WO2018045587A1 - 一种抗vegf类单克隆抗体的纯化方法 - Google Patents

一种抗vegf类单克隆抗体的纯化方法 Download PDF

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WO2018045587A1
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杨辉
马旭通
杨彬
林小鹊
李文佳
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广东东阳光药业有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators

Definitions

  • the invention relates to protein purification, in particular to a method for purifying an anti-VEGF monoclonal antibody.
  • Bevacizumab (trade name Avastin) is a recombinant humanized monoclonal antibody. Approved by the FDA on February 26, 2004, it was the first US drug to suppress tumor angiogenesis. The IgG1 antibody was confirmed to bind to human vascular endothelial growth factor (VEGF) and block its biological activity by an in vivo and in vitro detection system. Bevacizumab is produced by fermentation culture of Chinese Hamster Ovary (CHO) expression system. Once the monoclonal antibody clarified fermentation broth is obtained, a combination of different chromatographic techniques is usually used to try to target the protein of interest. The other proteins produced by the cells are separated.
  • CHO Chinese Hamster Ovary
  • the conventional purification process obtains a monoclonal antibody by three-step chromatography, such as Chinese patent CN95192680.2, and the purification sequence disclosed by the antibody purification is followed by Protein A affinity chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography.
  • Protein A column is the first choice for affinity chromatography due to its high selectivity and strong impurity removal ability, but its high price and low pH elution easily lead to the formation of high molecular polymer and the drop of Protein A ligand.
  • More research has begun to focus on solving existing problems with non-ProteinA processes.
  • the low recovery rate of the three-step process, the high economic cost, and the high salt used in hydrophobic chromatography have the risk of loss of protein activity. People began to focus on the use of more efficient two-step chromatography to purify monoclonal antibodies.
  • European patent EP1651665 uses MEP to capture and purify non-antibody proteins and antibody-like fragments. It uses two steps of elution. 35% propylene glycol is added to the first step elution, and 50% propylene glycol is added to the second step. The recovery rate is 85%, but it is not optimized for monoclonal antibodies. After application to monoclonal antibodies, the purity and yield are low.
  • the object of the present invention is to provide a purification method for an anti-VEGF monoclonal antibody capable of simultaneously effectively removing a plurality of contaminants in view of the above-mentioned drawbacks of the prior art.
  • the method can simultaneously reduce the content of host protein (HCP), DNA, multimer and acid peak, thereby achieving the purpose of significantly improving the purity of the antibody, and the operation is simple and the cost is low.
  • HCP host protein
  • the technical scheme of the present invention provides a method for purifying an anti-VEGF monoclonal antibody, comprising the following steps:
  • the present invention first captures with composite chromatography, separating the antibody from most of the components in the harvest, and then purifying it with hydroxyapatite chromatography to further remove host cell contaminants and aggregates.
  • the technical scheme of the present invention provides a method for purifying an anti-VEGF monoclonal antibody, comprising the following steps:
  • step 4) The sample obtained by step 4) elution adjusts the conductivity to 1.4-2.0 mS/cm, and is loaded on the hydroxyapatite chromatography material;
  • the anti-VEGF monoclonal antibody composition has a pH of 6.5-7.0;
  • the composite chromatography material is a composite medium of ion exchange and hydrophobic interaction, preferably a MEP composite produced by PALL Corporation. filler.
  • the anti-VEGF monoclonal antibody composition is a Chinese hamster ovary cell (CHO) fermentation expression.
  • the pH of the second wash buffer is between 5.5 and 5.8; in some preferred embodiments, the pH of the second wash buffer is 5.8.
  • the first wash buffer and/or the second wash buffer is 50 mM PBS.
  • the elution buffer pH of step 4) is 4.4 to 4.6; in some preferred embodiments, the elution buffer pH of step 4) is 4.6.
  • the volume of ethanol in the elution buffer of step 4) is from 1.0% to 1.5%.
  • the purpose of adding ethanol to the elution buffer is to change the polarity of the solution and improve the elution resolution.
  • an additive having polar properties such as polyethylene glycol can achieve the effect. Both are equivalent alternatives.
  • the elution buffer described in step 4) is a 50 mM acetic acid-sodium acetate buffer and contains 150 mM sodium chloride, preferably having an electrical conductivity of 17 to 19 mS/cm.
  • the elution buffer of step 4) further comprises sodium phenylbutyrate and urea; in some preferred embodiments, the sodium phenylbutyrate and urea content are 5-7 mM and 0.05, respectively. ⁇ 0.15 M, preferably, the content of sodium phenylbutyrate is 5 mM, 6 mM, 6.9 mM, 7 mM; the urea content is 0.05 M, 0.1 M, 0.15 M.
