TW202045527A - 包含使用活性碳材料之步驟之抗體純化方法 - Google Patents

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Abstract

本發明的課題係提供一種方法，其在抗體的純化中減少製造成本並縮短純化期間，並且有效率地去除溶液所含的雜質，將抗體確實地純化至使用作為人類治療用的充分純度。 本發明的解決手段係發現藉由活性碳材料，不論混合存在的雜質的量或種類為何皆可穩定地純化至高純度，更可確實地達成高的病毒清除能力，且在使用CHO細胞的抗體醫藥品的純化步驟中，能將利用活性碳材料之處理代替具有病毒清除能力的AEX層析步驟。藉此，相較於以往的純化方法，可單純且有效率地將抗體純化至使用作為人類治療用的充分純度，而且減少製造成本。

Description

包含使用活性碳材料之步驟之抗體純化方法
本發明係關於將抗體純化至高純度之方法。
近年來，對於作為醫藥品的單株抗體的注目、期待顯著。抗體因對於目標抗原進行特異性結合，故被期待高藥效與副作用少，尤其作為抗癌劑而受到注目。
多數的抗體醫藥品係藉由將CHO細胞作為宿主的生產系統而被製造(非專利文獻1)，但在培養上清液中，除了為目標物質之抗體以外，亦包含有源自宿主細胞的雜質(蛋白質、DNA等)、源自目標物質的雜質(凝聚物、類似物等)、及類病毒粒子。源自宿主細胞的蛋白質(宿主細胞蛋白(Host cell protein；HCP))已知對於人類係被辨識作為異種蛋白質，且不僅呈現抗原性，亦存在致腫瘤性風險。又，源自宿主細胞的DNA亦有致腫瘤性的疑慮。為源自目標物質的雜質之凝聚物具有成為免疫原性的原因的可能性，而片段物及目標蛋白質的轉譯後修飾物有對安全性及藥效造成不良影響的疑慮。再加上，內生性病毒及源自內生性病毒的DNA亦有感染性的疑慮。又，亦需要對於外生性病毒的混入的對策。多數情形，重要的是在避免來自細胞基材(例如主要使用於生產的CHO細胞)、培養基原材料、製備培養基的外生性病毒混入風險上進行各種悉心鑽研，以否定在各種in vitro病毒試驗、in vivo病毒試驗等中有可能混入製造步驟的代表性病毒的混入。再者，需要藉由評價在代表性模式病毒的純化程序中之衰減率及去除性能，而無限地降低最終所得之原藥中的病毒混入風險，進行安全醫藥品的製造。因此，在純化程序中，除了以高產率回收為目標物質之抗體，更需要使其完成作為可再現性佳且有效地去除雜質的純化方法。
為了上述目的，抗體的純化方法係組合包含複數的層析法之步驟而建立。一般而言，能使用以蛋白質A為首的親和層析法、離子交換層析法、疏水性相互作用層析法、陶瓷型氫氧磷灰石(ceramic hydroxyapatite)層析法等。此等層析法係基於目標物質與雜質的電荷、疏水性的程度、或者分子尺寸、或目標物質與經固定化的配體之間的特異性結合作用，而可效率佳地分離並去除源自宿主細胞的雜質、源自目標物質的雜質、浸出蛋白質A、類病毒粒子等。
尤其，作為抗體純化法的一般層析法手法，已報告許多組合蛋白質A層析法、陰離子交換(AEX)層析法及陽離子交換(CEX)層析法這三步驟而將抗體純化至高純度的例子。此等層析法，一般係使用結合/析出(B/E)模式(bind and elute mode)或流通(F/T)模式(flow-through mode)而實施。其中，在蛋白質A層析法及CEX層析法中，廣泛使用在使為目標物質之抗體吸附在樹脂等後以適當的條件進行與雜質的分離之B/E模式，除了去除上述雜質中包含內生性病毒的病毒的能力以外，亦能高度地純化目標物質。但是，在B/E模式中，因使目標物質吸附在樹脂等，故變得需要大量的樹脂及大型的管柱，而成為製造成本高的原因之一。
另一方面，伴隨技術的進展，在近年的CEX層析法中，已報告由包含過量裝填(over load)模式的F/T模式所致之純化手法的例子。以使混入量較目標物質少的雜質吸附在樹脂等的狀態，使為目標物質之抗體直接通過，藉此實現管柱的小型化與作業步驟的簡單化、效率化，其結果顯示亦可達成由層析樹脂的使用量減少所致之成本削減的可能性。實際上，在至今的B/E模式中，即使使用高性能樹脂，使用條件亦為100g/L樹脂以下，相對於此，在F/T模式中，即使藉由超過其10倍量的1000g/L樹脂的條件，亦可利用在目標物質的純化。亦即，因以1/10以下的樹脂容量便得到同等的純化性能，故期待隨之而來的管柱的小型化、低成本化。此種管柱的小型化，亦伴隨著使用緩衝液量的削減及各種槽容量的尺寸縮減，而被報告有利於由作業負荷的大幅減少所致之製造效率化(專利文獻1、非專利文獻2及非專利文獻3)。但是，作為高效率純化步驟而受期待的CEX層析法的F/T模式，因使混合存在的雜質吸附在少量的樹脂等並進行分離去除，故相較於B/E模式，其課題在於分離能力受到混合存在的雜質的量或種類影響。
再者，近年來，藉由培養步驟中之生產性的提升，多數的生成物被裝填在層析管柱，對於層析管柱的負擔增加。對於此情況，已報告藉由將作為高效率純化步驟而受期待的AEX層析法及CEX層析法的F/T模式與活性碳材料進行組合，而減少包含HCP的複數的雜質，結果延長層析管柱的使用時間(專利文獻2)。
但是，此等報告受限於僅可去除一般的源自宿主細胞的雜質(蛋白質、DNA)及源自目標物質的雜質(凝聚物、類似物等)的可能性，而期望一種具體的純化程序，其實現：原本的純化程序所期望更確實地去除之源自宿主細胞的雜質及源自目標物質的雜質，以及更確實且便宜地去除內生性及外生性病毒。 [先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1　國際公開第WO2011/150110號 專利文獻2　國際公開第WO2013/028330號 [非專利文獻]
非專利文獻1　Reichert, J. (2012). Marketed therapeutic antibodies compendium. MABs 4:3, 413-415. 非專利文獻2　Brown, A., Bill, J., Tully, T., Radhamohan, A., & Dowd, C. (2010). Overloading ion-exchange membranes as a purification step for monoclonal antibodies. Biotechnol. Appl. Biochem., 56:59-70. 非專利文獻3　Liu, H.F., McCooey, B., Duarte, T., Myers, D.E., Hudson, T., Amanullah, A., van Reis, R., & Kelley, B.D. (2011). Exploration of overloaded cation exchange chromatography for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. A., 1218, 6943-6952.
