CN105339388B - 确定利用活性炭从包含靶蛋白的样品去除病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供确定活性炭是否可以用于从包含靶蛋白的样品去除病毒或某种病毒的方法。

Description

确定利用活性炭从包含靶蛋白的样品去除病毒的方法
技术领域
本发明涉及确定活性炭是否可以用于从包含靶蛋白的样品去除病毒的方法。
背景技术
用于纯化靶蛋白如单克隆抗体的最常用的方法通常采用工程化的能够表达靶蛋白的细胞系(例如，哺乳动物或非哺乳动物细胞系)。这样的靶蛋白可以分泌入细胞培养基，或者其可以在细胞内表达并在裂解表达该蛋白的细胞之后回收。
靶蛋白通常需要进行一系列纯化步骤以分离靶蛋白与各种杂质，例如细胞、细胞碎片、DNA、宿主细胞蛋白等。
典型的纯化方法通常需要使细胞培养进料或培养基(在分泌性靶蛋白的情况下)或细胞裂解物(在细胞内靶蛋白的情况下)进行各种步骤，包括一个或多个色谱步骤，以便分离或纯化靶蛋白。例如，在诸如单克隆抗体的分泌性靶蛋白的情况下，通常使细胞培养基进行澄清步骤然后捕获步骤然后一个或多个阳离子交换结合/洗脱色谱步骤和阴离子交换色谱步骤。
CHO细胞常用于单克隆抗体的制备。典型的CHO细胞培养进料包含103-109病毒或病毒样颗粒，并且在纯化过程中去除这类病毒或病毒样颗粒特别重要，因为许多靶蛋白是直接给药于患者的治疗性蛋白。一般来说，基于整个纯化过程达到的总病毒去除的量评价病毒去除，期望其等于或超过18个对数(log)，特别是在需要监管机构批准的情况下。
一般来说，据显示典型纯化过程的每个步骤去除一定量的病毒；但是，所述量通常少于18个对数；因此，过程中必须包括额外的纯化步骤用于足够的病毒去除。建立特定纯化步骤是否可以去除一定量的病毒非常重要，以便确保通过纯化过程中的各种纯化步骤达到足够的病毒去除。
样品如生物技术产物的病毒安全评价的指导可以在International Conferenceon Harmonization of Technical Requirements for Registration ofPharmaceuticals for Human Use(ICH)主持下编写的“Harmonized TripartateGuideline:Q5A Viral Safety of Biotechnology Products Derived From Cell Linesof Human or Animal Origin.Fed.Reg.63(185)24 September 1998”中找到。
活性炭以前已用于水纯化应用以去除病毒以及并入过滤单元用于从生物流体如血液非特异性地去除物质，所述物质可以包括病毒(例如，参见，美国专利第8,123,940号)。
此外，整体援引加入本文的2012年8月2日提交的美国专利申请系列号13/565,463描述了活性炭联合其他介质在从包含所关注的生物分子(例如，抗体)的样品去除蛋白杂质(例如，宿主细胞蛋白)和DNA中的用途。
最后，援引加入本文的2013年2月26日提交的美国临时专利申请系列号61/769,269描述了活性炭在通过改变溶液条件来从蛋白混合物选择性地去除蛋白中的用途。
发明内容
本发明至少部分是基于令人惊讶和出乎意料的发现，在包含靶蛋白如单克隆抗体的某些样品的情况下，活性炭可以用于减少病毒的量。虽然，以前已描述活性炭在水纯化中去除一些病毒，但是用活性炭处理的样品一般具有低浓度的蛋白或无蛋白。本发明至少部分是基于出乎意料和令人惊讶的发现，在包括高蛋白浓度的某些样品(例如，包含待分离的靶蛋白的细胞培养进料或细胞裂解物)中，活性炭特异性地结合病毒，包括细小病毒、逆转录病毒和逆转录病毒样颗粒。因此，在某些纯化方法中包括活性炭可以导致可能消除蛋白纯化中通常使用的一个或多个昂贵的色谱步骤(例如，阳离子交换结合/洗脱色谱步骤)。
在各种实施方案中，提供一种确定活性炭是否可以用于从包含靶蛋白的样品去除病毒的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)提供包含靶蛋白的一部分样品；(b)以104-109PFU/mL的量将病毒添加至所述一部分样品中；(b)使所述一部分样品流过装有活性炭的柱；(c)从所述柱收集包含所述靶蛋白的一个或多个部分；以及(d)测量所述一个或多个部分中的病毒量，其中一个或多个部分中的病毒量减少至少3.0LRV表明活性炭能够用于从所述样品去除病毒。
在一些实施方案中，所述样品包含等于或大于0.2g/L的蛋白浓度。在一些实施方案中，所述样品包含3.0-10.0范围中的pH和/或少于0.5M的盐浓度。
在一些实施方案中，所述样品包含细胞培养进料。在一具体实施方案中，所述细胞培养进料为CHO细胞培养进料。
在一些实施方案中，所述样品包含已进行澄清的细胞培养进料。澄清方法包括但不限于离心、沉降、深层过滤、筛过滤、絮凝、使用刺激响应性聚合物和pH改变。
在一些实施方案中，所述样品包含洗脱液，所述洗脱液回收自靶蛋白的纯化中使用的A蛋白色谱步骤。
在一些实施方案，所述样品包含细胞裂解物，所述细胞裂解物获得自细胞内表达靶蛋白的细胞。
在一些实施方案中，所述靶蛋白为重组蛋白。示例性靶蛋白包括但不限于免疫球蛋白如单克隆抗体、包含Fc的蛋白以及非免疫球蛋白。
在一具体实施方案中，所述靶蛋白为治疗性蛋白。
附图说明
图1为示出实验结果的图，如对4种不同类型的单克隆抗体样品观察的，以便确定通过使溶液流过活性炭柱是否可以从单克隆抗体溶液去除小鼠细小病毒(MVM)代表的细小病毒。对于两种不同的单克隆抗体溶液MABI和MABIV，在1.0kg/L和2.0kg/L的柱装载，以大于5.0LRV的量去除MVM。但是，对于另外两种单克隆抗体溶液MABII和MABIII，在0.5kg/L、1.0kg/L和2.0kg/L的柱装载，未以1.0LRV以上的量去除MVM。X-轴示出在采集部分的点装载至每升(L)活性炭柱上的单克隆抗体的量(以kg计)，而Y-轴示出部分中MVM病毒的对数减少值。向上箭头表示样品中病毒的浓度低于部分的检测限。
图2为示出实验结果的图，如对4种不同类型的单克隆抗体样品观察的，以便确定通过流过活性炭柱是否可以从单克隆抗体溶液去除异嗜性小鼠白血病病毒(XMuLV)代表的逆转录病毒或逆转录病毒颗粒。对于MABI抗体溶液，在0.5kg/L、1.0kg/L和1.5kg/L的柱装载，以大于3.0LRV的量去除XMuLV。在抗体溶液MABII、MABIII和MABIV的情况下，在0.2kg/L、0.5kg/L和1.0kg/L的柱装载，以大于5.0LRV的量去除XMuLV。X-轴示出在采集部分的点装载至每升(L)活性炭柱上的单克隆抗体的量(以kg计)，而Y-轴示出部分中XMuLV病毒的对数减少值。向上箭头表示样品中病毒的浓度低于部分的检测限。
具体实施方式
如上文讨论的，本发明至少部分是基于新的和出乎意料的发现，活性炭可以用于从包含待纯化的靶蛋白的某些高蛋白浓度样品如某些细胞培养进料或细胞裂解物去除病毒。
在包含治疗性蛋白的生物反应器进料中病毒的典型浓度一般非常低。但是，这些低水平对于用纯化的治疗性蛋白治疗的患者仍然可能非常危险。为了确保在蛋白纯化中充分去除蛋白，确定某个纯化步骤是否从包含待纯化的蛋白的样品去除样品还有确定这个纯化步骤去除的病毒的量非常重要。
为了这样做，以已知浓度将代表性病毒掺入包含治疗性蛋白的溶液，然后使掺入病毒的治疗性蛋白溶液进行某个纯化步骤。纯化步骤之后，确定溶液中代表性病毒的量。在纯化步骤之后的溶液中病毒的水平低于该病毒的检测限或者不可检测表示通过纯化步骤充分去除病毒。细小病毒和逆转录病毒是一般在纯化CHO细胞中表达的治疗性蛋白期间测量的两种类型的病毒。
通常，用来确定纯化步骤中从包含蛋白的样品去除的病毒量的方法采用一部分样品代替整个样品体积。一旦确定特定纯化步骤能够从一部分包含靶蛋白的样品去除病毒，则可以认为所述纯化步骤会从所述样品去除病毒，只要采用的纯化介质和靶蛋白的比例保持相同。
本发明提供确定活性炭是否可以用于从某些样品去除某些病毒的方法。如本文实施例中证实的，利用本文所述的方法，可以确定活性炭是否能够从包含靶蛋白的特定样品去除病毒。因此，对于其中活性炭能够去除病毒的包含靶蛋白的那些样品，随后可以将活性炭并入该样品的纯化方法。
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。额外的定义在整个详细说明书中示出。
I.定义
