KR20160003726A - 표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 활성탄을 사용하여 바이러스 제거를 결정하는 방법 - Google Patents

표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 활성탄을 사용하여 바이러스 제거를 결정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 바이러스 또는 특정 바이러스를 제거하기 위해 활성탄이 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다.

Description

표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 활성탄을 사용하여 바이러스 제거를 결정하는 방법{A method of deterining virus removal from a sample containing a target protein using actiated carbon}
본 발명은 표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 바이러스 제거를 위해 활성탄이 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다.
예컨대, 단일클론 항체와 같은 표적 단백질을 정제하는데 가장 흔히 사용되는 공정들은 표적 단백질을 발현할 수 있는 조작된 세포주(예컨대, 포유동물 또는 비-포유동물 세포주)를 전형적으로 적용한다. 이러한 표적 단백질은 세포 배지로 분비될 수 있거나 또는 세포내에 발현되어서 단백질을 발현하는 세포의 용균 이후에 회수될 수 있다.
표적 단백질은 전형적으로 다양한 불순물, 예컨대, 세포, 세포 파쇄물(cell debris), DNA, 숙주 세포 단백질 등으로부터 표적 단백질을 분리하기 위하여 일련의 정제 단계를 거칠 필요가 있다.
전형적인 정제 공정은 세포 배양 공급물 또는 배지(분비성 표적 단백질의 경우) 또는 세포 용균물(세포내 표적 단백질의 경우)을 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 비롯한 다양한 단계에 처리하여 표적 단백질을 단리하거나 또는 정제하는 것을 대개 수반한다. 예를 들어, 분비성 표적 단백질, 예컨대, 단일클론 항체(monoclonal antibody)의 경우, 세포 배지는 전형적으로 정화(clarification) 단계에 처리된 다음 포획 단계에 이어 하나 이상의 양이온 교환 결합/용리(bind/elute) 크로마토그래피 단계 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 처리된다.
CHO 세포는 단일클론 항체 생산을 위해 흔히 사용된다. 전형적인 CHO 세포 배양 공급물(cell culture feed)은 103 내지 109 바이러스 또는 바이러스-유사 입자를 함유하며 또 그러한 바이러스 또는 바이러스-유사 입자의 제거는 정제 공정 동안 특히 중요한데, 이는 표적 단백질의 다수가 환자에 직접 투여될 치료성 단백질이기 때문이다. 일반적으로, 바이러스 제거는 전체 정제 공정에 의해 달성되는 전체 바이러스 제거량을 기본으로 하여 평가되며, 특히 당국 승인이 필요한 경우에 18 로그(logs)와 동일 또는 초과(이후 "이상"이라 칭함)인 것이 바람직하다.
일반적으로, 전형적인 정제 공정의 각 단계는 바이러스의 일부량을 제거하는 것으로 밝혀져 있으나, 그 양은 보통 18 로그 미만이다; 따라서, 적절한 바이러스 제거를 위하여 부가적 정제 단계가 상기 공정에 포함되어야 한다. 적절한 바이러스 제거가 정제 공정 중의 다양한 정제 단계에 의해 달성되도록 하기 위하여 특정 정제 단계가 특정 양의 바이러스를 제거할 수 있는지 여부를 확립하는 것이 중요하다.
샘플, 예컨대, 바이오기술 산물의 바이러스 안전 평가에 대한 안내는Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use(ICH)에 대한 국제 회의의 찬조로 제조된 "Harmonized Tripartate Guideline: Q5A Viral Safety of Biotechnology Products Derived From Cell Lines of Human or Animal Origin. Fed. Reg. 63(185) 24 September 1998" 에서 찾아 볼 수 있다.
활성탄은 바이러스를 제거하기 위하여 물 정제용으로 이전에 사용되었을 뿐만 아니라 생물학적 유체, 예컨대, 혈액으로부터 바이러스를 포함할 수 있는 물질을 비-특이적 제거하기 위한 여과 유닛에 포함되어 왔다(예컨대, 참조, 미국 특허 번호 8,123,940호).
또한, 그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함되는, 2012년 8월 2일 출원된 미국 특허 출원 번호 13/565,463호는 단백질성 불순물(예컨대, 숙주 세포 단백질) 및 DNA를 관심있는 생체분자(예컨대, 항체)를 함유하는 샘플로부터 제거하기 위한 기타 매질과 조합된 활성탄의 사용을 기재한다.
마지막으로, 참조에 의해 본 명세서에 포함되는, 2013년 2월 26일 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/769,269호는 용액 조건을 변경하는 것에 의해 단백질의 혼합물로부터 단백질을 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄을 사용하는 것을 개시한다.
본 발명은 표적 단백질, 예컨대, 단일클론 항체를 함유하는 특정 샘플의 경우 바이러스의 양을 감소시키기 위하여 활성탄이 사용될 수 있다는 놀랍고도 예상치 못한 발견을 적어도 일부 기초로 한다. 활성탄은 물 정제하는 동안 일부 바이러스를 제거하는 것으로 이전에 기재되었지만, 활성탄으로 처리된 샘플은 일반적으로 저 농도의 단백질을 갖거나 또는 단백질을 전혀 갖지 않는다. 본 발명은, 고 단백질 농도를 포함하는 특정 샘플(예컨대, 단리될 표적 단백질을 함유하는 세포 배양 공급물 또는 세포 용균물) 중의 파르보바이러스(parvovirus), 레트로바이러스(retrovirus) 및 레트로바이러스-유사(retrovirus-like) 입자를 비롯한 바이러스에 활성탄이 특이적으로 결합한다는 예상치 못한 놀라운 발견을 적어도 일부 기본으로 한다. 따라서, 특정 정제 공정에서 활성탄의 혼입은 단백질 정제 동안 전형적으로 사용되는 하나 이상의 고가의 크로마토그래피 단계(예컨대, 양이온 교환 결합/용리 크로마토그래피 단계)의 생략을 초래할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 바이러스 제거를 위해 활성탄이 이용될 수 있는지 여부를 결정하는 방법이 제공되며, 이 방법은,
(a) 표적 단백질을 포함하는 샘플의 일부를 제공하는 단계;
(b) 상기 샘플의 일부에 바이러스를 104 내지 109 PFU/mL 범위의 양으로 부가하는 단계;
(c) 상기 일부 샘플을 활성탄이 팩킹(packed)된 컬럼을 통과시키는 단계;
(d) 상기 컬럼으로부터 표적 단백질을 함유하는 하나 이상의 분획을 수집하는 단계; 및
(e) 상기 하나 이상의 분획에서 바이러스의 양을 측정하는 단계를 포함하고, 하나 이상의 분획 중의 바이러스 양에서 적어도 3.0 LRV 정도 감소하는 것은 샘플로부터 바이러스 제거를 위해 활성탄이 이용될 수 있다는 표시이다.
일부 실시양태에서 상기 샘플은 0.2 g/L 이상의 단백질 농도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플은 3.0-10.0 범위의 pH 및/또는 0.5M 미만의 염 농도를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 샘플은 세포 배양 공급물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 세포 배양 공급물은 CHO 세포 배양 공급물이다.
일부 실시양태에서, 상기 샘플은 정화(clarification) 처리된 세포 배양 공급물을 포함한다. 정화 방법은, 비제한적으로, 원심분리, 침강, 심층 여과(depth filtration), 스크린 여과, 응집, 자극 감응성 중합체의 사용 및 pH 변경을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 샘플은 표적 단백질을 정제하는 동안 사용된 단백질 A 크로마토그래피 단계로부터 회수된 용리물(eluate)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 샘플은 세포 내에 표적 단백질을 발현하는 세포로부터 수득된 세포 용균물(cell lysate)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 표적 단백질은 재조합 단백질이다. 예시적 표적 단백질은, 비제한적으로, 면역글로불린, 예컨대, 단일클론 항체, Fc-함유 단백질 뿐만 아니라 비-면역글로불린 단백질을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 표적 단백질은 치료성 단백질이다.
도 1은 4개의 상이한 유형의 단일클론 항체 샘플에서 관찰되는 바와 같이, 활성탄 컬럼을 통하여 단일클론 항체 용액을 흘려주는(통과시키는) 것에 의해 단일클론 항체 용액으로부터 마우스의 미세 바이러스(MVM)로 표시되는 파르보바이러스가 제거될 수 있는지 여부를 결정하는 실험의 결과를 도시하는 그래프이다. MVM는 2개의 별개 단일클론 항체 용액인 MABI 및 MABIV에 대해 1.0 kg/L 및 2.0 kg/L의 컬럼 로딩시 5.0 LRV 초과량으로 제거된다. 그러나, MVM는 2개의 다른 단일클론 항체 용액인 MABII 및 MABIII에 대해 0.5 kg/L, 1.0 kg/L, 및 2.0 kg/L의 컬럼 로딩시 1.0 LRV 초과량으로 제거되지 않는다. X-축은 분획이 취해진 지점에서 활성탄 리터(L)당 칼럼 상으로 로딩된 단일클론 항체의 양(kg)을 도시하고 또 Y-축은 분획 중의 MVM 바이러스의 로그 감소치를 도시한다. 상방 화살표는 샘플 중의 바이러스의 농도가 그 분획에 대한 검출 한계 미만인 것을 나타낸다.
도 2는 4개의 상이한 유형의 단일클론 항체 샘플에서 관찰되는 바와 같이, 활성탄 컬럼을 통하여 단일클론 항체 용액을 흘려주는(통과시키는) 것에 의해 단일클론 항체 용액으로부터 숙주 외에서만 증식하는(xenotropic) 쥐의 백혈병 바이러스(XMuLV)로 표시되는 레트로바이러스 또는 레트로바이러스-유사 입자가 제거될 수 있는지 여부를 결정하는 실험의 결과를 도시하는 그래프이다. XMuLV는 MABI 항체 용액에 대하여 0.5 kg/L, 1.0 kg/L, 및 1.5 kg/L의 컬럼 로딩시 3.0 LRV 초과량으로 제거된다. XMuLV는 항체 용액인 MABII, MABIII 및 MABIV의 경우, 0.2 kg/L, 0.5 kg/L, 및 1.0 kg/L의 컬럼 로딩시 5.0 LRV 초과량으로 제거된다. X-축은 분획이 취해진 지점에서 활성탄 리터(L)당 칼럼 상으로 로딩된 단일클론 항체의 양(kg)을 도시하고 또 Y-축은 분획 중의 XMuLV 바이러스의 로그 감소치를 도시한다. 상방 화살표는 샘플 중의 바이러스의 농도가 그 분획에 대한 검출 한계 미만인 것을 나타낸다.
상세한 설명
상기 논의한 바와 같이, 본 발명은 예컨대, 정제될 표적 단백질을 포함하는 특정 세포 배양 공급물 또는 세포 용균물과 같은 특정의 고 단백질 농도 샘플로부터 바이러스를 제거하기 위하여 활성탄이 사용될 수 있다는 신규하고 예상치 못한 발견을 적어도 일부 기본으로 한다.
치료성 단백질을 함유하는 바이오리액터 공급물 중의 바이러스의 전형적인 농도는 일반적으로 아주 낮다. 그러나, 이들 낮은 수준은 정제될 치료성 단백질에 의해 치료될 환자에게는 여전히 위험할 수 있다. 단백질 정제하는 동안 바이러스의 적절한 제거를 보증하도록, 특정 정제 단계가 바이러스 정제될 단백질을 함유하는 샘플로부터 바이러스를 제거하는지 여부를 결정하고 또 그러한 정제 단계에 의해 제거된 바이러스의 양을 결정하는지 여부가 중요하다.
