KR102413808B1 - 단백질 정제 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 감소된 수준의 항체 환원 관련 불순물을 갖는 항체 또는 그의 단편을 제조하는 방법을 제공한다.

Description

단백질 정제 방법
본 발명은 단백질 정제 방법에 관한 것이다.
치료 분야에서, 단백질, 특히 항체 및 항체 유도 분자의 사용은 끊임없이 존재감과 중요도가 높아지고 있으며, 결과적으로 제어된 제조 공정에 대한 필요성이 동시에 높아져 왔다. 치료용 단백질의 상업화는 그의 대량 생산을 필요로 한다. 이 목적을 위해, 단백질은 흔히 숙주 세포에서 발현된 후, 투여 가능한 형태로 제조되기 전에 회수되고 정제되어야 한다. 상기 정제 동안에 제거되는 불순물은 일반적으로, 숙주 세포 잔해물, 숙주 세포 단백질, 미량의 배양 배지 등을 포함하는 공정 관련 불순물과, 원하는 생성물의 변형, 분해 또는 응집에 기인하는 생성물 관련 불순물로 분류된다.
항체 분자의 가장 일반적인 부류는 면역 글로불린 G(IgG), 즉, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된 헤테로테트라머이다. IgG 분자는 2개의 기능적 서브 유닛: (1) 항체의 꼬리를 구성하고 면역 반응을 활성화하기 위해 세포 표면 수용체와 상호 작용하는 결정화 가능한 단편(Fc) 및 (2) 항원 인식을 매개하는 단편 항원 결합(Fab)으로 세분될 수 있다. Fc 영역은 쌍으로 된 2개의 중쇄로부터의 2쌍의 불변 도메인(CH2 및 CH3)을 포함하는 반면에, Fab 영역은 중쇄로부터의가변 도메인과 그 후속의 불변 도메인(각각 VH 및 CH1)으로 구성되며, 이들은 경쇄로부터의 가변 도메인 및 불변 도메인(각각 VL 및 CL)과 쌍을 형성한다. Fc 및 Fab 영역은 경첩 영역에 의해 경계 지어지고, 상기 경첩 영역은 2개의 중쇄를 함께 유지하는 이황화 결합을 함유하며; CH1 및 CL 도메인 내의 추가의 이황화 가교는 중쇄와 경쇄를 함께 쌍으로 형성한다.
IgG 부류의 전장 항체는 종래에, 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus) 유래의 단백질 A를 사용하는 친화성 크로마토 그래피의 포착 단계를 포함하는 방법을 이용하여 정제되어 왔다. 단백질 A와 항체의 Fc 영역 간의 높은 특이성은, 이 크로마토그래피의 방식이, 세포 배양 수확 배지와 같은 복합 용액으로부터 직접 시작되는 단일 단계로 98% 초과의 불순물을 제거할 수 있게 한다. 이 공정 단계로부터 얻어진 큰 정제 인자는 전체 다운스트림 정제 공정을 단순화하는 데 도움을 준다. 일반적으로, 오직 미량의 불순물, 예컨대 고분자량 응집물, 잔류 숙주 세포 단백질, 잔류 DNA 또는 침출 단백질 A가 남게 되며, 이들은 이 정제 단계 후에 제거되는데, 이는 통상로 하나 내지 둘의 후속 크로마토그래피 단계로 달성될 수 있다.
단백질 A에 기초한 항체 정제가 지난 수십 년 동안 이용되고 개발되었다는 사실에도 불구하고, 재조합 항체를 투여에 적합한 순도로 산업적 규모로 제조하는 것은 여전히 과제로 남아있다. 특히, 항체 및 그의 단편과 같은 단백질은 일반적으로, 항체를 그의 본래의 형태로 생산하여 그의 생물학적 활성을 유지하도록 하기 위해, 제조 및 정제 과정 중에 보호 및 유지되어야 하는 쇄간 이황화 결합을 포함한다.
이러한 쇄간 이황화 결합이 환경에 의해 영향을 받아 환원되는 경우, 상이한 폴리펩티드 사슬들이 분리되어, 최종 항체 조제물로부터 제거되어야 하는 불완전한 항체 분자로 이루어진 불순물 유형을 생성할 것이다. 이후 정제 과정에서 환경이 산화됨에 따라, 그러한 환원 관련 불순물이 부정확하게 개질되어 고분자량 및 저분자량 종과 관련된 생성물의 정도가 높아질 수 있다. 생성된 추가 불순물의 정제는, 공정 수율 감소 및 최종 약물 물질의 불순물 수준 증가를 초래한다. 또한 제조 뱃치 전반의 재생산성이 보장되어야 하고, 따라서 특정 제조 뱃치의 결함을 피하기 위해서 이러한 불순물의 존재 및 상대량을 조절하는 것이 필수적이다. 뱃치 결함은, 약물 물질 내의 불순물 수준이 증가하거나 공정 중 조절을 충족하지 못한 것에 기인할 수 있다. 약물 물질 중 불순물 수준의 증가는, 또한 의약품의 저장 수명을 감소시킬 수 있다.
항체 제조 동안에, 쇄간 이황화 결합의 환원으로 인해 이황화 결합이 부분적으로 부족한 생성물 관련 불순물, 예컨대 유리 중쇄 및 경쇄 해프머(halfmer)(하나의 중쇄 및 하나의 경쇄) 또는 이소형의 출현이, 단백질 A 크로마토그래피 단계 후에 관찰되었다. 정제 과정 중에 이러한 불순물의 출현은 방지되어야 하고, 상기 과정의 일부로서 불순물이 제거되어야 한다. 있을 수 있는 생성물 관련 불순물은, 비환원성 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS PAGE)으로 분석할 수 있으며,이를 도 1에 도시한다.
이러한 관점에서, US 8,574,869는 숙주 세포 배양물로부터 재조합 단백질을 수확하는 동안에 이황화 결합 환원을 방지하는 방법을 개시한다.
따라서, 단백질을 각종 뱃치에 걸쳐 일정한 순도로 그의 본래의 형태로 정제할 수 있는, 재현 가능한 단백질 제조 방법이 당업계에 필요하다.
도 1: 정제를 거친 후의 항체 샘플로부터 회수된, 있을 수 있는 생성물 관련 불순물을 보여주는 쿠마시(Coomassie) 염색식 비환원성 겔 전기영동.
도 2: 분자 A의 단백질 A 용출액 샘플의 비환원성 생체 분석기. 샘플은, 카본 필터를 사용하지 않는 제조 캠페인 2 뱃치 1 및 뱃치 2(각각 C2B1 및 C2B2), 및 카본 필터가 적용된 캠페인 3 뱃치 1(C3B1)로부터의 단백질 A 용출액 샘플이다. 뱃치 2 샘플에서 보이는 해프머는 뱃치 3 샘플에서는 보이지 않는다.
도 3: 탄소 여과를 포함하는 정제 공정 흐름도. 활성탄 필터 단계는 심층 여과(depth filtration)와 살균 필터 사이에서 일렬로 실행된다. 단백질 A를 이용하는 포착 단계, 및 후속의 정제 단계, 즉, 음이온 교환 크로마토그래피(AEX), 양이온 교환 크로마토그래피(CEX), 바이러스 환원 여과(VRF) 및 조제가 이어졌다.
