CN118291432A - 一种利用非亲和层析捕获技术纯化蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种利用非亲和层析捕获技术纯化蛋白的方法,提供了可用于捕获步骤的非亲和特异性层析,通过向澄清细胞培养收获液中添加蛋白稳定剂以及样品调节,克服收获液与非亲和特异性层析上样条件的相容问题。采用本公开的方法和产品,可将传统特异性亲和层析转化为非特异性层析捕获目的蛋白,使捕获纯化技术最大利益化,推动生物药物捕获步骤的进步,降低生物药物生产总成本。
Description
技术领域
本公开涉及蛋白纯化领域,具体涉及一种利用非亲和层析捕获技术纯化蛋白的方法。
背景技术
生物治疗药物具有靶向性强、特异性好、治疗效果显著和不良反应小等优点,已成为近年来开发的主要一类新药,在过去5年里,抗体已经成为医药市场上最畅销药物。
典型的抗体纯化过程首先通过Protein A亲和层析对抗体进行捕获,然后通过离子交换层析、疏水相互作用层析等进行精制。在抗体药物生产成本中,下游纯化占据其总生产成本的50%以上。下游纯化是抗体药物生产过程中的关键环节之一,直接关系到药物的生产质量,其中捕获步骤是决定纯化工艺的有效性和效率的关键步骤,对工艺成本有重要影响。
专利CN 102257006 A公开了通过亲和层析捕获步骤分离和纯化抗体的方法,Protein A亲和层析填料由于高选择性和强去污染物能力,经常被首选进行抗体捕获,但其价格昂贵,某些抗体和Fc融合蛋白在低pH洗脱易导致聚合物或降解片段形成,同时存在Protein A亲和层析填料配基脱落增加新污染物,给后续的精纯和工艺的稳健性也增加了难度。
近年来,随着生物药物种类增加和复杂性提高,传统抗体结构衍生出的复杂替代结构,包括Fab片段、Fc融合蛋白和双特异性结构等,其迅速的发展给抗体疗法行业的生产流程带来了新的挑战。
专利CN113980092A公开了采用洗脱pH偏移的策略纯化蛋白,虽然洗脱液仍然为低pH洗脱液,但是通过该pH偏移技术可使得洗脱下来的产品立即处于相对比较高的pH环境,避开了低pH诱发多聚体形成的风险。但洗脱液仍然为低pH洗脱液,层析柱柱上仍有瞬时低pH环境,且样品收集体积较大。在阳离子层析捕获应用中,专利CN105777903A中,提供了一种阿达木单抗阳离子交换层析捕获,引入多步冲洗和洗脱,同时添加低浓度尿素和甜菜碱类表面活性剂分别进行洗脱。在该专利中适用范围较窄,且一些抗体类在调节过程中存在蛋白不稳定,限制阳离子交换层析捕获抗体纯化的应用。
随着层析技术发展,蛋白酶类分离和纯化由最初沉淀法和离心法发展到层析色谱技术。与非亲和捕获层析(离子交换层析和凝胶层析)相比,亲和层析具有高选择性和纯化效率。对于蛋白酶类专属的特异性亲和层析填料,需定制生产,价格昂贵,且填料保存和清洗再生条件苛刻,不利于放大生产。
非亲和层析介质具有蛋白适用范围广、成本低、载量高以及耐碱清洗,为本领域捕获步骤进步提供了一种新纯化方法。但上清液中污染物组成复杂,电导率高,使得非特异性层析捕获步骤应用受限。同时上清液随着pH降低,上清液中污染物或目的蛋白有析出。为了解决非亲和层析捕获方法应用受限,需克服澄清细胞培养收获液与非亲和层析上样条件的相容问题。因此,本公开为蛋白酶类或抗体类非亲和特异性层析捕获技术的纯化方法,使捕获纯化技术最大利益化,推动抗体药物捕获步骤的进步,降低抗体药物生产总成本。
发明内容
本公开目的是通过非亲和特异性层析对细胞表达培养液中目的蛋白进行捕获纯化,来替代传统的亲和层析。针对上述非亲和层析捕获过程中存在的问题,提出蛋白酶类和抗体类捕获步骤的另一种策略,解决与澄清细胞培养收获液上样条件的相容问题、稳定样品和有效去除多聚体等污染物的纯化方法。
发明详述
1、术语
