JP2018085993A - 活性炭を使用して標的タンパク質を含む試料からのウイルス除去を決定する方法 - Google Patents

活性炭を使用して標的タンパク質を含む試料からのウイルス除去を決定する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】標的タンパク質を含む試料からウイルスを除去するために活性炭を使用することができるかどうかを決定する方法の提供。【解決手段】前記標的タンパク質を含む試料から前記ウイルスを除去するために前記活性炭を使用できるかどうかを決定するための方法であって、試料が０．２ｇ／Ｌ以上のタンパク質濃度を有し、さらに、前記標的タンパク質を含む試料の一部を提供する工程、続いて１０４から１０９ＰＦＵ／ｍｌの範囲の量で前記試料の一部に前記ウイルスを添加する工程、次に前記活性炭を充填したカラムに試料の一部を流す工程、そして前記カラムから１以上のフロースルー画分を収集する工程、及び前記１つ以上のフロースルー画分中の前記ウイルス量を測定する工程を含み、少なくとも３．０ＬＲＶの、１以上のフロースルー画分中の前記ウイルス量の低減が、前記試料から前記ウイルスを除去するために前記活性炭を使用できることを示す、方法。【選択図】図１

Description

本発明は、標的タンパク質を含む試料からウイルスを除去するために活性炭を使用することができるかどうかを決定する方法に関する。
モノクローナル抗体等の標的タンパク質の精製のために最も一般的に用いられる方法は、典型的には、標的タンパク質を発現することができる操作された細胞株（例えば、哺乳動物または非哺乳動物細胞株）を使用する。そのような標的タンパク質は細胞培養培地中に分泌され得るか、またはそれは細胞内で発現させ、タンパク質を発現する細胞の溶解後に回収することができる。
標的タンパク質は、典型的には、様々な不純物、例えば、細胞、細胞片、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質から標的タンパク質を分離するための一連の精製工程の対象となる必要がある。
典型的な精製工程は、通常、標的タンパク質を単離または精製するための一つ以上のクロマトグラフィー工程を含む、様々な工程に細胞培養フィードもしくは媒体（分泌標的タンパク質の場合）または細胞溶解物（細胞内標的タンパク質の場合）を供することを伴う。例えば、分泌標的タンパク質、例えば、モノクローナル抗体の場合には、細胞培養培地は、典型的には、清澄化工程、続いて捕捉工程、続いてカチオン交換結合／溶出クロマトグラフィー工程およびアニオン交換クロマトグラフィー工程の１つ以上に供される。
ＣＨＯ細胞は、一般に、モノクローナル抗体の産生のために使用される。典型的なＣＨＯ細胞培養フィードは１０３から１０９個のウイルスまたはウイルス様粒子を含んでおり、そのようなウイルスまたはウイルス様粒子の除去は精製方法の際特に重要である。何故ならば標的タンパク質の多くは、患者に直接投与される治療用タンパク質であるからである。一般的に、ウイルス除去は精製方法全体によって達成される総ウイルス除去の量に基づいて評価されるが、これは特に規制当局の承認が必要な場合には、１８ ｌｏｇ以上であることが望ましい。
一般に、標準的な精製方法の各工程は、ある量のウイルスを除去するように示されているが、その量は１８ ｌｏｇより通常少なく、従って、追加の精製工程を適切なウイルス除去のための方法に含めなければならない。適切なウイルス除去が精製方法における様々な精製工程によって達成されることを確実にするために、特定の精製工程が特定の量のウイルスを除去できるかどうかを確立することが重要である。
試料、例えば、バイオテクノロジー製品のウイルス安全性評価のための指導は、日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）の主催の下に準備された「Ｈａｒｍｏｎｉｚｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔａｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ： Ｑ５Ａ Ｖｉｒａｌ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｆｒｏｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｏｒｉｇｉｎ． Ｆｅｄ． Ｒｅｇ． ６３（１８５） ２４ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９８」に見出せる。
活性炭は、以前にウイルスを除去するための浄水用途に使用されており、同様に生物学的流体、例えば、血液からウイルスを含むおそれのある物質の非特異的除去のための濾過ユニットに組み込まれている（米国特許第８１２３９４０号参照）。
さらに、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願番号第１３／５６５４６３（出願日２０１２年８月２日）は、目的の生体分子（例えば、抗体）を含む試料からタンパク性不純物（例えば、宿主細胞タンパク質）およびＤＮＡを除去するための他の媒体との組み合わせで活性炭の使用を記載する。
最後に、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願番号第６１／７６９２６９（出願日２０１３年２月２６日）は、溶液条件を変化させることにより、タンパク質の混合物から１つのタンパク質を選択的に除去するための活性炭の使用を記載する。
米国特許第８１２３９４０号明細書 米国特許出願第１３／５６５４６３号 米国特許出願第６１／７６９２６９号
Ｈａｒｍｏｎｉｚｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔａｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ： Ｑ５Ａ Ｖｉｒａｌ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｆｒｏｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｏｒｉｇｉｎ． Ｆｅｄ． Ｒｅｇ． ６３（１８５） ２４ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９８
本発明は、少なくとも部分的には、炭素が、標的タンパク質、例えば、モノクローナル抗体を含む、特定の試料の場合には、ウイルス量を減少させるために活性炭が使用できるとの驚くべきかつ予想外の発見に基づいている。活性炭は、以前に浄水中にいくつかのウイルスを除去すると説明されてきたが、活性炭で処理される試料は、一般に、タンパク質の濃度が低いか、全くタンパク質を含んでいない。本発明は、少なくとも部分的には、活性炭が、高いタンパク質濃度を含む特定の試料（例えば、単離すべき標的タンパク質を含む細胞培養フィードまたは細胞溶解物）中のパルボウイルス、レトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子をはじめとするウイルスに特異的に結合するとの予想外の驚くべき発見に基づいている。従って、特定の精製方法に活性炭を含めることによって、典型的にはタンパク質精製中に使用される１以上の高価なクロマトグラフィー工程（例えば、カチオン交換結合／溶出クロマトグラフィー工程）の潜在的な廃止がもたらされ得る。
様々な実施形態では、標的タンパク質を含む試料からウイルスを除去するために活性炭を使用できるかどうかを決定するための方法が提供され、この方法は以下の工程：（ａ）標的タンパク質を含む試料の一部を提供する工程；（ｂ）１０４から１０９ＰＦＵ／ｍｌの範囲の量で試料の一部にウイルスを添加する工程；（ｂ）活性炭を充填したカラムに試料の一部を流す工程；（ｃ）カラムから標的タンパク質を含む１以上の画分を収集する工程；および（ｄ）１つ以上の画分中のウイルス量を測定する工程を含み、少なくとも３．０ＬＲＶの、１以上の画分中のウイルス量の低減によって、試料からウイルスを除去するために活性炭を使用できることが示される。
いくつかの実施形態において、試料は０．２ｇ／Ｌ以上のタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態において、試料は３．０から１０．０の範囲内のｐＨおよび／または０．５Ｍ未満の塩濃度を有する。
いくつかの実施形態において、試料は細胞培養フィードを含む。特定の実施形態において、細胞培養フィードはＣＨＯ細胞培養フィードである。
いくつかの実施形態において、試料は、清澄化に供された細胞培養用フィードを含む。清澄化の方法としては、遠心分離、沈降、深層濾過、スクリーン濾過、凝集、刺激応答性ポリマーの使用およびｐＨ変化が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、試料は、標的タンパク質の精製の間に使用されるタンパク質Ａクロマトグラフィー工程から回収した溶出液を含む。
いくつかの実施形態では、試料は細胞内で標的タンパク質を発現する細胞から得られた細胞溶解物を含む。
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は組換えタンパク質である。例示的な標的タンパク質としては、免疫グロブリン、例えば、モノクローナル抗体、Ｆｃ含有タンパク質、および非免疫グロブリンタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、標的タンパク質は治療用タンパク質である。
図１は、４つの異なる種類のモノクローナル抗体試料に対して観察されるように、活性炭のカラムに溶液を流すことにより、モノクローナル抗体の溶液から、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）で表される、パルボウイルスを除去できるかどうかを決定するための実験の結果を示すグラフである。ＭＶＭは１．０ｋｇ／Ｌおよび２．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で、二つの別個のモノクローナル抗体溶液、ＭＡＢＩおよびＭＡＢＩＶに対し５．０ＬＲＶよりも多い量で除去される。しかし、ＭＶＭは０．５ｋｇ／Ｌ、１．０ｋｇ／Ｌおよび２．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で、２つの他のモノクローナル抗体溶液、ＭＡＢＩＩおよびＭＡＢＩＩＩに対し、１．０ＬＲＶよりも多い量では除去されない。Ｘ軸は、画分が採取された時点での活性炭１リットル（Ｌ）当たりのカラムに充填されるモノクローナル抗体の量（ｋｇで表される）を示し、Ｙ軸は、画分中のＭＶＭウイルスの対数減少値を示す。上向き矢印は、試料中のウイルスの濃度が画分の検出限界未満であることを示す。 図２は、４つの異なる種類のモノクローナル抗体試料に対して観察されるように、活性炭のカラムに流すことにより、モノクローナル抗体の溶液から、異種指向性マウス白血病ウイルス（ＸＭｕＬＶ）で表される、レトロウイルスまたはレトロウイルス様粒子を除去できるかどうかを決定するための実験の結果を示すグラフである。ＸＭｕＬＶは０．５ｋｇ／Ｌ、１．０ｋｇ／Ｌおよび１．５ｋｇ／Ｌのカラム充填で、ＭＡＢＩ抗体溶液に対し、３．０ＬＲＶよりも多い量で除去される。ＸＭｕＬＶは，抗体溶液ＭＡＢＩＩ、ＭＡＢＩＩＩおよびＭＡＢＩＶの場合には、０．２ｋｇ／Ｌ、０．５ｋｇ／Ｌおよび１．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で、５．０ＬＲＶよりも多い量で除去される。Ｘ軸は、画分が採取された時点での活性炭１リットル（Ｌ）当たりのカラムに充填されるモノクローナル抗体の量（ｋｇで表される）を示し、Ｙ軸は、画分中のＸＭｕＬＶウイルスの対数減少値を示す。上向き矢印は、試料中のウイルスの濃度が画分の検出限界未満であることを示す。
上述したように、本発明は、少なくとも部分的には、例えば、精製すべき標的タンパク質を含有する特定の細胞培養フィードまたは細胞溶解物のような特定の高タンパク質濃度の試料からウイルスを除去するために活性炭を使用できるという新規かつ予想外の発見に基づいている。
治療用タンパク質を含むバイオリアクターフィード中のウイルスの典型的な濃度は、一般的に非常に低い。しかし、精製された治療用タンパク質で治療されている患者にとっては、これらの低レベルは依然として危険であり得る。タンパク質精製中のウイルスの十分な除去を確実にするためには、特定の精製工程が、精製されるべきタンパク質を含む試料からウイルスを除去するか否かを決定し、このような精製工程により除去されるウイルスの量を決定することが重要である。
そうするために、代表的なウイルスを、既知の濃度で治療用タンパク質を含む溶液に添加し、次いで、治療用タンパク質のウイルス添加溶液は、特定の精製工程に供される。精製工程の後に、溶液中の代表的なウイルスの量が決定される。精製工程による適切なウイルス除去は、ウイルスのレベルがそのウイルスの検出限界よりも低いまたは精製工程後の溶液では検出不能であることにより示される。パルボウイルスおよびレトロウイルスは、一般的に、ＣＨＯ細胞で発現される治療用タンパク質の精製の際に測定される２種類のウイルスである。
典型的には、精製工程の際にタンパク質を含有する試料から除去されたウイルスの量を決定するために使用される方法は、試料体積全体の代わりに試料の一部を使用する。特定の精製工程が、標的タンパク質を含む試料の一部からウイルスを除去することが可能であると決定されると、精製工程は、使用される精製媒体の割合および標的タンパク質が同じに保たれている限り、試料からウイルスを除去するであろうと仮定することができる。
