CN115975046A - 一种纯化融合蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纯化融合蛋白的方法,包括以下步骤:步骤1,处理层析填料,上样;步骤2,使用平衡缓冲液淋洗;步骤3,使用洗脱缓冲液洗脱产品,并收集产品。本发明通过改进纯化条件,对添加剂种类、添加剂浓度、洗脱pH的考量和筛选,得到了合适的纯化工艺,使得融合蛋白中去除多聚体的效果较好,最终得到了纯度高、稳定性好的融合蛋白,有利于提高产品的质量控制水平、药物稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种有效提纯多功能融合蛋白,减少多聚体杂质的纯化工艺。
背景技术
多聚体是指抗体蛋白以二聚体或多聚体形式存在的聚集体。多聚体主要在细胞培养、蛋白纯化、制剂处方和药物储存的工艺过程中由于受培养工艺、纯化条件以及制剂存储过程中某些因素的影响,从而导致蛋白质部分分解折叠或者错误折叠,暴露的相关区域相互作用引发聚集,形成多聚体。
多聚体不仅可能会使得药物活性降低甚至失去生物活性,从而影响药效,更有可能使得受体发生过敏性免疫原反应,从而影响了受体的健康。因此,多聚体是抗体蛋白类药物在制备过程中需要监控和去除的杂质,药物中的多聚体含量被认为是产品的一个重要的质量指标。
在抗体融合蛋白药物生产的过程中,虽然我们可以通过改变操作条件,来控制多聚体的产生,但是我们没有办法达到产品中完全没有多聚体的控制效果。所以有效的多聚体的去除手段对于多聚体的控制就显得至关重要。
目前抗体融合蛋白类药物去除多聚体的纯化工艺,主要包括凝胶过滤层析、亲和层析、离子层析和疏水层析,其中亲和层析作为最主要的纯化方法,在洗脱过程中最常用的是线性洗脱法。一般的线性洗脱法的效果优于等度洗脱法。然而,线性洗脱法也存在一定的弊端,由于涉及到产品的分管收集,在生产过程中收集产品繁琐,可操作性不高。另外,在实际生产过程中,线性梯度的条件也不容易操作,导致不适合工业化生产。
发明内容
为了克服这一技术难题,本发明对抗体融合蛋白的纯化工艺进行了优化,在洗脱步骤中考察了不同的层析填料,不同的洗脱方式,不同的洗脱缓冲液对去除多聚体的影响,筛选出了合适的添加剂种类、添加剂浓度和最优的洗脱pH,最终开发出了最优的等度洗脱法,从而筛选出了合适的纯化工艺,使得在融合蛋白中去除多聚体的效果显著提高,且操作简单,适合工业化生产。
具体而言,本发明公开了一种纯化融合蛋白的方法,包括以下步骤:
步骤1,处理层析填料,上样;
步骤2,使用平衡缓冲液淋洗;
步骤3,使用洗脱缓冲液洗脱产品,并收集产品。
进一步地,所述洗脱缓冲液包含NaAc-HAc、Tris-盐酸、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液中的一种或几种。
进一步地,所述洗脱缓冲液还包含添加剂。
进一步地,所述添加剂选自氨基酸、醇、糖、盐中的一种或多种。
进一步地,所述氨基酸为精氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸中的一种或几种。
进一步地,所述盐选自NaCl和CaCl2的一种或两种。
进一步地,所述添加剂的浓度为10-200mM,优选为20-100mM,更优选为30-80mM,进一步优选为40mM、50mM、60mM或70mM。
进一步地,所述洗脱方法为等度洗脱法或线性洗脱法。
进一步地,所述洗脱方法为等度洗脱法。
进一步地,所述洗脱缓冲液包含洗脱缓冲液1和洗脱缓冲液2。
进一步地,所述洗脱缓冲液1的pH为3.0-5.0,优选为3.5-4.5,更优选为3.9-4.1,进一步优选为3.9、4.0或4.1。
进一步地,所述层析填料选自纳微Nanoab50HC、JSR A3、MabselectSuRe LX和博格隆AT Protein A Diamond中的一种或几种。
进一步地,步骤1为用3-5倍柱体积缓冲液A(10-30mM PB,120-160mM NaCl,pH为7.2-7.6)以流速1.0-1.4mL/min冲洗平衡层析柱,用培养基上清液以流速1.0-1.4mL/min进行上样,上样体积为40-44mL。
进一步地,步骤1为用4倍柱体积缓冲液A(20mM PB,140mM NaCl,pH7.4)以流速1.2mL/min冲洗平衡层析柱,用培养基上清液以流速1.2mL/min进行上样,上样体积为42mL。