[發明所欲解決的課題]
在被期待作為高效率純化步驟的CEX層析法的F/T模式中，相較於B/E模式，有混合存在的雜質的量及種類對分離能力造成影響的課題。又，在AEX層析法及CEX層析法的F/T模式中組合活性碳材料的抗體純化方法雖可延長層析管柱的使用時間，但有純化步驟數多的課題。亦即，因除了蛋白質A層析法、AEX層析法及CEX層析法這三步驟的層析法以外還要實施利用活性碳材料之處理，故純化步驟數多，因此製造成本變高，且純化期間變長。又，在目標為低成本化的純化程序的步驟簡化中，不僅有源自宿主細胞的雜質及源自目標物質的雜質的清除能力降低之虞，亦有內生性及外生性病毒的清除能力降低之虞。因此，重要的課題為更確實地去除雜質，尤其是去除內生性、外生性病毒。上述課題的解決因不僅提供低成本且高效率的抗體醫藥品的製造方法，更連帶穩定供給高品質的抗體醫藥品，結果達成確保患者的安全性，故在產業上非常重要。 [用於解決課題的手段]
本案發明人等為了解決前述課題而專心致志地探討的結果，發現維持與以往的純化方法同等的品質且減少純化的步驟數之有效率的純化方法。亦即，發現藉由將CEX層析法的F/T模式與利用活性碳材料之處理加以組合，可期待藉由活性碳材料減少雜質，且可便宜地利用，另一方面，在有因混合存在的雜質的量或種類而分離能力降低的課題之CEX層析法的F/T模式中，可穩定且高純度地純化目標抗體醫藥品等。又，本案發明人等發現藉由活性碳材料而確實地去除病毒，並在使用CHO細胞的抗體醫藥品的純化步驟中補足具有高病毒清除能力的AEX層析步驟的功能，結果建立了能省略AEX層析步驟的製造程序。亦即，本案發明人等發現將蛋白質A層析法及CEX層析法的F/T模式這二步驟的層析法與利用活性碳材料之處理加以組合之有效率的純化方法，且相較於以往的純化方法，可減少純化步驟數及製造成本，並能有效率地將抗體純化至對於人類治療用途而言為充分的品質，進而完成本發明。
亦即，本發明如同以下所述。 [1]一種方法，其係用於從包含一或複數的雜質之組合物純化抗體的手法，其包含a1.至e1.的步驟， a1.準備含有抗體的細胞培養上清液； b1.藉由親和層析樹脂處理前述細胞培養上清液，獲得包含抗體的親和層析池液； c1.在前述親和層析池液中，將病毒進行不活化，獲得病毒不活化液； d1.藉由活性碳材料處理前述病毒不活化液，獲得活性碳材料池液； e1.藉由陽離子交換材料處理前述活性碳材料池液，獲得陽離子交換材料池液。 [2]如[1]所記載之方法，其係用於從包含一或複數的雜質之組合物純化抗體的手法，其包含a2.至f2.的步驟， a2.準備含有抗體的細胞培養上清液； b2.藉由親和層析樹脂處理前述細胞培養上清液，獲得包含抗體的親和層析池液； c2.在前述親和層析池液中，將病毒進行不活化，獲得病毒不活化液； d2.藉由深層過濾器(depth filter)處理前述病毒不活化液，獲得深層過濾器過濾池液； e2.藉由活性碳材料處理前述深層過濾器過濾池液，獲得活性碳材料池液； f2.藉由陽離子交換材料處理前述活性碳材料池液，獲得陽離子交換材料池液。 [3]如[1]或[2]所記載之方法，其中，親和層析樹脂為蛋白質A樹脂。 [4]如[3]所記載之方法，其中，蛋白質A樹脂為KanCapA、KanCapA3G、MabSelect SuRe、MabSelect SuRe pcc、MabSelect PrismA、或Amsphere A3。 [5]如[1]至[4]中任一項所記載之方法，其中，病毒不活化係選自包含利用酸、界面活性劑、化學物質、核酸交聯劑、紫外線、加馬射線及熱的處理之群組中的至少任一者。 [6]如[5]所記載之方法，其中，病毒不活化包含使親和層析池液的pH降低至3~4。 [7]如[6]所記載之方法，其中，在病毒不活化中，將親和層析池液培養60~120分鐘。 [8]如[6]或[7]所記載之方法，其中，在病毒不活化中，將親和層析池液培養在15~30℃。 [9]如[1]至[8]中任一項所記載之方法，其中，裝填至活性碳材料的溶液、活性碳材料的平衡化緩衝液及清洗緩衝液的pH為4.5~7.5。 [10]如[9]所記載之方法，其中，裝填至活性碳材料的溶液、活性碳材料的平衡化緩衝液及清洗緩衝液的pH為4.5~5.5。 [11]如[1]至[10]中任一項所記載之方法，其中，裝填至活性碳材料的溶液、活性碳材料的平衡化緩衝液及清洗緩衝液的導電率為2~10mS/cm。 [12]如[11]所記載之方法，其中，裝填至活性碳材料的溶液、活性碳材料的平衡化緩衝液及清洗緩衝液的導電率為2~5mS/cm。 [13]如[1]至[12]中任一項所記載之方法，其中，利用活性碳材料之處理係使用包含活性碳材料的過濾器而進行。 [14]如[13]所記載之方法，其中，過濾器為Millistak＋ Pod CR40、Zeta Plus活性碳吸附深層過濾器、或SUPRAcap 50 Seitz AKS濾器。 [15]如[1]至[14]中任一項所記載之方法，其中，對於陽離子交換材料，裝填超過該陽離子交換材料的吸附容量的活性碳材料池液。 [16]如[15]所記載之方法，其中，活性碳材料池液對於陽離子交換材料的裝填密度為500~2000g/L。 [17]如[16]所記載之方法，其中，活性碳材料池液對於陽離子交換材料的裝填密度為1000~1500g/L。 [18]如[1]至[17]中任一項所記載之方法，其中，陽離子交換材料為樹脂、整體管柱、或膜。 [19]如[18]所記載之方法，其中，陽離子交換材料的官能基為磺丙基、磺乙基、磺異丁基(sulfoisobutyl)、或羧基。 [20]如[19]所記載之方法，其中，陽離子交換材料為POROS XS、Eshmuno CPX、Eshmuno CP-FT、或CaptoS ImpAct。 [21]如[1]至[20]中任一項所記載之方法，其中，裝填至陽離子交換材料之溶液的pH為4~6。 [22]如[21]所記載之方法，其中，裝填至陽離子交換材料之溶液的pH為4.5~5.5。 [23]如[1]至[22]中任一項所記載之方法，其中，裝填至陽離子交換材料之溶液的導電率為3~7mS/cm。 [24]如[23]所記載之方法，其中，裝填至陽離子交換材料之溶液的導電率為3~5mS/cm。 [25]如[1]至[24]中任一項所記載之方法，其中，進一步藉由疏水性相互作用層析法處理陽離子交換材料池液，獲得池液。 [26]如[25]所記載之方法，其中，疏水性相互作用層析法為流通模式。 [27]如[26]所記載之方法，其中，疏水性相互作用層析法係使用樹脂或膜而實施。 [28]如[27]所記載之方法，其中，疏水性相互作用層析樹脂或膜具有苯基、苄基或己基。 [29]如[28]所記載之方法，其中，疏水性相互作用層析材料為POROS Benzyl Ultra、POROS Benzyl、Hexyl-650C、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow、Phenyl Sepharose High Performance、Sartobind Phenyl或ReadyToProcess Adsorber Phenyl。 [30]如[1]至[14]中任一項所記載之方法，其中，藉由疏水性相互作用層析法處理活性碳材料池液，獲得池液，再藉由陽離子交換材料進行處理，獲得池液。 [31]如[30]所記載之方法，其中，疏水性相互作用層析法為流通模式。 [32]如[31]所記載之方法，其中，疏水性相互作用層析法係使用樹脂或膜而實施。 [33]如[32]所記載之方法，其中，疏水性相互作用層析樹脂或膜具有苯基、苄基或己基。 [34]如[33]所記載之方法，其中，疏水性相互作用層析材料為POROS Benzyl Ultra、POROS Benzyl、Hexyl-650C、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow、Phenyl Sepharose High Performance、Sartobind Phenyl或ReadyToProcess Adsorber Phenyl。 [35]如[30]至[34]中任一項所記載之方法，其中，對於陽離子交換材料，裝填超過該陽離子交換材料的吸附容量的疏水性相互作用層析池液。 [36]如[35]所記載之方法，其中，疏水性相互作用層析池液對於陽離子交換材料的裝填密度為500~2000g/L。 [37]如[36]所記載之方法，其中，疏水性相互作用層析池液對於陽離子交換材料的裝填密度為1000~1500g/L。 [38]如[30]至[37]中任一項所記載之方法，其中，陽離子交換材料為樹脂、整體管柱、或膜。 [39]如[38]所記載之方法，其中，陽離子交換材料的官能基為磺丙基、磺乙基、磺異丁基、或羧基。 [40]如[39]所記載之方法，其中，陽離子交換材料為POROS XS、Eshmuno CPX、Eshmuno CP-FT、或CaptoS ImpAct。 [41]如[30]至[40]中任一項所記載之方法，其中，裝填至陽離子交換材料之溶液的pH為4~6。 [42]如[41]所記載之方法，其中，裝填至陽離子交換材料之溶液的pH為4.5~5.5。 [43]如[30]至[42]中任一項所記載之方法，其中，裝填至陽離子交換材料之溶液的導電率為3~7mS/cm。 [44]如[43]所記載之方法，其中，裝填至陽離子交換材料之溶液的導電率為3~5mS/cm。 [45]如[1]至[44]中任一項所記載之方法，其中，至少一種雜質係選自包含源自宿主細胞的蛋白質(宿主細胞蛋白(Host cell protein；HCP))、類磷脂酶B 2(phospholipase B-like 2；PLBL2)、病毒、類病毒粒子、高分子量體(高分子量物種(high molecular weight species；HMWS))、低分子量體(低分子量物種(low molecular weight species；LMWS))、培養基成分、浸出蛋白質A及/或DNA之群組。 [46]如[1]至[45]中任一項所記載之方法，其中，步驟為連續的。 [47]一種抗體，其係藉由如[1]至[46]中任一項所記載之方法而純化。 [48]一種方法，其係用於從包含一或複數的雜質之組合物純化抗體的手法，其包含a1.至d1.的步驟，藉由實施步驟d1而提升PLBL2清除能力， a1.準備含有抗體的細胞培養上清液； b1.藉由親和層析樹脂處理前述細胞培養上清液，獲得包含抗體的親和層析池液； c1.在前述親和層析池液中，將病毒進行不活化，獲得病毒不活化液； d1.藉由活性碳材料處理前述病毒不活化液，獲得活性碳材料池液。 [49]一種方法，其係用於從包含一或複數的雜質之組合物純化抗體的手法，其包含a2至e2.的步驟，藉由實施步驟e2而提升PLBL2清除能力， a2.準備含有抗體的細胞培養上清液； b2.藉由親和層析樹脂處理前述細胞培養上清液，獲得包含抗體的親和層析池液； c2.在前述親和層析池液中，將病毒進行不活化，獲得病毒不活化液； d2.藉由深層過濾器處理前述病毒不活化液，獲得深層過濾器過濾池液； e2.藉由活性碳材料處理前述深層過濾器過濾池液，獲得活性碳材料池液。 [50]一種方法，其係用於從包含一或複數的雜質之組合物純化抗體的手法，其包含a1.至e1.的步驟，藉由實施步驟d1而提升PLBL2清除能力， a1.準備含有抗體的細胞培養上清液； b1.藉由親和層析樹脂處理前述細胞培養上清液，獲得包含抗體的親和層析池液； c1.在前述親和層析池液中，將病毒進行不活化，獲得病毒不活化液； d1.藉由活性碳材料處理前述病毒不活化液，獲得活性碳材料池液； e1.藉由陽離子交換材料處理前述活性碳材料池液，獲得陽離子交換材料池液。 [51]一種方法，其係用於從包含一或複數的雜質之組合物純化抗體的手法，其包含a2至f2.的步驟，藉由實施步驟e2而提升PLBL2清除能力， a2.準備含有抗體的細胞培養上清液； b2.藉由親和層析樹脂處理前述細胞培養上清液，獲得包含抗體的親和層析池液； c2.在前述親和層析池液中，將病毒進行不活化，獲得病毒不活化液； d2.藉由深層過濾器處理前述病毒不活化液，獲得深層過濾器過濾池液； e2.藉由活性碳材料處理前述深層過濾器過濾池液，獲得活性碳材料池液； f2.藉由陽離子交換材料處理前述活性碳材料池液，獲得陽離子交換材料池液。 [發明效果]
本案發明人等發現，藉由在至今的抗體純化程序中追加利用活性碳材料之處理，可減少對於後段純化步驟的雜質負載(loading)，且不論混合存在的雜質的量或種類為何，皆可將抗體穩定地純化至目標純度。再者，本案發明人等發現，利用利用活性碳材料之處理可達成高病毒清除能力，在使用CHO細胞的抗體醫藥品的純化步驟中補足具有病毒清除能力的AEX層析步驟的功能，結果建立了能省略AEX層析法的製造程序。藉此，相較於以往的純化方法，可減少純化步驟數及製造成本，並有效率地將抗體純化至對於使用在人類治療而言為充分的純度。
[用於實施發明的形態]
以下，詳細地說明本發明。 1.定義
本說明書中，「抗體」的用語意指：單株抗體、多株抗體、嵌合抗體、人源化(humanized)抗體、人類抗體(human antibody)、由至少二個完整的抗體所形成之多重特異性抗體(雙重特異性抗體)、Fc融合蛋白質、及呈現生物學活性的抗體片段等。此外，能適用本發明的抗體，並不被該抗體特異性結合的抗原所限定。又，能適用本發明的抗體，並不被該抗體的胺基酸序列所限定。
本說明書中，「結合/析出(B/E)模式」的用語意指：試料中所含之至少一個生成物與層析樹脂或介質結合，其後所析出之生成物分離技術。
本說明書中，「流通(F/T)模式」的用語意指：試料中的至少一個生成物意圖通過層析樹脂或介質而流動，但至少一個潛在的成分與層析樹脂或介質結合之生成物分離技術。
