JPH05142223A - アミノ酸とノルロイシンの同時分離法 - Google Patents
アミノ酸とノルロイシンの同時分離法Info
- Publication number
- JPH05142223A JPH05142223A JP30152191A JP30152191A JPH05142223A JP H05142223 A JPH05142223 A JP H05142223A JP 30152191 A JP30152191 A JP 30152191A JP 30152191 A JP30152191 A JP 30152191A JP H05142223 A JPH05142223 A JP H05142223A
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- Japan
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- amino acid
- eluate
- norleucine
- eluent
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Abstract
(57)【要約】
【目的】非天然型のアミノ酸であるノルロイシンと天然
型アミノ酸の分離を高速対応型の高架橋度イオン交換樹
脂で可能にすることで、カラムコストの低減と一本化を
実現する。 【構成】表１の組成を有した溶離液１〜３を電磁弁４〜
６で任意に切り換えポンプ８で溶液を送液する。途中オ
ートサンプラ１０からサンプルを注入し分離カラム１１
で各成分に分離した後、ニンヒドリン反応液１４を加え
反応コイル１５で効率良く発色させ検出器１６にて検出
された信号をデータ処理器１７に送信して定量計算をす
るものである。 【効果】高架橋度イオン交換樹脂による、アミノ酸とノ
ルロシインの分離がカラムの一本化でも可能になった。
型アミノ酸の分離を高速対応型の高架橋度イオン交換樹
脂で可能にすることで、カラムコストの低減と一本化を
実現する。 【構成】表１の組成を有した溶離液１〜３を電磁弁４〜
６で任意に切り換えポンプ８で溶液を送液する。途中オ
ートサンプラ１０からサンプルを注入し分離カラム１１
で各成分に分離した後、ニンヒドリン反応液１４を加え
反応コイル１５で効率良く発色させ検出器１６にて検出
された信号をデータ処理器１７に送信して定量計算をす
るものである。 【効果】高架橋度イオン交換樹脂による、アミノ酸とノ
ルロシインの分離がカラムの一本化でも可能になった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、高架橋度の陽イオン交
換樹脂を用いる液体クロマトグラフィーにおける、アミ
ノ酸と内部標準物質としてのノルロイシンの一斉分離法
に関する。
換樹脂を用いる液体クロマトグラフィーにおける、アミ
ノ酸と内部標準物質としてのノルロイシンの一斉分離法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、アミノ酸の分析は、液体クロマト
グラフィーを利用するものが一般的となっている。最も
一般的なものは、イオン交換樹脂をカラムに充填した固
定相と、クエン酸ナトリウム緩衝液を移動相にして行う
方法である。この方法において効率良くアミノ酸を分離
するには、固定相であるイオン交換樹脂の選択と移動相
の濃度およびｐＨによっている。
グラフィーを利用するものが一般的となっている。最も
一般的なものは、イオン交換樹脂をカラムに充填した固
定相と、クエン酸ナトリウム緩衝液を移動相にして行う
方法である。この方法において効率良くアミノ酸を分離
するには、固定相であるイオン交換樹脂の選択と移動相
の濃度およびｐＨによっている。
【０００３】一方、最近のアミノ酸分析における傾向と
して、分析時間の短縮化が進み初期段階の分析計で２４
時間かかっていたものが、現在では０.５時間と短縮さ
れてきた。これら高速化の最大の改善点は、固定相であ
るイオン交換樹脂の形態の変化に他ならない。つまり高
速分析を可能にするためには、樹脂の粒径を小さくし、
カラム内の線速度を上げることである。そのため樹脂の
形態は、ランダムな破砕状から完全な球形へと変化し、
さらに粒径の均一化を図ることにより分離の向上と高速
化が同時に達成されてきた。
して、分析時間の短縮化が進み初期段階の分析計で２４
