KR101847004B1 - 표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 단편들의 활성탄을 이용한 제거 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특정 유형의 탄소질 물질을 포함하는 신규하고 개선된 단백질 정제 공정을 제공하며, 소망하는 단백질 생성물 수율에 나쁜 영향을 주지 않고도 단백질 단편의 선택적 제거를 초래한다.

Description

표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 단편들의 활성탄을 이용한 제거{REMOVAL OF FRAGMENTS FROM A SAMPLE CONTAINING A TARGET PROTEIN USING ACTIVATED CARBON}

본 발명은 샘플로부터 표적 단백질의 단편들을 제거하기 위한 활성탄의 용도에 관한 것이다.

단백질, 예컨대, 단일클론 항체를 정제하기 위해 가장 일반적으로 이용되는 공정은 단백질을 세포 배양 배지로 분비할 수 있는 조작된 세포주(예컨대, CHO 세포주)를 전형적으로 이용한다. 관심있는 단백질을 함유하는 배지(medium) 또는 세포 배양 공급물(cell culture feed)은 이어 일련의 정제 단계를 거쳐 다양한 불순물, 예컨대, 세포, 세포 파쇄물, DNA, 숙주 세포 단백질 등으로부터 상기 단백질을 분리한다.

전형적인 정제 공정은 대개 단백질을 함유하는 세포 배양 공급물 또는 지를 정화단계(clarification step)에 처리시킨 다음, 상기 정화된 세포 배양 공급물을 항체 포획 단계(예컨대, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계)에 처리시키고, 이어 양이온 교환 결합/용리(bind/elute) 크로마토그래피 단계 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 처리시키는 것을 포함한다.

상기 정제 공정에서의 다양한 단계들은 단백질을 함유하는 세포 배양 공급물 중의 불순물을 제거하기 위해 고안된 것이나, 바람직하지 않은 단백질의 단편들은 무손상(intact) 단백질과 동일한 다수의 특성을 공유하기 때문에 흔히 제거하기가 어렵다.

활성탄은 이전에는 공기 필터(참조, 예컨대, 미국 특허번호 6,413,303호), 가스 정제(참조, 예컨대, 미국 특허번호 7,918,923호), 카페인제거(참조, 예컨대, 미국 특허번호 4,481,223호), 금 정제(참조, 예컨대, 미국 특허번호 5,019,162호), 연료 정제(참조, 예컨대, 미국 공개번호 2006/0223705A1호), 혈액관류(참조, 예컨대, 미국 특허번호 4,048,064호), 독극물중독 및 남용의 치료(참조, 예컨대, 미국 특허번호 4,453,929호), 폐수 처리(참조, 예컨대, 미국 특허번호 8,329,035호), 유출물 청정화(참조, 예컨대, 미국 특허번호 4,770,715호), 지하수 교정(참조, 예컨대, 미국 특허번호 6,116,816호), 자동차 연료 시스템으로부터 휘발성 유기 화합물의 포획(참조, 예컨대, 미국 특허번호 7,044,112호), 화학적 정제(참조, 예컨대, 미국 특허번호 4,906,445호), 증류된 알코올 음료 정제(참조, 예컨대, 미국 공개번호 US 2007/0248730A1호), 설탕의 탈색(참조, 예컨대, 미국 특허번호 2,082,425호), 인공호흡기(참조, 예컨대, 미국 특허번호 5,714,126호), 가스 마스크(참조, 예컨대, 미국 특허번호 4,992,084호), 화학전쟁 보호복(참조, 예컨대, 미국 특허번호 7,877,819호), 및 정수 공정(참조, 예컨대, 미국 특허번호 7,537,695호)에 이용되어 왔다.

또한, 활성탄은 혈청 알부민으로부터 지방산 및 빌리루빈과 같은 소분자 불순물을 제거하기 위해 이용되어 왔다(참조, 예컨대, Chen et al., J. Biol. Chem., 242: 173-181(1967); Nakano et al., Anal Biochem., 129: 64-71(1983); Nikolaev et al., Int. J. Art. Org., 14:179-185(1991)). 활성탄은 또한 식물 바이러스를 정제하는 동안 안료뿐만 아니라 숙주 단백질, 프로테아제, 및 리보뉴클레아제를 제거하기 위해 사용되어 왔다(참조, 예컨대, Price, Am. J. Botany, 33: 45-54(1946); Corbett, Virology, 15:8-15(1961); McLeana et al., Virology, 31: 585-591(1967), 미국 공개번호 US 2006/0281075A1호). 부가적으로, 활성탄은 또한 플라스미드 DNA로부터 저분자량 플라스미드 단편을 제거하는데 유용한 것으로 기재되어 있다. 참조, Kim et al., J. Biosci. Bioeng. 110:608-613(2010).

또한, 전체 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함되는, 2012년 8월 2일 출원된 미국 특허출원 번호 13/565,463호는 관심있는 생체분자(예컨대, 항체)를 함유하는 샘플로부터 단백질성 불순물(예컨대, 숙주 세포 단백질) 및 DNA를 제거하기 위하여 다른 배지와 함께 활성탄을 사용하는 것을 개시한다.

최근들어, 참조에 의해 본 발명에 포함되는, 2013년 2월 26일 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/769,269호는 용액 조건을 변경하는 것에 의해 단백질의 혼합물로부터 일개 단백질을 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄을 사용하는 것을 개시한다.

발명의 요약

본 발명은 정제될 표적 단백질(예컨대, 단일클론 항체)을 함유하는 샘플로부터 단편(fragments)을 제거하기 위하여 활성탄이 사용될 수 있다는 놀랍고도 예상치 못한 발견을 적어도 일부 기본으로 하고 있다.

일부 실시양태에서, 정제될 표적 단백질을 포함하는 샘플에서 단편의 양을 감소시키기 위한 방법이 제공되며, 이 방법은

(a) 표적 단백질 및 단편을 포함하는 샘플을 제공하는 단계, 상기 단편은 표적 단백질의 양의 적어도 0.2% 이상(equal to or greater than)의 양으로 존재함;

(b) 상기 샘플을 활성탄과 접촉시키는 단계, 상기 활성탄은 단편과 결합함; 및

(c) 상기 샘플로부터 활성탄을 제거함으로써 샘플 중의 단편의 양을 감소시키는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 표적 단백질은 Fc-영역 함유 단백질이다. 다른 실시양태에서, 상기 표적 단백질은 비-면역글로불린(non-immunoglobulin) 단백질이다.

일부 실시양태에서, 상기 Fc-영역 함유 단백질은 항체, 예컨대, 단일클론 항체(monoclonal antibody) 또는 다중클론 항체(polyclonal antibody)이다.

일부 실시양태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 다른 실시양태에서, 항체는 다중클론 항체이다

일부 실시양태에서, 상기 단편은 표적 단백질의 양의 적어도 0.5% 이상의 양으로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단편은 표적 단백질의 양의 적어도 1% 이상의 양으로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단편은 표적 단백질의 양의 적어도 2% 이상의 양으로 존재한다.

일부 실시양태에서, 정제될 항체를 포함하는 샘플 중에서 항체 단편의 양을 감소시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은

(a) 항체 및 항체 단편을 포함하는 샘플을 제공하는 단계, 상기 항체 단편은 상기 항체 양의 적어도 0.2% 이상의 양으로 존재함;

(b) 상기 샘플을 활성탄과 접촉시키는 단계, 상기 활성탄은 상기 항체 단편과 결합함; 및

(c) 상기 샘플로부터 활성탄을 제거함으로써 샘플 중의 단편의 양을 감소시키는 단계;를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체 단편은 상기 항체 양의 적어도 0.5% 이상의 양으로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체 단편은 상기 항체 양의 적어도 1% 이상의 양으로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체 단편은 상기 항체 양의 적어도 2% 이상의 양으로 존재한다.

일부 실시양태에서, 상기 항체 단편은 단백질 A와 결합하는 단편을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 항체 단편은 단백질 A와 결합하지 않는다.

일부 실시양태에서, 상기 샘플은 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 수집된 용리액(eluate)이다.

일부 실시양태에서, 상기 활성탄은 장치에 팩킹(packing)된다. 예시적 장치는 예컨대, 컬럼(예컨대, 크로마토그래피 컬럼), 포드(pod), 디스크, 카트리지 및 캡슐을 포함한다.

다양한 실시양태에서, 본원 발명에 기재된 방법은 표적 단백질 또는 항체(경우에 따라)의 순도 증가를 초래한다. 표적 단백질 또는 항체의 순도는, 활성탄과 접촉되지 않은 샘플에 대하여, 예컨대 적어도 10% 정도, 또는 적어도 20% 정도, 또는 적어도 30% 정도, 또는 적어도 40% 정도, 또는 적어도 50% 정도, 또는 적어도 60% 정도, 또는 적어도 70% 정도, 또는 적어도 80% 정도, 또는 적어도 90% 정도, 또는 그 이상 증가할 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 표적 단백질-함유 샘플(또는 항체 함유 샘플)은 세포 배양 공급물이다. 다른 실시양태에서, 세포 배양액은 활성탄과 접촉하기 전에 먼저 정화되고 및/또는 정제된다. 정화 방법은, 비제한적으로, 원심분리, 침강, 심층여과(depth filtration), 스크린 여과, 응집, 자극 감응성 중합체의 사용 및 pH 변경을 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 샘플은 샘플을 본원 발명에 기재된 방법에 처리하기 전에 하나 이상의 정제 단계 또는 방법에 처리된다. 이러한 정제 단계 또는 방법은 비제한적으로, 결합 및 용리 모드 또는 플로우-쓰루(flow-through) 모드로 실시되는 컬럼 및/또는 막 크로마토그래피; 결정화; 2- 및 3-상 분배(two- and three-phase partitioning); 및 여과를 포함한다.