  • the goal is to change the buffer environment of the solution and increase the elution resolution.
  • the third washing buffer and/or the elution buffer in step 7) is 10 mM PBS, pH. Is 7.5.
  • the elution buffer of step 7) contains sodium chloride, and the content of sodium chloride is 0.2 to 0.4M. Preferably the sodium chloride content is 0.25M.
  • step 1) further comprises separating the cells and the fermentation broth prior to execution.
  • the separation is selected from centrifugation and filtration.
  • compositions to be purified herein comprises an antibody of interest and one or more contaminants.
  • the composition may be “partially purified” (ie, one or more purification steps have been performed) or may be obtained directly from a host cell or organism from which the antibody is produced (eg, the composition may comprise harvested cell culture) liquid).
  • Contaminants refers to a substance that is different from the desired antibody product. Contaminants include, but are not limited to, host cell material, such as host cell protein (HCP), DNA; variants, fragments, aggregates or derivatives of the desired antibody; cell culture medium components.
  • host cell material such as host cell protein (HCP)
  • HCP host cell protein
  • DNA DNA
  • variants, fragments, aggregates or derivatives of the desired antibody cell culture medium components.
  • wash buffer is used herein to refer to a buffer that flows through a composite chromatography material after loading the composition and before eluting the protein of interest.
  • the wash buffer can be used to remove one or more contaminants from the composite chromatography material without substantially eluting the desired antibody product.
  • first wash buffer "second wash buffer” and "third wash buffer” are used.
  • elution buffer is used to elute an antibody of interest from a solid phase.
  • an eluent that elutes an antibody of interest from a composite chromatography material 50 mM acetic acid-sodium acetate buffer, has a lower pH relative to the second wash buffer, and elutes from the hydroxyapatite chromatography material.
  • Eluent elution buffer of antibody of interest 10 mM PBS, preferably, the elution buffer contains a concentration of sodium chloride such that the desired antibody product elutes from the solid phase filler.
  • PBS buffer is a phosphate buffer saline which is generally used as a solvent to act as a dissolution protection reagent. It is the most widely used buffer in biochemical research. Its main components are Na 2 HPO 4 , KH 2 PO4, NaCl and KCl. Due to the secondary dissociation of Na 2 HPO 4 and KH 2 PO 4 , buffered The pH range is very wide.
  • multimer (D/A) is understood to mean a molecule in which a non-covalent association of the same antibody is combined by two or more antibodies.
  • the antibody may be composed of a homogeneous or heterologous plurality of polypeptides covalently bound (e.g., disulfide) to a single chain antibody.
  • the multimer of the present invention is soluble in an aqueous solution.
  • a dimer is a non-specific binding of two IgG molecules.
  • the formation of multimers is closely related to factors affecting the folding of natural antibodies and the deformation of antibody structures. For example, high salt and extreme pH induce antibody denaturation to form multimers.
  • the definition "or” used in the present invention means an alternative, and if appropriate, they may be combined, that is, the term “or” includes each of the individual alternatives listed and combinations thereof.
  • FIG. 1 is a view showing the detection of a multimer according to a first embodiment of the present invention.
  • Fig. 2 is a diagram showing the charge heterogeneity detection of Example 1 of the present invention.
  • Example 3 is a non-reducing purity detecting diagram of Example 1 of the present invention.
  • a denaturant such as urea
  • the inventors also found in the study that the acid peak is greatly affected by the acetylase.
  • the enzyme in the fermentation broth catalyzes the formation of an acid peak by adding deacetylase (HDAC) enzyme inhibition in the elution buffer.
  • HDAC deacetylase
  • Sodium phenylbutyrate can significantly reduce the ratio of acid peaks, and achieve the effect of removing acid peaks, thereby indirectly achieving the effect of improving purity.
  • 5-7 mM sodium phenylbutyrate is added to the elution buffer, neither It affects the activity of anti-VEGF antibody and improves the purity.
  • the present invention selects a composite filler having both ion exchange and hydrophobic interaction for chromatography, and the method does not need to dilute the sample before loading, and the medium for the anti-VEGF monoclonal antibody and the composite filler
  • the dynamic load is much higher than other antibodies.
  • the invention discloses a method for removing impurities during the purification process of VEGF monoclonal antibodies.
  • the main mass attributes of the samples obtained by the two-step chromatography in series purification were basically the same as those of the reference preparations.
  • the first stage of the capture phase uses ion exchange and hydrophobic composite chromatography media, using low pH buffer to remove contaminants, and then using a lower pH elution buffer to elute the antibody of interest; the second step of the purification phase using hydroxyapatite
  • the stone medium uses high pH buffer to remove contaminants. After purification, the main mass properties of the sample reach the requirements of the reference preparation.
