CN105324166A - 利用活性炭从包含靶蛋白的样品去除片段 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新的和改良的蛋白纯化方法，其涉及某种类型的含碳物质，并且导致高效且选择性地去除蛋白片段而不会不利影响期望的蛋白产物的收率。

Description

利用活性炭从包含靶蛋白的样品去除片段
技术领域
本发明涉及使用活性炭从样品去除靶蛋白片段。
背景技术
最常用的纯化蛋白如单克隆抗体的方法通常采用能够将蛋白分泌入细胞培养基的工程化细胞系(例如，CHO细胞系)。然后使包含所关注的蛋白的培养基或细胞培养进料进行一系列纯化步骤以分离蛋白与各种杂质，例如，细胞、细胞碎片、DNA、宿主细胞蛋白等。
典型的纯化方法通常需要使包含蛋白的细胞培养进料或培养基进行澄清步骤，然后使澄清的细胞培养进料进行抗体捕获步骤(例如，A蛋白亲和色谱步骤)，然后阳离子交换结合/洗脱色谱步骤和/或阴离子交换色谱步骤。
虽然设计纯化方法中的各种步骤去除包含蛋白的细胞培养进料中的杂质，但是不期望的蛋白片段通常难以去除，因为它们享有许多与完整蛋白相同的特性。
活性炭以前已用于空气过滤器(参见例如，美国专利第6,413,303号)、气体净化(参见例如，美国专利第7,918,923号)、脱咖啡因(参见例如，美国专利第4,481,223号)、黄金提纯(参见例如，美国专利第5,019,162号)、燃料纯化(参见例如，美国公开第2006/0223705A1号)、血液灌流(参见例如，美国专利第4,048,064号)、中毒和过量用药的治疗(参见例如，美国专利第4,453,929号)、污水处理(参见例如，美国专利第8,329,035号)、漏油清理(参见例如，美国专利第4,770,715号)、地下水修复(参见例如，美国专利第6,116,816号)、从汽车染料系统捕获挥发性有机化合物(参见例如，美国专利第7,044,112号)、化学纯化(参见例如，美国专利第4,906,445号)，蒸馏酒精饮料纯化(参见例如，美国公开第US2007/0248730A1号)、糖的脱色(参见例如，美国专利第2,082,425号)、口罩(参见例如，美国专利第5,714,126号)、防毒面具(参见例如，美国专利第4,992,084号)、防护防化服(参见例如，美国专利第7,877,819号)以及水净化过程(参见例如，美国专利第7,537,695号)。
此外，活性炭已用来从血清白蛋白去除小分子杂质如脂肪酸和胆红素(参见例如，Chenetal.,J.Biol.Chem.,242:173-181(1967)；Nakanoetal.,AnalBiochem.,129:64-71(1983)；Nikolaevetal.,Int.J.Art.Org.,14:179-185(1991))。活性炭还已用来在植物病毒的纯化期间去除色素以及宿主蛋白、蛋白酶和核糖核酸酶(参见例如，Price,Am.J.Botany,33:45-54(1946)；Corbett,Virology,15:8-15(1961)；McLeanaetal.,Virology,31:585-591(1967),美国公开第US2006/0281075A1号)。此外，还已描述活性炭可用于从质粒DNA去除低分子量质粒片段。参见，Kimetal.,J.Biosci.Bioeng.110:608-613(2010)。
此外，整体援引加入本文的2012年8月2日提交的美国专利申请系列号13/565,463描述了活性炭联合其他介质在从包含所关注的生物分子(例如，抗体)的样品去除蛋白杂质(例如，宿主细胞蛋白)中的用途。
最后，援引加入本文的2013年2月26日提交的美国临时专利申请系列号61/769,269描述了活性炭在通过改变溶液条件来从蛋白混合物选择性去除蛋白中的用途。
发明内容
本发明至少部分是基于令人惊讶和出乎意料的发现，活性炭可以用于从包含待纯化的靶蛋白(例如，单克隆抗体)的样品去除片段。
在一些实施方案中，提供一种减少包含待纯化的靶蛋白的样品中片段的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含靶蛋白和片段的样品，其中所述片段以等于或大于所述靶蛋白量的至少0.2％的量存在；(b)使所述样品与活性炭接触，其中所述活性炭结合所述片段；以及(c)从所述样品去除所述活性炭，从而减少所述样品中所述片段的量。
在一些实施方案中，所述靶蛋白为包含Fc-区的蛋白。在其他实施方案中，所述靶蛋白为非免疫球蛋白。
在一些实施方案中，所述包含Fc-区的蛋白为抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。在其他实施方案中，所述抗体为多克隆抗体。
在一些实施方案中，所述片段的量等于或大于所述靶蛋白量的至少0.5％。在其他实施方案中，所述片段的量等于或大于所述靶蛋白量的至少1％。在其他实施方案中，所述片段的量等于或大于所述靶蛋白量的至少2％。
在一些实施方案中，提供一种减少包含待纯化的抗体的样品中抗体片段的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含抗体和抗体片段的样品，其中所述抗体片段以等于或大于所述抗体量的至少0.2％的量存在；(b)使所述样品与活性炭接触，其中所述活性炭结合所述抗体片段；以及(c)从所述样品去除所述活性炭，从而导致减少所述样品中片段的量。在一些实施方案中，所述抗体片段以等于或大于所述抗体量的至少0.5％的量存在。在其他实施方案中，所述抗体片段以等于或大于所述抗体量的至少1％的量存在。在其他实施方案中，所述抗体片段以等于或大于所述抗体量的至少2％的量存在。
在一些实施方案中，抗体片段包括结合A蛋白的片段。在其他实施方案中，抗体片段不结合A蛋白。
在一些实施方案中，所述样品是收集自A蛋白色谱柱的洗脱液。
在一些实施方案中，将所述活性炭包装在装置中。示例性装置包括例如柱(例如，色谱柱)、荚(pod)、圆盘、筒(cartridge)和胶囊。
在各种实施方案中，本文所述的方法导致靶蛋白或抗体(视情况而定)纯度的增加。相对于未与活性炭接触的样品，靶蛋白或抗体的纯度可以增加例如至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或更多。
在一些实施方案中，包含靶蛋白的样品(或包含抗体的样品)为细胞培养进料。在其他实施方案中，在与活性炭接触之前首先将细胞培养物澄清和/或纯化。澄清方法包括但不限于离心、沉降、深层过滤、筛过滤、絮凝、使用刺激响应性聚合物以及pH改变。
在一些实施方案中，在使所述样品进行本文所述方法之前使所述样品进行一个或多个纯化步骤或方法。这类纯化步骤或方法包括但不限于以结合和洗脱或者流过模式操作的柱和/或膜色谱；结晶；两相或三相分配；以及过滤。
附图说明
图1为示出代表性实验结果的图，证实通过流过活性炭柱从单克隆抗体溶液去除单克隆抗体片段。使包含5.01mg/mL的MABI和2.01％的片段的掺入片段的MABI溶液通过装有活性炭的柱。X-轴示出通过柱的单克隆抗体的质量除以活性炭体积(kg/L)，左侧Y-轴示出累积部分池中片段的百分比，而右侧Y-轴示出累积部分池中单克隆抗体的浓度除以进料中单克隆抗体的浓度。
图2为示出代表性实验结果的图，证实通过流过活性炭柱从单克隆抗体溶液去除结合A蛋白的单克隆抗体片段。使包含7.13mg/mL的MABIII和3.50％的片段的掺入片段的MABIII溶液通过装有活性炭的柱。X-轴示出通过柱的单克隆抗体的质量除以活性炭体积(mg/mL)，左侧Y-轴示出特定柱部分中收集的单克隆抗体中片段的百分比，而右侧Y-轴示出特定柱部分中单克隆抗体的浓度除以进料中单克隆抗体的浓度。
图3为示出代表性实验结果的图，证实通过流过装有活性炭的柱从单克隆抗体溶液去除不结合A蛋白的单克隆抗体片段。使包含1.27mg/mL的MABIII和4.84％的片段的掺入片段的MABIII溶液通过活性炭柱。X-轴示出通过柱的单克隆抗体的质量除以活性炭体积(mg/mL)，左侧Y-轴示出特定柱部分中收集的单克隆抗体中片段的百分比，而右侧Y-轴示出特定柱部分中单克隆抗体的浓度除以进料中单克隆抗体的浓度。