時間かかっていたものが、現在では０.５時間と短縮さ
れてきた。これら高速化の最大の改善点は、固定相であ
るイオン交換樹脂の形態の変化に他ならない。つまり高
速分析を可能にするためには、樹脂の粒径を小さくし、
カラム内の線速度を上げることである。そのため樹脂の
形態は、ランダムな破砕状から完全な球形へと変化し、
さらに粒径の均一化を図ることにより分離の向上と高速
化が同時に達成されてきた。
【０００４】しかし、高速化が進む一方、樹脂にとって
はかなりの負荷がかかり樹脂そのものに歪を生じる結果
となった。そこで高速対応の樹脂として架橋度を上げる
ことが検討され、８％から１０％、そして現在は１２％
以上にまでなった。これにより耐圧性の高い高速対応型
の樹脂となり、現在の高速分析を可能にした。一方、ノ
ルロイシンは、非天然形のアミノ酸であることから内部
標準物質として定量精度向上のために有用な成分であ
る。しかし、架橋度が上がるにつれて、アミノ酸とノル
ロイシンの分離に影響を与えるようになった。その結果
架橋度が１２％になるとアミノ酸とノルロイシンは、全
く重なり分離が不可となった。そのためアミノ酸とノル
ロイシンを同時に分離する場合は、架橋度を１０％以下
の樹脂にして、耐圧性の低さから溶離液の流量を下げ長
い時間をかけて分析する方法を取ってきた。
はかなりの負荷がかかり樹脂そのものに歪を生じる結果
となった。そこで高速対応の樹脂として架橋度を上げる
ことが検討され、８％から１０％、そして現在は１２％
以上にまでなった。これにより耐圧性の高い高速対応型
の樹脂となり、現在の高速分析を可能にした。一方、ノ
ルロイシンは、非天然形のアミノ酸であることから内部
標準物質として定量精度向上のために有用な成分であ
る。しかし、架橋度が上がるにつれて、アミノ酸とノル
ロイシンの分離に影響を与えるようになった。その結果
架橋度が１２％になるとアミノ酸とノルロイシンは、全
く重なり分離が不可となった。そのためアミノ酸とノル
ロイシンを同時に分離する場合は、架橋度を１０％以下
の樹脂にして、耐圧性の低さから溶離液の流量を下げ長
い時間をかけて分析する方法を取ってきた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記の低架橋度（８％
〜１０％）樹脂を用いて、ノルロイシンを含むアミノ酸
分析は、次のような欠点を有している。
〜１０％）樹脂を用いて、ノルロイシンを含むアミノ酸
分析は、次のような欠点を有している。
【０００６】１．アミノ酸のみの分析と、ノルロイシン
を含む場合とでは、分析目的に応じて二種類のカラムを
用意しなければならず、それによるコスト高と交換に伴
う作業性の低下および内部標準物質としての意味の低下
を生ずる。
を含む場合とでは、分析目的に応じて二種類のカラムを
用意しなければならず、それによるコスト高と交換に伴
う作業性の低下および内部標準物質としての意味の低下
を生ずる。
【０００７】２．ノルロイシンを含むアミノ酸分析の樹
脂は、架橋度が低いため耐圧性が低く高速分析には不適
である。
脂は、架橋度が低いため耐圧性が低く高速分析には不適
である。
【０００８】本発明は、上記の欠点を排除し、高速化に
適応した高架橋度陽イオン交換樹脂により、全ての分析
を行う技術を提供することにある。
適応した高架橋度陽イオン交換樹脂により、全ての分析
を行う技術を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】アミノ酸は、その分子構
造から両性イオンを形成すると言われている。すなわち
溶離液のｐＨを変化させることにより、分子の電気的チ
ャージが正にも負にも変化する。これら分子の持つ電気
的性質を基にしてそれぞれのアミノ酸を分離してきた。
また、これらの分離を効率的に行うために、ｐＨおよび
塩濃度を変えた溶離液を何種類か用意し、各アミノ酸グ
ループに合った溶離液の切り換えによって行ってきた。
造から両性イオンを形成すると言われている。すなわち
溶離液のｐＨを変化させることにより、分子の電気的チ
ャージが正にも負にも変化する。これら分子の持つ電気
的性質を基にしてそれぞれのアミノ酸を分離してきた。
また、これらの分離を効率的に行うために、ｐＨおよび
塩濃度を変えた溶離液を何種類か用意し、各アミノ酸グ
ループに合った溶離液の切り換えによって行ってきた。
【００１０】ここで一般的にアミノ酸は、その溶出の度
合いによって酸性，中性，塩基性グループに分類され、
