CN108883345B - 用于蛋白纯化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于制备具有降低的抗体还原相关的杂质水平的抗体或其片段的方法。

Description

用于蛋白纯化的方法
发明背景
在治疗领域中，蛋白质和抗体以及特别是抗体衍生的分子的使用一直在不断地增加和突显重要性，因此对受控制造过程的需求也在同时发展。治疗性蛋白的商业化要求大量生产它们。为此目的，经常将所述蛋白在宿主细胞中表达，且必须随后回收和纯化，然后将它制成可施用的形式。在所述纯化过程中除去的杂质通常归类为方法相关的杂质(包括宿主细胞碎片、宿主细胞蛋白、痕量培养基等)和产物相关的杂质(其源自期望的产物的修饰、降解或聚集)。
最常见的一类抗体分子是免疫球蛋白G(IgG)，即由2个重链和2个轻链组成的异四聚体。所述IgG分子可以细分成两个功能亚基：(1)可结晶的片段(Fc)，其构成抗体的尾巴并与细胞表面受体相互作用以活化免疫应答，和(2)抗原结合片段(Fab)，其介导抗原识别。所述Fc区域包含来自两个成对重链的两对恒定结构域(CH2和CH3)，而所述Fab区域由来自重链的可变结构域和随后的恒定结构域(分别VH和CH1)组成，它们与来自轻链的可变结构域和恒定结构域(分别VL和CL)配对。所述Fc和Fab区域被铰链区分开，所述铰链区含有将两个重链保持在一起的二硫键；在CH1和CL结构域内的其它二硫键将所述重链和轻链配对在一起。
IgG类的全长抗体在传统上已经使用包括亲和色谱法的捕获步骤的方法来纯化，所述亲和色谱法使用从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)衍生出的蛋白A。蛋白A和抗体的Fc-区域之间的结合的高特异性使得该色谱法模式能够直接从复杂溶液(诸如细胞培养物收获培养基)开始在单个步骤中除去超过98％的杂质。从该方法步骤得到的大纯化因子(purification factor)有助于简化整个下游纯化过程。一般而言，仅痕量杂质诸如高分子量聚集体、残余的宿主细胞蛋白、残余的DNA或浸出的蛋白A有待在该纯化步骤以后除去，且这经常可以在1-2个后续色谱步骤中实现。
尽管事实上在过去的数十年中已经使用和开发了基于蛋白A的抗体纯化，但是在工业规模制备具有适合施用的纯度水平的重组抗体仍然是一个挑战。具体地，蛋白诸如抗体及其片段包含链间二硫键，其通常需要在制备和纯化过程中保护和维持，以便产生处于它们的天然构象从而保留它们的生物活性的抗体。
在这些链间二硫键受环境影响且变得还原的情况下，不同的多肽链将分离，从而产生一类由不完全抗体分子组成的杂质，其必须从最终的抗体制品除去。随着环境在纯化过程中后来变成氧化性的，这些还原相关的杂质可能不正确地改造(reform)，从而导致增加的产物相关的高和低分子量物质水平。产生的另外杂质的纯化导致降低的过程收率和在最终的药用物质中增加的杂质水平。此外，必须确保在制造批次之间的再现性，因此控制这样的杂质的存在和相对量是避免特定制造批次的失败所必需的。批次失败可以是由于药用物质(drug substance)中增加的杂质水平，或没有满足过程中(in-process)控制。药用物质中增加的杂质水平也可能降低药物产品的贮存期限。
在抗体制备过程中，在蛋白A色谱法步骤以后已经观察到产物相关的杂质(诸如游离重链和轻链、半聚体(halfmer)(一个重链和一个轻链)或由于链间二硫键的还原部分地缺少二硫键的同种型(isoform))的出现。必须避免这些杂质在纯化过程中的出现，和所述杂质作为所述过程的部分而除去。可以通过非还原十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析可能的产物相关的杂质并显示在图1中。
在该意义上，US 8,574,869公开了用于在从宿主细胞培养物收获重组蛋白过程中阻止二硫键还原的方法。
因此，本领域中仍然需要可再现的蛋白制备方法，其允许在不同批次之间以一致的纯度纯化处于它们的天然构象的蛋白。
附图说明
图1：考马斯染色的非还原凝胶电泳，其显示了从经历纯化以后的抗体样品回收的可能的产物相关的杂质。
图2：分子A的蛋白A洗脱液样品的非还原生物分析。所述样品是来自制备活动2批次1和批次2(分别C2B1和C2B2)(没有使用炭过滤器(carbon filter))和活动3批次1(C3B1)(其中应用炭过滤器)的蛋白A洗脱液样品。在批次2样品中看到的半聚体在批次3样品中没有见到。
图3：包括炭过滤(carbon filtration)的纯化过程流程图。在深度过滤和无菌过滤器(sterile filter)之间在线(inline)应用活性炭过滤器(activated carbon filter)步骤。它之后是使用蛋白A的捕获步骤，和后续纯化步骤：阴离子交换色谱法(AEX)、阳离子交换色谱法(CEX)、病毒减少过滤(VRF)和配制。
图4：IgG分子B制备样品的非还原生物分析。显示的样品是批次1的澄清的细胞培养液和捕获洗脱液(在蛋白A色谱法以后)，其中将所述抗体还原，从而形成半聚体和游离重链。也显示了批次3的捕获洗脱液，其中已经在初次回收中应用活性炭过滤器，且抗体分子在蛋白A捕获步骤以后仍然是单体。
图5：分子B的制备样品的Sypro染色的非还原SDS-PAGE分析。泳道1：分子量标准，泳道2：分子1参比标准，泳道3：活动1批次1细胞培养液，泳道4：活动1批次2炭过滤器前，泳道5：活动1批次2炭过滤器后，泳道6：活动1批次1捕获洗脱液，泳道7：活动1批次2无炭过滤器捕获洗脱液，泳道8：活动1批次2炭过滤器后捕获洗脱液。