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本文,所述引用的程度就如同已特定地和个别地将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入本文。
在下文详细描述本公开前,应理解本公开不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂,因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案,而并不意图限制本公开的范围。除非另外定义,本文中使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
本公开的术语“蛋白酶”是指任何具有催化功能的蛋白酶复合体。该术语包括但不限于胰蛋白酶、组织型纤溶酶原激活剂或糜蛋白酶等。
本公开的术语“抗体”是指任何免疫球蛋白,复合物或者其片段成分。该术语包括但不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM形式的单克隆或多克隆抗体,也包括通过人源、嵌合、重组、突变等基因工程修饰的形式。在本公开的实施方式中,抗体可以是人源化或全人源的单克隆抗体IgG或是双抗。
本公开的术语“亲和层析填料”是一种通过生物分子之间的特异性的相互作用来分离物质的层析填料,如抗原和抗体、酶和底物、激素和受体、生物素和亲和素等之间的相互作用。亲和层析填料包括但不限于Protein A亲和层析填料和Thermo CaptureSelecttPA。Protein A亲和层析填料包括但不限于Cytiva MabSelect系列、Millipore Eshmuno A系列、博格隆Dimond系列、苏州纳微Unimab系列、赛分科技MabPurix系列。
本公开的术语“污染物”指与期望的抗体产物不同的物质。污染物包括但不限于:宿主细胞物质;期望抗体的变体、聚集体、片段或衍生物;以及细胞培养基成分。
本公开的术语“洗脱缓冲液”用于使目标抗体产物从层析填料中洗脱。
本公开的术语“清洗缓冲液”用于清洗层析填料上一种或多种污染物,不用于洗脱期望的目标抗体产物。
本公开使用的术语“或”表示备选方案,如果合适的话,可以将它们组合,也就是术语“或”包括每个所列出的单独备选方案以及它们的组合。例如“洗脱缓冲液中还包含其他添加剂,例如精氨酸、组氨酸或聚乙二醇”表示在一些实施方式中,添加剂可以是精氨酸、组氨酸、聚乙二醇中的一种,也可以是其一种以上组合。
2、公开内容
本公开提供的一个技术方案为:一种利用非亲和层析捕获技术纯化蛋白的方法,其特征在于:
包括对细胞培养收获料液进行上样前处理,对处理后的料液进行非特异性层析捕获,并进行洗脱收集样品,所述方法包括如下步骤:
(a)对细胞培养收获料液进行上样前处理,包括调节料液pH、电导率以及添加蛋白稳定剂;
(b)将(a)步骤处理后的料液加载到非特异性层析填料中,使目的蛋白结合到该填料上;
(c)用洗脱缓冲液进行洗脱,收集洗脱组分。
所述的蛋白稳定剂选自氨基酸类,诸如精氨酸、甘氨酸、组氨酸或天冬氨酸,优选的,所述蛋白稳定剂为精氨酸。
优选的,所述调节料液pH是使用酸类调节至pH5.0-6.0;
所述酸类为醋酸、盐酸、磷酸或柠檬酸。
优选的,所述调节电导率是通过加水调节电导率,调节电导率≤15mS/cm,优选的,电导率≤10mS/cm。
优选的,所述非特异性层析填料官能团为-CH2-SO3-、-SO3-或-CH2-COO-。
优选的,所述非特异性层析为阳离子交换层析或复合层析;
所述阳离子层析填料为Poros XS、Eshmuno CPX、Capto S ImpAct、Monomix HC45S或GigaCap S-650M;
所述复合层析填料为Capto MMC、Capto adhere或NM90 Agarose HCM。
优选的,所述精氨酸浓度为50-200mM。