在本文中可交换使用的术语“活性炭(active carbon)”或“活性炭(activatedcarbon)”指已进行增加其孔结构的处理的含碳物质。活性炭有时还称作活性木炭。活性炭是具有非常高表面积的多孔固体。它们可以源自各种来源，包括煤炭、木材、椰壳、果壳和泥炭。可以利用在受控气氛下物理活化(包括加热)或者利用强酸、碱或氧化剂化学活化来从这些材料制备活性炭。活化过程产生具有高表面积的多孔结构，这赋予活性炭高的杂质去除能力。可以修改活化过程以控制表面的酸性。
典型的活化过程包括使碳源如树脂废物、煤炭、煤焦、石油焦、褐煤、聚合材料、以及包括纸浆和纸的木质纤维素材料、来自纸浆生产的残余物、木材(如木屑、锯末和木粉)、坚果壳(如杏仁壳和椰子壳)、果仁以及果核(如橄榄核和樱桃核)进行热过程(例如，用氧化性气体)或化学过程(例如，用磷酸或金属盐，如氯化锌)。包括用磷酸(H3PO4)化学活化基于木材的碳的示例性过程公开于美国专利第Re.31,093号，其导致碳的脱色和气体吸附能力的提高。而且，美国专利第5,162,286号教导了基于木材的材料的磷酸活化，所述基于木材的材料特别致密且包含相对高(30％)的木质素含量，如坚果壳、果核和果仁。木质纤维素材料的磷酸活化还在美国专利第5,204,310号中讨论，作为制备高活性和高密度的碳的一个步骤。这段中列出的每个专利的教导整体援引加入本文。
与大多数其他吸附材料相反，据信活性炭利用相对弱的范德华力或伦敦分散力与分子相互作用。如通过基于氮吸附的Brunauer-Emmett-Teller(“BET”)方法(本领域公知的方法)测量的，典型的商业活性炭产品表现出至少300m2/g的表面积。
虽然，活性炭(active carbon或activated carbon)以前已用于纯化液体和气体以及通过结合杂质来从其他杂质纯化重组表达的抗体的方法，但是其以前尚未用于从高蛋白浓度样品(即>0.2g/L蛋白浓度)去除病毒，特别是细小病毒和逆转录病毒。因此，在某些情况下，对于在纯化治疗性蛋白如单克隆抗体的过程中去除病毒，活性炭提供成本上有效的方案。
本发明提供确定活性炭是否可以用于从包含靶蛋白的样品去除病毒的方法。基于本文提供的方法，因为活性炭并不在所有样品的情况下导致有效去除病毒，所以可以容易地确定在哪些样品的情况下，活性炭可以用于去除病毒或特定类型的病毒。
在本文中可交换使用的术语“所关注的蛋白”和“靶蛋白”指蛋白或多肽，其纯化自包含病毒的组合物。在一些实施方案中，靶蛋白是向患者给药的治疗性蛋白。
一般来说，作为病毒去除的结果，靶蛋白的总纯度增加。靶蛋白可以是免疫球蛋白或非免疫球蛋白，并且可以是分泌性蛋白或细胞内蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白为免疫球蛋白，例如单克隆抗体。
靶蛋白的其他实例包括重组蛋白，其包括但不限于重组人生长激素、重组人胰岛素、重组促卵泡激素、重组因子VII(抗血友病因子)、重组人促红细胞生成素、重组粒细胞集落刺激因子、重组α-半乳糖苷酶a、重组艾杜糖苷酸酶、重组加硫酶(galsulfase)、重组链道酶α、重组组织纤溶酶原激活物、重组人干扰素、重组胰岛素样生长因子1以及重组天冬酰胺酶。
在本发明的其他实施方案中，靶蛋白是源自人血液或其他生理流体的蛋白。这类蛋白的实例包括但不限于免疫球蛋白G和M、VIII因子、IX因子、抗凝血酶III以及α-I-抗胰蛋白酶。
术语“免疫球蛋白”、“Ig”或“IgG”或“抗体”(在本文中可交换使用)指具有由两条重链和两条轻链组成的基本4多肽链结构的蛋白，例如通过链间二硫键稳定所述链，其具有特异性结合抗原的能力。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(在本文中可交换使用)指具有由一条重链和一条轻链组成的2-多肽链结构的蛋白，例如通过链间肽接头稳定所述链，其具有特异性结合抗原的能力。术语“结构域”指包含例如通过β-折叠和/或链内二硫键稳定的肽环(例如，包含3-4个肽环)的重链或轻链多肽的球状区域。基于在“恒定”结构域的情况下在各种类别成员的结构域内相对缺少序列变化，或者在“可变”结构域的情况下在各种类别成员的结构域内的显著变化，结构域在本文中进一步称为“恒定”或“可变”的。抗体或多肽“结构域”在本领域中常可交换地称作抗体或多肽“区”。抗体轻链的“恒定”结构域可交换地称为“轻链恒定区”、“轻链恒定结构域”、“CL”区或“CL结构域”。抗体重链的“恒定”结构域可交换地称为“重链恒定区”、“重链恒定结构域”、“CH”区或“CH结构域”。抗体轻链的“可变”结构域可交换地称为“轻链可变区”、“轻链可变结构域”、“VL”区或“VL结构域”。抗体重链的“可变”结构域可交换地称为“重链可变区”、“重链可变结构域”、“VH”区或“VH结构域”。
免疫球蛋白或抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以以单体或聚合物形式存在，例如以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗体。免疫球蛋白或抗体还可以包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
术语“Fc区”和“包含Fc区的蛋白”表示所述蛋白包含免疫球蛋白的重链和/或轻链恒定区或结构域(如先前定义的CH和CL区)。包含“Fc区”的蛋白可以具有免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能。“Fc区”如CH2/CH3区可以选择性地结合至亲和配体如A蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，包含Fc区的蛋白特异性地结合A蛋白或者其功能衍生物、变体或片段。在其他实施方案中，包含Fc区的蛋白特异性地结合G蛋白或L蛋白，或者它们的功能衍生物、变体或片段。
如上文讨论的，在一些实施方案中，靶蛋白为包含Fc区的蛋白，例如，免疫球蛋白。在一些实施方案中，包含Fc区的蛋白为重组蛋白，其包括融合至另一多肽或其片段的免疫球蛋白的Fc区。
一般来说，免疫球蛋白或抗体针对所关注的“抗原”。优选地，抗原是生物学上重要的多肽，并且向患有疾病或病症的哺乳动物给药抗体可以在该哺乳动物中导致治疗益处。
在本文中可交换使用的术语“单克隆抗体”或“MAb”指获得自一群基本上均质的抗体的抗体，即该群中的各个抗体除了少量可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的特征为获得自基本上同质的抗体群体，并且不应当理解为要求通过任何特定方法制备抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler et al.,Nature256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如，美国专利第4,816,567号)。“单克隆抗体”还可以利用Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术分离自噬菌体抗体文库。单克隆抗体还可以称作“MAb”或“mab”或“mAb”或“MAB”。
单克隆抗体还可以包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中部分重链和/或轻链与源自特定物种的抗体或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源，而链的剩余部分与源自另一物种的抗体或者属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源；以及这类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性(美国专利第4,816,567号；和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
非人(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式为嵌合抗体，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基被具有期望的特异性、亲和性和能力(capacity)的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基代替。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步精制抗体的性能。一般来说，人源化抗体包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体可以包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节参见Jones etal.,Nature321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