本発明は、特定の試料から特定のウイルスを除去するために活性炭を使用できるかどうかを決定する方法を提供する。本明細書に記載の方法を用いて、本明細書の実施例で示されるように、活性炭が、標的タンパク質を含む特定の試料からウイルスを除去することが可能であるかどうかを決定することができる。従って、標的タンパク質を含有するこれらの試料に対し、活性炭がウイルスを除去できる場合には、その後その試料の精製工程に活性炭を組み込むことができる。
本発明がより容易に理解されるようにするために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明の全体にわたって記載される。
Ｉ． 定義
本明細書において互換的に使用される用語「活性炭（ａｃｔｉｖｅ ｃａｒｂｏｎまたはａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ）」は、その細孔構造を強化するために処理された炭素質材料を意味する。活性炭は、時には活性炭（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｈａｒｃｏａｌ）と呼ばれる。活性炭は、非常に高い表面積を有する多孔質の固体である。これらは、石炭、木材、ヤシ殻、木の実の殻、泥炭をはじめとする種々の供給源から得ることができる。活性炭は、制御された雰囲気下での加熱を伴う物理的な活性化、または強酸、塩基、または酸化剤を使用する化学的活性化を使用して、これらの材料から製造することができる。活性化方法は、不純物除去のための高い能力を活性炭に与える高い表面積を有する多孔質構造を作り出す。活性化方法は、表面の酸性度を制御するために変更することができる。
典型的な活性化方法は、樹脂廃棄物、石炭、石炭コークス、石油コークス、亜炭、高分子材料、ならびにパルプおよび紙をはじめとするリグノセルロース材料、パルプの製造からの残留物、木材（木材チップ、おがくずおよび木粉）、アーモンド殻とやし殻のようなナッツ殻、殻粒、（オリーブおよびサクランボの種のような）フルーツピット等の炭素源を熱工程（例えば、酸化気体を有する）または化学工程（例えば、リン酸、または塩化亜鉛等の金属塩）に供することを含む。リン酸（Ｈ３ＰＯ４）を用いて木質系炭素の化学的活性化に関与する例示的な方法は、ＵＳ特許Ｎｏ． Ｒｅ．３１０９３に開示されており、炭素の脱色、ガス吸着能力の改善をもたらす。また、米国特許第５１６２２８６号は、特に緻密であり、ナッツの殻、核果、殻粒等の比較的高い（３０％）リグニン含量を含有する木質系材料のリン酸活性化を教示する。リグノセルロース材料のリン酸活性化はまた、高活性および高密度の炭素を調製する工程として、米国特許第５２０４３１０号に記載されている。この段落に記載された特許の各々の教示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ほとんどの他の吸着材料とは対照的に、活性炭は、比較的弱いファンデルワールスまたはロンドン分散力を使用して分子と相互作用すると考えられている。典型的な市販の活性炭生成物は、当技術分野で周知の方法であるブルナウアー−エメット−テラー（「ＢＥＴ」）法に基づく窒素吸着によって測定される、少なくとも３００ｍ２／ｇの表面積を示す。
なお、活性炭は以前、液体およびガスの精製方法、ならびに不純物と結合することによる他の不純物からの組換えにより発現した抗体の精製方法に使用されてきたが、それは以前、高タンパク質濃度の試料（即ち、＞０．２ｇ／Ｌのタンパク質濃度）からウイルス、特にパルボウイルスおよびレトロウイルスを除去するために使用されていない。従って、活性炭は、いくつかの例では、治療用タンパク質、例えば、モノクローナル抗体を精製するための方法の際にウイルスを除去するためのコスト効果のある解決法を提供する。
本発明は、標的タンパク質を含む試料からウイルスを除去するために活性炭を使用できるかどうかを決定するための方法を提供する。活性炭は、本明細書で提供される方法に基づいて、全ての試料においてウイルスの効果的な除去をもたらすわけではないので、どの試料の場合に、複数のウイルスまたは特定の種類のウイルスの除去に活性炭を使用できるかについて容易に決定することができる。
本明細書で互換的に使用される用語「目的のタンパク質」および「標的タンパク質」は、ウイルスを含む組成物から精製されるべきタンパク質またはポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、患者に投与される治療用タンパク質である。
一般に、ウイルス除去の結果として、標的タンパク質の全体的な純度が増加する。標的タンパク質は、免疫グロブリンまたは非免疫グロブリンタンパク質であってもよく、分泌タンパク質または細胞内タンパク質であってもよい。いくつかの 実施形態では、標的タンパク質は、免疫グロブリンタンパク質、例えば、モノクローナル抗体である。
標的タンパク質の他の例には、組換えタンパク質を含み、組換えヒト成長ホルモン、組換えヒトインスリン、組換え卵胞刺激ホルモン、組換え型第ＶＩＩ因子（抗血友病因子）、組換えヒトエリスロポエチン、組換え顆粒球コロニー刺激因子、組換えアルファ−ガラクトシダーゼａ、組換えイズロニダーゼ、組換えガルサルファーゼ、組換えドルナーゼアルファ、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子、組換えヒトインターフェロン、組換えインスリン様成長因子１、および組換えアスパラギナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の他の実施形態では、標的タンパク質は、ヒトの血液または他の生理的液体由来のタンパク質である。このようなタンパク質の例としては、免疫グロブリンＧおよびＭ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アンチトロンビンＩＩＩ、およびアルファ−Ｉ−抗トリプシンが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」または「ＩｇＧ」または「抗体」（本明細書において互換的に使用される）は、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる基本的な４ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指し、鎖は、例えば、抗原に特異的に結合する能力を有する鎖間ジスルフィド結合により安定化されている。用語「単鎖免疫グロブリン」または「単鎖抗体」（本明細書において互換的に使用される）は、１つの重鎖および１つの軽鎖からなる２ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指し、鎖は、例えば、抗原に特異的に結合する能力を有する鎖間ペプチドリンカーにより安定化される。用語「ドメイン」は、例えば、β-プリーツシートおよび／または鎖内ジスルフィド結合によって安定化されたペプチドループ（例えば、３から４ペプチドループを含む）を含む、重鎖または軽鎖ポリペプチドの球状領域を指す。ドメインはさらに、「定常」ドメインの場合、様々なクラスメンバーのドメイン内の配列変動の相対的欠如に基づいて、または「可変」ドメインの場合、様々なクラスメンバーのドメイン内の重要な変動に基づいて、「定常」または「可変」と呼ばれている。抗体またはポリペプチド「ドメイン」は、しばしば抗体またはポリペプチド「領域」と当技術分野では互換的に呼ばれる。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体の重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域または「ＶＨ」ドメインと互換的に呼ばれる。
免疫グロブリンまたは抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、モノマーまたはポリマー形態で存在することができ、例えば、五量体形態で存在するＩｇＭ抗体および／または単量体、二量体もしくは多量体形態で存在するＩｇＡ抗体であることができる。免疫グロブリンまたは抗体は、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含むこともできる。
用語「Ｆｃ領域」および「Ｆｃ領域含有タンパク質」とは、タンパク質が免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖定常領域またはドメイン（先に定義したようＣＨおよびＣＬ領域）を含むことを意味する。「Ｆｃ領域」を含むタンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を有することができる。そのようなＣＨ２／ＣＨ３領域等の「Ｆｃ領域」は、例えば、タンパク質Ａまたはその機能的変異体等の親和性リガンドに選択的に結合することができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域含有タンパク質は、タンパク質Ａまたはその機能的誘導体、変異体またはその断片に特異的に結合する。他の実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、タンパク質Ｇまたはタンパク質Ｌ、またはその機能的誘導体、変異体またはその断片に特異的に結合する。
上述のように、いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、Ｆｃ領域含有タンパク質、例えば、免疫グロブリンである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域含有タンパク質は、別のポリペプチドまたはその断片に融合した免疫グロブリンのＦｃ領域を含む組換えタンパク質である。
一般に、免疫グロブリンまたは抗体は、対象の「抗原」を指向する。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害に罹患している哺乳動物への抗体の投与によってその哺乳動物における治療上の利益がもたらされ得る。
本明細書において互換的に使用される用語「モノクローナル抗体」または「Ｍａｂ」は、「実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、即ち、集団内の個々の抗体は少量で存在し得る、可能性のある自然に生じる突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を指向する。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を指向する。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるものとして抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７号参照）によって作製することができる。「モノクローナル抗体」は、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。モノクローナル抗体はまた、「モノクローナル抗体」または「ＭＡｂ」、「ｍａｂ」、「ｍＡｂ」または「ＭＡＢ」と呼ばれることもある。
モノクローナル抗体はさらに、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種由来または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含むことができ、鎖の残りは、それらが所望の生物学的活性を示す限り、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体およびそのような抗体の断片における対応する配列と同一又は相同である。（米国特許第４８１６５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）からの超可変領域の残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、実質的にすべての少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、すべてのまたは実質的にすべての超可変ループが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むことができる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ、Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
本明細書で使用する用語「溶液」または「試料」は、本明細書に記載の方法を用いて活性炭が組成物からウイルスを除去するのに使用できることが実証された後、活性炭を用いたウイルス除去に供される標的タンパク質を含む組成物を意味する。いくつかの実施形態において、試料は、細胞培養フィード、例えば、分泌性標的タンパク質、例えば、モノクローナル抗体を発現する哺乳動物細胞培養（例えば、ＣＨＯ細胞）からのフィードを含む。いくつかの実施形態では、試料は、細胞内で標的タンパク質を発現する哺乳動物または非哺乳動物細胞から得られた細胞溶解物を含む。いくつかの実施形態では、試料は、清澄化に供された細胞培養フィードを含む。いくつかの実施形態では、試料は、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーカラムからの溶出液を含む。試料はまた、目的タンパク質または標的タンパク質を産生するために使用される非哺乳動物発現系を含む。
