CN105837687A - 一种抗TNF-α类单克隆抗体的层析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗TNF‑α类单克隆抗体的层析方法，属于生物技术领域。具体公开了一种TNF‑α类单抗纯化过程中去除宿主蛋白及多聚体的方法。采用离子交换与疏水复合层析的填料，使用低pH缓冲液清除污染物，然后使用更低pH洗脱缓冲液来洗脱目的抗体。本发明的技术方案，能去除一部分多聚体和大部分宿主蛋白，显著提高抗体纯度，价格更便宜且无proteinA脱落，简单方便，无需调节样品pH值与电导，适合于工艺放大及工业生产。

Description

一种抗TNF-α类单克隆抗体的层析方法

技术领域

本发明涉及单克隆抗体制备，具体涉及抗TNF-α类单克隆抗体的层析的方法。

背景技术

抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)单克隆抗体(Mc Ab)在临床治疗败血症休克、类风湿性关节炎等疾病中有广泛的应用前景，如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、Golimumab都是TNFα类抗体。其中阿达木单抗是全球首个被批准的抗肿瘤坏死因子α(TNFα)全人源单克隆抗体。阿达木单抗可阻止TNFα与其细胞表面受体结合，从而阻断TNFα的生物学活性，最终减轻炎症反应并减少破骨细胞激活，达到控制并缓解症状体征的目的。目前，绝大多数的药厂采用的是CHO(中国仓鼠卵巢)细胞，该细胞是被WHO和FDA认可用于抗体和重组蛋白等生物制品的生产传代细胞。

传统纯化方法如中国专利CN 102257006A，公开了通过亲和层析捕获步骤分离和纯化抗体的方法，Protein A柱由于选择性高和去杂质能力强，经常被首选进行抗体捕获，但其价格昂贵、洗脱的低pH易导致高分子聚合物形成、Protein A配基掉落等缺点，使越来越多的研究开始关注用非ProteinA工艺来解决现有问题。阳离子层析作为第一步层析，最大的瓶颈在于样品的调节，需要调节样品的pH值与电导，而亲和和复合离子则不需要，调节样品一方面增大了样品的体积导致储液罐和上样时间都要增大，另一方面调节过程中往往会产生沉淀从而造成样品的损失，因为样品中含有大量的HCP，pH调节过程中经过HCP的等电点从而造成了沉淀。同时阳离子的载量往往低于亲和层析。如阿达木的原研公司艾伯维公司的专利CN103509116A，采用了阳离子+阴离子+疏水填料的以阳离子为第一步的“三步层析法”，它的阳离子填料载量低于35mg/ml，但其料液需调节电导和pH，体积变大，导致成本的增加。欧州专利EP1651665采用了MEP捕获纯化非抗体蛋白以及类似于抗体的片段，它用了二步洗脱，第一步洗脱中加入了35％丙二醇，第二步洗脱中加入了50％丙二醇，回收率85％，但其未对单克隆抗体进行优化，应用于单克隆抗体后，纯度和收率都较低。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷，提出一种能够有效去除至少一种污染物的抗TNF-α类单抗的纯化方法。申请人在研究中发现，低浓度变性剂如尿素和表面活性剂等在复性过程中添加的辅助因子能够通过提高折叠中间体或伸展肽链的延展度而抑制聚集体生成，除了能更好地去除多聚体，本身还有稳定抗体高级结构的作用，抑制多聚体的形成。因此，在洗脱缓冲液中加入适当的添加剂，能够有助于去除多聚体等污染物和稳定样品。通过比较在洗脱液中加入0.1M尿素，既不会影响抗体活性，同时除多聚体的效果最佳。

申请人同样在研究中发现，通过添加脱乙酰化酶(HDAC)酶抑制剂苯丁酸钠可以显著降低酸性峰的比例，达到去除酸性峰的效果，从而间接达到提高纯度的效果，减轻下一步纯化的负担。由于酸性峰受酶的影响，室温中酶会慢慢催化酸性，为抑制酶的活性，在洗脱液中加入脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂苯丁酸钠，抑制酶的活性，减缓酶催化酸性峰，减少了酸性峰，从而间接的提高了抗体纯度。经过优化，在洗脱液中加入7-9mM苯丁酸钠，既不会影响抗体活性，同时提高纯度的效果最佳，且对于抗TNF-α类单克隆抗体，复合离子交换作用和疏水作用的介质的动态载量远高于其他抗体。