그렇게 하기 위하여, 대표적 바이러스를 공지 농도의 치료성 단백질을 함유하는 용액에 첨가한 다음 바이러스 첨가된 치료성 단백질 용액을 특정 정제 단계에 처리한다. 상기 정제 단계에 이어, 상기 용액 중의 대표적 바이러스의 양을 결정한다. 정제 단계에 의한 적절한 바이러스 제거는 바이러스의 양이 바이러스의 검출한계보다 더 낮은 것 또는 상기 정제 단계 이후의 용액 중에서 검출될 수 없는 것으로 표시된다. 파르보바이러스 및 레트로바이러스는 CHO 세포에서 발현된 치료성 단백질의 정제 동안 일반적으로 측정되는 2개 유형의 바이러스이다.
전형적으로, 정제 단계 동안 단백질을 함유하는 샘플로부터 제거된 바이러스의 양을 결정하기 위해 이용된 방법은 전체 샘플 부피 대신 샘플의 일부를 이용한다. 특정 정제 단계가 표적 단백질을 함유하는 샘플의 일부로부터 바이러스를 제거할 수 있는지 결정이 행해지면, 상기 이용된 정제 매질 및 표적 단백질의 비율이 동일하게 유지되는 한, 상기 정제 단계는 샘플로부터 바이러스를 제거할 것이라고 추정될 수 있다.
본 발명은 특정 샘플로부터 특정 바이러스를 제거하기 위하여 활성탄이 이용될 수 있는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 이하의 실시예에 예시된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여, 활성탄이 표적 단백질을 함유하는 특정 샘플로부터 바이러스를 제거할 수 있는지 여부를 결정할 수 있다. 따라서, 표적 단백질을 함유하는 샘플의 경우, 활성탄이 바이러스를 제거할 수 있으면, 활성탄은 상기 샘플에 대한 정제 공정에 포함될 수 있다.
본 발명을 더욱 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위하여, 특정 용어를 먼저 정의한다. 부가적 정의는 이하의 상세한 설명을 통하여 기재된다.
I. 정의
본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 용어 "활성 탄소" 또는 "활성탄"은 그의 기공 구조를 향상시키는 공정에 처리된 탄소질 물질을 지칭한다. 활성탄은 때때로 또한 활성화 목탄이라고도 부른다. 활성탄은 매우 높은 표면적을 갖는 다공성 고체이다. 이들은 석탄, 목재, 코코넛 껍질, 견과껍질, 및 토탄을 비롯한 다양한 공급원으로부터 유도될 수 있다. 활성탄은 제어된 분위기 하에서 가열을 비롯한 물리적 활성화 또는 강한 산, 염기, 또는 산화제를 사용한 화학적 활성화를 이용하여 이들 물질로부터 생성될 수 있다. 상기 활성화 공정들은 불순물 제거를 위한 높은 능력을 활성탄에게 제공하는 높은 표면적을 갖는 다공성 구조를 생성한다. 활성화 공정들은 표면의 산도를 제어하기 위하여 변형될 수 있다.
전형적인 활성화 공정들은 수지 폐기물, 석탄, 석탄 코크스, 석유 코크스, 리그나이트, 중합체 물질, 및 펄프 및 종이, 펄스 제조로부터 잔류물, 목재(목재 칩, 톱밥, 및 목재 가루와 같은), 견과 껍질(아몬드 껍질 및 코코넛 껍질), 알곡, 및 과일피트(올리브 및 체리 씨)를 포함한 리그노셀룰로오스 물질과 같은 탄소 공급원을 열적 공정(예컨대, 산화 가스 사용) 또는 화학적 공정(예컨대, 인산 또는 염화아연과 같은 금속염 사용)에 처리하는 것을 포함한다. 인산(H3PO4)을 사용한 목재-계 탄소의 화학적 활성화를 포함하는 예시적 공정은 미국 특허번호 Re. 31,093호에 개시되어 있고, 이는 탄소의 탈색 및 가스 흡착능 개선을 초래하였다. 또한, 미국 특허번호 5,162,286호는 특히 조밀하고 또 견과 껍질, 과일 씨, 및 알곡과 같이 비교적 높은(30%) 리그닌 함량을 함유하는 목재-계 물질의 인산 활성화를 개시한다. 리그노셀룰로오스 물질의 인산 활성화는 고활성 및 고밀도의 탄소 제조에 있어서의 한 단계로서 또한 개시되어 있다. 상기 단락에 수록된 특허 각각의 가르침은 그 전체 내용이 참조에 의해 본 발명에 포함된다.
대부분의 다른 흡착성 물질과 대조적으로, 활성탄은 비교적 약한 반 데어 발스력 또는 런던 분산력을 이용하여 분자와 상호작용하는 것으로 생각된다. 전형적인 상업적 활성탄 제품은 당업계에서 잘 알려진 방법인 BET(Brunauer-Emmett-Teller)법을 기본으로 한 질소 흡착에 의해 측정된 바와 같이 적어도 300 m2/g의 표면적을 나타낸다.
활성 탄소 또는 활성탄은 이전에는 불순물에 결합시키는 것에 의해 액체 및 가스를 정제하기 위한 공정뿐만 아니라 재조합적으로 발현된 항체를 다른 불순물로부터 정제하기 위한 공정에 사용되어 왔지만, 고 단백질 농도 샘플(즉, >0.2 g/L 단백질 농도)로부터 바이러스, 특히 파르보바이러스 및 레트로바이러스를 제거하기 위해서는 이전에 사용되지 않았다. 따라서, 활성탄은 일부 경우에서 치료성 단백질, 예컨대 단일클론 항체를 정제하는 공정 동안 바이러스의 제거를 위한 비용 효과적 해결책을 제공한다.
본 발명은 표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 바이러스를 제거하기 위해 활성탄이 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 활성탄은 모든 샘플의 경우에서 바이러스의 효과적인 제거를 초래하지는 않기 때문에, 본 발명에서 제공된 방법을 토대로, 어떤 샘플의 경우에 대하여 바이러스 또는 특정 유형의 바이러스를 제거하기 위하여 활성탄이 이용될 수 있는지 용이하게 결정될 수 있다.
본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 용어 "관심있는 단백질" 및 "표적 단백질"은 바이러스를 함유하는 조성물로부터 정제될 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 표적 단백질은 환자에게 투여될 치료성 단백질이다.
일반적으로, 표적 단백질의 전체 순도는 바이러스 제거의 결과로서 증가한다. 표적 단백질은 면역글로불린 또는 비-면역글로불린 단백질일 수 있고 또 분비성 단백질 또는 세포내 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 면역글로불린 단백질, 예컨대, 단일클론 항체이다.
표적 단백질의 다른 예는 비제한적으로, 재조합 인간 성장 호르몬, 재조합 인간 인슐린, 재조합 모낭 자극 호르몬, 재조합 인자 VII(항-혈우병(anti-hemophilic) 인자), 재조합 인간 에리트로포이에틴(erythropoietin), 재조합 과립구 콜로니 자극 인자, 재조합 알파-갈락토시다제 a, 재조합 이두로니다제(iduronidase), 재조합 갈술파제(galsulfase), 재조합 도르나제(dornase) 알파, 재조합 조직 플라스미노겐 활성화인자, 재조합 인간 인터페론, 재조합 인슐린-유사 성장 인자 1, 및 재조합 아스파라기나제를 포함한, 재조합 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 표적 단백질은 인간 혈액 또는 기타 생리적 유체로부터 유도된 단백질이다. 이러한 단백질의 예는, 비제한적으로, 면역글로불린 G 및 M, 인자 VIII, 인자 IX, 항트롬빈 III, 및 알파-I-항트립신을 포함한다.
용어 "면역글로불린", "Ig" 또는 "항체"(본 명세서에 상호교환적으로 사용됨)는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어지는 기본적 4-폴리펩티드 사슬 구조를 갖고, 상기 사슬들은 예컨대, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 사슬간(interchain) 다이설파이드 결합에 의해 안정화된다. 용어 "단쇄 면역글로불린" 또는 "단쇄 항체"(본 명세서에 상호교환적으로 사용됨)는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄로 이루어지는 2-폴리펩티드 사슬 구조를 갖고, 상기 사슬들은 예컨대, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 사슬간 펩티드 링커에 의해 안정화된다. 용어 "도메인"은 예컨대, β-병풍구조(β-pleated sheet) 및/또는 사슬간 다이설파이드 결합에 의해 안정화된 펩티드 루프(예를 들어, 3 내지 4개 펩티드 루프)를 포함하는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 구상(globular) 영역을 지칭한다. 도메인은 또한 본 명세서에서 "불변(constant)" 도메인의 경우 다양한 종류의 멤버의 도메인 내에서 서열 변이의 상대적 결여, 또는 "가변(variable)" 도메인의 경우 다양한 종류의 멤버의 도메인 내에서 상당한 변이를 기본으로 하여 "불변" 또는 "가변"이라고 칭한다. 항체 또는 폴리펩티드 "도메인"은 흔히 당해 분야에서 상호교환적으로 항체 또는 폴리펩티드 "영역(region)"이라 칭한다. 항체 경쇄의 "불변" 도메인은 상호교환적으로 "경쇄 불변 영역", "경쇄 불변 도메인", "CL" 영역 또는 "CL" 도메인이라 칭한다. 항체 중쇄의 "불변" 도메인은 상호교환적으로 "중쇄 불변 영역", "중쇄 불변 도메인", "CH" 영역 또는 "CH" 도메인이라 칭한다. 항체 경쇄의 "가변" 도메인은 상호교환적으로 "경쇄 가변 영역", "경쇄 가변 도메인", "VL" 영역 또는 "VL" 도메인이라 칭한다. 항체 중쇄의 "가변" 도메인은 상호교환적으로 "중쇄 가변 영역", "중쇄 가변 도메인", "VH" 영역 또는 "VH" 도메인이라 칭한다.
면역글로불린 또는 항체는 단일클론성(monoclonal) 또는 다중클론성(polyclonal)일 수 있고 또 단량체 또는 중합체 형태로 존재할 수 있고, 예를 들어, 오량체 형태로 존재하는 IgM 항체 및/또는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 존재하는 IgA 항체를 포함한다. 면역글로불린 또는 항체는 또한 다중특이적 항체(예컨대, 2중특이적 항체)를 포함할 수 있다.
용어 "Fc 영역" 및 "Fc 영역 함유 단백질"은 단백질이 면역글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역 또는 도메인(앞서 정의한 바와 같은 CH 및 CL 영역)을 함유하는 것을 의미한다. "Fc 영역"을 함유하는 단백질은 면역글로불린 불변 도메인의 이팩터(effector) 기능을 보유할 수 있다. CH2/CH3 영역과 같은 "Fc 영역"은 단백질 A 또는 그의 기능적 변이체와 같은 친화성 리간드에 선택적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 영역 함유 단백질은 단백질 A 또는 그의 기능적 유도체, 변이체 또는 단편에 특이적으로 결합한다. 다른 실시양태에서, Fc 영역 함유 단백질은 단백질 G 또는 단백질 L, 또는 그의 기능적 유도체, 변이체 또는 단편에 특이적으로 결합한다.
상기 논의한 바와 같이, 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 Fc 영역 함유 단백질, 예컨대, 면역글로불린이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역 함유 단백질은 다른 폴리펩티드 또는 그의 단편에 융합된 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 재조합 단백질이다.
일반적으로, 면역글로불린 또는 항체는 관심있는 "항원"에 대한 것이다. 바람직하게는, 상기 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고 또 질병 또는 질환에 걸린 포유동물에 대한 항체의 투여는 그 포유동물에서 치료적 효과를 초래할 수 있다.