도 1은 활성탄 컬럼을 통과시키는 것에 의해 단일클론 항체 용액으로부터 단일클론 항체 단편을 제거하는 것을 나타내는 대표적 실험의 결과를 도시하는 그래프이다. 2.01%의 단편을 갖는 5.01 mg/mL의 MAB I를 함유하는 단편첨가된 MAB I 용액을 활성탄이 팩킹된 컬럼을 통과시켰다. X-축은 활성탄의 부피로 나눠진 컬럼을 통과한 단일클론 항체의 중량(kg/L)을 도시하고, 좌측 Y-축은 누적 분획 풀 중의 단편의 퍼센트를 도시하며, 또 우측 Y-축은 공급물 중의 단일클론 항체의 농도로 나눠진 누적 분획 풀 중의 단일클론 항체의 농도를 도시한다.
도 2는 활성탄의 컬럼을 통과시키는 것에 의해 단일클론 항체 용액으로부터 단백질 A를 결합하는 단일클론 항체 단편의 제거를 나타내는 대표적 실험의 결과를 도시하는 그래프이다. 3.50%의 단편을 갖는 7.13 mg/mL의 MAB III를 함유하는 단편첨가된 MAB III 용액을 활성탄이 팩킹된 컬럼을 통과시켰다. X-축은 활성탄의 부피로 나눠진 컬럼을 통과한 단일클론 항체의 중량(mg/mL)을 도시하고, 좌측 Y-축은 특정 컬럼 분획에 수집된 단일클론 항체 중의 단편의 퍼센트를 도시하며, 또 우측 Y-축은 공급물 중의 단일클론 항체의 농도로 나눠진 특정 컬럼 분획에서 단일클론 항체의 농도를 도시한다.
도 3은 활성탄이 팩킹된 컬럼을 통과시키는 것에 의해 단일클론 항체 용액으로부터 단백질 A와 결합하지 않는 단일클론 항체 단편을 제거하는 것을 나타내는 대표적인 실험의 결과를 도시하는 그래프이다. 4.84%의 단편을 갖는 1.27 mg/mL의 MAB III를 함유하는 단편첨가된 MAB III 용액을 활성탄 컬럼을 활성탄 컬럼을 통과시켰다. X-축은 활성탄의 부피로 나눠진 컬럼을 통과한 단일클론 항체의 중량(mg/mL)을 도시하고, 좌측 Y-축은 특정 컬럼 분획에 수집된 단일클론 항체 중의 단편의 퍼센트를 도시하며, 또 우측 Y-축은 공급물 중의 단일클론 항체의 농도로 나눠진 특정 컬럼 분획에서 단일클론 항체의 농도를 도시한다.
도 4는 정적 결합 조건하에서 활성탄으로 처리하는 것에 의해 낮은 용액 전도율(solution conductivity) 및 높은 용액 전도율에서 4.0 내지 9.0 범위의 용액 pH에 걸친 단일클론 항체 용액으로부터 단일클론 항체 단편의 제거를 나타내는 대표적 실험의 결과를 도시하는 그래프이다. 활성탄으로 처리된 pH 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 또는 9.0에서의 단편첨가된 MAB II 용액은 낮은 전도율 및 높은 전도율 모두에서 6.38-7.44 mg/mL의 MAB II 및 1.5-1.7%의 단편을 함유하였다. X-축은 용액 pH를 도시하고 또 Y-축은 미처리 용액 중의 단편의 퍼센트로 나눠진 처리된 용액 중의 단편의 퍼센트를 100%로부터 빼는 것에 의해 산출한 단일클론 항체 용액으로부터 제거된 단편의 퍼센트를 도시한다.

상세한 설명

본 발명은 정제될 표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 단편을 제거하기 위한 신규하고 개선된 방법을 제공한다.

단백질, 특히 항체의 정제 방법은 아주 잘 확립되어 있다. 단백질(예컨대, 단일클론 항체)을 정제하는 동안 흔히 이용되는 중요한 단계 중의 하나는 정제될 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드 또는 화합물을 흔히 적용하는 포획 또는 친화성 단계이다. 예를 들어, 단일클론 항체의 경우, 이러한 단계는 흔히 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 적용한다.

상기 포획 단계는 높은 퍼센트의 다양한 바람직하지 않은 성분(예컨대, 불순물)으로부터 표적 단백질을 분리하는데 유용한 반면에, 단편의 다수가 친화성 리간드와 상호작용하여 표적 단백질과 동일한 분획 내에 존재하게 되므로 상기 포획 단계는 표적 단백질을 함유하는 분획에서 표적 단백질의 단편의 양을 감소시키는데 는 효과적이지 않다. 단편은, 특히 당국의 승인을 필요로 하는 치료 단백질의 경우, 정제된 단백질로부터 제거필 필요가 있는 바람직하지 않은 불순물이다.

3개 유형의 매질(media)이 단편의 제거를 위해 일반적으로 기재되어 있다. 이들의 하나는 크기 배제 크로마토그래피이며, 이는 유체역학적 부피에서의 차이를 기본으로 하여 전체 단백질(예컨대, 단일클론 항체)로부터 단편을 분리한다. 그러나, 크기 배제 크로마토그래피는 분석 평가를 위해 가장 일반적으로 이용되며 또 단백질, 예컨대, 단일클론 항체의 실제 정제에 대한 정량을 하기가 곤란하다. 단편을 포함하는 다양한 불순물 제거에 유용한 것으로 기재된 다른 매질은 세라믹 히드록시아파타이트(참조, 예컨대, 미국 특허 공개 번호 US20100234577호)이다. 세라믹 히드록시아파타이트 응집된 항체 불순물을 결합 및 용리 모드로 제거하기 위해 가장 흔히 이용된다. 마지막으로, 혼합 모드 리간드는 소수성 전하 유도 크로마토그래피를 이용하여 결합 및 용리 모드로 단편을 분리하는데 유용한 것으로 기재되었다(참조, 예컨대, J. Chromatogr. B.; 755: 37-46(2001)).

활성탄은 이전에는 정수 공정에 사용되었다. 또한, 활성탄은 혈청 알부민으로부터 지방산 및 빌리루빈과 같은 소분자 불순물을 제거하기 위하여 사용되어 왔다(참조, 예컨대, Chen et al., J. Biol. Chem., 242: 173-181(1967); Nakano et al., Anal Biochem., 129: 64-71(1983); Nikolaev et al., Int. J. Art. Org., 14:179-185(1991)). 활성탄은 또한 식물 바이러스의 정제 동안 안료뿐만 아니라 숙주 단백질, 프로테아제, 및 리보뉴클레아제를 제거하기 위하여 사용되어 왔다(참조, 예컨대, Price, Am. J. Botany, 33: 45-54(1946); Corbett, Virology, 15:8-15(1961); McLeana et al., Virology, 31: 585-591(1967).

따라서, 활성탄은 용액 중의 분자(예컨대, 물 샘플 중의 불순물)에 비특이적으로 결합하는 것으로 보고되어 있다

최근, 활성탄은 단백질 정제 공정 동안 사용되는 것으로 기재되어 있다. 예를 들어, 전체 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함되는, 2012년 8월 2일 출원된 미국 특허출원 번호 13/565,463호는 관심있는 생체분자(예컨대, 항체)를 함유하는 샘플로부터 단백질성 불순물(예컨대, 숙주 세포 단백질) 및 DNA를 제거하기 위하여 다른 매질과 조합하여 활성탄을 사용하는 것을 개시한다. 또한, 참조에 의해 본 발명에 포함되는 2013년 2월 26일 출원된, 미국 특허 가출원 번호 61/769,269호는 용액 조건을 변경하는 것에 의해 단백질의 혼합물로부터 일개 단백질을 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄을 사용하는 것을 기재한다.

본 명세서의 실시예에 나타낸 바와 같이, 활성탄은 정제될 표적 단백질을 함유하는 샘플에서 표적 단백질의 단편의 양을 감소시키기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 활성탄은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 표적 단백질 및 단백질의 단편을 함유하는 용액 중의 표적 단백질의 순도를 증가시키기 위하여 사용될 수 있고, 활성탄을 사용한 단편의 제거는 샘플 중에서 표적 단백질의 순도 증가를 초래한다.

본 발명의 내용이 더욱 용이하게 이해되도록, 특정 용어를 먼저 정의한다. 부가적 정의는 상세한 설명을 통하여 설명된다.

I. 정의

본 발명에서 상호변경가능하게 사용되는 용어 "활성 탄소" 또는 "활성탄"은 그의 기공 구조를 향상시키는 공정에 처리된 탄소질 물질을 지칭한다. 활성탄은 때때로 또한 활성화 목탄이라고도 부른다. 활성탄은 매우 높은 표면적을 갖는 다공성 고체이다. 이들은 석탄, 목재, 코코넛 껍질, 견과껍질, 및 토탄을 비롯한 다양한 공급원으로부터 유도될 수 있다. 활성탄은 제어된 분위기하에서 가열을 비롯한 물리적 활성화 또는 강한 산, 염기, 또는 산화제를 사용한 화학적 활성화를 이용하여 이들 물질로부터 생성될 수 있다. 상기 활성화 공정들은 불순물 제거를 위한 높은 능력을 활성탄에게 제공하는 높은 표면적을 갖는 다공성 구조를 생성한다. 활성화 공정들은 표면의 산도를 제어하기 위하여 변형될 수 있다.

전형적인 활성화 공정들은 수지 폐기물, 석탄, 석탄 코크스, 석유 코크스, 리그나이트, 중합체 물질, 및 펄프 및 종이, 펄스 제조로부터 잔류물, 목재(목재 칩, 톱밥, 및 목재 가루와 같은), 견과 껍질(아몬드 껍질 및 코코넛 껍질), 알곡, 및 과일피트(올리브 및 체리 씨)를 포함한 리그노셀룰로오스 물질과 같은 탄소 공급원을 열적 공정(예컨대, 산화 가스 사용) 또는 화학적 공정(예컨대, 인산 또는 염화아연과 같은 금속염 사용)에 처리하는 것을 포함한다. 인산(H₃PO₄)을 사용한 목재-계 탄소의 화학적 활성화를 포함하는 예시적 공정은 미국 특허번호 Re. 31,093호에 개시되어 있고, 이는 탄소의 탈색 및 가스 흡착능 개선을 초래하였다. 또한, 미국 특허번호 5,162,286호는 특히 조밀하고 또 견과 껍질, 과일 씨, 및 알곡과 같이 비교적 높은(30%) 리그닌 함량을 함유하는 목재-계 물질의 인산 활성화를 개시한다. 리그노셀룰로오스 물질의 인산 활성화는 고활성 및 고밀도의 탄소 제조에서의 단계로서 또한 개시되어 있다. 상기 단락에 수록된 특허 각각의 가르침은 그 전체 내용이 참조에 의해 본 발명에 포함된다.

대부분의 다른 흡착성 물질과 대조적으로, 활성탄은 비교적 약한 반 데어 발스력 또는 런던 분산력을 이용하여 분자와 상호작용하는 것으로 생각된다. 전형적인 상업적 활성탄 제품은 당업계에서 잘 알려진 방법인 BET(Brunauer-Emmett-Teller)법을 기본으로 한 질소 흡착에 의해 측정된 바와 같이 적어도 300 m²/g의 표면적을 나타낸다.

활성 탄소 또는 활성탄은 이전에는 숙주 세포 단백질과 같은 불순물에 결합시키는 것에 의해 액체 및 가스의 정제하기 위한 공정뿐만 아니라 재조합적으로 발현된 항체를 다른 불순물로부터 정제하기 위한 공정에 사용되어 왔지만(참조, 예컨대, 미국 공개번호 13/565,463호), 샘플로부터 단편(예컨대, 항체 단편)을 제거하기 위해서 이전에는 사용되지 않았다.

