CN105777895A - 苯丁酸钠在抗体酸性峰纯化中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗体酸性峰纯化的方法。在抗体酸性峰中的纯化过程中，添加苯丁酸钠在抗体酸性峰纯化中的应用具有较好的效果。在TNFα抗体的纯化中，使用含苯丁酸钠盐的电导率由小变大的缓冲液进行两步洗脱能明显降低抗体的酸性峰含量，具有突出的实际工业用途。

Description

苯丁酸钠在抗体酸性峰纯化中的应用
技术领域
本发明涉及抗体纯化领域，具体涉及一种抗体酸性峰纯化的方法。
背景技术
酸性峰是单克隆抗体的电荷异质性相关杂质。电荷异质性的差异主要来源于翻译后修饰，具体原因包括脱酰胺、末端赖氨酸的缺失等。酸性峰是普遍存在的现象，纯化一般用高分辨率的阳离子填料。但使用阳离子填料的话，需要调节样品的电导及pH，势必会稀释样品，延长上样时间。另外调节pH一般会引起共沉淀现象，降低回收率。
MEP-HyperCel为Pall公司的一款复合填料，具有疏水和离子交换两种机制。料液可以不经调节电导和pH，高盐直接上样。与填料结合后，可以通过改变pH、电导等来洗脱抗体与杂质。利用此方法，经本发明人实践得出，只能使酸性峰比例降至27-32％左右。为了减少下游纯化压力，因此需要进一步降低酸性峰的比例。
发明内容
本发明根据上述技术背景的不足，提供了一套可适于抗体酸性峰的纯化工艺，该工艺方法具有简单易行，成本较小，能有效降低抗体中酸性峰的比例。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了苯丁酸钠在抗体酸性峰纯化中的应用。
在本发明的一些实施方案中，苯丁酸钠在含抗体的溶液中的浓度为5～10mmol/L。
在本发明的一些实施方案中，在抗体与色谱基质接触的洗脱溶剂中加入苯丁酸钠。
在本发明的一些实施方案中，苯丁酸钠的浓度为5～10mmol/L。
在本发明的一些实施方案中，2～8℃温度下，包含使用MEP-HyperCel填料进行电导率由小变大的缓冲液洗脱，其中缓冲液中含有浓度为5～10mmol/L苯丁酸钠。
在本发明的一些实施方案中，电导率由小变大的缓冲液洗脱为两步洗脱。
在本发明的另一些实施方案中，两步洗脱条件为：
(1)使用pH为6.3～6.5，含30mmol/L柠檬酸盐、5～10mmol/L苯丁酸钠的缓冲液洗脱；
(2)使用pH为7.0～7.2，含50mmol/L柠檬酸盐、5～10mmol/L苯丁酸钠的缓冲液洗脱。
在本发明的一些实施方案中，抗体是TNFα抗体或其抗原结合部分，如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、Golimumab都是TNFα类抗体。
定义与解释
术语“色谱”是指由于在一定流动相影响下，混合物中的各溶质通过固相介质的速率不同，或者在结合和洗脱过程中从混合物中的其他溶质中分离混合物中有关溶质的方法。常见色谱基质有离子交换色谱基质和疏水作用色谱基质等，具有上述混合模式作用的色谱基质如本发明使用的Pall公司的MEPHyperCel填料基质也属于本领域技术人员的公知常识。
术语“抗体”意指由四个多肽链即两个重链(H)和两个轻链(L)通过二硫键相互连接构成的免疫球蛋白分子。
本发明有益效果在于：
本发明通过加入苯丁酸钠，可以降低抗体酸性峰的比例。同时样品可以直接上样，可以缩短整个纯化时间，减少操作步骤，减少抗体的损失。该纯化工艺具有对酸性峰去除效果好、抗体的回收率高等特点，整个工艺操作简单易行，重复性好，纯化效果理想。
具体实施方式
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。
实施方案中所用的原料及耗材均可以通过商业途径或公知途径自主获得。实施方案中用到的层析系统为GE公司的AKTApurifer，色谱柱为PallLRC15X080-200V01柱。实施方案中用到的色谱基质MEP-HyperCel为Pall公司的一款复合填料，具有疏水和离子交换两种机制，填料由4巯基乙基吡啶偶联刚性纤维素组成。SPsepharoseFF填料为阳离子交换树脂，填料由磺酸基团偶联6％的琼脂糖凝胶组成。
本发明实施例中使用的是CHO细胞表达的阿达木单抗(adalimumab)的发酵液，将发酵罐下来的料液离心过滤后进行色谱纯化实验。本发明以下实施例是采用两步离心法，第一次离心用4000g/min，离心10min，将CHO细胞及大颗粒离心除去，收集上清液；第二次用8000g/min去除细胞碎片及细小颗粒，收集上清液。将离心后的料液板式过滤，经过浊度计检测料液浊度为6NTU，符合要求后用于以下实验。
实施例1
a.准备：取料液(抗体浓度为2.32mg/ml)400ml，使用GE公司的层析系统AKTApurifer，选用PallLRC15X080-200V01柱，内含30mlMEP-HyperCel填料。样品和柱子始终保持在4℃。