본 발명에서 상호변경가능하게 사용되는 용어 "단일클론 항체" 또는 "Mab"는 실질적으로 균질한 항체 군집으로부터 얻어진 항체를 지칭하며, 즉, 군집 중의 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 천연 산출 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원 부위에 대하여 생긴 것이다. 또한, 상이한 결정기(항원결정기)에 대한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상의 (다중클론) 항체와 대조적으로, 각 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대하여 생성된다. 수식어 "단일클론"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어지는 항체의 특징을 나타내며, 또 특정 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단일클론 항체는 Kohler et al., Nature 256:495(1975)에 의해 처음으로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(참조, 예컨대, 미국 특허번호 4,816,567호)에 의해 제조될 수 있다. "단일클론 항체"는 또한 Clackson et al., Nature 352:624-628(1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)에 기재된 수법을 이용하는 파아지 항체 라이브러리(phage antibody libraries)로부터 단리될 수 있다. 단일클론 항체는 또한 "MAb" 또는 "mab" 또는 "mAb" 또는 "MAB"로도 지칭될 수 있다.
단일클론 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유도되거나 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동인 반면에, 상기 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유도되거나 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체뿐만 아니라, 소망하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 그러한 항체의 단편에서의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동인 "키메라" 항체(면역글로불린)를 더 포함할 수 있다(미국 특허번호 4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984)).
비-인간(예컨대, 쥐) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 소망하는 특이성, 친화성, 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종(공여체(donor) 항체)으로부터 초가변 영역 잔기에 의해 치환된 인간 면역글로불린(수용체(recipient) 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화된 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 행해진다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개, 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 그것에 상응하고 또 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 그것이다. 인간화된 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 더 상세한 내용은, Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329(1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992) 참조.
본 발명에 사용되는 바와 같은 용어 "용액" 또는 "샘플"은, 본 발명에 기재된 방법을 이용하여 표적 단백질 함유 조성물로부터 바이러스를 제거하기 위하여 활성탄이 사용될 수 있음이 밝혀지면, 활성탄을 사용하여 바이러스 제거 처리될 표적 단백질을 함유하는 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플은 세포 배양 공급물, 예를 들어, 표적 단백질(예컨대, 단일클론 항체)을 함유하는 포유동물 세포 배양액(예컨대, CHO 세포)으로부터의 공급물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플은 표적 단백질을 세포내에서 발현하는 포유동물 또는 비-포유동물 세포로부터 얻은 세포 용균물(cell lysate)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플은 정화 처리된 세포 배양 공급물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용리액을 포함한다. 샘플들은 또한 관심있는 단백질 또는 표적 단백질을 생산하기 위해 사용되는 비-포유동물 발현계를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "비-포유동물 발현계"는 치료성 단백질을 생성하기 위해 이용된 모든 숙주 세포 또는 기관을 지칭하며, 상기 숙주 세포 또는 기관은 비-포유동물 기원이다. 관심있는 단백질 또는 표적 단백질 생산에 사용된 비-포유동물 발현계의 예는 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모, 에세리키아 콜리(Escherichia coli), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 브레비바실루스 초시넨시스(Brevibacillus choshinensis)와 같은 세균, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포와 같은 곤충 세포, 배큘로바이러스 감염된 곤충 세포, 및 조류(alggae) 세포를 포함한다.
용어 "샘플의 일부"는 본 명세서에 기재된 바와 같이 샘플로부터 바이러스를 제거하기 위하여 활성탄이 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있는 표적 단백질을 함유하는 샘플의 일부를 지칭한다. 일반적으로, 표적 단백질을 함유하는 샘플의 일부로부터 바이러스 또는 특정 유형의 바이러스를 제거하기 위하여 활성탄이 사용되는 것으로 밝혀지면, 상기 샘플로부터 바이러스 또는 특정 유형의 바이러스를 제거하기 위하여 표적 단백질에 대한 정제 공정에 활성탄이 포함될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "정화하다", "정화" 및 "정화단계"는 현탁된 입자 및/또는 콜로이드를 제거하여 NTU(nephelometric turbidity units)으로 측정되는 바와 같이 표적 단백질 함유 용액의 탁도(turbidity)를 감소시키기 위한 공정 단계를 지칭한다. 정화는 원심분리 또는 여과를 비롯한 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 원심분리는 뱃치식 또는 연속 모드로 실시될 수 있었던 반면에, 여과는 정상 유동(예컨대 심층여과) 또는 접선 유동(tangential flow) 모드로 실시될 수 있었다. 오늘날 공업에 이용되는 공정에서, 원심분리 이후에는, 원심분리에 의해서는 제거될 수 없었던 불용성 불순물을 제거하기 위하여 심층여과가 전형적으로 잇따른다. 또한, 정화 효능을 향상시키기 위한 방법, 예컨대 석출이 이용될 수 있다. 불순물의 석출은 자극 감응성 중합체 또는 소분자에 기인한 응집, pH 조정(산 석출), 온도 변동, 상(phase) 변경과 같은 다양한 수단, 또는 이들 방법의 조합에 의해 달성될 수 있다. 본 발명에 기재된 일부 실시양태에서, 정화는 원심분리, 여과, 심층여과 및 석출의 2 이상의 조합을 포함한다.
본 발명에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "정제하는", "순도를 증가시키는", "분리하는" 또는 "단리하는"은 본원 발명에 기재된 방법을 이용하여 단편을 선택적으로 제거하는 것에 의해 표적 단백질의 단편에 대한 표적 단백질의 비율을 증가시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 표적 단백질을 함유하는 샘플의 일부로부터 바이러스를 제거하기 위하여 활성탄이 사용되는 것으로 밝혀지면, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 표적 단백질을 정제하기 위한 공정에 활성탄이 포함되므로, 표적 단백질의 순도를 증가시킨다.
용어 "바이러스" 또는 "바이러스들"은 생존 세포 내부에서만 복제할 수 있는 작은 감염성 물질 또는 입자를 지칭한다. 이들은 일반적으로 단백질 캡시드 내에 봉입된 핵산(RNA 또는 DNA) 및 경우에 따라 지질 엔빌로프(lipid envelope)로 구성된다.
용어 "파르보바이러스"는 선형의, 세그먼트화되지 않은 단일쇄 DNA 난엔빌로프(nonenveloped) 바이러스를 지칭하며, 그의 평균 게놈 크기는 5000개 뉴클레오타이드이고 또 직경은 18-26 nm이다. 본 발명에 기재된 방법에 사용된 예시적 파르보바이러스는 마우스의 미세 바이러스이다.
용어 "레트로바이러스"는 역전사 DNA 중간체를 통하여 감염 세포의 게놈 DNA에 유전자 정보를 통합할 수 있는 RNA 바이러스를 지칭한다. 용어 "레트로바이러스-유사 입자"는 그의 게놈에서 레트로바이러스-유도된 DNA의 일부를 갖는 세포에 의해 생성된 입자를 지칭한다. 이들 입자들은 레트로바이러스를 닮지만, 흔히 비감염성(noninfectious)이다. 본 발명의 실시예에서 사용된 숙주 외에서만 증식하는 쥐의 백혈병 바이러스는 모델 레트로바이러스 또는 레트로바이러스-유사 입자를 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 용어 "제거한다", "제거하는", "제거" 또는 "감소한다", "감소하는" 또는 "감소"는 정제될 표적 단백질을 함유하는 샘플에서 하나 이상의 바이러스의 양을 감소시키는 것을 지칭한다. 본 발명에 나타낸 바와 같이, 정제될 특정 표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 하나 이상의 바이러스를 제거하기 위하여 활성탄이 사용될 수 있다.
본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 용어 "플로우 쓰루(flow-through) 공정", "플로우 쓰루 모드" 및 "플로우 쓰루 크로마토그래피"는 샘플 중의 적어도 하나의 생성물(예컨대, 표적 단백질)은 활성탄을 통과하지만, 적어도 하나의 성분(예컨대, 바이러스)은 활성탄에 결합하는 생성물 분리 수법을 지칭한다.
통과시킬 샘플은 일반적으로 "이동상"이라 지칭한다. "플로우 쓰루 모드"는 일반적으로 등용매(isocratic) 작업(즉, 이동상의 조성이 변경되지 않는 공정)이다. 플로우 쓰루에 사용된 매질은 통상 표적 단백질 분자를 함유하는 동일 완충용액에 의해 미리 평형화(pre-equilibrated)된다. 정제 후, 상기 매질은 부가적인 양의 동일 완충액을 사용하여 씻겨져서 생성물 회수율을 증가시킨다.
용어 "완충액"은 그의 산-염기 콘쥬게이트 성분의 작용에 의해 pH 변동에 저항하는 용액을 지칭한다. 본원 발명에 기재된 방법에 사용될 수 있는 다양한 완충액은 Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation(1975)에 기재되어 있다. 상이한 완충액은 상이한 범위의 pH를 유지하며, 예를 들어 포스페이트 완충액은 pH 6.0 내지 8.0에서 통상 사용되는 한편, 더 높은 pH의 경우, 보레이트 완충액이 사용될 수 있고, 또 더 낮은 pH의 경우, 카보네이트 완충액이 사용될 수 있다. 당해 분야의 통상의 지식을 가진 사람들은 지속할 pH에 따라서 사용할 적합한 완충액을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 완충액의 비제한적인 예는 MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트, 카보네이트, 보레이트, 및 암모늄 완충액, 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다.
본 발명에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "세정 완충액" 또는 "평형화 완충액"은 샘플을 탄소질 물질과 접촉시키기 전에 탄소질 물질(예컨대, 활성탄)을 세정 또는 재평형화하기 위해 사용된 완충액을 지칭한다.
용어 "도전율"은 2개 전극 사이의 전류를 도전시키기 위한 수용액의 능력을 지칭한다. 용액에서, 전류는 이온 수송에 의해 흐른다. 따라서, 수용액에 존재하는 이온의 양이 증가함에 따라서, 그 용액은 더 높은 도전율을 가질 것이다. 도전율에 대한 측정 단위는 밀리지멘스/센티미터(mS/cm 또는 mS)이고, 또 상업적으로 입수가능한 도전율계(예컨대, 오리온으로부터 구입)를 이용하여 측정될 수 있다. 용액의 도전율은 이온의 농도를 변경하는 것에 의해 달리할 수 있다. 예를 들어, 용액 중의 완충제의 농도 및/또는 염(예컨대 NaCl 또는 KCl)의 농도를 달리하여 소망하는 도전율을 달성할 수 있다. 바람직하게는, 다양한 완충액의 농도를 변경하여 이하의 실시예에서와 같은 소망하는 도전율을 달성할 수 있다.
용어 "분획" 또는 "분획들"은 표적 단백질을 함유하는 샘플을 정제 단계에 처리한 후, 예컨대, 샘플을 활성탄 컬럼을 통과시킨 후 수집된 적은 부피의 액체를 지칭한다. 본 발명에 기재된 방법에서, 분획들은 표적 단백질을 함유하는 샘플의 일부를 컬럼에 로딩한 후 활성탄 컬럼으로부터 수집된다. 특정 지점에서 컬럼을 통과하는 바이러스와 같은 불순물의 양을 모니터링하기 위하여 분획이 사용된다. 컬럼을 통과하는 불순물의 양은 컬럼을 통과한 단백질의 양이 증가함에 따라 증가할 것이라고 전형적으로 예상된다. 정제 단계에서 사용된 물질의 공지 양의 물질, 예컨대 활성탄에 의해 처리될 수 있는 샘플 중의 단백질의 양은 하나 이상의 분획을 수집하고 상기 공지 양의 물질에 의해 제거된 예컨대 바이러스와 같은 불순물의 양을 결정하는 것에 의해 결정된다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "컬럼 로딩" 또는 "로딩"은 컬럼의 부피로 나눠진 컬럼을 통과한 용액 중의 표적 단백질의 질량에 상응하는 값이다. 컬럼을 통과한 표적 단백질의 질량은 샘플 중의 표적 단백질의 농도를 컬럼으로부터 수집된 샘플의 부피와 곱하여 산출된다.
