CN112010970B - 一种去除重组表达抗体聚体和降解产物的方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供一种去除抗体聚集体和降解片段、提高抗体单体得率和纯度的亲和层析方法。通过对重组阿达木单抗亲和层析过程中pH值、电导率、缓冲液类型等参数条件的优化提高了抗体单体的纯度，进而通过在洗脱缓冲液中加入尿素或PEG添加剂提高了抗体单体得率。在优选的实施例中重组阿达木单抗单体得率可达90%，产物中单体的纯度超过95%。

Description

一种去除重组表达抗体聚体和降解产物的方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种基因工程菌重组表达抗体的分离纯化方法，更具体涉及一种从含重组抗体的培养液中去除重组表达抗体聚体和降解产物、提高重组表达抗体单体的含量和纯度的方法。

背景技术

肿瘤坏死因子α(TNFα)是由许多细胞类型(包括单核细胞和巨噬细胞)产生的细胞因子，其原始鉴定是基于其诱导某些小鼠肿瘤坏死的能力(参见例如Old，L.(1985)Science230：630-632)。随后，一个与恶病质相关的名称为恶病质素的因子表明是与TNFα相同的分子。据信TNFα参与介导休克(参见例如Beutler，B.和Cerami，A.(1988)Annu.Rev. Biochem.57：505-518；Beutler，B.和Cerami，A.(1988)Annu.Rev. Immunol.7：625-655)。另外，据信TNFα参与各种各样的其它人类疾病和紊乱的病理生理学，包括脓毒症、感染、自身免疫疾病、移植物排斥和移植物抗宿主病(参见例如Moeller，A.等(1990)Cytokine 2：162-169；US5231024B；EP260610B1；Vasilli，P.(1992)Annu.Rev.Immunol. 10：411-452；Tracey，K.J.和Cerami，A.(1994)Annu.Rev.Med.45：491-503)。

由于人TNFα(hTNFα)在各种各样的人体紊乱中的有害作用，已设计治疗策略以抑制或抵消hTNFα的活性。特别是，已寻找与hTNFα结合或中和hTNFα的抗体做为抑制hTNFα活性的手段。一些最早的这种抗体是由用hTNFα免疫的小鼠的淋巴细胞制备的杂交瘤分泌的小鼠单克隆抗体(mAbs)(参见例如Hahn T；等，(1985)Proc Natl Acad Sci USA 82：3814-3818；Liang，C-M.等(1986)Biochem.Biophys.Res. Commun. 137：847-854；Hirai，M.等(1987)J.Immunol.Methods 96：57- 62；Fendly，B.M.等(1987)Hybridoma 6：359-370；Moeller，A.等(1990) Cytokine 2：162-169；US5231024B；EP186833B1；EP260610 B1号等)。为试图克服与在人体内使用全鼠抗体相关的问题，已对鼠抗hTNFα抗体进行遗传工程使其更“人类化”。例如，已制备嵌合抗体，其中抗体链的可变区为鼠源，而抗体链的恒定区为人源(Knight，D.M等 (1993)Mol.Immunol. 30：1443-1453等)。另外，也已制备人化抗体，其中所述抗体可变区的超变域为鼠源，但所述可变区的其余部分和所述抗体恒定区为人源(WO92/11383A1)；英夫利昔单抗是一种抗人TNFα的人鼠嵌合IgG1单克隆抗体(由人源IgG1恒定区和小鼠可变区组成)。

优于鼠mAbs或其衍生物(例如嵌合抗体或人化抗体)的hTNFα抑制剂可以是完全人类抗hTNFα抗体，因为这种药剂甚至在长期给药时也不会引起该HAMA反应。已使用人类杂交瘤技术制备了抗hTNFα人单克隆自身抗体(Boyle，P.等(1993)Cell.Immunol. 152：556-568；Boyle，P.等(1993)Cell.Immunol. 152：569-581)。阿达木单抗最初由CambridgeAntibody Technologies（CAT）和BASF子公司BASF Knoll合作开发。2002年，雅培制药公司（Abbott）以69亿美元收购BASFKnoll而获得阿达木单抗。阿达木单抗是重组人源IgG1单克隆抗体，含有人源轻链和重链可变区序列和人源IgG1，通过特异性结合人体内的TNFα，阻止TNFα与其细胞表面受体结合，从而阻断了TNFα的生物学活性，最终减轻炎症反应并减少破骨细胞激活，达到控制并缓解症状体征的目的。阿达木单抗在治疗成人中重度慢性类风湿性关节炎和儿童多关节少年特发性关节炎、银屑病和银屑病关节炎、强直性脊柱炎、儿童和成人克罗恩病、溃疡性结肠炎、结节病、葡萄膜炎治疗等方面效果明显。

在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）等基因工程细胞株制备抗体时，抗体分子在重组表达、提取、纯化过程中容易被宿主蛋白酶降解产生无活性降解产物，并且重组抗体分子在宿主细胞中翻译后修饰、折叠、转运、分泌过程中易发生多聚化产生聚集体。降解产物、聚集体的存在不仅对重组抗体分子活性带来不期望的影响，而且由于其与抗体分子单体序列结构、理化参数等方面高度相似，仅在长度、状态等方面存在差异，采用常规的蛋白质纯化手段往往难以达到理想的纯化效果。聚乙二醇（PEG）在离子交换过程中可以通过提高样品在柱上的保留时间，从而实现聚体的有效分离(Milby et al., 1989, Gagnon et al., 1996,2006)。Pete Gagnon在用羟基磷灰石进行抗体纯化过程中发现，PEG 4600可有效分离聚体（Pete Gagnon，2008）。