图6：关于还原剂硫氧还蛋白(A)、NAD/NADH(B)和NADP/NADPH(C)测定的、具有深度和无菌过滤(sterile filtration)(对照)和在深度和无菌过滤器之间引入炭过滤器以后的分子A澄清的细胞培养液(CCCF)。
图7：关于还原剂NAD/NADH和NADP/NADPH测定的、来自批次1(在引入炭过滤器之前，对照)和批次2(在炭过滤器应用以后)的分子B澄清的细胞培养液(CCCF)。
发明详述
本发明通过提供新的抗体制备方法解决了上面指出的需要，所述方法允许回收具有天然二硫键的抗体，从而提高过程收率和确保批次之间的一致性。
因此，在第一方面，本发明提供了一种用于制备抗体或其片段的方法，所述方法包括：
-在宿主细胞中表达所述抗体或其片段
-回收含有所述抗体或其片段、宿主细胞碎片和杂质的混合物；和
-从所述混合物纯化所述抗体或其片段，其中所述纯化包括：
-活性炭过滤，继之以
-蛋白A色谱法。
在第二方面，本发明提供了一种用于在纯化在宿主细胞中表达的抗体或其片段的过程中阻止二硫键还原的方法，所述方法包括：
-活性炭过滤，继之以
-蛋白A色谱法。
在第三方面，本发明提供了一种用于纯化抗体或其片段的方法，所述方法包括：
-活性炭过滤，继之以
-蛋白A色谱法。
在第四方面，本发明提供了一种用于在纯化抗体或其抗体片段的过程中减少还原剂的量的方法，所述方法包括：
-活性炭过滤，继之以
-蛋白A色谱法。
还原剂(reducing agent)(在本领域中也被称作还原剂(reductant)或还原剂(reducer))是在氧化还原化学反应中向另一种化学物质丢失(或贡献)电子的元素或化合物。由于还原剂丢失电子，认为它已经被氧化。某些还原剂(例如钙)可以存在于细胞培养基中，其它还原剂可以作为宿主细胞代谢的结果分泌进细胞培养液中。并且，在重组蛋白制备过程中，由于剪切力和随后的细胞损伤和可能的裂解和/或细胞凋亡(其将细胞组分释放进环境中)，还原剂可以进一步释放进培养基中。释放的细胞内容物的还原剂的量和能力是细胞系和过程依赖性的；这样的还原剂的例子包括、但不限于谷胱甘肽、半胱氨酰基甘氨酸盐(cysteinyl glycinate)、半胱氨酰基磺酸盐(cysteinyl sulphonate)、硫氧还蛋白、NADP、NADPH、NAD、NADH。
在本发明的第四方面的一个特定实施方案中，本发明的方法会减少硫氧还蛋白、NADP、NADPH、NAD和/或NADH的量。
在本发明的第四方面的另一个特定实施方案中，本发明的方法会减少硫氧还蛋白、NADP、NADPH、NAD和/或NADH的量。
通常，以结合和洗脱模式进行蛋白A色谱法，其中目标蛋白与固相的结合允许杂质(诸如宿主细胞蛋白)穿流(flow through)色谱介质，而目标蛋白保持结合至固相。然后用洗脱缓冲液从固相回收结合的目标蛋白，所述洗脱缓冲液破坏目标蛋白结合所述固相的机制。
在本发明的方法的另一个实施方案中，在应用包含所述抗体或其片段的混合物以后，将第一种溶液加入蛋白A色谱法材料，使得未结合的材料在所述溶液中被除去。
在根据本发明的方法的另一个实施方案中，将洗脱缓冲液应用于蛋白A色谱法材料，使得结合的抗体或其片段被释放。
在本发明的方法的一个特定实施方案中，通过应用具有适合破坏抗体结合的pH的洗脱缓冲液，使结合的抗体从蛋白A色谱法材料释放。所述pH依赖于具体分子，且通常由熟练的技术人员凭经验确定，并调节以达到期望的端点，即可能希望从应用的混合物回收可能的最大量的单体，或可能需要以最高的可能纯度得到单体。在本发明的方法的一个具体实施方案中，所述洗脱缓冲液具有pH 3至pH 4.5，优选地，pH 3.2至pH 4.3，pH 3.5至pH 4，优选地pH 3.6至pH 3.9。
适合用作蛋白A色谱法中的洗涤和洗脱缓冲液的缓冲液是本领域中容易得到的，且作为非限制性例子可以选自磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris、组氨酸、乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液、或MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸咪唑)、BES(N,N-(二-2-羟基乙基)-2-氨基乙烷磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)-丙烷磺酸)或HEPES(N-2-羟基乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸)缓冲液。
在第二个实施方案中，本发明提供了根据第一、第二、第三或第四方面的方法，其中所述纯化包括至少一个另外的色谱法步骤。所述进一步的另外色谱法步骤选自阴离子或阳离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、混合模式色谱法，诸如羟基磷灰石色谱法、手性色谱法或电解质色谱法。这些色谱法步骤可以分离使用，或可替换地与另一个色谱法步骤组合使用。此外，这些色谱法步骤可以以结合和洗脱模式或以穿流(flow-through)模式运行。在穿流模式中，所述杂质结合固相或在固相中具有降低的迁移率，而靶蛋白被回收在洗脱液或穿流级分中。在另一个特定实施方案中，在所述蛋白A色谱法以后进行所述另外的色谱法步骤。
在第三个实施方案中，本发明提供了根据第二个实施方案的方法，其中所述另外的色谱法步骤包含阳离子交换色谱法和/或阴离子交换色谱法。