图4为示出代表性实验结果的图，证实通过在静态结合条件下用活性炭处理，在低和高溶液电导率下于4.0-9.0的溶液pH下从单克隆抗体溶液去除单克隆抗体片段。用活性炭处理的pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0或9.0的掺入片段的MABII溶液包含6.38-7.44mg/mL的MABII和1.5-1.7％的片段，在低和高电导率下。X-示出溶液pH，而Y-轴示出通过用100％减去处理的溶液中片段的百分比除以未处理的溶液中片段的百分比计算的从单克隆抗体溶液去除的片段的百分比。
具体实施方式
本发明提供新的和改良的从包含待纯化的靶蛋白的样品去除片段的方法。
纯化蛋白，特别是抗体的方法已相当成熟。纯化蛋白(例如，单克隆抗体)期间常用的关键步骤之一是捕获或亲和步骤，其通常采用特异性结合待纯化的蛋白的配体或化合物。例如，在单克隆抗体的情况下，这样的步骤通常采用A蛋白亲和色谱。
虽然捕获步骤可用于分离靶蛋白与高百分比的各种不期望的实体(例如，杂质)，但是捕获步骤一般在减少包含靶蛋白的部分中靶蛋白片段的量中是无效的，因为许多片段与亲和配体相互作用并最终在与靶蛋白相同的部分中。片段是需要从纯化的蛋白去除的不期望的杂质，特别是在需要监管机构批准的治疗性蛋白的情况下。
通常已描述3种类型的介质用于去除片段。这些之一是大小排阻色谱，其基于它们流体动力学体积的差异分离片段与完整蛋白(例如，单克隆抗体)。但是，大小排阻色谱最常用于分析评价，并且难以放大用于蛋白如单克隆抗体的实用纯化。已描述可用于去除包括片段在内的各种杂质的另一介质是陶瓷羟基磷灰石(参见例如，美国专利公开第US20100234577号)。陶瓷羟基磷灰石最常用来以结合和洗脱模式去除聚集的抗体杂质。最后，描述了混合模式配体可用于以结合和洗脱模式利用疏水电荷诱导色谱分离片段(参见例如，J.Chromatogr.B.；755:37-46(2001))。
活性炭以前已用于水纯化方法。此外，活性炭已用来从血清白蛋白去除小分子杂质如脂肪酸和胆红素(参见例如，Chenetal.,J.Biol.Chem.,242:173-181(1967)；Nakanoetal.,AnalBiochem.,129:64-71(1983)；Nikolaevetal.,Int.J.Art.Org.,14:179-185(1991))。活性炭还已用来在植物病毒的纯化期间去除色素以及宿主蛋白、蛋白酶和核糖核酸酶(参见例如，Price,Am.J.Botany,33:45-54(1946)；Corbett,Virology,15:8-15(1961)；McLeanaetal.,Virology,31:585-591(1967)。
因此，已报道活性炭非特异性地结合溶液中的分子(例如，水样品中的杂质)。
最近，已描述在蛋白纯化过程期间使用活性炭。例如，整体援引加入本文的2012年8月2日提交的美国专利申请系列号13/565,463描述了活性炭联合其他介质在从包含所关注的生物分子(例如，抗体)的样品去除蛋白杂质(例如，宿主细胞蛋白)中的用途。此外，援引加入本文的2013年2月26日提交的美国临时专利申请系列号61/769,269描述了活性炭在通过改变溶液条件来从蛋白混合物选择性去除蛋白中的用途。
如本文实施例中证实的，活性炭可以用于减少包含待纯化的靶蛋白的样品中靶蛋白片段的量。此外，如本文所述，活性炭可以用来增加包含靶蛋白和蛋白片段的溶液中靶蛋白的纯度，其中利用活性炭去除片段导致样品中靶蛋白的纯度增加。
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。额外的定义在整个详细说明书中示出。
I.定义
在本文中可交换使用的术语“活性炭(activecarbon)”或“活性炭(activatedcarbon)”指已进行增加其孔结构的处理的含碳物质。活性炭有时还称作活性木炭。活性炭是具有非常高表面积的多孔固体。它们可以源自各种来源，包括煤炭、木材、椰壳、果壳和泥炭。可以利用在受控气氛下物理活化(包括加热)或者利用强酸、碱或氧化剂化学活化来从这些材料制备活性炭。活化过程产生具有高表面积的多孔结构，这赋予活性炭高的杂质去除能力。可以修改活化过程以控制表面的酸性。
典型的活化过程包括使碳源如树脂废物、煤炭、煤焦、石油焦、褐煤、聚合材料、以及包括纸浆和纸的木质纤维素材料、来自纸浆生产的残余物、木材(如木屑、锯末和木粉)、坚果壳(如杏仁壳和椰子壳)、果仁以及果核(如橄榄核和樱桃核)进行热过程(例如，用氧化性气体)或化学过程(例如，用磷酸或金属盐，如氯化锌)。包括用磷酸(H3PO4)化学活化基于木材的碳的示例性过程公开于美国专利第Re.31,093号，其导致碳的脱色和气体吸附能力的提高。而且，美国专利第5,162,286号教导了基于木材的材料的磷酸活化，所述基于木材的材料特别致密且包含相对高(30％)的木质素含量，如坚果壳、果核和果仁。木质纤维素材料的磷酸活化还在美国专利第5,204,310号中讨论，作为制备高活性和高密度的碳的一个步骤。这段中列出的每个专利的教导整体援引加入本文。
与大多数其他吸附材料相反，据信活性炭利用相对弱的范德华力或伦敦分散力与分子相互作用。如通过基于氮吸附的Brunauer-Emmett-Teller(“BET”)方法(本领域公知的方法)测量的，典型的商业活性炭产品表现出至少300m2/g的表面积。
虽然，活性炭(activecarbon，activatedcarbon)以前已用于纯化液体和气体的方法以及用于通过结合杂质如宿主细胞蛋白来从其他杂质纯化重组表达抗体的方法(参见例如，美国公开第13/565,463号)，但是其以前尚未用于从样品去除片段(例如，抗体片段)。
在一些实施方案中，提供样品，其包含待纯化的蛋白(例如，单克隆抗体)和片段，所述片段的量等于或大于纯化的靶蛋白量的至少0.2％。在其他实施方案中，片段以等于或大于待纯化的靶蛋白量的至少0.5％，或者等于或大于待纯化的靶蛋白量的至少1％的量存在。一般来说，去除片段之后，去除片段之后保留的靶蛋白的纯度增加。纯度增加的蛋白称作靶蛋白。靶蛋白可以是免疫球蛋白或非免疫球蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白为免疫球蛋白，例如单克隆抗体。
以下是可以根据本发明纯化的蛋白的实例。如上文讨论的，在一些实施方案中，靶蛋白为单克隆抗体。靶蛋白的其他实例包括重组蛋白，其包括但不限于重组人生长激素、重组人胰岛素、重组促卵泡激素、重组因子VII(抗血友病因子)、重组人促红细胞生成素、重组粒细胞集落刺激因子、重组α-半乳糖苷酶a、重组艾杜糖苷酸酶、重组加硫酶(galsulfase)、重组链道酶α、重组组织纤溶酶原激活物、重组人干扰素、重组胰岛素样生长因子1以及重组天冬酰胺酶。
在本发明的其他实施方案中，靶蛋白是源自人血液或其他生理流体的蛋白。这类蛋白的实例包括但不限于免疫球蛋白G和M、VIII因子、IX因子、抗凝血酶III以及α-I-抗胰蛋白酶。
术语“免疫球蛋白”、“Ig”或“IgG”或“抗体”(在本文中可交换使用)指具有由两条重链和两条轻链组成的基本4-多肽链结构的蛋白，例如通过链间二硫键稳定所述链，其具有特异性结合抗原的能力。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(在本文中可交换使用)指具有由一条重链和一条轻链组成的2-多肽链结构的蛋白，例如通过链间肽接头稳定所述链，其具有特异性结合抗原的能力。术语“结构域”指包含例如通过β-折叠和/或链内二硫键稳定的肽环(例如，包含3-4个肽环)的重链或轻链多肽的球状区域。基于在“恒定”结构域的情况下在各种类别成员的结构域内相对缺少序列变化，或者在“可变”结构域的情况下在各种类别成员的结构域内的显著变化，结构域在本文中进一步称为“恒定”或“可变”的。抗体或多肽“结构域”在本领域中常可交换地称作抗体或多肽“区”。抗体轻链的“恒定”结构域可交换地称为“轻链恒定区”、“轻链恒定结构域”、“CL”区或“CL”结构域。抗体重链的“恒定”结构域可交换地称为“重链恒定区”、“重链恒定结构域”、“CH”区或“CH”结构域。抗体轻链的“可变”结构域可交换地称为“轻链可变区”、“轻链可变结构域”、“VL”区或“VL”结构域。抗体重链的“可变”结构域可交换地称为“重链可变区”、“重链可变结构域”、“VH”区或“VH”结构域。