  • the purified preparation of the antibody is carried out by using a monoclonal antibody secreted by the modified CHO cell, which is a genetically engineered CHO cell, capable of stably and efficiently expressing anti-VEGF (in the embodiment of the present invention, bevacizumin is used.
  • Anti-monoclonal antibody using a mechanical agitated bioreactor to culture CHO cells in large-scale high-density suspension, first remove the cell debris and tangibles by multiple centrifugation, then further reduce the turbidity by filtration, and then cascade in two steps. To purify.
  • the first stage of the capture phase uses ion exchange and hydrophobic composite chromatography media, using low pH buffer to remove contaminants, and then using a lower pH elution buffer to elute the antibody of interest; the second step of the purification phase using hydroxyapatite Stone medium, using high pH buffer to remove contaminants.
  • the supernatant of the CHO cells was centrifuged twice with 10,000 g of the eppendorf centrifuge to remove the cells and cell debris, and the 0.2 ⁇ m filter was passed to further reduce the turbidity of the sample and adjust the pH to 7.0, which is the composition to be loaded with the monoclonal antibody.
  • CGE Capillary gel electrophoresis
  • Thermo molecular sieve analysis column (5 ⁇ m) was equilibrated with mobile phase A (50 mM PBS + 5% acetonitrile) using an automated Agilent HPLC system. Detection wavelength: 280 nm, flow rate: 0.5 mL/min, elution gradient: 100% A phase, detection time: 35 minutes, and the sample was filtered through a 0.2 ⁇ m water-based filter membrane and loaded with 40 ⁇ g. The chromatogram is shown in Figure 1, and the test results are shown in Table 7.
  • Cygnus's HCP detection kit Immunoenzymetric Assay for the Measurement of Chinese Hamster Ovary Host Cell Proteins, F015, Cygnus Technologies
  • kit instructions the specific steps are as follows:
  • Micro sample genomic DNA extraction kit (Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd.) experimental steps:
  • Reagent name Add volume PCR MIXer 10 ⁇ L Pre-primer (Shanghai Shenggong Synthetic) 0.6 ⁇ L Post-primer (Shanghai Biosynthetics) 0.6 ⁇ L water 3.8 ⁇ L DNA template (extracted DNA) 5 ⁇ L Single tube reaction volume 20 ⁇ L
  • the column was a weak cation exchange column (ProPac WCX-10, 4 mm ⁇ 250 mm); the phase A (10 mM phosphate), phase B (10 mM phosphate, 0.5 M sodium chloride) was used as the mobile phase, and the detection wavelength was 280 nm.
  • the sample was diluted to 2 mg/mL with ultrapure water as a sample solution. Take 50 ul into the liquid chromatograph and measure according to the procedure. The measurement results are shown in Fig. 2.
  • the peak at 10.2 min is the main peak of charge heterogeneity, and the previous peaks are all acidic peaks.
  • the product after purification by chromatography-MEP was determined to have an acid peak content of 22.761%; the product after purification by chromatography MPC was determined to have an acid peak content of 20.234%, which met the requirements of the reference preparation.
  • the supernatant of the CHO cells was centrifuged twice by 10,000 g using an eppendorf centrifuge to remove cells and cell debris, and the membrane was passed through a 0.2 ⁇ m filter to further reduce the turbidity of the sample and adjust the pH to 6.5, which is the composition to be loaded with the monoclonal antibody.
  • the supernatant of the CHO cells was centrifuged twice by 10,000 g using an eppendorf centrifuge to remove cells and cell debris, and the membrane was passed through a 0.2 ⁇ m filter to further reduce the turbidity of the sample and adjust the pH to 6.8, which is the composition to be loaded with the monoclonal antibody.