용어 "로그 제거값(Log Removal Value)" 또는 "LRV"는 공지량의 불순물이 통과할 때 컬럼에 의해 제거된 불순물 양을 나타내는 값이다. LRV = log(Cf) - log(Cp), 이때 C f 는 공급 용액 중의 불순물의 농도이고 또 Cp는 컬럼을 통과한 후 공급 용액 중의 불순물의 양이다.
II. 본 발명에 기재된 방법에 사용하기 위한 예시적 활성탄 재료
활성탄을 이용하는 본 발명에 기재된 방법을 기초로 하여, 표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 파르보바이러스 및 레트로바이러스를 비롯한 바이러스의 제거를 위해 활성탄이 사용될 수 있는지 여부를 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성탄은 활성화된 목탄을 포함한다. 활성탄은 비제한적으로 석탄, 목재, 코코넛 껍질, 견과껍질, 및 토탄을 비롯한 다양한 공급원으로부터 유도될 수 있다. 활성탄은 제어된 분위기하에서 가열을 비롯한 물리적 활성화에 의해 또는 강한 산, 염기, 또는 산화제를 사용한 화학적 활성화에 의해 상기 물질로부터 생성될 수 있다. 상기 활성화 공정들은 고 표면적을 갖는 다공성 구조를 생성하여, 활성탄에 보다 큰 불순물 제거능을 부여한다. 활성화 공정들은 표면의 산도를 제어하도록 변형될 수 있다.
활성탄은 다양한 상업적 공급원으로부터 다수의 등급 및 포맷으로 입수가능하다. 활성탄의 상업적 공급자의 일부는 미드웨스트바코 코포레이션(미국 버지니아 리치몬드 소재); 노리트 아메리카스 인코포레이티드(미국 택사스 마샬 소재); 칼곤 카본 코포레이션(미국 펜실베니아 피츠버그 소재)과 같은 회사를 포함한다.
본 발명에 기재된 일부 실시양태에서, 활성탄은 본 발명에 기재된 바와 같은 셀룰로오스-함유 섬유성 매질에 포함된다.
본 발명에 따른 방법에 이용될 수 있는 상업적으로 입수가능한 활성탄 물질은 비제한적으로, Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재); Nuchar SA 20(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재); Nuchar SN(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재); Nuchar WV-B 30(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재); RGC Powder 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재); 노리트 Darco KB-G 활성탄(노리트 아메리카스 인코포레이티드, 미국 텍사스 마샬 소재); 노리트 CGP 슈퍼 활성탄(노리트 아메리카스 인코포레이티드, 미국 텍사스 마샬 소재); 노리트 A 슈프라 USP(노리트 아메리카스 인코포레이티드, 미국 텍사스 마샬 소재); 노리트 E 슈프라 USP(노리트 아메리카스 인코포레이티드, 미국 텍사스 마샬 소재); 노리트 C GRAN(노리트 아메리카스 인코포레이티드, 미국 텍사스 마샬 소재); 노리트 SX Ultra(노리트 아메리카스 인코포레이티드, 미국 텍사스 마샬 소재); 및 Chemviron Pulsorb PGC 활성탄(챔비론 카본, 벨기에 페루이 소재)을 포함한다.
활성탄의 2개의 주요 포맷은 분말형 및 과립형이다. 분말형(Powdered) 활성탄은 소형 및 보통 1 mm 미만 직경의 입자를 함유하며, 또 가장 흔히 액체의 정제에 사용된다. 과립형(granular) 활성탄은 큰 입자 크기를 가져서 더 작은 표면적을 가지므로, 확산 속도가 더 신속한 가스 정제에 사용되는 것이 바람직하다.
소비자 적용(물, 식품, 음료, 및 약제 정제와 같은)에서 활성탄의 사용과 관련한 안전성에 대한 중요한 고려사항은 추출가능한 화합물의 감소 및 제어이다. 음료수 및 음식 접촉적용을 위한 활성탄은 통상 물에 대한 모든 간접적 첨가제를 포괄하는 안전성 표준 ANSI/NSF Standard 61을 준수해야 한다. 또한, ASTM 표준 시험 방법 D6385는 활성탄 중에 존재하는 산 추출가능한 함량을 애싱(ashing)에 의해 결정하는 것을 개시하며 또 활성탄으로부터 추출가능한 양을 연구하고 감소시키기 위하여 이용될 수 있었다.
다양한 적용을 위해 다양한 활성탄 유형이 이용될 수 있다. 예를 들어, 미드웨스트바코 코포레이션은 이들의 능력, 표면 산도, 표적 분자에 대한 기공 접근성, 및 목적하는 용도가 상이한 적어도 12개 유형의 분말형 활성탄을 공급한다. 불순물 제거를 위한 활성탄 능력을 최대화하는 것이 일반적으로 바람직하다.
III. 본 발명에 기재된 방법에 사용된 예시적 바이러스
본 발명에 기재된 방법에 사용될 수 있는 예시적 바이러스는, 비제한적으로, 아데노바이러스, 칼리씨바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 소 설사 바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 오리 B형 간염 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 단순 포진 바이러스, 소의 감염성 비강기관염 바이러스, 위광견병(Pseudorabies) 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 시미안 바이러스(Simian virus) 타입 40, 파라인플루엔자 바이러스, 인간 파르보바이러스, 마우스의 미세 바이러스, 돼지 파르보바이러스, 개의 파르보바이러스, 뇌척수 심근염 바이러스, A형 간염 바이러스, 폴리오바이러스, 소 엔테로바이러스, 돼지 엔테로바이러스, 백시니아 (Vaccinia) 바이러스, 레오바이러스, 쥐의 백혈병 바이러스[숙주 외에서만 증식하는(xenotropic), 광숙주성(Amphotropic), 협숙주성(Ecotropic)], 인간 면역결핍 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 신드비스(Sindbis) 바이러스 및 샘리키삼림열(Semliki Forest) 바이러스를 포함한다.
바이러스는, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 샘플의 일부를 활성탄과 접촉시키기 전에 104 내지 108 PFU/mL 또는 TCID50/mL의 양으로, 표적 단백질을 함유하는 샘플의 일부에 부가된다.
일부 실시양태에서, 파르보바이러스를 대표하는 마우스의 미세 바이러스는 표적 단백질을 함유하는 샘플의 일부에 부가된다. 다른 실시양태에서, 레트로바이러스 또는 레트로바이러스-유사 입자를 대표하는, 숙주 외에서만 증식하는(xenotropic) 쥐의 백혈병 바이러스는 표적 단백질을 함유하는 샘플의 일부에 부가된다.
IV. 활성탄을 사용한 플로우 쓰루 공정
활성탄을 사용한 바이러스 제거를 결정하기 위해 사용될 수 있는 1개의 일반적인 플로우 쓰루 과정은 아래에 기재한다.
일부 실시양태에서, 크로마토그래피 장치, 예컨대, 컬럼,에 활성탄의 수성 슬러리를 로딩한다. 활성탄은 장치, 예컨대, 컬럼,에 건조 분말로서 로딩된 다음 수용액에 의해 습윤될 수도 있다. 그러나, 때때로 컬럼이 건조 팩킹될 때 활성탄 입자 사이에 있는 소형 공기 기포를 제거하는 것이 문제가 될 수 있다. 컬럼은 표적 단백질을 함유하는 샘플과 동일한 pH를 갖는 완충액에 의해 평형화된다( equilibrated). 이어 샘플은 15초 내지 10.0분의 컬럼 체류 시간을 초래하는 유속으로 활성탄 컬럼을 통과시킨다. 표적 단백질을 함유하는 용리액을 수집한다.
V. 샘플 중의 바이러스 양의 측정 방법
본 명세서에 기재된 바와 같이 샘플의 일부가 활성탄에 의해 처리되면, 샘플 중에 잔류하는 바이러스의 양은 본 명세서에 기재된 또는 당해분야에 공지된 하나 이상의 방법을 이용하여 측정된다. 이들 방법은, 비제한적으로, 50% 조직 배양 감염성 투여량(TCID50) 에세이, 플라크 형성 유닛(plaque-forming unit) 에세이, 포커스 형성 유닛 에세이, 50% 치사 투여량 에세이, 혈구응집 에세이, 형광 포커스 에세이(FFA), 비신코닌산 에세이(BCA), 일원평판 면역확산법(single radial immunodiffusion: SRID) 에세이, 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR), 효소-결합된 면역흡착 에세이(ELISA), 투과성 전자 현미경을 포함한다. 일반적으로, 사용되는 방법은 측정될 또는 검출될 바이러스에 따라 달라질 것이다. 본 발명에 기재된 방법에 혼입될 수 있는 에세이의 일부를 아래에 기재한다.
50% 조직 배양 감염성 투여량(TCID50)은 감염된 숙주 세포의 50%를 치사하시키는 또는 접종된 조직 배양 세포의 50%에서 세포독성 효과를 생성하는데 필요한 바이러스의 양을 정량하는 종점 희석 에세이이다. 배양 이후, 세포 치사(즉. 감염된 세포)의 퍼센트는 각 바이러스 희석에 대해 기록하며 수동으로 관찰하여 기록하며 그 결과는 TCID50를 수학적으로 산출하기 위해 이용된다.
바이러스 플라크 형성 유닛 에세이는 숙주 세포의 콘플루언트(confluent) 단층에 걸쳐 샘플의 다양한 희석물을 퍼지게 한 다음 적합한 배양 기간(일반적으로 3-14 일) 후, 단층에서 플라크의 수를 카운트하는 것에 의해 샘플에서 플라크 형성 유닛(PFU)의 수를 결정한다.
50% 치사 투여량(LD50) 에세이는 샘플의 희석물을 적합한 숙주 동물에 투여하여 동물의 50%를 치사시키기에 충분한 투여량을 결정하는 것에 의해 실시한다.
혈구응집 에세이는 샘플의 시리얼 희석물(serial dilution)을 1% 적혈구 용액과 함께 1시간 동안 배양한 다음 응집이 최초로 생긴 바이러스 희석물을 육안으로 결정하는 것에 의해 특정 바이러스(예컨대 인플루엔자)를 정량하기 위해 이용될 수 있다.
형광 포커스 에세이는, 감염성 유닛의 수가 세포 단층을 바이러스 성분에 특이적으로 결합하는 형광 항체에 의해 염색하는 것에 의해 결정되는 것을 제외하고는, 플라크 형성 유닛 에세이와 유사하게 실시한다. 얼마나 많은 세포가 감염되었는지를 계수하고 정량하기 위해 형광 현미경이 사용된다.
비신코닌산 에세이(BCA)는 샘플 중의 단백질의 전체 양을 측정하는 것에 의해 바이러스의 양을 정량한다. BCA 시약을 샘플에 부가하면, 단백질의 펩티드 결합은 정량적으로 Cu2 +를 Cu1 +로 환원시키며, 이는 옅은 청색을 생성한다. 2:1 비율의 BCA 킬레이트 Cu1 +는 562 nm에서 흡수하는 더욱 강하게 착색된 종을 초래한다. 562 nm에서 샘플의 흡수는 샘플 중의 괴상 단백질 농도를 결정하는데 이용된다. 에세이 결과는 분광광도계 또는 평판 판독기를 이용한 분석 이후 공지된 표준 곡선과 대조된다.