抗体药物生产过程中亲和纯化是非常关键的一个工艺步骤，该过程对发酵液中的抗体进行捕获浓缩，实现抗体粗纯化的第一步，通过对亲和纯化工艺进行优化提高抗体单体纯度、增加抗体单体得率、降低抗体聚体含量、减少抗体降解产物是抗体药物制备过程中急需解决的技术问题。

发明内容

为了解决亲和层析难以去除抗体聚体和降解片段的技术问题，本发明基于对现有技术中去除蛋白聚体方法的研究发现聚乙二醇（PEG）增加抗体蛋白保留时间、去除聚集体的功能主要取决于PEG改善了层析过程中固定相表面的水合能力，推测PEG改善基质水合能力的作用也可能适用于亲和基质，尝试在亲和层析中使用PEG提高亲和层析的分辨率、以期去除聚集体和降解片段。基于上述发现和分析，提供了一种去除抗体聚集体和降解片段、提高抗体单体得率和纯度的亲和层析方法。通过对重组阿达木单抗亲和纯化过程中pH值、电导率、缓冲液类型等参数条件的优化提高了抗体单体的纯度，进而通过在洗脱缓冲液中加入尿素或PEG添加剂提高了抗体单体得率。在优选的实施例中重组阿达木单抗单体得率可达90%，产物中单体的纯度超过95%。

具体而言：

一方面，本发明提供一种抗体亲和层析方法，其特征在于，在洗脱缓冲液中加入选自聚乙二醇（PEG）和尿素的添加剂，所述添加剂以有效去除抗体聚集体和降解片段、提高单体得率的方式添加于洗脱缓冲液中。

进一步，本发明所述的抗体亲和层析方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液中的添加剂为PEG8000，其在洗脱缓冲液中的工作浓度以重量/体积百分比计为2-8%，优选3-4%，更优选3.4%。

进一步，本发明所述的抗体亲和层析方法，其特征在于所述添加剂为尿素，其在洗脱缓冲液中的工作浓度为0.1-1M，优选0.5M。

进一步，本发明所述的抗体亲和层析方法，其特征在于所述洗脱缓冲液选自由柠檬酸-Na₂HPO₄、Gly-HCl、Arg-HCl、NaAc-HAc组成的组，所述洗脱缓冲液的pH值为3.6-4.2，优选3.85-3.92，更优选3.9。

进一步，本发明所述的抗体亲和层析方法，其特征在于亲和层析的填料选自Mabselect、Bestarose Diamond。

进一步，本发明所述的抗体亲和层析方法，其特征在于所述抗体具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所述重链可变区；并且，具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所述轻链可变区。

进一步，本发明前述任一所述的抗体亲和层析方法，包括：

（1）样品的准备：将含抗体的细胞培养液上清澄清制备样品；

（2）平衡：以2-3柱体积的平衡缓冲液平衡亲和层析柱；

（3）上样：将样品上样至亲和层析柱，上样量为20-40mg/mL；

（3）再平衡：上样完成后以2-3柱体积的再平衡缓冲液进行再平衡；

（4）洗脱：以含有聚乙二醇（PEG）或尿素添加剂的洗脱缓冲液洗脱；

（5）回收：分段收集洗脱液、合并洗脱峰级分。

进一步，本发明所述的抗体亲和层析方法，其特征在于，亲和层析纯化产物中抗体单体得率>80%、抗体单体纯度>85%；优选抗体单体得率>85%、单体纯度>95%。

第二方面，本发明还提供前述第一方面任一所述的抗体亲和层析方法在提高抗体单体纯度的应用。

本发明还提供前述第一方面任一所述的抗体亲和层析方法在增加抗体单体得率的应用。

其中，所述单体得率是指洗脱样品总蛋白中单体含量与起始样品中单体含量的百分比。

本发明还提供前述第一方面任一所述的抗体亲和层析方法在降低抗体聚体含量的应用。

本发明还提供前述第一方面任一所述的抗体亲和层析方法在减少抗体降解产物中的应用。

第三方面，本发明提供添加剂在提高抗体单体纯度、增加抗体单体得率、降低抗体聚体含量、和/或减少抗体降解产物中的应用，其特征在于，将所述添加剂作为抗体亲和层析纯化方法中洗脱缓冲液的组分，所述添加剂选自聚乙二醇（PEG）和尿素，优选所述添加剂为PEG8000。

进一步，本发明所述的应用，其特征在于，所述洗脱缓冲液中的添加剂为PEG8000，其在洗脱缓冲液中的工作浓度以重量/体积百分比计为2-8%，优选3-4%，更优选3.4%。

进一步，本发明所述的应用，其特征在于所述添加剂为尿素，其在洗脱缓冲液中的工作浓度为0.1-1M，优选0.5M。

进一步，本发明所述的应用，其特征在于所述洗脱缓冲液选自由柠檬酸-Na₂HPO₄、Gly-HCl、Arg-HCl、NaAc-HAc组成的组，所述洗脱缓冲液的pH值为3.6-4.2，优选3.85-3.92，更优选3.9。

进一步，本发明所述的应用，其特征在于亲和层析的填料选自Mabselect、Bestarose Diamond。

进一步，本发明所述的应用，其特征在于所述抗体具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所述重链可变区；并且，具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所述轻链可变区。

除非另有说明，本文所用的术语和短语具有下文所列的含义。特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域技术人员通常理解的含义进行解释。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