在前期实验中证明，不加入苯丁酸钠与尿素，MEP捕获后的纯度只能达到75％-80％，多聚体1.5-2.0％。在加苯丁酸钠与尿素后纯度被大大提高。另外，由于洗脱pH为酸性环境，此时绝大部分HCP带上负电，结合在柱子上，从而达到了除HCP的效果。

根据上述发现，本发明的技术方案提供了一种分离抗TNF-α类单克隆抗体和污染物的方法，包括对包括以下步骤：

1)将抗TNF-α类单抗组合物加载到复合层析材料上；

2)用pH约为7.0～7.4的第一清洗缓冲液清洗所述复合层析材料；

3)用pH低于第一清洗缓冲液的的第二清洗缓冲液清洗所述复合层析材料；

4)用pH低于第二清洗缓冲液、含有乙醇的洗脱缓冲液洗脱；

其中，所述抗TNF-α类单抗组合物pH约为6.0～7.0；所述的复合层析材料为离子交换作用和疏水作用的复合介质；所述的污染物包括宿主细胞蛋白。

根据上述技术方案提供的方法，在一些实施方式中，所述的污染物选自宿主细胞蛋白、多聚体或细胞培养基。

在一些实施方式中，所述的抗TNF-α类单抗组合物是由CHO(中国仓鼠卵巢)细胞发酵表达。在其中一些实施方式中，步骤1)执行前还包括分离细胞和发酵液。所述的分离选自离心和过滤。

在一些实施方式中，步骤3)中，第二清洗缓冲液的pH约为5.6～6.0；在其中一些优选的实施方式中，第二清洗缓冲液的pH为约6.0。

在一些实施方式中，步骤4)所述的洗脱缓冲液pH约为4.6～4.8；在其中一些优选的实施方式中，步骤4)所述的洗脱缓冲液pH约为4.8。

步骤4)所述的洗脱液中含有苯丁酸钠及尿素；在一些优选的实施方式中，苯丁酸钠及尿素含量分别为8mM和0.1M。目的是改变溶液的缓冲液环境，提高洗脱分辨率。其次，步骤4)所述的洗脱液中含有乙醇；在一些优选的实施方式中，乙醇的体积含量约为2％。在本发明的技术方案中，洗脱液中加入乙醇的目的是改变溶液的极性，提高洗脱分辨率，理论上，能达到该效果的具有极性性质的添加剂，例如聚乙二醇都属于等同的替代方案。

在一些优选的实施方式中，步骤2)中，第一清洗缓冲液为50mM PBS；步骤3)中第二清洗缓冲液为50mM PBS，步骤4)中，洗脱缓冲液为50mM NaAc-HAc+150mM NaCl。

在一些实施方式中，步骤4)中所述的洗脱缓冲液的电导率为16-18ms/cm。

上述实施方式中，复合层析介质可以为PALL公司生产的MEP复合填料。

本文中要纯化的“组合物”包含感兴趣的抗体和一种或多种污染物。所述组合物可以是“部分纯化的”(即已经进行过一个或多个纯化步骤)或者可以是自生成抗体的宿主细胞或生物体直接获得的(例如所述组合物可以包含收获的细胞培养液)。

术语“污染物”指与期望的抗体产物不同的物质。污染物包括但不限于：宿主细胞物质，诸如宿主细胞蛋白(HCP)；期望抗体的变体、片段、聚集物或衍生物；细胞培养基成分。

术语“清洗缓冲液”在本文中用于指在加载组合物之后且在洗脱感兴趣蛋白质之前流过复合层析材料的缓冲液。清洗缓冲液可用于自复合层析材料清除一种或多种污染物，基本上不洗脱期望抗体产物。依照本文中发明的优选实施方案，使用“第一清洗缓冲液”和“第二清洗缓冲液”。