在本发明的一个特定实施方案中，所述第一个另外的色谱法步骤是阴离子交换色谱法步骤以捕获杂质和产生含有所述蛋白的穿流液(flow-through)。
在本发明的另一个特定实施方案中，所述第一个另外的色谱法步骤继之以阳离子交换色谱法步骤，其中目标蛋白结合所述色谱介质，且随后洗脱进含有所述蛋白的洗脱液中。可替换地，以这样的方式运行所述阳离子交换色谱法步骤以捕获杂质和产生含有所述蛋白的穿流液。
在另一个实施方案中，本发明提供了根据第二个或第三个实施方案的方法，其中所述另外的色谱法步骤包含第一个阴离子交换色谱法步骤和第二个阳离子交换色谱法步骤。
在一个替代实施方案中，本发明提供了根据第二个或第三个实施方案的方法，其中所述另外的色谱法步骤包含第一个阳离子交换色谱法步骤和第二个阴离子交换色谱法步骤。
在另外的实施方案中，在所述色谱法步骤之间进行一个或多个超滤或渗滤(UF/DF)步骤。在工业规模蛋白制备中，这通常使用基于膜的切向流过滤步骤运行，所述步骤为了产物浓缩和缓冲液更换的目的而进行。这些膜经常是低蛋白结合的，且具有特定标称分子量截止值以防止产物损失，例如这些包括具有30kDa标称分子量截止值的聚醚砜(PES)膜(来自Pall Life Sciences的T-系列Omega PES膜)或具有30kDa标称分子量截止值的再生纤维素(来自Pall Life Sciences的Delta Regenerated Cellulose Membrane)。可替换地，使用具有30kDa分子量截止值的膜，诸如来自Millipore的Pellicon 3或来自Sartorius的Hydrosart。
一种纯化策略可以包括处于不同组合的这些步骤中的任一种，以适合靶蛋白的物理化学性质。
在本发明的方法的另一个特定实施方案中，从混合物纯化蛋白的步骤包括：第一个另外的色谱法步骤，其为从其中回收第一种含有所述蛋白的穿流液的阴离子交换色谱法，第二个另外的色谱法步骤，其为从其洗脱含有所述蛋白的洗脱液的阳离子交换色谱法；和应用于所述洗脱液的第二个超滤或渗滤步骤。
在本发明的方法的另一个特定实施方案中，从混合物纯化蛋白的步骤包括：第一个另外的色谱法步骤，其为从其洗脱第一种含有所述蛋白的洗脱液的阳离子交换色谱法，应用于所述第一种洗脱液的第一个超滤或渗滤步骤，第二个另外的色谱法步骤，其为阴离子交换色谱法以产生含有所述蛋白的穿流液；和应用于所述穿流液的第二个超滤或渗滤步骤。
在本发明的方法的另一个特定实施方案中，所述纯化过程进一步包括在所述蛋白A色谱法之后和在另外的色谱法步骤之前的超滤或渗滤步骤。
在第四个实施方案中，本发明提供了根据上述实施方案中的任一个的方法，其中所述回收的抗体或其片段包含天然二硫键。
在第五个实施方案中，本发明提供了根据上述实施方案中的任一个的方法，其中所述回收的抗体或其片段包含天然链间二硫键。
在根据本发明的任何方面的另一个实施方案中，本发明提供了根据上述实施方案中的任一个的方法，其中从所述蛋白A色谱法回收的抗体或片段包含小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的抗体还原相关的杂质。
在根据本发明的任何方面的另一个另外实施方案中，本发明提供了根据任何前述实施方案的方法，其中与从没有活性炭过滤步骤的相同方法回收的抗体或片段相比，从所述蛋白A色谱法回收的抗体或其片段包含更少的抗体还原相关的杂质。
在根据本发明的任何方面的另一个替代实施方案中，本发明提供了根据任何前述实施方案的方法，其中纯化的抗体或其片段具有降低的抗体还原相关的杂质水平。
在根据本发明的任何方面的另一个替代实施方案中，本发明提供了根据任何前述实施方案的方法，其中在所述蛋白A色谱法步骤以后，纯化的抗体或其片段具有降低的抗体还原相关的杂质水平。
在第六个实施方案中，本发明提供了根据上述实施方案中的任一个的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，且含有所述抗体的混合物是细胞培养物上清液。
在第七个实施方案中，本发明提供了根据第五个实施方案的方法，其中所述纯化过程另外包括在活性炭过滤之前的细胞培养物上清液的深度过滤。
在本发明的另一个可能的实施方案中，所述过滤顺序(sequence)可以包括熟练的技术人员可得到的另外过滤器，例如消毒过滤器。
在蛋白纯化过程中的连续过滤步骤可以作为单独步骤进行，其中使要过滤的混合物穿过一个过滤器，回收滤液，并然后穿过第二个过滤器，从其回收第二份滤液。可替换地，所述过滤步骤可以在线运行，其中一个过滤器邻近下一个，所以要过滤的培养基接连地穿过两个过滤器，且在该步骤以后回收一份滤液；所述在线方案(set up)通常被称作过滤器串(filter train)。
在第八个实施方案中，本发明提供了根据第七个实施方案的方法，其中在线运行深度过滤和活性炭过滤。
可替换地，在本发明的方法的第七个实施方案的另一个特定实施方案中，深度过滤和活性炭过滤是单独步骤。