免疫球蛋白或抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以以单体或聚合物形式存在，例如以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗体。免疫球蛋白或抗体还可以包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
术语“Fc区”和“包含Fc区的蛋白”表示所述蛋白包含免疫球蛋白的重链和/或轻链恒定区或结构域(如先前定义的CH和CL区)。包含“Fc区”的蛋白可以具有免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能。“Fc区”如CH2/CH3区可以选择性地结合至亲和配体如A蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，包含Fc区的蛋白特异性地结合A蛋白或者其功能衍生物、变体或片段。在其他实施方案中，包含Fc区的蛋白特异性地结合G蛋白或L蛋白，或者它们的功能衍生物、变体或片段。
如上文讨论的，在一些实施方案中，靶蛋白为包含Fc区的蛋白，例如，免疫球蛋白。在一些实施方案中，包含Fc区的蛋白为重组蛋白，其包括融合至另一多肽或其片段的免疫球蛋白的Fc区。
一般来说，免疫球蛋白或抗体针对所关注的“抗原”。优选地，抗原是生物学上重要的多肽，并且向患有疾病或病症的哺乳动物给药抗体可以在该哺乳动物中导致治疗益处。
在本文中可交换使用的术语“单克隆抗体”或“MAb”指获得自一群基本上均质的抗体的抗体，即该群中的各个抗体除了少量可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的特征为获得自基本上同质的抗体群体，并且不应当理解为要求通过任何特定方法制备抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohleretal.,Nature256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如，美国专利第4,816,567号)。“单克隆抗体”还可以利用Clacksonetal.,Nature352:624-628(1991)和Marksetal.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术分离自噬菌体抗体文库。单克隆抗体还可以称作“MAb”或“mab”或“mAb”或“MAB”。
单克隆抗体还可以包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中部分重链和/或轻链与源自特定物种的抗体或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源，而链的剩余部分与源自另一物种的抗体或者属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源；以及这类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性(美国专利第4,816,567号；和Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。
在本文中使用的术语“高变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(即轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；ChothiaandLeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。“框架”或“FR”残基是除如本文所定义的高变区残基以外的那些可变结构域残基。
非人(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式为嵌合抗体，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基被具有期望的特异性、亲和性和能力(capacity)的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基代替。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步精制抗体的性能。一般来说，人源化抗体包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体可以包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节参见Jonesetal.,Nature321:522-525(1986)；Riechmannetal.,Nature332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
如本文所用，术语“片段”或“多个片段”是包括部分靶蛋白并具有少于靶蛋白的质量的杂质。靶蛋白中化学键的断裂导致一种或多种片段的形成。靶蛋白的不正确或不完整合成也可以导致片段。片段是靶蛋白纯化期间需要去除的常见杂质。它们是难以从靶蛋白分离的杂质，因为它们常具有与靶蛋白非常相似的特性，如它们的疏水性和等电点。例如，如果亲和色谱用于捕获靶蛋白，则包含亲和配体的结合结构域的片段也被捕获，并且必须在后来的步骤中去除。
如本文所用，术语“溶液”、“组合物”或“样品”指至少一种待纯化的靶蛋白和靶蛋白片段的混合物，所述靶蛋白片段以等于或大于靶蛋白量的至少0.2％的量存在。在一些实施方案中，样品包含细胞培养进料，例如来自包含靶蛋白(例如，单克隆抗体)的哺乳动物细胞培养物(例如，CHO细胞)的进料。在一些实施方案中，样品包含已进行澄清的细胞培养进料。在一具体实施方案中，样品包含来自亲和色谱柱(例如，A蛋白亲和色谱柱)的洗脱液。样品还涵盖用于产生所关注的蛋白或靶蛋白的非哺乳动物表达系统。
如本文所用，术语“非哺乳动物表达系统”指用来产生治疗性蛋白的所有宿主细胞或生物体，其中所述宿主细胞或生物体是非人来源的。用于产生所关注的蛋白或靶蛋白的非哺乳动物表达系统的实例包括酵母如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(Pichiapastoris)，细菌如大肠杆菌(Escherichiacoli)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、桥石短芽孢杆菌(Brevibacilluschoshinensis)，昆虫细胞如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞、杆状病毒感染的昆虫细胞，以及藻类细胞。
在本文中可交换使用的术语“所关注的蛋白”和“靶蛋白”指蛋白或多肽，其纯化自靶蛋白和蛋白片段的混合物。在一具体实施方案中，靶蛋白为免疫球蛋白。