术语“洗脱缓冲液”用于自固相洗脱感兴趣抗体。在本文中，洗脱缓冲液具有相对于第二清洗缓冲液更低pH，使得期望抗体产物自复合层析介质中洗脱。

术语“多聚体”(D/A)可以理解为相同抗体的非共价结合，由两个以上的抗体结合而成的分子。所述抗体可以由单链抗体共价结合(例如二硫键)的均质或异质多条多肽构成。本发明的多聚体可溶于水溶液。例如，二聚体是两个IgG分子的非特异性结合。多聚体的形成与对天然抗体折叠和抗体结构的变形影响因素紧密相关。例如，高盐与极端pH诱导抗体变性形成多聚体。

本发明中的数字均为近似值，无论有否使用“大约”或“约”等字眼。数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％等差异。每当公开一个具有N值的数字时，任何具有N+/-1％，N+/-2％，N+/-3％，N+/-5％，N+/-7％，N+/-8％或N+/-10％值的数字会被明确地公开，其中“+/-”是指加或减，并且N-10％到N+10％之间的范围也被公开。例如，对于“第二清洗缓冲液的pH为约6.0”，则有6.0+/-1％，6.0+/-2％，6.0+/-3％，6.0+/-5％，6.0+/-7％，6.0+/-8％和6.0+/-10％的值被同时公开，同时，pH6.0-10％到pH6.0+10％之间的温度范围也属于公开的范围，亦即pH5.4-pH6.6及其之间的值，都在第二清洗缓冲液pH值的包含范围内。

本发明使用的定义“或”表示备选方案，如果合适的话，可以将它们组合，也就是说，术语“或”包括每个所列出的单独备选方案以及它们的组合。例如，“污染物选自宿主细胞蛋白、多聚体或细胞培养基”表示在一些实施方式中，污染物可以是宿主细胞蛋白、多聚体、细胞培养基之中的一种，也可以是其一种以上的组合。

附图说明

图1是本发明实施例1的纯化色谱图。

图2是本发明实施例1的非还原纯度检测图谱。

图3是本发明实施例1-3的上样前多聚体检测图谱。

图4是本发明实施例1的纯化后样品检测图谱。

图5是本发明实施例2的纯化色谱图。

图6是本发明实施例2的非还原纯度检测图谱。

图7是本发明实施例2的纯化后样品检测图谱。

图8是本发明实施例3的纯化色谱图。

图9是本发明实施例3的非还原纯度检测图谱。

图10是本发明实施例3的纯化后样品检测图谱。

具体实施方式

本发明采用改造的CHO细胞分泌的单克隆抗体进行抗体的纯化制备，该细胞是经基因工程的CHO细胞，能稳定高效表达抗TNF-α(在本发明实施方式中采用阿达木单抗)；用机械搅拌式生物反应器，大规模高密度悬浮培养CHO细胞，首先通过多次离心去除细胞碎片及有形物，再通过过滤再一步降低浊度，采用离子交换及疏水复合层析介质，当pH大于5.8时复合层析介质不带电，调节组合物pH大于5.8小于目标抗体的平均pI，靠疏水作用结合目标抗体，然后使用第一清洗缓冲液来清洗层析介质，继而用更低pH的第二清洗缓冲液清洗层析介质，最后用pH低于第二清洗缓冲液的洗脱液洗脱目标抗体。具体的包括如下步骤：

(1)选取复合层析介质

复合层析介质是同时带有离子交换与疏水作用的填料，其中疏水作用体现于结合目标抗体，而电荷排斥作用体现于洗脱目标抗体。

(2)调节待纯化样品(含目标抗体)的pH至6.5-7.0，第一缓冲液的pH约为6.5-7.0，第二清洗缓冲液的pH约为5.6-6.0，洗脱缓冲液的pH约为4.6-4.8(电导率设定为16-18ms/cm以及包含0-0.15MNaCl，1～4％乙醇，7～10mM苯丁酸钠以及0.05～0.3M尿素)