优选的,所述洗脱缓冲液中盐类为氯化钠,所述洗脱缓冲液中氯化钠浓度为50~300mM;
所述洗脱缓冲液为醋酸钠-醋酸缓冲液、柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、琥珀酸钠-琥珀酸缓冲液;
所述洗脱缓冲液中还包含其他添加剂,例如精氨酸、组氨酸或聚乙二醇。
优选的,所述目的蛋白为蛋白酶或抗体;
所述蛋白酶为胰蛋白酶、组织型纤溶酶原激活剂或糜蛋白酶,优选的,蛋白酶为阿替普酶;
所述抗体为曲妥珠单抗、贝伐珠单抗、古塞奇尤单抗或PD-L1/TGFβ双抗、CD3/Claudin18.2双抗等IgG1、IgG2及IgG4抗体。
优选的,所述细胞培养收获料液来自哺乳动物、细菌或真菌细胞培养物;优选的,所述细胞培养收获料液来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。
本公开具有以下有益效果:
申请人在研究中发现上清液中电导率高,使得非亲和层析填料载量较低。同时上清液随着pH降低,上清液中污染物有析出,某些蛋白在较低pH环境下(如pH5.0环境)有目的蛋白析出。在上清液处理过程中添加氨基酸类蛋白稳定剂(精氨酸、甘氨酸、组氨酸或天冬氨酸等),能够通过改善蛋白重折叠、蛋白质-蛋白质相互作用提高蛋白稳定性,可以解决上清液在合适非亲和层析上样pH环境下蛋白稳定性问题,提高非亲和层析捕获步骤应用。同时降低上样电导率,提高非亲和层析填料载量,使非亲和层析捕获纯化技术最大利益化。
附图说明
图1为实施例1中细胞培养收获料液添加蛋白稳定剂后性状对比图。
图2为实施例2中非特异性层析捕获层析图谱。
图3为实施例2中非特异性层析洗脱样品SEC-HPLC图谱。
图4为实施例2中亲和层析洗脱样品SEC-HPLC图谱。
图5为实施例4中非特异性层析捕获层析图谱。
图6为实施例4中非特异性层析洗脱样品SEC-HPLC图谱。
图7为实施例4中亲和层析洗脱样品SEC-HPLC图谱。
具体实施方式
通过以下实施例进一步详细说明本公开。
下面结合具体实施方式,进一步阐述本公开。以下所述的是本公开的优选实施方式,仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。应当指出,对于本领域的技术人员来说在此公开创造构思的基础上,做出的若干变形和改进,都属于本公开的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,可采用本领域中的常规方法。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本公开方法中。
实施例1:收获料液中添加蛋白稳定剂处理在纯化阿替普酶中应用
将阿替普酶目的基因载体转入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,进行体外表达培养。对培养料液进行离心取上层液除菌过滤获得细胞培养收获料液,所用离心机为Thermo X1R,3500rpm离心时间25min。考察细胞培养收获料液上样前处理稳定性,具体处理如下:
对照组:未经处理细胞培养收获料液
实验组1:不添加蛋白稳定剂直接调节料液pH和电导率:细胞培养收获料液先加水调节电导率10mS/cm,料液澄清,最后用36%~37%醋酸调节至pH6.0,料液严重浊光。
实验组2:添加蛋白稳定剂后再进行料液调节pH和电导率:细胞培养收获料液中添加精氨酸至100mM浓度,再加水调节电导率10mS/cm,料液澄清,最后用36%~37%醋酸调节至pH6.0,料液澄清。
结果检测及分析:
将不同处理方式的培养收获料液取样进行浊度和表达量测定。