本說明書中，「過量裝填模式」的用語意指：意圖超過管柱等的吸附容量地進行裝填，且利用目標物質與雜質的吸附量的強度差之生成物分離技術。本說明書中，對於陽離子交換材料，裝填超過該陽離子交換材料的吸附容量的抗體粗純化物。抗體粗純化物對於陽離子交換材料的吸附容量係每1L陽離子交換材料為約100g的蛋白質量。過量裝填模式中之裝填密度係每1L陽離子交換材料為150~4000g的蛋白質量，但較佳的裝填密度為500~2000g/L的範圍，再佳的裝填密度為1000~1500g/L的範圍。
本說明書中，「親和層析法」的用語係指：目標蛋白質(例如，含有目標Fc區域的蛋白質或抗體)特異性地結合至對於目標蛋白質具特異性的配體之蛋白質分離技術。在純化抗體之情形中，此種配體為蛋白質A或者蛋白質G或其功能性變異體，其與層析固相材料共價結合，抗體溶液在與層析固相材料接觸之際會與溶液中的抗體結合。
本說明書中，「深層過濾器」的用語意指：以從抗體溶液去除粒子為目的而使用之具有逐漸減少的孔徑之連續地配置之一連串的過濾器。深層過濾器的三維基質形成抗體溶液所通過的迷路狀路徑，涵蓋該基質的深度整體而隨機地吸附粒子並機械地進行捕捉。各種的深層過濾器係由捲綿、聚丙烯、嫘縈纖維素、玻璃纖維、燒結金屬、磁器、矽藻土或其他公知成分所構成。
本說明書中，「陽離子交換材料」或「CEX (cation exchange)材料」的用語係互換地使用，意指帶負電而如此具有用於與通過固相上或固相中的水性溶液中的陽離子進行交換之游離陽離子的固相。
本說明書中，「陰離子交換材料」或「AEX(anion exchange)材料」的用語係互換地使用，意指具有與固相結合之一級、二級、三級或四級胺基等一或複數個帶正電的配體之帶正電的固相。
本說明書中，「疏水性相互作用層析法」或「HIC(Hydrophobic Interaction Chromatography)」的用語意指：用於基於分子的疏水性，亦即分子從水性溶液吸附至疏水性表面的能力而分離分子的方法。疏水性相互作用層析法，典型而言係依賴溶質分子的表面上的疏水性基的差異。此等疏水性基具有與不溶性基質的表面上的疏水性基結合之傾向。由於HIC使用比逆相液體層析法更高極性、更少變性的環境，故時常藉由與離子交換或凝膠過濾層析法組合而通常地使用在抗體純化。
本說明書中，「活性碳材料」的用語意指由碳所構成或含有碳之任意物質、活性碳。「活性碳(activated carbon)」意指為了強化其細孔結構而經處理的碳質材料。活性碳為具有非常高的表面積之多孔質的固體。此等可從以煤、木材、椰子殼、樹木果實的殼、泥炭為首的各種供給源而得。活性碳可使用伴隨在經控制的環境下的加熱之物理性活性化、或使用強酸、鹼、或氧化劑之化學性活性化，而從此等材料進行製造。活性化方法製作出用於對活性碳賦予高雜質清除能力之具有高表面積的多孔質結構。相對於幾乎所有的其他吸附材料，活性碳被認為使用較弱的凡得瓦力而與分子進行相互作用。作為用於本發明的純化方法之活性碳，可單獨使用一種類的活性碳，亦可單獨或混合使用二種類以上的活性碳。
本說明書中，「連續的」的用語意指具有在被直接連結的各材料間能連續流動之某種其他機制。亦即，意指用於純化目的物質的方法，其包含二個以上的程序步驟(或單元操作)，以使來自一個程序步驟的輸出會無介入地直接流動至方法中的下一個程序步驟，且可針對其期間的至少一部分同時實施二個以上的程序步驟。
本說明書中，「去除」、「減少」、「清除」的用語係互換地使用，意指使應被純化之包含抗體的試料中的一個以上的雜質量降低。
本說明書中，「純化」、「提高純度」的用語係互換地使用，意指藉由從試料去除一個以上的雜質，而使目標抗體對於試料中的一個以上的雜質之比例增加。
本說明書中，「導電率」的用語意指在二個電極間傳導電流之水溶液的能力。在溶液中，電流係藉由離子輸送而流動。因此，若存在於水溶液中的離子的量增加，則溶液變得具有更高的導電率。導電率可使用導電率測定器而測定，導電率的測定單位為每1公分的毫導電度(mS/cm或mS)。溶液的導電率可藉由改變其中的離子濃度而變更。例如，溶液中的緩衝液的濃度及/或鹽的濃度可為了達成所期望的導電率而變更。較佳為以達成所期望的導電率的方式修正各種緩衝液的鹽濃度。
本說明書中，「流份(fraction)」的用語意指例如在將試料負載至活性碳材料的步驟中，在供給包含目標抗體的試料後所收集之小容量的液體。
本說明書中，「HCP；宿主細胞蛋白(host cell protein)」的用語意指：由中國倉鼠卵巢(CHO)細胞培養液所誘導之源自宿主細胞的蛋白質的混合物。HCP一般而言以雜質的形態存在於細胞培養液中，該細胞培養液包含CHO細胞中所表現之抗體等目標蛋白質。
本說明書中「HMWS；高分子量物種(high molecular weight species)」的用語意指：在分子量不同的抗體變異體之中，在比單體更高分子量區域側析出者。
本說明書中「LMWS；低分子量物種(low molecular weight species)」的用語意指：在分子量不同的抗體變異體之中，在比單體更低分子量區域側析出者。
本說明書中，「病毒」的用語意指僅可在活細胞的內部進行複製之小型的感染體或粒子。此等一般而言係由封入至蛋白質的殼體內側之核酸(RNA或DNA)、及依情況而定的脂質套膜所構成。
本說明書中，「類病毒粒子」的用語意指：在電子顯微鏡下推測形態上與既知病毒具關連性之結構物。
本說明書中，「反轉錄病毒」的用語意指：能透過經逆轉錄的DNA中間體而將其遺傳訊息整合入經感染的細胞的基因體DNA之RNA病毒。
本說明書中，「類反轉錄病毒粒子(retrovirus-like particles)」的用語意指：藉由在其基因體中具有源自反轉錄病毒的DNA部分之細胞而生成的粒子。此等粒子與反轉錄病毒類似，但常常為非感染性。本說明書的實施例所使用之小鼠白血病病毒(MLV)表現典型的反轉錄病毒或類反轉錄病毒粒子。
本說明書中，「小病毒」的用語係指具有5000個核苷酸的平均基因體尺寸及18至26nm的直徑之直鏈、非片段化單股DNA非套膜病毒。在本說明書所記載的方法中所使用之典型的小病毒為小鼠微小病毒(MMV)。
本說明書中，「對數去除值」或「LRV」的用語係表示在使既知量的雜質通過管柱、過濾器等時，由管柱、過濾器等所致之雜質的清除能力的值。在Cf為進料液中的雜質的濃度，且Cp為通過管柱、過濾器後的雜質的濃度時，LRV=log(Cf)-log(Cp)。
本說明書中，作為「培養基成分」，可列舉血清、成長因子(胰島素等)、或抗生素等。
2.由F/T模式CEX層析法所致之HCP的去除 遵循專利文獻1、非專利文獻2及非專利文獻3所示之先前技術，已知接續蛋白質A層析法、AEX層析法而利用F/T模式CEX層析法純化抗體培養液的結果，依據抗體種類(包含由宿主細胞或者培養方法差異所致之混合存在的雜質的量或種類之差異)而有無法充分去除HCP的例子。已知接續蛋白質A層析法、AEX層析法而包含F/T模式CEX層析法的方法由成本、勞力及作業時間的方面而言雖優異，但在去除雜質、尤其HCP的觀點上，其效果不穩定。