도 4: IgG 분자 B 제조 샘플의 비환원성 생체 분석기. 도시된 샘플은 뱃치 1을 위한 정화 세포 배양액 및 포착 용출액(단백질 A 크로마토그래피 후)이며, 상기 뱃치 1에서는 항체가 환원되어 해프머 및 유리 중쇄를 형성한다. 뱃치 3을 위한 포착 용출액이 또한 도시되며, 뱃치 3에서는 활성탄 필터가 1차 회수에서 적용되고 항체 분자가 단백질 A 포착 단계 후도 여전히 모노머이다.
도 5: 분자 B의 제조 샘플의 시프로(Sypro) 염색식 비환원성 SDS-PAGE 분석. 레인 1: 분자량 표준물, 레인 2: 분자 1 기준 표준물, 레인 3: 캠페인 1 뱃치 1 세포 배양액, 레인 4: 캠페인 1 뱃치 2 프리카본 필터, 레인 5: 캠페인 1 뱃치 2 포스트카본 필터, 레인 6: 캠페인 1 뱃치 1 포착 용출액, 레인 7: 캠페인 1 뱃치 2 무카본 필터 포착 용출액, 레인 8: 캠페인 1 뱃치 2 포스트카본 필터 포착 용출액.
도 6: 심층 여과 및 살균 여과(대조군)된, 분자 A 정화 세포 배양액(CCCF). 심층 필터와 살균 필터 사이에 카본 필터를 도입한 후, 환원제 티오레독신(A), NAD/NADH(B) 및 NADP/NADPH(C)에 대해 분석함.
도 7: 뱃치 1(카본 필터 도입 전, 대조군) 및 뱃치 2(카본 필터 적용 후)로부터의 분자 B 정화 세포 배양액(CCCF), 환원제 NAD/NADH 및 NADP/NADPH에 대해 분석함.
본 발명은, 본래의 이황화 결합을 갖는 항체를 회수할 수 있도록 하여 공정 수율을 향상시키고 뱃치들에 걸쳐 일관성을 보장하는 신규한 항체 제조 방법을 제공함으로써, 상기에서 인지된 요구를 해결한다.
따라서 제1 양태에서, 본 발명은 항체 또는 그의 단편의 제조 방법으로서,
- 상기 항체 또는 그의 단편을 숙주 세포에서 발현시키는 단계,
- 항체 또는 그의 단편, 숙주 세포 잔해물 및 불순물을 함유하는 혼합물을 회수하는 단계; 및
- 상기 혼합물로부터 상기 항체 또는 그의 단편을 정제하는 단계로서, 상기 정제는
- 활성탄 여과, 및 이에 후속되는
- 단백질 A 크로마토그래피
를 포함하는 것인 단계
를 포함하는 제조 방법을 제공한다.
제2 양태에서, 본 발명은 숙주 세포에서 발현된 항체 또는 그의 단편의 정제 동안에 이황화 결합 환원을 방지하는 방법으로서,
- 활성탄 여과 단계, 및 이에 후속되는
- 단백질 A 크로마토그래피
를 포함하는 방법을 제공한다.
제3 양태에서, 본 발명은 항체 또는 그의 단편을 정제하는 방법으로서,
- 활성탄 여과, 및 이에 후속되는
- 단백질 A 크로마토그래피
를 포함하는 방법을 제공한다.
제4 양태에서, 본 발명은 항체 또는 그의 항체 단편의 정제 동안에 환원제의 양을 감소시키는 방법으로서,
- 활성탄 여과, 및 이에 후속되는
- 단백질 A 크로마토그래피
를 포함하는 방법을 제공한다.
당업계에서 환원체(reductant) 또는 환원자(reducer)로도 일컬어지는 환원제(reducing agent)는, 산화환원 화학 반응에서 다른 화학 종에 전자를 소실(또는 공여)하는 원소 또는 화합물이다. 환원제는 전자를 소실하기 때문에 산화된 것으로 간주된다. 예를 들어 칼슘과 같은 특정 환원제가 세포 배양 배지에 존재할 수 있고, 추가의 환원제가 숙주 세포 대사의 결과로서 세포 배양액으로 분비될 수 있다. 또한, 재조합 단백질 제조 동안에, 전단력 및 그로 인한 세포 손상 및 있을 수 있는 용해 및/또는 세포 성분을 환경으로 방출시키는 아포토시스로 인해, 환원제가 배지에 추가로 방출될 수 있다. 방출된 세포 내용물의 환원제의 양 및 능력은, 세포주 및 공정 의존적이며, 이러한 환원제의 예는 글루타티온, 시스테이닐 글리시네이트, 시스테이닐 술포네이트, 티오레독신, NADP, NADPH, NAD, NADH를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 제4 양태의 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 티오레독신, NADP, NADPH, NAD 및/또는 NADH의 양을 감소시킨다.
본 발명의 제4 양태의 추가의 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 티오레독신, NADP, NADPH, NAD 및/또는 NADH의 양을 감소시킨다.
일반적으로, 단백질 A 크로마토그래피는 결합 및 용출 모드에서 수행되며, 여기서 고체상으로의 관심의 단백질의 결합은, 관심의 단백질이 고체상에 결합된 채로 있는 동안에, 숙주 세포 단백질과 같은 불순물이 크로마토그래피 매질을 통해 흐르게 한다. 이어서, 결합된 관심의 단백질은, 그 관심의 단백질을 상기 고체상에 결합시키는 메카니즘을 방해하는 용리 버퍼에 의해 고체상으로부터 회수된다.
본 발명의 방법의 추가의 실시양태에서, 결합되지 않은 물질이 용액으로부터 제거되도록, 항체 또는 그의 단편을 포함하는 혼합물을 적용한 후에 제1 용액을 단백질 A 크로마토그래피 물질에 첨가한다.
본 발명에 따른 방법의 추가의 실시양태에서, 결합된 항체 또는 그의 단편이 방출되도록, 용출 버퍼를 단백질 A 크로마토그래피 물질에 적용한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 결합된 항체는, 항체 결합을 방해하는 데 적합한 pH를 갖는 용출 버퍼를 적용함으로써 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 방출된다. 상기 pH는 특정 분자에 의존적이고, 일반적으로 숙련된 당업자에 의해 경험적으로 결정되며, 원하는 종말점을 성취하도록 조정되는데, 즉, 적용된 혼합물로부터 있을 수 있는 최대량의 모노머를 회수하는 것이 바람직할 수 있거나, 또는 가능한 가장 높은 순도로 모노머를 얻는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 용출 버퍼는 pH 3 ∼ pH 4.5, 바람직하게는, pH 3.2 ∼ pH 4.3, pH 3.5 ∼ pH 4, 바람직하게는 pH 3.6 ∼ pH 3.9를 갖는다.
단백질 A 크로마토그래피에서의 세정 및 용출 버퍼로서 사용하기에 적합한 버퍼는 당업계에서 용이하게 입수 가능하며, 비제한 예로서, 인산 완충 식염수(PBS), 트리스, 히스티딘, 아세트산, 시트르산 버퍼, 또는 MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 이미다졸), BES (N,N-(비스-2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노)-프로판술폰산) 또는 HEPES (N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산) 버퍼 중에서 선택될 수 있다.