天然形のアミノ酸でないノルロイシンは、イソロイシイ
ン，ロイシンの後に溶出されるが、樹脂の架橋度が上が
っていくとこれらの成分が重なり分離ができなくなる。
合いによって酸性，中性，塩基性グループに分類され、
天然形のアミノ酸でないノルロイシンは、イソロイシイ
ン，ロイシンの後に溶出されるが、樹脂の架橋度が上が
っていくとこれらの成分が重なり分離ができなくなる。
【００１１】本発明では、イソロイシン，ロイシンとノ
ルロイシンがわずかに異なる等電点を利用して、第二溶
離液のｐＨを４.２〜４.３から３.９０〜４.０５に下げ
ることによりイオン解離度に変化を与えことで、中性グ
ループにノルロイシンが入っていても十分に分離するこ
とを可能にした。
ルロイシンがわずかに異なる等電点を利用して、第二溶
離液のｐＨを４.２〜４.３から３.９０〜４.０５に下げ
ることによりイオン解離度に変化を与えことで、中性グ
ループにノルロイシンが入っていても十分に分離するこ
とを可能にした。
【００１２】
【作用】アミノ酸は、その分子構造の中に−ＮＨ2 基と
−ＣＯＯＨ基を持つことに特徴がある。これらは、溶離
液のｐＨが低い場合は−ＮＨ3+となり、スルホン酸形の
陽イオン交換樹脂中でイオン交換を生じ保持される。
−ＣＯＯＨ基を持つことに特徴がある。これらは、溶離
液のｐＨが低い場合は−ＮＨ3+となり、スルホン酸形の
陽イオン交換樹脂中でイオン交換を生じ保持される。
【００１３】 Ｒ−ＳＯ3Ｎａ＋Ｒ−ＮＨ3+ → Ｒ−ＳＯ3-…ＮＨ3−Ｒ＋Ｎａ+ …(化１) ここでｐＨの異なる溶離液を切り換えていくと、イオン
の解離度がそれぞれのアミノ酸で異なるため順次溶出さ
れてくる。
の解離度がそれぞれのアミノ酸で異なるため順次溶出さ
れてくる。
【００１４】一方、ノルロイシンは中性グループに属
し、イソロイシンおよびロイシンとは構造異性体の関係
にある。そのため低架橋度樹脂では、イオン交換能力の
他にゲル濾過的な要素により分離していた。しかし、架
橋度が上がるにつれゲル濾過的な効果がなくなり分離が
不可能となった。そこで本発明においては、わずかに異
なるイオンの解離定数に着目してｐＨを４.２〜４.３か
ら３.９０〜４.０５に下げてみた。 ノルロイシ
ン PKa=2.39 PKb=9.76 イソロイシン PKa=2.36 PKb=9.60 ロイシン PKa=2.36 PKb=9.68 ｐＨを従来の値から３.９０〜４.０５にするにより、中
性グループのアミノ酸のイオン解離状態に変化を与えら
れる。これによって生じるイオン交換樹脂に対する交換
力の作用を利用した。
し、イソロイシンおよびロイシンとは構造異性体の関係
にある。そのため低架橋度樹脂では、イオン交換能力の
他にゲル濾過的な要素により分離していた。しかし、架
橋度が上がるにつれゲル濾過的な効果がなくなり分離が
不可能となった。そこで本発明においては、わずかに異
なるイオンの解離定数に着目してｐＨを４.２〜４.３か
ら３.９０〜４.０５に下げてみた。 ノルロイシ
ン PKa=2.39 PKb=9.76 イソロイシン PKa=2.36 PKb=9.60 ロイシン PKa=2.36 PKb=9.68 ｐＨを従来の値から３.９０〜４.０５にするにより、中
性グループのアミノ酸のイオン解離状態に変化を与えら
れる。これによって生じるイオン交換樹脂に対する交換
力の作用を利用した。
【００１５】
【実施例】以下本発明の実施例を図１，図２より説明す
る。
る。
【００１６】図１は、本発明を実施するための液体クロ
マトグラフの流路系を示す概略図である。溶離液１〜２
は、分離に用いる液体を示す。溶離液３は、カラムに残
存する成分を分析後洗浄するのを主な目的するものであ
る。電磁弁４〜６は、任意の割合で溶離液を混合するこ
とが可能なものである。すなわち第一溶離液は、溶離液
１を用い、第二溶離液には溶離液１と溶離液３を任意の
割合で混合し、ｐＨを４.０ に調製したものを用い、第
三溶離液には、溶離液３を用い分析するものである。
マトグラフの流路系を示す概略図である。溶離液１〜２
は、分離に用いる液体を示す。溶離液３は、カラムに残
存する成分を分析後洗浄するのを主な目的するものであ
る。電磁弁４〜６は、任意の割合で溶離液を混合するこ
とが可能なものである。すなわち第一溶離液は、溶離液
１を用い、第二溶離液には溶離液１と溶離液３を任意の
割合で混合し、ｐＨを４.０ に調製したものを用い、第