根据本发明的实施方案的宿主细胞是例如原核细胞、酵母(例如但不限于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和其它克鲁维酵母属种(Kluyveromyces spp.)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))、粘菌(Myxomycete)(例如但不限于盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum))、丝状真菌(例如但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)和其它木霉属种(Trichoderma spp.)、黑曲霉(Aspergillus niger)和其它曲霉菌属种(Aspergillusspp.))、藓类(例如但不限于小立碗藓(Physcomitrella patens)、波叶仙鹤藓(Atrichumundulatum))、昆虫或哺乳动物细胞。哺乳动物宿主细胞是，例如但不限于，NSO、SP2.0、3T3细胞、COS细胞、人骨肉瘤细胞、MRC-5细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、VERO细胞、CHO细胞、rCHO-tPA细胞、rCHO-Hep B表面抗原细胞、CHO-S细胞、HEK 293细胞、rHEK 293细胞、C127细胞、rC127-Hep B表面抗原细胞、人成纤维细胞、基质细胞、肝细胞或PER.C6细胞。
所述宿主细胞优选地是真核宿主细胞，优选地哺乳动物宿主细胞，更优选地中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，例如DG44株。
对于真核宿主细胞(例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)，可以采用不同的转录和翻译调节序列，取决于宿主的性质。它们可以源自病毒来源，诸如腺病毒、牛乳头状瘤病毒、猿猴病毒等，其中调节信号与具有高表达水平的特定基因有关。例子是疱疹病毒的TK启动子、SV40早期启动子、酵母gal4基因启动子等。可以选择允许抑制和活化的转录起始调节信号，使得可以调节基因的表达。通过引入一种或多种标志物(其允许选择含有表达载体的宿主细胞)，也可以选择已经被引入的DNA稳定地转化的细胞。所述标志物还可以提供光营养(给营养缺陷型宿主)、杀生物剂抗性，例如但不限于抗生素或重金属诸如铜等。可选择的标记基因可以直接地连接至要表达的DNA基因序列，或通过共转染引入相同细胞中。为了本发明的蛋白的最佳合成，也可能需要另外的元件。
将真核宿主细胞用一种或多种编码目标蛋白的表达载体转染，并随后在将支持它们的生长和目标蛋白的表达的任何培养基中培养。所述培养基是化学成分确定的培养基，其不含动物来源的产物诸如动物血清和蛋白胨。本领域技术人员可获得不同的细胞培养基，其包含维生素、氨基酸、激素、生长因子、离子、缓冲剂、核苷、葡萄糖或等同能量来源的不同组合，它们以适当浓度存在以实现细胞生长和蛋白生产。在本领域技术人员已知的细胞培养周期中的不同时间，可以在细胞培养基中以适当的浓度包含另外的细胞培养基组分。
哺乳动物细胞培养可以在任何合适的容器中进行，诸如摇瓶或生物反应器，其可以根据需要的生产规模以补料(fed batch)分批次模式运行或可以不这样运行。这些生物反应器可以是搅拌釜或气升式反应器。可获得的各种大规模生物反应器的容量可以是超过400L、1,000L至50,000L或100,000L，优选5,000L至20,000L或至10,000L。可替换地，也可以使用更小规模诸如2L、80L至100L的生物反应器来根据本发明的方法制造抗体。
目标蛋白，诸如根据本发明的过程和方法在真核宿主细胞(诸如CHO细胞)中生产的抗体或抗原结合片段通常存在于细胞培养物的上清液中。在本发明的一个实施方案中，所述上清液是在本发明的方法中纯化的混合物。
因此，在本发明的一个特定实施方案中，本发明的过程和方法包括离心细胞培养液和回收离心后的液相的步骤，以便得到含有所述抗体或其片段的混合物用于根据本发明的方法的进一步纯化。
可替换地或额外地，使用熟练的技术人员已知的澄清技术例如深度过滤，可以回收所述上清液。因此，在本发明的一个特定实施方案中，所述方法包括深度过滤的步骤，以便得到含有所述抗体或其片段的混合物用于根据本发明的方法的进一步纯化。
可替换地，宿主细胞是原核细胞，优选地革兰氏阴性细菌，优选地，大肠杆菌(E.coli)细胞。用于蛋白表达的原核宿主细胞是本领域众所周知的(Terpe,2006；ApplMicrobiol Biotechnol 72,211-222.)。宿主细胞是经遗传工程改造以产生目标蛋白(诸如抗体片段)的重组细胞。重组的大肠杆菌宿主细胞可以来源于任何合适的大肠杆菌菌株，包括MC4100、TG1、TG2、DHB4、DH5α、DH1、BL21、K12、XL1Blue和JM109。一个例子是大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)，即用于重组蛋白发酵的常用宿主菌株。也可以通过培养修饰的大肠杆菌菌株(例如代谢突变体或蛋白酶缺陷型大肠杆菌菌株)来产生抗体片段。
可以根据本发明的方法纯化的抗体片段通常存在于大肠杆菌宿主细胞的周质中或宿主细胞培养物上清液中，取决于蛋白的性质、生产规模和使用的大肠杆菌菌株。将蛋白靶向至这些区室的方法是本领域众所周知的(Makrides,1996；Microbiol Rev 60,512-538)。将蛋白导向至大肠杆菌周质的合适信号序列的例子包括大肠杆菌PhoA、OmpA、OmpT、LamB和OmpF信号序列。通过依赖于天然分泌途径或通过诱导外膜的有限渗漏以造成蛋白分泌，可以将蛋白靶向至上清液，其实例是使用pelB前导序列(leader)、蛋白A前导序列，细菌素释放蛋白的共表达、丝裂霉素诱导的细菌素释放蛋白以及向培养基中加入甘氨酸、以及用于膜透化的kil基因的共表达。最优选地，在本发明的方法中，在宿主大肠杆菌的周质中表达所述重组蛋白。