在本文中可交换使用的术语“A蛋白”或“ProA”涵盖从其天然来源(例如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))回收的A蛋白，合成制备的A蛋白(例如，通过肽合成或通过重组技术)，以及保留结合具有CH2/CH3区如Fc区的蛋白的能力的片段和变体。A蛋白可以商购自Repligen、Pharmacia、EMDMillipore和Fermatech。一般将A蛋白固定在固相支持材料上。术语“ProA”还指亲和色谱树脂或柱，其包含共价连接A蛋白的色谱固体支持基质。
在本文中可交换使用的术语“纯化”、“增加纯度”、“分离(separating)”或“分离(isolating)”指通过利用本文所述的方法选择性地去除片段来增加靶蛋白比靶蛋白片段的比例。通常，去除包含靶蛋白的样品中的片段之后，靶蛋白的纯度增加50％、或60％、或70％、或80％、或90％或更多。
如本文所用，在本文中可交换使用的术语“去除(remove)”、“去除(removing)”、“去除(removal)”、“减少(reduce)”、“减少(reducing)”或“减少(reduction)”指利用本文所述的方法降低样品中片段的量，所述样品包含待纯化的靶蛋白以及靶蛋白片段，所述靶蛋白片段的量等于或大于靶蛋白量的至少0.2％。在一些实施方案中，样品包含片段，所述片段的量等于或大于靶蛋白量的至少0.5％。在其他实施方案中，样品包含片段，所述片段的量等于或大于靶蛋白量的至少1％，或者等于或大于靶蛋白量的至少2％。如本文证实的，活性炭选择性地结合片段，并且在从样品去除结合至片段的活性炭时样品中的片段水平降低。
在本文中可交换使用的术语“选择性地去除(selectivelyremove)”、“选择性地去除(selectivelyremoved)”和“选择性去除”指活性炭特异性地结合样品中的靶蛋白片段的能力，所述样品包含待纯化的靶蛋白和靶蛋白片段，所述靶蛋白片段的量等于或大于靶蛋白量的至少0.2％。因此，虽然活性炭结合靶蛋白片段，但是其不结合靶蛋白本身，从而导致在从样品去除活性炭之后从样品选择性地去除片段。
如本文所用，术语“澄清(clarify)”、“澄清(clarification)”和“澄清步骤”指用于去除悬浮的颗粒和或胶体的加工步骤，从而减少包含靶蛋白的溶液的浊度，如测量的以NTU(比浊法浊度单位)计的。澄清可以通过各种方式实现，包括离心或过滤。离心可以以分批或连续模式进行，而过滤可以以正常流动(例如深层过滤)或切向流模式进行。在现在工业中使用的方法中，离心之后通常是深层过滤，深层过滤意图去除离心尚未去除的不溶性杂质。此外，可以使用增加澄清效率的方法，例如沉淀。杂质的沉淀可以通过各种方式进行，例如通过絮凝、pH调节(酸沉淀)、温度变化、由于刺激响应性聚合物或小分子的相改变或者这些方法的任何组合。在本文所述的一些实施方案中，澄清包括离心、过滤、深层过滤和沉淀中的两种或更多种的任何组合。
在本文中可交换使用的术语“流过方法”、“流过模式”和“流过色谱”指一种产物分离技术，其中样品中的至少一种产物意图流过含碳介质，而至少一种潜在组分结合至所述含碳介质(例如，活性炭)。
意图流过的样品一般称作“流动相”。“流过模式”一般为等度运行(即，期间流动相的组成未改变的过程)。用于流过的介质通常用包含靶蛋白分子的相同缓冲液溶液预平衡。纯化之后，可以用额外量的相同缓冲液冲洗介质以增加产物回收率。
术语“缓冲液”指通过其酸-碱缀合组分的作用抗pH变化的溶液。可以用于本文所述方法的各种缓冲液描述于Buffers.AGuideforthePreparationandUseofBuffersinBiologicalSystems,Gueffroy,D.,ed.CalbiochemCorporation(1975)。不同缓冲液维持不同范围的pH，例如磷酸盐缓冲液通常用于6.0-8.0的pH，而对于更高的pH，可以使用硼酸盐缓冲液，而对于更低的pH，可以使用碳酸盐缓冲液。本领域技术人员能够根据待维持的pH容易地确定使用的合适缓冲液。可以用于本发明的方法的缓冲液的非限制性实例包括MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、碳酸盐、硼酸盐和铵缓冲液，以及这些的组合。
术语“洗涤缓冲液”或“平衡缓冲液”在本文中可交换使用，指在使样品与含碳物质接触之前用来洗涤或重新平衡含碳物质(例如，活性炭)的缓冲液。
术语“电导率”指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子转运流动。因此，随着水溶液中存在的离子量的增加，溶液会具有较高的电导率。测量电导率的单位为毫西门子(milliSiemens)每厘米(mS/cm或mS)，并且可以利用可商购的电导率计(例如，由Orion销售)进行测量。溶液的电导率可以通过改变其中离子的浓度来改变。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如NaCl或KCl)的浓度以获得期望的电导率。优选地，如下文实施例中，修改各种缓冲液的盐浓度以获得期望的电导率。
II.用于本文所述方法的示例性含碳物质
在本发明的方法中，某些含碳物质如活性炭用于选择性地去除片段。活性炭可以描述为具有非常高表面积的多孔固体。在一些实施方案中，活性炭包含活性木炭。活性炭可以源自各种来源，包括但不限于煤炭、木材、椰壳、果壳和泥炭。可以通过在受控气氛下物理活化(包括加热)或者通过利用强酸、碱或氧化剂化学活化来从这些材料制备活性炭。活化过程产生具有高表面积的多孔结构，这赋予活性炭更大的杂质去除能力。可以修改活化过程以控制表面的酸性。
活性炭可获得自各种商业来源，并且有许多等级和形式。活性炭的一些商业供应商包括公司如MeadWestVacoCorp.,Richmond,VA,USA；NoritAmericasInc.,Marshall,TX,USA；CalgonCarbonCorp.,Pittsburgh,PA,USA。
在本文所述的一些实施方案中，如本文所述，将活性炭掺入包含纤维素的纤维介质中。
可以用于本发明的方法的可商购的活性炭材料包括但不限于NucharHD活性炭(MeadWestVacoCorporation,Richmond,VA,USA)；NucharSA20(MeadWestVacoCorporation,Richmond,VA,USA)；NucharSN(MeadWestVacoCorporation,Richmond,VA,USA)；NucharWV-B30(MeadWestVacoCorporation,Richmond,VA,USA)；RGCPowder活性炭(MeadWestVacoCorporation,Richmond,VA,USA)；NoritDarcoKB-G活性炭(NoritAmericasInc.,Marshall,Texas,USA)；NoritCGPSuper活性炭(NoritAmericasInc.,Marshall,Texas,USA)；NoritASupraUSP(NoritAmericasInc.,Marshall,Texas,USA)；NoritESupraUSP(NoritAmericasInc.,Marshall,Texas,USA)；NoritCGRAN(NoritAmericasInc.,Marshall,Texas,USA)；NoritSXUltra(NoritAmericasInc.,Marshall,Texas,USA)；以及ChemvironPulsorbPGC活性炭(ChemvironCarbon,Feluy,Belgium)。
活性炭的两种主要形式为粉状和颗粒状。粉状活性炭包含小且通常小于1mm直径的颗粒，并且最常用于液体的纯化。颗粒状活性炭具有较大的颗粒和因此较小的表面积，因此其优选用于其中扩散速度较快的气体纯化。