b.平衡：平衡缓冲液为150mmol/LPBS(pH7.3)，保持流速为4.5ml/min。
c.上样：每毫升填料上样量为29.4mg抗体，上样体积为380ml。
d.冲洗：用150mmol/LPBS(pH7.3)的平衡缓冲液去冲洗至基线平稳。
e.洗脱：分两步洗脱，洗脱缓冲液一为：30mmol/L柠檬酸盐+10mmol/L苯丁酸钠(pH6.5)，洗脱出一个峰为酸性峰杂质舍弃。待平衡后，用洗脱缓冲液二：50mmol/L柠檬酸盐+10mmol/L苯丁酸钠(pH7.0)进行洗脱，收集目标峰，大约得到40ml。
参照组1同上述相同方法准备、平衡、上样、冲洗，但洗脱缓冲液中均不加苯丁酸钠，其余条件同上。
检测酸性峰的方法参考文献《离子交换色谱对抗VEGFR2单抗的电荷异质性分析》中的检测方法，使用高分辨率的离子交换柱检测纯化后抗体中酸性峰的比例。其检测结果显示，相同洗脱条件下，添加苯丁酸钠的洗脱缓冲液洗脱收集的目标峰中的酸性峰为未添加有苯丁酸钠的洗脱缓冲液洗脱收集的目标峰含量的80％，证明在洗脱液中添加苯丁酸钠后对阿达木单抗中的酸性峰的去除效果有明显改进。
实施例2
a.准备：取400ml料液(抗体浓度为2.41mg/ml)加入2倍体积的水稀释，加0.2M醋酸调节pH至7.1，过滤，此时料液体积为1.2L。使用GE公司的层析系统AKTApurifer，选用PallLRC15X080-200V01柱，内含25mlSPsepharoseFF填料。样品和柱子始终保持在4℃。
b.平衡：平衡缓冲液为31mmol/LPBS(pH7.3)，保持流速为4ml/min。
c.上样：每毫升填料上样量为38.6mg抗体，上样体积为1200ml。
d.冲洗：用40mmol/LPBS(pH7.3)的平衡缓冲液去冲洗至基线平稳。
e.洗脱：用洗脱缓冲液40mmol/LPBS+200mmol/LNaCl+10mmol/L苯丁酸钠(pH7.3)洗脱，分离出两个峰，收集第一个峰。
参照组2同上述相同方法准备、平衡、上样、冲洗，但洗脱缓冲液中均不加苯丁酸钠，其余条件同上。
检测两组目标峰酸性峰的含量，其检测方法同实施例1，其检测结果显示，同样洗脱条件下，添加有苯丁酸钠的洗脱缓冲液洗脱收集的目标峰中的酸性峰为未添加有苯丁酸钠的洗脱缓冲液洗脱收集的目标峰含量的85％，证明添加苯丁酸钠对阿达木单抗的酸性峰去除有明显改进。
实施例3
a.准备：取料液(抗体浓度为2.54mg/ml)450ml，使用GE公司的层析系统AKTApurifer，选用PallLRC15X080-200V01柱，内含30mlMEP-HyperCel填料。样品和柱子始终保持在8℃。
b.平衡：平衡缓冲液为150mmol/LPBS(pH7.3)，保持流速为4.5ml/min。
c.上样：每毫升填料上样量为38.1mg抗体，上样体积为450ml。
d.冲洗：用150mmol/LPBS(pH7.3)的平衡缓冲液去冲洗至基线平稳。
e.洗脱：分两步洗脱，洗脱缓冲液一为：30mmol/L柠檬酸盐+5mmol/L苯丁酸钠(pH6.4)，洗脱出一个峰为酸性峰杂质舍弃。待平衡后，用洗脱缓冲液二：50mmol/L柠檬酸盐+5mmol/L苯丁酸钠(pH7.2)进行洗脱，收集目标峰，大约得到43ml。
参照组3同上述相同方法准备、平衡、上样、冲洗，但洗脱缓冲液中均不加苯丁酸钠，其余条件同上。
检测两组目标峰酸性峰的含量，其检测方法同实施例1，其检测结果显示，同样洗脱条件下，添加有苯丁酸钠的洗脱缓冲液洗脱收集的目标峰中的酸性峰为未添加有苯丁酸钠的洗脱缓冲液洗脱收集的目标峰含量的75％，证明添加苯丁酸钠对阿达木单抗的酸性峰去除有明显改进。
实施例4
a.准备：取450ml料液(料液浓度为2.54mg/ml)加入2倍体积的水稀释，加0.2M醋酸调节pH至7.1，过滤，此时料液体积为1.35L。使用GE公司的层析系统AKTApurifer，选用PallLRC15X080-200V01柱，内含25mlSPsepharoseFF填料。样品和柱子始终保持在8℃。
b.平衡：平衡缓冲液为31mmol/LPBS(pH7.3)，保持流速为4ml/min。
c.上样：每毫升填料上样量为45.7mg抗体，上样体积为1.35L。
d.冲洗：用40mmol/LPBS(pH7.3)的平衡缓冲液去冲洗至基线平稳。
e.洗脱：用洗脱缓冲液40mmol/LPBS+200mmol/LNaCl+5mmol/L苯丁酸钠(pH7.3)洗脱，分离出两个峰，收集第一个峰。
参照组4同上述相同方法准备、平衡、上样、冲洗，但洗脱缓冲液中均不加苯丁酸钠，其余条件同上。
检测两组目标峰酸性峰的含量，其检测方法同实施例1，其检测结果显示，同样洗脱条件下，添加有苯丁酸钠的洗脱缓冲液洗脱收集的目标峰中的酸性峰为未添加有苯丁酸钠的洗脱缓冲液洗脱收集的目标峰含量的79％，证明添加苯丁酸钠对阿达木单抗的酸性峰去除有明显改进。
结论：通过低温上样和添加脱乙酰化酶(HDAC)酶抑制剂苯丁酸钠可以显著降低酸性峰的比例，达到去除酸性峰的效果，减轻下一步纯化的负担。