重组蛋白在大肠杆菌宿主细胞中的表达也可以处于诱导型系统的控制下，由此重组抗体在大肠杆菌中的表达处于诱导型启动子的控制下。适用于大肠杆菌的许多诱导型启动子是本领域众所周知的，并且取决于启动子，通过改变因素诸如温度或生长培养基中的特定物质的浓度，可以诱导重组蛋白的表达。诱导型启动子的例子包括可用乳糖或不可水解的乳糖类似物异丙基-b-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导的大肠杆菌lac、tac和trc启动子，以及分别由磷酸盐、色氨酸和L-阿拉伯糖诱导的phoA、trp和araBAD启动子。通过例如添加诱导物或温度的变化(在诱导是温度依赖性时)，可以诱导表达。在通过向培养物中加入诱导物来实现重组蛋白表达的诱导的情况下，可以通过任意合适的方法添加诱导物，取决于发酵系统和诱导物，例如，通过单次或多次注射添加(shot addition)或通过饲料逐步添加诱导物。应当理解，在诱导物的添加和蛋白表达的实际诱导之间可能存在延迟，例如在诱导物是乳糖的情况下，当在乳糖之前利用任何预先存在的碳源时，在蛋白表达的诱导之前可能存在延迟。
可以在任何培养基中培养大肠杆菌宿主细胞培养物(发酵物)，所述培养基将支持大肠杆菌的生长和重组蛋白的表达。所述培养基可以是任何化学成分确定的培养基，例如在(Durany O,2004；Process Biochem 39,1677-1684)中描述的。
大肠杆菌宿主细胞的培养可以在任何合适的容器(诸如摇瓶或发酵罐)中进行，取决于需要的生产规模。可获得的各种大规模发酵罐的容量可以是超过1,000L至100,000L。优选地，使用1,000L至50,000升的发酵罐，更优选地1,000L至10,000L或12,000L。也可以使用具有0.5L至1,000L的容量的更小规模的发酵罐。
可以在任何合适的系统中进行宿主细胞(例如，CHO或大肠杆菌)的发酵，例如连续、分批次或补料分批次模式，取决于蛋白和所需的产率。可以使用分批次模式，其中在需要的时候注射添加营养物或诱导物。可替换地，可以使用补料分批次培养，并且培养物以最大比生长速率在诱导前以分批次模式生长，所述最大比生长速率可以使用最初存在于发酵罐中的营养物和一种或多种用于控制生长速率的营养物补料方案维持直到发酵完成。
在一个实施方案中，根据本发明的方法包括，在加载到蛋白A色谱法基质上之前，离心细胞培养物收获物的步骤，随后通过加入提取缓冲液来悬浮宿主细胞。
对于大肠杆菌发酵过程(其中目标蛋白诸如抗体片段存在于宿主细胞的周质空间中)，需要从宿主细胞释放蛋白。所述释放可以通过任何合适的方法实现，诸如通过机械或压力处理、冻融处理、渗透冲击、提取剂或热处理完成的细胞裂解。这样的用于蛋白释放的提取方法是本领域众所周知的。
本文中使用的术语“活性炭”表示这样的碳(carbon)形式：其已经经过处理以在碳原子之间产生数百万个小孔，从而导致显著增加的表面积。活性炭的表面积使得所述材料适合于吸附，即从流体、蒸汽或气体除去杂质的过程。活性炭也被称作活性碳。商购可得的活性炭过滤器包括、但不限于Millipore Millistak+CR系列、Pall Activated CarbonFilters Incorporating
Figure BDA0001812716910000131
AKS Filter Media和3M Zeta PlusTMActivated CarbonFilters。
本文中使用的术语“阴离子交换色谱法”表示这样的色谱法：其中固相是带正电荷的，例如具有一个或多个与其连接的带正电荷的配体，诸如季氨基。商购可得的阴离子交换基质包括DEAE纤维素、QAE SEPHADEXTM、FAST Q SEPHAROSETMCapto Q、Capto Adhere和Capto Q Impres(GE Healthcare)、Unosphere和Nuvia Q(BioRad)、GigaCap Q(Tosoh)、Mustang Q XT(Pall)、Fractogel Q和Eshmuno Q(Merck Millipore)、Poros XQ(ThermoFisher)和阴离子交换膜吸附剂诸如SartoBind Q(Sartorius)和整体料(monolith)吸附剂诸如QA整体料(Bia Separations)。
本文中使用的术语“抗体”表示包含两个重链和两个轻链的单克隆或多克隆四聚体全长抗体。术语免疫球蛋白与“抗体”同义地使用。本文中使用的术语“抗体”包括、但不限于如本领域已知的通过重组技术产生的重组抗体。“抗体”可以是任何起源，包括来自哺乳动物物种诸如人、非人灵长类动物(例如人，诸如来自黑猩猩、狒狒、恒河猴或食蟹猴)、啮齿动物(例如来自小鼠、大鼠、兔、仓鼠或豚鼠)、山羊、牛或马物种。本文中的抗体针对目标“抗原”。优选地，所述抗原是生物学上重要的多肽，且所述抗体向遭受疾病或障碍的哺乳动物的施用可以在该哺乳动物中产生治疗益处。但是，也预见到针对非多肽抗原的抗体。在抗原是多肽的情况下，它可以是跨膜分子(例如受体)或配体诸如生长因子或细胞因子。对于本发明包括的抗体而言优选的分子靶标包括：CD多肽诸如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD38、CD40和CD40-L；FcRN；OX40；HER受体家族的成员诸如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子诸如LFA-1、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和av/b3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如抗-CD11a、抗-CD18或抗-CD11b抗体)；趋化因子和细胞因子或它们的受体诸如IL-1α和β、IL-2、IL-6、IL-6受体、IL-12、IL-13、IL-17A和/或IL-17F、IL-18、IL-21、IL-23、TNFα和TNFβ；生长因子诸如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；多肽C；PD1，PD-L1，PCSK9；硬骨素；等。