如本文所用，术语“溶液”或“样品”指包含靶蛋白的组合物，一旦利用本文所述的方法证实活性炭可以用于从所述组合物去除病毒，则利用活性炭进行病毒去除。在一些实施方案中，样品包含细胞培养进料，例如来自表达分泌性靶蛋白如单克隆抗体的哺乳动物细胞培养物(例如，CHO细胞)的进料。在一些实施方案，所述样品包含获得自细胞内表达靶蛋白的哺乳动物或非哺乳动物细胞的细胞裂解物。在一些实施方案中，所述样品包含已进行澄清的细胞培养进料。在一些实施方案中，所述样品包含来自A蛋白亲和色谱柱的洗脱液。样品还涵盖用于产生所关注的蛋白或靶蛋白的非哺乳动物表达系统。
如本文所用，术语“非哺乳动物表达系统”指用来产生治疗性蛋白的所有宿主细胞或生物体，其中所述宿主细胞或生物体是非哺乳动物来源的。用于产生所关注的蛋白或靶蛋白的非哺乳动物表达系统的实例包括酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)，细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)，昆虫细胞如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞、杆状病毒感染的昆虫细胞，以及藻类细胞。
如本文所述，术语“一部分样品”指一部分包含靶蛋白的样品，其用来确定活性炭是否可以用来从样品去除病毒。一般来说，一旦证实活性炭能够从一部分包含靶蛋白的样品去除病毒或某种类型的病毒，则可以将活性炭加入靶蛋白的纯化过程，以便从样品去除病毒或某种类型的病毒。
如本文所用，术语“澄清(clarify)”、“澄清(clarification)”和“澄清步骤”指用于去除悬浮的颗粒和或胶体的加工步骤，从而减少包含靶蛋白的溶液的浊度，如测量的以NTU(比浊法浊度单位)计的。澄清可以通过各种方式实现，包括离心或过滤。离心可以以分批或连续模式进行，而过滤可以以正常流动(例如深层过滤)或切向流模式进行。在现在工业中使用的方法中，离心之后通常是深层过滤，深层过滤意图去除离心尚未去除的不溶性杂质。此外，可以使用增加澄清效率的方法，例如沉淀。杂质的沉淀可以通过各种方式进行，例如通过絮凝、pH调节(酸沉淀)、温度变化、由于刺激响应性聚合物或小分子的相改变或者这些方法的任何组合。在本文所述的一些实施方案中，澄清包括离心、过滤、深层过滤和沉淀中的两种或更多种的任何组合。
在本文中可交换使用的术语“纯化”、“增加纯度”、“分离(separating)”或“分离(isolating)”指通过从样品去除一种或多种病毒来增加样品中靶蛋白比一种或多种病毒的比例。通常，如本文所述，一旦确定活性炭可以用于从包含靶蛋白的样品去除病毒，则在纯化该靶蛋白的过程中包括活性炭，从而增加靶蛋白的纯度。
术语“病毒”或“多种病毒”指仅可以在活细胞内复制的小的感染性物质或颗粒。它们一般包括封闭在蛋白衣壳和任选存在的脂质包膜内的核酸(RNA或DNA)。
术语“细小病毒”指线性的、非分段的单链DNA无包膜病毒，具有5000个核苷酸的平均基因组大小和18-26nm的直径。本文所述方法中使用的示例性细小病毒为小鼠细小病毒。
术语“逆转录病毒”指能够通过逆转录的DNA中间体将其遗传信息整合入感染细胞的基因组DNA的RNA病毒。术语“逆转录病毒样颗粒”指在它们的基因组中具有逆转录病毒衍生的DNA部分的细胞产生的颗粒。这些颗粒与逆转录病毒类似，但是常常是非感染性的。本文实施例中使用的异嗜性小鼠白血病病毒代表模型逆转录病毒或逆转录病毒样颗粒。
如本文所用，在本文中可交换使用的术语“去除(remove)”、“去除(removing)”、“去除(removal)”、“减少(reduce)”、“减少(reducing)”或“减少(reduction)”指降低包含待纯化的靶蛋白的样品中一种或多种病毒的量。如本文中证实的，活性炭可以用来从包含待纯化的靶蛋白的某些样品去除一种或多种病毒。
在本文中可交换使用的术语“流过方法”、“流过模式”和“流过色谱”指一种产物分离技术，其中样品中的至少一种产物意图流过活性炭(例如，靶蛋白)，而至少一种潜在组分结合至活性炭(例如，病毒)。
意图流过的样品一般称作“流动相”。“流过模式”一般为等度运行(即，期间流动相的组成未改变的过程)。用于流过的介质通常用包含靶蛋白分子的相同缓冲液溶液预平衡。纯化之后，可以用额外量的相同缓冲液冲洗介质以增加产物回收率。
术语“缓冲液”指通过其酸-碱缀合组分的作用抗pH变化的溶液。可以用于本文所述方法的各种缓冲液描述于Buffers.A Guide for the Preparation and Use ofBuffers in Biological Systems,Gueffroy,D.,ed.Calbiochem Corporation(1975)。不同缓冲液维持不同范围的pH，例如磷酸盐缓冲液通常用于6.0-8.0的pH，而对于更高的pH，可以所用硼酸盐缓冲液，对于更低的pH，可以使用碳酸盐缓冲液。本领域技术人员能够根据待维持的pH容易地确定使用的合适缓冲液。可以用于本发明的方法的缓冲液的非限制性实例包括MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、碳酸盐、硼酸盐和铵缓冲液，以及这些的组合。
术语“洗涤缓冲液”或“平衡缓冲液”在本文中可交换使用，指在使样品与活性炭接触之前用来洗涤或重新平衡活性炭材料的缓冲液。
术语“电导率”指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子转运流动。因此，随着水溶液中存在的离子量的增加，溶液会具有较高的电导率。测量电导率的单位为毫西门子(milliSiemens)每厘米(mS/cm或mS)，并且可以利用可商购的电导率计(例如，由Orion销售)进行测量。溶液的电导率可以通过改变其中离子的浓度来改变。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如NaCl或KCl)的浓度以获得期望的电导率。优选地，如下文实施例中，修改各种缓冲液的盐浓度以获得期望的电导率。
术语“部分(fraction)”或“多个部分(fractions)”指使包含靶蛋白的样品进行纯化步骤之后，例如使样品流过活性炭柱之后收集的小体积液体。在本文所述的方法中，用一部分包含靶蛋白的样品装载柱之后从活性炭柱收集部分。部分用来监测在特定点通过柱的杂质如病毒的量。通常期望在通过柱的蛋白的量增加时，通过柱的杂质的量会增加。可以通过纯化步骤中使用的已知量的材料如活性炭加工的样品中的蛋白量可以这样确定，收集一个或多个部分并确定通过该已知量的材料去除的杂质如病毒的水平。
如本文所用，术语“柱装载”或“装载”是对应于已通过柱的溶液中靶蛋白的质量除以柱体积的值。已通过柱的靶蛋白的质量通过样品中靶蛋白的浓度乘以收集自柱的样品体积来计算。
术语“对数去除值”或“LRV”是表示在已知量的杂质通过时柱去除的杂质水平的值。LRV＝log(Cf)-log(Cp)，其中Cf是进料溶液中杂质的浓度，而Cp是已通过柱之后进料溶液中杂质的浓度。
II.用于本文所述方法的示例性活性炭
基于本文所述的采用活性炭的方法，可以确定活性炭是否可以用于从包含靶蛋白的样品去除病毒，包括细小病毒和逆转录病毒。在一些实施方案中，活性炭包含活性木炭。活性炭可以源自各种来源，包括但不限于煤炭、木材、椰壳、果壳和泥炭。可以通过在受控气氛下物理活化(包括加热)或者通过利用强酸、碱或氧化剂化学活化来从这些材料制备活性炭。活化过程产生具有高表面积的多孔结构，这赋予活性炭更大的杂质去除能力。可以修改活化过程以控制表面的酸性。
活性炭可获得自各种商业来源，并且有许多等级和形式。活性炭的一些商业供应商包括公司如MeadWestVaco Corp.,Richmond,VA,USA；Norit Americas Inc.,Marshall,TX,USA；Calgon Carbon Corp.,Pittsburgh,PA,USA。
在本文所述的一些实施方案中，将活性炭掺入包含纤维素的纤维介质。