本明細書で使用する用語「非哺乳動物発現系」は、治療用タンパク質を生成するために用いられるすべての宿主細胞または生命体を指し、宿主細胞または生命体は非哺乳動物起源である。目的のタンパク質または標的タンパク質を産生するために使用される非哺乳動物発現系の例としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母、大腸菌、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）のような細菌、ヨトウガ細胞、バキュロウイルスが感染した昆虫細胞のような昆虫細胞、および藻細胞が挙げられる。
用語「試料の部分」は、本明細書に記載されるように、試料からウイルスを除去するために活性炭を使用できるかどうかを決定するために使用される、標的タンパク質を含む試料の一部を指す。一般に、活性炭が、標的タンパク質を含む試料の一部から複数のウイルスまたは特定の種類のウイルスを除去することができることが実証されると、活性炭は、その後、試料から複数のウイルスまたは特定の種類のウイルスを除去するために、標的タンパク質のための精製方法に組み込むことができる。
本明細書で使用される用語「清澄化する」、「清澄化」および「清澄化工程」は、ＮＴＵ（ネフェロ分析濁度ユニット）において測定された、標的タンパク質含有溶液の懸濁粒子および／またはコロイドを除去し、それによって濁度を低減する工程を指す。清澄化は、遠心分離または濾過をはじめとする様々な手段によって達成することができる。濾過は通常フロー（例えば、深層濾過）または接線流モードで行うことができる一方で、遠心分離は、バッチまたは連続モードで行うことができる。今日の産業で使用される方法において、遠心分離は、典型的には遠心分離により除去されていない可能性がある不溶性不純物を除去することを目的として深層濾過が続く。また、清澄化効率を向上させるための方法、例えば、沈殿を使用することができる、不純物の沈殿は、凝集、ｐＨ調整（酸沈殿）、温度変化，刺激応答性ポリマーまたは小分子による相変化、またはこれらの方法の任意の組み合わせによって等、様々な手段によって実施することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態において、清澄化は、遠心分離、濾過、深層濾過および沈殿の２つ以上の任意の組み合わせを含む。
本明細書中で交換可能に使用される用語「精製」、「純度を高めること」、「分離」または「単離」は、試料から１つ以上のウイルスを除去することにより、試料中の１つ以上のウイルスに対する標的タンパク質の比を増加させることを指す。典型的には、本明細書に記載されるように、活性炭が標的タンパク質を含む試料からウイルスを除去するために使用することができると決定されると、活性炭はその標的タンパク質を精製する方法に含まれ、それによって標的タンパク質の純度を高める。
用語「ウイルス（単数または複数）」は、生きた細胞の内部でのみ複製することができる小型の感染体または粒子を指す。これらは一般に、タンパク質キャプシドの内側に封入された核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、および場合により脂質エンベロープから構成される。
用語「パルボウイルス」は、５０００ヌクレオチドの平均ゲノムサイズおよび１８から２６ｎｍの直径を有する、直鎖、非セグメント化一本鎖ＤＮＡ非エンベロープウイルスを指す。本明細書に記載される方法において使用される典型的なパルボウイルス、マウスの微小ウイルスである。
用語「レトロウイルス」は、逆転写されたＤＮＡ中間体を介して感染した細胞のゲノムＤＮＡに、その遺伝情報を統合することが可能なＲＮＡウイルスを指す。用語「レトロウイルス様粒子」は、そのゲノム中にレトロウイルス由来のＤＮＡの部分を有する細胞によって生成された粒子を指す。これらの粒子はレトロウイルスに似ているが、多くの場合、非感染性である。本明細書の実施例で使用される異種指向性マウス白血病ウイルスは、モデルレトロウイルスまたはレトロウイルス様粒子を表す。
本明細書で使用する場合、本明細書において互換的に使用されるように、用語、「除去する」、「除去すること」、「除去」、「減少させる」、「減少させること」または「減少」は、精製されるべき標的タンパク質を含む試料中の１つ以上のウイルス量を低下させることを指す。本明細書中で実証されるように、精製されるべき標的タンパク質を含む特定の試料からの１つ以上のウイルスを除去するために活性炭を使用できる。
本明細書において互換的に用いられる用語「フロースループロセス」、「フロースルーモード」および「フロースルークロマトグラフィー」は、少なくとも１つの潜在的な成分が活性炭に結合している一方（例えば、ウイルス）、試料中の少なくとも１つの生成物が活性炭を通って流れること（フロースルー）が意図された（例えば、標的タンパク質）生成物の分離技術を指す。
フロースルーが意図される試料は、一般に「移動相」と呼ばれる。 「フロースルーモード」は、一般に均一濃度の操作（即ち、移動相の組成が変化しない間の処理）である。フロースルーに使用される培地は、通常、標的タンパク質分子を含む同じ緩衝液で予め平衡化される。精製後、培地は、生成物の回収率を上げるために、追加量の同じ緩衝液でフラッシングすることができる。
用語「緩衝液」は、その酸−塩基共役成分の作用によりｐＨの変化に抵抗する溶液を指す。本明細書に記載される方法に使用され得る様々な緩衝液は、Ｂｕｆｆｅｒｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇｕｅｆｆｒｏｙ， Ｄ．，編集． Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９７５）に記載されている。異なる緩衝液はｐＨの異なる範囲を維持し、例えば、リン酸塩緩衝液は、通常、６．０と８．０の間のｐＨに使用され、より高いｐＨに対してはホウ酸塩緩衝液を使用することができ、より低いｐＨには、炭酸塩緩衝液を使用することができる。当業者は維持されるべきｐＨに応じて、使用する適切な緩衝液を容易に特定することができるであろう。本発明の方法において使用できる緩衝剤の非限定的な例としては、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、トリス、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、炭酸塩、ホウ酸塩、およびアンモニウム緩衝液、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
用語「洗浄緩衝液」または「平衡化緩衝液」は本明細書で互換的に用いられるが、活性炭に試料を接触させる前に活性炭材料を洗浄または再平衡化するために使用される緩衝液を指す。
用語「導電率」は、２つの電極間に電流を伝導する水溶液の能力を指す。溶液中で、電流はイオン輸送によって流れる。従って、水溶液中に存在するイオンの量が増加すると、溶液はより高い導電率を有することになる。導電率の測定単位は１センチメートル当たりのミリジーメンス（ｍＳ／ｃｍまたはｍＳ）であり、（例えば、オリオン販売の）市販の導電率計を用いて測定することができる。溶液の導電率は、その中のイオンの濃度を変えることによって変更することができる。例えば、溶液中の緩衝剤の濃度および／または塩（例えば、ＮａＣｌまたはＫＣ１）の濃度は、所望の導電率を達成するために変更することができる。好ましくは、種々の緩衝液の塩濃度は、以下の実施例のように、所望の導電率を達成するように修正される。
用語「画分（単数または複数）」は、例えば、活性炭カラムに試料を流す精製工程に、標的タンパク質を含む試料を供した後に収集された小容量の液体を指す。本明細書に記載の方法において、画分は、標的タンパク質を含む試料の一部でカラムを充填した後に活性炭カラムから回収される。画分は、特定の時点で、カラムを通過している、ウイルス等の不純物の量を監視するために使用される。典型的には、カラムを通過したタンパク質の量が増加するにつれて、カラムを通過する不純物の量が増加することが予想される。精製工程で使用される材料（例えば、活性炭）の既知の量によって処理することができる試料中のタンパク質の量は、１以上の画分を収集し、材料の既知量によって除去された、ウイルス等の不純物のレベルを決定することによって決定することができる。
本明細書で使用する用語「カラム充填」または「充填」は、カラムの容積で割ったカラムを通過した溶液中の標的タンパク質の質量に対応する値である。カラムを通過した標的タンパク質の質量は、カラムから回収した試料の体積を、試料中の標的タンパク質の濃度に乗じて算出される。
用語「対数除去値」または「ＬＲＶ」は、既知量の不純物を通過させたときに、カラムによって除去された不純物のレベルを表す値である。Ｃｆがフィード溶液中の不純物濃度であり、Ｃｐがカラムを通過した後のフィード溶液中の不純物の濃度であるときＬＲＶ＝ｌｏｇ（Ｃｆ）−ｌｏｇ（Ｃｐ）である。
ＩＩ． 本明細書に記載の方法において使用するための例示的な活性炭材料
活性炭を使用する本明細書に記載される方法に基づいて、活性炭が、標的タンパク質を含む試料から、パルボウイルスおよびレトロウイルス等のウイルスの除去のために使用できるかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態では、活性炭（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ）は活性炭（ａｃｒｉｖａｔｅｄ ｃｈａｒｃｏａｌ）を含む。活性炭は、これらに限定されないが、石炭、木材、ヤシ殻、木の実の殻、泥炭等の様々な供給源から得ることができる。活性炭は、制御された雰囲気下での熱を伴う物理的活性化、または強酸、塩基、または酸化剤を用いた化学的活性化によって、これらの材料から製造することができる。活性化方法は、活性炭に不純物除去のための大容量を与える高い表面積を有する多孔質構造を作り出す。活性化方法は、表面の酸性度を制御するために変更することができる。
活性炭は多種多様な商業的供給源から入手可能であり、多数のグレードおよび形式の形で売られる。活性炭の商業的供給者としては、Ｍｅａｄ Ｗｅｓｔ Ｖａｃｏ Ｃｏｒｐ．， リッチモンド、バージニア州、米国； Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．， マーシャル、テキサス州、米国； Ｃａｌｇｏｎ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｒｐ．， ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国が挙げられる。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、活性炭は、セルロースを含む繊維状の媒体に組み込まれる。
本発明の方法で使用できる市販の活性炭材料としては、Ｎｕｃｈａｒ ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、リッチモンド、バージニア州、米国）；Ｎｕｃｈａｒ ＳＡ２０（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、リッチモンド、バージニア州、米国）； Ｎｕｃｈａｒ ＳＮ（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、リッチモンド、バージニア州、米国）；Ｎｕｃｈａｒ ＷＶ−Ｂ３０（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、リッチモンド、バージニア州、米国）；ＲＧＣ Ｐｏｗｄｅｒ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、リッチモンド、バージニア州、米国）；Ｎｏｒｉｔ Ｄａｒｃｏ ＫＢ−Ｇ活性炭（Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．、マーシャル、テキサス州、米国）；Ｎｏｒｉｔ ＣＧＰ Ｓｕｐｅｒ活性炭（Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．、マーシャル、テキサス州、米国）；Ｎｏｒｉｔ Ａ Ｓｕｐｒａ ＵＳＰ（Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．、マーシャル、テキサス州、米国）；Ｎｏｒｉｔ Ｅ Ｓｕｐｒａ ＵＳＰ（Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．、マーシャル、テキサス州、米国）；Ｎｏｒｉｔ Ｃ ＧＲＡＮ（Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．、マーシャル、テキサス州、米国）；Ｎｏｒｉｔ ＳＸ Ｕｌｔｒａ（Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．、マーシャル、テキサス州、米国）；Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ Ｐｕｌｓｏｒｂ ＰＧＣ活性炭（Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ Ｃａｒｂｏｎ、フェルイ、ベルギー）が挙げられるが、これらに限定されない。