本文中使用的术语“抗体片段”表示抗体的部分，通常是其抗原结合或可变区域。抗体片段的例子包括缺乏或不具有Fc部分的任何抗体。抗体片段的例子也包括诸如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv和scFv片段；以及双抗体(diabody)，包括形式诸如
Figure BDA0001812716910000141
(Bi-specific T-cell Engagers)和DARTsTM(Dual Affinity Re-Targeting technology)，三链抗体(triabodies)，四链抗体(tetrabodies)，微型抗体(minibodies)，结构域抗体(dAbs)，诸如sdAbs，VHH和VNAR片段，单链抗体，由抗体片段或抗体形成的双特异性的、三特异性的、四特异性的或多特异性的抗体，包括、但不限于Fab-Fv、Fab-scFv、Fab(Fv)2或Fab-(scFv)2构建体。如上定义的抗体片段是本领域已知的。为了清楚的目的，Fab-Fv应当理解为表示含有以任意顺序连接的一个Fv区域和一个Fab区域的构建体，即Fab-Fv或Fv-Fab，其中在一个区域中的最后一个氨基酸之后是在下一个区域中的第一个氨基酸，或反之亦然。类似地，Fab-scFv应当理解为表示含有以任意顺序连接的一个scFv区域和一个Fab区域的构建体，且在Fab连接至任一个多肽链的情况下(即Fab-scFv或scFv-Fab)，其中在一个区域中的最后一个氨基酸之后是在下一个区域中的第一个氨基酸，或反之亦然。以相同方式，Fab-(Fv)2应当理解为表示含有以任意顺序连接的两个Fv区域和一个Fab区域的构建体，即Fab-Fv-Fv、Fv-Fab-Fv或Fv-Fv-Fab，其中在一个区域中的最后一个氨基酸之后是在下一个区域中的第一个氨基酸，或反之亦然。类似地，Fab-(scFv)2应当理解为表示含有以任意顺序连接的两个scFv区域和一个Fab区域的构建体，且在Fab连接至任一个多肽链的情况下，产生20种可能的排列。通常，这些构建体包括在第一个区域(例如Fab)和第二个区域(例如Fv)之间的肽接头。这样的接头是本领域众所周知的，且可以是一个或多个氨基酸，通常由熟练的技术人员在长度和组成方面进行优化。可替换地，所述区域可以直接地(即没有肽接头)连接。用于将可变结构域连接至Fab或Fab'的合适接头区域的例子描述在WO 2013/068571(通过引用并入本文)中，且包括、但不限于柔性接头序列和刚性接头序列。柔性接头序列包括在以下文献中公开的那些：Huston等人,1988,10 PNAS 85:5879-5883；Wright&Deonarain,Mol.Immunol.,2007,44(11):2860-2869；Alfthan等人,Prot.Eng.,1995,8(7):725-731；Luo等人,J.Biochem.,1995,118(4):825-831；Tang等人,1996,J.Biol.Chern.271(26):15682-15686；和Turner等人,1997,JIMM 205,42-54。可以将抗体片段去糖基化(aglycosylated)或糖基化。
本文中使用的术语“抗体还原相关的杂质”表示杂质诸如游离的重链和轻链、半聚体(一个重链和一个轻链)或部分地缺乏二硫键的同种型，其由于链间二硫键的还原而出现。
本文中使用的术语“阳离子交换色谱法”表示这样的色谱法：其中固相是带负电荷的，例如具有一个或多个带负电荷的配体，例如羧酸盐或磺酸盐基团。商购可得的阳离子交换基质包括羧基-甲基-纤维素、固定化在琼脂糖上的磺丙基(SP)和固定化在琼脂糖上的磺酰基，诸如Capto S和Capto S Impres(GE Healthcare)、Unosphere S和Nuvia S(BioRad)、GigaCap S(Tosoh)、Fractogel S和Eshmuno S(Merck Millipore)、Poros S和Poros XS(Thermo Fisher)，或阳离子交换膜吸附剂诸如SartoBind S(Sartorius)和整体料吸附剂诸如SO3整体料(Bia Separations)。
本文中使用的术语“蛋白A”包括从其天然来源回收的蛋白A、合成地(例如通过肽合成或通过重组技术)生产的蛋白A、及其变体，所述变体保留结合具有CH2/CH3区域(诸如Fc区)的蛋白的能力。蛋白A可以商业上购自Repligen、GE Healthcare和Fermatech。蛋白A通常固定化在固相支持物材料(诸如膜或树脂)上。术语“蛋白A”也表示亲和色谱树脂或柱，其含有蛋白A共价地连接的色谱固体支持物基质。商购可得的蛋白A基质包括：MabSelect、MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX(来自GE Healthcare)；Amsphere Protein A(JSRLife Sciences)、KanCapA(Kaneka)、