일부 실시양태에서, 정제될 단백질(예컨대, 단일클론 항체) 및 정제될 표적 단백질의 양의 적어도 0.2% 이상의 양으로 존재하는 단편을 포함하는 샘플이 제공된다. 다른 실시양태에서, 상기 단편은 정제될 표적 단백질의 양의 적어도 0.5% 이상의 양으로 존재한다. 일반적으로, 단편의 제거 후에도 잔존하는 표적 단백질의 순도는 단편의 제거 이후에 증가한다. 순도가 증가하는 단백질을 표적 단백질이라 칭한다. 표적 단백질은 면역글로불린 또는 비-면역글로불린 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 표적 단백질은 면역글로불린 단백질, 예컨대, 단일클론 항체이다.

다음은 본 발명에 따라 정제될 수 있는 단백질의 예이다. 상기 논의된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 단일클론 항체이다. 표적 단백질의 다른 예는 재조합 단백질이며, 이는 비제한적으로, 재조합 인간 성장 호르몬, 재조합 인간 인슐린 재조합 모낭 자극 호르몬, 재조합 인자 VII(anti-hemophilic factor), 재조합 인간 에리트로포이에틴(erythropoietin), 재조합 과립구 콜로니 자극 인자, 재조합 알파-갈락토시다제 a, 재조합 이두로니다제(iduronidase), 재조합 갈술파제(galsulfase), 재조합 도르나제(dornase) 알파, 재조합 조직 플라스미노겐 활성화인자, 재조합 인간 인터페론, 재조합 인슐린-유사 성장 인자 1, 및 재조합 아스파라기나제를 포함한다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 표적 단백질은 인간 혈액 또는 기타 생리적 유체로부터 유도된 단백질이다. 이러한 단백질의 예는, 비제한적으로, 면역글로불린 G 및 M, 인자 VIII, 인자 IX, 항트롬빈 III, 및 알파-I-항트립신을 포함한다.

용어 "면역글로불린", "Ig" 또는 "항체"(본 명세서에 상호교환적으로 사용됨)는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어지는 기본적 4-폴리펩티드 사슬 구조를 갖고, 상기 사슬들은 예컨대, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 사슬간(interchain) 다이설파이드 결합에 의해 안정화된다. 용어 "단쇄 면역글로불린" 또는 "단쇄 항체"(본 명세서에 상호교환적으로 사용됨)는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄로 이루어지는 2-폴리펩티드 사슬 구조를 갖고, 상기 사슬들은 예컨대, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 사슬간 펩티드 링커에 의해 안정화된다. 용어 "도메인"은 예컨대, β-병풍구조(β-pleated sheet) 및/또는 사슬간 다이설파이드 결합에 의해 안정화된 펩티드 루프(예를 들어, 3 내지 4개 펩티드 루프)를 포함하는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 구상(globular) 영역을 지칭한다. 도메인은 또한 본 명세서에서 "불변(constant)" 도메인의 경우 다양한 종류의 멤버의 도메인 내에서 서열 변이의 상대적 결여, 또는 "가변(variable)" 도메인의 경우 다양한 종류의 멤버의 도메인 내에서 상당한 변이를 기본으로 하여 "불변" 또는 "가변"이라고 칭한다. 항체 또는 폴리펩티드 "도메인"은 흔히 당해 분야에서 상호교환적으로 항체 또는 폴리펩티드 "영역(region)"이라 칭한다. 항체 경쇄의 "불변" 도메인은 상호교환적으로 "경쇄 불변 영역", "경쇄 불변 도메인", "CL" 영역 또는 "CL" 도메인이라 칭한다. 항체 중쇄의 "불변" 도메인은 상호교환적으로 "중쇄 불변 영역", "중쇄 불변 도메인", "CH" 영역 또는 "CH" 도메인이라 칭한다. 항체 경쇄의 "가변" 도메인은 상호교환적으로 "경쇄 가변 영역", "경쇄 가변 도메인", "VL" 영역 또는 "VL" 도메인이라 칭한다. 항체 중쇄의 "가변" 도메인은 상호교환적으로 "중쇄 가변 영역", "중쇄 가변 도메인", "VH" 영역 또는 "VH" 도메인이라 칭한다.

면역글로불린 또는 항체는 단일클론성 또는 다중클론성일 수 있고 또 단량체 또는 중합체 형태로 존재할 수 있고, 예를 들어, 오량체 형태로 존재하는 IgM 항체 및/또는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 존재하는 IgA 항체를 포함한다. 면역글로불린 또는 항체는 또한 다중특이적 항체(예컨대, 2중특이적 항체)를 포함할 수 있다.

용어 "Fc 영역" 및 "Fc 영역 함유 단백질"은 단백질이 면역글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역 또는 도메인(앞서 정의한 바와 같은 CH 및 CL 영역)을 함유하는 것을 의미한다. "Fc 영역"을 함유하는 단백질은 면역글로불린 불변 도메인의 이팩터(effector) 기능을 보유할 수 있다. C_H2/C_H3 영역과 같은 "Fc 영역"은 단백질 A 또는 그의 기능적 변이체와 같은 친화성 리간드에 선택적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 영역 함유 단백질은 단백질 A 또는 그의 기능적 유도체, 변이체 또는 단편에 특이적으로 결합한다. 다른 실시양태에서, Fc 영역 함유 단백질은 단백질 G 또는 단백질 L, 또는 그의 기능적 유도체, 변이체 또는 단편에 특이적으로 결합한다.

상기 논의한 바와 같이, 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 Fc 영역 함유 단백질, 예컨대, 면역글로불린이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역 함유 단백질은 다른 폴리펩티드 또는 그의 단편에 융합된 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 재조합 단백질이다.

일반적으로, 면역글로불린 또는 항체는 관심있는 "항원"에 대한 것이다. 바람직하게는, 상기 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고 또 질병 또는 질환에 걸린 포유동물에 대한 항체의 투여는 그 포유동물에서 치료적 효과를 초래할 수 있다.

본 발명에서 상호변경가능하게 사용되는 용어 "단일클론 항체" 또는 "Mab"는 실질적으로 균질한 항체 군집으로부터 얻어진 항체를 지칭하며, 즉, 군집 중의 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 천연 산출 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원 부위에 대하여 생긴 것이다. 또한, 상이한 결정기(항원결정기)에 대한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상의 (다중클론) 항체와 대조적으로, 각 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대하여 생성된다. 수식어 "단일클론"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어지는 항체의 특징을 나타내며, 또 특정 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단일클론 항체는 Kohler et al., Nature 256:495(1975)에 의해 처음으로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(참조, 예컨대, 미국 특허번호 4,816,567호)에 의해 제조될 수 있다. "단일클론 항체"는 또한 Clackson et al., Nature 352:624-628(1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)에 기재된 수법을 이용하는 파아지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 단일클론 항체는 또한 "MAb" 또는 "mab" 또는 "mAb" 또는 "MAB"로도 지칭될 수 있다.

단일클론 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유도되거나 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동인 반면에, 상기 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유도되거나 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체뿐만 아니라, 소망하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 그러한 항체의 단편에서의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동인 "키메라" 항체(면역글로불린)를 더 포함할 수 있다(미국 특허번호 4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984)).

본 발명에서 사용될 때 용어 "초가변 영역"은 항원-결합에 관여하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 상기 초가변 영역은 경쇄 가변 도메인 중의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"(즉 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인 중의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)로부터의 아미노산 잔기; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)) 및/또는 "초가변 루프"(즉 경쇄 가변 도메인 중의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및 중쇄 가변 도메인 중의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))로부터의 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

비-인간(예컨대, 쥐) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 소망하는 특이성, 친화성, 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종(공여체 항체)으로부터 초가변 영역 잔기에 의해 치환된 인간 면역글로불린(수용체 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화된 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 행해진다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개, 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 그것에 상응하고 또 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 그것이다. 인간화된 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 상세한 내용은, Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329(1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992) 참조.

본 발명에서 사용되는 용어 "단편" 또는 "단편들"은 일부 표적 단백질을 포함하는 불순물이며 또 표적 단백질의 중량보다 낮은 중량을 갖는다. 표적 단백질에서 화학 결합의 파괴는 하나 이상의 단편 형성을 초래한다. 표적 단백질의 부정확한 또는 불완전한 합성도 또한 단편을 초래할 수 있다. 단편들은 표적 단백질을 정제하는 동안 제거를 필요로 하는 일반적 불순물이다. 이들은 소수성 및 등전점과 같이 표적 단백질과 아주 유사한 특성을 흔히 갖기 때문에 표적 단백질로부터 분리하기가 어려운 불순물이다. 예를 들어, 표적 단백질의 포획을 위해 친화성 크로마토그래피가 이용되면, 친화성 리간드에 대한 결합 도메인을 함유하는 단편도 또한 포획되므로 나중 단계에서 제거되어야 한다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 용어 "용액", "조성물" 또는 "샘플"은 정제될 적어도 하나 표적 단백질 및 표적 단백질의 양의 적어도 0.2% 이상의 양으로 존재하는 표적 단백질의 단편의 혼합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플은 세포 배양 공급물, 예를 들어, 표적 단백질(예컨대, 단일클론 항체)을 함유하는 포유동물 세포 배양액(예컨대, CHO 세포)으로부터의 공급물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플은 정화 처리된 세포 배양 공급물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 샘플은 친화성 크로마토그래피 컬럼(예컨대, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼)으로부터의 용리액을 포함한다. 샘플들은 또한 관심있는 단백질 또는 표적 단백질을 생산하기 위해 사용되는 비-포유동물 발현계를 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "비-포유동물 발현계"는 치료성 단백질을 생성하기 위해 이용된 모든 숙주 세포 또는 기관을 지칭하며, 상기 숙주 세포 또는 기관은 비-포유동물 기원이다. 관심있는 단백질 또는 표적 단백질 생산에 사용된 비-포유동물 발현계의 예는 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모, 에세리키아 콜리(Escherichia coli), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 브레비바실루스 초시넨시스(Brevibacillus choshinensis)와 같은 세균, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포와 같은 곤충 세포, 배큘로바이러스 감염된 곤충 세포, 및 조류(alggae) 세포를 포함한다.

본 발명에서 상호변경가능하게 사용되는 용어 "관심있는 단백질" 및 "표적 단백질"은 표적 단백질 및 그 단백질의 단편의 혼합물로부터 정제될 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상기 표적 단백질은 면역글로불린이다.