可以用于本发明的方法的可商购的活性炭材料包括但不限于Nuchar HD活性炭(MeadWestVaco Corporation,Richmond,VA,USA)；Nuchar SA 20(MeadWestVacoCorporation,Richmond,VA,USA)；Nuchar SN(MeadWestVaco Corporation,Richmond,VA,USA)；Nuchar WV-B 30(MeadWestVaco Corporation,Richmond,VA,USA)；RGC Powder活性炭(MeadWestVaco Corporation,Richmond,VA,USA)；Norit Darco KB-G活性炭(NoritAmericas Inc.,Marshall,Texas,USA)；Norit CGP Super活性炭(Norit Americas Inc.,Marshall,Texas,USA)；Norit A Supra USP(Norit Americas Inc.,Marshall,Texas,USA)；Norit E Supra USP(Norit Americas Inc.,Marshall,Texas,USA)；Norit C GRAN(Norit Americas Inc.,Marshall,Texas,USA)；Norit SX Ultra(Norit Americas Inc.,Marshall,Texas,USA)；以及Chemviron Pulsorb PGC活性炭(Chemviron Carbon,Feluy,Belgium)。
活性炭的两种主要形式为粉状和颗粒状。粉状活性炭包含小且通常小于1mm直径的颗粒，并且最常用于液体的纯化。颗粒状活性炭具有较大的颗粒和因此较小的表面积，因此其优选用于其中扩散速度较快的气体纯化。
活性炭在消费者应用(如水、食品、饮料和药物纯化)中使用的对安全的重要考虑是减少并控制可提取的化合物。意图用于饮用水和食品接触应用的活性炭通常按照覆盖水的所有间接添加剂的安全标准ANSI/NSF Standard 61进行制备。而且，ASTM标准测试方法D6385描述了通过灰化确定活性炭中酸可提取含量，并且可以用来研究和最小化来自活性炭的可提取物水平。
一系列活性炭类型可用于各种应用。例如，MeadWestVaco Corp.提供随它们的容量、表面酸性、对靶分子的孔可接近性和预期应用变化的12种类型的粉状活性炭。一般期望最大化活性炭的杂质去除能力。
III.用于本文所述方法的示例性病毒
可以用于本文所述方法的示例性病毒包括但不限于腺病毒、杯状病毒、传染性胃肠炎病毒、牛腹泻病毒、西尼罗病毒、鸭乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、伪狂犬病病毒、流感病毒、猿猴病毒40型、副流感病毒、人细小病毒、小鼠细小病毒、猪细小病毒、犬细小病毒、脑心肌炎病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、牛肠道病毒、猪肠道病毒、痘苗病毒、呼肠病毒、小鼠白血病病毒(异嗜性、双嗜性、单嗜性)。人免疫缺陷病毒、水泡性口炎病毒、辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒。
如本文所述，在使一部分包含靶蛋白的样品与活性炭接触之前，以104-108PFU/mL或TCID50/mL的量将病毒添加至所述一部分样品中。
在一些实施方案中，将代表细小病毒的小鼠细小病毒添加至一部分包含靶蛋白的样品中。在其他实施方案中，将代表逆转录病毒或逆转录病毒样颗粒的异嗜性小鼠白血病病毒添加至一部分包含靶蛋白的样品中。
IV.利用活性炭的流过方法
下文描述一种可以用于确定利用活性炭去除病毒的一般流过方法。
在一些实施方案中，用活性炭的含水浆装载色谱装置，例如柱。还可以将活性炭作为干粉装入装置，例如柱，然后用水溶液湿润。但是，有时，当将柱干包装时，从活性炭之间去除小气泡可能具有挑战性。然后用具有与包含靶蛋白的样品相同pH的缓冲液平衡柱。随后使样品以一定流速通过活性炭柱，所述流速导致15sec-10.0min的柱停留时间。随后收集包含靶蛋白的洗脱液。
V.测量样品中的病毒量的方法
如本文所述，一旦用活性炭处理一部分样品，利用本文所述的一种或多种方法或者本领域已知的那些方法测量样品中剩余的病毒量。这些方法包括但不限于50％组织培养感染剂量(TCID50)测定、空斑形成单位测定、病灶形成单位测定、50％致死剂量测定、血细胞凝集测定、荧光灶测定(FFA)、二喹啉甲酸测定(BCA)、单向免疫扩散测定(SRID)、定量聚合酶链反应(qPCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、透射电镜术。一般来说，使用的方法会取决于测量或检测的病毒。下文描述可以并入本文所述方法的一些测定。
50％组织培养感染剂量(TCID50)为终点稀释测定，其定量杀死50％感染的宿主细胞或者在50％接种的组织培养细胞中产生细胞病变效应所需要的病毒量。培养之后，对每个细胞稀释手动观察并记录细胞死亡(即感染细胞)的百分比，并且结果用来数学计算TCID50。
病毒空斑形成单位测定通过将样品的各种稀释液涂布在汇合的宿主细胞单层上，然后在合适的培养时间(一般3-14天)之后计数单层中的空斑数量，从而确定样品中空斑形成单位(PFU)的数量。
50％致死剂量(LD50)测定是这样进行的，将样品的稀释液给药入合适的宿主动物以确定足以杀死50％动物的剂量。
血细胞凝集测定可以用来定量某些病毒(例如流感)，其通过培养样品的系列稀释液与1％红细胞溶液一小时，然后目视确定凝集首先出现的病毒稀释液。
荧光灶测定与空斑形成单位测定相似地进行，除了通过用特异性地结合病毒组分的荧光抗体染色细胞单层来确定感染单位的数量。荧光显微术用来计数和定量感染了多少细胞。
二喹啉甲酸测定(BCA)通过测量样品中蛋白的总量来定量病毒。将BCA试剂添加至样品中，并且蛋白的肽键定量地将Cu2+还原为Cu1+，这产生浅蓝色。BCA以2:1比例螯合Cu1+，导致在562nm处吸收更强的有色物质。样品在562nm处的吸光度用来确定样品中的整体蛋白浓度。用分光光度计或酶标仪分析之后将测定结果与已知的标准曲线进行比较。
也称为Mancini方法的单向免疫扩散测定(SRID)是通过在半固体介质(例如琼脂)中免疫扩散来检测特异性病毒抗原量的蛋白测定。所述介质包含所关注的抗原特异性的抗血清，并且将抗原置于圆盘的中心。随着抗原扩散入介质，其产生沉淀环，所述沉淀环生长直至达到平衡。测定时间可以为10小时至几天，这取决于抗原和抗体的平衡时间。环的区域直径与蛋白浓度的对数线性相关，并且将其与已知蛋白标准品的区域直径进行比较以定量。
定量聚合酶链反应(qPCR)是测量样品中的特异性核酸序列量的技术。通过利用病毒遗传序列特异性的探针，可以计数样品中病毒基因组的数量。
透射电镜术(TEM)也可以用于通过产生样品的高分辨率放大图像来定量病毒。TEM图像可以显示单个病毒颗粒，并且定量图像分析可以用来确定病毒浓度。
通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应当理解为限制性的。本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及图均援引加入本文。
实施例
实施例1.小鼠细小病毒的制备
这个实施例描述了制备代表细小病毒的小鼠细小病毒(MVM)的方法。随后将MVM掺入MAB溶液，并且检测其通过活性炭选择性去除。
通过感染包含1％(v/v)胎牛血清(FBS)与青霉素(0.2单位/mL)、链霉素(0.2μg/mL)和2.0mM L-谷氨酰胺的Advanced/F12达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)Invitrogen(目录编号12634-028)中汇合的A9细胞(ATCC CCL-1.4)产生高滴度MVM。在37℃和5％二氧化碳下培养3天之后，用不含血清的相同培养基更换培养基，并且感染再继续7天。
收获细胞裂解物并通过离心(300g持续20分钟)澄清，随后通过超滤(EMDMillipore Corporation，目录编号UFC710008)浓缩。通过在Beckman Centrifuge中利用SW28转子以112,000g超速离心来获得终浓度。在利用流过阳离子交换色谱的最终纯化步骤之前，将病毒沉淀重悬于TNE缓冲液(10mM Tris,100mM NaCl,1mM EDTA在pH 7.5)中。将纯化的病毒在-80℃下储存于缓冲液中用于掺入研究。
实施例2.小鼠细小病毒浓度的确定
这个实施例描述了确定溶液中的小鼠细小病毒(MVM)量的方法。这个方法可以用来确定通过活性炭处理之后剩余多少掺入MAB溶液的MVM。