만씨니법으로도 공지된 일원평판 면역확산법 에세이(SRID)는, 반-고체 배지(예컨대 한천)에서 면역확산에 의해 특정 바이러스 항원의 양을 검출하는 단백질 에세이이다. 상기 배지는 관심있는 항원에 특이적인 항혈청(antiserum)을 함유하며 또 상기 항원은 디스크의 중심에 위치한다. 항원이 배지에 확산됨에 따라서 평형이 도달할 때까지 성장하는 석출물 링(precipitate ring)을 생성한다. 에세이 시간은 항원 및 항체의 평형 시간에 따라서 10시간 내지 수 일 범위일 수 있다. 상기 링으로부터 대역 직경(zone diameter)은 단백질 농도의 로그에 선형적으로 관련되고 또 정량을 위해 공지 단백질 표준에 대한 대역 직경과 비교된다.
정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR)은 샘플 중의 특정 핵산 서열의 양을 측정하는 수법이다. 바이러스 유전자 서열에 특이적인 프로브(probe)를 사용하는 것에 의해, 샘플 중의 바이러스 게놈의 수가 계수될 수 있다.
투과성 전자 현미경(TEM)은 샘플의 고해상도 확대 화상을 생성하는 것에 의해 바이러스를 정량하기 위해 이용될 수 있다. TEM 화상은 개별 바이러스 입자를 도시할 수 있고 또 정량적 화상 분석은 바이러스 농도를 결정하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명은 이하의 실시예에 의해 또한 예시되며, 이는 본 발명을 제한하지 않는다. 본 출원을 통하여 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용뿐만 아니라 도면은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
실시예
실시예 1. 마우스의 미세 바이러스의 생성
이 실시예는 파르보바이러스를 대표하는 마우스의 미세 바이러스(MVM)를 준비하는 공정을 설명한다. MVM을 MAB 용액에 첨가하고 활성탄에 의한 선택적 제거를 조사하였다.
높은 역가의 MVM는 페니실린(0.2 단위/mL), 스트렙토마이신(0.2 ㎍/mL), 및 2.0 mM L-글루타민과 함께 1%(v/v) 우태아 혈청(FBS)을 함유하는 Advanced/F12 듈베코 변형 이글 배지(DMEM) Invitrogen(카탈로그 번호 12634-028)에 콘플루언트(confluent) A9 세포(ATCC CCL-1.4)를 감염시키는 것에 의해 생성된다. 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 3일 배양한 후, 배지를 혈청을 함유하지 않는 동일 배지로 교체하고 7일 이상 감염을 계속시켰다.
세포 용균물을 수집하고 원심분리(300 g로 20분간)에 의해 정화시킨 다음 한외여과(EMD 밀리포어 코포레이션, 카탈로그 번호 UFC710008)에 의해 농축시켰다. 최종 농도는 SW28 로터를 이용하여 112,000g에서 베크만 원심분리에 의해 4시간 동안 초원심분리에 의해 얻었다. 플로우 쓰루 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 최종 폴리싱(polishing) 단계에 거치기 전에 바이러스 펠릿을 TNE 완충액(10mM Tris, 100 mM NaCl, 1mM EDTA, pH 7.5)에 재현탁시켰다. 정제된 바이러스는 첨가 연구에 사용하기 위하여 -80℃에서 완충액 중에 저장하였다.
실시예 2. 마우스의 미세 바이러스 농도의 측정
이 실시예는 용액 중의 마우스의 미세 바이러스(MVM)의 양을 측정하기 위한 공정을 기술한다. 이 공정은 MAB 용액에 첨가된 MVM이 활성탄에 의한 처리 이후에 얼마나 많이 잔존하는지를 결정하기 위하여 이용될 수 있다.
MVM 역가(titers)는 Bolton et al., Biotechnol. Appl. Biochem. Vol. 42, 2005, 133-142에 기재된 조직 배양 감염성 투여량 50%(TCID50) 에세이를 이용하여 결정된다. 시험 샘플을 세포독성과 바이러스 간섭을 감소시키기 위하여 세포 배양 배지를 사용하여 10배 연속희석물(10-fold serial dilutions)로 희석하고 또 각 희석물의 100 ㎕ 부분표본(aliquots)을 서브-콘플루언트(sub-confluent) 324K를 함유하는 96-웰 마이크로티터 플레이트의 16웰 각각에 부가하였다. PT 세포를 미국 커넷티컷 뉴헤이븐 예일 대학 의학부, Department of Laboratory Medicine and Genetics의 P. 타터살 교수로부터 입수하였다. 5% CO2 중 37℃에서 10-12 일간 배양한 후, 감염된 웰을 세포독성 효과(CPE)에 대해 육안으로 평가하였고 또 스페어만-쾨르버(Spearman-Koerber)법(Spearman, C., British Journal of Psychology, Vol 2, 1908, 227-242; K?rber, G., Arch. Exp. Pathol. Pharmak. Vol 162, 1931, 480-483)을 이용하여 역가를 결정하였다. 낮은 카운트가 예상되는 경우(여액 샘플), 대량 부피의 플레이팅 수법을 또한 이용하였다. 관찰되는 CPE의 빈도에 따라서, 이들 샘플의 역가는 상이한 허용되는 통계 방법 중의 하나를 이용하여 추산된다. 로그 감소치(Log reduction values: LRV)는 상류의 바이러스 로딩의 log 10을 결정하고 여액 중의 전체 바이러스의 log 10을 차감하는 것에 의해 산출하였다.
실시예 3. 숙주 외에서만 증식하는( Xenotropic ) 쥐의 백혈병 바이러스의 생산
이 실시예는 레트로바이러스 또는 레트로바이러스-유사 입자를 나타내는, 숙주 외에서만 증식하는 쥐의 백혈병 바이러스(XMuLV)를 생성하기 위한 공정을 설명한다. 이어 XMuLV를 MAB 용액에 첨가하고 또 활성탄에 의한 그의 선택적 제거를 조사하였다.
10%(v/v) 우태아 혈청(FBS)이 보충되고 페니실린(0.2 단위/mL), 스트렙토마이신(0.2 ㎍/mL), 및 2 mM L-글루타민을 갖는 DMEM 존재하에서 MV1Lu 세포(밍크 폐 세포 ATCC CCL-64)의 단일 플라스크를 감염시키는 것에 의해 고도로 정제된 XMuLV를 생성하였다. 이 감염된 세포 플라스크는 2.5%(v/v) 우태아 혈청(FBS)이 보충되고 페니실린(0.2 유닛/mL), 스트렙토마이신(0.2 ㎍/mL), 및 2 mM L-글루타민을 갖는 DMEM에서 반복해서 통과 및 팽창시켰다. 감염된 단층의 세포 배양액을 수집하고 또 플라스크에 페니실린(0.2 단위/mL), 스트렙토마이신(0.2 ㎍/mL), 및 2 mM L-글루타민을 함유하는 Advanced/F12 듈베코 변형 이글 배지(Adv DMEM) Invitrogen(카탈로그 번호 12634-028)를 공급하였다. 5% CO2 중 37℃에서 2 일간 배양한 후, 감염된 단층의 세포 배양액을 수집하고 또 그 단층에 페니실린(0.2 단위/mL), 스트렙토마이신(0.2 ㎍/mL), 및 2 mM L-글루타민을 갖는 Adv DMEM을 다시 공급하였다.
37℃ 및 5% 이산화탄소에서 2일간 배양한 후, 세포 배양액을 수집하였다. 모든 세포 배양액을 저속 원심분리(300 g로 20분간)에 의해 정화시키고, 0.45 ㎛ Durapore 필터를 통하여 여과하며 또 Sorvall 원심분리기의 GSA 로터를 이용하여 9500 x g에서 2 시간 동안 원심분리에 의해 정제하였다. 펠릿화된 바이러스는 무-단백질 저장 완충액에 재현탁시키고 또 첨가 연구에 사용하기 전까지 -80℃에서 자장하였다.
실시예 4. 숙주 외에서만 증식하는 쥐의 백혈병 바이러스 농도의 결정
이 실시예는 숙주 외에서만 증식하는 쥐의 백혈병 바이러스(XMuLV)의 용액 중의 양을 결정하기 위한 공정을 설명한다. 이 공정은 MAB 용액에 첨가된 XMuLV가 활성탄에 의해 처리된 후 얼마나 많이 잔류하는지 결정하기 위하여 이용된다.
XMuLV 역가는 Bolton et al., Biotechnol. Appl. Biochem. Vol. 42, 2005, 133-142에 기재된 조직 배양 감염성 투여량 50%(TCID50) 에세이를 이용하여 결정된다. 세포독성과 바이러스 간섭을 감소시키기 위하여 세포 배양 배지를 사용하여 시험 샘플을 10배 연속희석물(10-fold serial dilutions)로 희석하고 또 각 희석물의 100 ㎕ 부분표본을 서브-콘플루언트(sub-confluent) PG4 세포(ATCC CRL-2032)를 함유하는 96-웰 마이크로티터 플레이트의 16웰 각각에 부가하였다. 이들 플레이트를 원심분리(1800 rpm으로 60분간)에 의해 스핀접종(spinoculated)하였다. 5% CO2 중 37℃에서 7 일간 배양한 후, 감염된 웰을 세포독성 효과(CPE)에 대해 육안으로 평가하였고 또 스페어만-쾨르버(Spearman-Koerber)법(Spearman, C., British Journal of Psychology, Vol 2, 1908, 227-242; Koerber, G., Arch. Exp. Pathol. Pharmak. Vol 162, 1931, 480-483)을 이용하여 역가를 결정하였다. 낮은 카운트가 예상되는 경우(여액 샘플), 대량 부피의 플레이팅 수법을 또한 이용하였다. 관찰되는 CPE의 빈도에 따라서, 이들 샘플의 역가는 상이한 허용되는 통계 방법 중의 하나를 이용하여 추산된다. 로그 감소치(Log reduction values: LRV)는 상류의 바이러스 로딩의 log 10을 결정하고 여액 중의 전체 바이러스의 log 10을 차감하는 것에 의해 산출하였다.
실시예 5. MABI 단일클론 항체 용액으로부터 파르보바이러스를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 이용될 수 있는지 여부를 결정하는 방법
이 실시예는 마우스의 미세 바이러스(MVM)로 표시되는 파르보바이러스가 활성탄 컬럼을 통과(플로우 쓰루)하는 것에 의해 단일클론 항체(즉, MABI)를 함유하는 용액으로부터 제거되는지 여부를 결정하는 방법을 설명하는 대표적 실시예이다. 결과는 MABI 단일클론 항체 용액으로부터 파르보바이러스를 선택적으로 제거하기 위해 활성탄이 사용될 수 있음을 나타낸다.
MABI 용액에 MVM을 첨가한 다음 아래에 기재된 바와 같이 활성탄 컬럼을 통하여 통과(플로우 쓰루)시켰다.
CHO 세포로부터 생성된 MABI를 정화시킨 다음 단백질 A 친화성 크로마토그래피(25 mM 아세트산, 25 mM 글리신 HCl에 의해 용리)에 처리시킨다. 단백질 A 용리액의 pH는 1M Tris 염기를 사용하여 pH 7.0으로 조정하고 또 상기 용리액을 Stericup-GP 0.22 ㎛ Millipore Express PLUS 막(1 L, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하였다. MABI 공급물 pH 7.0에 실시예 1에 기재된 과정에 따라 생성된 초순수 등급 MVM을 표적 양 2.0E+06 TCID 50 /mL으로 첨가하였다. 첨가된 공급물은 활성탄과 접촉시키기 전에 0.22 ㎛ GP 익스프레스 필터(express filter)를 통하여 여과하였다.