(3)层析流速设定为200-250cm/h。

(4)检测收集的洗脱样品，目标抗纯体纯度至少90％。

本发明实施例中所用水均为去离子水。

以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。实施例中所用的原料或耗材均可以通过商业途径获得。

实施例1

一)细胞液澄清

采用eppendorf离心机，10000g离心CHO细胞培养上清2次，除去细胞及细胞碎片，过0.2μm滤膜，进一步降低样品浊度。

二)复合层析

利用AKTA purifier-100(GE Healthcare)层析系统，将1.2ml MEP(PALL公司)复合层析介质装载于Tricorn10/20(GE公司)层析柱中。以平衡缓冲液(50mM PBS pH7.0)充分平衡复和层析柱，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导、pH保持稳定时开始上样，再以第一清洗缓冲液(50mM PBS pH7.0)冲洗未结全合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导率、pH保持稳定后，然后用第二清洗缓冲液(50mM PBS pH6.0)进行冲洗，待280nm的紫外吸收回到基纯，且电导率、pH保持稳定后，用洗脱缓冲液(50mM醋酸缓冲液+0.15M NaCl，pH4.6，1％乙醇，7mM苯丁酸钠，0.05M尿素)直接洗脱，收集洗脱液。

其纯化色谱图见图1，其92ml的峰为目的收集峰。详细洗脱参数见表1

表1实施例1的详细洗脱参数

三)结果检测

毛细管凝胶电泳(CGE)测纯度：

将100μg样品加入离心管中，用超滤管除盐，加入碘乙酰胺及上样缓冲液，加热10min，放入毛细管样品盘，进行测定。测定结果见图2，28.3min的峰为完整抗体峰，经CGE测定MEP纯化后的样品纯度由面积积分计算为92.32％，

凝胶过滤层析(SEC)测定多聚体(D/A)

利用自动化的安捷伦HPLC系统，流动相A(50mM PBS+5％乙腈)平衡Thermo分子筛分析柱(5μm)。检测波长：280nm，流速：0.5ml/min，洗脱梯度：100％A相，检测时间：35min，将样品用径0.2μm水系滤膜过滤后上样40μg。检测结果见表4、图3与图4。由表4和图3、图4可见，14min的峰为多聚体峰，16min的峰为单体峰，其D/A含量由4.2降为0.5％。可见，复合层析能够有效地去除D/A，有效地保证了产品质量。

ELISA测定HCP

用Cygnus公司的HCP检测试剂盒(Immunoenzymetric Assay for the Measurement of Chinese HamsterOvary Host Cell Proteins，F015，Cygnus Technologies).参照试剂盒说明书，具体操作步骤如下：

(1)向每个离心管中分别加入200μl的标准品(0-80ng/ml)、对照品、检测样品；

(2)每个离心管中分别加入400μl的碱性磷酸酶标记的抗CHO HCP抗体；

(3)盖好离心管，混匀，室温孵育2小时

(4)向96孔板条中转移已经反应好的以上混合液，每孔200μl；

(5)盖好板条，并放入密封的塑料袋，室温下200rpm转动孵育2小时；

(6)甩干板条中的液体，加清洗液350μl，再甩干，重复4次；

(7)每孔中加入200μl的显色剂；

(8)盖好板条，孵育90min；

(9)405/492nm读值。

检测结果显示(见表4)，大部分HCP被去除，大约降至1/37，产品中残留的HCP为216.45ppm，可见，本发明提供的方法具有良好的去除HCP效果，与proteinA除HCP效果相差不大。经计算抗体回收率为94.3％。