제2 실시양태에서, 본 발명은 제1, 제2, 제3 또는 제4 양태에 따른 방법으로서, 상기 정제가 1 이상의 추가의 크로마토그래피 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다. 상기 또 다른 추가의 크로마토그래피 단계는 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피, 예컨대 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 키랄 크로마토그래피 또는 유전체 크로마토그래피로부터 선택된다. 이들 크로마토그래피 단계는 단독으로 또는 대안적으로, 또 다른 크로마토그래피 단계와 조합하여 이용될 수 있다. 또한, 이들 크로마토그래피 단계는 결합 및 용출 모드 또는 플로우 쓰루 모드로 작동될 수 있다. 플로우 쓰루 모드에서, 불순물은 결합하거나 고체상으로 감소된 이동성을 가지는 반면, 표적 단백질은 용출 또는 플로우 쓰루 분획으로 회수된다. 추가의 특정 실시양태에서, 상기 추가의 크로마토그래피 단계는 단백질 A 크로마토그래피 후에 수행된다.
제3 실시양태에서, 본 발명은 제2 실시양태에 따른 방법으로서, 상기 추가의 크로마토그래피 단계가 양이온 교환 크로마토그래피 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법으로 제공한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 제1 추가의 크로마토그래피 단계는, 불순물을 포착하고 단백질을 함유하는 플로우 쓰루를 생성하는 음이온 교환 크로마토그래피 단계이다.
본 발명의 다른 특정 실시양태에서, 제1 추가의 크로마토그래피 단계에 양이온 교환 크로마토그래피 단계가 후속되며, 여기서는 관심 단백질이 크로마토그래피 매질에 결합한 후, 단백질을 함유하는 용출액으로 용출된다. 대안적으로, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 불순물을 포획착고 단백질을 함유하는 플로우 쓰루를 생성하는 방식으로 작동된다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 제2 또는 제3 양태에 따른 방법으로서, 상기 추가의 크로마토그래피 단계가 음이온 교환 크로마토그래피의 제1 단계 및 양이온 교환 크로마토그래피의 제2 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
대안적 실시양태에서, 본 발명은 제2 또는 제3 실시양태에 따른 방법으로서, 상기 추가의 크로마토그래피 단계가 양이온 교환 크로마토그래피의 제1 단계 및 음이온 교환 크로마토그래피의 제2 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
추가의 실시양태에서, 하나 이상의 한외 여과 또는 디아 필터(diafiltration)(UF/DF) 단계가 크로마토그래피 단계들 사이에서 수행된다. 산업 규묘의 단백질 제조에서, 이것은 일반적으로 생성물 농축 및 버퍼 교환의 목적으로 수행되는 멤브레인 기반 접선 유동 여과 단계를 이용하여 작동된다. 이 멤브레인은 일반적으로 낮은 단백질 결합성이고, 생성물 소실을 방지하기 위해 특정 명목 분자량 컷오프를 가지고 있으며, 예를 들어 이것은 30 kDa의 공칭 분자량 컷오프를 갖는 폴리에테르술폰(PES)(Pall Life Sciences의 T-시리즈 Omega PES 멤브레인), 또는 30 kDa의 공칭 분자량 컷오프를 갖는 재생된 셀룰로오스(Pall Life Sciences의 Delta Regenerated Cellulose Membrane)를 포함한다. 대안적으로, 30 kDa 분자량 컷오프를 갖는 멤브레인, 예컨대 Millipore의 Pellicon 3 또는 Sartorius의 Hydrosart가 사용된다.
정제 계획은, 표적 단백질의 물리적-화학적 특성에 맞게, 상기 단계들 중 임의의 단계를 다양한 조합으로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 추가의 특정 실시양태에서, 혼합물로부터의 단백질 정제의 단계는 단백질을 함유하는 제1 플로우 쓰루가 회수되는 음이온 교환 크로마토그래피인 제1 추가의 크로마토그래피 단계, 단백질을 함유하는 용출액이 용출되는 양이온 교환 크로마토그래피인 제2 추가의 크로마토그래피 단계; 및 용출액에 적용되는 제2 한외 여과 또는 디아 여과 단계를 포함한다.
본 발명의 방법의 추가의 특정 실시양태에서, 혼합물로부터의 단백질 정제의 단계는 단백질을 함유하는 제1 용출액이 용출되는 양이온 교환 크로마토그래피인 제1 추가의 크로마토그래피 단계, 제1 용출액에 적용되는 제1 한외 여과 또는 디아 여과 단계, 단백질을 함유하는 플로우 쓰루를 생성하는 음이온 교환 크로마토그래피인 제2 추가의 크로마토그래피 단계; 및 플로우 쓰루에 적용되는 제2 한외 여과 또는 디아 여과 단계를 포함한다.
본 발명의 방법의 추가의 특정 실시양태에서, 정제 공정은 단백질 A 크로마토그래피 후에 및 추가의 크로마토그래피 단계 전에 한외 여과 또는 디아 여과 단계를 추가로 포함한다.
제4 실시양태에서. 본 발명은 앞선 실시양태 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 회수된 항체 또는 그의 단편이 본래의 이황화 결합을 포함하는 것인 방법을 제공한다.
제5 실시양태에서, 본 발명은 앞선 실시양태 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 회수된 항체 또는 그의 단편이 본래의 쇄간 이황화 결합을 포함하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 양태 중 어느 하나에 따른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 앞선 실시양태 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 항체 또는 단편이 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만의 항체 환원 관련 불순물을 포함하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 양태 중 어느 하나에 따른 다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 임의의 앞선 실시양태에 따른 방법으로서, 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 항체 또는 그의 단편이, 활성탄 여과 단계가 없는 동일한 공정으로부터 회수된 항체 또는 단편보다 적은 항체 환원 관련 불순물을 포함하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 양태 중 어느 하나에 따른 추가의 대안적 실시양태에서, 본 발명은 임의의 앞선 실시양태에 따른 방법으로서, 정제된 항체 또는 그의 단편이 감소된 수준의 항체 환원 관련 불순물을 갖는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 양태 중 어느 하나에 따른 추가의 대안적 실시양태에서, 본 발명은 임의의 앞선 실시양태에 따른 방법으로서, 정제된 항체 또는 그의 단편이, 단백질 A 크로마토그래피 단계에 감소된 수준의 항체 환원 관련 불순물을 갖는 것인 방법을 제공한다.
제6 실시양태에서, 본 발명은 앞선 실시양태 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 숙주 세포가 포유류 숙주 세포이고, 항체를 함유하는 혼합물이 세포 배양 상청액인 방법을 제공한다.
제7 실시양태에서 본 발명은 제5 실시양태에 따른 방법으로서, 상기 정제 공정이, 활성탄 여과 전에 세포 배양 상청액의 심층 여과를 추가로 포함하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 가능한 실시양태에서, 상기 여과 과정은, 예를 들어 멸균 필터와 같은, 당업자가 이용할 수 있는 추가의 필터를 포함할 수 있다.