如Bolton et al.,Biotechnol.Appl.Biochem.Vol.42,2005,133-142所述，利用组织培养感染剂量50％(TCID50)测定确定MVM滴度。将受试样品稀释以减轻细胞毒性和病毒干扰，然后用细胞培养基制备10-倍系列稀释液，并且将100μl等分试样的每种稀释液添加至96-孔微量滴定板的16个孔的每个中，所述孔包含近汇合的324K.PT细胞(获得自Professor P.Tattersall,Department of Laboratory Medicine and Genetics,YaleUniversity School of Medicine,New Haven,CT,USA)。在37℃下于5％CO2中培养10-12天之后，目视评价感染细胞的细胞病变效应(CPE)，并且利用Spearman-
Figure BDA0000888653210000161
方法(Spearman,C.,British Journal of Psychology,Vol 2,1908,227-242；
Figure BDA0000888653210000162
G.,Arch.Exp.Pathol.Pharmak.Vol 162,1931,480-483)确定滴度。当预期低计数时(滤液样品)，还使用大体积平板接种技术。根据观察的CPE的频率，利用几种不同的公认的统计方法之一估计这些样品的滴度。通过确定病毒装载上游的log 10并减去滤液中总病毒的log 10来计算对数减少值(LRV)。
实施例3.异嗜性小鼠白血病病毒的制备
这个实施例描述了制备代表逆转录病毒或逆转录病毒样颗粒的异嗜性小鼠白血病病毒(XMuLV)的方法。随后将XMuLV掺入MAB溶液，并且检测其通过活性炭选择性去除。
通过在补充了10％(v/v)胎牛血清(FBS)与青霉素(0.2单位/mL)、链霉素(0.2μg/mL)和2mM L-谷氨酰胺的DMEM的存在下感染单瓶MV1Lu细胞(水貂肺细胞ATCC CCL-64)来制备高度纯化的XMuLV。使这瓶感染的细胞进行重复传代并在补充了2.5％(v/v)胎牛血清(FBS)与青霉素(0.2单位/mL)、链霉素(0.2μg/mL)和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中扩增。收获感染单层的细胞培养流体，并且为瓶提供包含青霉素(0.2单位/mL)、链霉素(0.2μg/mL)和2mML-谷氨酰胺的Advanced/F12达尔伯克改良伊格尔培养基(Adv DMEM)Invitrogen(目录编号12634-028)。在37℃ 5％CO2下培养2天之后，收获感染单层的细胞培养流体，并且再次向单层提供具有青霉素(0.2单位/mL)、链霉素(0.2μg/mL)和2mM L-谷氨酰胺的Adv DMEM。
在37℃和5％二氧化碳下培养2天之后，收获细胞培养流体。将所有细胞培养流体通过低速离心(300g持续20分钟)澄清，通过0.45μm Durapore滤器过滤，并且通过在Sorvall离心机中利用GSA转子以9500×g离心2小时来进行纯化。将沉淀的病毒重悬于不含蛋白的储存缓冲液中，并且在-80℃下储存直至准备好用于掺入研究。
实施例4.异嗜性小鼠白血病病毒浓度的确定
这个实施例描述了确定溶液中的异嗜性小鼠白血病病毒(XMuLV)量的方法。这个方法用来确定用活性炭处理之后剩余多少掺入MAB溶液的XMuLV。
如Bolton et al.,Biotechnol.Appl.Biochem.Vol.42,2005,133-142所述，利用组织培养感染剂量50％(TCID50)测定确定XMuLV滴度。将受试样品稀释以减轻细胞毒性和病毒干扰，然后用细胞培养基制备10-倍系列稀释液，并且将100μl等分试样的每种稀释液添加至96-孔微量滴定板的16个孔的每个中，所述孔包含近汇合的PG4细胞(ATCC CRL-2032)。然后将板在离心机中离心(1800rpm持续60min)。在37℃下于5％CO2中培养7天之后，目视评价感染细胞的细胞病变效应(CPE)，并且利用Spearman-
Figure BDA0000888653210000171
方法(Spearman,C.,British Journal of Psychology,Vol 2,1908,227-242；
Figure BDA0000888653210000172
G.,Arch.Exp.Pathol.Pharmak.Vol 162,1931,480-483)确定滴度。当预期低计数时(滤液样品)，还使用大体积平板接种技术。根据观察的CPE的频率，利用几种不同的公认的统计方法之一估计这些样品的滴度。通过确定病毒装载上游的log 10并减去滤液中总病毒的log 10来计算对数减少值(LRV)。
实施例5.确定活性炭是否可以用来从MABI单克隆抗体溶液选择性地去除细小病毒的方法
这是证实一种方法的代表性实施例，所述方法确定通过流过活性炭柱是否从包含单克隆抗体(即，MABI)的溶液去除小鼠细小病毒(MVM)代表的细小病毒。结果显示活性炭可以用来从MABI单克隆抗体溶液选择性地去除细小病毒。
如下文所述，向MABI溶液掺入MVM，然后流过活性炭柱。
将制备自CHO细胞的MABI澄清，随后进行A蛋白亲和色谱(用25mM乙酸、25mM甘氨酸HCl洗脱)。用1M Tris碱将A蛋白洗脱液的pH调整至pH 7.0，并且通过Stericup-GP 0.22μmMillipore Express PLUS膜(1L,目录编号：SCGPU02RE,EMD Millipore Corporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤洗脱液。向pH 7.0的MABI进料掺入根据实施例1所述方法制备的超纯级MVM至2.0E+06TCID50/mL的目标量。在与活性炭接触之前通过0.22μm GP高速滤器过滤掺入的进料。
将200mg的水中成浆的Nuchar HD活性炭(MeadWestVaco Corporation,Richmond,VA,USA)装入玻璃色谱柱(Omnifit Benchmark Column 10mm/100mm,10mm直径,100mm长度,SKU:006BCC-10-10-AF,Diba Industries,Danbury,CT 06810,US)。通过使水流过来包装柱，这导致0.8mL的包装柱体积。
将活性炭柱用约10CV的pH 7.0的25mM Tris预平衡。用Watson Marlow盒式泵将掺入病毒的MAB进料以1mL/min(0.8CV/min)泵过活性炭柱。在1.0kg/L和2.0kg/L的柱装载从流出液收集2ml部分。如实施例2所述，通过病毒感染性测定滴定样品。如表I和图1中总结的，这个实验证实通过使溶液以1.0kg/L和2.0kg/L的柱装载流过活性炭柱，从MABI溶液去除大于5.0LRV的MVM代表的细小病毒。因此，活性炭可以用来从包含MABI的溶液选择性地去除细小病毒。
表I.在活性炭柱上于MABI的各种柱装载下收集的部分中测量的从包含MABI的溶液去除的MVM的LRV。实验一式两份地进行，并且所列的值是那两个值的平均值。注意部分中的MVM浓度低于检测水平。
活性炭上MABI的柱装载(kg/L) 从MABI去除MVM的LRV
Figure BDA0000888653210000181
实施例6.确定活性炭是否可以用来从MABII单克隆抗体溶液选择性地去除细小病毒的方法
这是与实施例5一起的第二代表性实施例，其证实一种方法，所述方法确定通过流过活性炭柱是否从包含单克隆抗体(即，MABII)的溶液去除小鼠细小病毒(MVM)代表的细小病毒。结果显示活性炭不可以用于从MABII单克隆抗体溶液选择性地去除细小病毒。
如下文所述，向MABII溶液掺入MVM，随后流过活性炭柱。
将制备自CHO细胞的MABII澄清，然后进行A蛋白柱色谱(用25mM乙酸、25mM甘氨酸HCl洗脱)。用1M Tris碱将A蛋白洗脱液的pH调整至pH 7.0，并且通过Stericup-GP 0.22μmMillipore Express PLUS膜(1L,目录编号：SCGPU02RE,EMD Millipore Corporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤。用透析管(Standard RC Dialysis Trial Kits,Spectra/
Figure BDA0000888653210000191