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Abstract

一种抗VEGF类单克隆抗体的纯化方法，包括首先用复合材料层析进行捕获，使抗体与收获液中的大多数组分分离，继而用羟基磷灰石层析进行精细纯化，进一步去除宿主细胞污染物和聚集体等，所述的复合层析材料为离子交换作用和疏水作用的复合介质。该方法同时降低宿主蛋白(HCP)、DNA、多聚体、酸性峰的含量，从而达到显著提高抗体纯度的目的，且操作简单，成本较低。

Description

一种抗VEGF类单克隆抗体的纯化方法 技术领域
本发明涉及蛋白质纯化，具体涉及一种抗VEGF类单克隆抗体的纯化方法。
背景技术
贝伐珠单抗(Bevacizumab，商品名Avastin)是重组的人源化单克隆抗体。2004年2月26日获得FDA的批准，是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药。通过体内、体外检测系统证实IgG1抗体能与人血管内皮生长因子(VEGF)结合并阻断其生物活性。贝伐珠单抗是通过中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)表达系统发酵培养生产的，一旦获得感兴趣的单抗澄清发酵液，通常使用不同层析技术的组合来试图将目的蛋白与细胞生成的其它蛋白质分开。
传统的纯化工艺通过三步层析得到单克隆抗体，如中国专利CN95192680.2，抗体纯化公开的纯化顺序依次为Protein A亲和层析，离子交换层析以及疏水层析。Protein A柱由于选择性高和去杂质能力强，是亲和层析的首选，但其价格昂贵、洗脱的低pH易导致高分子聚合物形成、Protein A配基掉落等缺点，使越来越多的研究开始关注用非ProteinA工艺来解决现有问题。另外，三步工艺的回收率低、经济成本高以及疏水层析所用到高盐有使蛋白失出活性的风险，人们开始关注使用更高效率的两步层析来纯化单克隆抗体。
贝伐珠单抗原研单位基因泰克公司申请的专利CN200880119331.X，通过阳离子交换层析进行的抗体纯化，阳离子层析作为第一步层析，最大的瓶颈在于样品的调节，需要调节样品的pH值与电导率，调节样品一方面增大了样品的体积导致储液罐和上样时间都要增大，另一方面调节过程中往往会产生沉淀从而造成样品的损失，因为样品中含有大量的宿主蛋白(host cell protein，HCP)，pH调节过程中经过HCP的等电点从而造成了沉淀。同时阳离子的载量往往低于亲和层析，导致成本的增加。
欧州专利EP1651665采用了MEP捕获纯化非抗体蛋白以及类似于抗体的片段，它用了二步洗脱，第一步洗脱中加入了35％丙二醇，第二步洗脱中加入了50％丙二醇，回收率85％，但其未对单克隆抗体进行优化，应用于单克隆抗体后，纯度和收率都较低。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷，提出一种能够同时有效去除多种污染物的抗VEGF类单抗的纯化方法。该方法能够同时降低宿主蛋白(HCP)、DNA、多聚体、酸性峰的含量，从而达到显著提高抗体纯度的目的，且操作简单，成本较低。
本发明的技术方案提供了一种抗VEGF类单克隆抗体的纯化方法，包括以下步骤：
1)运用复合材料层析对收获液中的抗体进行捕获，所述复合材料为同时具备离子交换作用和疏水作 用的复合介质；
2)运用羟基磷灰石层析进行精细纯化。
本发明首先用复合材料层析进行捕获，使抗体与收获液中的大多数组分分离，继而用羟基磷灰石层析进行精细纯化，进一步去除宿主细胞污染物和聚集体等。
具体地，本发明的技术方案提供了一种抗VEGF类单克隆抗体的纯化方法，包括以下步骤：
第一步层析-捕获：
1)将抗VEGF类单抗组合物加载到复合层析材料上；
2)用pH为7.0～7.4的第一清洗缓冲液清洗所述复合层析材料；
3)用pH低于第一清洗缓冲液的第二清洗缓冲液清洗所述复合层析材料；
4)用pH低于第二清洗缓冲液、含有乙醇的洗脱缓冲液洗脱；
第二步层析-精细纯化：
5)将步聚4)洗脱得到的样品调节电导率至1.4～2.0mS/cm，加载于羟基磷灰石层析材料上；
6)用pH为7.0～7.5的第三清洗缓冲液清洗所述羟基磷灰石材料；
7)用pH为7.5～8.0、含NaCl的洗脱缓冲液洗脱。
根据本发明一些具体实施例，所述抗VEGF类单抗组合物pH为6.5～7.0；所述的复合层析材料为离子交换作用和疏水作用的复合介质，优选地为PALL公司生产的MEP复合填料。
根据本发明一些具体实施例，所述的抗VEGF类单抗组合物是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)发酵表达。
根据本发明一些具体实施例，步骤3)中，第二清洗缓冲液的pH为5.5～5.8；在其中一些优选的实施方式中，第二清洗缓冲液的pH为5.8。
在一些优选的实施方式中，所述第一清洗缓冲液和/或第二清洗缓冲液为50mM PBS。
根据本发明一些具体实施例，步骤4)所述的洗脱缓冲液pH为4.4～4.6；在其中一些优选的实施方式中，步骤4)所述的洗脱缓冲液pH为4.6。