本文所用的术语“人TNFα”(本文缩写为hTNFα或简单地写为hTNF)是指以17kD分泌形式和26kD膜结合形式存在的人细胞因子，其生物学活性形式由非共价键连接的17kD分子的三聚体组成。hTNFα的结构另外描述于例如Pennica，D.等(1984)Nature 312：724-729；Davis，J.M.等(1987)Biochemistry 26：1322-1326；和Jones，E.Y.等(1989) Nature 338：225-228。术语人TNFα包括重组人TNFα(rhTNFα)，它可以通过标准重组表达方法制备或购买得到(R&D Systems，目录号 210-TA，Minneapolis，MN)。

本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，它们由四条多肽链组成，即由二硫键相互连接的二条重链(H)和二条轻链(L)。每条重链由重链可变区(本文简写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。该重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域组成。每条轻链由轻链可变区(本文简写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。该轻链恒定区由一个结构域即CL组成。VH和VL区可以进一步划分为超变区，称为互补性决定区(CDR)，其间散布着更为保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，它从氨基末端至羧基末端的排布顺序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

本文所用的抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)指保留与抗原(例如hTNFα)特异性结合能力的抗体的一个或多个片段。已发现可以由全长抗体的片段行使抗体的抗原结合功能。在抗体的“抗原结合部分”术语中包括的结合片段的例子包括：(i)一个Fab片段，由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；(ii)一个F(ab’)₂片段，包含在铰链区由二硫桥连接的二个Fab片段的二价片段；(ii)一个Fd片段，由VH和CH1域组成；(iv)一个Fv片段，由抗体单臂的VL和VH域组成；(v)一个dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，由一个VH域组成；和(vi)一个分离的互补性决定区(CDR)。另外，尽管该Fv片段的二个结构域VL和VH由独立的基因编码，但可以采用重组方法用能使它们成为单蛋白链的合成接头将它们连接，在该单蛋白链中所述VL和VH区配对形成单价分子(已知为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这种单链抗体亦包含于术语抗体的“抗原结合部分”之中。亦包括其它形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL域表达于一个多肽单链上，但所用的接头太短使得同一链上的这二个结构域不能配对，因此迫使这些结构域与另一链的互补结构域配对而创造出二个抗原结合位点(参见例如Holliger，P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444- 6448；Poljak，R.J.等(1994)Structure 2：1121-1123)。

另外，抗体或其抗原结合部分可以是一个较大的免疫粘附分子的一部分，该分子由该抗体或抗体部分与一个或多个其它蛋白或肽通过共价或非共价结合而形成。这种免疫粘附分子的例子包括用抗生蛋白链菌素核心区制备四聚体scFv分子(Kipriyanov，S.M.等(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6：93-101)和使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端多组氨酸标记制备二价生物素化scFv分子(Kipriyanov，S.M.等 (1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。可以采用常规技术例如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分别消化完整抗体，从完整抗体制备诸如Fab和 F(ab’)2片段的抗体部分。另外，可以按照本文描述的标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。

本文使用的术语“人抗体”包括具有得自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体例如在CDR中和在CDR3中可以包括未被人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)。然而，本文使用的术语“人抗体”不包括其中CDR序列得自其它哺乳动物种(例如小鼠)并已被移植至人框架序列的抗体。

本文使用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创造或分离的所有人抗体，例如用转染至宿主细胞的重组表达载体表达的抗体(在以下第II节进一步描述)、从重组、联合人抗体文库中分离的抗体(在以下第III节进一步描述)、从用人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor，L.D.等(1992)Nucl. AcidsRes. 20：6287-6295)或通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方法制备、表达、创造或分离的抗体。这种重组人抗体具有得自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，对这种重组人抗体进行体外诱变(或使用人Ig序列转基因动物时为体内体细胞诱变)，因此所述重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是那些虽然得自人种系VH和VL序列并与之相关、但在体内的人抗体种系的所有组成部分中都不天然存在的序列。

本文使用的“分离抗体”是指大致不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如特异性结合hTNFα的分离抗体大致不含有与hTNFα之外的抗原特异性结合的抗体)。然而，与hTNFα特异性结合的分离抗体具有对其它抗原(例如来自其它种的hTNFα)的交叉反应性(在以下详细讨论)。另外，分离抗体可以大致不含其它细胞物质和/或化学物质。

本文所用的术语“纯化”以及其语法上的变化用于表示完全或部分地去除包含蛋白质和一种或多种杂质的混合物中的至少一种杂质，降低该组合物中杂质的含量，从而提高组合物中蛋白质的纯化水平。

本文所用的术语“层析”是指通过在该方法的特定缓冲液条件下使该混合物流经层析填料，从而将目的溶质即目的蛋白与其他溶质分离的方法，分离原理是由于溶质的各种性质例如等电点，大小，结构等不同，与填料的结合强弱不同，因此保留时间不同，从而从层析填料上洗脱时间不同。

本文所用的术语“单体”，是指药物学上的单体，其一般包括先导化合物、候选化合物、生物活性化合物三类。对于抗体药物，轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为Ig分子的单体；单体是构成所有免疫球蛋白分子的基本结构；所有抗体的单体都是四条肽链的对称结构，即：两条糖基化重链(H)和两条非糖基化轻链(L)；每条重链和轻链分为氨基端(N端)和羧基端(C端)。