活性炭在消费者应用(如水、食品、饮料和药物纯化)中使用的对安全的重要考虑是减少并控制可提取的化合物。意图用于饮用水和食品接触应用的活性炭通常按照覆盖水的所有间接添加剂的安全标准ANSI/NSFStandard61进行制备。而且，ASTM标准测试方法D6385描述了通过灰化确定活性炭中酸可提取含量，并且可以用来研究和最小化来自活性炭的可提取物水平。
一系列活性炭类型可用于各种应用。例如，MeadWestVacoCorp.提供随它们的能力、表面酸性、对靶分子的孔可接近性和预期应用变化的12种类型的粉状活性炭。一般期望最大化活性炭的杂质去除能力。
III.确定样品中的片段量的方法
确定样品中靶蛋白片段量的一般技术包括几种不同的分析色谱方法。大小排阻或凝胶渗透色谱基于它们流体动力学体积的差异分离片段与靶蛋白。反相HPLC和疏水相互作用色谱(HIC)基于它们疏水性的差异分离片段与靶蛋白。阴离子交换(AEX)和阳离子交换(CEX)色谱基于电荷量的差异分离片段与靶蛋白。混合模式色谱基于它们电荷量和它们疏水性的差异分离片段与靶蛋白。
通常利用在线UV检测器确定回收自色谱柱的溶液中蛋白的相对量，虽然也可以采用其他类型的在线检测器，如折射率检测器、荧光检测器。将所得的色谱图中的不同峰整合以确定靶蛋白峰和对应于靶蛋白片段的峰的面积。然后通过用所有片段峰面积的总和除以靶蛋白峰面积和所有片段峰面积的总和来计算样品中片段的百分比。
确定包含靶蛋白的样品中的片段量的一般技术还包括几种不同的凝胶电泳分析技术，如SDS聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳、自由流电泳、等电聚焦、等速电泳、亲和电泳、免疫电泳、对流电泳和毛细管电泳。然后通常利用染色使一段凝胶中的蛋白量可见。将染色点的强度定量，然后通过用片段峰的强度除以靶蛋白峰的强度和片段峰的强度的总和来计算样品中片段的百分比。
IV.含碳物质在去除片段中的用途
下文描述一种可以用于从包含靶蛋白的样品选择性地去除片段的一般方法。
在一些实施方案中，利用本文所述的方法，通过用活性炭静态处理溶液来从靶蛋白的溶液选择性地减少片段。在这个实施方案中，以干燥形式或悬浮于溶液中来将活性炭添加至包含靶蛋白和待去除的片段的溶液中。然后允许溶液与活性炭相互作用长达48小时的时间。优选保持将活性炭悬浮于溶液内，以便最大化蛋白杂质吸附率。通过移动溶液容器或用磁力搅拌棒搅拌溶液或用机械搅拌器搅拌溶液来搅动溶液。
然后从溶液分离出活性炭，其中活性炭结合至待选择性地去除的片段。可以通过过滤溶液并回收溶液滤液来分离结合的活性炭。或者，可以通过离心溶液或允许结合的活性炭沉降并回收上清溶液来分离结合的活性炭。如果离心或沉降之后任何颗粒留在上清中，可以通过过滤将它们去除。剩余溶液包含降低水平的选择性地去除的片段。
在一些实施方案中，用活性炭的含水浆装载色谱装置，例如柱。还可以将活性炭作为干粉装入装置，例如柱，然后用水溶液湿润。但是，有时，当将柱干包装时，从活性炭之间去除小气泡可能具有挑战性。然后用与包含靶蛋白的溶液相似的缓冲液将柱平衡。随后使溶液以一定流速通过活性炭柱，所述流速导致15sec-10.0min的柱停留时间。然后收集已通过活性炭柱的溶液，其不含或包含降低水平的利用活性炭选择性地去除的片段。
在各种实施方案中，可以通过过滤或者离心或者离心和过滤的组合从包含靶蛋白的样品去除结合至片段的活性炭。可以通过分析色谱(SEC、HIC、AEX、CEX、混合模式)或分析凝胶电泳技术(SDSPAGE、自由流电泳、等电聚焦、等速电泳、亲和电泳、免疫电泳、对流电泳、毛细管电泳)确定靶蛋白溶液中片段的初始水平。
通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应当理解为限制性的。本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及图均援引加入本文。
实施例
实施例1.活性炭在静态结合条件下去除单克隆抗体片段中的用途
这个代表性实施例证实通过用活性炭静态处理可以从包含单克隆抗体的样品选择性地去除单克隆抗体片段。
如下文所述，制备称作MABI和MABII的两种单克隆抗体的溶液，从而其包含约1％单克隆抗体片段，并且在静态结合条件下用活性炭处理。
通过用木瓜蛋白酶消化一部分单克隆抗体以产生片段来开始制备掺入MABI和MABII片段的溶液。消化之后，通过添加0.3M碘乙酸盐溶液来将酶灭活。用透析管(StandardRCDialysisTrialKits,1-3,3.5KMWCO,54mmFLATWIDTH,序列号:132725,SpectrumLaboratories,Inc.RanchoDominguez,CA,90220USA)将木瓜蛋白酶消化的单克隆抗体溶液透析入水以去除缓冲液盐。将透析管装载约0.15L木瓜蛋白酶消化的单克隆抗体溶液并浸入4.0L水中24小时。随后将透析管移入有4.0L新鲜水的新容器中，其中其保持浸没额外的24小时。
掺入片段的MABI储备溶液制备自0.5mL木瓜蛋白酶消化的MABI和8.0mL的pH7.0的25mMTris中的未消化的MABIA蛋白洗脱液。掺入片段的MABII储备溶液制备自1.0mL木瓜蛋白酶消化的MABII、8.0mL水中的未消化的MABII和2.0mL的pH7.0的50mMTris。通过0.22μm膜(Stericup-GP0.22μmMilliporeExpressPLUS膜，250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMDMilliporeCorporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤溶液。掺入片段的MABI溶液包含5.52mg/mL的MABI与1.06％的片段，而掺入片段的MABII溶液包含5.72mg/mL的MABII与0.85％的片段。
对于两种单克隆抗体溶液，将15mL离心管装载0mg、5mg或10mg的NucharHD活性炭(MeadWestVacoCorporation,Richmond,VA,USA)。将2.0mL掺入片段的MABI储备溶液或掺入片段的MABII储备溶液添加至离心管中。允许管旋转20小时。随后将所有管进行离心并通过0.22微米膜(MillexSyringeFilterUnits,Millex-GV,0.22μm,PVDF,33mm,γ灭菌,目录编号：SLGV033RB,EMDMilliporeCorporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤上清溶液，以便去除可能仍然悬浮于溶液中的任何活性炭颗粒。利用IgG定量通过A蛋白HPLC确定样品中剩余的MABI或MABII的量。通过大小排阻色谱(SEC)确定样品中片段的百分比。
如下文表I中总结的，这个实验证实用活性炭静态处理包含单克隆抗体的样品导致选择性地去除认为不期望的单克隆抗体片段。随着添加至单克隆抗体溶液的活性炭的量增加，片段的百分比减少。用10mg活性炭处理样品使MABI溶液中片段的量从1.06％减少至低于SEC的检测限。用10mg活性炭处理使MABII溶液中片段的量从0.85％减少至0.15％。这个数据证实活性炭可以用来在静态结合条件下从样品选择性地去除单克隆抗体片段。
表I.用活性炭静态处理MABI和MABII溶液之后单克隆抗体的回收率和片段的百分比。注意0.00％表示片段的百分比低于SEC的检测限
实施例2.通过流过装有活性炭的色谱柱来从包含单克隆抗体的样品去除 单克隆抗体片段
这个代表性实施例证实通过使样品流过装有活性炭的色谱柱可以从包含单克隆抗体的样品选择性地去除单克隆抗体片段。
如下文所述，用约2％单克隆抗体制备MABI溶液并使其流过装有活性炭的色谱柱。