根据本发明一些具体实施例，步骤4)所述的洗脱缓冲液中乙醇的体积含量为1.0％～1.5％。在本发明的技术方案中，洗脱缓冲液中加入乙醇的目的是改变溶液的极性，提高洗脱分辨率，理论上，能达到该效果的具有极性性质的添加剂，例如聚乙二醇都属于等同的替代方案。
在一些优选的实施方式中，步骤4)中所述的洗脱缓冲液为50mM醋酸-醋酸钠缓冲液并含有150mM氯化钠，优选地，电导率为17～19mS/cm。
根据本发明一些具体实施例，步骤4)所述的洗脱缓冲液中还含有苯丁酸钠及尿素；在一些优选的实施方式中，苯丁酸钠及尿素含量分别为5～7mM和0.05～0.15M，优选地，苯丁酸钠的含量为5mM、6mM、6.9mM、7mM；尿素含量为0.05M、0.1M、0.15M。目的是改变溶液的缓冲液环境，提高洗脱分辨率。
在一些优选的实施方式中，所述第三清洗缓冲液和/或步骤7)中所述洗脱缓冲液为10mM PBS，pH 为7.5。
根据本发明一些具体实施例，步骤7)所述的洗脱缓冲液有含氯化纳，氯化钠的含量为0.2～0.4M。优选地氯化钠的含量为0.25M。
根据本发明一些具体实施例，步骤1)执行前还包括分离细胞和发酵液。所述的分离选自离心和过滤。
术语定义
本文中要纯化的“组合物”包含感兴趣的抗体和一种或多种污染物。所述组合物可以是“部分纯化的”(即已经进行过一个或多个纯化步骤)或者可以是自生成抗体的宿主细胞或生物体直接获得的(例如所述组合物可以包含收获的细胞培养液)。
术语“污染物”指与期望的抗体产物不同的物质。污染物包括但不限于：宿主细胞物质，诸如宿主细胞蛋白(HCP)、DNA；期望抗体的变体、片段、聚集物或衍生物；细胞培养基成分。
术语“清洗缓冲液”在本文中用于指在加载组合物之后且在洗脱感兴趣蛋白质之前流过复合层析材料的缓冲液。清洗缓冲液可用于自复合层析材料清除一种或多种污染物，基本上不洗脱期望抗体产物。依照本文中发明的优选实施方案，使用“第一清洗缓冲液”、“第二清洗缓冲液”和“第三清洗缓冲液”。
术语“洗脱缓冲液”用于自固相洗脱感兴趣抗体。在本文中，包括自复合层析材料洗脱感兴趣抗体的洗脱液50mM醋酸-醋酸钠缓冲液，具有相对于第二清洗缓冲液更低pH，及自羟基磷灰石层析材料洗脱感兴趣抗体的洗脱液洗脱缓冲液10mM PBS，优选地，洗脱缓冲液中含有一定浓度的氯化钠，使得期望抗体产物自固相填料中洗脱。
术语“PBS缓冲液”是磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广。
术语“多聚体”(D/A)可以理解为相同抗体的非共价结合，由两个以上的抗体结合而成的分子。所述抗体可以由单链抗体共价结合(例如二硫键)的均质或异质多条多肽构成。本发明的多聚体可溶于水溶液。例如，二聚体是两个IgG分子的非特异性结合。多聚体的形成与对天然抗体折叠和抗体结构的变形影响因素紧密相关。例如，高盐与极端pH诱导抗体变性形成多聚体。
本发明使用的定义“或”表示备选方案，如果合适的话，可以将它们组合，也就是说，术语“或”包括每个所列出的单独备选方案以及它们的组合。例如，“污染物选自宿主细胞蛋白、多聚体或细胞培养基”表示在一些实施方式中，污染物可以是宿主细胞蛋白、多聚体、细胞培养基之中的一种，也可以是其一种以上的组合。
附图说明
图1是本发明实施例1的多聚体检测图。
图2是本发明实施例1的电荷异质性检测图。
图3是本发明实施例1的非还原性纯度检测图
具体实施方式
发明人在研究中发现，在单抗复性过程中添加低浓度变性剂如尿素，能够提高折叠中间体或伸展肽链的延展度而抑制聚集体生成，除了能抑制多聚体的形成，尿素还有稳定抗体高级结构的作用。通过大量创造性劳动，发明人发现在洗脱缓冲液中加入0.05～0.15M尿素，既不会影响抗VEGF类抗体活性，同时去除多聚体的效果最佳。
发明人同样在研究中发现，酸性峰受乙酰化酶的影响很大，室温下，发酵液中的酶会催化生成酸性峰，通过在洗脱缓冲液中添加脱乙酰化酶(HDAC)酶抑制剂苯丁酸钠可以显著降低酸性峰的比例，达到去除酸性峰的效果，从而间接达到提高纯度的效果，经过不断优化，在洗脱缓冲液中加入5～7mM苯丁酸钠，既不会影响抗VEGF类抗体活性，同时提高纯度的效果最佳。
通过不断地优化，本发明选取同时具备离子交换作用和疏水作用的复合填料进行层析，该方法在上样前，不需对样品进行稀释，且对于抗VEGF类单克隆抗体，复合填料的介质的动态载量远高于其他抗体。
在前期实验中证明，不加入苯丁酸钠与尿素，MEP捕获后的纯度只能达到72％-75％，多聚体6.0-8.0％。在加苯丁酸钠与尿素后纯度被大大提高。另外，由于洗脱pH为酸性环境，此时绝大部分HCP带上负电，结合在柱子上，从而达到了除HCP的效果，但与同类别参比制剂相比仍有一定差距，通过大量创造性劳动后，发明人发现上述复合填料层析结合羟基磷灰石层析具有很好的除杂效果，能达到与参比制剂相当的水平。
本发明公开了一种VEGF类单抗纯化过程中去除杂质的方法。通过两步层析串联纯化的方式得到的样品，其主要质量属性与参比制剂基本一致。第一步捕获阶段采用离子交换与疏水复合层析的介质，使用低pH缓冲液清除污染物，然后使用更低pH洗脱缓冲液来洗脱目的抗体；第二步精细纯化阶段采用羟基磷灰石的介质，使用高pH缓冲液清除污染物，纯化后样品主要质量属性达到参比制剂要求。