活性炭の二つの主要な形式は、粉末や粒状である。粉末活性炭は、小さな、通常は１ｍｍ未満の直径の粒子を含み、液体の精製のために最も一般的に使用される。粒状活性炭は、より大きな粒子サイズおよびその結果としてより小さな表面積を有し、そのため拡散速度がより速いガス精製に使用するのが好ましい。
（水、食料、飲料、および医薬品精製等の）民生用アプリケーションにおける活性炭を用いる安全性のための重要な考慮事項は、抽出可能な化合物の減少および制御である。飲料水および食品接触用途のために意図された活性炭は、通常、水に対するすべての間接的な添加物を包含する安全規格ＡＮＳＩ／ＮＳＦ規格６１に準拠して作られる。また、ＡＳＴＭ標準試験法Ｄ６３８５は、アッシングにより活性炭中の酸抽出含量を決定することを記載し、活性炭からの抽出物のレベルを研究し、最小限にするために使用することができる。
様々な活性炭種類は様々な用途に利用可能である。例えば、ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐ．は、それらの容量、表面酸性度、標的分子に対する細孔アクセシビリティおよび意図したアプリケーションによって異なる少なくとも１２種類の粉末活性炭を供給する。不純物除去には活性炭の容量を最大化することが一般には望ましい。
ＩＩＩ． 本明細書に記載の方法において使用される例示的なウイルス
本明細書に記載された方法に使用され得る典型的なウイルスとしては、アデノウイルス、カリシウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ウシ下痢ウイルス、西ナイルウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、伝染性ウシ鼻気管炎ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、シミアンウイルスタイプ４０、パラインフルエンザウイルス、ヒトパルボウイルス、マウスの微小ウイルス、ブタパルボウイルス、イヌパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、マウス白血病ウイルス（異種指向、アンホトロピック、エコトロピック）、ヒト免疫不全ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載のように、ウイルスは、試料の一部を活性炭と接触させる前に１０４から１０８ＰＦＵ／ｍＬの範囲またはＴＣＩＤ５０／ｍＬの量で、標的タンパク質を含む試料の一部に添加される。
いくつかの実施形態では、マウスの微小ウイルスは、パルボウイルスを表し、標的タンパク質を含む試料の一部に添加される。他の実施形態において、異種指向性マウス白血病ウイルスは、レトロウイルスまたはレトロウイルス様粒子を表し、標的タンパク質を含む試料の一部に添加される。
ＩＶ． 活性炭を使用するフロースルー方法
活性炭を用いるウイルスの除去を決定するために使用され得る１つの一般的なフロースルー手順について以下に説明する。
いくつかの実施形態は、クロマトグラフィー装置、例えば、カラムには、活性炭の水性スラリーを充填する。活性炭はまた、乾燥粉末として装置、例えば、カラムに充填され、その後、水溶液で湿らすことができる。しかし、カラムが乾燥パックされる場合、時には活性炭粒子の間から小さな気泡を除去することが困難であり得る。次いで、カラムは、標的タンパク質を含有する試料と同じｐＨを有する緩衝液で平衡化される。試料は、その後１５秒から１０．０分の間のカラム滞留時間をもたらす流速で、活性炭カラムに通される。その後、標的タンパク質を含有する溶出液が回収される。
Ｖ． 試料中のウイルスの量を測定する方法
本明細書に記載されるように、試料の一部が活性炭で処理されると、試料中に残存するウイルスの量が本明細書に記載される１つ以上の方法または当該分野で公知の方法を使用して測定される。これらの方法としては、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）アッセイ、プラーク形成単位アッセイ、焦点形成単位アッセイ、５０％致死量アッセイ、血球凝集アッセイ、蛍光焦点アッセイ（ＦＦＡ）、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）、一元放射免疫拡散アッセイ（ＳＲＩＤ）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、透過型電子顕微鏡が挙げられるが、これらに限定されない。一般的に、使用される方法は、測定または検出されているウイルスに依存するだろう。本明細書に記載の方法に組み込むことができるアッセイのいくつかを以下に記載する。
５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）は、感染した宿主細胞の５０％を殺すために、または接種組織培養細胞の５０％に細胞変性効果を生み出すのに必要なウイルスの量を定量化する終点希釈アッセイである。インキュベーション後、細胞死（即ち、感染した細胞）の割合は手動で観察され、各ウイルス希釈に対し記録され、結果はＴＣＩＤ５０を数学的に計算するために使用される。
ウイルスのプラーク形成単位アッセイは、宿主細胞の融合性単層に試料の種々の希釈物を広げ、次いで（一般的に３から１４日間の）適切なインキュベーション期間の後、単層におけるプラークの数を数えることによって、試料中のプラーク形成単位（ＰＦＵ）の数を決定する。
５０％致死量（ＬＤ５０）アッセイは、動物の５０％を死滅させるのに十分である投与量を決定するために適切な宿主動物に試料の希釈物を投与することにより実施される。
血球凝集アッセイは、１時間、１％の赤血球溶液を含む試料の連続希釈物をインキュベートし、凝集が最初に発生するウイルスの希釈物を目視で決定することによって、特定のウイルス（例えば、インフルエンザ）を定量化するために使用できる。
蛍光焦点アッセイは、感染単位の数は、ウイルス成分に特異的に結合する蛍光抗体を用いて細胞単層を染色することによって決定されることを除いて、プラーク形成単位アッセイと同様に行われる。蛍光顕微鏡は、細胞が感染している数を計測し、定量化するために使用される。
ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）は試料中のタンパク質の総量を測定することによりウイルスを定量化する。ＢＣＡ試薬を試料に添加し、タンパク質のペプチド結合が定量的にＣｕ２＋をＣｕ１＋に還元し、これはライトブルー色を生成する。５６２ｎｍで吸収するより強く着色した種をもたらす２：１の比でＢＣＡはＣｕ１＋をキレートする。５６２ｎｍでの試料の吸光度は、試料中のバルクタンパク質濃度を決定するために使用される。アッセイの結果は、分光光度計またはプレートリーダーを用いて分析した後、既知の標準曲線と比較される。
また、マンシーニ法とも呼ばれる一元放射免疫拡散アッセイ（ＳＲＩＤ）は、半固形培地（例えば、寒天）中で免疫拡散することによって、特定のウイルス抗原の量を検出するタンパク質アッセイである。培地は目的の抗原に特異的な抗血清を含み、抗原はディスクの中央に配置される。抗原は培地中に拡散するときに、それは平衡に達するまで成長する沈殿リングを作成する。アッセイ時間は、抗原および抗体の平衡時間に応じて１０時間から数日の範囲とすることができる。リングからのゾーンの直径は、タンパク質濃度の対数に対して直線的に関係し、定量化のための既知のタンパク質標準のゾーンの直径と比較される。
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、試料中の特定の核酸配列の量を測定する手法である。ウイルスの遺伝子配列に特異的なプローブを用いることにより、試料中のウイルスゲノムの数を計測できる。
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、試料の高解像度の拡大画像を生成することによりウイルスを定量化するために使用されてもよい。ＴＥＭ画像は個々のウイルス粒子を示すことができ、定量的画像解析はウイルス濃度を決定するために用いることができる。
本発明は、限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに説明される。この出願中で引用されたすべての参考文献、特許および公開された特許出願の内容、ならびに図面は、参照により本明細書に組み込まれる。
［実施例１］ マウスの微小ウイルスの生産
本実施例は、パルボウイルスを表すマウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）を調製する方法を記載する。ＭＶＭをその後ＭＡＢの溶液に添加し、活性炭によるその選択的な除去を検査する。
高力価のＭＶＭを、ペニシリン（０．２単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．２μｇ／ｍｌ）、および２．０ｍＭのＬ−グルタミンと共に１％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む高度／Ｆ１２ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号１２６３４−０２８）中の融合性Ａ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１．４）を感染させることによって、生成する。３７℃で５％二酸化炭素での３日間のインキュベーション後、培地を、血清を含まない同じ培地に交換し、感染をあと７日継続する。
細胞溶解物を回収し、遠心分離（２０分間で３００ｇ）によって清澄化し、その後限外濾過（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号ＵＦＣ７１０００８）により濃縮する。最終濃度は、ベックマン遠心分離機でＳＷ２８ローターを使用して、１１２，０００ｇで４時間超遠心分離することによって得られる。ウイルスペレットを、カチオン交換クロマトグラフィーを通る流れを用いる最終研磨工程の前にＴＮＥ緩衝液（ｐＨ７．５の１０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁する。精製されたウイルスを、添加研究に使用するために−８０℃で緩衝液中に保存する。
［実施例２］ マウスの微小ウイルス濃度の決定
本実施例は、溶液中のマウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）の量を決定する方法について説明する。この方法は、活性炭による処理後にＭＡＢの溶液中に添加されたＭＶＭがどのくらい残っているかを決定するために用いることができる。
Ｂｏｌｔｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２巻、２００５、１３３−１４２で記載されたように、ＭＶＭの力価を、組織培養感染量５０％（ＴＣＩＤ５０）アッセイを用いて決定する。試験試料を細胞毒性およびウイルス干渉を緩和するために希釈し、続いて細胞培養培地を用いて１０倍連続希釈物を調製し、各希釈物の１００μｌアリコートを、サブコンフルエント３２４Ｋ．ＰＴ細胞（教授Ｐ． Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ、医学的検査および遺伝学部、エール大学医学部、ニューヘブン、コネチカット州、米国から入手した）を含む９６ウェルマイクロタイタープレートの１６ウェルの各々に添加する。３７℃で５％ＣＯ２での１０から１２日間のインキュベーション後、感染したウェルを細胞変性効果（ＣＰＥ）について視覚的に評価し、力価をＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法（Ｓｐｅａｒｍａｎ、Ｃ．、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ、２巻、１９０８、２２７−２４２；Ｋａｒｂｅｒ， Ｇ．， Ａｒｃｈ． Ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｌ． Ｐｈａｒｍａｋ、１６２巻、１９３１、４８０−４８３）を使用して決定する。低いカウントが予想される場合（濾液試料）、大容量のプレーティング技術も使用される。観察されたＣＰＥの頻度に応じて、これらの試料の力価を、いくつかの異なる受け入れられた統計学的方法の１つを使用して推定する。対数減少値（ＬＲＶ）は、開始時のウイルス充填のｌｏｇ １０を決定し、濾液中の全ウイルスのｌｏｇ １０を引くことによって計算される。
［実施例３］ 異種指向性マウス白血病ウイルスの産生
本実施例は、レトロウイルスまたはレトロウイルス様粒子を表す、異種指向性マウス白血病ウイルス（ＸＭｕＬＶ）を調製する方法を記載する。ＸＭｕＬＶをその後ＭＡＢの溶液に添加し、活性炭によるその選択的な除去を検査する。