본 발명에서 상호변경가능하게 사용되는 용어 "단백질 A" 또는 "ProA"는 천연 공급원(예컨대, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus))으로부터 회수된 단백질 A, 합성적으로 제조된 단백질 A(예컨대, 펩티드 합성에 의해 또는 재조합 수법에 의해), 및 Fc 영역과 같이 C_H2/C_H3 영역을 갖는 단백질에 결합하는 능력을 보유하는 그의 단편 및 변이체를 포함한다. 단백질 A는 Repligen, Pharmacia, EMD Millipore 및 Fermatech로부터 상업적으로 입수가능하다. 단백질 A는 일반적으로 고상 지지체 물질 상에 고정된다. 용어 "ProA"는 또한 단백질 A가 공유적으로 부착된 크로마토그래피 고체 지지체 매트릭스를 함유하는 친화성 크로마토그래피 수지 또는 컬럼을 지칭한다.

본 발명에서 상호변경가능하게 사용되는 용어 "정제하는", "순도를 증가시키는", "분리하는" 또는 "단리하는"은 본원 발명에 기재된 방법을 이용하여 단편을 선택적으로 제거하는 것에 의해 표적 단백질의 단편에 대한 표적 단백질의 비율을 증가시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 표적 단백질의 순도는 표적 단백질을 함유하는 샘플 중의 단편을 제거한 이후 50% 정도, 또는 60% 정도, 또는 70% 정도, 또는 80% 정도, 또는 90% 정도 또는 그 이상 증가된다.

본 발명에 사용된 바와 같이, 본 발명에서 상호변경가능하게 사용되는 용어 "제거한다", "제거하는", "제거" 또는 "감소한다", "감소하는" 또는 "감소"는 정제될 표적 단백질뿐만아니라 표적 단백질의 양의 적어도 0.2% 이상으로 존재하는 표적 단백질의 단편을 함유하는 샘플 중에서 단편의 양을 본원 발명에 기재된 방법을 이용하여 저하시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 표적 단백질의 양의 적어도 0.5% 이상의 양으로 단편을 함유한다. 다른 실시양태에서, 샘플은 표적 단백질의 양의 적어도 1% 이상의 양으로, 또는 표적 단백질의 양의 적어도 2% 이상의 양으로 단편을 함유한다. 본 발명에 나타낸 바와 같이, 활성탄은 선택적으로 상기 단편과 결합하며 샘플 중의 단편의 양은 단편에 결합된 샘플로부터 활성탄을 제거하면 감소된다.

본 발명에서 상호변경가능하게 사용되는 용어 "선택적으로 제거한다", "선택적으로 제거된" 및 "선택적 제거"는 정제될 표적 단백질 및 표적 단백질의 양의 적어도 0.2% 이상의 양으로 존재하는 표적 단백질의 단편을 함유하는 샘플 중에서 표적 단백질의 단편들에 특이적으로 결합하는 활성탄의 능력을 지칭한다. 따라서, 활성탄은 표적 단백질의 단편에는 결합하지만, 표적 단백질 그자체에는 결합하지 않으므로, 샘플로부터 활성탄 제거 이후 샘플로부터 단편의 선택적 제거를 초래한다.

본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "정화하다", "정화" 및 "정화단계"는 현탁된 입자 및/또는 콜로이드를 제거하여 NTU(nephelometric turbidity units)으로 측정되는 바와 같이 표적 단백질 함유 용액의 탁도(turbidity)를 감소시키기 위한 공정 단계를 지칭한다. 정화는 원심분리 또는 여과를 비롯한 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 원심분리는 뱃치식 또는 연속 모드로 실시될 수 있었던 반면에, 여과는 정상 유동(예컨대 심층여과) 또는 접선 유동(tangential flow) 모드로 실시될 수 있었다. 오늘날 공업에 이용되는 공정에서, 원심분리 이후에는 원심분리에 의해서는 제거될 수 없었던 불용성 불순물을 제거하기 위하여 심층여과가 전형적으로 잇따른다. 또한, 정화 효능을 향상시키기 위한 방법, 예컨대 석출이 이용될 수 있다. 불순물의 석출은 자극 감응성 중합체 또는 소분자에 기인한 응집, pH 조정(산 석출), 온도 변동, 상 변경과 같은 다양한 수단, 또는 이들 방법의 조합에 의해 달성될 수 있다. 본 발명에 기재된 일부 실시양태에서, 정화는 원심분리, 여과, 심층여과 및 석출의 2 이상의 조합을 포함한다.

본 발명에서 상호변경가능하게 사용되는 용어 "플로우-쓰루(flow-through) 공정", "플로우-쓰루 모드" 및 "플로우-쓰루 크로마토그래피"는 샘플 중의 적어도 하나의 생성물은 탄소질 매질을 통과하는 반면에 적어도 하나의 임의 성분은 탄소질 매질(예컨대, 활성탄)에 결합되는 생성물 분리 수법을 지칭한다.

통과시키려는 샘플은 일반적으로 "이동상"이라 지칭한다. "플로우-쓰루 모드"는 일반적으로 등용매 작업(즉, 이동상의 조성이 변경되지 않는 공정)이다. 플로우-쓰루에 사용된 매질은 통상 표적 단백질 분자를 함유하는 동일 완충용액에 의해 미리 평형화(pre-equilibrated)된다. 정제 후, 상기 매질은 부가적인 양의 동일 완충액을 사용하여 씻겨져서 생성물 회수율을 증가시킨다.

용어 "완충액"은 그의 산-염기 콘쥬게이트 성분의 작용에 의해 pH 변동에 저항하는 용액을 지칭한다. 본원 발명에 기재된 방법에 사용될 수 있는 다양한 완충액은 Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation(1975)에 기재되어 있다. 상이한 완충액은 상이한 범위의 pH를 유지하며, 예를 들어 포스페이트 완충액은 pH 6.0 내지 8.0에서 통상 사용되는 한편, 더 높은 pH의 경우, 보레이트 완충액이 사용될 수 있고, 또 더 낮은 pH의 경우, 카보네이트 완충액이 사용될 수 있다. 당해 분야의 통상의 지식을 가진 사람들은 지속할 pH에 따라서 사용할 적합한 완충액을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 완충액의 비제한적인 예는 MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트, 카보네이트, 보레이트, 및 암모늄 완충액, 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다.

본 발명에서 상호변경가능하게 사용되는 용어 "세정 완충액" 또는 "평형화 완충액"은 샘플을 탄소질 물질과 접촉시키기 전에 탄소질 물질(예컨대, 활성탄)을 세정 또는 재평형화하기 위해 사용된 완충액을 지칭한다.

용어 "도전율"은 2개 전극 사이의 전류를 도전시키기 위한 수용액의 능력을 지칭한다. 용액에서, 전류는 이온 수송에 의해 흐른다. 따라서, 수용액에 존재하는 이온의 양이 증가함에 따라서, 그 용액은 더 높은 도전율을 가질 것이다. 도전율에 대한 측정 단위는 밀리지멘스/센티미터(mS/cm 또는 mS)이고, 또 상업적으로 입수가능한 도전율계(예컨대, 오리온으로부터 구입)를 이용하여 측정될 수 있다. 용액의 도전율은 이온의 농도를 변경하는 것에 의해 달리할 수 있다. 예를 들어, 용액 중의 완충제의 농도 및/또는 염(예컨대 NaCl 또는 KCl)의 농도를 달리하여 소망하는 도전율을 달성할 수 있다. 바람직하게는, 다양한 완충액의 농도를 변경하여 이하의 실시예에서와 같은 소망하는 도전율을 달성할 수 있다.

II. 본원 발명에 기재된 방법에 사용하기 위한 예시적 탄소질 물질

본 발명에 따른 방법에서, 단편의 선택적 제거를 위하여 활성탄과 같은 특정 탄소질 물질이 사용된다. 활성탄은 매우 높은 표면적을 갖는 다공성 고체로 기재될 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성탄은 활성화된 목탄을 포함한다. 활성탄은 비제한적으로 석탄, 목재, 코코넛 껍질, 견과껍질, 및 토탄을 비롯한 다양한 공급원으로부터 유도될 수 있다. 활성탄은 제어된 분위기하에서 가열을 비롯한 물리적 활성화에 의해 또는 강한 산, 염기, 또는 산화제를 사용한 화학적 활성화에 의해 상기 물질로부터 생성될 수 있다. 상기 활성화 공정들은 고 표면적을 갖는 다공성 구조를 생성하여, 활성탄에 보다 큰 불순물 제거능을 부여한다. 활성화 공정들은 표면의 산도를 제어하도록 변형될 수 있다.

활성탄은 다양한 상업적 공급원으로부터 다수의 등급 및 포맷으로 입수가능하다. 활성탄의 상업적 공급자의 일부는 미드웨스트바코 코포레이션(미국 버지니아 리치몬드 소재); 노리트 아메리카스 인코포레이티드(미국 택사스 마샬 소재); 칼곤 카본 코포레이션(미국 펜실베니아 피츠버그 소재)과 같은 회사를 포함한다.

본 발명에 기재된 일부 실시양태에서, 활성탄은 본 발명에 기재된 바와 같은 셀룰로오스-함유 섬유성 매질에 포함된다.

본 발명에 따른 방법에 이용될 수 있는 상업적으로 입수가능한 활성탄 물질은 비제한적으로, Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재); Nuchar SA 20(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재); Nuchar SN(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재); Nuchar WV-B 30(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재); RGC Powder 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재); 노리트 Darco KB-G 활성탄(노리트 아메리카스 인코포레이티드, 미국 텍사스 마샬 소재); 노리트 CGP 슈퍼 활성탄(노리트 아메리카스 인코포레이티드, 미국 텍사스 마샬 소재); 노리트 A 슈프라 USP(노리트 아메리카스 인코포레이티드, 미국 텍사스 마샬 소재); 노리트 E 슈프라 USP(노리트 아메리카스 인코포레이티드, 미국 텍사스 마샬 소재); 노리트 C GRAN(노리트 아메리카스 인코포레이티드, 미국 텍사스 마샬 소재); 노리트 SX Ultra(노리트 아메리카스 인코포레이티드, 미국 텍사스 마샬 소재); 및 Chemviron Pulsorb PGC 활성탄(챔비론 카본, 벨기에 페루이 소재)을 포함한다.

활성탄의 2개의 주요 포맷은 분말형 및 과립형이다. 분말형(Powdered) 활성탄은 소형 및 보통 1 mm 미만 직경의 입자를 함유하며, 또 가장 흔히 액체의 정제에 사용된다. 과립형(granular) 활성탄은 큰 입자 크기를 가져서 더 작은 표면적을 가지므로, 확산 속도가 더 신속한 가스 정제에 사용되는 것이 바람직하다.

소비자 적용(물, 식품, 음료, 및 약제 정제와 같은)에서 활성탄의 사용과 관련한 안전성에 대한 중요한 고려사항은 추출가능한 화합물의 감소 및 제어이다. 음료수 및 음식 접촉적용을 위한 활성탄은 통상 물에 대한 모든 간접적 첨가제를 포괄하는 안전성 표준 ANSI/NSF Standard 61을 준수해야 한다. 또한, ASTM 표준 시험 방법 D6385는 활성탄 중에 존재하는 산 추출가능한 함량을 애싱(ashing)에 의해 결정하는 것을 개시하며 또 활성탄으로부터 추출가능한 양을 연구하고 감소시키기 위하여 이용될 수 있었다.

