0; (b) lavar o material de troca de catiões com um primeiro tampão de lavagem, em que o pH do primeiro tampão de lavagem é de 6,8 a 9,0; (c) lavar o material de troca de catiões com um segundo tampão de lavagem a um pH de 5,0 a 6,0; e (d) eluir o anticorpo do material de troca de catiões com um tampão de eluição a uma condut ividade que é pelo menos 2mS/cm superior à do segundo tampão de lavagem.
2. 2. O método da reivindicação 1 em que o pH do segundo tampão de lavagem e o pH do tampão de eluição são aproximadamente os mesmos.
3. 3. O método da reivindicação 1 em que o anticorpo se liga à CD20 humana.
4. 4. O método da reivindicação 1 em que o anticorpo se liga ao fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF).
5. 5. O método da reivindicação 1 em que o pH da composição em (a) é de 4,0 a 6,0, o pH do primeiro tampão de lavagem é de 6,8 a 8,0, o pH do segundo tampão de lavagem é de 5,0 a 6,0 e o pH do tampão de eluição é de 5,0 a 6,0.
6. 6. 0 método da reivindicação 1 em que a condutividade do tampão de eluição é de 10mS/cm a 100mS/cm.
7. 7. O método da reivindicação 1 em que o tampão de eluição compreende 100 a 300mM NaCl.
8. 8. O método da reivindicação 1 em que o material de troca de catiões compreende partículas de fluxo contínuo de poli(estireno-divinilbenzeno) reticuladas revestidas com um polímero polihidroxilado funcionalizado com grupos sulfopropilo.
9. 9. O método da reivindicação 1 em que o contaminante é selecionado do grupo que consiste em Proteínas do ovário de Hamster Chinês (CHOP), proteína A lixiviada, ADN, anticorpo agregado, componente dos meios de cultura celulares, garamicina e contaminante virai.
10. 10. Um método para purificar um anticorpo que se liga à CD20 humana de uma composição que compreende o anticorpo e um ou mais contaminantes seleccionados do grupo que consiste em proteínas do ovário de Hamster Chinês (CHOP), proteína A lixiviada, ADN e anticorpo CD20 agregado, cujo método compreende as etapas sequenciais de: (a) carregar a composição sobre um material de troca de catiões em que a composição tem um pH de 4,0 a 6,0; (b) lavar o material de troca de catiões com um primeiro tampão de lavagem a um pH de 6,8 a 9,0; (c) lavar o material de troca de catiões com um segundo tampão de lavagem a um pH de 5,0 a 6,0; e (d) eluir o anticorpo do material de troca de catiões utilizando um tampão de eluição com um pH de 5,0 a 6,0 e uma condutividade de 10mS/cm a 100mS/cm.
11. 11. 0 método da reivindicação 10 em que o anticorpo é rituximab.
12. 12. O método da reivindicação 10 em que o tampão de eluição compreende 100 a 300mM NaCl.
13. 13. Um método para purificar um anticorpo que se liga ao fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF) de uma composição que compreende o anticorpo e um ou mais contaminantes selecionados do grupo que consiste em componente dos meios de cultura celulares, garamicina, proteínas do ovário de Hamster Chinês (CHOP), ADN, contaminante virai e anticorpo VEGF agregado, cujo método compreende as etapas sequenciais de: (a) carregar a composição sobre um material de troca de catiões em que a composição tem um pH de 4,0 a 6,0; (b) lavar o material de troca de catiões com um primeiro tampão de lavagem a um pH de 6,8 a 8,0; (c) lavar o material de troca de catiões com um segundo tampão de lavagem a um pH de 5,0 a 6,0; e (d) eluir o anticorpo do material de troca de catiões utilizando um tampão de eluição com um pH de 5,0 a 6,0 e uma condutividade de 10mS/cm a 100mS/cm.
14. 14. O método da reivindicação 13 em que o anticorpo é bevaci zumab.
15. 15. O método da reivindicação 13 em que o tampão de eluição compreende 100 a 300mM NaCl. Lisboa, 18 de Março de 2015