本文所用的术语“聚体”，是指一个或多个目的蛋白的面条样块。聚体是多个通过位阻相互作用或彼此之间相互作用而变成团的蛋白分子。单抗在生产、储存、运输和注射到病人体内时都会伴随缓慢的聚体形成过程。控制单抗聚体含量，一方面是为降低杂质，提高纯度；另一方面是因为在治疗过程中，聚体的存在不仅会降低药物的效果，还会引起机体的免疫反应，具有潜在的副作用。在动物免疫原性研究的实验中发现，聚体中天然结构比例以及聚体的大小决定其免疫原性的强弱，因此有学者推断，聚体的免疫原性是由其表面的抗原表位的重复性决定的。

本文所用的术语“亲和层析”，也称亲和色谱，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

第一、本发明在传统层析方法的基础上进行改进，以总蛋白得率、单体得率、产物中单体纯度为指标，通过预洗液的选择、洗脱缓冲液pH值和电导率的参数优化等，不仅使亲和纯化产物纯度由不足70%提高至近90%，而且为后续通过添加剂提高聚体和降解片段去除率提供了基础。

第二、基于对现有技术中去除蛋白聚体方法的研究发现聚乙二醇（PEG）增加抗体蛋白保留时间、去除聚集体的功能主要取决于PEG改善了层析过程中固定相表面的水合能力，推测PEG改善基质水合能力的作用也可能适用于亲和基质，尝试在亲和层析中使用PEG提高亲和层析的分辨率、以期去除聚集体和降解片段。基于上述发现和分析，在亲和洗脱液中使用PEG达到了去除抗体聚集体和降解片段、提高抗体单体得率和纯度的技术效果。

第三、对CHO细胞重组表达的全人源阿达木单抗，在本发明所述亲和层析方法的基础上进行了具体的优化，通过单一的亲和层析即可实现重组阿达木单抗单体纯度超过95%、单体得率达90%的技术效果。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1：重组人源阿达木单抗CHO细胞上清液经典亲和层析图谱。

图2A：利用缓冲液为Na₂HPO₄-柠檬酸：20mM，pH 3.4，Cond 2.0 mS/cm亲和层析图谱。

图2B：利用缓冲液为Gly-HCl：20mM，pH 3.4，Cond 2.0 mS/cm亲和层析图谱。

图2C：利用缓冲液为Arg-HCl：20mM，pH 3.4，Cond 2.0 mS/cm和层析图谱。

图2D：利用缓冲液为NaAc-HAc：20mM，pH 3.4，Cond 2.0 mS/cm和层析图谱。

图3A ：利用缓冲液为Na₂HPO₄-柠檬酸：20mM，pH 3.4，Cond 2.0 mS/cm亲和层析SEC-HPLC图谱。

图3B：利用缓冲液为Gly-HCl：20mM，pH 3.4，Cond 2.0 mS/cm亲和层析SEC-HPLC图谱。

图3C：利用缓冲液为Arg-HCl：20mM，pH 3.4，Cond 2.0 mS/cm亲和层析SEC-HPLC图谱。

图3D：利用缓冲液为NaAc-HAc：20mM，pH 3.4，Cond 2.0 mS/cm亲和层析SEC-HPLC图谱。

图3E：利用缓冲液为A-D四重SEC-HPLC图谱叠加对比亲和层析SEC-HPLC图谱。

图4A：经典亲和层析得率测定值与预测值的拟合。

图4B：经典亲和层析聚体百分比测定值与预测值的拟合。

图4C：经典亲和层析降解产物百分比测定值与预测值的拟合。

图5：经典亲和层析中DOE分析多因子响应预测刻画器分析。

图6A：pH4.2洗脱缓冲液中加入20mM柠檬酸-Na₂HPO₄，pH 4.2亲和层析SEC-HPLC图谱。

图6B：pH4.2洗脱缓冲液中加入20mM柠檬酸-Na₂HPO₄+0.5% PEG8000，pH 4.2亲和层析SEC-HPLC图谱。

图6C：pH4.2洗脱缓冲液中加入20mM柠檬酸-Na₂HPO₄+0.5M urea，pH 4.2亲和层析SEC-HPLC图谱。

图6D：pH4.2洗脱缓冲液中加入A-C三重SEC-HPLC图谱叠加对比亲和层析SEC-HPLC图谱。

图7A：PEG改良亲和层析中聚体含量百分比测定值与预测值的拟合。

图7B：PEG改良亲和层析中单体得率测定值与预测值的拟合。

图7C：PEG改良亲和层析中单体纯度测定值与预测值的拟合。

图8：PEG改良亲和层析中DOE分析多因子响应预测刻画器分析。

图9：PEG改良亲和层析中洗脱添加剂等高线刻画器图。

图10A：基质为Mabselect填料的PEG改良亲和层析SEC-HPLC图谱。

图10B：基质为Bestarose Diamond填料的PEG改良亲和层析SEC-HPLC图谱。

图10C：图10A-图10B二重SEC-HPLC图谱叠加对比。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1：重组人抗TNF-α单克隆抗体的蛋白序列。

一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体为重组人抗TNF-α单克隆抗体是通过基因工程手段，在CHO细胞中表达的，并且通过一系列标准的层析步骤纯化获得的。本实施例中具体使用的阿达木单抗序列具有SEQ ID NO:1所述重链可变区；并且，具有SEQ ID NO:2所述轻链可变区。其分子量约为148kDa，由2条IgG1重链和2条κ轻链组成。每条重链含有451个氨基酸，分子量约为49kDa，其序列如SEQ ID NO:5所示；每条轻链含有214个氨基酸，分子量约为24kDa，其序列如SEQ ID NO:6所示。