HCP已廣為人知具有經由各種機制而誘導免疫原性的可能性。實際上，在Somatropin(生長激素)的生物後續製品的臨床試驗中，有報告指出因HCP的殘留而所有患者產生抗HCP抗體，最多60%的患者產生非中和抗Somatropin抗體(M. Pavlovic et al., Horm.Res. 69:14-21(2008))。藉由進一步去除HCP，抗Somatropin抗體被改善至被報告在其他成長荷爾蒙抗體的程度。又，在由CHO細胞所產生的重組第IX因子的臨床試驗中，報告以相當高的比例產生抗HCP抗體，且雖未被報告有不良事件，但仍接受到來自管制機關的暫緩命令(https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/LicensedProductsBLAs/FractionatedPlasmaProducts/UCM448429.pdf Food and Drug Administration STATISTICAL REVIEW AND EVALUATION BLA FINAL, Product Name: IB1001, Indication(s): Control and prevention of bleeding episodes and perioperative management in patients with hemophilia B, CBER Receipt Date: Apr 6 2012 或https://www.news-medical.net/news/20120710/Inspiration-receives-FDA-clinical-hold-order-for-IB1001-phase-III-studies-on-hemophilia-B.aspx News-Medical.net - An AZoNetwork Site Inspiration receives FDA clinical hold order for IB1001 phase III studies on hemophilia B, Jul 10 2012)。
除了被報告有與安全性相關的不良事件之情形以外，即使是未被報告有與安全性相關的不良事件之情形，管制機關亦會考慮潛在風險的可能性，而有指示在進一步減少殘留的HCP後實施臨床試驗的可能性。再者，近年來，報告有因殘留的HCP(脂蛋白脂酶)而分解製劑中的聚山梨醇酯，影響醫藥品的穩定性的例子(T Hall et al., J. Chromatogr. A 105:1633-1642(2016))，由醫藥品的穩定性方面而言，在純化步驟中適當地去除HCP也是重要的。
針對由HCP的殘留所致之對於安全性及穩定性的影響，認為除了依據宿主細胞的種類及殘留的HCP的種類而異，亦依據製品的用法、用量而異。因此，針對HCP的殘留容許值，需要考慮製造步驟、最大投與量、投與部位、投與頻率等，而對於每個製品設定適當的值，但期望能儘可能地減少製造步驟。
由以上所述，期望一種不依賴抗體種類的泛用方法，其即使在使用F/T模式作為CEX層析法的純化流程中，亦可減少以HCP為首的雜質。
3.由活性碳材料的應用所致之雜質的去除 本案發明人等目標特定一種減少製造成本且將抗體確實地純化至高純度的方法，而在以往的純化步驟中追加利用活性碳材料之處理，藉此發現不論抗體種類為何皆可純化至高純度。
由作為異種蛋白質而能對人類顯示抗原性、又源自哺乳動物細胞的蛋白質存在致腫瘤性風險、再者對於醫藥品中由聚山梨醇酯分解所致之穩定性的觀點而言，如同前述，HCP需要以純化步驟去除至充分低的程度。又，類磷脂酶B 2(phospholipase B-like 2；PLBL2)為HCP的一種，但被報告為因與抗體的相互作用而殘留的搭便車(hitchhike)HCP(B. Tran et al., J. Chromatogr. A 1438:31-38(2016))。再者，因PLBL2殘留在抗體製劑中，而有報告指出在Lebrikizumab的臨床試驗中高頻率地產生抗倉鼠PLBL2抗體(國際公開第WO2015/038888號)。抗倉鼠PLBL2抗體的產生在臨床上的重要性仍未知，在Lebrikizumab的臨床試驗中即使高頻率地產生抗倉鼠PLBL2抗體，亦與安全性事件無關。但是，由反覆投與所致之長期曝露在過敏或過敏症的患者集團中仍然有使嚴重過敏、過敏症等不期望的影響增大之虞，因此製劑中的PLBL2被認為期望儘可能地減少。
對於此等要求，藉由追加利用活性碳材料之處理，而減少此等雜質對於CEX層析法的負載，其結果，可將HCP去除至充分低的程度。又，為因與抗體的相互作用而殘留的搭便車HCP之PLBL2，因在一般的純化方法中難以減少，故藉由活性碳材料而減少約50%的裝填液一事，亦即藉由活性碳材料而得到PLBL2的對數去除值(LRV)0.27一事具有重大意義。
再者，藉由活性碳材料而減少為源自目標物質的雜質之HMWS及LMWS。藉由由活性碳材料所致之HMWS的減少，而變得減少對於CEX層析法的負載，結果變得可穩定地減少最終純化物中的HMWS量。又，LMWS在一般的純化方法中難以減少，因此對於由活性碳材料所致之最終純化物的純度提升有很大的貢獻。
除此等之外，藉由調節裝填至活性碳材料的抗體溶液的pH，亦會使病毒清除能力提升。雖已揭示藉由活性碳材料而有去除反轉錄病毒及/或類反轉錄病毒粒子的可能性，或者藉由抗體溶液而有雖有限地但可去除小病毒的可能性(國際公開第WO2015/005961號)，但溶液pH條件為7.0。另一方面，在本發明中發現以pH5.0的條件可去除病毒，更進一步呈示了在pH5.0的條件中之病毒清除能力比已被報告的條件更良好。
在一般的抗體的純化法中，實施蛋白質A層析法、由低pH所致之病毒不活化處理，在不活化後有被中和至pH5.0附近之情形。又，在後段的CEX層析法中以pH5.0附近的條件進行實施的例子多，因此在此等步驟間實施利用活性碳材料之處理之際，可不實施特別的pH調整及稀釋操作等地進行利用活性碳材料之處理一事，對於單純化製造作業有很大貢獻。再者，依據抗體而有因pH變化而不穩定化之情形，因此可不調整pH地進行活性碳處理一事，被認為對於維持抗體的穩定性亦有很大貢獻。
在使用CHO細胞的抗體醫藥品的純化步驟中，一般而言，AEX層析步驟已知具有病毒清除能力，但因已明確得知活性碳材料具有與AEX層析法同等的病毒清除能力，故變得能以利用活性碳材料之處理取代AEX層析步驟，藉此，顯示可省略AEX層析法的可能性。以AEX層析法為首的層析法，其作業性繁雜，藉由使用活性碳材料作為吸附過濾器，可省略作業性繁雜的層析法，能成為單純且有效率的程序。又，藉由將高價的AEX樹脂及膜吸附器(Membrane Adsorber)等設為便宜的活性碳吸附過濾器，而達成運轉費用的大幅減少。再者，因不需要高額的層析裝置，且能置換成便宜的過濾器單元，故被認為對於減少製造設備的初期投資亦有很大的貢獻。