三溶離液には、溶離液３を用い分析するものである。
【００１７】これら溶離液は、ポンプ８によりカラム系
へ送液される。アンモニアトッラプカラム９は、前述の
溶離液中のアンモニアをアミノ酸分析の間除去するもの
である。次に、オートサンプラ１０よりサンプルを注入
し、分離カラム１１ヘ送る。９および１１のカラムサイ
ズは、それぞれ４.６ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ４０ｍｍ，４.６ｍ
ｍＩ．Ｄ．Ｘ６０ｍｍで前者は、日立カスタムイオン交
換樹脂２６５０Ｌが充填されており、後者には、架橋度
１２％，粒径３μｍのスルホン酸形陽イオン交換樹脂を
充填した。カラム１１からの溶出液は、ニンヒドリン反
応液をポンプ１３で０.２０ ｍｌ／ｍｉｎの流量で送液
したものとミキサ１２で混合し、反応チュ−ブ１５で１
３０℃に加熱され、その後検出器１６で５７０ｎｍおよ
び440ｎｍの可視光の吸収として検出され、デ−タ処理
機１７で計算される。ここで反応チューブは、０.２５
ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ７ｍのテフロンチュ−ブを用いた。
へ送液される。アンモニアトッラプカラム９は、前述の
溶離液中のアンモニアをアミノ酸分析の間除去するもの
である。次に、オートサンプラ１０よりサンプルを注入
し、分離カラム１１ヘ送る。９および１１のカラムサイ
ズは、それぞれ４.６ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ４０ｍｍ，４.６ｍ
ｍＩ．Ｄ．Ｘ６０ｍｍで前者は、日立カスタムイオン交
換樹脂２６５０Ｌが充填されており、後者には、架橋度
１２％，粒径３μｍのスルホン酸形陽イオン交換樹脂を
充填した。カラム１１からの溶出液は、ニンヒドリン反
応液をポンプ１３で０.２０ ｍｌ／ｍｉｎの流量で送液
したものとミキサ１２で混合し、反応チュ−ブ１５で１
３０℃に加熱され、その後検出器１６で５７０ｎｍおよ
び440ｎｍの可視光の吸収として検出され、デ−タ処理
機１７で計算される。ここで反応チューブは、０.２５
ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ７ｍのテフロンチュ−ブを用いた。
【００１８】また、溶離液１〜３は、表１に示す組成の
ものを使用した。分離カラム１１の温度設定は、スタ−
ト時に５７℃とし、４０分後に５２℃，７２分後に５０
℃，９５分後に５７℃に戻すようにした。溶離液の切り
換えは、溶離液１が０〜１０分の間、混合した溶離液は
１０〜４６分、溶離液２は４６〜８０分、溶離液３は８
０〜９５分、そして９５〜１６０分の間再度溶離液１を
送液する行程を１分析サイクルとした。
ものを使用した。分離カラム１１の温度設定は、スタ−
ト時に５７℃とし、４０分後に５２℃，７２分後に５０
℃，９５分後に５７℃に戻すようにした。溶離液の切り
換えは、溶離液１が０〜１０分の間、混合した溶離液は
１０〜４６分、溶離液２は４６〜８０分、溶離液３は８
０〜９５分、そして９５〜１６０分の間再度溶離液１を
送液する行程を１分析サイクルとした。
【００１９】図２は、上記条件下で得られたクロマトグ
ラムの例を示しており、サンプルは、標準品混合物各２
ｎｍｏｌ／１０μｌ（プロリンのみ４ｎｍｏｌ／１０μ
ｌ）を含み、検出は、５７０ｎｍの波長で行った結果で
ある。
ラムの例を示しており、サンプルは、標準品混合物各２
ｎｍｏｌ／１０μｌ（プロリンのみ４ｎｍｏｌ／１０μ
ｌ）を含み、検出は、５７０ｎｍの波長で行った結果で
ある。
【００２０】
【表１】
【００２１】
【発明の効果】本発明によれば、高架橋度のイオン交換
樹脂を用いて、ノルロイシンを含むアミノ酸分析が可能
となり、高速分析に適している。
樹脂を用いて、ノルロイシンを含むアミノ酸分析が可能
となり、高速分析に適している。
【００２２】また、カラム交換が不要となり、カラムコ
ストが半分になる効果を生む。
ストが半分になる効果を生む。
【図１】本発明を実施するための、液体クロマトグラフ
の流路系を示す概略図である。
の流路系を示す概略図である。
【図２】本発明による、１２％架橋度の樹脂による分離
状態を示すクロマトグラフを示す図である。
状態を示すクロマトグラフを示す図である。
１〜２…分離用溶離液、３…カラム再生用溶離液、４〜
６…電磁弁、７…マニホールド、８…送液ポンプ、９…