通过用木瓜蛋白酶消化一部分单克隆抗体以产生片段来开始制备掺入MABI片段的溶液。消化之后，通过添加0.3M碘乙酸盐溶液来将酶灭活。用透析管(StandardRCDialysisTrialKits,1-3,3.5KMWCO,54mmFLATWIDTH,序列号:132725,SpectrumLaboratories,Inc.RanchoDominguez,CA,90220USA)将木瓜蛋白酶消化的单克隆抗体溶液透析入水以去除缓冲液盐。将透析管装载约0.15L木瓜蛋白酶消化的单克隆抗体溶液并浸入4.0L水中24小时。然后将透析管移入有4.0L新鲜水的新容器中，其中其保持浸没额外的24小时。
掺入片段的MABI储备溶液制备自20mL的水中的木瓜蛋白酶消化的MABII溶液和160mL的pH7.0的25mMTris中的未消化的MABIA蛋白洗脱液。通过0.22μm膜(Stericup-GP0.22μmMilliporeExpressPLUS膜，250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMDMilliporeCorporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤溶液。掺入片段的MABI溶液包含5.01mg/mL的MABI与2.01％的片段。
将200mg的水中成浆的NucharHD活性炭(MeadWestVacoCorporation,Richmond,VA,USA)装入玻璃色谱柱(OmnifitBenchmarkColumn10mm/100mm,10mm直径,100mm长度,SKU:006BCC-10-10-AF,DibaIndustries,Danbury,CT06810,US)。通过使水流过来包装柱，这导致0.8mL的包装柱体积。用pH7.0的25mMTris将柱平衡。
然后，使154mL掺入片段的MABI溶液以0.40mL/min通过活性炭柱，给出2.0分钟的柱停留时间。收集6个25mL部分。随后使10mL的pH7.0的25mMTris通过柱，同时收集额外的10mL部分。利用IgG定量通过装有A蛋白亲和色谱柱的HPLC系统(“A蛋白HPLC”)确定单个部分以及所有7个部分的成比例汇集样品中MABI的量。通过大小排阻色谱(SEC)确定单个部分以及所有7个部分的成比例汇集样品中片段的百分比。
如下文表II和图1中总结的，这个实验证实通过流过装有活性炭的色谱柱可以从单克隆抗体样品选择性地去除单克隆抗体片段。
表II.通过活性炭柱之后收集的汇集部分中MABI的归一化浓度和片段的百分比
实施例3.从包含单克隆抗体的样品选择性地去除结合A蛋白的单克隆抗 体片段
这个代表性实施例证实通过流过装有活性炭的色谱柱可以从包含单克隆抗体的样品选择性地去除结合A蛋白的单克隆抗体片段。
用约3.5％结合A蛋白的单克隆抗体片段制备MABIII的样品。如下文所述，然后使这个样品流过装有活性炭的色谱柱。
用40ml的24.3mg/mlMABIII溶液开始制备结合A蛋白的单克隆抗体片段，用100mM磷酸钠缓冲液和半胱氨酸将其稀释。然后，添加木瓜蛋白酶直至0.11mg/ml的终浓度。将溶液在37℃下温育3小时，然后通过添加碘乙酸盐以给出20mM的最终碘乙酸盐溶液浓度来将木瓜蛋白酶灭活。为了确保完全酶失活，在允许冷却至室温之前将溶液在37℃下温育额外的一小时。消化之后，通过利用聚醚砜膜(PelliconXLFilter,截止30KDa,EMDMilliporeCorporation,Billerica,MA01821)超滤/渗滤来将溶液浓缩。然后，使浓缩的MABIII消化液缓冲液交换入pH7.4的20mMPBS。使pH7.4的浓缩的MABIII消化液经过A蛋白柱(UltraPlus,10*100mm,MerckKGaA,Darmstadt,Germany)。用pH7.4的20mMPBS缓冲液洗涤之后，用pH2.9的100mM甘氨酸缓冲液从柱洗脱结合A蛋白的MABIII片段。然后通过添加2.0MTris碱的溶液来将洗脱部分的pH增加至pH5.4。
掺入片段的MABIII样品制备自120mL的pH7.0的MABIII溶液和12mL的MABIII片段溶液。通过0.22μm膜(Stericup-GP0.22μmMilliporeExpressPLUS膜，250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMDMilliporeCorporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤掺入片段的MABIII样品。掺入片段的MABIII溶液包含7.13mg/mL的MABIII与3.50％的片段。
将250mg的水中成浆的NucharHD活性炭(MeadWestVacoCorporation,Richmond,VA,USA)装入玻璃色谱柱(OmnifitBenchmarkColumn10mm/100mm,10mm直径,100mm长度,SKU:006BCC-10-10-AF,DibaIndustries,Danbury,CT06810,US)。通过使水流过来包装柱，这导致1.0mL的包装柱体积。用pH7.0的25mMTris将柱平衡。
使30.5mL掺入片段的MABIII溶液以0.30mL/min通过活性炭柱，给出在活性炭柱中3.3分钟的停留时间。收集17个1.9mL部分。利用IgG定量通过A蛋白HPLC确定单个部分中MABIII的量。通过大小排阻色谱(SEC)确定单个部分中片段的百分比。
如表III和图2中总结的，这个实验证实通过流过装有活性炭的色谱柱可以从包含单克隆抗体的样品选择性地去除结合A蛋白的单克隆抗体片段。这个结果证实活性炭可以用来去除常见且通常难以去除的片段，因为在纯化抗体时它们最终在相同的A蛋白洗脱池中。
表III.使样品通过活性炭柱之后收集的部分中MABIII的浓度以及结合A蛋白的单克隆抗体片段的百分比
实施例4.从包含单克隆抗体的样品去除不结合A蛋白的单克隆抗体片段
这个代表性实施例证实通过流过装有活性炭的色谱柱还可以从包含单克隆抗体的样品选择性地去除不结合A蛋白的单克隆抗体片段。
如下文所述，用约4.84％不结合A蛋白的单克隆抗体制备MABIII溶液，然后使其流过装有活性炭的色谱柱。
用40ml的24.3mg/mlMABIII溶液开始制备不结合A蛋白的单克隆抗体片段，用100mM磷酸钠缓冲液和半胱氨酸将其稀释。然后，添加木瓜蛋白酶直至0.11mg/ml的终浓度。将溶液在37℃下温育3小时，然后通过添加碘乙酸盐来将木瓜蛋白酶灭活，以便给出20mM的最终碘乙酸盐溶液浓度。为了确保完全酶失活，在允许冷却至室温之前将溶液在37℃下温育额外的一小时。消化之后，通过利用聚醚砜膜(PelliconXLFilter,截止30KDa,EMDMilliporeCorporation,Billerica,MA01821)超滤/渗滤来将溶液浓缩。然后，使浓缩的MABIII消化液缓冲液交换入pH7.4的20mMPBS。使pH7.4的浓缩的MABIII消化液装载在A蛋白柱(UltraPlus,10*100mm,MerckKGaA,Darmstadt,Germany)上。通过使浓缩的MABIII消化液流过A蛋白柱来分离不结合A蛋白的片段。
掺入片段的MABIII溶液制备自150mL的pH7.0的MABIII溶液和20mL上文产生的包含不结合A蛋白的MABIII片段的溶液。然后通过0.22μm膜(Stericup-GP0.22μmMilliporeExpressPLUS膜，250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMDMilliporeCorporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤掺入片段的MABIII储备溶液。掺入片段的MABIII溶液包含1.27mg/mL的MABIII和4.84％的片段。
将250mg的水中成浆的NucharHD活性炭(MeadWestVacoCorporation,Richmond,VA,USA)装入玻璃色谱柱(OmnifitBenchmarkColumn10mm/100mm,10mm直径,100mm长度,SKU:006BCC-10-10-AF,DibaIndustries,Danbury,CT06810,US)。通过使水流过来包装柱，导致1.0mL的包装柱体积。用pH7.0的25mMTRIS将柱平衡。