4.本發明所採用的純化步驟 本說明書中提供一種方法(以下，改良方法2)，其係用於從包含一或複數的雜質之組合物純化抗體的手法，其包含a1.至e1.的步驟， a1.準備含有抗體的細胞培養上清液； b1.藉由親和層析樹脂處理前述細胞培養上清液，獲得包含抗體的親和層析池液； c1.在前述親和層析池液中，將病毒進行不活化，獲得病毒不活化液； d1.藉由活性碳材料處理前述病毒不活化液，獲得活性碳材料池液； e1.藉由陽離子交換材料處理前述活性碳材料池液，獲得陽離子交換材料池液。
作為b1.步驟中之親和層析樹脂的較佳例，可列舉蛋白質A樹脂。作為能採用的蛋白質A樹脂，蛋白質A樹脂可列舉KanCapA(KANEKA)、KanCapA3G(KANEKA)、MabSelect SuRe(GE Healthcare Life Science)、MabSelect SuRe pcc(GE Healthcare Life Science)、MabSelect PrismA(GE Healthcare Life Science)、或Amsphere A3(JSR Life Sciences )，但不限定於此等樹脂。
針對c1.的步驟中之病毒不活化，可列舉選自包含使用酸、界面活性劑、化學物質、核酸交聯劑、紫外線、加馬射線及熱的處理之群組的任一種方法。選擇酸處理作為病毒不活化處理之情形的較佳pH範圍為使親和層析池液的pH降低至3~4的處理，作為病毒不活化處理更佳的pH為3.5。此情形的較佳的處理時間為60~120分鐘，較佳的處理溫度為15~30℃。
d1.的步驟中之活性碳材料被填充至層析管柱中。在其他實施形態中，活性碳材料為過濾器類型，被填充至拋棄式的Millistak＋(註冊商標)Pod等密閉一次性使用的裝置中。再者，在其他實施形態中，活性碳材料被填充至匣或膠囊中。大多數的過濾器類型係在纖維素基質等具強度的結構的濾材中混合活性碳材料。
作為市售的活性碳過濾器的例子，可列舉Millistak＋(註冊商標) Pod CR40(Merck Millipore)、Zeta Plus 活性碳吸附深層過濾器(3M)、SUPRAcap 50 Seitz(註冊商標) AKS濾器(PALL)，但不限定於此等活性碳材料。在一些實施形態中，活性碳過濾器具有在纖維素基質中保持活性碳材料的結構。d1.的步驟中之裝填至活性碳材料的溶液、活性碳材料的平衡化緩衝液及清洗緩衝液的較佳的pH為4.5~7.5，更佳的pH為4.5~5.5，再佳的pH為5.0。又，d1.的步驟的裝填至活性碳材料的溶液、活性碳材料的平衡化緩衝液及清洗緩衝液的較佳的導電率為2~10mS/cm，更佳的導電率為2~5mS/cm。
e1.的步驟中之陽離子交換材料係選擇樹脂、整體管柱、或膜中任一項。陽離子交換材料的官能基為磺丙基、磺乙基、磺異丁基、或羧基。作為市售的陽離子交換材料的例子，可列舉POROS XS(Thermo Fisher Scientific)、Eshmuno(註冊商標) CPX(Merck Millipore)、Eshmuno(註冊商標) CP-FT(Merck Millipore)、或Capto S ImpAct(GE Healthcare Life Science)，但不受限於此等陽離子交換材料。
在e1.的步驟中，裝填超過陽離子交換材料的吸附容量的由d1.的步驟所得之活性碳材料池液。裝填密度能在每1L陽離子交換材料為150~4000g的蛋白質量的範圍選擇，但較佳的裝填密度為500~2000g/L的範圍，再佳的裝填密度為1000~1500g/L的範圍。所裝填之活性碳材料池液的較佳的pH為pH4~6，更佳的pH為4.5~5.5，再佳的pH為5.0。又，e1.的步驟的裝填至陽離子交換材料的溶液之較佳的導電率為3~7mS/cm，更佳的導電率為3~5mS/cm。
在上述改良方法2中，可在a1.至e1.的各步驟前後追加一種類以上的任意步驟。
例如，在改良方法2中，可在c1.的步驟與d1.的步驟之間追加利用深層過濾器之處理。深層過濾器係可從吸附作用與由通常的多孔性濾材所致之機械性過濾作用這二方面大致捕捉尺寸超過1 μm的粒子之過濾器，且包含纖維素基質與矽藻土等濾材。藉由具有無數的長流路之具厚度的濾材，而有可在過濾器內部圍捕(trap)對象物的特徵。深層過濾器被填充至Millistak＋(註冊商標)Pod等密閉一次性使用的裝置中。作為市售的深層過濾器的例子，可列舉Millistak＋(註冊商標)A1HC、D0HC、X0HC，但不限定於此等深層過濾器。
作為追加深層過濾器的具體例，提供一種在改良方法2的c1.的步驟與d1.的步驟之間追加利用深層過濾器之處理之方法(以下，改良方法1)，其係用於從包含一或複數的雜質之組合物純化抗體的手法，其由包含a2.至f2.的步驟而成， a2.準備含有抗體的細胞培養上清液； b2.藉由親和層析樹脂處理前述細胞培養上清液，獲得包含抗體的親和層析池液； c2.在前述親和層析池液中，將病毒進行不活化，獲得病毒不活化液； d2.藉由深層過濾器處理前述病毒不活化液，獲得深層過濾器過濾池液； e2.藉由活性碳材料處理前述深層過濾器過濾池液，獲得活性碳材料池液； f2.藉由陽離子交換材料處理前述活性碳材料池液，獲得陽離子交換材料池液。
又，可在上述改良方法2的c1.的步驟與d1.的步驟之間、或在上述改良方法1的d2.的步驟與e2.步驟之間追加利用陰離子交換材料之處理。陰離子交換材料可選擇樹脂、整體管柱、或膜中任一項，但膜之情形可選擇Q膜。通常，陰離子交換材料被使用於F/T模式。作為市售的陰離子交換材料的例子，可列舉NatriFlo(註冊商標)HD-Q、Mustang(註冊商標)Q、或Sartobind(註冊商標)Q，但不限定於此等陰離子交換材料。
可將由上述改良方法2的e1.的步驟或上述改良方法1的f2.的步驟所得之陽離子交換材料池液進一步藉由疏水性相互作用層析法處理而獲得池液(以下，改良方法3)。又，可將由上述改良方法2的d1.的步驟或上述改良方法1的e2.的步驟所得之活性碳材料池液進一步藉由疏水性相互作用層析法處理而獲得疏水性相互作用層析池液，再藉由陽離子交換材料處理而獲得陽離子交換材料池液(以下，改良方法4)。前述的疏水性相互作用層析法較佳為F/T模式。又，前述的疏水性相互作用層析法係使用具有苯基、苄基或者己基的樹脂或膜而實施。作為市售的疏水性相互作用層析材料的例子，可列舉Phenyl Sepharose High Performance(GE Healthcare Life Science)、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(GE Healthcare Life Science)、Sartobind(註冊商標)Phenyl(sartorius)、ReadyToProcess Adsorber Phenyl(GE Healthcare Life Science)、POROS Benzyl Ultra(Thermo Fisher Scientific)、POROS Benzyl(Thermo Fisher Scientific)、Hexyl-650C(Tosoh)，但不限定於此等疏水性相互作用層析材料。