实施例2：重组人阿达木单抗的重组表达和纯化。

参照Woodetal.,JImmunol.145:3011(1990)等的方法，特异性结合TNF-α的单克隆抗体抗TNF-α抗体在CHO细胞表达。含抗体基因的表达载体用常规的分子生物学方法构建（MolecularCloning），以CHO-k1细胞(ATCCCCL61)的一种衍生细胞系作为宿主细胞表达。高产稳定细胞系的构建过程简单描述如下：宿主细胞悬浮生长于CD-CHO培养基（Gibco, CA），取处于对数生长期的宿主细胞离心，重悬于新鲜的CD-CHO培养基，计数并调节细胞密度到1.43×10⁷个/毫升，取600ul上述细胞悬液加入电击杯，然后加入已线性化的质粒40ug，(用移液枪吸打使细胞与质粒混合均匀。用Bio-rad电转仪电击转化，仪器参数设定为：电容：960uFD,电压：300V。通常电击时间为15-20毫秒为正常。把电击后的细胞立即重悬于37℃预热的CD-CHO培养基)，每孔100ul分装于96孔板，2-3天后加入等量的筛选培养基 (CD-CHOmedia+50uMMSX)。测定96孔板细胞培养上清来测定抗体的表达水平。表达水平较高的克隆从96孔板转移到24孔板，待细胞生长到一定数量，把细胞转入6孔板，使每孔5ml培养基含2×10⁵个细胞，测定细胞的抗体产量和产率。通常20-30个克隆被转到摇瓶做进一步评价。最后5-8个表达量最高的克隆进行亚克隆和进一步的表达检测。收获料液，通过低速离心使细胞和培养基分离，把离心上清高速离心进一步澄清。

实施例3：重组阿达木单抗普通亲和层析预洗条件对得率和单体纯度的影响。

通过在亲和层析中增加预洗步骤，主要是添加不同的预洗添加剂，考察预洗条件对于聚体的去除效果。如果预洗条件不合适的话，则重点集中对洗脱步骤进行优化研究。

亲和层析（不同预洗）：

填料：GE Mabselect 5ml，层析柱：博格隆 BXP10mm/20cm，柱高：6.4cm；

缓冲液：

平衡缓冲液Buffer A1（20mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.0）；

再平衡缓冲液Buffer A2（20mM PB，pH 7.0）；

3种预洗脱液Buffer B1-1（20mM PB +1M 尿素，pH 7.0）；

Buffer B1-2（0.2 M Arg-HCl +1M NaCl，pH 7.0）；

Buffer B1-3（10 mM EDTA +1M NaCl，pH 7.0）；

洗脱液Buffer B2（20mM柠檬酸-Na₂HPO₄，pH3.4）。

实验过程：

先用Buffer A1平衡层析柱2-3CV（柱体积），整个层析过程流速保持1-4ml/min。平衡结束开始上样，上样载量控制在30-37mg/ml，上样完成后，先用Buffer A2平衡层析柱2-3CV，继而分别以3种不同预洗溶液Buffer B1洗涤柱子2-3CV，最后用洗脱缓冲液Buffer B2洗脱目的蛋白，当UV280nm吸收达到100mAU时用干净瓶子收集洗脱峰，当UV280nm吸收小于100mAU时停止收集，收集样品送检SEC-HPLC，并计算得率及单体得率。结果如表1所示。

表1：亲和层析不同预洗条件比较

得率：洗脱得到的蛋白量占上样量的百分比。

单体得率：洗脱样品总蛋白量中单体含量（蛋白量×SEC单体%）与起始样品中单体含量的百分数。由于聚体和降解均为杂质，需要进一步去除，因此采用单体得率来评价不同条件对于SEC单体的影响。其中，单体为SEC检测直接获得的数据，单体得率为洗脱得到的蛋白中单体含量占起始样品中单体含量的百分比，用于直观比较对聚体和降解等杂质的去除效率。

SEC-HPLC：分子排阻高效液相色谱，主要是通过分子量的大小来对蛋白进行分离，分子量大的蛋白先出峰，称作聚（集）体（aggregate）；主峰随后出峰，称作单体；分子量小的蛋白后出峰，称作降解片段（fragment）。

表1的结果显示，上述三种不同的预洗条件下，聚体含量均大于22%，降解量均接近10%，这些不同预洗条件下，各组间的得率和单体得率没有显著差异，因此没有起到提高聚体和单体分辨率的作用。上说结果提示不同的预洗条件对于聚体和降解片段的去除几乎没有影响、通过预洗条件的优化不能有效的去除聚体和降解，因此后续研究着重于洗脱pH、洗脱缓冲液、洗脱添加剂等洗脱条件。

实施例4：重组阿达木单抗普通亲和层析洗脱pH对得率和单体纯度的影响。

本实验采用线性洗脱的方式对亲和层析的洗脱液pH进行考察，主要是为了确定洗脱pH然后进行后续的研究。

亲和层析（线性洗脱）：

填料：Mabselect 5ml，博格隆 BXP10mm/20cm，柱高6.4cm；

缓冲液：

平衡液Buffer A（20mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.0）；

洗脱液Buffer B1（20mM柠檬酸-Na₂HPO₄，pH 5.0）；

洗脱液Buffer B2（20mM柠檬酸-Na₂HPO₄，pH 3.0）。

实验过程：

先用Buffer A1平衡层析柱2-3CV（柱体积），整个层析过程流速保持1-4ml/min。平衡结束开始上样，上样载量控制在30-37mg/ml，上样完成后，先用Buffer A再平衡层析柱2-3CV，继而进行20CV的线性洗脱（B1：B2为100-0%：0-100%，pH 5.0-pH 3.0），收集不同的组分，每2.5CV收集一管，根据不同收集组分的样品量和聚体含量确定合适的洗脱pH，收集的样品送检SEC-HPLC并计算得率。结果如图1、表2所示。