유리 크로마토그래피 컬럼(Omnifit Benchmark 컬럼 10 mm/100 mm, 10 mm 직경, 100 mm 길이, SKU: 006BCC-10-10-AF, 디바 인더스트리스, 미국 커네티컷 06810 댄뷰리 소재)에 물 중에 슬러리화된 200 mg의 Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재)을 로딩하였다. 상기 컬럼은 컬럼에 물을 흘려주는 것에 의해 팩킹되어 0.8 mL의 팩킹 컬럼 부피를 초래한다.
상기 활성탄 컬럼은 약 10 CV의 25 mM Tris, pH 7.0에 의해 예비평형화(pre-equilibrated)시켰다. 바이러스 첨가된 MAB 공급물은 왓슨 말로우 카세트 펌프(Watson Marlow cassette pumps)를 이용하여 1 mL/분(0.8 CV/분)으로 활성탄 컬럼을 펌핑 통과시켰다. 1.0 kg/L 및 2.0 kg/L의 컬럼 로딩에서 용출액으로부터 2 ml 분획을 수집하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 바이러스 감염성 에세이에 의해 샘플을 적정하였다. 하기 표 I 및 도 1 에 요약한 바와 같이, 이 실험은 1.0 kg/L 및 2.0 kg/L 컬럼 로딩시 활성탄 컬럼을 통하여 MABI 용액을 흘려주는 것에 의해 MABI 용액으로부터 5.0 LRV 초과의 MVM로 표시되는 파르보바이러스가 제거됨을 나타낸다. 따라서, MABI를 함유하는 용액으로부터 파르보바이러스를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 이용될 수 있다.
표 I. 활성탄 컬럼 상에서 MABI의 다양한 컬럼 로딩에서 수집된 분획에서 측정된 MABI 함유 용액으로부터 제거된 MVM의 LRV. 이 실험은 2회 반복되며 수록된 값은 2개 값의 평균이다. 분획 중의 MVM의 농도는 검출 수준 아래임에 주목바람.
Figure pct00001
실시예 6. MABII 단일클론 항체 용액으로부터 파르보바이러스를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 방법
이 실시예는 마우스의 미세 바이러스(MVM)로 표시되는 파르보바이러스가 활성탄 컬럼을 통과하는 것에 의해 단일클론 항체(즉, MABII)를 함유하는 용액으로부터 제거되는지 여부를 결정하는 방법을 설명하는 실시예 5와 함께 두번째 대표적 실시예이다. 결과는 MABII 단일클론 항체 용액으로부터 파르보바이러스를 선택적으로 제거하기 위해 활성탄이 사용될 수 있음을 나타낸다.
MABII 용액에 MVM을 첨가한 다음 아래에 기재된 바와 같이 활성탄 컬럼을 통하여 통과(플로우 쓰루)시켰다.
CHO 세포로부터 생성된 MABII를 정화시킨 다음 단백질 A 컬럼 크로마토그래피(25 mM 아세트산, 25 mM 글리신 HCl에 의해 용리)에 처리시킨다. 단백질 A 용리액의 pH는 1M Tris 염기를 사용하여 pH 7.0으로 조정하고 또 상기 용리액을 Stericup-GP 0.22 ㎛ Millipore Express PLUS 막(1 L, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하였다. 이 공급물을 투석관(Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/Por 1-3, 3.5K MWCO, 54 mm FLAT 폭, 시리얼 번호: 132725, 스펙트럼 라보라토리스 인코포레이티드, 미국 캘리포니아 90220 란초 도밍게즈 소재)을 이용하여 25 mM Tris pH 7.0에 2회 투석시켰다. 이 용액을 Stericup-GP 0.22 ㎛ Millipore Express PLUS 막(1 L, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하였다. 투석된 MABII 공급물 pH 7.0에 실시예 1에 기재된 과정에 따라 생성된 초순수 등급의 MVM을 표적량 2.0E+06 TCID 50 /mL으로 첨가하였다. 첨가된 공급물은 활성탄과 접촉시키기 전에 0.22 ㎛ GP 익스프레스 필터를 통하여 여과하였다.
유리 크로마토그래피 컬럼(Omnifit Benchmark 컬럼 10 mm/100 mm, 10 mm 직경, 100 mm 길이, SKU: 006BCC-10-10-AF, 디바 인더스트리스, 미국 커네티컷 06810 댄뷰리 소재)에 물 중에 슬러리화된 200 mg의 Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재)을 로딩하였다. 상기 컬럼은 컬럼에 물을 흘려주는 것에 의해 팩킹되어 0.8 mL의 팩킹 컬럼 부피를 초래한다.
상기 활성탄 컬럼은 약 10 CV의 25 mM Tris, pH 7.0에 의해 예비평형화(pre-equilibrated)시켰다. 바이러스 첨가된 MAB 공급물은 왓슨 말로우 카세트 펌프(Watson Marlow cassette pumps)를 이용하여 1 mL/분(0.8 CV/분)으로 활성탄 컬럼을 펌핑 통과시켰다. 0.5 kg/L, 1.0 kg/L 및 2.0 kg/L의 컬럼 로딩에서 용출액으로부터 2 ml 분획을 수집하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 바이러스 감염성 에세이에 의해 샘플을 적정하였다.
하기 표 II 및 도 1 에 요약한 바와 같이, 이 실험은 0.5 kg/L, 1.0 kg/L 및 2.0 kg/L 컬럼 로딩시 활성탄 컬럼을 통하여 MABII 용액을 흘려주는 것에 의해 MABII 용액으로부터 1.0 LRV 초과의 MVM로 표시되는 파르보바이러스-유사 입자가 제거됨을 나타낸다. 따라서, 이 결과는 MABII 단일클론 항체 용액으로부터 파르보바이러스를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 이용될 수 있음을 나타낸다.
표 II. 활성탄 컬럼 상에서 MABII의 다양한 컬럼 로딩에서 수집된 분획에서 MABII로부터 제거된 MVM의 LRV.
Figure pct00002
실시예 7. MABIII 단일클론 항체 용액으로부터 파르보바이러스를 선택적으 로 제거하기 위하여 활성탄이 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 방법
이 실시예는 마우스의 미세 바이러스(MVM)로 표시되는 파르보바이러스가 활성탄 컬럼을 통과하는 것에 의해 단일클론 항체(즉, MABIII)를 함유하는 용액으로부터 제거되는지 여부를 결정하는 방법을 실시예 5 및 6과 함께 설명하는 세 번째 대표적 실시예이다. 결과는 MABIII 단일클론 항체 용액으로부터 파르보바이러스를 선택적으로 제거하기 위해 활성탄이 사용될 수 있음을 나타낸다.
MABIII 용액에 MVM을 첨가한 다음 아래에 기재된 바와 같이 활성탄 컬럼을 통하여 통과시켰다.
MABIII는 머크 세로노(Merck Serono)의해 정화된 세포 배양액으로 제공된다. MABIII는 단백질 A 크로마토그래피(pH 2.6에서 20 mM 글리신-염산 완충액에 의해 용리)에 의해 포획된다. MABIII 용리액의 pH는 1M Tris 염기를 사용하여 pH 7.0으로 조정하고 또 상기 용액을 Stericup-GP 0.22 ㎛ Millipore Express PLUS 막(1 L, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하였다. 이 공급물을 투석관(Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/Por 1-3, 3.5K MWCO, 54 mm FLAT 폭, 시리얼 번호: 132725, 스펙트럼 라보라토리스 인코포레이티드, 미국 캘리포니아 90220 란초 도밍게즈 소재)을 이용하여 25 mM Tris pH 7.0에 2회 투석시켰다. 이 용액을 Stericup-GP 0.22 ㎛ Millipore Express PLUS 막(1 L, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하였다.
MABIII 공급물 pH 7.0에 실시예 1에 기재된 과정에 따라 생성된 초순수 등급의 MVM을 표적량 2.0E+06 TCID 50 /mL으로 첨가하였다. 첨가된 공급물은 활성탄과 접촉시키기 전에 0.22 ㎛ GP 익스프레스 필터를 통하여 여과하였다.
유리 크로마토그래피 컬럼(Omnifit Benchmark 컬럼 10 mm/100 mm, 10 mm 직경, 100 mm 길이, SKU: 006BCC-10-10-AF, 디바 인더스트리스, 미국 커네티컷 06810 댄뷰리 소재)에 물 중에 슬러리화된 200 mg의 Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재)을 로딩하였다. 상기 컬럼은 컬럼에 물을 흘려주는 것에 의해 팩킹되어 0.8 mL의 팩킹 컬럼 부피를 초래한다.
상기 활성탄 컬럼은 약 10 CV의 25 mM Tris, pH 7.0에 의해 예비평형화(pre-equilibrated)시켰다. 바이러스 첨가된 MAB 공급물은 왓슨 말로우 카세트 펌프(Watson Marlow cassette pumps)를 이용하여 1 mL/분(0.8 CV/분)으로 활성탄 컬럼을 펌핑 통과시켰다. 0.5 kg/L, 1.0 kg/L 및 2.0 kg/L의 컬럼 로딩에서 용출액으로부터 2 ml 분획을 수집하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 바이러스 감염성 에세이를 이용하여 샘플을 적정하였다.
하기 표 III 및 도 1에 요약한 바와 같이, 이 실험은 0.5 kg/L, 1.0 kg/L 및 2.0 kg/L 컬럼 로딩시 활성탄 컬럼을 통하여 MABIII 용액을 흘려주는 것에 의해 MABIII 용액으로부터 1.0 LRV 초과의 MVM로 표시되는 파르보바이러스-유사 입자가 제거됨을 나타낸다. 따라서, 이 결과는 MABIII 단일클론 항체 용액으로부터 파르보바이러스-유사 입자를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 이용될 수 있음을 나타낸다.
표 III. 활성탄 컬럼 상에서 MABIII의 다양한 컬럼 로딩에서 수집된 분획에서 MABIII으로부터 제거된 MVM의 LRV
Figure pct00003
실시예 8. MABIV 단일클론 항체 용액으로부터 파르보바이러스를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 방법
이 실시예는 마우스의 미세 바이러스(MVM)로 표시되는 파르보바이러스가 활성탄 컬럼을 통과하는 것에 의해 단일클론 항체(즉, MABIV)를 함유하는 용액으로부터 제거되는지 여부를 결정하는 방법을 실시예 5, 6 및 7과 함께 설명하는 네 번째 대표적 실시예이다. 결과는 MABIV 단일클론 항체 용액으로부터 파르보바이러스를 선택적으로 제거하기 위해 활성탄이 사용될 수 있음을 나타낸다.
MABIV 용액에 MVM을 첨가한 다음 아래에 기재된 바와 같이 활성탄 컬럼을 통하여 통과시켰다.
MABIV 단일클론 항체는 머크 세로노 바이오디벨롭먼트(Merck Serono Biodevelopment)의해 10 mM 시트르산, 100 mM 글리신, 100 mM 염화 나트륨, 및 0.01% Tween을 함유하는 10 g/L 수용액으로서 입수하였다. 이 공급물을 투석관(Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/Por 1-3, 3.5K MWCO, 54 mm FLAT 폭, 시리얼 번호: 132725, 스펙트럼 라보라토리스 인코포레이티드, 미국 캘리포니아 90220 란초 도밍게즈 소재)을 이용하여 25 mM Tris pH 7.0에 2회 투석시켰다. 이 용액을 Stericup-GP 0.22 ㎛ Millipore Express PLUS 막(1 L, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하였다. MABIV 공급물 pH 7.0에 실시예 1에 기재된 과정에 따라 생성된 초순수 등급의 MVM을 표적 첨가량 2.0 E+06 TCID 50 /mL으로 첨가하였다. 첨가된 공급물은 활성탄과 접촉시키기 전에 0.22 ㎛ GP 익스프레스 필터를 통하여 여과하였다.