단백질 정제 동안의 연속적인 여과 단계는 분리 단계로서 수행될 수 있으며, 여기서 여과될 혼합물은 하나의 필터를 통과하고, 여과액이 회수된 다음, 제2 필터를 통과하며, 여기서 제2 여과액이 회수된다. 대안적으로, 상기 여과 단계는 일렬로 실행될 수 있으며, 여기서는 하나의 필터가 다음 필터에 인접하여, 여과될 매체가 두 필터를 연속적으로 통과하고 이 단계 후에 하나의 여과액이 회수되며, 상기 일렬의 설정은 흔히 필터 트레인(filter train)으로 일컬어진다.
제8 실시양태에서, 본 발명은 제7 실시양태에 따른 방법으로서, 심층 여과와 활성탄 여과가 일렬로 실행되는 것인 방법을 제공한다.
대안적으로, 본 발명의 방법의 제7 실시양태의 다른 특정 실시양태에서, 심층 여과와 활성탄 여과는 별개의 단계이다.
본 발명의 실시양태에 따른 숙주 세포는, 예를 들어 원핵 생물, 효모[예를 들어 제한 없이 칸디다 보이디니(Candida boidinii), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 기타 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces spp .), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)], 점균류[예를 들어 제한 없이 딕티오스텔리움 디스코이듐(Dictyostelium discoideum)], 사성성 진균[예를 들어 제한 없이 트리초데르마 리제이(Trichoderma reesei) 및 다른 트리초데르마 종(Trichoderma spp.), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 및 다른 아스페르길루스 종(Aspergillus spp .)], 이끼[예를 들어 제한 없이 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens), 아트리춤 운둘라툼(Atrichum undulatum)], 곤충 또는 포유류 세포이다. 포유류 숙주 세포는, 예를 들어 제한 없이 NSO, SP2.0, 3T3 세포, COS 세포, 인간 골육종 세포, MRC-5 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, VERO 세포, CHO 세포, rCHO-tPA 세포, rCHO-Hep B 표면 항원 세포, CHO-S 세포, HEK 293 세포, rHEK 293 세포, C127 세포, rC127-Hep B 표면 항원 세포, 인간 섬유아 세포, 간질 세포, 간 세포 또는 PER.C6 세포를 포함한다.
숙주 세포는 바람직하게는 진핵 숙주 세포, 바람직하게는 포유류 숙주 세포,보다 바람직하게는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 DG44 균주의 것이다.
진핵 숙주 세포(예를 들어, 효모, 곤충 또는 포유류 세포)의 경우, 숙주의 성질에 따라 상이한 전사 및 번역 조절 서열이 사용될 수 있다. 이들은, 바이러스원, 예컨대 아데노 바이러스, 소 유두종 바이러스, 시미안 바이러스 등으로부터 유래될 수 있으며, 여기서 조절 신호는 높은 발현 수준을 갖는 특정 유전자와 관련된다. 예는 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터, SV40 초기 프로모터, 효모 gal4 유전자 프로모터 등이다. 유전자 발현이 조절될 수 있도록 억제 및 활성화를 허용하는 전사 개시 조절 신호가 선택될 수 있다. 도입된 DNA에 의해 안정하게 형질 전환된 세포는, 또한 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선택될 수 있다. 마커는 영양 요구성 숙주에 대한 광영양, 살 생물제 내성, 예를 들어 제한 없이 항생제 또는 중금속, 예컨대 구리 등을 제공할 수 있다. 선별 마커 유전자는 발현되는 DNA 유전자 서열에 직접 연결되거나, 또는 동시 형질 감염에 의해 동일한 세포로 도입될 수 있다. 추가의 요소가 또한 본 발명의 단백질의 최적 합성을 위해 필요할 수 있다.
진핵 숙주 세포는, 관심의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터로 형질 감염된 후, 관심의 단백질의 성장 및 발현을 지원하는 임의의 배지에서 배양된다. 배지는 동물 유래물, 예컨대 동물성 혈청 및 펩톤이 없는 화학적으로 규정된 배지이다. 세포 성장 및 단백질 보호를 가능하게 하는 적절한 농도로 존재하는 비타민, 아미노산, 호르몬, 성장 인자, 이온, 버퍼, 뉴클레오시드, 글루코오스 또는 등가 에너지원의 상이한 조합을 포함하는, 당업자가 이용 가능한 각종의 세포 배양 배지가 있다. 추가적인 세포 배양 배지 성분들이, 당업자에게 공지된 세포 배양 주기 동안의 상이한 시간에 적절한 농도로 세포 배양 배지에 포함될 수 있다.
포유류 세포 배양은, 요구되는 생산 규모에 따라 유가 모드로 작동되거나 작동되지 않을 수 있는 진탕 플라스크 또는 생물 반응기와 같은 임의의 적합한 용기에서 이루어질 수 있다. 이러한 생물 반응기는 교반 탱크 또는 에어 리프트 반응기일 수 있다. 다양한 대규모 생물 반응기가, 400 L 초과, 1,000　L ∼ 50,000　L 또는 100,000　L, 바람직하게는 5,000　L ∼ 20,000　L, 또는 ∼ 10,000　L의 용량으로 이용 가능하다. 대안적으로, 2 L, 80 L 및 100 L 사이와 같은 소규모의 생물 반응기가, 본 발명의 방법에 따른 항체를 제조하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 공정 및 방법에 따라, CHO 세포와 같은 진핵 숙주 세포에서 생산되는 항체 또는 항원 결합 단편과 같은 관심의 단백질은, 일반적으로 세포 배양물의 상청액에서 발견된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 상청액은 본 발명의 방법으로 정제된 혼합물이다.
따라서 본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 공정 및 방법은, 본 발명의 방법에 따른 추가의 정제를 위해, 세포 배양액의 원심 분리 단계, 및 원심 분리 후 액체상을 회수하여 항원 또는 그의 단편을 함유하는 혼합물을 얻는 단계를 포함한다.
대안적으로 또는 부가적으로, 상기 상청액은 예를 들어 심층 여과와 같은 당업자에게 공지된 정화 기술을 이용하여 회수될 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 방법은 본 발명의 방법에 따른 추가의 정제를 위해, 항체 또는 그의 단편을 함유하는 혼합물을 수득하기 위한 심층 여과의 단계를 포함한다.
대안적으로, 숙주 세포는 원핵 세포, 바람직하게는 그람 음성 박테리아, 바람직하게는 대장균 세포이다. 단백질 발현을 위한 원핵 숙주 세포는 당해 분야에 널리 공지되어 있다(Terpe, 2006; Appl Microbiol Biotechnol 72, 211-222). 숙주 세포는 항체 단편과 같은 관심의 단백질을 생산하도록 유전적으로 조작된 재조합 세포이다. 재조합 대장균 숙주 세포는, MC4100, TG1, TG2, DHB4, DH5α, DH1, BL21, K12, XL1Blue 및 JM109를 포함하는 임의의 적합한 대장균 균주로부터 유래될 수 있다. 일례는 재조합 단백질 발효에 일반적으로 사용되는 숙주 균주인 대장균 균주 W3110(ATCC 27, 325)이다. 또한 항체 단편은 변형된 대장균 균주, 예를 들어 대사 돌연변이 또는 프로테아제 결핍 대장균 균주를 배양하여 생산할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 정제될 수 있는 항체 단편은 일반적으로, 단백질의 성질, 생산 규모 및 사용되는 대장균 균주에 따라, 대장균 숙주 세포의 주변 세포질 또는 숙주 세포 배양 상청액에서 발견된다. 이들 구획으로 단백질을 표적화하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(Makrides, 1996; Microbiol Rev 60, 512-538). 대장균의 주변 세포질로 단백질을 유도하기에 적합한 신호 서열의 예는, 대장균 PhoA, OmpA, OmpT, LamB 및 OmpF 신호 서열을 포함한다. 단백질은 자연 분비 경로에 의존하거나 또는 단백질 분비를 일으키기 위해 외부 막의 제한된 누출을 유도하는 것에 의해 상청액으로 표적화될 수 있으며, 그 예는 pelB 리더, 단백질 A 리더, 박테리오신 방출 단백질, 배양 배지에 글리신을 첨가하는 것과 함께 마이토마이신 유도 박테리오신 방출 단백질의 공동 발현, 막 투과성화를 위한 kil 유전자의 공동 발현이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 방법에서, 재조합 단백질은 숙주 대장균의 주변 세포질에서 발현된다.