在此處所記載之任一方法的幾個實施形態中，進一步包含回收經純化的抗體。在幾個實施形態中，純化抗體係由此處所記載之任一純化步驟回收。
藉由上述的步驟而去除選自HCP、PLBL2、病毒、類病毒粒子、HMWS、LMWS、培養基成分、浸出蛋白質A及DNA的至少一種雜質。 [實施例]
藉由以下的實施例具體地說明本發明，但本發明不受限於此等實施例。
實施例1.一般方法 本實施例中，針對在實施例2以後所示的實施例中共通使用的一般的方法進行說明。
1)抗體濃度測定 抗體濃度係藉由使用PA ID Sensor Cartridge (2.1mm×3mm、Applied Biosystems)管柱的HPLC法而測定。
2)HCP測定 使用Cygnus Technologies公司的third-generation CHO宿主細胞蛋白套組或者BioGENES公司的CHO|360 HCP ELISA套組，並藉由酵素結合免疫吸附法(ELISA)而進行測定。將所得之HCP濃度除以抗體濃度，換算成ngHCP/mg抗體。 實施例2~5中使用Cygnus Technologies公司的third-generation CHO 宿主細胞蛋白套組，在實施例6~8中使用BioGENES公司的CHO|360 HCP ELISA套組。
3)PLBL2測定 使用Immunology Consultants Laboratory, INC.的倉鼠類磷脂酶B 2(Hamster Phospholipase B-Like 2)(PLBL2) ELISA套組，並藉由酵素結合免疫吸附法(ELISA)而進行測定。將所得之PLBL2濃度除以抗體濃度，換算成ngPLBL2/mg抗體。進一步藉由以下的計算，算出在各純化步驟的PLBL2清除能力(對數去除值，Log Reduction Value；LRV)。在Cf為進料液中的PLBL2的濃度且Cp為通過管柱、過濾器後的PLBL2的濃度時，為LRV=log(Cf)-log(Cp)。
4)高分子量體(HMWS)、低分子量體(LMWS)及單體(monomer)含量 藉由使用TSK gel G3000SWXL管柱(5μm、7.8mm×300mm、Tosoh)或ACQUITY UPLC蛋白質BEH SEC管柱(1.7μm，4.6mm×300mm，Waters)的HPLC法而進行測定。移動相使用含有0.4M氯化鈉的0.1M磷酸緩衝液。
5)蛋白質A測定 使用Cygnus Technologies公司的蛋白質A ELISA套組，並藉由酵素結合免疫吸附法(ELISA)而進行測定。為了結果比較，將所得之蛋白質A濃度除以抗體濃度，換算成ng蛋白質A/mg抗體。
6)病毒力價測定及病毒清除能力(對數去除值，Log Reduction Value；LRV)的算出 病毒力價係藉由利用細胞感染到病毒時形狀會變化的現象(細胞變性)而測定感染50%的細胞的病毒量之方法(組織培養感染性試驗；TCID50 )而進行測定。作為對象病毒，設為小鼠白血病病毒(MLV)、小鼠微小病毒(MMV)、假性狂犬病病毒(PRV)、里奧病毒第三型(Reo3)。又，作為指示細胞，使用PG4細胞(MLV的指示細胞)、324K細胞或者A9細胞(MMV的指示細胞)、Vero細胞(PRV的指示細胞)、L-929細胞(Reo3的指示細胞)。在病毒清除試驗之前，為了調查緩衝液或樣品是否對指示細胞造成不期望的影響，而評價對於病毒力價測定法的毒性作用或干擾作用。藉由以下的計算，算出病毒清除能力(對數去除值，LRV)。在Cf為進料液中的病毒的濃度且Cp為通過管柱、過濾器後的病毒的濃度時，為LRV=log(Cf)-log(Cp)。
7)DNA測定 藉由對CHO使用特異性的引子、探針的qPCR法而進行測定。將所得之DNA濃度除以抗體濃度，換算成pgDNA/mg抗體。
實施例2.以F/T模式純化CEX層析步驟的參考例(Mab A) 本實施例針對以下的表1所示之純化流程中之被稱為Mab A的單株抗體的雜質清除進行說明。
[表1]
培養液澄清化
↓
親和層析法
↓
病毒不活化
↓
深層過濾器過濾
↓
AEX層析法
↓
CEX層析法 (F/T模式)
1)材料及方法 針對產生Mab A的CHO細胞培養液，藉由深層過濾器過濾而去除細胞，進行澄清化而獲得細胞培養上清液。藉由使用KanCapA樹脂的蛋白質A層析法純化細胞培養上清液。以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，將管柱進行平衡化後，裝填培養上清液，其後，先以包含1M氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)、接著以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)進行清洗。以乙酸緩衝液(pH3.6)，將Mab A從管柱析出。監控280mm的吸光度，取得包含Mab A的流份(親和層析池液)。在親和層析池液中添加鹽酸，將pH調整成3.5，進行1小時的病毒不活化處理。該步驟係在室溫實施。1小時的病毒不活化處理之後，使用Tris水溶液中和至pH5.0。將中和液裝填至已預先以乙酸緩衝液(pH5.0)清洗的深層過濾器(Millistak(註冊商標) Pod A1HC)，接著，以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓，回收Mab A。接著，以0.2μm的過濾器進行過濾並保存(深層過濾器過濾池液)。以Tris水溶液，將深層過濾器過濾池液調整成pH7.5，作為AEX材料裝填液。在先以包含1M氯化鈉的Tris緩衝液(pH7.5)、接著再以Tris緩衝液(pH7.5)進行平衡化的AEX膜吸附器(AEX Membrane Adsorber)(NatriFlo(註冊商標) HD-Q)中，將AEX材料裝填液進行通液，接著以Tris緩衝液(pH7.5)進行清洗，藉此回收Mab A。回收液係在使用乙酸調整成pH5.0後，以0.2μm的過濾器進行過濾，而保存作為AEX材料池液。在先以包含1M氯化鈉的乙酸緩衝液(pH5.0)、接著再以乙酸緩衝液(pH5.0)進行平衡化之填充POROS XS的CEX管柱中，將AEX材料池液進行通液。對於CEX管柱的裝填密度設定為2000g/L樹脂以下。裝填後，以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓。監控280mm的吸光度，取得包含Mab A的流份，作為由F/T模式所致之CEX材料池液。