다양한 적용을 위해 다양한 활성탄 유형이 이용될 수 있다. 예를 들어, 미드웨스트바코 코포레이션은 이들의 능력, 표면 산도, 표적 분자에 대한 기공 접근성, 및 목적하는 용도가 상이한 적어도 12개 유형의 분말형 활성탄을 공급한다. 불순물 제거를 위한 활성탄 능력을 최대화하는 것이 일반적으로 바람직하다.

III. 샘플 중의 단편의 양을 결정하는 방법

샘플 중의 표적 단백질의 단편의 양을 결정하는 일반적 수법들은 몇 개의 상이한 분석 크로마토그래피 공정들을 포함한다. 크기 배제 또는 겔 투과 크로마토그래피는 유체역학적 부피에서의 차이를 기본으로 하여 표적 단백질로부터 단편을 분리한다. 역상 HPLC 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 이들의 소수성에서의 차이를 기본으로 하여 표적 단백질로부터 단편을 분리한다. 음이온 교환(AEX) 및 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피는 전하 양의 차이를 기본으로 하여 표적 단백질로부터 단편을 분리한다. 혼합 모드 크로마토그래피는 전하의 양 및 이들의 소수성에서의 차이를 기본으로 하여 표적 단백질로부터 단편을 분리한다.

크로마토그래피 컬럼으로부터 회수된 용액 중에서 단백질의 상대량은 전형적으로 인 라인(in line) UV 검출기를 이용하여 결정되지만, 굴절률 검출기, 형광 검출기와 같은 다양한 유형의 인 라인 검출기가 또한 이용될 수 있다. 생성된 크로마토그램에서 상이한 피크는 적분되어 표적 단백질 피크 및 상기 표적 단백질의 단편에 상응하는 피크의 면적들을 결정한다. 샘플 중의 단편의 퍼센트는 모든 단편 피크의 면적의 합을 표적 단백질 피크의 면적과 모든 단편 피크의 면적의 합으로 나눠서 산출된다.

표적 단백질을 함유하는 샘플 중의 단편의 양을 결정하는 일반적 수법은 또한 SDS 폴리아크릴아마이드 겔(PAGE) 전기영동, 자유 유동 전기영동, 겔 전기포커싱(electrofocusing), 아이소타코포레시스(isotachophoresis), 친화성 전기영동, 면역전기영동, 카운터전기영동(counter electrophoresis), 및 모세관 전기영동과 같은 몇 개의 상이한 겔 전기영동 분석 수법을 포함한다. 겔 부분에서 단백질의 양은 흔히 염색을 이용하여 가시화된다. 염색된 스폿의 세기는 정량되며 또 샘플 중의 단편의 퍼센트는 단편 피크들의 세기를 표적 단백질 피크의 세기와 단편 피크의 세기의 합으로 나누는 것에 의해 산출된다.

IV. 단편 제거에서 탄소질 물질의 사용

표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 단편을 선택적으로 제거하기 위해 이용될 수 있는 1개의 일반적 과정은 다음과 같이 기재된다.

일부 실시양태에서, 상기 단편은 용액을 활성탄으로 정적 처리(static treatment)하는 것에 의해 본원 발명에 기재된 방법을 이용하여 표적 단백질의 용액으로부터 선택적으로 감소된다. 이 실시양태에서 활성탄은 표적 단백질 및 제거될 단편을 함유하는 용액에 건조 형태 또는 용액에 현탁된 형태로 부가된다. 상기 용액은 48시간 이하 동안 활성탄과 상호작용하도록 허용된다. 상기 활성탄은 용액 단백질 불순물 흡착 비율을 최대화하기 위하여 바람직하게는 용액 내에 현탁되어 유지된다. 상기 용액은 용액 용기의 이동에 의해 또는 용액을 자기 교반기 바(bar)를 이용하여 교반하거나 또는 또는 용액을 기계적 진탕기를 이용하여 교반하는 것에 의해 진탕된다.

이어 상기 용액으로부터 활성탄이 분리되며, 상기 활성탄은 선택적으로 제거될 단편에 결합되어 있다. 결합된 활성탄은 용액을 여과하고 또 여과된 용액을 회수하는 것에 의해 분리될 수 있다. 다르게는, 상기 결합된 활성탄은 용액을 원심분리하거나 또는 결합된 활성탄을 침강시키고 상층액을 회수하는 것에 의해 분리될 수 있다. 원심분리 또는 침강 후에도 상층액 내에 입자가 잔류하면, 이들은 여과에 의해 제거될 수 있다. 잔류하는 용액은 감소된 양의 선택적으로 제거될 단편을 함유한다.

일부 실시양태에서, 크로마토그래피 장치, 예컨대, 컬럼에는 활성탄의 수성 슬러리가 로딩(loaded)된다. 활성탄은 건조 분말로서 장치, 예컨대, 컬럼에 로딩된 다음 수용액에 의해 습윤된다. 그러나, 때때로, 컬럼이 건조 팩킹되었을 때 활성탄 입자 사이로부터 소형의 공기 기포를 제거하도록 시도될 수 있다. 상기 컬럼은 표적 단백질을 함유하는 용액과 유사한 완충액에 의해 평형화된다. 이어 상기 용액은 15초 내지 10.0분 사이의 컬럼 체류 시간을 초래하는 유동 속도로 활성탄 컬럼을 통과한다. 활성탄 컬럼을 통과한 용액을 수집하며, 이는 활성탄을 사용하여 선택적으로 제거한 단편을 함유하지 않거나 또는 감소된 양으로 함유한다.

다양한 실시양태에서, 단편에 결합된 활성탄은 표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 여과 또는 원심분리에 의해 또는 원심분리와 여과의 조합에 의해 제거될 수 있다. 표적 단백질 용액 중의 단편의 초기 수준은 분석적 크로마토그래피(SEC, HIC, AEX, CEX, 혼합 모드)에 의해 또는 분석적 겔 전기영동 수법(SDS PAGE, 자유 유동 전기영동, 겔 전기포커싱, 아이소타코포레시스, 친화성 전기영동, 면역전기영동, 카운터전기영동, 모세관 전기영동)에 의해 결정될 수 있다.

본 발명은 제한을 의미하지 않는 이하의 실시예에 의해 더욱 자세하게 설명된다. 본 출원을 통하여 인용된 모든 참고문헌, 특허, 및 공개된 특허 출원의 내용뿐만 아니라 도면은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

실시예

실시예 1. 정적 결합 조건하에서 단일클론 항체 단편을 제거하기 위한 활성탄의 사용

이 대표적 실시예는 활성탄을 사용한 정적 처리에 의해 단일클론 항체를 함유하는 샘플로부터 단일클론 항체 단편이 선택적으로 제거될 수 있음을 나타낸다.

대략 1%의 단일클론 항체 단편을 함유하는 MAB I 및 MAB II로 지칭되는 2개의 단일클론 항체의 용액을 제조하고 또 이하에 기재된 바와 같이 정적 결합 조건하에서 활성탄으로 처리하였다.

MAB I 및 단편첨가된 MAB II 용액의 제조는 단일클론 항체를 파파인 효소에 의해 분해시켜 단편을 제조하는 것에 의해 개시되었다. 분해 후, 상기 효소는 0.3 M 요도아세테이트 용액을 부가하는 것에 의해 불활성화되었다. 상기 파파인 분해된 단일클론 항체 용액을 투석 튜빙(Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/Por 1-3, 3.5K MWCO, 54 mm FLAT WIDTH, 일련 번호: 132725, 스펙트럼 라보라토리즈 인코포레이티드, 미국 캘리포니아 90220 란초 도밍게즈 소재)을 이용하여 물에 투석시켜 완충염(buffer salts)을 제거하였다. 상기 투석 튜빙에 대략 0.15 L의 상기 파파인 분해된 단일클론 항체 용액을 로딩하고 또 4.0 L의 물에 24시간 동안 침지하였다. 이어 상기 투석 튜빙을 4.0L의 새로운 물을 함유하는 새로운 용기로 옮기고 그곳에서 24시간 더 침지하였다.

단편첨가된 MAB I 저장 용액은 0.5 mL의 파파인 분해된 MAB I 및 25 mM Tris, pH 7.0 중의 8.0 mL의 미분해 MAB I 단백질 A 용리로부터 제조하였다. 단편첨가된 MAB II 저장 용액은 1.0 mL의 파파인 분해된 MAB II, 물 중의 8.0 mL의 미분해 MAB II, 및 2.0 mL의 50 mM Tris, pH 7.0로부터 제조하였다. 상기 용액들을 0.22 μm 막(Stericup-GP 0.22 μm Millipore Express PLUS 막, 250 mL, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하였다. 단편첨가된 MAB I 용액은 5.52 mg/mL의 MAB I과 함께 1.06%의 단편을 함유하였고 또 단편첨가된 MAB II 용액은 5.72 mg/mL의 MAB II와 함께 0.85%의 단편을 함유하였다.

15 mL 원심분리관에 양쪽 단일클론 항체 용액에 대해 0 mg, 5 mg, 또는 10 mg의 Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재)을 로딩하였다. 단편첨가된 MAB I 저장 용액 또는 단편첨가된 MAB II 저장 용액 2.0 mL를 상기 원심분리관에 부가하였다. 상기 관들을 20시간 동안 회전시켰다. 모든 관들을 원심분리 처리시키고 또 그 상층액들을 0.22 마이크론 막(Millex Syringe Filter Units, Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, 감마 멸균됨, 카탈로그 번호: SLGV033RB, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하여 용액에 현탁되어 잔존할 수 있는 활성탄 입자를 제거하였다. 샘플에 잔존하는 MAB I 또는 MAB II의 양은 단백질 A HPLC에 의한 IgG 정량을 이용하여 결정하였다. 샘플 중의 단편의 퍼센트는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정하였다.

하기 표 I에 요약된 바와 같이, 상기 실험은 단일클론 항체를 함유하는 샘플의 활성탄을 사용한 정적 처리가 바람직하지 않은 단일클론 항체의 단편의 선택적 제거를 초래함을 나타낸다. 단일클론 항체 용액에 부가된 활성탄의 양이 증가함에 따라, 단편의 퍼센트는 감소된다. 10 mg의 활성탄을 사용한 샘플의 처리는 MAB I 용액 중의 단편의 양을 1.06%로부터 SEC에 의한 검출한계 아래로 감소시킨다. 10 mg의 활성탄을 사용한 처리는 MAB II 용액 중의 단편의 양을 0.85%로부터 0.15%로 감소시킨다. 이 데이터는 활성탄을 사용하여 정적 결합 조건하에서 샘플로부터 단일클론 항체 단편을 선택적으로 제거할 수 있음을 나타낸다.