高度に精製されたＸＭｕＬＶを、ペニシリン（０．２単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．２μｇ／ｍＬ）、および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加した１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭの存在下で、単一のフラスコのＭＶ１Ｌｕ細胞（ミンク肺細胞ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６４）を感染させることによって産生する。この感染フラスコの細胞は、ペニシリン（０．２単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．２μｇ／ｍＬ）、および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加した２．５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中で繰り返しの継代および拡大を受ける。感染した単層の細胞培養液を採取し、フラスコにペニシリン（０．２単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．２μｇ／ｍＬ）、および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含む高度／Ｆ１２ダルベッコ改変イーグル培地（Ａｄｖ．ＤＭＥＭ）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号１２６３４−０２８）を供給する。３７℃で５％ＣＯ２での２日間のインキュベーション後、感染した単層の細胞培養液を採取し、再び単層にペニシリン（０．２単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．２μｇ／ｍＬ）、および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＡｄｖ． ＤＭＥＭを供給する。
３７℃で５％二酸化炭素での２日間のインキュベート後に、細胞培養液を採取する。すべての細胞培養液を低速遠心分離（２０分間で３００ｇ）によって清澄化し、０．４５μｍデュラポアフィルターで濾過し、Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分離機でＧＳＡローターを用いて、９５００×ｇで２時間遠心分離することによって精製する。ペレット化ウイルスを、タンパク質を含まない保存緩衝液中に再懸濁し、添加研究に使用するための準備ができるまで−８０℃で保存する。
［実施例４］ 異種指向性マウス白血病ウイルスの濃度の決定
本実施例は、溶液中で異種指向性マウス白血病ウイルス（ＸＭｕＬＶ）の量を決定するための方法を記載する。この方法は、活性炭で処理した後にＭＡＢの溶液に添加されたＸＭｕＬＶがどの程度残るかを決定するために使用される。
Ｂｏｌｔｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２巻、２００５、１３３−１４２で記載したように、ＸＭｕＬＶの力価を、組織培養感染量５０％（ＴＣＩＤ５０）アッセイを用いて決定する。試験試料を細胞毒性およびウイルス干渉を緩和するために希釈し、続いて細胞培養培地を用いて１０倍連続希釈物を調製し、各希釈物の１００μｌアリコートを、サブコンフルエントＰＧ４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０３２）を含む９６ウェルマイクロタイタープレートの１６ウェルの各々に添加する。次いで、プレートを遠心分離（１８００ｒｐｍで６０分間）でスピノキュレーションする。３７℃で５％ＣＯ２での７日間のインキュベーション後、感染したウェルを細胞変性効果（ＣＰＥ）について視覚的に評価し、力価をＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法（Ｓｐｅａｒｍａｎ、Ｃ．、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ、２巻、１９０８、２２７−２４２；Ｋａｒｂｅｒ， Ｇ．， Ａｒｃｈ． Ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｌ． Ｐｈａｒｍａｋ、１６２巻、１９３１、４８０−４８３）を使用して決定する。低いカウントが予想される場合（濾液試料）、大容量のプレーティング技術も使用される。観察されたＣＰＥの頻度に応じて、これらの試料の力価を、いくつかの異なる受け入れられた統計学的方法の１つを使用して推定する。対数減少値（ＬＲＶ）は、開始時のウイルス充填のｌｏｇ １０を決定し、濾液中の全ウイルスのｌｏｇ １０を引くことによって計算される。
［実施例５］ 活性炭をＭＡＢＩモノクローナル抗体溶液からパルボウイルスを選択的に除去するために使用できるかどうかを決定するための方法
これは、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）で表されるパルボウイルスが、活性炭のカラムに流すことによって、モノクローナル抗体（即ち、ＭＡＢＩ）を含有する溶液から除去されるかどうかを決定するための方法を示す代表的な例である。その結果は、活性炭をＭＡＢＩモノクローナル抗体溶液からパルボウイルスを除去するために使用できることを示す。
以下に記載するように、ＭＡＢＩ溶液をＭＶＭと混合し、その後活性炭カラムに流す。
ＣＨＯ細胞から生産されたＭＡＢＩを清澄化し、その後、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー（２５ｍＭの酢酸、２５ｍＭのグリシンＨＣｌで溶出される）に供する。タンパク質Ａ溶出液のｐＨを１Ｍトリス塩基でｐＨ７．０に調整し、溶出液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。ｐＨ７．０のＭＡＢＩフィードを実施例１に記載した手順に従って製造される超高純度グレードのＭＶＭと２．０Ｅ＋０６ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの目標量まで混合する。次いで、混合されたフィードを、活性炭と接触させる前に０．２２μｍ ＧＰ Ｅｘｐｒｅｓｓフィルターで濾過する。
ガラスクロマトグラフィーカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｃｏｌｕｍｎ １０ｍｍ／１００ｍｍ、直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、ＳＫＵ：００６ＢＣＣ−１０−１０−ＡＦ、Ｄｉｂａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ダンベリー、コネチカット州０６８１０、米国）に水中でスラリーにされた２００ｍｇのＮｕｃｈａｒ ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、リッチモンド、バージニア州、米国）を充填する。カラムに水を流すことによってカラムを充填し、０．８ｍｌの充填されたカラム体積がもたらされる。
活性炭カラムを、ｐＨ７．０の約１０ＣＶの２５ｍＭトリスで予め平衡化する。ウイルスが添加されたＭＡＢフィードを、Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗカセットポンプを用いて１ｍＬ／分（０．８ＣＶ／分）で活性炭カラムにポンプ輸送する。２ｍｌの画分を１．０ｋｇ／Ｌおよび２．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で溶出液から回収する。実施例２に記載したようにこの試料をウイルス感染性アッセイにより滴定する。表Ｉおよび図１にまとめたように、この実験は、５．０ＬＲＶを超える、ＭＶＭによって表されるパルボウイルスが、１．０ｋｇ／Ｌおよび２．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で活性炭カラムに溶液を流すことによりＭＡＢＩ溶液から除去されることを実証する。従って、活性炭はＭＡＢＩを含む溶液からパルボウイルスを選択的に除去するのに使用できる。
表Ｉ．活性炭カラム上でＭＡＢＩの様々なカラム充填で集めた画分中で測定された、ＭＡＢＩ含有溶液から除去されたＭＶＭのＬＲＶ。実験は二重で実行され、記載された値はこれら２つの値の平均値である。画分中のＭＶＭ濃度は検出レベル未満であることに留意されたい。
Figure 2018085993
［実施例６］ 活性炭をＭＡＢＩＩモノクローナル抗体溶液からパルボウイルスを選択的に除去するために使用できるかどうかを決定するための方法
これは、実施例５と共に、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）で表されるパルボウイルスが、活性炭カラムに流すことにより、モノクローナル抗体（即ち、ＭＡＢＩＩ）を含む溶液から除去されるかどうかを決定するための方法を示す、第２の代表例である。結果は、活性炭を、ＭＡＢＩＩモノクローナル抗体溶液からパルボウイルスを選択的に除去するのに使用できないことを示す。
以下に説明するように、ＭＡＢＩＩの溶液をＭＶＭと混合し、その後活性炭カラムに流す。
ＣＨＯ細胞から生産されたＭＡＢＩＩを清澄化し、その後、タンパク質Ａクロマトグラフィー（２５ｍＭの酢酸、２５ｍＭのグリシンＨＣｌで溶出される）に供する。タンパク質Ａ溶出液のｐＨを１Ｍトリス塩基でｐＨ７．０に調整し、Ｓｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。透析チューブ（標準ＲＣ透析トライアルキット、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １−３、３．５Ｋ ＭＷＣＯ、５４ｍｍフラット幅、シリアル番号１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ、ランチョドミンゲス、カリフォルニア州、９０２２０ 米国）を用いて、フィードを２５ｍＭトリスｐＨ７．０の中に２度透析する。その後、溶液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。ｐＨ７．０の透析したＭＡＢＩＩフィードを実施例１に記載した手順に従って製造される超高純度グレードのＭＶＭと２．０Ｅ＋０６ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの目標量まで混合する。次いで、混合されたフィードを、活性炭と接触させる前に０．２２μｍ ＧＰ Ｅｘｐｒｅｓｓフィルターで濾過する。
ガラスクロマトグラフィーカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｃｏｌｕｍｎ １０ｍｍ／１００ｍｍ、直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、ＳＫＵ：００６ＢＣＣ−１０−１０−ＡＦ、Ｄｉｂａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ダンベリー、コネチカット州０６８１０、米国）に水中でスラリーにされた２００ｍｇのＮｕｃｈａｒ ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、リッチモンド、バージニア州、米国）を充填する。カラムに水を流すことによってカラムを充填し、０．８ｍｌの充填されたカラム体積がもたらされる。
活性炭カラムを、ｐＨ７．０の約１０ＣＶの２５ｍＭトリスで予め平衡化する。ウイルスが添加されたｍＡｂフィードを、Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗカセットポンプを用いて１ｍＬ／分（０．８ＣＶ／分）で活性炭カラムにポンプ輸送する。２ｍｌの画分を０．５ｋｇ／Ｌ、１．０ｋｇ／Ｌおよび２．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で溶出液から回収する。実施例２に記載したように、この試料を、ウイルス感染性アッセイを使用して滴定する。
表ＩＩおよび図１にまとめたように、この実験は、１．０ＬＲＶ未満の、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）によって表されるパルボウイルス様粒子が、０．５ｋｇ／Ｌ、１．０ｋｇ／Ｌおよび２．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で活性炭カラムに溶液を流すことによりＭＡＢＩＩ溶液から除去されることを実証する。その結果は、活性炭がＭＡＢＩＩモノクローナル抗体溶液からパルボウイルスを選択的に除去するのに使用できないことを示す。
表ＩＩ．活性炭カラム上でＭＡＢＩＩの様々なカラム充填で集めた画分中のＭＡＢＩＩから除去されたＭＶＭのＬＲＶ。
Figure 2018085993
［実施例７］ 活性炭をＭＡＢＩＩＩモノクローナル抗体溶液からパルボウイルスを選択的に除去するために使用できるかどうかを決定するための方法
これは、実施例５および実施例６と共に、ＭＶＭで表されるパルボウイルスが、活性炭カラムに流すことにより、モノクローナル抗体（即ち、ＭＡＢＩＩＩ）を含む溶液から除去されるかどうかを決定するための方法を示す、第３の代表例である。その結果は、活性炭を、ＭＡＢＩＩＩモノクローナル抗体溶液からパルボウイルスを選択的に除去するのに使用できないことを示す。
以下に説明するように、ＭＡＢＩＩＩの溶液をＭＶＭと混合し、その後活性炭カラムに流す。
ＭＡＢＩＩＩは、Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏにより清澄化細胞培養物として提供される。 ＭＡＢＩＩＩは、タンパク質Ａクロマトグラフィー（ｐＨ２．６の２０ｍＭのグリシン−塩酸塩緩衝液を用いる溶出）により捕捉される。ＭＡＢＩＩＩ溶出液のｐＨを１Ｍトリス塩基でｐＨ７．０に調整し、溶出液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。透析チューブ（標準ＲＣ透析トライアルキット、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １−３、３．５Ｋ ＭＷＣＯ、５４ｍｍフラット幅、シリアル番号１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ、ランチョドミンゲス、カリフォルニア州、９０２２０ 米国）を用いて、フィードを２５ｍＭトリスｐＨ７．０の中に２度透析する。続いて溶液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。