本发明的具体实施方式采用改造的CHO细胞分泌的单克隆抗体进行抗体的纯化制备，该细胞是经基因工程的CHO细胞，能稳定高效表达抗VEGF(在本发明实施方式中采用贝伐珠单抗单抗)；用机械搅拌式生物反应器，大规模高密度悬浮培养CHO细胞，首先通过多次离心去除细胞碎片及有形物，再通过过滤再一步降低浊度，然后通过两步层析串联来纯化。第一步捕获阶段采用离子交换与疏水复合层析的介质，使用低pH缓冲液清除污染物，然后使用更低pH洗脱缓冲液来洗脱目的抗体；第二步精细纯化阶段采用羟基磷灰石的介质，使用高pH缓冲液清除污染物。
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。实施例中所用的原料及参比制剂均可以通过商业途径获得，具体实施例中所用的参比制剂为贝伐珠单抗(美国罗氏公司)。
实施例1
一)细胞液澄清
采用eppendorf离心机，10000g离心CHO细胞培养上清2次，除去细胞及细胞碎片，过0.2μm滤膜，进一步降低样品浊度,调节pH至7.0，即为待上样单抗组合物。
二)复合层析
利用AKTA purifier-100(GE Healthcare)层析系统，将9.4mL MEP(PALL公司)复合层析介质装载于PALL层析柱(1.0*20cm，PALL公司)中。以平衡缓冲液充分平衡复和层析柱，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导率、pH保持稳定时开始上样，以第一清洗缓冲液冲洗未结全合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导率、pH保持稳定后，用第二清洗缓冲液进行冲洗，待280nm的紫外吸收回到基纯，且电导率、pH保持稳定后，用洗脱缓冲液直接洗脱，收集洗脱液。详细洗脱参数见表1
表1实施例1复合层析的详细洗脱参数
Figure PCTCN2016098714-appb-000001
三)羟基磷灰石层析
利用AKTA purifier-100(GE Healthcare)层析系统，将10.2mL MPC(Bio-rad公司)羟基磷灰石介质装载于PALL层析柱(1.0*20cm，PALL公司)中。以平衡缓冲液充分平衡层析柱，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导率、pH保持稳定时开始上样，再以平衡缓冲液冲洗未结全合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导率、pH保持稳定后，用第三清洗缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。详细洗脱参数见表2
表2实施例1羟基磷灰石层析的详细洗脱参数
Figure PCTCN2016098714-appb-000002
四)结果检测
1.毛细管凝胶电泳(CGE)测纯度：
将100μg样品加入离心管中，用超滤管除盐，分别加入碘乙酰胺5μg及50mM PBS(pH7.0)20μL，加热10min，放入毛细管样品盘，进行测定。测定结果见表7。
2.凝胶过滤层析测定多聚体(D/A)
利用自动化的安捷伦HPLC系统，流动相A(50mM PBS+5％乙腈)平衡Thermo分子筛分析柱(5μm)。检测波长：280nm，流速：0.5mL/min，洗脱梯度：100％A相，检测时间：35分钟，将样品用径0.2μm水系滤膜过滤后上样40μg。色谱图见图1，检测结果见表7。
3.ELISA测定宿主蛋白(HCP)
用Cygnus公司的HCP检测试剂盒(Immunoenzymetric Assay for the Measurement of Chinese Hamster Ovary Host Cell Proteins，F015，Cygnus Technologies)，参照试剂盒说明书，具体操作步骤如下：
(1)向每个离心管中分别加入200μL的参比制剂(0～80ng/mL)、检测样品；
(2)每个离心管中分别加入400μL的碱性磷酸酶标记的抗CHO HCP抗体；
(3)盖好离心管，混匀，室温孵育2小时
(4)向96孔板条中转移已经反应好的以上混合液，每孔200μL；
(5)盖好板条，并放入密封的塑料袋，室温下200rpm转动孵育2小时；
(6)甩干板条中的液体，加清洗液350μL，再甩干，重复4次；
(7)每孔中加入200μL的显色剂；
(8)盖好板条，孵育90min；
(9)405/492nm读值。
检测结果见表7。
4.RT-PCR方法测定DNA含量
微量样品基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)实验步骤：
(1)取100μL样品到1.5mL的离心管中，加入1μL 1μg/μL Carrier RNA储存液。
(2)加入20μL Proteinase K溶液(来自于试剂盒)，涡旋混匀。
(3)加入200μL的缓冲液GB(来自于试剂盒)，轻轻涡旋混匀，56℃孵育10分钟，并不时摇动样品。简短离心以去除管盖内壁的液滴。
(4)加入200μL的乙醇。如果室温超过25℃，请将乙醇置冰上预冷。轻轻涡旋混匀样品，室温放置5分钟，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