表2：不同洗脱组分得率和聚体含量

分段不同组分	得率（%）	聚体含量（%）
			起始样品	——	15.18
MF2-F1	1.64	1.61
			MF2-F3	17.84	3.34
MF2-F5	55.75	5.18
			MF2-F7	95.07	12.77

注：MF2-F1、F3、F5、F7为分段收集的样品，对应图1洗脱峰处标记的1,3,5,7。

根据图1、表2的结果可知，MF2-F1至F5对应的聚体含量相比起始样品而言下降较多，但得率较低，样品损失过多，不符合工艺的经济性，而MF2-F7对应聚体含量略有增加，但得率较高。为了在亲和层析步骤去除部分聚体，为后续层析步骤减轻压力，同时保证单克隆抗体纯化捕获步骤的得率，因此选择MF2-F7对应的pH作为洗脱pH进行后续其余条件参数的研究，此时洗脱pH为3.4。

实施例5：重组阿达木单抗普通亲和层析洗脱缓冲体系对得率和单体纯度的影响。

考虑到不同洗脱液缓冲体系可能会对收获的亲和层析样品的体积和蛋白纯度存在一定影响，因此选择4种常见的缓冲体系（Na₂HPO₄-柠檬酸、Gly-HCl、Arg-HCl、NaAc-HAc）进行考察。

亲和层析（4种不同洗脱缓冲体系）：

填料：Mabselect 5ml，博格隆BXP 10mm/20cm，柱高6.4cm；

缓冲液：

平衡液Buffer A1（20mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.0）；

再平衡液Buffer A2（20mM PB，pH 7.0）；

4种洗脱液Buffer B1（20mM Na₂HPO₄-柠檬酸，pH 3.4，Cond 2.0 mS/cm）；

Buffer B2（20 mM Gly-HCl，pH 3.4，Cond 2.0 mS/cm）；

Buffer B3（0.1M Arg-HCl，pH 3.4，Cond 2.0 mS/cm）；

Buffer B4（0.1M NaAc-HAc，pH 3.4，Cond 2.0 mS/cm）。

实验过程：

先用Buffer A1平衡层析柱2-3CV，整个层析过程流速保持1-4ml/min。平衡结束开始上样，上样载量控制在30-37mg/ml，上样完成后，先用Buffer A2平衡层析柱1-2CV，继而分别用BufferB1-B4洗脱液洗脱目的蛋白，当UV280nm吸收达到100mAU时用干净瓶子收集洗脱峰，当UV280nm吸收小于100mAU时停止收集，收集样品送检SEC-HPLC并计算得率和单体得率。结果如图2A、图2B、图2C、图2D、图3A、图3B、图3C、图3D、图3E、表3所示。

表3：亲和层析不同缓冲体系洗脱效果的比较

图2A、图2B、图2C、图2D、图3A、图3B、图3C、图3D、图3E、表3显示NaAc-HAc体系对应得率最高，但聚体含量也最高；Arg-HCl与NaAc-HAc体系聚体含量相似，但单体峰出现前后拖尾现象，得率明显较低，柠檬酸-Na₂HPO₄能够兼顾得率和聚体含量。上述结果表明亲和层析中抗体聚体与抗体单体的对填料的结合力相近，因此存在聚体含量和得率正相关的现象。通过权衡得率和SEC纯度，选择柠檬酸-Na₂HPO₄作为亲和层析的缓冲体系。

实施例6：重组阿达木单抗普通亲和层析洗脱条件多因子DOE实验。

为了解洗脱液pH和电导对亲和层析得率的影响，采用DOE实验从2水平、2因子进行实验设计，pH 3.4-4.2，电导1-7 mS/cm，并对结果用最小二乘法进行拟合，从而进一步研究不同pH、电导条件对样品的聚体含量及得率的影响。具体DOE设计如表4所示。

亲和层析（pH、电导DOE实验）：

填料：Mabselect 5ml，博格隆BXP 10mm/20cm，柱高6.4cm；

缓冲液：

平衡液Buffer A1（20mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.0）；

再平衡液Buffer A2（20mM PB，pH 7.0）；

洗脱液Buffer B（20mM柠檬酸-Na₂HPO₄，不同pH、电导，详见表4）。

实验过程：

先用Buffer A1平衡层析柱2-3CV，整个层析过程流速保持1-4ml/min。平衡结束开始上样，上样载量控制在30-37mg/ml，上样完成后，先用Buffer A2平衡层析柱2-3CV，继而按DOE实验设计采用不同pH和电导的洗脱液洗脱目的蛋白，当UV280nm吸收达到100mAU时用干净瓶子收集洗脱峰，当UV280nm吸收小于100mAU时停止收集。收集样品送检SEC-HPLC并计算得率及单体得率。结果如表4所示，通过JMP软件对经典亲和层析中得率、聚体、降解产物的测定值与预测值进行拟合，结果如图4A、图4B、图4C所示；进而对多因子响应利用预测刻画器分析，结果如图5所示。