实施例2

一)细胞液澄清

采用eppendorf离心机，10000g离心CHO细胞培养上清2次，除去细胞及细胞碎片，过0.2μm滤膜，进一步降低样品浊度。

二)复合层析

利用AKTA purifier-100(GE Healthcare)层析系统，将1.2ml MEP(PALL公司)复合层析介质装载于Tricorn10/20(GE公司)层析柱中。以平衡缓冲液(50mM PBS pH7.0)充分平衡复和层析柱，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导率、pH保持稳定时开始上样，再以第一清洗缓冲液(50mM PBS pH7.0)冲洗未结全合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导率、pH保持稳定后，然后用第二清洗缓冲液(50mM PBSpH6.0)进行冲洗，待280nm的紫外吸收回到基纯，且电导率、pH保持稳定后，用洗脱缓冲液(50mM醋酸缓冲液+0.15M NaCl，pH4.6，1％乙醇，9mM苯丁酸钠，0.15M尿素)直接洗脱，收集洗脱液。其纯化色谱图见图5，其89ml的峰为目的收集峰。详细洗脱参数见表2

表2实施例2的详细洗脱参数

三)结果检测

毛细管凝胶电泳(CGE)测纯度：

将100μg样品加入离心管中，用超滤管除盐，加入碘乙酰胺及上样缓冲液，加热10min，放入毛细管样品盘，进行测定。测定结果见图6，28.3min的峰为完整抗体峰，经CGE测定MEP纯化后的产品纯度由面积积分计算为92.43％，

凝胶过滤层析(SEC)测定多聚体(D/A)

利用自动化的安捷伦HPLC系统，流动相A(50mM PBS+5％乙腈)平衡Thermo分子筛分析柱(5μm)。检测波长：280nm，流速：0.5ml/min，洗脱梯度：100％A相，检测时间：35min，将样品用径0.2μm水系滤膜过滤后上样40μg。检测结果见表4、图3与图7。由表4和图7可见，14min的峰为多聚体峰，16min的峰为单体峰，其D/A含量由4.2降为0.7％。可见，复合层析能够有效地去除D/A，有效地保证了产品质量。

ELISA测定HCP

用Cygnus公司的HCP检测试剂盒(Immunoenzymetric Assay for the Measurement of Chinese HamsterOvary Host Cell Proteins，F015，Cygnus Technologies).参照试剂盒说明书，具体操作步骤如下：

(1)向每个离心管中分别加入200μl的标准品(0-80ng/ml)、对照品、检测样品；

(2)每个离心管中分别加入400μl的碱性磷酸酶标记的抗CHO HCP抗体；

(3)盖好离心管，混匀，室温孵育2小时

(4)向96孔板条中转移已经反应好的以上混合液，每孔200μl；

(5)盖好板条，并放入密封的塑料袋，室温下200rpm转动孵育2小时；

(6)甩干板条中的液体，加清洗液350μl，再甩干，重复4次；

(7)每孔中加入200μl的显色剂；

(8)盖好板条，孵育90min；

(9)405/492nm读值。

检测结果显示(见表4)，大部分HCP被去除，大约降至1/32，产品中残留的HCP为242.00ppm，可见，本发明提供的方法具有良好的去除HCP效果，与proteinA除HCP效果相差不大。

经计算抗体回收率为93.9％。

实施例3

一)细胞液澄清

采用eppendorf离心机，10000g离心CHO细胞培养上清2次，除去细胞及细胞碎片，过0.2μm滤膜，进一步降低样品浊度。

二)复合层析

利用AKTA purifier-100(GE Healthcare)层析系统，将1.2ml MEP(PALL公司)复合层析介质装载于Tricorn10/20(GE公司)层析柱中。以平衡缓冲液(50mM PBS pH7.0)充分平衡复和层析柱，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导、pH保持稳定时开始上样，再以第一清洗缓冲液(50mM PBS pH7.0)冲洗未结全合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导、pH保持稳定后，然后用第二清洗缓冲液(50mM PBS pH6.0)进行冲洗，待280nm的紫外吸收回到基纯，且电导、pH保持稳定后，用洗脱缓冲液(50mM醋酸缓冲液+0.15MNaCl，pH4.6，3％乙醇，9mM苯丁酸钠，0.15M尿素)直接洗脱，收集洗脱液。其纯化色谱图见图8，其87ml的峰为目的收集峰。详细洗脱参数见表3