대장균 숙주 세포에서의 재조합 단백질의 발현은 또한, 유도 시스템의 제어하에 있을 수 있으며, 그에 의해 대장균에서의 재조합 항체의 발현이 유도성 프로모터의 제어하에 있게 된다. 대장균에서의 사용에 적합한 다수의 유도성 프로모터는 당업계에 널리 공지되어 있고 프로모터에 의존하며, 재조합 단백질의 발현은, 성장 내지에서의 온도 또는 특정 물질의 농도와 같은 다양한 인자에 의해 유도될 수 있다. 유도성 프로모터의 예는, 락토오스 또는 비가수분해성 락토오스 유사체, 이소프로필-b-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG), 그리고 phoA, trp 및 araBAD 프로모터로 유도 가능한 대장균 lac, tac 및 trc 프로모터이고, 이들은 인산염, 트립토판 및 L-아라비노오스에 의해 각각 유도된다. 발현은, 예를 들어 유도 물질의 첨가 또는 온도 변화에 의해 유도될 수 있으며, 여기서 유도는 온도 의존적이다. 배양 물에 유도 물질을 첨가하여 재조합 단백질 발현의 유도를 달성하는 경우, 발현 시스템 및 유도 물질에 따라 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어, 단일 또는 다중 샷 첨가에 의해, 또는 공급물을 통한 유도 물질의 점진적 첨가에 의해 유도 물질을 첨가할 수 있다. 유도 물질의 첨가와 단백질 발현의 실제 유도 사이에는 지연이 있을 수 있으며, 예를 들어 유도 물질이 락토오스인 경우, 락토오스 전에 임의의 기존의 탄소원이 이용되면서, 단백질 발현의 유도가 발생하기 전에 지연이 있을 수 있다.
대장균 숙주 세포 배양(발효)은 대장균의 성장 및 재조합 단백질의 발현을 지지하는 임의의 배지에서 배양될 수 있다. 배지는, 예를 들어 문헌[Durany O, 2004; Process Biochem 39, 1677-1684]에 기술되어 있는 임의의 화학적으로 규정된 배지일 수 있다.
대장균 숙주 세포의 배양은 요구되는 생산 규모에 따라 진탕 플라스크 또는 발효기와 같은 임의의 적합한 용기에서 이루어질 수 있다. 다양한 대규모 발효기가 1,000　L 초과 100,000　L 이하의 용량으로 이용 가능하다. 바람직하게는 1,000　L ∼ 50,000　리터의 발효기, 보다 바람직하게는 1,000　L ∼ 10,000　L 또는 12,000　L의 발효기가 사용된다. 0.5　L ∼ 1,000　L의 용량을 갖는 소규모 발효기가 사용될 수도 있다.
CHO 또는 대장균과 같은 숙주 세포의 발효는, 단백질 및 필요한 수율에 따라 임의의 적합한 시스템, 예를 들어 연속식, 뱃치식 또는 유가식 모드로 수행될 수 있다. 뱃치 모드는, 필요할 경우 영양소 또는 유도 물질의 샷 첨가와 함께 이용될 수 있다. 대안적으로, 유가 배지가 사용될 수 있고, 영양소를 이용하여 지속될 수 있는 최대 비 성장 속도에서 뱃치 모드 사전 유도로 성장된 배양물이, 발효가 완료될 때까지 성장 속도를 조절하는 데에 사용되는 하나 이상의 영양 공급 체계 및 발효기에 초기에 존재한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은, 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스 상에 로딩하기 전에, 세포 배양 수확물을 원심 분리하는 단계, 및 그 후속으로 추출 버퍼의 첨가에 의해 숙주 세포를 현탁하는 단계를 포함한다.
항체 단편과 같은 관심의 단백질이 숙주 세포의 주변 세포질 공간에서 발견되는 대장균 발효 공정에 있어서, 숙주 세포로부터 단백질을 방출할 것이 요구된다. 그 방출은 기계적 또는 압력 처리, 동결-해동 처리, 삼투 충격, 추출제 또는 열 처리에 의한 세포 용해와 같은 임의의 적합한 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 단백질 방출을 위한 추출 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
본원에서 사용될 때 용어 "활성탄"은 탄소 원자들 사이에 수백만 개의 작은 공극을 생성하여 표면적이 극적으로 증가하도록 가공된 카본의 형태를 가리킨다. 활성탄의 표면적은 물질을 흡착에 적합하게 하며, 흡착은 불순물을 유체, 증기 또는 기체로부터 제거하는 공정이다. 활성탄은 활성숯으로도 공지되어 있다. 시판의 활성탄 필터는 Millipore Millistak+ CR 시리즈, Pall Activated Carbon Filters Incorporating Seitz® AKS Filter Media, 및 3M Zeta PlusTM Activated Carbon Filter가 포함 되나 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용될 때 용어 "음이온 교환 크로마토그래피"는, 고체상이 양으로 하된, 예컨대 그에 부착된 하나 이상의 양으로 하전된 리간드, 예컨대 4급 아미노기를 갖는 크로마토그래피를 가리킨다. 시판의 음이온 교환 매트릭스는 DEAE 셀룰로오스, QAE SEPHADEXTM, FAST　Q SEPHAROSETM Capto　Q, Capto Adhere 및 Capto　Q Impres(GE Healthcare), Unosphere 및 Nuvia　Q(BioRad), GigaCap　Q(Tosoh), Mustang Q XT(Pall), Fractogel　Q 및 Eshmuno　Q(Merck Millipore), Poros XQ(Thermo Fisher) 및 음이온 교환막 흡착제, 예컨대 SartoBind　Q(Sartorius), 및 모놀리스 흡착제, 예컨대 QA 모놀리스(Bia Separations)를 포함한다.