1-3,3.5K MWCO,54mm FLAT WIDTH,序列号:132725,Spectrum Laboratories,Inc.Rancho Dominguez,CA,90220 USA)将进料透析入25mM Tris pH 7.0两次。然后通过Stericup-GP 0.22μm Millipore Express PLUS膜(1L,目录编号:SCGPU02RE,EMDMillipore Corporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤溶液。向pH 7.0的透析的MABII进料掺入根据实施例1所述方法制备的超纯级MVM至2.0E+06TCID50/mL的目标量。然后在与活性炭接触之前通过0.22μm GP高速滤器过滤掺入的进料。
将200mg的水中成浆的Nuchar HD活性炭(MeadWestVaco Corporation,Richmond,VA,USA)装入玻璃色谱柱(Omnifit Benchmark Column 10mm/100mm,10mm直径,100mm长度,SKU:006BCC-10-10-AF,Diba Industries,Danbury,CT 06810,US)。通过使水流过来包装柱，这导致0.8mL的包装柱体积。
将活性炭柱用约10CV的pH 7.0的25mM Tris预平衡。用Watson Marlow盒式泵将掺入病毒的mAb进料以1mL/min(0.8CV/min)泵过活性炭柱。在0.5kg/L、1.0kg/L和2.0kg/L的柱装载从流出液收集2ml部分。如实施例2所述，利用病毒感染性测定滴定样品。
如表II和图1中总结的，这个实验证实通过使溶液以0.5kg/L、1.0kg/L和2.0kg/L的柱装载流过活性炭柱，从MABII溶液去除少于1.0LRV的小鼠细小病毒(MVM)代表的细小病毒样颗粒。结果显示活性炭不可以用来从MABII单克隆抗体溶液选择性地去除细小病毒。
表II.在活性炭柱上于MABII的各种柱装载下收集的部分中从MABII去除的MVM的LRV。
活性炭上MABII的柱装载(kg/L) 从MABII去除MVM的LRV
Figure BDA0000888653210000201
实施例7.确定活性炭是否可以用来从MABIII单克隆抗体溶液选择性地去除细小病毒的方法
这是与实施例5和实施例6一起的第三代表性实施例，其证实一种方法，所述方法确定通过流过活性炭柱是否从包含单克隆抗体(即，MABIII)的溶液去除MVM代表的细小病毒。结果显示活性炭不可以用来从MABIII单克隆抗体溶液选择性地去除细小病毒。
如下文所述，向MABIII溶液掺入MVM，然后流过活性炭柱。
MABIII由Merck Serono提供，为澄清的细胞培养物。用A蛋白色谱捕获MABIII(用pH 2.6的20mM甘氨酸-盐酸盐缓冲液洗脱)。用1M Tris碱将MABIII洗脱液的pH调整至pH7.0，然后通过Stericup-GP 0.22μm Millipore Express PLUS膜(1L,目录编号：SCGPU02RE,EMD Millipore Corporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤溶液。用透析管(Standard RC Dialysis Trial Kits,Spectra/
Figure BDA0000888653210000202
1-3,3.5K MWCO,54mm FLAT WIDTH,序列号:132725,Spectrum Laboratories,Inc.Rancho Dominguez,CA,90220USA)将进料透析入25mM Tris pH 7.0两次。随后通过Stericup-GP 0.22μm Millipore Express PLUS膜(1L,目录编号:SCGPU02RE,EMD Millipore Corporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤溶液。
向pH 7.0的MABIII进料掺入根据实施例1所述方法制备的超纯级MVM至2.0E+06TCID50/mL的目标掺入。然后在与活性炭接触之前通过0.22μm GP高速滤器过滤掺入的进料。
将200mg的水中成浆的Nuchar HD活性炭(MeadWestVaco Corporation,Richmond,VA,USA)装入玻璃色谱柱(Omnifit Benchmark Column 10mm/100mm,10mm直径,100mm长度,SKU:006BCC-10-10-AF,Diba Industries,Danbury,CT 06810,US)。通过使水流过来包装柱，这导致0.8mL的包装柱体积。
将活性炭柱用约10CV的pH 7.0的25mM Tris预平衡。用Watson Marlow盒式泵将掺入病毒的MAB进料以1mL/min(0.8CV/min)泵过活性炭柱。在0.5kg/L、1.0kg/L和2.0kg/L的柱装载从流出液收集2ml部分。如实施例2所述，利用病毒感染性测定滴定样品。
如表III和图1中总结的，这个实验证实通过使溶液以0.5kg/L、1.0kg/L和2.0kg/L的柱装载流过活性炭柱，从MABIII溶液去除少于1.0LRV的小鼠细小病毒(MVM)代表的细小病毒样颗粒。这个方法的结果显示活性炭不可以用来从MABIII单克隆抗体溶液选择性地去除细小病毒样颗粒。
表III.在活性炭柱上于MABIII的各种柱装载下收集的部分中从MABIII去除的MVM的LRV。
活性炭上MABIII的柱装载(kg/L) 从MABIII去除MVM的LRV
Figure BDA0000888653210000211
实施例8.确定活性炭是否可以用来从MABIV单克隆抗体溶液选择性地去除细小病毒的方法
这是与实施例5、实施例6和实施例7一起的第四代表性实施例，其证实一种方法，所述方法确定通过流过活性炭柱是否从包含单克隆抗体(即，MABIV)的溶液去除MVM代表的细小病毒。结果显示活性炭可以用来从MABIV单克隆抗体溶液选择性地去除细小病毒。
如下文所述，向MABIV溶液掺入MVM，然后流过活性炭柱。
MABIV单克隆抗体获得自Merck Serono Biodevelopment，为包含10mM柠檬酸、100mM甘氨酸、100mM氯化钠和0.01％Tween的10g/L水溶液。用透析管(Standard RCDialysis Trial Kits,Spectra/Por 1-3,3.5K MWCO,54mm FLAT WIDTH,序列号:132725,Spectrum Laboratories Inc.,Rancho Dominguez,CA,90220 USA)将进料透析入25mMTris pH 7.0两次。通过Stericup-GP 0.22μm Millipore Express PLUS膜(1L,目录编号:SCGPU02RE,EMD Millipore Corporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤溶液。向pH 7.0的MABIV进料掺入根据实施例1所述方法制备的超纯级MVM至2.0E+06TCID50/mL的目标掺入。然后在与活性炭接触之前通过0.22μm GP高速滤器过滤掺入的进料。
将200mg的水中成浆的Nuchar HD活性炭(MeadWestVaco Corporation,Richmond,VA,USA)装入玻璃色谱柱(Omnifit Benchmark Column 10mm/100mm,10mm直径,100mm长度,SKU:006BCC-10-10-AF,Diba Industries,Danbury,CT 06810,US)。通过使水流过来包装柱，这导致0.8mL的包装柱体积。
然后将活性炭柱用约10CV的pH 7.0的25mM Tris预平衡。用Watson Marlow盒式泵将掺入病毒的MAB进料以1mL/min(0.8CV/min)泵过活性炭柱。在1.0kg/L和2.0kg/L的柱装载从流出液收集2ml部分。如实施例2所述，利用病毒感染性测定滴定样品。
如表IV和图1中总结的，这个实验证实通过使溶液以1.0kg/L和2.0kg/L的柱装载流过活性炭柱，从MABIV溶液去除大于5.0LRV的MVM代表的细小病毒。结果显示活性炭可以用来从MABIV单克隆抗体溶液选择性地去除细小病毒。
表IV.在活性炭柱上于MABIV的各种柱装载下收集的部分中从MABIV去除的MVM的LRV。实验一式两份地进行，并且所列的值是那两个值的平均值。注意部分中的MVM浓度低于检测水平。
活性炭上MABIV的柱装载(kg/L) 从MABIV去除MVM的LRV
Figure BDA0000888653210000221