(5)将上一步所得溶液添加到一个吸附柱CR2(来自于试剂盒)中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
(6)向吸附柱CR2中加入500μL缓冲液GD(来自于试剂盒)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
(7)向吸附柱CR2中加入600μL漂洗液PW(来自于试剂盒)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
(8)重复操作步骤7。
(9)12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置5分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(10)将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL RNA洗脱液，室温放置5分钟，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(11)再一次向吸附膜中间位置悬空滴加50μL洗脱缓冲液TB(来自于试剂盒)，室温放置5分钟，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
定量PCR体系(均三个复孔)
试剂名称 加入体积
PCR MIXer 10μL
前引物(上海生工合成) 0.6μL
后引物(上海生工合成) 0.6μL
水 3.8μL
DNA模板(抽提得到的DNA) 5μL
单管反应体积 20μL
然后放入PCR仪，按照程序进行反应。检测结果见表7。
5.SEC-HPLC测定电荷异质性
色谱柱为弱阳离子交换柱(ProPac WCX-10，4mm×250mm)；以A相(10mM磷酸盐)、B相(10mM磷酸盐，0.5M氯化钠)为流动相，检测波长为280nm。
用超纯水将样品稀释至2mg/mL，作为样品溶液。取50ul注入液相色谱仪，按程序进行测定。测定结果见图2，10.2min的峰为电荷异质性主峰，之前的峰都为酸性峰。测定层析一MEP纯化后的产品，酸性峰含量为22.761％；测定层析二MPC纯化后的产品，酸性峰含量为20.234％，达到参比制剂的要求。
实施例2
一)细胞液澄清
采用eppendorf离心机，10000g离心CHO细胞培养上清2次，除去细胞及细胞碎片，过0.2μm滤膜，进一步降低样品浊度,调节pH至6.5，即为待上样单抗组合物。
二)复合层析
利用AKTA purifier-100(GE Healthcare)层析系统，将1.2mL MEP(PALL公司)复合层析介质装载于Tricorn10/20(GE公司)层析柱中。以平衡缓冲液(50mM PBS pH7.0)充分平衡复和层析柱，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导率、pH保持稳定时开始上样，再以平衡缓冲液(50mM PBS pH7.0)冲洗未结全合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导率、pH保持稳定后，然后用第二缓冲液(50mM PBS pH6.0)进行冲洗，待280nm的紫外吸收回到基纯，且电导率、pH保持稳定后，用洗脱缓冲液(50mM醋酸缓冲液+0.15M NaCl，pH4.6，1％乙醇，9mM苯丁酸钠，0.15M尿素)直接洗脱，收集洗脱液。其89mL的峰为目的收集峰。详细洗脱参数见表3
表3实施例2复合层析的详细洗脱参数
Figure PCTCN2016098714-appb-000003
三)羟基磷灰石层析
利用AKTA purifier-100(GE Healthcare)层析系统，将10.2mL MPC(Bio-rad公司)羟基磷灰石介质装载于PALL层析柱(1.0*20cm，PALL公司)中。以平衡缓冲液(10mM PBS pH7.5)充分平衡复和层析柱，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导率、pH保持稳定时开始上样，再以平衡缓冲液(10mM PBS pH7.5)冲洗未结全合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导率、pH保持稳定后，用洗脱缓冲液(10mM PBS+0.4M NaCl)直接洗脱，收集洗脱液。详细洗脱参数见表4
表4实施例2羟基磷灰石层析的详细洗脱参数
Figure PCTCN2016098714-appb-000004
三)结果检测
抗体纯度、多聚体、宿主蛋白、DNA含量、电荷异质性的检测方法同实施例1，检测结果见表7。
实施例3
一)细胞液澄清
采用eppendorf离心机，10000g离心CHO细胞培养上清2次，除去细胞及细胞碎片，过0.2μm滤膜，进一步降低样品浊度,调节pH至6.8，即为待上样单抗组合物。
二)复合层析