표 I. 활성탄을 사용하여 MAB I 및 MAB II 용액을 정적 처리한 후 단일클론 항체의 회수율 및 단편의 퍼센트. 0.00%는 단편의 퍼센트가 SEC에 의한 검출한계 아래임을 나타낸다.

실시예 2. 활성탄이 팩킹된 크로마토그래피 컬럼을 통과시키는 것에 의해 단일클론 항체 함유 샘플로부터 단일클론 항체 단편의 제거

이 대표적 실시예는 단일클론 항체 샘플을, 활성탄이 팩킹된 크로마토그래피 컬럼을 통하여 통과시키는 것에 의해, 단일클론 항체를 함유하는 샘플로부터 단일클론 항체 단편이 선택적으로 제거될 수 있음을 나타낸다.

MAB I의 용액은 대략 2%의 단일클론 항체 단편을 갖도록 제조하고 또 이하에 기재된 바와 같이 활성탄이 팩킹된 크로마토그래피 컬럼을 통과시켰다.

단편첨가된 MAB I 용액의 제조는 단일클론 항체의 일부를 파파인 효소를 사용하여 분해하여 단편을 생성하는 것에 의해 개시되었다. 0.3 M 요도아세테이트를 부가하는 것에 의해 상기 효소를 불활성화한 후, 상기 파파인 분해된 단일클론 항체 용액을 투석 튜빙(Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/Por 1-3, 3.5K MWCO, 54 mm FLAT WIDTH, 일련 번호: 132725, 스펙트럼 라보라토리즈 인코포레이티드, 미국 캘리포니아 90220 란초 도밍게즈 소재)을 이용하여 물에 투석시켜 완충염을 제거하였다. 상기 투석 튜빙에 대략 0.15 L의 상기 파파인 분해된 단일클론 항체 용액을 로딩하고 또 4.0 L의 물에 24시간 동안 침지하였다. 상기 투석 튜빙은 4.0L의 새로운 물을 함유하는 새로운 용기로 이동시키며, 그곳에서 24시간 동안 더 침지하였다.

단편첨가된 MAB I 용액은 물 중의 20 mL의 파파인 분해된 MAB II 용액 및 25 mM Tris, pH 7.0 중의 160 mL의 미분해 MAB I 단백질 A 용리로부터 제조하였다. 상기 용액을 0.22 μm 막(Stericup-GP 0.22 μm Millipore Express PLUS 막, 250 mL, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하였다. 단편첨가된 MAB I 용액은 5.01 mg/mL의 MAB I과 함께 2.01%의 단편을 함유하였다.

유리 크로마토그래피 컬럼(Omnifit Benchmark 컬럼 10 mm/100 mm, 10 mm 직경, 100 mm 길이, SKU: 006BCC-10-10-AF, 디바 인더스트리스, 미국 커네티컷 06810 댄뷰리 소재)에 물에 슬러리화된 200 mg의 Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재)을 로딩하였다. 이 컬럼은 물을 흘려주는 것에 의해 팩킹되었고, 그로써 0.8 mL의 팩킹된 컬럼 부피를 초래하였다. 상기 컬럼은 25 mM Tris, pH 7.0를 이용하여 평형화되었다.

이어, 단편첨가된 MAB I 용액 154 mL를 0.40 mL/min으로 활성탄 컬럼을 통과시켜 2.0분의 컬럼 체류 시간을 얻었다. 6개의 25 mL 분획을 수집하였다. 10 mL의 25 mM Tris, pH 7.0를 컬럼을 통과시키고 부가적 10 mL 분획을 수집하였다. 개별 분획뿐만 아니라 모든 7개 분획의 비례적으로 모아진 샘플 중의 MAB I의 양은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼("Protein A HPLC")을 구비한 HPLC 계에 의한 IgG 정량을 이용하여 결정하였다. 개별 분획뿐만 아니라 모든 7개 분획의 비례적으로 모아진 샘플 중의 단편의 퍼센트는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정하였다.

하기 표 II 및 도 1에 요약된 바와 같이, 상기 실험은 활성탄이 팩킹된 크로마토그래피 컬럼을 통과시키는 것에 의해 단일클론 항체 샘플로부터 단일클론 항체 단편이 선택적으로 제거될 수 있음을 나타낸다.

표 II. 활성탄 컬럼을 통과한 후 수집된 모아진 분획 중의 MAB I의 정규화된 농도 및 단편의 퍼센트

실시예 3. 단일클론 항체를 함유하는 샘플로부터 단백질 A를 결합하는 단일클론 항체 단편의 선택적 제거

이 대표적 실시예는 활성탄이 팩킹된 크로마토그래피 컬럼을 통과시키는 것에 의해, 단일클론 항체를 함유하는 샘플로부터 단백질 A를 결합하는 단일클론 항체 단편이 선택적으로 제거될 수 있음을 나타낸다.

MAB III의 샘플은 단백질 A를 결합하는 대략 3.5%의 단일클론 항체 단편을 갖도록 제조하였다. 이 샘플을, 아래에 기재된 바와 같이, 활성탄이 팩킹된 크로마토그래피 컬럼을 통과시켰다.

단백질 A를 결합하는 단일클론 항체 단편은 40 mL의 24.3 mg/ml MAB III 용액으로 부터 출발하여 제조된 다음, 100 mM 나트륨 포스페이트 완충액 및 시스테인으로 희석시켰다. 이어, 파파인 효소를 최종 농도 0.11 mg/ml로 부가하였다. 상기 용액을 37℃에서 3시간 배양한 다음 요도아세테이트 부가에 의해 파파인 효소를 불활성화시켜 20 mM의 최종 요도아세테이트 용액 농도를 얻었다. 전체 효소를 확실하게 불활성화하기 위하여, 상기 용액은 실온으로 냉각시키기 전에 37℃에서 부가적 시간 동안 배양하였다. 분해 후, 상기 용액을 폴리에테르술폰 막(Pellicon XL Filter, 컷 오프 30 KDa, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 이용하여 한외여과/투석여과에 의해 농축시켰다. 이어, 농축된 MAB III 분해물을 20 mM PBS, pH 7.4에 완충액 교환처리시켰다. pH 7.4에 있는 농축된 MAB III 분해물을 단백질 A 컬럼(ProSep® Ultra Plus, 10*100mm, Merck KGaA, 독일 다름슈타트 소재)에 처리시켰다. 단백질 A를 결합하는 MAB III 단편은 20 mM PBS 완충액, pH 7.4로 세정한 이후 100 mM 글리신 완충액, pH 2.9으로 컬럼으로부터 용리시켰다. 용리된 분획의 pH는 2.0 M Tris 염기 용액을 부가하는 것에 의해 pH 5.4로 증가시켰다.

단편첨가된 MAB III 샘플을 120 mL의 MAB III 용액, pH 7.0 및 12 mL의 MAB III 단편 용액으로부터 제조하였다. 단편첨가된 MAB III 샘플은 0.22 μm 막(Stericup-GP 0.22 μm Millipore Express PLUS 막, 250 mL, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과시켰다. 단편첨가된 MAB III 용액은 7.13 mg/mL의 MAB III과 함께 3.50%의 단편을 함유하였다.

유리 크로마토그래피 컬럼(Omnifit Benchmark 컬럼 10 mm/100 mm, 10 mm 직경, 100 mm 길이, SKU: 006BCC-10-10-AF, 디바 인더스트리스, 미국 커네티컷 06810 댄뷰리 소재)에 물에 슬러리화된 250 mg의 Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재)을 로딩하였다. 상기 컬럼은 물을 흘려주는 것에 의해 팩킹되었고, 이로써 1.0 mL 팩킹 컬럼 부피를 초래하였다. 상기 컬럼은 25 mM Tris, pH 7.0에 의해 평형화되었다.

단편첨가된 MAB III 용액 30.5 mL를 0.30 mL/min으로 활성탄 컬럼을 통과시켜, 활성탄 컬럼에서 3.3 분의 체류 시간을 초래하였다. 17개의 1.9 mL 분획을 수집하였다. 개별 분획 중의 MAB III의 양은 단백질 A HPLC에 의한 IgG 정량을 이용하여 결정하였다. 개별 분획 중의 단편의 퍼센트는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정하였다.

표 III 및 도 2에 요약된 바와 같이, 상기 실험은 활성탄이 팩킹된 크로마토그래피 컬럼을 통과시키는 것에 의해, 단일클론 항체 함유 샘플로부터 단백질 A를 결합하는 단일클론 항체 단편이 선택적으로 제거될 수 있음을 나타낸다. 이로써 상기 활성탄은 일반적으로 발견되고 흔히 제거하기 어려워 항체가 정제됨에 따라 동일 단백질 A 용리 풀에 들어가고 마는 단편을 제거하기 위해 이용될 수 있음을 나타낸다.

표 III. 활성탄의 컬럼을 통하여 샘플을 통과시킨 후 수집된 분획에서 MAB III 의 농도 및 단백질 A를 결합하는 단일클론 항체 단편의 퍼센트

실시예 4. 단일클론 항체를 함유하는 샘플로부터 단백질 A를 결합하지 않는 단일클론 항체 단편의 제거

이 대표적 실시예는 활성탄이 팩킹된 크로마토그래피 컬럼을 통과시키는 것에 의해, 단일클론 항체 함유 샘플로부터 단백질 A를 결합하지 않는 단일클론 항체 단편 또한 선택적으로 제거될 수 있음을 나타낸다.

MAB III 용액은 단백질 A를 결합하지 않는 대략 4.84%의 단일클론 항체 단편을 갖도록 제조한 다음 아래에 기재된 바와 같이 활성탄이 팩킹된 크로마토그래피 컬럼을 통과시켰다.

단백질 A를 결합하지 않는 단일클론 항체 단편은 40 mL의 24.3 mg/ml MAB III 용액으로부터 출발해서, 100 mM 나트륨 포스페이트 완충액 및 시스테인으로 희석시키는 것에 의해 제조하였다. 이어, 파파인 효소를 최종 농도 0.11 mg/ml까지 부가하였다. 상기 용액은 37℃에서 3시간 동안 배양한 다음 요도아세테이트를 부가하는 것에 의해 파파인 효소를 불활성화하여, 최종 요도아세테이트 용액 농도 20 mM를 얻었다. 완전한 효소 불활성화를 확실히 하기 위하여, 상기 용액을 37℃에서 부가적으로 1시간 동안 배양한 다음 실온으로 냉각시켰다. 분해 이후, 상기 용액은 폴리에테르술폰 막(Pellicon XL Filter, 컷 오프 30 KDa, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 이용하여 한외여과/투석여과에 의해 농축시켰다. 이어, 농축된 MAB III 분해물을 20 mM PBS, pH 7.4로 완충액 교환 처리시켰다. 농축된 MAB III 분해물, pH 7.4을 단백질 A 컬럼(ProSep® Ultra Plus, 10*100mm, Merck KGaA, 독일 다름슈타트 소재)에 로딩하였다. 단백질 A를 결합하지 않는 단편은 농축된 MAB III 분해물을 단백질 A 컬럼을 통과시키는 것에 의해 단리하였다.