ｐＨ７．０のＭＡＢＩＩＩフィードを実施例１に記載した手順に従って製造される超高純度グレードのＭＶＭと２．０Ｅ＋０６ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの目標添加まで混合する。次いで、混合されたフィードを、活性炭と接触させる前に０．２２μｍ ＧＰ Ｅｘｐｒｅｓｓフィルターで濾過する。
ガラスクロマトグラフィーカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｃｏｌｕｍｎ １０ｍｍ／１００ｍｍ、直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、ＳＫＵ：００６ＢＣＣ−１０−１０−ＡＦ、Ｄｉｂａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ダンベリー、コネチカット州０６８１０、米国）に水中でスラリーにされた２００ｍｇのＮｕｃｈａｒ ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、リッチモンド、バージニア州、米国）を充填する。カラムに水を流すことによってカラムを充填し、０．８ｍｌの充填されたカラム体積がもたらされる。
活性炭カラムを、ｐＨ７．０の約１０ＣＶの２５ｍＭトリスで予め平衡化する。ウイルスが添加されたＭＡＢフィードを、Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗカセットポンプを用いて１ｍＬ／分（０．８ＣＶ／分）で活性炭カラムにポンプ輸送する。２ｍｌの画分を０．５ｋｇ／Ｌ、１．０ｋｇ／Ｌおよび２．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で溶出液から回収する。実施例２に記載したようにこの試料をウイルス感染性アッセイを使用して滴定する。
表ＩＩＩおよび図１にまとめたように、この実験は、１．０ＬＲＶ未満の、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）によって表されるパルボウイルス様粒子が、０．５ｋｇ／Ｌ、１．０ｋｇ／Ｌおよび２．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で活性炭カラムに溶液を流すことによりＭＡＢＩＩＩ溶液から除去されることを実証する。この方法の結果は、活性炭はＭＡＢＩＩＩモノクローナル抗体溶液からパルボウイルス様粒子を選択的に除去するのに使用できないことを示す。
表ＩＩＩ．活性炭カラム上でＭＡＢＩＩＩの様々なカラム充填で集めた画分中のＭＡＢＩＩＩから除去されたＭＶＭのＬＲＶ。
Figure 2018085993
［実施例８］ 活性炭をＭＡＢＩＶモノクローナル抗体溶液からパルボウイルスを選択的に除去するために使用できるかどうかを決定するための方法
これは、実施例５、実施例６および実施例７と共に、ＭＶＭで表されるパルボウイルスが、活性炭カラムに流すことにより、モノクローナル抗体（即ち、ＭＡＢＩＶ）を含む溶液から除去されるかどうかを決定するための方法を示す、第４の代表例である。その結果は、活性炭を、ＭＡＢＩＶモノクローナル抗体溶液からパルボウイルスを選択的に除去するのに使用できることを示す。
以下に説明するように、ＭＡＢＩＶの溶液をＭＶＭと混合し、その後活性炭カラムに流す。
ＭＡＢＩＶモノクローナル抗体を、Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ Ｂｉｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔから１０ｍＭクエン酸、１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、および０．０１％のＴｗｅｅｎを含有する１０ｇ／Ｌの水溶液として得る。透析チューブ（標準ＲＣ透析トライアルキット、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １−３、３．５Ｋ ＭＷＣＯ、５４ｍｍフラット幅、シリアル番号１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ、ランチョドミンゲス、カリフォルニア州、９０２２０ 米国）を用いて、フィードを２５ｍＭトリスｐＨ７．０の中に２度透析する。溶液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。ｐＨ７．０のＭＡＢＩＶフィードを実施例１に記載した手順に従って製造される超高純度グレードのＭＶＭと２．０Ｅ＋０６ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの目標添加まで混合する。次いで、混合されたフィードは、活性炭と接触させる前に０．２２μｍ ＧＰ Ｅｘｐｒｅｓｓフィルターで濾過する。
ガラスクロマトグラフィーカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｃｏｌｕｍｎ １０ｍｍ／１００ｍｍ、直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、ＳＫＵ：００６ＢＣＣ−１０−１０−ＡＦ、Ｄｉｂａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ダンベリー、コネチカット州０６８１０、米国）に水中でスラリーにされた２００ｍｇのＮｕｃｈａｒ ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、リッチモンド、バージニア州、米国）を充填する。カラムに水を流すことによってカラムを充填し、０．８ｍｌの充填されたカラム体積がもたらされる。
次いで活性炭カラムを、ｐＨ７．０の約１０ＣＶの２５ｍＭトリスで予め平衡化する。ウイルスが添加されたＭＡＢフィードを、Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗカセットポンプを用いて１ｍＬ／分（０．８ＣＶ／分）で活性炭カラムにポンプ輸送する。２ｍｌの画分を１．０ｋｇ／Ｌおよび２．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で溶出液から回収する。実施例２に記載したように、この試料を、ウイルス感染性アッセイを使用して滴定する。
表ＩＶおよび図１にまとめたように、この実験は、５．０ＬＲＶを超える、ＭＶＭによって表されるパルボウイルスが、１．０ｋｇ／Ｌおよび２．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で活性炭カラムに溶液を流すことによりＭＡＢＩＶ溶液から除去されることを実証する。その結果は、活性炭はＭＡＢＩＶモノクローナル抗体溶液からパルボウイルスを選択的に除去するのに使用できることを示す。
表ＩＶ．活性炭カラム上でＭＡＢＩＶの様々なカラム充填で集めた画分中のＭＡＢＩＶから除去されたＭＶＭのＬＲＶ。実験は二重で実行され、記載された値はこれら２つの値の平均値である。画分中のＭＶＭ濃度は検出レベル未満であることに留意されたい。
Figure 2018085993
［実施例９］ 活性炭をＭＡＢＩモノクローナル抗体溶液からレトロウイルスおよび／またはレトロウイルス様粒子を選択的に除去するために使用できるかどうかを決定するための方法
これは、異種指向性マウス白血病ウイルス（ＸＭｕＬＶ）で表されるレトロウイルスおよび／またはレトロウイルス様粒子が、活性炭のカラムに流すことによって、モノクローナル抗体（即ち、ＭＡＢＩ）を含有する溶液から除去されるかどうかを決定するための方法を示す代表的な例である。その結果は、活性炭をＭＡＢＩモノクローナル抗体溶液からレトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子を除去するために使用できることを示す。
以下に説明するように、ＭＡＢＩ溶液をＸＭｕＬＶと混合し、その後活性炭カラムに流す。
ＣＨＯ細胞から生産されたＭＡＢＩを清澄化し、その後、タンパク質Ａカラムクロマトグラフィー（２５ｍＭの酢酸、２５ｍＭのグリシンＨＣｌで溶出される）を使用して単離する。タンパク質Ａ溶出液のｐＨを１Ｍトリス塩基でｐＨ７．０に調整し、溶液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。ｐＨ７．０のＭＡＢＩフィードを実施例３に記載した手順に従って製造され、ＴＦＦで精製されたＸＭｕＬＶと１．０Ｅ＋０５ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの目標添加まで混合する。次いで、混合されたフィードを、活性炭と接触させる前に０．４５μｍデュラポアフィルターで濾過する。
ガラスクロマトグラフィーカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｃｏｌｕｍｎ １０ｍｍ／１００ｍｍ、直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、ＳＫＵ：００６ＢＣＣ−１０−１０−ＡＦ、Ｄｉｂａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ダンベリー、コネチカット州０６８１０、米国）に水中でスラリーにされた２００ｍｇのＮｕｃｈａｒ ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、リッチモンド、バージニア州、米国）を充填する。カラムに水を流すことによってカラムを充填し、０．８ｍｌの充填されたカラム体積がもたらされる。
活性炭カラムを、ｐＨ７．０の約１０ＣＶの２５ｍＭトリスで予め平衡化する。ウイルスが添加されたＭＡＢフィードを、Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗカセットポンプを用いて１ｍＬ／分（０．８ＣＶ／分）で活性炭カラムにポンプ輸送する。２ｍｌの画分を０．５ｋｇ／Ｌ、１．０ｋｇ／Ｌおよび１．５ｋｇ／Ｌのカラム充填で溶出液から回収する。実施例４に記載したようにこの試料をウイルス感染性アッセイを使用して滴定する。
表Ｖおよび図２にまとめたように、この実験は、３．０ＬＲＶを超える、ＸＭｕＬＶによって表されるレトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子が、０．５ｋｇ／Ｌ、１．０ｋｇ／Ｌおよび１．５ｋｇ／Ｌのカラム充填で活性炭カラムに溶液を流すことによりＭＡＢＩ溶液から除去されることを実証する。従って、その結果は、活性炭をＭＡＢＩモノクローナル抗体溶液からレトロウイルス様粒子を選択的に除去するのに使用できることを示す。
表Ｖ．活性炭カラム上でＭＡＢＩの様々なカラム充填で集めた画分中のＭＡＢＩから除去されたＸｍｕＬＶのＬＲＶ。実験は二重で実行され、記載された値はこれら２つの値の平均値である。画分中のＸＭｕＬＶ濃度は検出レベル未満であることに留意されたい。
Figure 2018085993
［実施例１０］ 活性炭をＭＡＢＩＩモノクローナル抗体溶液からレトロウイルスおよび／またはレトロウイルス様粒子を選択的に除去するために使用できるかどうかを決定するための方法
これは、実施例９と共に、ＸＭｕＬＶで表されるレトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子が、活性炭カラムを流れることにより、モノクローナル抗体（即ち、ＭＡＢＩＩ）を含む溶液から除去されるかどうかを決定するための方法を示す、第２の代表例である。その結果は、活性炭を、ＭＡＢＩＩモノクローナル抗体溶液からレトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子を選択的に除去するのに使用できることを示す。
以下に説明するように、ＭＡＢＩＩの溶液をＸＭｕＬＶと混合し、その後活性炭カラムに流す。
ＣＨＯ細胞から生産されたＭＡＢＩＩを清澄化し、その後、タンパク質Ａカラムクロマトグラフィー（２５ｍＭの酢酸、２５ｍＭのグリシンＨＣｌで溶出される）を使用して単離する。タンパク質Ａ溶出液のｐＨを１Ｍトリス塩基でｐＨ７．０に調整し、溶液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。続いて透析チューブ（標準ＲＣ透析トライアルキット、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １−３、３．５Ｋ ＭＷＣＯ、５４ｍｍフラット幅、シリアル番号１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ、ランチョドミンゲス、カリフォルニア州、９０２２０ 米国）を用いて、フィードを２５ｍＭトリスｐＨ７．０の中に２度透析する。溶液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。
ｐＨ７．０のＭＡＢＩＩフィードを実施例３に記載した手順に従って製造される超高純度グレードのＸＭｕＬＶと１．０Ｅ＋０６ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの目標添加まで混合する。混合されたフィードは、活性炭と接触させる前に０．４５μｍデュラポアフィルターで濾過する。
ガラスクロマトグラフィーカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｃｏｌｕｍｎ １０ｍｍ／１００ｍｍ、直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、ＳＫＵ：００６ＢＣＣ−１０−１０−ＡＦ、Ｄｉｂａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ダンベリー、コネチカット州０６８１０、米国）に水中でスラリーにされた２００ｍｇのＮｕｃｈａｒ ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、リッチモンド、バージニア州、米国）を充填する。カラムに水を流すことによってカラムを充填し、０．８ｍｌの充填されたカラム体積がもたらされる。
活性炭カラムを、ｐＨ７．０の約１０ＣＶの２５ｍＭトリスで予め平衡化する。ウイルスが添加されたＭＡＢフィードを、Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗカセットポンプを用いて１ｍＬ／分（０．８ＣＶ／分）で活性炭カラムにポンプ輸送する。２ｍｌの画分を０．２ｋｇ／Ｌ、０．５ｋｇ／Ｌおよび１．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で溶出液から回収する。実施例４に記載したようにこの試料をウイルス感染性アッセイを使用して滴定する。
表ＶＩおよび図２にまとめたように、この実験は、５．０ＬＲＶを超える、ＸＭｕＬＶによって表されるレトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子が、０．２ｋｇ／Ｌ、０．５ｋｇ／Ｌおよび１．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で活性炭カラムに溶液を流すことによりＭＡＢＩＩ溶液から除去されることを実証する。従って、その結果は活性炭をＭＡＢＩＩモノクローナル抗体溶液からレトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子を選択的に除去するのに使用できることを示す。
表ＶＩ．活性炭カラム上でＭＡＢＩＩの様々なカラム充填で集めた画分中のＭＡＢＩＩから除去されたＸＭｕＬＶのＬＲＶ。画分中のＸＭｕＬＶ濃度は検出レベル未満であることに留意されたい。
Figure 2018085993
［実施例１１］ 活性炭をＭＡＢＩＩＩモノクローナル抗体溶液からレトロウイルスおよび／またはレトロウイルス様粒子を選択的に除去するために使用できるかどうかを決定するための方法
これは、実施例９および実施例１０と共に、ＸＭｕＬＶで表されるレトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子が、活性炭カラムを流れることにより、モノクローナル抗体（即ち、ＭＡＢＩＩＩ）を含む溶液から除去されるかどうかを決定するための方法を示す、第３の代表例である。その結果は、活性炭を、ＭＡＢＩＩＩモノクローナル抗体溶液からレトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子を選択的に除去するのに使用できることを示す。
以下に説明するように、ＭＡＢＩＩＩの溶液をＸＭｕＬＶと混合し、その後活性炭カラムに流す。
ＭＡＢＩＩＩは、Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏにより清澄化細胞培養物として提供される。 それは、タンパク質Ａクロマトグラフィー（ｐＨ２．６の２０ｍＭのグリシン−塩酸塩緩衝液を用いて溶出される）により捕捉される。溶出液は高いレベルのＨＣＰを有し、従ってタンパク質Ａカラムクロマトグラフィーを使用して２回目の精製を行う。クロマトグラフィーカラムに充填する前に、ＭＡＢＩＩＩ溶液の塩化ナトリウム濃度を０．５Ｍに上昇させる。その後、ＭＡＢＩＩＩ抗体を２５ｍＭの酢酸、２５ｍＭのグリシンＨＣｌで溶出する。ＭＡＢＩＩＩ溶出液のｐＨを１Ｍトリス塩基でｐＨ７．０に調整し、溶液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。透析チューブ（標準ＲＣ透析トライアルキット、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １−３、３．５Ｋ ＭＷＣＯ、５４ｍｍフラット幅、シリアル番号１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ、ランチョドミンゲス、カリフォルニア州、９０２２０ 米国）を用いて、フィードを２５ｍＭトリスｐＨ７．０の中に２度透析する。溶液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。
ｐＨ７．０のＭＡＢＩＩＩフィードを実施例３に記載した手順に従って製造される超高純度グレードのＸｍｕＬＶと１．０Ｅ＋０６ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの目標添加まで混合する。次いで、混合されたフィードを、活性炭と接触させる前に０．４５μｍデュラポアフィルターで濾過する。
ガラスクロマトグラフィーカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｃｏｌｕｍｎ １０ｍｍ／１００ｍｍ、直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、ＳＫＵ：００６ＢＣＣ−１０−１０−ＡＦ、Ｄｉｂａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ダンベリー、コネチカット州０６８１０、米国）に水中でスラリーにされた２００ｍｇのＮｕｃｈａｒ ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、リッチモンド、バージニア州、米国）を充填する。カラムに水を流すことによってカラムを充填し、０．８ｍｌの充填されたカラム体積がもたらされる。
活性炭カラムを、ｐＨ７．０の約１０ＣＶの２５ｍＭトリスで予め平衡化する。ウイルスが添加されたＭＡＢフィードを、Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗカセットポンプを用いて１ｍＬ／分（０．８ＣＶ／分）で活性炭カラムにポンプ輸送する。２ｍｌの画分を０．２ｋｇ／Ｌ、０．５ｋｇ／Ｌおよび１．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で溶出液から回収する。実施例４に記載したようにこの試料をウイルス感染性アッセイを使用して滴定する。
表ＶＩＩおよび図２にまとめたように、この実験は、５．０ＬＲＶを超える、ＸｍｕＬＶによって表されるレトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子が、０．２ｋｇ／Ｌ、０．５ｋｇ／Ｌおよび１．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で活性炭カラムに溶液を流すことによりＭＡＢＩＩＩ溶液から除去されることを実証する。その結果は、活性炭をＭＡＢＩＩＩモノクローナル抗体溶液からレトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子を選択的に除去するのに使用できることを示す。
表ＶＩＩ．活性炭カラム上でＭＡＢＩＩＩの様々なカラム充填で集めた画分中のＭＡＢＩＩＩから除去されたＬＭｕＬＶのＬＲＶ。画分中のＸＭｕＬＶ濃度は検出レベル未満であることに留意されたい。
Figure 2018085993
［実施例１２］ 活性炭をＭＡＢＩＶモノクローナル抗体溶液からレトロウイルスおよび／またはレトロウイルス様粒子を選択的に除去するために使用できるかどうかを決定するための方法
これは、実施例９、実施例１０および実施例１１と共に、ＸＭｕＬＶで表されるレトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子が、活性炭カラムを流れることにより、モノクローナル抗体（即ち、ＭＡＢＩＶ）を含む溶液から除去されるかどうかを決定するための方法を示す、第４の代表例である。その結果は、活性炭を、ＭＡＢＩＶモノクローナル抗体溶液からレトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子を選択的に除去するのに使用できることを示す。
以下に説明するように、ＭＡＢＩＶの溶液をＸＭｕＬＶと混合し、その後活性炭カラムに流す。
ＭＡＢＩＶモノクローナル抗体を、Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ Ｂｉｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔから１０ｍＭクエン酸、１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、および０．０１％のＴｗｅｅｎを含有する１０ｇ／Ｌの水溶液として得る。次いで、透析チューブ（標準ＲＣ透析トライアルキット、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １−３、３．５Ｋ ＭＷＣＯ、５４ｍｍフラット幅、シリアル番号１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ、ランチョドミンゲス、カリフォルニア州、９０２２０ 米国）を用いて、フィードを２５ｍＭトリスｐＨ７．０の中に２度透析する。溶液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。ｐＨ７．０のＭＡＢＩＶフィードを実施例３に記載した手順に従って製造される超高純度グレードのＸｍｕＬＶと１．０Ｅ＋０６ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの目標添加まで混合する。次いで、混合されたフィードは、活性炭と接触させる前に０．４５μｍデュラポアフィルターで濾過する。
ガラスクロマトグラフィーカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｃｏｌｕｍｎ １０ｍｍ／１００ｍｍ、直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、ＳＫＵ：００６ＢＣＣ−１０−１０−ＡＦ、Ｄｉｂａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ダンベリー、コネチカット州０６８１０、米国）に水中でスラリーにされた２００ｍｇのＮｕｃｈａｒ ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、リッチモンド、バージニア州、米国）を充填する。カラムに水を流すことによってカラムを充填し、０．８ｍｌの充填されたカラム体積がもたらされる。
活性炭カラムを、ｐＨ７．０の約１０ＣＶの２５ｍＭトリスで予め平衡化する。ウイルスが添加されたＭＡＢフィードを、Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗカセットポンプを用いて１ｍＬ／分（０．８ＣＶ／分）で活性炭カラムにポンプ輸送する。２ｍｌの画分を０．２ｋｇ／Ｌ、０．５ｋｇ／Ｌおよび１．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で溶出液から回収する。実施例４に記載したようにこの試料をウイルス感染性アッセイを使用して滴定する。
表ＶＩＩＩおよび図２にまとめたように、この実験は、５．０ＬＲＶを超える、ＸＭｕＬＶによって表されるレトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子が、０．２ｋｇ／Ｌ、０．５ｋｇ／Ｌおよび１．０ｋｇ／Ｌのカラム充填で活性炭カラムに溶液を流すことによりＭＡＢＩＶ溶液から除去されることを実証する。その結果は、活性炭をＭＡＢＩＶモノクローナル抗体溶液からレトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子を選択的に除去するのに使用できることを示す。
表ＶＩＩＩ．活性炭カラム上でＭＡＢＩＶの様々なカラム充填で集めた画分中のＭＡＢＩＶから除去されたＸＭｕＬＶのＬＲＶ。実験は二重で実行され、記載された値はこれら２つの値の平均値である。画分中のＸＭｕＬＶ濃度は検出レベル未満であることに留意されたい。
Figure 2018085993
明細書は、最も徹底的に、参照により本明細書に組み込まれている、明細書の範囲内で引用した参考文献の教示に照らして理解される。明細書内の実施形態は、本発明における実施形態の実例を提供し、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明に包含されることを認識する。すべての刊行物および発明はその全体が参照により援用される。参照により組み込まれる資料が本明細書に反していたり、矛盾している限り、本明細書はあらゆるそのような資料に優先する。本明細書中の任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する従来技術であることを認めるものではない。