然后，使130.5mL掺入片段的MABIII溶液以0.30mL/min通过活性炭柱，给出在活性炭柱中3.3分钟的停留时间。收集30个4.5mL部分。利用IgG定量通过A蛋白HPLC确定单个部分中MABIII的量。通过大小排阻色谱(SEC)确定单个部分中片段的百分比。
如表IV和图3中总结的，这个实验证实通过流过装有活性炭的色谱柱还可以从包含单克隆抗体的样品选择性地去除不结合A蛋白的单克隆抗体片段。
表IV.使样品通过活性炭柱之后收集的部分中MABIII的浓度以及不结合A蛋白的单克隆抗体片段的百分比
实施例5.不同类型的活性炭在静态结合条件下从包含单克隆抗体的样品 去除单克隆抗体片段中的用途
这个代表性实施例证实通过用不同类型的活性炭静态处理可以从包含单克隆抗体的样品选择性地去除单克隆抗体片段。
如下文所述，用约1.7％的单克隆抗体片段制备MABII溶液，并且在静态结合条件下用三种不同类型的活性炭之一处理。
通过用木瓜蛋白酶消化一部分单克隆抗体以产生抗体片段来开始制备掺入MABII片段的溶液。消化之后，通过添加0.3M碘乙酸盐溶液来将酶灭活。用透析管(StandardRCDialysisTrialKits,1-3,3.5KMWCO,54mmFLATWIDTH,序列号:132725,SpectrumLaboratories,Inc.RanchoDominguez,CA,90220USA)将木瓜蛋白酶消化的单克隆抗体溶液透析入水以去除缓冲液盐。将透析管装载约0.15L木瓜蛋白酶消化的单克隆抗体溶液并浸入4.0L水中24小时。然后将透析管移入有4.0L新鲜水的新容器中，其中其保持浸没额外的24小时。
掺入单克隆抗体片段的MABII溶液制备自18.0mL木瓜蛋白酶消化的MABII、72.0mL水中的未消化的MABII和9.0mL的pH7.0的250mMTris。然后通过0.22μm膜(Stericup-GP0.22μmMilliporeExpressPLUS膜，250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMDMilliporeCorporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤溶液。掺入片段的MABII溶液包含7.86mg/mL的MABII和1.72％的片段。
将15mL离心管装载5mg或10mg的NucharHD活性炭(MeadWestVacoCorporation,Richmond,VA,USA)、DarcoKB-G活性炭(NoritAmericasInc.,Marshall,Texas,USA)或CGPSuper活性炭(NoritAmericasInc.,Marshall,Texas,USA)。未将介质添加至额外的一套用作对照的15mL离心管。然后，将5.0mL掺入片段的MABII添加至离心管中。允许管旋转20小时。然后将管进行离心并通过0.22微米膜(MillexSyringeFilterUnits,Millex-GV,0.22μm,PVDF,33mm,γ灭菌,目录编号：SLGV033RB,EMDMilliporeCorporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤样品，以便去除可能仍然悬浮于溶液中的任何活性炭颗粒。利用IgG定量通过A蛋白HPLC确定样品中剩余的MABII的量。通过大小排阻色谱(SEC)确定样品中片段的百分比。
如下文表V中总结的，这个实验证实通过在静态结合条件下用不同类型的活性炭处理可以从包含单克隆抗体的样品选择性地去除单克隆抗体片段。随着添加至单克隆抗体溶液的活性炭的量增加，存在的片段的百分比减少。数据表明不同类型的活性炭可以用来在静态结合条件下从包含单克隆抗体的样品选择性地去除单克隆抗体片段。
表V.用三种不同类型的活性炭静态处理MABII溶液之后单克隆抗体的回收率和片段的百分比
实施例6.活性炭在静态结合条件下于中性和酸性pH下从包含单克隆抗体 的样品去除单克隆抗体片段中的用途
这个代表性实施例证实通过在酸性和中性pH溶液条件下利用活性炭静态处理可以从包含单克隆抗体的样品选择性地去除单克隆抗体片段。
用约1.72％的单克隆抗体片段制备pH4.1或pH7.5的MABII溶液，并且在静态结合条件下用活性炭处理。
通过用木瓜蛋白酶消化一部分单克隆抗体以产生片段来开始制备掺入MABII片段的溶液。消化之后，通过添加0.3M碘乙酸盐溶液来将酶灭活。用透析管(StandardRCDialysisTrialKits,1-3,3.5KMWCO,54mmFLATWIDTH,序列号:132725,SpectrumLaboratories,Inc.RanchoDominguez,CA,90220USA)将木瓜蛋白酶消化的单克隆抗体溶液透析入水以去除缓冲液盐。将透析管装载约0.15L木瓜蛋白酶消化的单克隆抗体溶液并浸入4.0L水中24小时。随后将透析管移入有4.0L新鲜水的新容器中，其中其保持浸没额外的24小时。
掺入片段的MABII溶液制备自18mL水中的木瓜蛋白酶消化的MABII、72mL水中的未消化的MABII和9mL的pH7.0的250mMTris。通过添加3.0M乙酸来使这个溶液的一部分降低至pH4.1。通过添加Tris碱来使溶液pH升高至7.5。然后通过0.22μm膜(Stericup-GP0.22μmMilliporeExpressPLUS膜，250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMDMilliporeCorporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤溶液。pH4.1的掺入片段的MABII溶液包含7.88mg/mL的MABII与1.76％的片段，而pH7.5的掺入片段的MABII溶液包含7.78mg/mL的MABII与1.72％片段。
将15mL离心管装载20mg的NucharHD活性炭(MeadWestVacoCorporation,Richmond,VA,USA)。未将活性炭添加至用作对照的第二套15mL离心管。将5.0mL的pH4.1或pH7.5的掺入片段的MABII储备溶液添加至适当的离心管中。允许管旋转24小时。通过0.22微米膜(MillexSyringeFilterUnits,Millex-GV,0.22μm,PVDF,33mm,γ灭菌,目录编号：SLGV033RB,EMDMilliporeCorporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤溶液以去除可能仍然悬浮于溶液中的任何颗粒。通过测量在280nm处的吸光度来确定溶液中剩余的MABII的浓度。通过大小排阻色谱(SEC)确定样品中片段的百分比。
如下文表VI中总结的，这个实验证实通过在中性和酸性pH条件下用活性炭静态处理可以从单克隆抗体溶液选择性地单克隆抗体片段。
表VI.在7.5的中性pH或4.1的酸性pH下用活性炭静态处理MABII溶液之后单克隆抗体的回收率和片段的百分比
实施例7.活性炭在静态结合条件下于低和高电导率下在4.0-9.0的pH范 围中从包含单克隆抗体的样品去除单克隆抗体片段中的用途
这个代表性实施例证实通过在低和高溶液电导率下于4.0-9.0的pH范围中利用活性炭静态处理可以从单克隆抗体溶液选择性地去除单克隆抗体片段。
制备MABII溶液，其包含1.49％-1.74％单克隆抗体片段，溶液pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0或9.0，具有4.5mS/cm或22mS/cm的溶液电导率。如下文所述，随后在静态结合条件下用活性炭处理不同溶液。