유리 크로마토그래피 컬럼(Omnifit Benchmark 컬럼 10 mm/100 mm, 10 mm 직경, 100 mm 길이, SKU: 006BCC-10-10-AF, 디바 인더스트리스, 미국 커네티컷 06810 댄뷰리 소재)에 물 중에 슬러리화된 200 mg의 Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재)을 로딩하였다. 상기 컬럼은 컬럼에 물을 흘려주는 것에 의해 팩킹되어 0.8 mL의 팩킹 컬럼 부피를 초래한다.
상기 활성탄 컬럼은 약 10 CV의 25 mM Tris, pH 7.0에 의해 예비평형화(pre-equilibrated)시켰다. 바이러스 첨가된 MAB 공급물은 왓슨 말로우 카세트 펌프(Watson Marlow cassette pumps)를 이용하여 1 mL/분(0.8 CV/분)으로 활성탄 컬럼을 펌핑 통과시켰다. 1.0 kg/L 및 2.0 kg/L의 컬럼 로딩에서 용출액으로부터 2 ml 분획을 수집하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 바이러스 감염성 에세이를 이용하여 샘플을 적정하였다.
하기 표 IV 및 도 1 에 요약한 바와 같이, 이 실험은 1.0 kg/L 및 2.0 kg/L 컬럼 로딩시 활성탄 컬럼을 통하여 MABIV 용액을 흘려주는 것에 의해 MABIV 용액으로부터 5.0 LRV 초과의 MVM로 표시되는 파르보바이러스가 제거됨을 나타낸다. 따라서, 이 결과는 MABIV 단일클론 항체 용액으로부터 파르보바이러스를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 이용될 수 있음을 나타낸다.
표 IV. 활성탄 컬럼 상에서 MABIV의 다양한 컬럼 로딩에서 수집된 분획에서 MABIV으로부터 제거된 MVM의 LRV. 이 실험은 2회 반복되며 수록된 값은 2개 값의 평균이다. 분획 중의 MVM의 농도는 검출 수준 아래임에 주목.
Figure pct00004
실시예 9. MABI 단일클론 항체 용액으로부터 레트로바이러스 및/또는 레트로바이러스-유사 입자를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 방법
이 실시예는 숙주 외에서만 증식하는 쥐의 백혈병 바이러스(XMuLV)로 표시되는 레트로바이러스 및/또는 레트로바이러스-유사 입자가 활성탄 컬럼을 통과하는 것에 의해 단일클론 항체(즉, MABI)를 함유하는 용액으로부터 제거되는지를 결정하는 방법을 설명하는 대표적 실시예이다. 결과는 MABI 단일클론 항체 용액으로부터 레트로바이러스 및 레트로바이러스-유사 입자를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 사용될 수 있음을 나타낸다.
MABI 용액에 XMuLV를 첨가하고 또 아래에 기재된 바와 같이 활성탄 컬럼을 통과시켰다.
CHO 세포에서 생성된 MABI는 정화된 다음 단백질 A 컬럼 크로마토그래피(25 mM 아세트산, 25 mM 글리신 HCl에 의해 용리)를 이용하여 단리된다. 단백질 A 용리액의 pH는 1M Tris 염기를 사용하여 pH 7.0으로 조정하고 또 상기 용액을 Stericup-GP 0.22 ㎛ Millipore Express PLUS 막(1 L, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하였다. MABI 공급물, pH 7.0에 실시예 3에 기재된 과정에 따라서 생성된 TFF 정제된 XMuLV를 표적 첨가량 1.0E+05 TCID59/mL로 첨가하였다. 이 첨가된 공급물은 활성탄과 접촉하기 전에 0.45 ㎛ Durapore 필터를 통하여 여과하였다.
유리 크로마토그래피 컬럼(Omnifit Benchmark 컬럼 10 mm/100 mm, 10 mm 직경, 100 mm 길이, SKU: 006BCC-10-10-AF, 디바 인더스트리스, 미국 커네티컷 06810 댄뷰리 소재)에 물 중에 슬러리화된 200 mg의 Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재)을 로딩하였다. 상기 컬럼은 컬럼에 물을 흘려주는 것에 의해 팩킹되어 0.8 mL의 팩킹 컬럼 부피를 초래한다.
상기 활성탄 컬럼은 약 10 CV의 25 mM Tris, pH 7.0에 의해 예비평형화(pre-equilibrated)시켰다. 바이러스 첨가된 MAB 공급물은 왓슨 말로우 카세트 펌프(Watson Marlow cassette pumps)를 이용하여 1 mL/분(0.8 CV/분)으로 활성탄 컬럼을 펌핑 통과시켰다. 0.5 kg/L, 1.0 kg/L 및 1.5 kg/L의 컬럼 로딩에서 용출액으로부터 2 ml 분획을 수집하였다. 실시예 4에 기재된 바와 같이 바이러스 감염성 에세이를 이용하여 샘플을 적정하였다.
하기 표 V 및 도 2에 요약한 바와 같이, 이 실험은 0.5 kg/L, 1.0 kg/L 및 1.5 kg/L 컬럼 로딩시 활성탄 컬럼을 통하여 MABI 용액을 흘려주는 것에 의해 MABI 용액으로부터 3.0 LRV 초과의 XMuLV로 표시되는 레트로바이러스 및 레트로바이러스-유사 입자가 제거됨을 나타낸다. 따라서, 이 결과는 MABI 단일클론 항체 용액으로부터 레트로바이러스=유사 입자를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 이용될 수 있음을 나타낸다.
표 V. 활성탄 컬럼 상에서 MABI의 다양한 컬럼 로딩에서 수집된 분획에서 MABI로부터 제거된 XMuLV의 LRV. 이 실험은 2회 반복되며 수록된 값은 2개 값의 평균이다. 분획 중의 XMuLV의 농도는 검출 수준 아래임에 주목.
Figure pct00005
실시예 10. MABII 단일클론 항체 용액으로부터 레트로바이러스 및/또는 레트로바이러스-유사 입자를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 방법
이 실시예는 XMuLV로 표시되는 레트로바이러스 및/또는 레트로바이러스-유사 입자가 활성탄 컬럼을 통과하는 것에 의해 단일클론 항체(즉, MABII)를 함유하는 용액으로부터 제거되는지 여부를 결정하는 방법을 실시예 9와 함께 설명하는 두 번째 대표적 실시예이다. 결과는 MABII 단일클론 항체 용액으로부터 레트로바이러스 및 레트로바이러스-유사 입자를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 사용될 수 있음을 나타낸다.
MABII 용액에 XMuLV를 첨가하고 또 아래에 기재된 바와 같이 활성탄 컬럼을 통과시켰다.
CHO 세포에서 생성된 MABII는 정화된 다음 단백질 A 컬럼 크로마토그래피(25 mM 아세트산, 25 mM 글리신 HCl에 의해 용리)를 이용하여 단리된다. 단백질 A 용리액의 pH는 1M Tris 염기를 사용하여 pH 7.0으로 조정하고 또 상기 용액을 Stericup-GP 0.22 ㎛ Millipore Express PLUS 막(1 L, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하였다. 상기 공급물을 투석관(Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/Por 1-3, 3.5K MWCO, 54 mm FLAT 폭, 시리얼 번호: 132725, 스펙트럼 라보라토리즈 인코포레이티드, 미국 캘리포니아 90220 란초 도밍게즈 소재)을 이용하여 25 mM Tris pH 7.0에 2회 투석시켰다. 상기 용액을 Stericup-GP 0.22 ㎛ Millipore Express PLUS 막(1 L, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하였다.
MABII 공급물, pH 7.0에 실시예 3에 기재된 과정에 따라서 생성된 초순수 등급의 XMuLV를 표적 첨가량 1.0E+06 TCID59/mL로 첨가하였다. 이 첨가된 공급물은 활성탄과 접촉하기 전에 0.45 ㎛ Durapore 필터를 통하여 여과하였다.
유리 크로마토그래피 컬럼(Omnifit Benchmark 컬럼 10 mm/100 mm, 10 mm 직경, 100 mm 길이, SKU: 006BCC-10-10-AF, 디바 인더스트리스, 미국 커네티컷 06810 댄뷰리 소재)에 물 중에 슬러리화된 200 mg의 Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재)을 로딩하였다. 상기 컬럼은 컬럼에 물을 흘려주는 것에 의해 팩킹되어 0.8 mL의 팩킹 컬럼 부피를 초래한다.
상기 활성탄 컬럼은 약 10 CV의 25 mM Tris, pH 7.0에 의해 예비평형화(pre-equilibrated)시켰다. 바이러스 첨가된 MAB 공급물은 왓슨 말로우 카세트 펌프(Watson Marlow cassette pumps)를 이용하여 1 mL/분(0.8 CV/분)으로 활성탄 컬럼을 펌핑 통과시켰다. 0.2 kg/L, 0.5 kg/L 및 1.0 kg/L의 컬럼 로딩에서 용출액으로부터 2 ml 분획을 수집하였다. 실시예 4에 기재된 바와 같이 바이러스 감염성 에세이를 이용하여 샘플을 적정하였다.
하기 표 VI 및 도 2에 요약한 바와 같이, 이 실험은 0.2 kg/L, 0.5 kg/L 및 1.0 kg/L 컬럼 로딩시 활성탄 컬럼을 통하여 MABII 용액을 흘려주는 것에 의해 MABII 용액으로부터 5.0 LRV 초과의 XMuLV로 표시되는 레트로바이러스 및 레트로바이러스-유사 입자가 제거됨을 나타낸다. 따라서, 이 결과는 MABII 단일클론 항체 용액으로부터 레트로바이러스 및 레트로바이러스-유사 입자를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 이용될 수 있음을 나타낸다.
표 VI. 활성탄 컬럼 상에서 MABII의 다양한 컬럼 로딩에서 수집된 분획에서 MABII로부터 제거된 XMuLV의 LRV. 분획 중의 XMuLV의 농도는 검출 수준 아래임에 주목.
Figure pct00006
실시예 11. MABIII 단일클론 항체 용액으로부터 레트로바이러스 및/또는 레트로바이러스-유사 입자를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 방법
이 실시예는 XMuLV로 표시되는 레트로바이러스 및/또는 레트로바이러스-유사 입자가 활성탄 컬럼을 통과하는 것에 의해 단일클론 항체(즉, MABIII)를 함유하는 용액으로부터 제거되는지 여부를 결정하는 방법을 실시예 9 및 실시예 10과 함께 설명하는 세 번째 대표적 실시예이다. 결과는 MABIII 단일클론 항체 용액으로부터 레트로바이러스 및 레트로바이러스-유사 입자를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 사용될 수 있음을 나타낸다.
MABIII 용액에 XMuLV를 첨가하고 또 아래에 기재된 바와 같이 활성탄 컬럼을 통과시켰다.
MABIII는 머크 세로노(Merck Serono)에 의해 정화된 세포 배양액으로 제공되었다. 단백질 A 크로마토그래피(pH 2.6에서 20 mM 글리신-염산 완충액에 의해 용리)를 이용하여 포획하였다. 용리액은 고수준의 HCP를 가지므로 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 두번째 정제하였다. 크로마토그래피 컬럼에 로딩하기 전에, MABIII 용액의 염화 나트륨 농도는 0.5 M로 상승하였다. MABIII 항체는 이어 25 mM 아세트산, 25 mM 글리신 HCl에 의해 용리시켰다. MABIII 용리액의 pH는 1M Tris 염기를 사용하여 pH 7.0으로 조정하고 또 그 용액을 Stericup-GP 0.22 ㎛ Millipore Express PLUS 막(1 L, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하였다. 상기 공급물은 투석관(Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/Por 1-3, 3.5K MWCO, 54 mm FLAT 폭, 시리얼 번호: 132725, 스펙트럼 라보라토리스 인코포레이티드, 미국 캘리포니아 90220 란초 도밍게즈 소재)을 이용하여 25 mM Tris pH 7.0에 2회 투석시켰다. 이 용액을 Stericup-GP 0.22 ㎛ Millipore Express PLUS 막(1 L, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하였다.