特に断りのない限り、特許請求の範囲を含む本明細書で使用される成分、細胞培養、処理条件等の量を表す全ての数字は用語「約」によって全ての場合において修飾されるものとして理解されるべきである。従って、それ以外の場合は逆に示されない限り、数値パラメータは近似値であり、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変えることができる。特に明記しない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は一連のすべての要素を指すものと理解されるべきである。当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、または日常的な実験のみを用いて確認することができるであろう。このような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
当業者には明らかなように、本発明の多くの改変および変更は、その精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載の特定の実施形態は例としてのみ提供され、決して限定するものではない。以下の特許請求の範囲によって示される本発明の真の範囲および精神をもって、明細書および実施例は例示としてのみ考慮されることが意図される。
用語「Ｆｃ領域」および「Ｆｃ領域含有タンパク質」とは、タンパク質が免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖定常領域またはドメイン（先に定義したようＣＨおよびＣＬ領域）を含むことを意味する。「Ｆｃ領域」を含むタンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を有することができる。そのようなＣＨ２／ＣＨ３領域等の「Ｆｃ領域」は、例えば、プロテインＡまたはその機能的変異体等の親和性リガンドに選択的に結合することができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域含有タンパク質は、プロテインＡまたはその機能的誘導体、変異体またはその断片に特異的に結合する。他の実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、プロテインＧまたはプロテインＬ、またはその機能的誘導体、変異体またはその断片に特異的に結合する。
本明細書で使用する用語「溶液」または「試料」は、本明細書に記載の方法を用いて活性炭が組成物からウイルスを除去するのに使用できることが実証された後、活性炭を用いたウイルス除去に供される標的タンパク質を含む組成物を意味する。いくつかの実施形態において、試料は、細胞培養フィード、例えば、分泌性標的タンパク質、例えば、モノクローナル抗体を発現する哺乳動物細胞培養（例えば、ＣＨＯ細胞）からのフィードを含む。いくつかの実施形態では、試料は、細胞内で標的タンパク質を発現する哺乳動物または非哺乳動物細胞から得られた細胞溶解物を含む。いくつかの実施形態では、試料は、清澄化に供された細胞培養フィードを含む。いくつかの実施形態では、試料は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムからの溶出液を含む。試料はまた、目的タンパク質または標的タンパク質を産生するために使用される非哺乳動物発現系を含む。
ＣＨＯ細胞から生産されたＭＡＢＩを清澄化し、その後、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（２５ｍＭの酢酸、２５ｍＭのグリシンＨＣｌで溶出される）に供する。プロテインＡ溶出液のｐＨを１Ｍトリス塩基でｐＨ７．０に調整し、溶出液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。ｐＨ７．０のＭＡＢＩフィードを実施例１に記載した手順に従って製造される超高純度グレードのＭＶＭと２．０Ｅ＋０６ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの目標量まで混合する。次いで、混合されたフィードを、活性炭と接触させる前に０．２２μｍ ＧＰ Ｅｘｐｒｅｓｓフィルターで濾過する。
ＣＨＯ細胞から生産されたＭＡＢＩＩを清澄化し、その後、プロテインＡクロマトグラフィー（２５ｍＭの酢酸、２５ｍＭのグリシンＨＣｌで溶出される）に供する。プロテインＡ溶出液のｐＨを１Ｍトリス塩基でｐＨ７．０に調整し、Ｓｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。透析チューブ（標準ＲＣ透析トライアルキット、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １−３、３．５Ｋ ＭＷＣＯ、５４ｍｍフラット幅、シリアル番号１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ、ランチョドミンゲス、カリフォルニア州、９０２２０ 米国）を用いて、フィードを２５ｍＭトリスｐＨ７．０の中に２度透析する。その後、溶液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。ｐＨ７．０の透析したＭＡＢＩＩフィードを実施例１に記載した手順に従って製造される超高純度グレードのＭＶＭと２．０Ｅ＋０６ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの目標量まで混合する。次いで、混合されたフィードを、活性炭と接触させる前に０．２２μｍ ＧＰ Ｅｘｐｒｅｓｓフィルターで濾過する。
ＭＡＢＩＩＩは、Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏにより清澄化細胞培養物として提供される。ＭＡＢＩＩＩは、プロテインＡクロマトグラフィー（ｐＨ２．６の２０ｍＭのグリシン−塩酸塩緩衝液を用いる溶出）により捕捉される。ＭＡＢＩＩＩ溶出液のｐＨを１Ｍトリス塩基でｐＨ７．０に調整し、溶出液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。透析チューブ（標準ＲＣ透析トライアルキット、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １−３、３．５Ｋ ＭＷＣＯ、５４ｍｍフラット幅、シリアル番号１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ、ランチョドミンゲス、カリフォルニア州、９０２２０ 米国）を用いて、フィードを２５ｍＭトリスｐＨ７．０の中に２度透析する。続いて溶液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。
ＣＨＯ細胞から生産されたＭＡＢＩを清澄化し、その後、プロテインＡカラムクロマトグラフィー（２５ｍＭの酢酸、２５ｍＭのグリシンＨＣｌで溶出される）を使用して単離する。プロテインＡ溶出液のｐＨを１Ｍトリス塩基でｐＨ７．０に調整し、溶液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。ｐＨ７．０のＭＡＢＩフィードを実施例３に記載した手順に従って製造され、ＴＦＦで精製されたＸＭｕＬＶと１．０Ｅ＋０５ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの目標添加まで混合する。次いで、混合されたフィードを、活性炭と接触させる前に０．４５μｍデュラポアフィルターで濾過する。
ＣＨＯ細胞から生産されたＭＡＢＩＩを清澄化し、その後、プロテインＡカラムクロマトグラフィー（２５ｍＭの酢酸、２５ｍＭのグリシンＨＣｌで溶出される）を使用して単離する。プロテインＡ溶出液のｐＨを１Ｍトリス塩基でｐＨ７．０に調整し、溶液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。続いて透析チューブ（標準ＲＣ透析トライアルキット、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １−３、３．５Ｋ ＭＷＣＯ、５４ｍｍフラット幅、シリアル番号１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ、ランチョドミンゲス、カリフォルニア州、９０２２０ 米国）を用いて、フィードを２５ｍＭトリスｐＨ７．０の中に２度透析する。溶液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。
ＭＡＢＩＩＩは、Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏにより清澄化細胞培養物として提供される。それは、プロテインＡクロマトグラフィー（ｐＨ２．６の２０ｍＭのグリシン−塩酸塩緩衝液を用いて溶出される）により捕捉される。溶出液は高いレベルのＨＣＰを有し、従ってプロテインＡカラムクロマトグラフィーを使用して２回目の精製を行う。クロマトグラフィーカラムに充填する前に、ＭＡＢＩＩＩ溶液の塩化ナトリウム濃度を０．５Ｍに上昇させる。その後、ＭＡＢＩＩＩ抗体を２５ｍＭの酢酸、２５ｍＭのグリシンＨＣｌで溶出する。ＭＡＢＩＩＩ溶出液のｐＨを１Ｍトリス塩基でｐＨ７．０に調整し、溶液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。透析チューブ（標準ＲＣ透析トライアルキット、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １−３、３．５Ｋ ＭＷＣＯ、５４ｍｍフラット幅、シリアル番号１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ、ランチョドミンゲス、カリフォルニア州、９０２２０ 米国）を用いて、フィードを２５ｍＭトリスｐＨ７．０の中に２度透析する。溶液をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１ Ｌ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州、０１８２１、米国）で濾過する。

Claims (16)

  1. 標的タンパク質を含む試料からウイルスを除去するために活性炭を使用できるかどうかを決定するための方法であって、試料が０．２ｇ／Ｌ以上のタンパク質濃度を有し、
    （ａ）標的タンパク質を含む試料の一部を提供する工程；
    （ｂ）１０４から１０９ＰＦＵ／ｍｌの範囲の量で試料の一部にウイルスを添加する工程；
    （ｃ）活性炭を充填したカラムに試料の一部を流す工程；
    （ｄ）カラムから１以上のフロースルー画分を収集する工程；および
    （ｅ）１つ以上のフロースルー画分中のウイルス量を測定する工程
    を含み、少なくとも３．０ＬＲＶの、１以上のフロースルー画分中のウイルス量の低減が、試料からウイルスを除去するために活性炭を使用できることを示す、方法。
  2. 試料が０．５ｇ／Ｌ以上のタンパク質濃度を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 試料が１ｇ／Ｌ以上のタンパク質濃度を有する、請求項１に記載の方法。
  4. 試料が３．０から１０．０の範囲内のｐＨおよび／または０．５Ｍ未満の塩濃度を有する、請求項１に記載の方法。
  5. ウイルスが、レトロウイルス、レトロウイルス様粒子およびパルボウイルスからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  6. ウイルスが、マウスの微小ウイルスおよび異種指向性マウス白血病ウイルスから選択される、請求項１に記載の方法。
  7. 試料が細胞培養フィードを含む、請求項１に記載の方法。
  8. 細胞培養フィードがＣＨＯ細胞培養フィードである、請求項５に記載の方法。
  9. 標的タンパク質が組換えタンパク質である、請求項１に記載の方法。
  10. 標的タンパク質が治療用タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  11. 標的タンパク質が抗体である、請求項１に記載の方法。
  12. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項９に記載の方法。
  13. 試料が清澄化細胞培養フィードを含む、請求項１に記載の方法。
  14. 清澄化細胞培養フィードが、遠心分離、沈降、深層濾過、スクリーン濾過、凝集、刺激応答性ポリマーの使用およびｐＨ変化から選択される１つ以上の方法を使用して得られる、請求項１３に記載の方法。
  15. 試料が、タンパク質Ａクロマトグラフィーカラムから得られた溶出液を含み、溶出液が標的タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
  16. 工程（ｅ）が、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）アッセイ、プラーク形成単位アッセイ、フォーカス形成単位アッセイ、５０％致死量アッセイ、血球凝集アッセイ、蛍光焦点アッセイ（ＦＦＡ）、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）、一元放射免疫拡散アッセイ（ＳＲＩＤ）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および透過型電子顕微鏡からなる群から選択される１つ以上の方法を使用する、請求項１に記載の方法。
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