进一步地,步骤2为先用1-3倍柱体积缓冲液A(10-30mM PB,120-160mM NaCl,pH为7.2-7.6)以流速1.0-1.4mL/min冲洗,然后用2-4倍柱体积缓冲液C(20-30mM NaAc-HAc,450-550mM NaCl,pH为4.8-5.2)以流速1.0-1.4mL/min冲洗,最后用2-4倍柱体积缓冲液D-2(40-60mM NaAc-HAc,pH为4.8-5.2)以流速1.0-1.4mL/min冲洗。
进一步地,步骤2为先用2倍柱体积缓冲液A(20mM PB,140mM NaCl,pH7.4)以流速1.2mL/min冲洗,然后用3倍柱体积缓冲液C(25mM NaAc-HAc,500mM NaCl,pH5.0)以流速1.2mL/min冲洗,最后用3倍柱体积缓冲液D-2(50mM NaAc-HAc,pH5.0)以流速1.2mL/min冲洗。
进一步地,步骤3使用等度洗脱法,即用4-6倍柱体积的缓冲液1以流速1.0-1.4mL/min洗脱,然后用2-4倍柱体积的缓冲液2以流速1.0-1.4mL/min洗脱。
进一步地,步骤3使用等度洗脱法,即用5倍柱体积的缓冲液1以流速1.2mL/min洗脱,然后用3倍柱体积的缓冲液2以流速1.2mL/min洗脱。
进一步地,所述融合蛋白包括第一重链、第二重链、第一轻链和第二轻链,所述第一重链的一部分和第一轻链的一部分、所述第二重链的一部分和第二轻链的一部分分别配对,且二者之一或全部形成PD-1抗原结合位点,所述第一重链还包含细胞因子IL-15片段以及免疫球蛋白Fc部分,所述第二重链还包含IL-15受体片段以及免疫球蛋白Fc部分,所述第一重链中的细胞因子IL-15片段与第二重链中的IL-15受体片段相互结合。
进一步地,所述第一重链中的IL-15片段和第二重链中的IL-15受体片段可以分别嵌合于所述链的Fc部分内部,也可以存在于Fc部分外部,优选位于所述相应重链的CH1和CH2功能区之间。
进一步地,所述融合蛋白的第一重链氨基酸序列选自SEQ ID NO:1;所述融合蛋白的第二重链氨基酸序列选自SEQ ID NO:3;所述融合蛋白的第一轻链和第二轻链的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5。
术语
“氨基酸”以三字母或单字母代码命名,如下所示:丙氨酸(Ala,A)、精氨酸(Arg,R)、天冬酰胺(Asn,N)、天冬氨酸(Asp,D)、半胱氨酸(Cys,C)、谷氨酰胺(Gln,Q)、谷氨酸(Glu,E)、甘氨酸(Gly,G)、组氨酸(His,H)、异亮氨酸(Ile,I)、亮氨酸(Leu,L)、赖氨酸(Lys,K)、甲硫氨酸(Met,M)、苯丙氨酸(Phe,F)、脯氨酸(Pro,P)、丝氨酸(Ser,S)、苏氨酸(Thr,T)、色氨酸(Trp,W)、酪氨酸(Tyr,Y)和缬氨酸(Val,V)。
“缓冲液”是通过它的酸-碱共轭物组分的作用而抵抗pH的变化的缓冲溶液。
“洗脱缓冲液”用于从层析基质洗脱蛋白,即将目标蛋白从固相上洗脱下来。洗脱缓冲液的电导率和/或pH能使目标蛋白从层析填料上洗脱下来。
本发明中的洗脱缓冲液1包含NaAc-HAc和L-精氨酸,洗脱缓冲液2包含NaAc-HAc和L-精氨酸。
“线性洗脱”是指这样的方法,例如在某些实施例中,在整个洗脱过程中,洗脱缓冲液A和洗脱缓冲液B的总体积不变,洗脱缓冲液B的体积分数跟时间呈线性关系,即洗脱缓冲液B的体积随着时间的延长呈线性增加。
“等度洗脱”是指这样的方法,例如在某些实施例中,其中例如引起洗脱(即从层析填料中分离出结合的化合物)的缓冲液浓度立即上升或下降,即在单步骤中直接从起始值/水平到终值/水平。
“盐”是通过酸和碱的相互作用而形成的化合物。
有益效果
本发明提供了一种简单有效的纯化融合蛋白的方法,能够提高融合蛋白药物制备过程中去除多聚体的效率,解决了线性洗脱法中产品的分管收集繁琐、线性梯度条件控制难度大的问题,为融合蛋白药物纯化工艺提供了更加可靠的选择。
具体实施方式
以下结合具体的实施例详细说明本发明的内容,但这些实施例并非限制本发明的范围。本发明未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1抗体的制备
本发明融合蛋白的轻链和重链氨基酸序列信息选自公开的或自研PD-1靶点单抗序列信息,分析获得该序列的可变区和恒定区信息。将天然IL-15序列或IL-15变体序列插入一条重链的氨基酸序列中,并在另一条重链的相应位置插入IL-15受体序列,优选为IL-15RαSushi序列。根据需要,调整所述融合蛋白氨基酸序列的Fc为其他IgG类型,如IgG4等,并进一步在各重链中设计所需形式的氨基酸突变,由此得到目标融合蛋白的氨基酸序列,分别为:
第一重链的全长序列为SEQ ID NO:1,第二重链的全长序列为SEQ ID NO:3,第一轻链和第二轻链的全长序列为(二者相同)为SEQ ID NO:5。
将上述各目标氨基酸序列转化为核苷酸序列,分别为:
第一重链为SEQ ID NO:2,第二重链为SEQ ID NO:4,第一轻链和第二轻链(二者相同)为SEQ ID NO:6。
利用分子克隆技术,将融合蛋白片段插入PCDNA3.1载体中,构建成哺乳动物细胞表达质粒。在37℃、8% CO2、100rpm下培养ExpiCHO至细胞密度6×106细胞/mL。使用脂质体分别将构建的载体PCDNA3.1-G418-16-1、PCDNA3.1-G418-16-2、PCDNA3.1-G418-16-3转染到上述细胞中,转染质粒浓度为1μg/mL,脂质体浓度参照ExpiCHOTMExpression System试剂盒确定,在32℃、5%CO2,100rpm下培养7-10天。转染18-22h之后和5-8天之间分别补料一次。4000rpm离心上述培养产物,0.22μm滤膜过滤并收集培养基上清液(培养基上清液中含有本发明的融合蛋白)。
实施例2层析填料筛选
在实施例2中,探索了使用纳微Nano UniMab50HC,JSR A3,MabselectSuRe LX和博格隆AT Protein A Diamond几种不同的层析填料进行样品纯化,研究保留时间5min,20mg/mL载量时,不同层析填料的纯化效果。
层析条件:
样品来源:实施例1中的培养基上清液,表达量:3.23mg/mL
缓冲液A:20mM PB,140mM NaCl,pH7.4
缓冲液B:0.1M NaOH
缓冲液C:25mM NaAc-HAc,500mM NaCl,pH5.0
缓冲液D-1:25mM NaAc-HAc,pH5.0
缓冲液E-1:50mM NaAc-HAc,pH3.5
用2倍柱体积缓冲液B以流速1.2mL/min冲洗层析柱,用4倍柱体积缓冲液A以流速1.2mL/min冲洗平衡层析柱,用实施例1中的培养基上清液以流速1.2mL/min进行上样。
先用2倍柱体积缓冲液A以流速1.2mL/min冲洗,然后用3倍柱体积缓冲液C以流速1.2mL/min冲洗,最后用3倍柱体积缓冲液D以流速1.2mL/min冲洗。
用缓冲液E以流速1.2mL/min洗脱,收集洗脱峰。
结果发现,当使用纳微Nano UniMab50HC,JSR A3,MabselectSuRe LX和博格隆ATProtein A Diamond中的任一层析填料进行样品纯化时,其分离效果都不好。SEC纯度≥90%的产品为合格样品,计算合格样品的回收率,结果如表1所示。
表1不同层析填料的纯化结果
由结果可知,当使用一种洗脱液时,纳微Nano UniMab50HC,JSR A3,MabselectSuRe LX和博格隆AT Protein A Diamond中的任一层析填料进行样品纯化时,目标产品和多聚体的分离效果都不好,未得到SEC纯度≥90%的合格样品。
实施例3洗脱缓冲液的优化(线性洗脱法)
通过改变洗脱条件,来考察不同的洗脱条件对抗体纯化效果的影响。
层析条件:
样品来源:实施例1中的培养基上清液,表达量:3.23mg/mL
填料:AT ProteinA Diamond,6.15mL
缓冲液A:20mM PB,140mM NaCl,pH7.4
缓冲液B:0.1M NaOH
缓冲液C:25mM NaAc-HAc,500mM NaCl,pH5.0
缓冲液D-2:50mM NaAc-HAc,pH5.0
缓冲液E-2:50mM NaAc-HAc,pH3.2
缓冲液F:50mM NaAc-HAc,100mM NaCl,pH5.0
缓冲液G:50mM NaAc-HAc,100mM NaCl,pH3.2
缓冲液H:50mM NaAc-HAc,50mM L-精氨酸,pH5.0
缓冲液I:50mM NaAc-HAc,50mM L-精氨酸,pH3.2
用4倍柱体积缓冲液A以流速1.2mL/min冲洗平衡层析柱,用实施例1中的培养基上清液以流速1.2mL/min进行上样,上样体积为38mL。
先用2倍柱体积缓冲液A以流速1.2mL/min冲洗,然后用3倍柱体积缓冲液C以流速1.2mL/min冲洗,最后用3倍柱体积缓冲液D以流速1.2mL/min冲洗。
以流速1.2mL/min进行洗脱,收集洗脱峰。
采用表2中的方案线性洗脱,使洗脱缓冲液2的体积分数由0%线性升至100%。
表2使用不同洗脱缓冲液的线性洗脱
方案 | 洗脱缓冲液1 | 洗脱缓冲液2 | 洗脱体积 |
方案1 | 缓冲液D-2 | 缓冲液E-2 | 15柱体积 |
方案2 | 缓冲液F | 缓冲液G | 15柱体积 |