实施例9.确定活性炭是否可以用来从MABI单克隆抗体溶液选择性地去除逆转录病毒和/或逆转录病毒样颗粒的方法
这是证实一种方法的代表性实施例，所述方法确定通过流过活性炭柱是否从包含单克隆抗体(即，MABI)的溶液去除异嗜性小鼠白血病病毒(XMuLV)代表的逆转录病毒和/或逆转录病毒样颗粒。结果显示活性炭可以用来从MABI单克隆抗体溶液选择性地去除逆转录病毒和逆转录病毒样颗粒。
如下文所述，向MAB I溶液掺入XMuLV并流过活性炭柱。
将CHO细胞中制备的MABI澄清，然后利用A蛋白柱色谱进行分离(用25mM乙酸、25mM甘氨酸HCl洗脱)。用1M Tris碱将A蛋白洗脱液的pH调整至pH 7.0，并且通过Stericup-GP0.22μm Millipore Express PLUS膜(1L,目录编号：SCGPU02RE,EMD MilliporeCorporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤溶液。向pH 7.0的MABI进料掺入根据实施例3所述方法制备的TFF纯化的XMuLV至1.0E+05TCID50/mL的目标掺入。在与活性炭接触之前通过0.45μm Durapore滤器过滤掺入的进料。
将200mg的水中成浆的Nuchar HD活性炭(MeadWestVaco Corporation,Richmond,VA,USA)装入玻璃色谱柱(Omnifit Benchmark Column 10mm/100mm,10mm直径,100mm长度,SKU:006BCC-10-10-AF,Diba Industries,Danbury,CT 06810,US)。通过使水流过来包装柱，这导致0.8mL的包装柱体积。
将活性炭柱用约10CV的pH 7.0的25mM Tris预平衡。用Watson Marlow盒式泵将掺入病毒的MAB进料以1mL/min(0.8CV/min)泵过活性炭柱。在0.5kg/L、1.0kg/L和1.5kg/L的柱装载从流出液收集2ml部分。如实施例4所述，利用病毒感染性测定滴定样品。
如表V和图2中总结的，这个实验证实通过使溶液以0.5kg/L、1.0kg/L和1.5kg/L的柱装载流过活性炭柱，从MABI溶液去除大于3.0LRV的XMuLV代表的逆转录病毒和逆转录病毒样颗粒。结果显示活性炭可以用来从MABI单克隆抗体溶液选择性地去除逆转录病毒样颗粒。
表V.在活性炭柱上于MABI的各种柱装载下收集的部分中从MABI去除的XMuLV的LRV。实验一式两份地进行，并且所列的值是那两个值的平均值。注意部分中的XMuLV浓度低于检测水平。
活性炭上MABI的柱装载(kg/L) 从MABI去除XMuLV的LRV
Figure BDA0000888653210000231
实施例10.确定活性炭是否可以用来从MABII单克隆抗体溶液选择性地去除逆转录病毒和/或逆转录病毒样颗粒的方法
这是与实施例9一起的第二代表性实施例，其证实一种方法，所述方法确定通过流过活性炭柱是否从包含单克隆抗体(即，MABII)的溶液去除XMuLV代表的逆转录病毒和逆转录病毒样颗粒。结果显示活性炭可以用来从MABII单克隆抗体溶液选择性地去除逆转录病毒和逆转录病毒样颗粒。
如下文所述，向MABII溶液掺入XMuLV并流过活性炭柱。
将CHO细胞中制备的MABII澄清，然后利用A蛋白柱色谱进行分离(用25mM乙酸、25mM甘氨酸HCl洗脱)。用1M Tris碱将A蛋白洗脱液的pH调整至pH 7.0，然后通过Stericup-GP 0.22μm Millipore Express PLUS膜(1L,目录编号：SCGPU02RE,EMD MilliporeCorporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤溶液。随后用透析管(Standard RC DialysisTrial Kits,Spectra/Por 1-3,3.5K MWCO,54mm FLAT WIDTH,序列号:132725,SpectrumLaboratories Inc.,Rancho Dominguez,CA,90220USA)将进料透析入25mM Tris pH 7.0两次。通过Stericup-GP 0.22μm Millipore Express PLUS膜(1L,目录编号:SCGPU02RE,EMDMillipore Corporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤溶液。
向pH 7.0的MABII进料掺入根据实施例3所述方法制备的超纯级XMuLV至1.0E+06TCID50/mL的目标掺入。在与活性炭接触之前通过0.45μm Durapore滤器过滤掺入的进料。
将200mg的水中成浆的Nuchar HD活性炭(MeadWestVaco Corporation,Richmond,VA,USA)装入玻璃色谱柱(Omnifit Benchmark Column 10mm/100mm,10mm直径,100mm长度,SKU:006BCC-10-10-AF,Diba Industries,Danbury,CT 06810,US)。通过使水流过来包装柱，这导致0.8mL的包装柱体积。
将活性炭柱用约10CV的pH 7.0的25mM Tris预平衡。用Watson Marlow盒式泵将掺入病毒的MAB进料以1mL/min(0.8CV/min)泵过活性炭柱。在0.2kg/L、0.5kg/L和1.0kg/L的柱装载从流出液收集2ml部分。如实施例4所述，利用病毒感染性测定滴定样品。
如表VI和图2中总结的，这个实验证实通过使溶液以0.2kg/L、0.5kg/L和1.0kg/L的柱装载流过活性炭柱，从MABII溶液去除大于5.0LRV的XMuLV代表的逆转录病毒和逆转录病毒样颗粒。结果显示活性炭可以用来从MABII单克隆抗体溶液选择性地去除逆转录病毒和逆转录病毒样颗粒。
表VI.在活性炭柱上于MABII的各种柱装载下收集的部分中从MABII去除的XMuLV的LRV。注意部分中的XMuLV浓度低于检测水平。
活性炭上MABII的柱装载(kg/L) 从MABII去除XMuLV的LRV
Figure BDA0000888653210000251
实施例11.确定活性炭是否可以用来从MABIII单克隆抗体溶液选择性地去除逆转录病毒和/或逆转录病毒样颗粒的方法
这是与实施例9和实施例10一起的第三代表性实施例，其证实一种方法，所述方法确定通过流过活性炭柱是否从包含单克隆抗体(即，MABIII)的溶液去除XMuLV代表的逆转录病毒和逆转录病毒样颗粒。结果显示活性炭可以用来从MABIII单克隆抗体溶液选择性地去除逆转录病毒和逆转录病毒样颗粒。
如下文所述，向MABIII溶液掺入XMuLV并流过活性炭柱。
MABIII由Merck Serono提供，为澄清的细胞培养物。利用A蛋白色谱将其捕获(用pH 2.6的20mM甘氨酸-盐酸盐缓冲液洗脱)。洗脱液具有高水平的HCP，因此利用A蛋白柱色谱进行第二次纯化。在装载色谱柱之前，使MABIII溶液的氯化钠浓度增加至0.5M。然后用25mM乙酸、25mM甘氨酸HCl洗脱MABIII抗体。用1M Tris碱将MABIII洗脱液的pH调整至pH7.0，并且通过Stericup-GP 0.22μm Millipore Express PLUS膜(1L,目录编号：SCGPU02RE,EMD Millipore Corporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤溶液。用透析管(Standard RC Dialysis Trial Kits,Spectra/
Figure BDA0000888653210000252
1-3,3.5K MWCO,54mm FLAT WIDTH,序列号:132725,Spectrum Laboratories,Inc.Rancho Dominguez,CA,90220 USA)将进料透析入25mM Tris pH 7.0两次。通过Stericup-GP 0.22μm Millipore Express PLUS膜(1L,目录编号:SCGPU02RE,EMD Millipore Corporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤溶液。
向pH 7.0的MAB III进料掺入根据实施例3所述方法制备的超纯级XMuLV至1.0E+06TCID50/mL的目标掺入。在与活性炭接触之前通过0.45μm Durapore滤器过滤掺入的进料。