表3实施例3的详细洗脱参数

三)结果检测

毛细管凝胶电泳(CGE)测纯度：

将100μg样品加入离心管中，用超滤管除盐，加入碘乙酰胺及上样缓冲液，加热10min，放入毛细管样品盘，进行测定。测定结果见图9，28.3min的峰为完整抗体峰，经CGE测定MEP纯化后的产品纯度由面积积分计算为91.92％，

凝胶过滤层析(SEC)测定多聚体(D/A)

利用自动化的安捷伦HPLC系统，流动相A(50mM PBS+5％乙腈)平衡Thermo分子筛分析柱(5μm)。检测波长：280nm，流速：0.5ml/min，洗脱梯度：100％A相，检测时间：35min，将样品用径0.2μm水系滤膜过滤后上样40μg。检测结果见表4、图3与图10。由表4和图10可见，14min的峰为多聚体峰，16min的峰为单体峰，其D/A含量由4.2降为0.4％。可见，MEP复合层析介质能够有效地去除D/A，有效地保证了产品质量。

ELISA测定HCP

用Cygnus公司的HCP检测试剂盒(Immunoenzymetric Assay for the Measurement of Chinese HamsterOvary Host Cell Proteins，F015，Cygnus Technologies).参照试剂盒说明书，具体操作步骤如下：

(1)向每个离心管中分别加入200μl的标准品(0-80ng/ml)、对照品、检测样品；

(2)每个离心管中分别加入400μl的碱性磷酸酶标记的抗CHO HCP抗体；

(3)盖好离心管，混匀，室温孵育2小时

(4)向96孔板条中转移已经反应好的以上混合液，每孔200μl；

(5)盖好板条，并放入密封的塑料袋，室温下200rpm转动孵育2小时；

(6)甩干板条中的液体，加清洗液350μl，再甩干，重复4次；

(7)每孔中加入200μl的显色剂；

(8)盖好板条，孵育90min；

(9)405/492nm读值。

检测结果显示(见表4)，大部分HCP被去除，大约降至1/35，产品中残留的HCP为229.11ppm，可见，本发明提供的方法具有良好的去除HCP效果，与proteinA除HCP效果相差不大。

经计算抗体回收率为93.5％。

表4 实施例1-3的检测结果

Claims (11)

1.一种抗TNF-α类单克隆抗体的层析方法，包括以下步骤：

1)将抗TNF-α类单抗组合物加载到复合层析材料上；

2)用pH 7.0～7.4的第一清洗缓冲液清洗所述复合层析材料；

3)用pH低于第一清洗缓冲液的的第二清洗缓冲液清洗所述复合层析材料；

4)用pH低于第二清洗缓冲液、含有7～10mM的苯丁酸钠、0.05～0.3M尿素以及1～4％体积含量乙醇的洗脱缓冲液洗脱；

其中，所述的抗TNF-α类单抗组合物pH为6.0～7.0；所述的复合层析材料为离子交换作用和疏水作用的复合介质；所述的污染物包括宿主细胞蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)为用pH低于第二清洗缓冲液、含有7～9mM的苯丁酸钠、0.05～0.15M尿素以及1～3％体积含量乙醇的洗脱缓冲液洗脱。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)为用pH低于第二清洗缓冲液、含有8mM的苯丁酸钠、0.1M尿素以及2％体积含量乙醇的洗脱缓冲液洗脱。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的污染物选自宿主细胞蛋白、多聚体或细胞培养基。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的第二清洗缓冲液的pH为5.6～6.0。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的第二清洗缓冲液的pH为6.0。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的洗脱缓冲液pH为4.6～4.8。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的洗脱缓冲液pH为4.8。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的第一清洗缓冲液为50mM PBS；步骤3)所述的第二清洗缓冲液为50mM PBS；步骤4)所述的洗脱缓冲液为50mM NaAc-HAc+150mM NaCl。

10.根据权利要求1～9任一项所述的方法，其特征在于，所述复合层析材料为PALL公司的MEP复合填料。

11.根据权利要求1～9任一项所述的方法，其特征在于，所述的TNF-α类单克隆抗体为阿达木单抗。