단편첨가된 MAB III 용액은 150 mL의 MAB III 용액, pH 7.0 및 단백질 A를 결합하지 않는 MAB III 단편을 함유하는 상기 생성된 20 mL의 용액으로부터 제조하였다. 단편첨가된 MAB III 저장 용액은 0.22 μm 막(Stericup-GP 0.22 μm Millipore Express PLUS 막, 250 mL, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과시켰다. 단편첨가된 MAB III 용액은 1.27 mg/mL의 MAB III 및 4.84%의 단편을 함유하였다.

유리 크로마토그래피 컬럼(Omnifit Benchmark 컬럼 10 mm/100 mm, 10 mm 직경, 100 mm 길이, SKU: 006BCC-10-10-AF, 디바 인더스트리스, 미국 커네티컷 06810 댄뷰리 소재)에 물에 슬러리화된 250 mg의 Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재)을 로딩하였다. 이 컬럼은 물을 흘려주는 것에 의해 팩킹되어, 1.0 mL의 팩킹된 컬럼 부피를 초래하였다. 상기 컬럼은 25 mM TRIS, pH 7.0에서 평형화시켰다.

이어, 단편첨가된 MAB III 용액 130.5 mL를 활성탄 컬럼을 통하여 0.30 mL/min으로 통과시켜 활성탄 컬럼에서 3.3분의 체류 시간을 얻었다. 30개의 4.5 mL 분획을 수집하였다. 개별 분획 중의 MAB III의 양은 단백질 A HPLC에 의해 IgG 정량을 사용하여 결정하였다. 개별 분획 중의 단편의 퍼센트는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정하였다.

표 IV 및 도 3에 요약한 바와 같이, 상기 실험은 활성탄이 팩킹된 크로마토그래피 컬럼을 통하여 통과시키는 것에 의해, 단일클론 항체를 함유하는 샘플로부터 단백질 A를 결합하지 않는 단일클론 항체 단편이 선택적으로 제거될 수 있음을 나타낸다.

표 IV. 활성탄이 팩킹된 컬럼을 통하여 샘플을 통과시킨 후 수집된 분획에서 MAB III의 농도 및 단백질 A를 결합하지 않는 단일클론 항체 단편의 퍼센트

실시예 5. 정적 결합 조건하에서 단일클론 항체 함유 샘플로부터 단일클론 항체 단편을 제거하기 위한 상이한 유형의 활성탄의 사용

이 대표적 실시예는 상이한 유형의 활성탄을 사용한 정적 처리에 의해 단일클론 항체 함유 샘플로부터 단일클론 항체 단편이 선택적으로 제거될 수 있음을 나타낸다.

MAB II 용액은 대략 1.7%의 단일클론 항체 단편을 갖도록 제조되며 또 아래에 기재된 바와 같이 정적 결합 조건하에서 3개의 상이한 유형의 활성탄 중의 하나를 사용하여 처리하였다.

단편첨가된 MAB II 용액의 제조는 단일클론 항체의 일부를 파파인 효소를 사용하여 분해하여 항체 단편을 생성하는 것으로 개시되었다. 분해 후, 상기 효소는 0.3 M 요도아세테이트 용액을 부가하는 것에 의해 불활성화된다. 상기 파파인 분해된 단일클론 항체 용액은 투석 튜빙(Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/Por 1-3, 3.5K MWCO, 54 mm FLAT WIDTH, 일련 번호: 132725, 스펙트럼 라보라토리즈 인코포레이티드, 미국 캘리포니아 90220 란초 도밍게즈 소재)을 이용하여 물에 투석시켜 완충염을 제거하였다. 상기 투석 튜빙에 대략 0.15 L의 상기 파파인 분해된 단일클론 항체 용액을 로딩하고 또 4.0 L의 물에 24시간 동안 침지하였다. 상기 투석 튜빙은 4.0L의 새로운 물을 함유하는 새로운 용기로 이동시키며, 그곳에서 부가적으로 24시간 동안 침지하였다.

단일클론 항체 단편첨가된 MAB II 용액은 18.0 mL의 파파인 분해된 MAB II, 물 중의 72.0 mL의 미분해 MAB II, 및 9.0 mL의 250 mM Tris, pH 7.0로부터 제조하였다. 상기 용액을 0.22 μm 막(Stericup-GP 0.22 μm Millipore Express PLUS 막, 250 mL, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하였다. 단편첨가된 MAB II 용액은 7.86 mg/mL의 MAB II 및 1.72%의 단편을 함유하였다.

15 mL 원심분리관에 5 mg 또는 10 mg의 Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재), Darco KB-G 활성탄(노리트 아메리카스 인코포레이티드, 미국 텍사스 마샬 소재), 또는 CGP 슈퍼 활성탄(노리트 아메리카스 인코포레이티드, 미국 텍사스 마샬 소재)을 로딩하였다. 대조군으로 이용한 15 mL 원심분리관의 부가적 세트에는 매질을 부가하지 않았다. 이어, 단편첨가된 MAB II 5.0 mL를 상기 원심분리관에 부가하였다. 상기 관들을 20시간 동안 회전시켰다. 이어 상기 관들을 원심분리 처리시키고 또 샘플을 0.22 마이크론 막(Millex Syringe Filter Units, Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, 감마 멸균됨, 카탈로그 번호: SLGV033RB, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과시켜 용액 내에 현탁되어 있을 수 있는 활성탄 입자를 제거하였다. 샘플 중에 잔존하는 MAB II의 양은 단백질 A HPLC에 의한 IgG 정량을 이용하여 결정하였다. 샘플 중의 단편의 퍼센트는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정하였다.

하기 표 V에 요약한 바와 같이, 상기 실험은 정적 결합 조건하에서 상이한 유형의 활성탄에 의한 처리에 의해, 단일클론 항체를 함유하는 샘플로부터 단일클론 항체 단편이 선택적으로 제거될 수 있음을 나타낸다. 상기 단일클론 항체 용액에 부가된 활성탄의 양이 증가함에 따라서, 존재하는 단편의 퍼센트는 감소된다. 이 데이터는 단일클론 항체 정적 결합 조건하에서 상이한 유형의 활성탄을 사용하여, 단일클론 항체를 함유하는 샘플로부터 단일클론 항체 단편을 선택적으로 제거할 수 있음을 나타낸다.

표 V. 3개의 상이한 유형의 활성탄을 사용하여 MAB II 용액을 정적 처리한 후 단일클론 항체의 회수율 및 단편의 퍼센트

실시예 6. 정적 조건하의 중성 및 산성 pH에서, 단일클론 항체를 함유 하는 샘플로부터 단일클론 항체 단편을 제거하기 위한 활성탄의 사용

이 대표적 실시예는 활성탄을 사용하여 산성 및 중성 pH 용액 조건에서 정적 처리하는 것에 의해 단일클론 항체 함유 샘플로부터 단일클론 항체 단편이 선택적으로 제거될 수 있음을 나타낸다.

MAB II 용액은 pH 4.1 또는 pH 7.5에서 대략 1.72%의 단일클론 항체 단편을 갖도록 제조되었고 또 정적 결합 조건하에서 활성탄에 의해 처리하였다.

단편첨가된 MAB II 용액의 제조는 단일클론 항체의 일부를 파파인 효소를 사용하여 분해하여 단편을 생성하는 것에 의해 개시되었다. 분해 후, 상기 효소는 0.3 M 요도아세테이트 용액을 부가하는 것에 의해 불활성화되었다. 상기 파파인 분해된 단일클론 항체 용액은 투석 튜빙(Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/Por 1-3, 3.5K MWCO, 54 mm FLAT WIDTH, 일련 번호: 132725, 스펙트럼 라보라토리즈 인코포레이티드, 미국 캘리포니아 90220 란초 도밍게즈 소재)을 이용하여 물에 투석시켜 완충염을 제거하였다. 상기 투석 튜빙에 대략 0.15 L의 상기 파파인 분해된 단일클론 항체 용액을 로딩하고 또 4.0 L의 물에 24시간 동안 침지하였다. 상기 투석 튜빙은 4.0 L의 신선한 물을 함유하는 새로운 용기로 이동시키고, 그곳에서 부가적으로 24 시간 동안 침지하였다.

단편첨가된 MAB II 용액은 물 중의 18 mL의 파파인 분해된 MAB II, 물 중의 72 mL의 미분해 MAB II, 및 9 mL의 250 mM Tris, pH 7.0로부터 제조하였다. 상기 용액의 일부는 3.0 M 아세트산을 부가하는 것에 의해 pH 4.1로 저하시켰다. 이 용액 pH는 Tris 염기 부가에 의해 7.5로 상승시켰다. 이 용액을 0.22 μm 막(Stericup-GP 0.22 μm Millipore Express PLUS 막, 250 mL, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과시켰다. 단편첨가된 MAB II 용액, pH 4.1은 7.88 mg/mL의 MAB II와 함께 1.76%의 단편을 함유하였고 또 단편첨가된 MAB II 용액, pH 7.5은 7.78 mg/mL의 MAB II와 함께 1.72%의 단편을 함유하였다.

15 mL 원심분리관에 20 mg의 Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션,미국 버지니아 리치몬드 소재)을 로딩하였다. 대조군으로 사용되는 15 mL 원심분리관에는 활성탄을 로딩하지 않았다. pH 4.1 또는 pH 7.5에서의 단편첨가된 MAB II 저장 용액 5.0 mL를 적절한 원심분리관에 부가하였다. 상기 관들은 24시간 동안 회전시켰다. 상기 용액을 0.22 마이크론 막(Millex Syringe Filter Units, Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, 감마 멸균됨, 카탈로그 번호: SLGV033RB, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과시켜 용액 중에 현탁되어 잔류할 수 있는 입자를 제거하였다. 용액 중에 잔류하는 MAB II의 농도는 280 nm에서 흡수를 측정하는 것에 의해 결정된다. 샘플 중의 단편의 퍼센트는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정하였다.

하기 표 VI에 요약한 바와 같이, 상기 실험은 중성 및 산성 pH 조건에서 활성탄을 사용하여 정적 처리하는 것에 의해 단일클론 항체 용액으로부터 단일클론 항체 단편이 선택적으로 제거될 수 있음을 나타낸다.