将200mg的水中成浆的Nuchar HD活性炭(MeadWestVaco Corporation,Richmond,VA,USA)装入玻璃色谱柱(Omnifit Benchmark Column 10mm/100mm,10mm直径,100mm长度,SKU:006BCC-10-10-AF,Diba Industries,Danbury,CT 06810,US)。通过使水流过来包装柱，这导致0.8mL的包装柱体积。
将活性炭柱用约10CV的pH 7.0的25mM Tris预平衡。用Watson Marlow盒式泵将掺入病毒的MAB进料以1mL/min(0.8CV/min)泵过活性炭柱。在0.2kg/L、0.5kg/L和1.0kg/L的柱装载从流出液收集2ml部分。如实施例4所述，利用病毒感染性测定滴定样品。
如表VII和图2中总结的，这个实验证实通过使溶液以0.2kg/L、0.5kg/L和1.0kg/L的柱装载流过活性炭柱，从MABIII溶液去除大于5.0LRV的XMuLV代表的逆转录病毒和逆转录病毒样颗粒。结果显示活性炭可以用来从MABIII单克隆抗体溶液选择性地去除逆转录病毒和逆转录病毒样颗粒。
表VII.在活性炭柱上于MABIII的各种柱装载下收集的部分中从MABIII去除的XMuLV的LRV。注意部分中的XMuLV浓度低于检测水平。
活性炭上MABIII的柱装载(kg/L) 从MABIII去除XMuLV的LRV
Figure BDA0000888653210000261
实施例12.确定活性炭是否可以用来从MABIV单克隆抗体溶液选择性地去除逆转录病毒和/或逆转录病毒样颗粒的方法
这是与实施例9、实施例10和实施例11一起的第四代表性实施例，其证实一种方法，所述方法确定通过流过活性炭柱是否从包含单克隆抗体(即，MABIV)的溶液去除XMuLV代表的逆转录病毒和逆转录病毒样颗粒。结果显示活性炭可以用来从MABIV单克隆抗体溶液选择性地去除逆转录病毒和逆转录病毒样颗粒。
如下文所述，向MABIV溶液掺入XMuLV并流过活性炭柱。
MABIV单克隆抗体获得自Merck Serono Biodevelopment，为包含10mM柠檬酸、100mM甘氨酸、100mM氯化钠和0.01％的Tween的10g/L水溶液。然后用透析管(Standard RCDialysis Trial Kits,Spectra/Por 1-3,3.5K MWCO,54mm FLAT WIDTH,序列号:132725,Spectrum Laboratories Inc.,Rancho Dominguez,CA,90220 USA)将进料透析入25mMTris pH 7.0两次。通过Stericup-GP 0.22μm Millipore Express PLUS膜(1L,目录编号:SCGPU02RE,EMD Millipore Corporation,Billerica,MA,01821,USA)过滤溶液。向pH 7.0的MABIV进料掺入根据实施例3所述方法制备的超纯级XMuLV至1.0E+06TCID50/mL的目标掺入。在与活性炭接触之前通过0.45μm Durapore滤器过滤掺入的进料。
将200mg的水中成浆的Nuchar HD活性炭(MeadWestVaco Corporation,Richmond,VA,USA)装入玻璃色谱柱(Omnifit Benchmark Column 10mm/100mm,10mm直径,100mm长度,SKU:006BCC-10-10-AF,Diba Industries,Danbury,CT 06810,US)。通过使水流过来包装柱，这导致0.8mL的包装柱体积。
将活性炭柱用约10CV的pH 7.0的25mM Tris预平衡。用Watson Marlow盒式泵将掺入病毒的MAB进料以1mL/min(0.8CV/min)泵过活性炭柱。在0.2kg/L、0.5kg/L和1.0kg/L的柱装载从流出液收集2ml部分。如实施例4所述，利用病毒感染性测定滴定样品。
如表VIII和图2中总结的，这个实验证实通过使溶液以0.2kg/L、0.5kg/L和1.0kg/L的柱装载流过活性炭柱，从MABIV溶液去除大于5.0LRV的XMuLV代表的逆转录病毒和逆转录病毒样颗粒。结果显示活性炭可以用来从MABIV单克隆抗体溶液选择性地去除逆转录病毒和逆转录病毒样颗粒。
表VIII.在活性炭柱上于MABIV的各种柱装载下收集的部分中从MABIV去除的XMuLV的LRV。实验一式两份地进行，并且所列的值是那两个值的平均值。注意部分中的XMuLV浓度低于检测水平。
活性炭上MABIV的柱装载(kg/L) 从MABIV去除XMuLV的LRV
Figure BDA0000888653210000281
根据本说明书内引用的参考文献的教导最全面地理解本说明书，所述参考文献援引加入本文。本说明书内的实施方案提供本发明中的实施方案的说明，并且不应当理解为限制其范围。技术人员容易地认识到本发明涵盖许多其他实施方案。所有出版物和发明均整体援引加入本文。如果援引加入的材料与本说明书矛盾或不一致，则本说明书会取代任何这样的材料。本文中任何参考文献的引用不是承认这类参考文献是本发明的现有技术。
除非另有说明，本说明书(包括权利要求书)中使用的所有表示成分、细胞培养、处理条件等的量的数字应当理解为在所有条件下受到术语“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，数值参数为近似值，并且可以根据通过本发明试图获得的期望特性而变化。除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。本领域技术人员会认识到或者能够利用不超过常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。以下权利要求书意图涵盖这类等同物。
本领域技术人员会清楚，可以进行本发明的许多修改和变化而不背离其精神和范围。本文所述的具体实施方案仅通过实例的方式提供，并不意味着以任何方式限制。本发明的真正范围和精神通过以下权利要求书示出，说明书和实施例仅认为是示例性的。

Claims (14)

1.一种确定活性炭是否可以用于从包含靶蛋白的样品去除病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含靶蛋白的一部分样品，其中所述靶蛋白为抗体；
(b)以104-109PFU/mL的量将病毒添加至所述一部分样品中，其中所述病毒选自逆转录病毒、逆转录病毒样颗粒和细小病毒；
(c)使所述一部分样品流过装有活性炭的柱；
(d)从所述柱收集一个或多个流过部分；以及
(e)测量所述一个或多个流过部分中的病毒量，
其中所述一个或多个流过部分中的病毒量减少至少3.0LRV表明活性炭能够用于从所述样品去除病毒，
其中所述样品包含等于或大于0.2g/L的蛋白浓度。
2.权利要求1的方法，其中所述样品包含等于或大于0.5g/L的蛋白浓度。
3.权利要求1的方法，其中所述样品包含等于或大于1g/L的蛋白浓度。
4.权利要求1的方法，其中所述样品包含3.0-10.0范围中的pH和/或少于0.5M的盐浓度。
5.权利要求1的方法，其中所述病毒选自小鼠细小病毒和异嗜性小鼠白血病病毒。
6.权利要求1的方法，其中所述样品包含细胞培养进料。
7.权利要求6的方法，其中所述细胞培养进料为CHO细胞培养进料。
8.权利要求1的方法，其中所述靶蛋白为重组抗体。
9.权利要求1的方法，其中所述靶蛋白为治疗性抗体。
10.权利要求1的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
11.权利要求1的方法，其中所述样品包含澄清的细胞培养进料。
12.权利要求11的方法，其中澄清的细胞培养进料是利用选自离心、沉降、深层过滤、筛过滤、絮凝、使用刺激响应性聚合物和pH改变的一种或多种方法获得的。
13.权利要求1的方法，其中所述样品包含获得自A蛋白色谱柱的洗脱液，其中所述洗脱液包含所述靶蛋白。
14.权利要求1的方法，其中步骤(e)采用选自以下的一种或多种方法：50％组织培养感染剂量(TCID50)测定、空斑形成单位测定、病灶形成单位测定、致死剂量50％测定、血细胞凝集测定、荧光灶测定(FFA)、二喹啉甲酸测定(BCA)、单向免疫扩散测定(SRID)、定量聚合酶链反应(qPCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和透射电镜术。
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