通过用木瓜蛋白酶消化一部分单克隆抗体以产生片段来开始制备掺入MABII片段的溶液。消化之后，通过添加0.3M碘乙酸盐溶液来将酶灭活。用透析管(StandardRCDialysisTrialKits,1-3,3.5KMWCO,54mmFLATWIDTH,序列号:132725,SpectrumLaboratories,Inc.RanchoDominguez,CA,90220USA)将木瓜蛋白酶消化的单克隆抗体溶液透析入水以去除缓冲液盐。将透析管装载约0.15L木瓜蛋白酶消化的单克隆抗体溶液并浸入4.0L水中24小时。然后将透析管移入有4.0L新鲜水的新容器中，其中其保持浸没额外的24小时。
通过合并144mL水中的MABII溶液、36mL水中的木瓜蛋白酶消化的MABII和18mL的250mMTris碱来制备掺入片段的MABII的储备溶液。添加1.8MTris碱来将溶液调整至pH9.0。通过0.22μm膜(Stericup-GP0.22μmMilliporeExpressPLUS膜，250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMDMilliporeCorporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤溶液。所得的溶液具有4.5mS/cm的电导率。将4.0M氯化钠添加至一部分pH9.0的掺入片段的MABII溶液中，直至溶液电导率达到22mS/cm。
然后通过添加3.0M乙酸来将一部分4.5mS/cm或22mS/cm的pH9.0掺入片段的MABII溶液的pH降低至pH8.0。然后通过添加3.0M乙酸来将一部分pH8.0的这些溶液的pH降低至pH7.0。通过添加3.0M乙酸来将一部分pH7.0的这些溶液的pH降低至pH6.0。然后通过添加3.0M乙酸来将一部分pH6.0的这些溶液的pH降低至pH5.0。通过添加3.0M乙酸来将一部分pH5.0的这些溶液的pH降低至pH4.0。因此，利用这种方法，获得具有4.5mS/cm或22mS/cm电导率的pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0或9.0的掺入片段的MABII溶液的12种溶液。掺入片段的MABII溶液包含6.38-7.44mg/mL的MABII和1.5-1.7％的片段。
将每个溶液pH和电导率的15mL离心管装载20mg的NucharHD活性炭(MeadWestVacoCorporation,Richmond,VA,USA)。额外的一套15mL离心管用作对照，并且不添加介质。向每个管添加5.0mL具有适当pH和电导率的掺入片段的MABII储备溶液。允许管旋转24小时，随后通过0.22微米膜(MillexSyringeFilterUnits,Millex-GV,0.22μm,PVDF,33mm,γ灭菌,目录编号：SLGV033RB,EMDMilliporeCorporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤样品，以便去除可能仍然悬浮于溶液中的任何活性炭颗粒。通过在280nm处的UV分光光度计确定样品中剩余的MABII的浓度。通过大小排阻色谱(SEC)确定样品中剩余的片段的百分比。
如表VII和图4中总结的，这个实验证实在低和高溶液电导率下于4.0-9.0的广泛pH范围中利用活性炭可以从单克隆抗体溶液选择性地去除单克隆抗体片段。
表VII.在低和高溶液电导率下于4.0-9.0的pH范围中用活性炭静态处理MABII溶液之后单克隆抗体的回收率和片段的百分比
根据本说明书内引用的参考文献的教导最全面地理解本说明书，所述参考文献援引加入本文。本说明书内的实施方案提供本发明中的实施方案的说明，并且不应当理解为限制其范围。技术人员容易地认识到本发明涵盖许多其他实施方案。所有出版物和发明均整体援引加入本文。如果援引加入的材料与本说明书矛盾或不一致，则本说明书会取代任何这样的材料。本文中任何参考文献的引用不是承认这类参考文献是本发明的现有技术。
除非另有说明，本说明书(包括权利要求书)中使用的所有表示成分、细胞培养、处理条件等的量的数字应当理解为在所有条件下受到术语“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，数值参数为近似值，并且可以根据通过本发明试图获得的期望特性而变化。除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。本领域技术人员会认识到或者能够利用不超过常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。以下权利要求书意图涵盖这类等同物。
本领域技术人员会清楚，可以进行本发明的许多修改和变化而不背离其精神和范围。本文所述的具体实施方案仅通过实例的方式提供，并不意味着以任何方式限制。本发明的真正范围和精神通过以下权利要求书示出，说明书和实施例仅认为是示例性的。

Claims (22)

1.一种减少包含待纯化的靶蛋白的样品中片段的量的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含靶蛋白和所述靶蛋白片段的样品，其中所述片段的量等于或大于所述靶蛋白量的至少0.2％，
(b)使所述样品与活性炭接触，其中所述活性炭结合所述片段，
(c)从所述样品去除所述活性炭，
从而减少所述样品中所述片段的量。
2.权利要求1的方法，其中所述靶蛋白为包含Fc-区的蛋白。
3.权利要求2的方法，其中所述包含Fc-区的蛋白为抗体。
4.权利要求3的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
5.权利要求3的方法，其中所述抗体为多克隆抗体。
6.权利要求1的方法，其中将所述活性炭包装在装置中。
7.权利要求6的方法，其中所述装置为柱、荚、筒或胶囊。
8.权利要求1的方法，其中所述片段以等于或大于所述靶蛋白量的至少0.5％的量存在。
9.权利要求1的方法，其中所述片段以等于或大于所述靶蛋白量的至少1％的量存在。
10.权利要求1的方法，其中所述片段以等于或大于所述靶蛋白量的至少2％的量存在。
11.权力要求1的方法，其中步骤(c)包括使用过滤或离心或它们的组合以从所述样品去除所述活性炭。
12.一种减少包含待纯化的抗体的样品中抗体片段的量的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含抗体和抗体片段的样品，其中所述片段的量等于或大于所述抗体量的至少0.2％，
(b)使所述样品与活性炭接触，其中所述活性炭结合所述抗体片段，
(c)从所述样品去除所述活性炭，
从而导致减少所述样品中片段的量。
13.权利要求12的方法，其中所述片段结合A蛋白。
14.权利要求12的方法，其中所述片段不结合A蛋白。
15.权利要求12的方法，其中所述样品是收集自A蛋白亲和色谱柱的洗脱液。
16.权利要求12的方法，其中将活性炭包装在柱、荚、筒或胶囊中。
17.权利要求12的方法，其中所述片段的量等于或大于所述抗体量的至少0.5％。
18.权利要求12的方法，其中所述片段的量等于或大于所述抗体量的至少1％。
19.权利要求12的方法，其中所述片段的量等于或大于所述抗体量的至少2％。
20.权利要求12的方法，其中利用过滤或离心或它们的组合去除所述活性炭。
21.权利要求1的方法，其中片段的量减少之后，所述样品中靶蛋白的纯度增加。
22.权利要求21的方法，其中所述靶蛋白的纯度增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％或更多。
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