アンモニアトッラプカラム、１０…オートサンプラ、１
１…分離カラム、１２…ミキサ、１３…送液ポンプ、１
４…ニンヒドリン反応液、１５…反応コイル、１６…検
出器、１７…データ処理器。
６…電磁弁、７…マニホールド、８…送液ポンプ、９…
アンモニアトッラプカラム、１０…オートサンプラ、１
１…分離カラム、１２…ミキサ、１３…送液ポンプ、１
４…ニンヒドリン反応液、１５…反応コイル、１６…検
出器、１７…データ処理器。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 石川 昌子 茨城県勝田市堀口字長久保832番地２ 日 立計測エンジニアリング株式会社内
Claims (1)
- 【請求項１】複数の溶離液と１２％を越える架橋度を有
するスチレン＝ジビニルベンゼン共重合体をベ−スとし
たスルホン酸形陽イオン交換樹脂カラムを用いた液体ク
ロマトグラフの分離系において、逐次クエン酸ナトリウ
ム緩衝液の濃度を高くしながらアミノ酸を溶出させると
き、第二溶離液にｐＨ３.９０から４.０５のクエン酸ナ
トリウム緩衝液を用いて、中性アミノ酸グループに溶出
してくるノルロイシンをアミノ酸と分離溶出させること
を特徴とする、アミノ酸とノルロイシンの同時分離法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30152191A JPH05142223A (ja) | 1991-11-18 | 1991-11-18 | アミノ酸とノルロイシンの同時分離法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30152191A JPH05142223A (ja) | 1991-11-18 | 1991-11-18 | アミノ酸とノルロイシンの同時分離法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05142223A true JPH05142223A (ja) | 1993-06-08 |
Family
ID=17897935
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30152191A Pending JPH05142223A (ja) | 1991-11-18 | 1991-11-18 | アミノ酸とノルロイシンの同時分離法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05142223A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009031201A (ja) * | 2007-07-30 | 2009-02-12 | Hitachi High-Technologies Corp | 液体クロマトグラフ／質量分析計 |
| JPWO2010100914A1 (ja) * | 2009-03-04 | 2012-09-06 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 液体クロマトグラフ及び分析方法 |
| CN114137120A (zh) * | 2021-11-29 | 2022-03-04 | 赛诺神畅医疗科技有限公司 | 一种雷帕霉素药物支架中有关物质的检测方法 |
-
1991
- 1991-11-18 JP JP30152191A patent/JPH05142223A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009031201A (ja) * | 2007-07-30 | 2009-02-12 | Hitachi High-Technologies Corp | 液体クロマトグラフ／質量分析計 |
| JPWO2010100914A1 (ja) * | 2009-03-04 | 2012-09-06 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 液体クロマトグラフ及び分析方法 |
| CN114137120A (zh) * | 2021-11-29 | 2022-03-04 | 赛诺神畅医疗科技有限公司 | 一种雷帕霉素药物支架中有关物质的检测方法 |
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