从表1结果可以看出,对照组为未调节的料液,实验组1未加精氨酸直接调节料液pH,将料液调节至合适非亲和层析捕获层析填料上样pH6条件时,料液澄清度发生变化,浊光明显,浊度由21NTU增加至189NTU,过滤后检测料液目的蛋白表达,澄清度变化伴随蛋白损失约40.5%。实验组2为添加蛋白稳定剂,在料液中先添加精氨酸后再进行pH调节至pH6时,料液澄清度未发生改变,蛋白基本无损失。添加精氨酸后很好地解决了阿替普酶非特异性填料捕获层析上样条件与料液相容性问题。图1显示在细胞培养收获液调节过程中未添加精氨酸放置出现明显浑浊,添加精氨酸后可以显著改善收获液的浊光和蛋白损失。
表1料液调节前后表达对比
实施例2:非亲和特异性层析捕获在纯化阿替普酶中应用
本实施例中分为实验组和对照组,实验组为使用非亲和层析填料捕获料液中目的蛋白,其中料液按照实施例1实验组2方法进行处理;对照组为使用亲和特异性层析填料捕获料液中目的蛋白,其中料液按照实施例1对照组方法进行处理。
实验组:
1)平衡:使用Cytiva公司层析系统AKTA avant25,选用Tricom5/15层析柱,内含4.79ml Thermo Poros XS填料。流速为0.8mL/min,使用50mM磷酸盐,pH6.0平衡缓冲液冲洗3-5倍柱体积。
2)上样:流速为0.8mL/min,对调节后上清上样,上样体积约127ml,载量15g/L,上样结束后用50mM磷酸盐,pH6.0平衡缓冲液冲洗至基线平稳。
3)洗脱:流速为0.8mL/min,200mM精氨酸,1M氯化钠,pH6.0进行洗脱,分段收集组分,组分1为0.1AU开始收集,1.5AU停收;组分2为经过峰顶后峰下降至0.05AU停收。其中组分2为洗脱收集组分。
4)清洗:流速为0.8mL/min,用0.5M氢氧化钠清洗层析柱。
对照组:
1)平衡:使用Cytiva公司层析系统AKTA avant25,选用Tricorn 5/15层析柱,内含1ml Thermo CaptureSelect tPA亲和填料。流速为0.2mL/min,使用20mM Tris-HCl,150mM氯化钠,pH7.2平衡缓冲液冲洗3-5倍柱体积。
2)上样:流速为0.2mL/min,对细胞培养收获料液直接进行上样,上样体积约15ml,上样结束后用20mM Tris-HCl,150mM氯化钠pH7.2平衡缓冲液冲洗至基线平稳。
3)洗脱:流速为0.2mL/min,100mM甘氨酸,200mM精氨酸,pH3.0进行洗脱,收集洗脱样品。
4)清洗:流速为0.2mL/min,用100mM甘氨酸,pH2.0清洗层析柱。
结果检测及分析:
将收集的非亲和层析填料和亲和层析填料洗脱样品,进行回收率和SEC-HPLC纯度分析。SEC-HPLC纯度分析,其中Mainpeak为单体,HMWS为多聚体,LMWS是小分子。
检测结果见表2,实施例2中非特异性层析图谱为附图2,其中虚线表示电导率,实线表示280nm下的紫外吸收值。非特异性层析洗脱样品SEC-HPLC图谱见附图3,亲和层析洗脱样品SEC-HPLC图谱见附图4,附图3-4中11-15min的峰是高分子聚合物(HMWS),15-17.5min峰为单体(MainPeak),17.5-22min为低分子量物质(LMWS)。
图2是采用Poros XS非特异性层析填料进行蛋白捕获纯化图谱,如图中UV280nm峰显示,洗脱峰中组分2为目标产物。如图3-4和表2可见,非特异性层析洗脱样品和亲和层析洗脱样品在收率、SEC纯度和活性上基本一致。
表2亲和特异性层析和非特异性层析捕获质量对比
实施例3:收获料液中添加蛋白稳定剂处理在纯化PD-L1/TGFβ双抗中应用
PD-L1/TGFβ双抗的序列和结构详见W02022063193A1实施例1。
将PD-L1/TGFβ双抗目的基因载体转入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,进行体外表达培养。对培养料液进行离心取上层液除菌过滤获得细胞培养收获料液。所用离心机为ThermoX1R,3500rpm离心时间25min。考察细胞培养收获料液上样前处理稳定性,具体处理如下:
对照组:未经处理细胞培养收获料液;
实验组1:不添加蛋白稳定剂直接调节料液pH和电导率:细胞培养收获料液先加水调节电导率10mS/cm,料液澄清,最后用36%~37%醋酸调节至pH6.0,料液严重浊光。
实验组2:添加蛋白稳定剂后再进行料液调节pH和电导率:细胞培养收获料液中添加精氨酸至50mM浓度,再加水调节电导率7mS/cm,料液澄清。最后用36%~37%醋酸调节至pH5.0,上清轻微浊光,进行离心后上样。所用离心机为Thermo X1R,1500-2000rpm离心时间10-15min。
结果检测及分析:
将不同处理方式的培养收获料液取样进行浊度和表达量测定。
从表3结果可以看出,对照组为未进行调节处理的料液,实验组1未加精氨酸直接调节料液pH,将料液调节至合适非亲和层析捕获层析填料上样pH5条件时,料液澄清度发生变化,浊光明显,浊度由11NTU增加至376NTU,过滤后检测料液目的蛋白表达,澄清度变化伴随蛋白损失约23.6%。实验组2为添加蛋白稳定剂,在料液中先添加精氨酸后再进行pH调节至pH5时,料液澄清度未发生改变,蛋白基本无损失。添加精氨酸后同样解决了PD-L1/TGFβ双抗非特异性填料捕获层析上样条件与料液相容性问题。
表3料液调节前后表达对比
实施例4:非亲和特异性层析捕获在纯化PD-L1/TGFβ双抗中应用
试验分组:本实施例4中分为实验组和对照组,实验组为使用本公开中非亲和层析填料捕获料液中目的蛋白,其中料液按照实施例3实验组2方法进行处理;对照组为使用亲和特异性层析填料捕获料液中目的蛋白,其中料液按照实施例3对照组方法进行处理。
实验组:
1)平衡:使用Cytiva公司层析系统AKTA avant25,选用赛分6.6/40层析柱,内含8ml Thermo PorosXS填料。流速为1.4mL/min,使用50mM醋酸钠-醋酸,50mM氯化钠,pH5.0平衡缓冲液冲洗3-5倍柱体积。
2)上样:流速为1.4mL/min,对调节后上清上样,上样体积约110ml,上样结束后用50mM醋酸钠-醋酸,50mM氯化钠,pH5.0平衡缓冲液冲洗至基线平稳。
3)洗脱:流速为1.4mL/min,50mM醋酸钠-醋酸,500mM氯化钠,pH5.0进行洗脱,分段收集组分,组分1为0.1AU开始收集,0.5AU停收;组分2为经过峰顶后峰下降至0.5AU停收;组分3为0.5AU峰后。其中组分2为洗脱收集组分。
4)清洗:流速为1.4mL/min,用1M氯化钠清洗层析柱。
对照组:
1)平衡:使用Cytiva公司层析系统AKTA avant25,选用赛分6.6/40层析柱,内含8ml Protein A亲和填料。流速为1.4mL/min,使用20mM Tris-HCl,200mM氯化钠,pH7.4平衡缓冲液冲洗3-5倍柱体积。
2)上样:流速为1.4mL/min,对细胞培养收获料液直接进行上样,上样体积约90ml,上样结束后用20mM Tris-HCl,200mM氯化钠,pH7.4平衡缓冲液冲洗至基线平稳。
3)冲洗:流速为1.4mL/min,使用20mM Tris-HCl,pH7.4缓冲液冲洗3-5倍柱体积。
4)洗脱:流速为1.4mL/min,20mM醋酸钠-醋酸,pH3.5进行洗脱,收集洗脱样品。
5)清洗:流速为1.4mL/min,用0.1M氢氧化钠清洗层析柱。
结果检测及分析:
将收集的非特异性层析填料和Protein A亲和层析填料洗脱样品,进行回收率和SEC-HPLC纯度分析。SEC-HPLC纯度分析,其中Mainpeak为单体,HMWS为多聚体,LMWS是小分子。
检测结果见表4,实施例4中非特异性层析图谱为附图5。非特异性层析洗脱样品SEC-HPLC图谱见附图6,Protein A亲和层析洗脱样品SEC-HPLC图谱见附图7,附图6-7中11-14min的峰是高分子聚合物(HMWS),14-17min峰为单体(MainPeak),17-24min为低分子量物质(LMWS)。