表4：亲和层析洗脱DOE条件及结果

图4A、图4B、图4C结果显示，得率、聚体、降解产物的测定值与预测值能够实现拟合，在此基础上图5的预测刻画器分析结果显示随着pH值的升高，得率降低，聚体含量降低，降解含量减少；随着电导增加，得率降低，聚体含量降低，降解含量降低。总而言之，电导对得率的影响弱于pH。经分析获得的预测的洗脱最优条件为：pH 4.2，Cond 6.0 mS/cm，此时对应单体得率76.6 %，聚体3.2 %，降解4.0 %。

表4、图4A、图4B、图4C-图5的结果表明，重组阿达木单抗普通亲和层析的最优洗脱条件（pH 4.2，Cond 6.0 mS/cm）能够实现使产物中阿达木单抗的单体纯度接近90%，然而单体得率偏低。由此可知，在重组阿达木单抗普通亲和层析中通过条件优化除去聚体和降解片段只能以损失大量单体为代价。

实施例7：重组阿达木单抗洗脱添加剂改良亲和层析实验——添加剂筛选。

为了进一步提高得率，并降低聚体含量，我们尝试向亲和层析洗脱缓冲液中加入不同的添加剂（如：PEG8000、urea等）。

亲和层析（洗脱添加剂改良）：

填料：Mabselect 5ml，博格隆 BXP10mm/20cm，柱高6.4cm；

溶液：平衡液Buffer A1（20mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.0）；

再平衡液Buffer A2（20mM PB，pH 7.0）；

3种洗脱液Buffer B1-1（20mM柠檬酸-Na₂HPO₄，pH 4.2）；

Buffer B1-2（20mM柠檬酸-Na₂HPO₄+0.5% PEG8000，pH 4.2）；

Buffer B1-3（20mM柠檬酸-Na₂HPO₄+0.5M urea，pH 4.2）；

再生液Buffer B2（20mM柠檬酸-Na₂HPO₄，pH 3.4）。

实验过程：

先用Buffer A1平衡层析柱2-3CV，整个层析过程流速保持1-4ml/min。平衡结束开始上样，上样载量控制在30-37mg/ml，上样完成后，先用Buffer A2平衡层析柱2-3CV，继而分别以3种不同洗脱液Buffer B1洗脱目的蛋白，然后用Buffer B2再生柱子，当UV280nm吸收达到100mAU时用干净瓶子收集洗脱峰，当UV280nm吸收小于100mAU时停止收集，样品送检SEC-HPLC，并计算得率、单体得率。结果如表5、图6A、图6B、图6C、图6D所示。

表5：亲和层析不同添加剂实验比较

表5、图6A、图6B、图6C、图6D的结果显示，通过比较洗脱缓冲液中加入的不同添加剂，得到较好的几种添加剂条件，如Urea、PEG8000。其中，0.5M urea和0.5% PEG8000都有比较好的结果，表现为聚体含量较低、单体得率高。

上述结果表明，PEG8000等添加剂会通过增加聚体和单体的分离度，从而可以在牺牲少量单体收率的基础上，进而去除大量聚集体杂质，以达到有效的分离效果。

实施例8：重组阿达木单抗洗脱添加剂改良亲和层析实验——多因子DOE。

由于实施例3-6的普通亲和层析方法优化中已经表明洗脱缓冲液pH值对得率和单体纯度具有显著影响，而实施例7中表明在洗脱添加剂改良亲和层析方法中，添加剂浓度能够影响单体得率和单体纯度。因此，针对添加剂浓度和pH值进行DOE设计和条件优化。选择PEG8000作为后续添加剂进行进一步研究，通过设计DOE实验来优化洗脱pH和PEG8000的浓度，洗脱pH考察范围3.6-4.2，PEG8000浓度范围2-8%，设计2因子，2水平的DOE实验，从而进一步考察洗脱pH和PEG8000浓度对单体得率及SEC纯度的影响。

亲和层析（洗脱pH值、添加剂浓度DOE实验）：

填料：Mabselect 5ml，博格隆BXP 10mm/20cm，柱高6.4cm；

溶液：平衡液Buffer A1（20mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.0）；

再平衡液Buffer A2（20mM PB，pH 7.0）；

洗脱液Buffer B（如表6所示DOE实验设计）。

先用Buffer A1平衡层析柱2-3CV，整个层析过程流速保持1-4ml/min。平衡结束开始上样，上样载量控制在30-37mg/ml，上样完成后，先用Buffer A2平衡层析柱2-3CV，继而按DOE实验设计采用不同pH值和添加剂的洗脱液洗脱目的蛋白，当UV280nm吸收达到100mAU时用干净瓶子收集洗脱峰，当UV280nm吸收小于100mAU时停止收集。收集样品送检SEC-HPLC并计算单体得率。结果如表6所示，通过JMP软件对经典亲和层析中单体得率、聚体、降解产物的测定值与预测值进行拟合，结果如图7A、图7B、图7C所示；然后对多因子响应利用预测刻画器分析，结果如图8所示；进而对洗脱添加剂利用等高线刻画器作图，结果如图7A、图7B、图7C-图9所示。

表6：亲和层析洗脱pH值、添加剂DOE实验

表6、图7A、图7B、图7C-图8的结果显示，在洗脱pH3.6-4.2范围内，洗脱pH对聚体含量的影响显著，在PEG8000浓度2-8%范围内，PEG8000浓度对聚体含量的影响不显著；洗脱pH及PEG8000浓度对单体得率的影响均显著；洗脱pH及PEG8000浓度对单体得率，聚体含量的影响趋势见预测刻画器图，最优值是洗脱pH 3.9，PEG8000浓度3.4%。