Figure BDA0001812716910000161
High Cap(NovaSep)、UNOsphere SUPrA(BioRad)、Toyopearl(Toso BioScience)、Prosep Ultra plus、Eshmuno A、
Figure BDA0001812716910000162
Ultra(来自Millipore)、Poros Mab-Capture A(LifeTechnologies)和Praesto AC(Purolite)。
本文中使用的术语“深度过滤器”表示多种过滤器，其使用多孔过滤介质来保留贯穿所述介质(而不是仅仅在所述介质的表面上)的颗粒。它们通常用于含有高颗粒负载的流体，因为它们在变成饱和之前可以保留较大质量的颗粒。
实施例
实施例1:在2000L生物反应器规模过程中的抗体还原的阻止
在本实施例中，在2000L规模的分子A的制备表现出在蛋白A捕获色谱法步骤以后在活动2中的显著抗体还原。在随后的制备活动(活动3)中，在图3所示的初次回收过程中实现活性炭过滤步骤(Millistak+CR40,Millipore)。在该活动中没有检测到抗体还原。
分子A是一种人源化的单克隆IgG4P抗体，其在补料分批次生物反应器过程中在CHO DG44细胞系中表达并用3步骤色谱法过程纯化。确定完整糖基化分子的理论完整质量是147,460Da。图3详述了分子A的纯化过程，其中进料材料(feed material)来自生长了14天的2000L生物反应器。使用为产物回收和澄清优化过的设置，将所述材料使用叠盘(diskstack)离心机离心。在活动2中，然后将浓缩物(或上清液)用Pall PDE2和PDD1过滤器(或等同物)深度过滤，随后无菌过滤。这之后是使用蛋白A的捕获步骤(MabSelect SuRe LX,GEHealthcare)和随后的纯化步骤：阴离子交换(AEX，使用Capto Q,GE Healthcare)、阳离子交换(CEX，使用Capto SP ImpRes)、病毒减少过滤(VRF)和配制。在活动3中，在深度过滤和消毒过滤器(0.2μm孔径)之间在线应用活性炭过滤器。
捕获色谱法纯化步骤降低没有结合至树脂的宿主细胞杂质和细胞培养基组分的水平。所述产物在中性pH结合至柱。使用30mM醋酸钠(pH 3.7)，从柱洗脱结合的产物。
通过非还原生物分析仪，分析在捕获洗脱液样品中检测到的抗体还原，参见图2。借助于芯片上电泳(on-Chip-Electrophoresis)测定，使用所述分析方法来确定样品的纯度和在非还原条件下由抗体还原产生的杂质的存在。所述测定由两个主要步骤组成：蛋白与荧光染料的共价结合(标记)，以及用芯片上电泳对标记的蛋白的分离和检测。
所述芯片上测定由凝胶聚合物填充的微-通道的互连集合组成，所述微-通道随着蛋白借助于电泳被驱动穿过它而按照大小筛选所述蛋白。使用的设备是具有2100 Expert软件的2100 Bioanalyzer(由Agilent供给,参考#G2940CA)，和高灵敏度蛋白分析试剂盒(由Agilent technologies供给,参考#5067-1575)。
样品是来自制备活动2批次1和批次2(分别C2B1和C2B2)(其中在初次回收过程中没有应用炭过滤器)和活动3批次1(C3B1)(其中应用炭过滤器)的蛋白A洗脱液样品。在活动2样品中看到的抗体还原产物(半聚体和游离链)在活动3样品中没有看到。
图6显示了关于分子A的澄清的细胞培养液(CCCF)的样品，具有深度和无菌过滤(活动2过程，对照)，且在深度和无菌过滤器之间引入炭过滤器以后(活动3过程)，针对还原剂硫氧还蛋白、NAD/NADH和NADP/NADPH测定。在引入炭过滤器以后，检测到更低的这些还原剂水平。但是，通过炭过滤没有除去硫氧还蛋白还原酶。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是参与许多氧化还原反应的酶辅因子。NAD作为电子载体起作用，在氧化(NAD)和还原(NADH)形式之间循环。Sigma Aldrich NAD/NADHQuantification Kit MAK037在没有从样品预先纯化下检测NAD和NADH和它们的比率。该测定是对NAD和NADH特异性的，且不会检测NADP或NADPH。在比色测定(450nm)中定量NAD总(NAD和NADH)或NADH。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)是参与许多氧化还原反应的酶辅因子，其中它在还原(NADPH)和氧化(NADP)形式之间循环。
Sigma Aldrich NADP/NADPH Quantification Kit MAK038在没有从样品预先纯化下检测NADP和NADPH和它们的比率。该测定是对NADP和NADPH特异性的，且不会检测NAD或NADH。在比色测定(450nm)中定量NADP总(NADP和NADPH)或NADPH。
使用Simon Simple Western测定，测量硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶。将样品用SDS/DTT处理并热变性。然后将样品加载进毛细管中，通过大小分离，并经由专有UV捕获方法固定化至毛细管壁。将靶蛋白用抗体(抗硫氧还蛋白途径/抗谷氧还蛋白)免疫探测，随后进行HRP放大的化学发光检测(兔抗山羊HRP缀合物)。