由图6-7和表4可见,非特异性层析捕获样品SEC单体纯度和Protein A亲和层析洗脱样品基本一致。
表4亲和特异性层析和非特异性层析捕获质量对比
实施例5:收获料液中添加蛋白稳定剂处理在纯化贝伐珠单抗中应用
将贝伐珠单抗目的基因载体转入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,进行体外表达培养。对培养料液进行离心取上层液除菌过滤获得细胞培养收获料液。所用离心机为Thermo X1R,3500rpm离心时间25min。考察细胞培养收获料液上样前处理稳定性,具体处理如下:
对照组:未经处理细胞培养收获料液;
实验组1:不添加蛋白稳定剂直接调节料液pH和电导率:细胞培养收获料液先加水调节电导率7mS/cm,料液澄清,最后用36%~37%醋酸调节至pH5.0,料液严重浊光。
实验组2:添加蛋白稳定剂后再进行料液调节pH和电导率:细胞培养收获料液中先添加精氨酸至50mM浓度,再加水调节电导率7mS/cm,料液澄清,最后用36%~37%醋酸调节至pH5.0,料液澄清。
结果检测及分析:
将不同处理方式的培养收获料液取样进行浊度和表达量测定。
从表5结果可以看出,实验组1未加精氨酸直接调节料液pH,将料液调节至合适非亲和层析捕获层析填料上样pH5条件时,料液澄清度发生变化,轻微浊光,浊度由16NTU增加至138NTU,过滤后检测料液目的蛋白表达,仅轻微降低3.9%。实验组2为添加蛋白稳定剂,在料液中先添加精氨酸后再进行pH调节至pH5时,料液澄清度未发生改变,蛋白基本无损失。添加精氨酸后改善了贝伐珠单抗非亲和填料捕获层析上样料液澄清度。
表5料液调节前后表达对比
实施例6:非亲和特异性层析捕获在纯化贝伐珠单抗中应用
本实施例6中分为实验组和对照组,实验组为使用本公开中非亲和层析填料捕获料液中目的蛋白,其中料液按照实施例5实验组2方法进行处理;对照组为使用亲和特异性层析填料捕获料液中目的蛋白,其中料液按照实施例5对照组方法进行处理。
实验组:
1)平衡:使用Cytiva公司层析系统AKTA avant25,选用Cytiva Capto S ImpAct预装柱,柱体积4.7ml。流速为0.8mL/min,使用50mM醋酸钠-醋酸,50mM氯化钠,pH5.0平衡缓冲液冲洗3-5倍柱体积。
2)上样:流速为0.8mL/min,对调节后上清上样,上样体积约70ml,上样结束后用50mM醋酸钠-醋酸,50mM氯化钠,pH5.0平衡缓冲液冲洗至基线平稳。
3)洗脱:流速为0.8mL/min,50mM醋酸钠-醋酸,150mM氯化钠,pH5.5进行洗脱,分段收集组分,组分1为0.1AU开始收集,0.5AU停收;组分2为经过峰顶后峰下降至0.5AU停收;组分3为0.5AU峰后。其中组分2为洗脱收集组分。
4)清洗:流速为0.8mL/min,用1M氯化钠清洗层析柱。
对照组:
1)平衡:使用Cytiva公司层析系统AKTA avant25,选用Millipore 11/250层析柱,内含22ml Protein A亲和填料。流速为3.8mL/min,使用20mM Tris-HCl,200mM氯化钠,pH7.4平衡缓冲液冲洗3-5倍柱体积。
2)上样:流速为3.8mL/min,对细胞培养收获料液直接进行上样,上样体积约200ml,上样结束后用20mM Tris-HCl,200mM氯化钠,pH7.4平衡缓冲液冲洗至基线平稳。
3)冲洗:流速为3.8mL/min,使用20mM Tris-HCl,pH7.4缓冲液冲洗3-5倍柱体积。
4)洗脱:流速为3.8mL/min,20mM醋酸钠-醋酸,pH3.5进行洗脱,收集洗脱样品。
5)清洗:流速为3.8mL/min,用0.1M氢氧化钠清洗层析柱。
结果检测及分析:
将收集的非亲和层析和Protein A亲和层析洗脱样品,分别进行回收率和SEC-HPLC纯度分析。SEC-HPLC纯度分析,其中Mainpeak为单体,HMWS为多聚体,LMWS是小分子。
从表6可见,非亲和特异性层析捕获样品SEC单体纯度和Protein A亲和层析洗脱样品基本一致。
表6亲和特异性层析和非特异性层析捕获质量对比
实施例7:收获料液中添加蛋白稳定剂处理在纯化古塞奇尤单抗中应用
将古塞奇尤单抗目的基因载体转入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,进行体外表达培养。对培养料液进行离心取上层液除菌过滤获得细胞培养收获料液。所用离心机为ThermoX1R,3500rpm离心时间25min。考察细胞培养收获料液上样前处理稳定性,具体处理如下:
对照组:未经处理细胞培养收获料液;
实验组1:不添加蛋白稳定剂直接调节料液pH和电导率:细胞培养收获料液先加水调节电导率7mS/cm,料液轻微浊光,最后用1mol/L柠檬酸调节至pH6.0,料液浊光。
实验组2:添加蛋白稳定剂后再进行料液调节pH和电导率:细胞培养收获料液中先添加精氨酸至50mM浓度,再加水调节电导率7mS/cm,料液澄清,最后用1mol/L柠檬酸调节至pH6.0,料液轻微浊光。
结果检测及分析:
将不同处理方式的培养收获料液取样进行浊度和表达量测定。
从表7结果可以看出,实验组1未加精氨酸直接调节料液电导和pH,将料液调节至合适非亲和层析捕获层析填料上样pH6条件时,料液澄清度发生变化,浊光,浊度由7.79NTU增加至41.9NTU,过滤后检测料液目的蛋白表达,降低10.0%。实验组2为添加蛋白稳定剂,在料液中先添加精氨酸后再进行pH调节至pH6时,料液澄清度仅轻微发生改变,蛋白基本无损失。添加精氨酸后改善了古塞奇尤单抗非亲和填料捕获层析上样料液澄清度。
表7料液调节前后表达对比
实施例8:非亲和特异性层析捕获在纯化古塞奇尤单抗中应用
本实施例7中分为实验组和对照组,实验组为使用本公开中非亲和层析填料捕获料液中目的蛋白,其中料液按照实施例7实验组2方法进行处理;对照组为使用亲和特异性层析填料捕获料液中目的蛋白,其中料液按照实施例7对照组方法进行处理。
实验组:
1)平衡:使用Cytiva公司层析系统AKTA avant25,选用赛分6.6/40层析柱,内含8.38ml Merck Eshmuno CPX层析介质。流速为1.396mL/min,使用20mM柠檬酸钠-柠檬酸,pH6.0平衡缓冲液冲洗3-5倍柱体积。
2)上样:流速为1.396mL/min,对调节后上清上样,上样体积约102ml,上样结束后用20mM柠檬酸钠-柠檬酸,pH6.0平衡缓冲液冲洗至基线平稳。
3)洗脱:流速为1.396mL/min,20mM柠檬酸钠-柠檬酸,220mM氯化钠,pH6.0,进行洗脱,分段收集组分,组分1为0.1AU开始收集,0.5AU停收;组分2为经过峰顶后峰下降至1.0AU停收;组分3为1.0AU峰后。其中组分2为洗脱收集组分。
4)清洗:流速为1.396mL/min,用1M氯化钠清洗层析柱。
对照组:
1)平衡:使用Cytiva公司层析系统AKTA avant25,选用赛分6.6/40层析柱,内含7.56ml Protein A亲和填料。流速为1.26mL/min,使用20mM Tris-HCl,200mM氯化钠,pH7.4平衡缓冲液冲洗3-5倍柱体积。
2)上样:流速为1.26mL/min,对细胞培养收获料液直接进行上样,上样体积约60ml,上样结束后用20mM Tris-HCl,200mM氯化钠,pH7.4平衡缓冲液冲洗至基线平稳。
3)冲洗:流速为1.26mL/min,使用20mM Tris-HCl,pH7.4缓冲液冲洗3-5倍柱体积。
4)洗脱:流速为1.26mL/min,20mM醋酸钠-醋酸,pH3.6进行洗脱,收集洗脱样品。