利用AKTA purifier-100(GE Healthcare)层析系统，将1.2mL MEP(PALL公司)复合层析介质装载于Tricorn10/20(GE公司)层析柱中。以平衡缓冲液(50mM PBS pH7.0)充分平衡复和层析柱，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导率、pH保持稳定时开始上样，再以平衡缓冲液(50mM PBS pH7.0)冲洗未结全合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导率、pH保持稳定后，然后用第二缓冲液(50mM PBS pH6.0)进行冲洗，待280nm的紫外吸收回到基纯，且电导率、pH保持稳定后，用洗脱缓冲液(50mM醋酸缓冲液+0.15M NaCl，pH4.6，3％乙醇，9mM苯丁酸钠，0.15M尿素)直接洗脱，收集洗脱液。其纯化色谱 图见图8，其87mL的峰为目的收集峰。详细洗脱参数见表5
表5实施例3复合层析的详细洗脱参数
Figure PCTCN2016098714-appb-000005
三)羟基磷灰石层析
利用AKTA purifier-100(GE Healthcare)层析系统，将10.2mL MPC(Bio-rad公司)羟基磷灰石介质装载于PALL层析柱(1.0*20cm，PALL公司)中。以平衡缓冲液(10mM PBS pH7.5)充分平衡复和层析柱，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导率、pH保持稳定时开始上样，再以平衡缓冲液(10mM PBS pH7.5)冲洗未结全合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导率、pH保持稳定后，用洗脱缓冲液(10mM PBS+0.4M NaCl)直接洗脱，收集洗脱液。详细洗脱参数见表6。
表6实施例3羟基磷灰石层析的详细洗脱参数
Figure PCTCN2016098714-appb-000006
三)结果检测
抗体纯度、多聚体、宿主蛋白、DNA含量、电荷异质性的检测方法同实施例1，检测结果见表7。
表7实施例1-3的检测结果
Figure PCTCN2016098714-appb-000007

Claims (10)

  1. 一种抗VEGF类单克隆抗体的纯化方法，包括以下步骤：
    1)运用复合材料层析对收获液中的抗体进行捕获，所述复合材料为同时具备离子交换作用和疏水作用的复合介质；
    2)运用羟基磷灰石层析进行精细纯化。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
    第一步层析-捕获：
    1)将抗VEGF类单抗组合物加载到复合层析材料上；
    2)用pH为7.0～7.4的第一清洗缓冲液清洗所述复合层析材料；
    3)用pH低于第一清洗缓冲液的第二清洗缓冲液清洗所述复合层析材料；
    4)用pH低于第二清洗缓冲液、含有乙醇的洗脱缓冲液洗脱；
    第二步层析-精细纯化：
    5)将步聚4)洗脱得到的样品调节电导率至1.4～2.0mS/cm，加载于羟基磷灰石层析材料上；
    6)用pH为7.0～7.5的第三清洗缓冲液清洗所述羟基磷灰石材料；
    7)用pH为7.5～8.0、含NaCl的洗脱缓冲液洗脱；
    所述复合材料为同时具备离子交换作用和疏水作用的复合介质。
  3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗VEGF类单抗组合物pH为6.5～7.0。
  4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一清洗缓冲液和/或第二清洗缓冲液为50mM PBS，第二清洗缓冲液的pH为5.5～5.8。
  5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述的洗脱缓冲液为50mM醋酸-醋酸钠缓冲液并含有150mM氯化钠，pH为4.4～4.6。
  6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述的洗脱缓冲液中还含有苯丁酸钠及尿素，苯丁酸钠及尿素含量分别为5～7mM和0.05～0.15M。
  7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第三清洗缓冲液和/或步骤7)中所述洗脱缓冲液为10mM PBS，pH为7.5。
  8. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤7)所述的洗脱缓冲液有含氯化纳，氯化钠的含量为0.2～0.4M。
  9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)执行前还包括分离细胞和发酵液，所述的分离为离心和/或过滤。
  10. 根据权利要求1～9其中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗VEGF类单克隆抗体为贝伐珠单抗。
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