与活动2相比在活动3中降低的杂质水平导致在随后阳离子交换色谱法步骤(其设计成除去低分子量物质和高分子量物质)上更高的步骤收率。来自活动3的材料的贮存期限也长于来自活动2的材料。
实施例2:在400L生物反应器规模过程中的抗体还原的阻止
在本实施例中，在400L规模的分子B的制备表现出在蛋白A捕获色谱法步骤以后在活动1批次1中的显著抗体还原。在随后的制造批次中，在图3所示的初次回收过程中实现活性炭过滤步骤(Millistak+CR40,Millipore)。在这些批次中没有检测到抗体还原。
分子B是一种人源化的单克隆IgG4P抗体。它在补料分批次生物反应器过程中在CHO DG44细胞系中表达并用3步骤色谱法过程纯化。确定完整糖基化IgG分子的理论完整质量是146,372Da(至最接近的整数道尔顿)。
纯化过程非常类似于实施例1中的分子A的纯化过程。差异是来自蛋白A色谱柱的洗脱缓冲液为100mM醋酸钠,pH3.7。在图4中所示的IgG分子B制备样品的非还原生物分析仪显示了批次1的澄清的细胞培养液和捕获洗脱液样品(在蛋白A色谱法以后)，其中还原的单体形成半聚体和重链。也显示了批次3的捕获洗脱液样品，其中已经在初次回收中应用活性炭过滤器，且所述分子在蛋白A捕获步骤以后仍然是单体。
图7显示了来自批次1(引入炭过滤器之前，对照)和批次2(炭过滤器应用之后)的分子B的澄清的细胞培养液(CCCF)，针对还原剂NAD/NADH和NADP/NADPH进行测定。在引入炭过滤器以后，检测到更低的这些还原剂水平。
实施例3
样品取自过滤以后分子B的制备活动(有和没有炭过滤)，但是随后使用制造过程的按比例缩小模型在低氧条件下纯化。该模型包括将样品用氮气鼓泡至少30分钟，然后将其在这些条件下储存过夜。
可以在图5上看到使用Sypro染色的非还原SDS-PAGE分析的该过程的结果。使用该分析方法来确定样品的纯度和在非还原条件下由抗体还原产生的杂质的存在。使用的凝胶是来自Thermo Fisher(Cat#EC6028)的NuPAGE 4-20％Tris-甘氨酸10×15孔1.5mm。显示了Mark 12分子量标准(Thermo Fisher,#LC5677)。使所述凝胶在125V的恒定电压运行。使用SYPRO红宝石红色荧光染料(Bio-Rad,cat#170-3125)进行染色。
然后将捕获步骤前(pre capture step)的样品(泳道3、4和5)冷冻(≤-60℃)和在即将分析之前解冻。将泳道6、7和8中的样品在用氮气鼓泡的包中通过蛋白A纯化，并然后将洗脱液样品冷冻和在即将分析之前解冻。
活动1批次1细胞培养液和捕获洗脱液样品含有低水平的单体和高水平的来自抗体还原的杂质。在炭过滤器之前所取的活动1批次2样品和来自该样品的捕获洗脱液都含有高水平的与抗体还原有关的杂质。在炭过滤器之后所取的样品和来自该样品的捕获洗脱液含有高水平的单体和低/零水平的由抗体还原产生的杂质。因此，炭过滤抑制在蛋白A色谱法以后观察到的还原抗体产物的形成。

Claims (10)

1.用于制备抗体或其片段的方法，所述方法包括：
-在宿主细胞中表达所述抗体或其片段
-回收含有所述抗体或其片段、宿主细胞碎片和杂质的混合物；和
-从所述混合物纯化所述抗体或其片段，其中所述纯化包括：
-活性炭过滤，继之以
-蛋白A色谱法，
其中，与从没有活性炭过滤步骤的相同方法回收的抗体或其 片段相比，从蛋白A色谱法回收的抗体或其 片段包含更少的抗体还原相关的杂质，
其中，在纯化所述抗体或其片段的过程中减少还原剂的量，所述还原剂是硫氧还蛋白、NADP、NADPH、NAD和/或NADH。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化包括至少一个另外的色谱法步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述另外的色谱法步骤包含阳离子交换色谱法和/或阴离子交换色谱法。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述回收的抗体或其片段包含天然二硫键。
5.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述回收的抗体或其片段包含天然链间二硫键。
6.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，且含有所述抗体的混合物是细胞培养物上清液。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述纯化过程另外包括在活性炭过滤之前的细胞培养物上清液的深度过滤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中在线运行深度过滤和活性炭过滤。
9.根据权利要求1-3和7-8中的任一项所述 的方法，其中从蛋白A色谱法回收的抗体或其 片段包含小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的抗体还原相关的杂质。
10.用于在纯化在宿主细胞中表达的抗体或其片段的过程中阻止二硫键还原的方法，所述方法包括：
-活性炭过滤步骤，继之以
-蛋白A色谱法。
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