方案3 | 缓冲液H | 缓冲液I | 15柱体积 |
分管收集洗脱样品测定纯度,其中,方案1-3中每管收集1mL,计算纯度≥90%的产品的回收率。结果如表3所示。
表3使用不同洗脱缓冲液的线性洗脱的纯化结果
由结果可知,当洗脱缓冲液中添加NaCl或L-精氨酸时,目标产品的洗脱分离效果都比较好。
实施例4洗脱条件pH的优化(等度洗脱法)
通过改变洗脱条件pH,来考察不同的pH对抗体纯化效果的影响。
样品来源:实施例1中的培养基上清液,表达量:3.23mg/mL
填料:AT ProteinA Diamond,6.15mL
缓冲液A:20mM PB,140mM NaCl,pH7.4
缓冲液B:0.1M NaOH
缓冲液C:25mM NaAc-HAc,500mM NaCl,pH5.0
缓冲液D-2:50mM NaAc-HAc,pH5.0
用4倍柱体积缓冲液A以流速1.2mL/min冲洗平衡层析柱,用实施例1中的培养基上清液以流速1.2mL/min进行上样,上样体积为42mL。
先用2倍柱体积缓冲液A以流速1.2mL/min冲洗,然后用3倍柱体积缓冲液C以流速1.2mL/min冲洗,最后用3倍柱体积缓冲液D-2以流速1.2mL/min冲洗。
使用等度洗脱法,即用5倍柱体积的缓冲液1以流速1.2mL/min洗脱,然后用3倍柱体积的缓冲液2以流速1.2mL/min洗脱。其中,缓冲液1将合格产品从填料上洗脱,洗脱液2将多聚物等杂质从填料上洗脱。
收集洗脱样品测定纯度,计算样品的纯度和回收率,结果如表4所示。
表4不同pH洗脱缓冲液的纯化结果
由结果可知,当洗脱缓冲液1的pH值在3.9至4.1之间,不但目标产品的洗脱分离效果好,而且回收率高。
由方案4-6与方案1-3的结果对比可知,使用等度洗脱法的洗脱效果和回收率,显著优于线性洗脱法。
应当说明的是,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用于限制本发明的范围,凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种纯化融合蛋白的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1,处理层析填料,上样;
步骤2,使用平衡缓冲液淋洗;
步骤3,使用洗脱缓冲液洗脱产品,并收集产品;
所述融合蛋白包括第一重链、第二重链、第一轻链和第二轻链,所述第一重链的一部分和第一轻链的一部分、所述第二重链的一部分和第二轻链的一部分分别配对,且二者之一或全部形成PD-1抗原结合位点,所述第一重链还包含细胞因子IL-15片段以及免疫球蛋白Fc部分,所述第二重链还包含IL-15受体片段以及免疫球蛋白Fc部分,所述第一重链中的细胞因子IL-15片段与第二重链中的IL-15受体片段相互结合。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述洗脱缓冲液包含NaAc-HAc、Tris-盐酸、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述洗脱缓冲液还包含添加剂。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述添加剂选自氨基酸、醇、糖、盐中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述氨基酸为精氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸中的一种或几种。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述盐选自NaCl和CaCl2的一种或两种。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法,其特征在于,所述添加剂的浓度为10-200mM,优选为20-100mM,更优选为30-80mM。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法,其特征在于,所述洗脱方法为等度洗脱法或线性洗脱法。
9.根据权利要求1-7任一项所述的方法,其特征在于,所述洗脱方法为等度洗脱法。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述洗脱缓冲液包含洗脱缓冲液1和洗脱缓冲液2。
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