为了获得更大的操作参数范围、具有较大的可操作性空间，根据图9的等高线刻画器图可设置单体得率大于80%、纯度大于85%，此时的PEG8000浓度为3-4%，pH 3.85-3.92。包含上述洗脱pH 3.9、PEG8000浓度3.4%的最优值。

实施例9：重组阿达木单抗洗脱添加剂改良亲和层析实验——放大验证。

为了确定实施例8获得的重组阿达木单抗洗脱添加剂改良亲和层析实验条件能否适应不同的抗体亲和基质，利用不同的抗体亲和纯化填料进行放大验证。

填料：Mabselect 20ml，GE XK16mm/20cm，柱高10cm；

Bestarose Diamond 20ml，GE XK16mm/20cm，柱高10cm。

溶液：平衡液Buffer A（20mM PB，pH 7.0）；

洗脱液Buffer B1（20mM 柠檬酸-Na₂HPO₄+3.4% PEG8000，pH 3.9）；

再生缓冲液Buffer B2（20mM 柠檬酸-Na₂HPO₄，pH 3.0）。

用Buffer A平衡层析柱2-3CV，整个层析过程流速保持1-4ml/min。平衡结束开始上样，上样载量控制在30-37mg/ml，上样完成后，先用Buffer A平衡层析柱2-3CV，继而以洗脱液Buffer B1洗脱目的蛋白，当UV280nm吸收达到100mAU时用干净瓶子收集洗脱峰，当UV280nm吸收小于100mAU时停止收集，然后用缓冲液Buffer B2再生，收集的样品送检SEC-HPLC并计算单体得率。结果如表7、图10A、图10B、图10C所示。

表7： Mabselect和Bestarose Diamond填料亲和层析实验结果分析汇总表

表7、图10A、图10B、图10C的结果显示，用Mabselect和Bestarose Diamond分别对洗脱最优条件进行了放大，结果表明单体得率均比较高，聚体含量能够显著下降。上述结果表明，通过在亲和洗脱液中添加PEG8000的方式进行洗脱去除抗体聚体、降解片段并提高单体得率的方法不仅适用于Mabselect填料，也适用于其它本领域常用的亲和填料。

实施例10：SEC-HPLC检测方法。

高效液相色谱仪：Waters Arc Acquity；

色谱柱：TSKgel G3000SWxl 7.8mm*30cm，5μm；

流动相：0.1mol/L PB+0.1mol/L Na₂SO₄ ;

pH：6.80。

样品制备：将样品用流动相稀释至1mg/ml，12000rpm离心10min，取上清进样分析。

分析条件：流速：0.6ml/min；柱温：30℃；检测波长：214nm；分析时间：25min。

系统适用性测试：取工作参考品进样20微升按分析条件进行HPLC分析，单体峰理论塔板数≥5000；单体和聚集体之间的分离度R≥1.5。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 迈威（上海）生物科技股份有限公司

江苏迈威康新药研发有限公司

<120> 一种去除重组表达抗体聚体和降解产物的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Thr Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Ile Gln Asn Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Tyr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Thr Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 6

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims (5)

1.一种抗TNF-α单克隆抗体亲和层析方法，其特征在于在洗脱缓冲液中加入PEG8000添加剂，所述添加剂以有效去除抗体聚集体和降解片段、提高单体得率的方式添加于洗脱缓冲液中；所述抗TNF-α单克隆抗体为IgG1抗体，具有SEQ ID NO:1所示重链可变区；并且，具有SEQ ID NO:2所示轻链可变区；其中所述PEG8000在洗脱缓冲液中的浓度为3-4%；所述的洗脱缓冲液为柠檬酸-Na₂HPO₄，其pH值为3.85-3.92；所述的亲和层析的填料选自Mabselect、Bestarose Diamond。

2.如权利要求1所述的抗TNF-α单克隆抗体亲和层析方法，包括：

（1）样品的准备：将含抗体的细胞培养液上清澄清制备样品；

（2）平衡：以2-3柱体积的平衡缓冲液平衡亲和层析柱；

（3）上样：将样品上样至亲和层析柱，上样量为20-40mg/mL；

（3）再平衡：上样完成后以2-3柱体积的再平衡缓冲液进行再平衡；

（4）洗脱：以含有PEG8000添加剂的洗脱缓冲液洗脱；

（5）回收：分段收集洗脱液、合并洗脱峰级分。

3.如权利要求1或2所述的抗TNF-α单克隆抗体亲和层析方法，其特征在于抗体单体得率>80%、抗体单体纯度>85%。

4.如权利要求1-3任一所述的抗TNF-α单克隆抗体亲和层析方法在提高抗体单体纯度、增加抗体单体得率、降低抗体聚体含量、和减少抗体降解产物中的应用。

5.添加剂在提高抗TNF-α单克隆抗体单体纯度、增加抗TNF-α单克隆抗体单体得率、降低抗TNF-α单克隆抗体聚体含量、和减少抗TNF-α单克隆抗体降解产物中的应用，其特征在于，将所述添加剂作为抗体亲和层析纯化方法中洗脱缓冲液的组分，所述添加剂为PEG8000，PEG8000在洗脱缓冲液中的浓度为3-4%的；其中，所述抗TNF-α单克隆抗体具有SEQID NO:1所示重链可变区；并且，具有SEQ ID NO:2所示轻链可变区；所述的洗脱缓冲液为柠檬酸-Na₂HPO₄，其pH值为3.85-3.92；所述的亲和层析的填料选自Mabselect、BestaroseDiamond。

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