본원에서 사용될 때 용어 "항체" 또는 "항체들"은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 단클론성 또는 다클론성 4량체 전장 항체를 가리킨다. 용어 '면역 글로불린' 또는 '면역 글로불린들'은 각각 "항체" 또는 "항체들"과 동의어로 사용된다. 본원에서 사용될 때 용어 "항체" 또는 "항체들"은 당업계에 공지된 재조합 기술에 의해 생성된 재조합 항체를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. "항체" 또는 "항체들"은, 포유류 종, 예컨대 인간, 비인간 영장류(예컨대 침팬지, 개코원숭이, 붉은털 원숭이 또는 시노몰구스 원숭이 유래), 설치류(예컨대 마우스, 래트, 토끼, 햄스터 또는 기니아 피그 유래), 염소, 소 또는 말 종을 포함하는 임의의 기원을 가질 수 있다. 본원의 항체는 관심의 "항원"에 대항하여 유도된다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이며, 질환 또는 장애를 앓고 있는 포유동물에게 항체를 투여하는 것은 그 포유동물에게 치료 효과를 일으킬 수 있다. 그러나, 비-폴리펩티드 항원에 대항하여 유도된 항체도 고려된다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 그것은 막 관통성 분자(예컨대, 수용체) 또는 리간드, 예컨대 성장 인자 또는 사이토카인일 수 있다. 본 발명에 포함되는 항체의 바람직한 분자 표적은 CD 폴리펩티드, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD34, CD38, CD40 및 CD40-L; FcRN; OX40; HER 수용체 일족의 구성원, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 α 또는 β 서브유닛을 포함하는 av/b3 인테그린(예컨대 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 케모카인 및 사이토카인 또는 그들의 수용체, 예컨대 IL-1α 및 β, IL-2, IL-6, IL-6 수용체, IL-12, IL-13, IL-17A 및/또는 IL-17F, IL-18, IL-21, IL-23, TNFα 및 TNFβ; 성장 인자, 예컨대 VEGF; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만(OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 폴리펩티드 C; PD1, PD-L1, PCSK9; 스크렐로스틴 등을 포함한다.
본원에 사용될 때 용어 "항체 단편" 또는 "항체 단편들"은 항체의 일부분, 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 가리킨다. 항체 단편의 예는, Fc 부분이 부족하거나 Fc 부분을 갖지 않는 임의의 항체를 포함한다. 항체 단편의 예로는 또한 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 및 scFv 단편; 그리고 BiTEs®(Bi-specific T-cell Engagers) 및 DARTsTM(Dual Affinity Re-Targeting 기술)와 같은 포맷을 포함하는 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 도메인 항체(dAb), 예컨대 sdAb, VHH 및 VNAR 단편; 단쇄 항체; Fab-Fv, Fab-scFv, Fab(Fv)2 또는 Fab-(scFv)2 구조물을 포함하나 이에 한정되지 않는 항체 단편 또는 항체로부터 형성된 2중 특이적, 3중 특이적, 4중 특이적 또는 다중 특이적 항체를 포함한다. 상기 정의된 바와 같은 항체 단편은 당업계에 공지되어 있다. 명료함을 위해, Fab-Fv는 임의의 순서로 결합된 하나의 Fv 영역 및 하나의 Fab 영역, 즉 Fab-Fv 또는 Fv-Fab를 함유하는 구조물을 가리키는 것으로 이해되어야 하며, 여기서 한 영역 내의 마지막 아미노산에는 다음 영역의 첫 번째 아미노산이 후속되고, 그 반대도 마찬가지이다. 유사하게, Fab-scFv는 임의의 순서로 결합된 하나의 scFv 영역 및 하나의 Fab 영역을 함유하는 구조물을 가리키는 것으로 이해되어야 하고, Fab의 경우 폴리펩티드 사슬, 즉 Fab-scFv 또는 scFv-Fab을 가리키며, 하나의 영역에서의 마지막 아미노산에는 다음 영역에서의 첫 번째 아미노산이 후속되고, 그 반대로 마찬가지이다. 동일한 방식으로, Fab-(Fv)2는 임의의 순서로 결합된 2개의 Fv 영역 및 하나의 Fab 영역을 함유하는 구조물, 즉 Fab-Fv-Fv, Fv-Fab-Fv 또는 Fv-Fv-Fab를 가리키는 것으로 이해되어야 하고, 여기서 하나의 영역에서의 마지막 아미노산에는 다음 영역에서의 첫 번째 아미노산이 후속되거나 그 반대로 마찬가지이다. 유사하게, Fab-(scFv)2는 임의의 순서로 결합된 2개의 scFv 영역 및 하나의 Fab 영역을 함유하는 구조물을 가리키는 것으로 이해되어야 하고, Fab의 경우에는 20개의 가능한 순열을 유도하는 폴리펩티드 사슬을 가리킨다. 일반적으로, 이들 구조물은 제1 영역(예를 들어, Fab)과 제2 영역(예를 들어, Fv) 사이에 펩티드 링커를 포함한다. 이러한 링커는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 일반적으로 당업자에 의해 길이 및 조성이 최적화 된 하나 이상의 아미노산일 수 있다. 대안적으로, 상기 영역은 직접적으로, 즉 펩티드 링커 없이 연결될 수 있다. 가변 도메인을 Fab 또는 Fab'에 연결하기에 적합한 링커 영역의 예는 본원에 참고로 인용된 WO 2013/068571에 기재되어 있으며, 가요성 링커 서열 및 경질 링커 서열을 포함하나 이제 한정되지 않는다. 가요성 링커 서열은 문헌[Huston et al., 1988, 10 PNAS 85:5879-5883; Wright & Deonarain, Mol. Immunol., 2007, 44(11):2860-2869; Alfthan et al., Prot. Eng., 1995, 8(7):725-731; Luo et al., J. Biochem., 1995, 118(4):825-831; Tang et al., 1996, J. Biol. Chern. 271(26): 15682-15686]; 및 문헌[Turner et al., 1997, JIMM 205, 42-54]에 개시된 것들을 포함한다. 항체 단편은 탈글리코실화되거나 글리코실화될 수 있다.
본원에서 사용될 때 용어 "항체 환원 관련 불순물"은, 쇄간 이황화 결합의 환원로 인해 나타나는, 부분적으로 이황화 결합을 갖지 않는 유리 중쇄 및 경쇄, 해프머(하나의 중쇄 및 하나의 경쇄) 또는 이소형을 지칭한다.
본원에서 사용될 때 용어 "양이온 교환 크로마토그래피"는 음으로 하전된 고체상이, 예를 들어 하나 이상의 음으로 하전된 리간드, 예컨대 카르복실레이트 또는 술포네이트 기를 갖는 크로마토그래피를 가리킨다. 시판의 양이온 교환 매트릭스는 아가로오스 상에 고정화된 카르복시-메틸-셀룰로오스 술포프로필(SP), 및 아가로오스 상에 고정화된 술포닐, 예컨대 Capto　S, 및 Capto　S Impres(GE Healthcare), Unosphere　S 및 Nuvia　S(BioRad), GigaCap　S(Tosoh), Fractogel　S 및 Eshmuno　S(Merck Millipore) Poros S 및 Poros XS(Thermo Fisher) 또는 양이온 교환막 흡찾게, 예컨대 SartoBind　S(Sartorius) 및 모놀리스 흡착제, 예컨대 SO3 모놀리스(Bia Separations)를 포함한다.