표 VI. 중성 pH 7.5 또는 산성 pH4.1에서 활성탄을 사용하여 MAB II 용액을 정적 처리한 후 단일클론 항체의 회수율 및 단편의 퍼센트

실시예 7. 정적 결합 조건하의 낮은 전도율 및 높은 전도율 모두에서 4.0 내지 9.0 범위의 pH에 걸쳐 단일클론 항체 함유 샘플로부터 단일클론 항체 단편의 제거를 위한 활성탄의 사용

이 대표적 실시예는 낮은 용액 전도율 및 높은 용액 전도율에서 4.0 내지 9.0의 pH 범위에 걸쳐 활성탄을 사용한 정적 처리에 의해 단일클론 항체 용액으로부터 단일클론 항체 단편이 선택적으로 제거될 수 있음을 나타낸다.

MAB II 용액은 4.5 mS/cm 또는 22 mS/cm의 용액 도전율을 갖는 0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 또는 9.0의 용액 pH에서 1.49% 및 1.74% 단일클론 항체 단편을 함유하도록 제조하였다. 상이한 용액을 아래에 기재한 바와 같이 정적 결합 조건하에서 활성탄을 사용하여 처리한다.

단편첨가된 MAB II 용액의 제조는 단일클론 항체의 일부를 파파인 효소를 사용하여 분해하여 단편을 생성하는 것에 의해 개시되었다. 분해 후, 상기 효소는 0.3 M 요도아세테이트 용액을 부가하는 것에 의해 불활성화시켰다. 상기 파파인 분해된 단일클론 항체 용액은 투석 튜빙(Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/Por 1-3, 3.5K MWCO, 54 mm FLAT WIDTH, 일련 번호: 132725, 스펙트럼 라보라토리즈 인코포레이티드, 미국 캘리포니아 90220 란초 도밍게즈 소재)을 이용하여 물에 투석시켜 완충염을 제거하였다. 상기 투석 튜빙에 대략 0.15 L의 상기 파파인 분해된 단일클론 항체 용액을 로딩하고 또 4.0 L의 물에 24시간 동안 침지하였다. 상기 투석 튜빙은 4.0L의 새로운 물을 함유하는 새로운 용기로 이동시키며, 그곳에서 부가적으로 24시간 동안 침지하였다.

단편첨가된 MAB II 저장 용액은 물 중의 144 mL의 MAB II 용액, 물 중의 36 mL의 파파인 분해된 MAB II, 및 18 mL의 250 mM Tris 염기를 조합하는 것에 의해 제조하였다. 상기 용액은 1.8 M Tris 염기를 부가하는 것에 의해 pH 9.0으로 조정하였다. 이 용액을 0.22 μm 막(Stericup-GP 0.22 μm Millipore Express PLUS 막, 250 mL, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하였다. 생성한 용액은 4.5 mS/cm의 도전율을 가졌다. 용액 도전율이 22 mS/cm에 도달할 때까지, pH 9.0에서의 단편첨가된 MAB II 용액의 일부에 4.0 M 염화 나트륨을 부가하였다.

4.5 mS/cm 또는 22 mS/cm을 갖는 pH 9.0 단편첨가된 MAB II 용액의 일부의 pH는 3.0M 아세트산을 부가하는 것에 의해 pH 8.0으로 감소시켰다. pH 8.0에서의 이들 용액의 일부의 pH는 3.0 M 아세트산을 부가하는 것에 의해 pH 7.0으로 감소시켰다. pH 7.0의 이들 용액의 일부의 pH는 3.0M 아세트산을 부가하는 것에 의해 pH 6.0으로 감소시켰다. pH 6.0의 이들 용액의 일부의 pH는 3.0M 아세트산을 부가하는 것에 의해 pH 5.0으로 감소시켰다. pH 5.0의 이들 용액의 일부의 pH는 3.0M 아세트산을 부가하는 것에 의해 pH 4.0으로 감소시켰다. 따라서, 상기 방법을 이용하여, pH 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 또는 9.0이고 4.5 mS/cm 또는 22 mS/cm의 도전율을 갖는 12개의 단편첨가된 MAB II 용액을 얻었다. 단편첨가된 MAB II 용액은 6.38-7.44 mg/mL의 MAB II 및 1.5-1.7%의 단편을 함유하였다.

각 용액 pH 및 도전율에 대한 15 mL 원심분리관에 20 mg의 Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재)를 로딩하였다. 15 mL 원심분리관의 부가적 세트를 대조군으로 이용하고 또 매질을 부가하지 않았다. 각 관에는 적절한 pH와 도전율을 갖는 단편첨가된 MAB II 저장 용액 5.0 mL를 부가하였다. 상기 관들을 24시간 동안 회전시키고 또 샘플들은 0.22 마이크론 막(Millex Syringe Filter Units, Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, 감마 멸균됨, 카탈로그 번호: SLGV033RB, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과시켜 용액에 현탁되어 잔류할 수 있는 활성탄 입자를 제거하였다. 샘플 중에 잔류하는 MAB II의 농도는 280 nm에서 UV 분광광도계를 이용하여 결정하였다. 샘플 중에 잔존하는 단편의 퍼센트는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정하였다.

표 VII 및 도 4에 요약한 바와 같이, 상기 실험은 낮은 용액 전도율 및 높은 용액 전도율에서 4.0 내지 9.0의 넓은 범위의 pH에 걸쳐 단일클론 항체 용액으로부터 활성탄을 사용하여 단일클론 항체 단편이 선택적으로 제거될 수 있음을 나타낸다.

표 VII. 낮은 용액 전도율 및 및 높은 용액 전도율에서 4.0 내지 9.0의 pH 범위에 걸쳐 활성탄을 사용하여 MAB II 용액을 정적 처리한 후 단일클론 항체의 회수율 및 단편의 퍼센트

본 명세서는 참조로 본 명세서에 포함되는 명세서에 인용된 참고문헌의 가르침을 참조하여 대부분 잘 이해된다. 본 명세서에 내의 실시양태는 본 발명에서 실시예의 설명을 제공하며 그 범위를 제한하려는 것이 아니다. 당업자들은 다수의 다른 실시양태가 본 발명에 포함됨을 인지할 것이다. 모든 공개문헌 및 발명은 참고로 본 명세서에 포함된다. 참조로 포함된 자료가 본 본 발명의 명세서와 상반되거나 일치하지 않는 경우, 본 발명의 명세서에 개시된 내용이 이러한 자료를 대체할 것이다. 본 명세서에서 참고문헌의 인용은 그러한 참고문헌이 본 발명의 선행기술이라고 인정하는 것은 아니다.

다르게 나타내지 않는 한, 특허청구범위를 포함한 본 발명의 명세서에서 이용된 성분, 세포 배양물, 처리 조건 등과 관련된 양을 표현하는 모든 숫자는 예를 들어 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해된다. 따라서, 상반되게 나타내지 않는 한, 숫자 변수는 근사치이고 또 본 발명에 의해 얻고자 하는 소망하는 특성에 따라서 달라질 수 있다. 다르게 나타내지 않는 한, 일련의 요소 앞에 나오는 용어 "적어도"는 이 시리즈 중의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해된다. 당업자들은 통상적인 실험 이외에, 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 다수의 등가물을 이용하여 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 이하의 특허청구범위에 의해 포함되는 것으로 이해된다.

본 발명의 다수의 변형 및 변이는 당업자에게 분명한 바와 같이 본 발명의 정신과 범위로부터 벗어나지 않고 행해질 수 있다. 본 명세서에 기재된 특정 실시양태는 예시적으로만 기재된 것이고 어떠한 의미로든 제한을 의미하지 않는다. 명세서 및 실시예는 예시적으로만 간주되어야 하고, 본 발명의 진정한 범위 및 정신은 이하의 특허청구범위에 의해 표시된다.

Claims (22)

1. (a) 표적 단백질 및 표적 단백질의 단편을 포함하는 샘플을 제공하는 단계, 상기 단편은 표적 단백질의 양의 적어도 0.2% 이상의 양으로 존재함;
   (b) 상기 샘플을 활성탄과 접촉시키는 단계, 상기 활성탄은 단편과 결합함; 및
   (c) 상기 샘플로부터 활성탄을 제거함으로써 샘플 중의 단편의 양을 감소시키는 단계를 포함하는,
   정제될 표적 단백질을 포함하는 샘플에서 단편의 양을 감소시키기 위한 방법으로서, 표적 단백질이 Fc-영역 함유 단백질인 방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, Fc-영역 함유 단백질이 항체인 방법.
4. 제3항에 있어서, 항체가 단일클론 항체인 방법.
5. 제3항에 있어서, 항체가 다중클론 항체인 방법.
6. 제1항에 있어서, 활성탄이 장치에 팩킹되어 있는 방법.
7. 제6항에 있어서, 장치가 컬럼, 포드, 카트리지, 또는 캡슐인 방법.
8. 제1항에 있어서, 단편이 표적 단백질의 양의 적어도 0.5% 이상의 양으로 존재하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 단편이 표적 단백질의 양의 적어도 1% 이상의 양으로 존재하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 단편이 표적 단백질의 양의 적어도 2% 이상의 양으로 존재하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 단계(c)가 샘플로부터 활성탄을 제거하기 위하여 여과 또는 원심분리 또는 그의 조합을 이용하는 것을 포함하는 방법.
12. (a) 항체 및 항체 단편을 포함하는 샘플을 제공하는 단계, 상기 단편은 항체의 양의 적어도 0.2% 이상의 양으로 존재함,
    (b) 상기 샘플을 활성탄과 접촉시키는 단계, 상기 활성탄은 항체 단편과 결합함,
    (c) 상기 샘플로부터 활성탄을 제거하여, 샘플 중의 단편의 양을 감소시키는 단계를 포함하는, 정제될 항체를 포함하는 샘플 중의 항체 단편의 양을 감소시키는 방법.
13. 제12항에 있어서, 단편이 단백질 A에 결합하는 방법.
14. 제12항에 있어서, 단편이 단백질 A에 결합하지 않는 방법.
15. 제12항에 있어서, 샘플이 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 수집된 용리액인 방법.
16. 제12항에 있어서, 활성탄이 컬럼, 포드, 카트리지, 또는 캡슐에 팩킹되는 방법.
17. 제12항에 있어서, 단편이 항체의 양의 적어도 0.5% 이상의 양으로 존재하는 방법.
18. 제12항에 있어서, 단편이 항체의 양의 적어도 1% 이상의 양으로 존재하는 방법.
19. 제12항에 있어서, 단편이 항체의 양의 적어도 2% 이상의 양으로 존재하는 방법.
20. 제12항에 있어서, 상기 활성탄은 여과 또는 원심분리 또는 그의 조합을 이용하여 제거되는 방법.
21. 제1항에 있어서, 샘플 중의 표적 단백질의 순도는 단편 양의 감소 이후 증가하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 표적 단백질의 순도는 적어도 10% 이상 증가하는 방법.

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