MAB III 공급물 pH 7.0에 실시예 3에 기재된 과정에 따라 생성된 초순수 등급의 XMuLV를 표적 첨가량 1.0E+06 TCID 50 /mL으로 첨가하였다. 첨가된 공급물은 활성탄과 접촉시키기 전에 0.45 ㎛ Durapore 필터를 통하여 여과하였다.
유리 크로마토그래피 컬럼(Omnifit Benchmark 컬럼 10 mm/100 mm, 10 mm 직경, 100 mm 길이, SKU: 006BCC-10-10-AF, 디바 인더스트리스, 미국 커네티컷 06810 댄뷰리 소재)에 물에 슬러리화된 200 mg의 Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재)를 로딩하였다. 상기 컬럼은, 컬럼을 통하여 물을 흘려주어 팩킹되어 0.8 mL의 팩킹된 컬럼 부피를 초래하였다.
상기 활성탄 컬럼은 약 10 CV의 25 mM Tris, pH 7.0에 의해 예비평형화(pre-equilibrated)시켰다. 바이러스 첨가된 MAB 공급물은 왓슨 말로우 카세트 펌프(Watson Marlow cassette pumps)를 이용하여 1 mL/분(0.8 CV/분)으로 활성탄 컬럼을 펌핑 통과시켰다. 0.2 kg/L, 0.5 kg/L 및 1.0 kg/L의 컬럼 로딩에서 용출액으로부터 2 ml 분획을 수집하였다. 실시예 4에 기재된 바와 같이 바이러스 감염성 에세이를 이용하여 샘플을 적정하였다.
하기 표 VII 및 도 2에 요약한 바와 같이, 이 실험은 0.2 kg/L, 0.5 kg/L 및 1.0 kg/L 컬럼 로딩시 활성탄 컬럼을 통하여 MABIII 용액을 흘려주는 것에 의해 MABIII 용액으로부터 5.0 LRV 초과의 XMuLV로 표시되는 레트로바이러스 및 레트로바이러스-유사 입자가 제거됨을 나타낸다. 따라서, 이 결과는 MABIII 단일클론 항체 용액으로부터 레트로바이러스 및 레트로바이러스-유사 입자를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 이용될 수 있음을 나타낸다.
표 VII. 활성탄 컬럼 상에서 MABIII의 다양한 컬럼 로딩에서 수집된 분획에서 MABIII로부터 제거된 XMuLV의 LRV. 분획 중의 XMuLV의 농도는 검출 수준 아래임에 주목.
Figure pct00007
실시예 12. MABIV 단일클론 항체 용액으로부터 레트로바이러스 및/또는 레트로바이러스-유사 입자를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 방법
이 실시예는 XMuLV로 표시되는 레트로바이러스 및/또는 레트로바이러스-유사 입자가 활성탄 컬럼을 통과하는 것에 의해 단일클론 항체(즉, MABIV)를 함유하는 용액으로부터 제거되는지 여부를 결정하는 방법을 실시예 9, 실시예 10 및 실시예 11과 함께 설명하는 네 번째 대표적 실시예이다. 결과는 MABIV 단일클론 항체 용액으로부터 레트로바이러스 및 레트로바이러스-유사 입자를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 사용될 수 있음을 나타낸다.
MABIV 용액에 XMuLV를 첨가하고 또 아래에 기재된 바와 같이 활성탄 컬럼을 통과시켰다.
MABIV 단일클론 항체는 머크 세로노 바이오디벨롭먼트(Merck Serono Biodevelopment)로부터 10 mM 시트르산, 100 mM 글리신, 100 mM 염화 나트륨, 및 0.01% Tween을 함유하는 10 g/L 수용액으로서 입수하였다. 이 공급물을 투석관(Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/Por 1-3, 3.5K MWCO, 54 mm FLAT 폭, 시리얼 번호: 132725, 스펙트럼 라보라토리스 인코포레이티드, 미국 캘리포니아 90220 란초 도밍게즈 소재)을 이용하여 25 mM Tris pH 7.0에 2회 투석시켰다. 이 용액을 Stericup-GP 0.22 ㎛ Millipore Express PLUS 막(1 L, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 01821 빌레리카 소재)을 통하여 여과하였다. MABIV 공급물 pH 7.0에 실시예 3에 기재된 과정에 따라 생성된 초순수 등급의 XMuLV를 표적량 1.0E+06 TCID 50 /mL으로 첨가하였다. 첨가된 공급물은 활성탄과 접촉시키기 전에 0.22 ㎛ GP 익스프레스 필터를 통하여 여과하였다.
유리 크로마토그래피 컬럼(Omnifit Benchmark 컬럼 10 mm/100 mm, 10 mm 직경, 100 mm 길이, SKU: 006BCC-10-10-AF, 디바 인더스트리스, 미국 커네티컷 06810 댄뷰리 소재)에 물 중에 슬러리화된 200 mg의 Nuchar HD 활성탄(미드웨스트바코 코포레이션, 미국 버지니아 리치몬드 소재)을 로딩하였다. 상기 컬럼은, 컬럼에 물을 흘려주는 것에 의해 팩킹되어 0.8 mL의 팩킹 컬럼 부피를 초래한다.
상기 활성탄 컬럼은 약 10 CV의 25 mM Tris, pH 7.0에 의해 예비평형화(pre-equilibrated)시켰다. 바이러스 첨가된 MAB 공급물은 왓슨 말로우 카세트 펌프(Watson Marlow cassette pumps)를 이용하여 1 mL/분(0.8 CV/분)으로 활성탄 컬럼을 펌핑 통과시켰다. 0.2 kg/L, 0.5 kg/L 및 1.0 kg/L의 컬럼 로딩에서 용출액으로부터 2 ml 분획을 수집하였다. 실시예 4에 기재된 바와 같이 바이러스 감염성 에세이를 이용하여 샘플을 적정하였다.
하기 표 VIII 및 도 2 에 요약한 바와 같이, 이 실험은 0.2 kg/L, 0.5 kg/L 및 1.0 kg/L 컬럼 로딩시 활성탄 컬럼을 통하여 MABIV 용액을 흘려주는 것에 의해 MABIV 용액으로부터 5.0 LRV 초과의 XMuLV로 표시되는 레트로바이러스 및 레트로바이러스-유사 입자가 제거됨을 나타낸다. 따라서, 이 결과는 MABIV 단일클론 항체 용액으로부터 레트로바이러스 및 레트로바이러스-유사 입자를 선택적으로 제거하기 위하여 활성탄이 이용될 수 있음을 나타낸다.
표 VIII. 활성탄 컬럼 상에서 MABIV의 다양한 컬럼 로딩에서 수집된 분획에서 MABIV로부터 제거된 XMuLV의 LRV. 이 실험은 2회 반복 실시하였고 수록된 값은 2개 값의 평균치이다. 분획 중의 XMuLV의 농도는 검출 수준 아래임에 주목해야 한다.
Figure pct00008
본 명세서는 참조로 본 명세서에 포함되는 명세서에 인용된 참고문헌의 가르침을 참조하여 대부분 잘 이해된다. 본 명세서에 내의 실시양태는 본 발명에서 실시예의 설명을 제공하며 그 범위를 제한하려는 것이 아니다. 당업자들은 다수의 다른 실시양태가 본 발명에 포함됨을 인지할 것이다. 모든 공개문헌 및 발명은 참고로 본 명세서에 포함된다. 참조로 포함된 자료가 본 본 발명의 명세서와 상반되거나 일치하지 않는 경우, 본 발명의 명세서에 개시된 내용이 이러한 자료를 대체할 것이다. 본 명세서에서 참고문헌의 인용은 그러한 참고문헌이 본 발명의 선행기술이라고 인정하는 것은 아니다.
다르게 나타내지 않는 한, 특허청구범위를 포함한 본 발명의 명세서에서 이용된 성분, 세포 배양물, 처리 조건 등과 관련된 양을 표현하는 모든 숫자는 예를 들어 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해된다. 따라서, 상반되게 나타내지 않는 한, 숫자 변수는 근사치이고 또 본 발명에 의해 얻고자 하는 소망하는 특성에 따라서 달라질 수 있다. 다르게 나타내지 않는 한, 일련의 요소 앞에 나오는 용어 "적어도"는 이 시리즈 중의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해된다. 당업자들은 통상적인 실험 이외에, 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 다수의 등가물을 이용하여 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 이하의 특허청구범위에 의해 포함되는 것으로 이해된다.
본 발명의 다수의 변형 및 변이는 당업자에게 분명한 바와 같이 본 발명의 정신과 범위로부터 벗어나지 않고 행해질 수 있다. 본 명세서에 기재된 특정 실시양태는 예시적으로만 기재된 것이고 어떠한 의미로든 제한을 의미하지 않는다. 명세서 및 실시예는 예시적으로만 간주되어야 하고, 본 발명의 진정한 범위 및 정신은 이하의 특허청구범위에 의해 표시된다.

Claims (17)

  1. (a) 표적 단백질을 포함하는 샘플의 일부를 제공하는 단계;
    (b) 상기 샘플의 일부에 바이러스를 104 내지 109 PFU/mL 범위의 양으로 부가하는 단계;
    (c) 상기 일부 샘플을 활성탄이 팩킹(packed)된 컬럼을 통과시키는 단계;
    (d) 상기 컬럼으로부터 표적 단백질을 함유하는 하나 이상의 분획을 수집하는 단계; 및
    (e) 상기 하나 이상의 분획에서 바이러스의 양을 측정하는 단계를 포함하고,
    하나 이상의 분획 중의 바이러스 양에서 적어도 3.0 LRV 정도 감소하는 것은 샘플로부터 바이러스 제거를 위해 활성탄이 이용될 수 있다는 표시인,
    표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 바이러스 제거를 위해 활성탄이 이용될 수 있는지 여부를 결정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 0.2 g/L 이상의 단백질 농도를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 0.5 g/L 이상의 단백질 농도를 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 1.0 g/L 이상의 단백질 농도를 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 3.0-10.0 범위의 pH 및/또는 0.5M 미만의 염 농도를 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 레트로바이러스-유사 입자, 및 파르보바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 마우스의 미세 바이러스 및 숙주 외에서만 증식하는(xenotropic) 쥐의 백혈병 바이러스로부터 선택되는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 세포 배양 공급물을 포함하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 세포 배양 공급물이 CHO 세포 배양 공급물인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 표적 단백질은 재조합 단백질인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 표적 단백질은 치료성 단백질인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 표적 단백질은 항체인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 정화 처리된 세포 배양 공급물을 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 정화된 세포 배양 공급물은 원심분리, 침강, 심층 여과(depth filtration), 스크린 여과, 응집, 자극 감응성 중합체의 사용 및 pH 변경으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법을 이용하여 얻어지는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 표적 단백질을 정제하는 동안 사용된 단백질 A 크로마토그래피 단계로부터 회수된 용리액을 포함하고, 상기 용리액은 표적 단백질을 포함하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 단계(e)는 50% 조직 배양 감염성 투여량(TCID50) 에세이, 플라크 형성 유닛 에세이, 포커스 형성 유닛 에세이, 치사 투여량 50% 에세이, 혈구응집 에세이, 형광 포커스 에세이(FFA), 비신코닌산 에세이(BCA), 일원평판 면역확산법 에세이(SRID), 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR), 효소-결합된 면역흡착 에세이(ELISA), 및 투과성 전자 현미경으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법을 적용하는 방법.
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