본원에서 사용될 때 용어 "단백질 A"는, 그의 천연 공급원으로부터 회수된 단백질 A, 합성에 의해(예를 들어, 펩타이드 합성 또는 재조합 기술에 의해) 생성 된 단백질 A, 및 CH2/CH3 영역, 예컨대 Fc 영역을 갖는 단백질을 결합하는 능력을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 단백질 A는 Repligen, GE Healthcare 및 Fermatech에서 상업적으로 구입할 수 있다. 단백질 A는 일반적으로 막 또는 수지와 같은 고체상 지지체 물질 상에 고정화된다. 용어 "단백질 A"는, 또한 단백질 A가 공유 결합되는 크로마토그래피 고체 지지체 매트릭스를 함유하는 친화성 크로마토 그래피 수지 또는 컬럼을 가리킨다. 시판의 단백질 A 매트릭스는 GE Healthcare의 MabSelect, MabSelect SuRe, MabSelect SuRe LX; Amsphere Protein A(JSR Life Sciences), KanCapA(Kaneka), AbSolute® High Cap(NovaSep), UNOsphere SUPrA(BioRad), Toyopearl(Toso BioScience), Millipore의 Prosep Ultra plus, Eshmuno A, ProSep®-vA, ProSep®-vA Ultra, Poros Mab-Capture A(Life Technologies), 및 Praesto AC (Purolite)를 포함한다.
본원에서 사용될 때 용어 "심층 필터"는 다공성 여과 매체를 사용하여 매체의 표면 상에 뿐만 아니라 매체 전반에 입자를 보유하는 다양한 필터들을 지칭한다. 이들은 일반적으로, 포화되기 전에 보다 많은 양의 입자를 보유할 수 있기 때문에 입자의 장입이 많은 유체에 사용된다.
실시예
실시예 1: 2000 L 생물 반응기 규모의 공정에서의 항체 환원의 방지
본 실시예에서, 2000 L 규모의 분자 A의 제조는 단백질 A 포착 크로마토그래피 단계 후에 캠페인 2에서 현저한 항체 환원을 나타냈다. 후속의 제조 캠페인(캠페인 3)에서 도 3에 도시된 바와 같이 1차 회수 과정에서 활성탄 여과 단계(Millistak+CR40, Millipore)가 실행되었다. 이 캠페인에서 항체 환원은 검출되지 않았다.
분자 A는 유가식 생물 반응기 공정에서 CHO DG44 세포주에서 발현되고 3 단계 크로마토그래피 공정으로 정제된 인간화 단일 클론 IgG4P 항체이다. 완전한 글리코실화된 분자에 대한 이론적인 온전한 질량은 147,460 Da으로 결정되었다. 도 3은 14일 동안 배양된 2000 L 생물 반응기로부터의 공급 물질로 분자 A에 의한 정제 과정을 상세히 보여준다. 디스크 적층 원심 분리기를 사용하여, 생성물 회수 및 정화를 위한 최적의 설정을 이용하여 물질을 원심 분리하였다. 이어서, 캠페인 2에서 원심분리물(또는 상청액)을 Pall PDE2 및 PDD1 필터(또는 등가물)로 심층 여과한 다음, 살균 여과하였다. 이에는, 단백질 A(MabSelect SuRe LX, GE Healthcare)를 이용하는 포착 단계, 및 그 후속의 정제 단계: 음이온 교환(Capto Q를 이용하는 AEX, GE Healthcare), 양이온 교환(Capto SP ImpRes를 이용하는 CEX), 바이러스 환원 여과(VRF), 및 조제가 이어졌다. 캠페인 3에서, 활성탄 필터는 심층 여과와 멸균 필터(구멍 직경 0.2 μm) 사이에서 일렬로 실행되었다.
포착 크로마토그래피 정제 단계는 수지에 결합하지 않는 세포 배양 배지 성분 및 숙주 세포 불순물의 수준을 감소시킨다. 생성물은 중성 pH에서 컬럼에 결합된다. 결합된 생성물을 30 mM 아세트산나트륨(pH 3.7)을 이용하여 컬럼으로부터 용출시킨다.
항체 환원은 비환원성 생물 분석기로 분석한 포착 용출액 샘플에서 검출되었다(도 2 참조). 분석 방법은, 온-칩 전기영동 분석에 의해 비환원 조건에서, 항체 환원에 의해 생성된 불순물의 존재 및 샘플의 순도를 결정하기 위해 이용되었다. 이 분석은 두 가지 주요 단계, 즉, 형광 염료(표지)를 이용한 단백질의 공유 결합, 및 온-칩 전기영동으로 표지된 단백질의 분리 및 검출로 이루어져 있다.
온-칩 분석법은, 전기영동에 의해 단백질을 통과시키면서 크기별로 단백질을 체질하는 겔 폴리머로 채워진 마이크로 채널의 상호연결된 세트로 구성된다. 사용 된 장비는 2100 Expert 소프트웨어(Agilent에 의해 공급됨, 참조 번호 #G2940CA) 및 고감도 단백질 분석 키트(Agilent technologies에 의해 공급됨, 참조 번호 #5067-1575)를 갖는 2100 Bioanalyzer이다.
샘플은, 1차 회수 동안에 카본 필터가 적용되지 않은 제조 캠페인 2 뱃치 1 및 뱃치 2(각각 C2B1 및 C2B2), 및 카본 필터가 적용된 캠페인 3 뱃치 1(C3B1)로부터의 단백질 A 용출액 샘플이다. 캠페인 2 샘플에서 보이는 항체 환원 생성물(해프머 및 유리 사슬)은 캠페인 3 샘플에서는 보이지 않는다.
도 6은, 환원제 티오레독신, NAD/NADH 및 NADP/NADPH에 대해 분석한, 심층 여과 및 살균 여과(캠페인 2 공정, 대조군)가 실시된, 그리고 심층 필터와 멸균 필터 사이에 카본 필터를 도입(캠페인 3 공정)한 후의, 분자 A에 대한 정화 세포 배양액(CCCF)의 샘플을 도시한다. 카본 필터가 도입된 후에는 이러한 환원제가 낮은 수준으로 검출된다. 그러나 티오레독신 환원 효소는 카본 여과에 의해 제거되지 않는다.
니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)는 다수의 산화 환원 반응에 관여하는 효소적 보조 인자이다. NAD는 산화된 형태(NAD)와 환원된 형태(NADH) 사이를 순환하는 전자 캐리어로서 기능한다. Sigma Aldrich NAD/NADH Quantification Kit MAK037은 샘플로부터 사전 정제 없이 NAD와 NADH, 및 그들의 비율을 검출한다. 이 분석은 NAD 및 NADH에 특이적인 것이고, NADP 또는 NADPH는 검출하지 않는다. NADtotal(NAD 및 NADH) 또는 NADH는 비색 분석(450 nm)으로 정량화된다.
니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP)는 환원된 형태(NADPH)와 산화된 형태(NADP) 사이를 순환하는 다수의 산화 환원 반응에 관여하는 효소적 보조 인자이다.
Sigma Aldrich NADP/NADPH Quantification Kit MAK038은 샘플로부터 사전 정제 없이 NADP와 NADPH, 및 그들의 비율을 검출한다. 이 분석은 NADP 및 NADPH에 특이적인 것이고, NAD 또는 NADH는 검출하지 않는다. NADPtotal(NADP 및 NADPH) 또는 NADPH는 비색 분석(450 nm)으로 정량화된다.