5)清洗:流速为1.26mL/min,用0.1M氢氧化钠清洗层析柱。
结果检测及分析:
将收集的非亲和层析和Protein A亲和层析洗脱样品,分别进行回收率和SEC-HPLC纯度分析。SEC-HPLC纯度分析,其中Mainpeak为单体,HMWS为多聚体,LMWS是小分子。
从表8可见,非亲和特异性层析捕获样品SEC单体纯度和Protein A亲和层析洗脱样品基本一致。
表8亲和特异性层析和非特异性层析捕获质量对比
Claims (9)
1.一种利用非亲和层析捕获技术纯化蛋白的方法,其特征在于:
包括对细胞培养收获料液进行上样前处理,对处理后的料液进行非特异性层析捕获,并进行洗脱收集样品,所述方法包括如下步骤:
(a)对细胞培养收获料液进行上样前处理,包括调节料液pH、电导率以及添加蛋白稳定剂;
(b)将(a)步骤处理后的料液加载到非特异性层析填料中,使目的蛋白结合到该填料上;
(c)用洗脱缓冲液进行洗脱,收集洗脱组分,
所述的蛋白稳定剂选自氨基酸类,诸如精氨酸、甘氨酸、组氨酸或天冬氨酸,优选的,所述蛋白稳定剂为精氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
所述调节料液pH是使用酸类调节至pH5.0-6.0;
所述酸类为醋酸、盐酸、磷酸或柠檬酸。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法,其特征在于:
所述调节电导率是通过加水调节电导率,调节电导率≤15mS/cm,优选的,电导率≤10mS/cm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法,其特征在于:
所述非特异性层析填料官能团为-CH2-SO3-、-SO3-或-CH2-COO-。
5.根据权利要求1-4任一项所述方法,其特征在于:
所述非特异性层析为阳离子交换层析或复合层析;
所述阳离子层析填料为Poros XS、Eshmuno CPX、Capto S ImpAct、Monomix HC45 S或GigaCap S-650M;
所述复合层析填料为Capto MMC、Capto adhere或NM90 Agarose HCM。
6.根据权利要求1-5任一项所述方法,其特征在于:所述精氨酸浓度为50-200mM。
7.根据权利要求1-6任一项所述方法,其特征在于:
所述洗脱缓冲液中盐类为氯化钠,所述洗脱缓冲液中氯化钠浓度为50~300mM;
所述洗脱缓冲液为醋酸钠-醋酸缓冲液、柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液和/或琥珀酸钠-琥珀酸缓冲液;
所述洗脱缓冲液中还包含其他添加剂,例如精氨酸、组氨酸或聚乙二醇。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法,其特征在于:
所述目的蛋白为蛋白酶或抗体;
所述蛋白酶为胰蛋白酶、组织型纤溶酶原激活剂或糜蛋白酶,优选的,蛋白酶为阿替普酶;
所述抗体为曲妥珠单抗、贝伐珠单抗、古塞奇尤单抗或PD-L1/TGFβ双抗、CD3/Claudin18.2双抗等IgG1、IgG2及IgG4抗体。
9.根据权利要求1-8任一项所述方法,其特征在于:
所述细胞培养收获料液来自哺乳动物、细菌或真菌细胞培养物;优选的,所述细胞培养收获料液来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。
Applications Claiming Priority (1)
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CN202310025268X | 2023-01-05 |
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