Claims (7)

1.苯丁酸钠在抗体酸性峰纯化中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，苯丁酸钠在含抗体溶液中的浓度为5～10mmol/L。
3.一种纯化抗体酸性峰的方法，其特征在于，在抗体与色谱基质接触的洗脱溶剂中加入苯丁酸钠。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，苯丁酸钠的浓度为5～10mmol/L。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，还包含在2～8℃下，使用MEP-HyperCel填料进行电导率由小变大的缓冲液洗脱。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述电导率由小变大的缓冲液洗脱为两步洗脱。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述两步洗脱条件为：
a)使用pH为6.3～6.5，含30mmol/L柠檬酸盐、5～10mmol/L苯丁酸钠的缓冲液洗脱；
b)使用pH为7.0～7.2，含50mmol/L柠檬酸盐、5～10mmol/L苯丁酸钠的缓冲液洗脱。
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9499616B2 (en) 2013-10-18 2016-11-22 Abbvie Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US9505834B2 (en) 2011-04-27 2016-11-29 Abbvie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
US9522953B2 (en) 2013-10-18 2016-12-20 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US9550826B2 (en) 2013-11-15 2017-01-24 Abbvie Inc. Glycoengineered binding protein compositions
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9683033B2 (en) 2012-04-20 2017-06-20 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
US9688752B2 (en) 2013-10-18 2017-06-27 Abbvie Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US9708399B2 (en) 2013-03-14 2017-07-18 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9708400B2 (en) 2012-04-20 2017-07-18 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
WO2018045587A1 (zh) * 2016-09-12 2018-03-15 广东东阳光药业有限公司 一种抗vegf类单克隆抗体的纯化方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHAMUEL YANNAL: "《Dictionary of Food Compounds with CD-ROM, Seccond Edition》", 23 October 2012, ISBN 9781420083514 *
刘美: "GS-CHO细胞培养工艺优化", 《东北农业大学硕士学位论文》 *
夏海锋，等: "疏水性电荷诱导层析——原理、性能及其应用", 《化工进展》 *
童红飞,等: "疏水性电荷诱导层析纯化免疫球蛋白IgY", 《化工学报》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9505834B2 (en) 2011-04-27 2016-11-29 Abbvie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
US9683033B2 (en) 2012-04-20 2017-06-20 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
US9957318B2 (en) 2012-04-20 2018-05-01 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
US9708400B2 (en) 2012-04-20 2017-07-18 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
US9708399B2 (en) 2013-03-14 2017-07-18 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9688752B2 (en) 2013-10-18 2017-06-27 Abbvie Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US9499616B2 (en) 2013-10-18 2016-11-22 Abbvie Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9522953B2 (en) 2013-10-18 2016-12-20 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US9550826B2 (en) 2013-11-15 2017-01-24 Abbvie Inc. Glycoengineered binding protein compositions
WO2018045587A1 (zh) * 2016-09-12 2018-03-15 广东东阳光药业有限公司 一种抗vegf类单克隆抗体的纯化方法

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