티오레독신 및 티오레독신 환원 효소는 Simon Simple Western 분석법을 이용하여 측정한다. 샘플을 SDS/DTT로 처리하고 열 변성시킨다. 이어서 샘플을 모세관에 넣고, 크기별로 분리하고, 독자적인 UV 포착 방법을 통해 모세관 벽에 고정화한다. 표적 단백질을 항체(안티 티오레독신 경로/항 글루타레독신)로 면역 주사한 다음, HRP-증폭된 화학발광 검출(토끼 항 염소 HRP 접합체)을 수행한다.
캠페인 2와 비교하여 캠페인 3에서 불순물 수준이 감소한 것은, 저분자량 종 및 고분자량 종을 제거하기 위해 고안된 후속의 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서의 단계 수율을 증가시켰다. 캠페인 3으로부터의 물질의 저장 수명은, 또한 캠페인 2의 물질보다 길었다.
실시예 2: 400 L 생물 반응기 규모의 공정에서의 항체 환원의 방지
본 실시예에서, 400 L 규모의 분자 B의 제조는 단백질 A 포착 크로마토그래피 단계 후에 캠페인 1 뱃치 1에서 현저한 항체 환원을 나타냈다. 후속의 제조 뱃치에서 도 3에 도시된 바와 같이 1차 회수 과정에서 활성탄 여과 단계(Millistak+CR40, Millipore)가 실행되었다. 이들 뱃치에서 항체 환원은 검출되지 않았다.
분자 B는 인간화 단일 클론 IgG4P 항체이다. 이것은 유가식 생물 반응기 공정에서 CHO DG44 세포주에서 발현되고, 3 단계 크로마토그래피 공정으로 정제된다. 완전한 글리코실화된 IgG 분자에 대한 이론적인 온전한 질량은 146,372 Da(가장 가까운 전체 달톤)으로 결정되었다.
정제 공정은 실시예 1의 분자 A의 공정과 매우 유사하였다. 차이점은, 100 mM 아세트산나트륨(pH 3.7)인 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출 버퍼였다. 도 4에 도시된 IgG 분자 B 제조 샘플의 비환원성 생물 분석기는, 모노머가 해프머 및 및 중쇄 형성을 감소시키는 배치 1에 대한 정화 세포 배양액 및 포착 용출액 샘플(단백질 A 크로마토그래피 후)을 보여준다. 뱃치 3에 대한 포착 용출액 샘플이 또한 도시되며, 여기서 활성탄 필터는 1차 회수에서 적용되었고, 단백질 A 포착 단계 후에도 분자는 여전히 모너머이다.
도 7은, 환원제 NAD/NADH, 및 NADP/NADPH에 대해 분석된, 뱃치 1(카본 필터의 도입 전, 대조군) 및 뱃치 2(카본 필터 적용 후)로부터의 분자 B에 대한 정화 세포 배양액(CCCF)을 도시한다. 카본 필터가 도입된 후, 이러한 환원제의 수준이 낮게 검출된다.
실시예 3
샘플은 여과(카본 여과의 존재 또는 부재 하) 후, 분자 B의 제조 캠페인으로부터 취한 다음, 제조 공정의 축소 모델을 이용하여 저산소 조건에서 정제하였다. 이 모델은 적어도 30분 동안 질소 가스로 샘플을 살포하는 단계를 포함하였으며, 이어서 이러한 조건에서 하룻밤 동안 저장하였다.
Sypro로 염색된 비환원성 SDS-PAGE를 사용하여 분석한 이 과정4의 결과를 도 5에서 볼 수 있다. 이 분석 방법은 비환원 조건에서 항체 환원에 의해 생성된 불순물의 존재 및 시료의 순도를 결정하는 데 사용된다. 사용된 겔은 Thermo Fisher의 NuPAGE 4-20% Tris-Glycine 10 × 15 웰 1.5 mm(Cat#EC6028)였다. 마크 12 분자량 표준물이 도시된다(Thermo Fisher, #LC5677). 겔은 125 V의 정전압에서 주행되었다. 염색은 시프로 루비 적색 형관 염색(Bio-Rad, cat#170-3125)을 이용하여 수행 하였다.
이어서, 샘플 사전 포착 단계(레인 3, 4 및 5)를 동결(≤ -60℃)하였으며, 분석 직전에 해동하였다. 레인 6, 7 및 8의 샘플을 질소 가스가 살포된 백에서 단백질 A에 의해 정제한 다음, 용출액 샘플을 동결하고 분석 직전에 해동하였다.
캠페인 1 뱃치 세포 배양액 및 포착 용출액 샘플은 낮은 수준의 모노머, 및낮은 수준의, 항체 환원에 기인하는 불순물을 함유한다. 카본 필터 전에 채취된 캠페인 1 뱃치 2 샘플 및 이 샘플로부터의 포착 용출액은 둘 다, 항체 환원과 관련된, 높은 수준의 불순물을 함유하였다. 카본 필터 후에 채취된 샘플 및 이 샘플로부터의 포획 용출액은 높은 수준의 모노머를 함유하였고, 항체 환원에 기인하는 불순물의 수준이 낮거나 없었다. 따라서 카본 여과는 단백질 A 크로마토그래피 후에 관찰되는, 환원된 항체 생성물의 형성을 억제한다.

Claims (15)

  1. 항체 또는 그의 단편의 제조 방법으로서,
    - 상기 항체 또는 그의 단편을 숙주 세포에서 발현시키는 단계,
    - 항체 또는 그의 단편, 숙주 세포 잔해물 및 불순물을 함유하는 혼합물을 회수하는 단계; 및
    - 상기 혼합물로부터 상기 항체 또는 그의 단편을 정제하는 단계로서, 상기 정제는
    - 활성탄 여과, 및 이에 후속되는
    - 단백질 A 크로마토그래피
    를 포함하는 것인 단계
    를 포함하고, 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 항체 또는 단편이, 활성탄 여과 단계가 없는 동일한 공정으로부터 회수된 항체 또는 단편보다 적은 항체 환원 관련 불순물을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 단편의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 정제가 1 이상의 추가의 크로마토그래피 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 추가의 크로마토그래피 단계가 양이온 교환 크로마토그래피 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 항체 또는 그의 단편이 본래의 이황화 결합을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 항체 또는 그의 단편이 본래의 쇄간 이황화 결합을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 포유류 숙주 세포이고, 항체를 함유하는 혼합물이 세포 배양 상청액인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 정제 단계는, 활성탄 여과 전에 세포 배양 상청액의 심층 여과(depth filtration)를 추가로 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 심층 여과와 활성탄 여과가 일렬로 실행되는 것인 방법.
  9. 숙주 세포에서 발현된 항체 또는 그의 단편의 정제 동안에 이황화 결합 환원을 방지하는 방법으로서,
    - 활성탄 여과 단계, 및 이에 후속되는
    - 단백질 A 크로마토그래피
    를 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 항체 또는 단편이, 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만의 항체 환원 관련 불순물을 포함하는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 항체 또는 단편이, 활성탄 여과 단계가 없는 동일한 공정으로부터 회수된 항체 또는 단편보다 적은 항체 환원 관련 불순물을 포함하는 것인 방법.
  12. 삭제
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  14. 삭제
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