2)結果 由CEX層析步驟的F/T模式所致之Mab A回收率為92%。呈示雜質清除的結果(表2)。
[表2] 表2藉由CEX層析法的F/T模式進行純化之情形的雜質清除
步驟液 單體含量(%) HCP含量(ng/mg)
細胞培養上清液 - 2.1×106
親和層析池液 98.43 3.9×103
深層過濾器過濾池液 97.93 7.5×102
AEX材料池液 97.81 6.3×102
CEX材料池液 (F/T模式) 98.52 3.5×101
實施例3.由活性碳材料所致之雜質清除(Mab A、Mab B、Mab C、Mab D) 本實施例係針對以下的表3所示之純化流程中之被稱為Mab A、Mab B、Mab C、或Mab D的複數種抗體之由活性碳材料所致之雜質清除進行說明。此外，Mab A、Mab B、Mab C、或Mab D的胺基酸序列及結合的抗原各不相同。
[表3]
培養液澄清化
↓
親和層析法
↓
病毒不活化
↓
深層過濾器過濾
↓
活性碳過濾器過濾
1)活性碳材料中之雜質清除(病毒以外) 使用Millistak＋(註冊商標) Pod CR40作為活性碳材料，針對Mab B及Mab A進行抗體回收率及雜質清除的評價。將遵循實施例2所示之方法所得之Mab B及Mab A的深層過濾器過濾池液使用作為對於活性碳過濾器的裝填液(活性碳材料裝填液)。但是，為了易於評價利用活性碳過濾器的HCP的清除能力，針對Mab B係在蛋白質A層析法中不實施在裝填培養上清液後的由包含1M氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)所致之清洗。活性碳過濾器係在預先遵照操作說明書而實施適當清洗後，以乙酸緩衝液(pH5.0)進行平衡化。此外，平衡化以後的流速設定為109LMH。平衡化後，將活性碳材料裝填液在Mab B負載約300L/m2 ，在Mab A則負載約117L/m2 ，通液後，以乙酸緩衝液回收Mab B及Mab A(活性碳材料池液)。
呈示針對各抗體的純化條件(表4)、抗體回收率(表5)、HCP清除(表6)、PLBL2清除(表7)、及HMWS、LMWS清除(表8)。在任一抗體皆藉由活性碳過濾器過濾而減少HCP、PLBL2。再者，確認到HMWS及LMWS減少，且單體含量的提升。尤其，關於HCP，其藉由活性碳過濾器過濾而被大幅地減少(實施例2中，在AEX層析法處理的前後，HCP去除的程度低，未減少HCP對於CEX層析法的負載)。再者，已知因與抗體的相互作用而亦藉由活性碳過濾器過濾而減少PLBL2，該PLBL2被報告為在一般的抗體純化流程中難以減少的搭便車HCP(國際公開第WO2015/038888號)。為搭便車HCP之PLBL2因在一般的純化方法中難以減少，故藉由活性碳材料而減少約50%的裝填液一事，亦即藉由活性碳材料而獲得PLBL2的對數去除值(LRV)0.27一事具有重大意義。
[表4] 表4針對各抗體的純化條件一覽
純化條件 Mab B Mab A
親和層析法中之1M 氯化鈉清洗 無 有
對於活性碳過濾器的負載量 (L/m2 ) 300 117
[表5] 表5活性碳過濾器過濾中之抗體回收率(%)
步驟液 Mab B Mab A
活性碳材料池液 95 94
[表6] 表6活性碳過濾器過濾中之HCP清除(ng/mg)
步驟液 Mab B Mab A
活性碳材料裝填液 2.2×103 6.1×102
活性碳材料池液 6.0 6.0×101
[表7] 表7活性碳過濾器過濾中之PLBL2清除(對數去除值)
純化步驟 Mab A
活性碳過濾器過濾 0.27
[表8] 表8活性碳過濾器過濾中之HMWS、LMWS清除(%)
步驟液 Mab B Mab A
活性碳材料裝填液 HMWS：1.80 LMWS：0.94 單體：97.26 HMWS：1.42 LMWS：0.24 單體：98.34
活性碳材料池液 HMWS：1.55 LMWS：0.51 單體：97.95 HMWS：1.40 LMWS：0.19 單體：98.41
2)活性碳材料中之病毒清除 使用Millistak＋(註冊商標) Pod CR40作為活性碳材料，評價病毒清除。藉由對於Mab B、Mab C、及Mab D的添加(spike)試驗而確認病毒清除能力。作為添加對象病毒，設為在使用CHO細胞的抗體醫藥品的病毒清除試驗中通常使用的4病毒(MLV、MMV、Reo3及PRV)。作為具有對由活性碳過濾器過濾所致之病毒清除能力造成影響的可能性的因子，可舉出流速、pH及抗體種類，規劃確認此等的影響的試驗。將遵循實施例2所示之方法而得之Mab B、Mab C、及Mab D的深層過濾器過濾池液使用作為對於活性碳過濾器的裝填液(活性碳材料裝填液)(pH5.0)。再者，針對pH7.5的條件的裝填液，藉由Tris水溶液，將pH調整成7.5。活性碳過濾器係在預先遵照操作說明書而實施適當清洗後，以乙酸緩衝液(pH5.0)或者Tris緩衝液(pH7.5)進行平衡化。此外，平衡化以後的流速設定為109LMH或者54.5LMH。平衡化後，將活性碳材料裝填以約55L/m2 或者約110L/m2 進行負載，通液後，以乙酸緩衝液(pH5.0)或者Tris緩衝液(pH7.5)回收Mab B、Mab C、及Mab D(活性碳材料池液)，由活性碳材料裝填液及活性碳材料池液的病毒力價算出病毒對數去除值(LRV)(表9)。此結果，明確得知活性碳過濾器對於4種病毒具有清除能力。病毒清除能力不會受到流速、共存的抗體種類及負載量的影響，且針對在使用CHO細胞的抗體醫藥品的病毒清除試驗中使用的4種病毒，LRV皆具有＞=4的高清除能力。另一方面，在MLV的評價中，在pH5.0及7.5比較病毒清除能力的結果，可知在pH7.5時LRV降低，可知pH為影響活性碳材料中之病毒清除的重要參數。
[表9] 表9活性碳過濾器過濾中之病毒清除(對數去除值)
病毒 pH 流速 (LMH) 負載量 (L/m2 ) 抗體 病毒對數去除值 (LRV)
MLV 5.0 109 110 Mab C ＞=5.26
MLV 5.0 54.5 110 Mab C ＞=5.09
MLV 7.5 109 110 Mab C 2.31
MLV 5.0 109 110 Mab B ＞=4.82
MLV 5.0 109 110 Mab D 4.81
MMV 5.0 109 55 Mab C 4.29
MMV 5.0 109 110 Mab D 5.87
Reo3 5.0 109 55 Mab C ＞=7.67
PRV 5.0 109 55 Mab C 6.32
實施例4.由改良方法1所致之純化例(Mab A、Mab C) 本實施例係針對以下的表10所示之純化流程中之被稱為Mab A或Mab C的單株抗體的雜質清除進行說明。
[表10]
培養液澄清化
↓
親和層析法
↓
病毒不活化
↓
深層過濾器過濾
↓
活性碳過濾器過濾
↓
CEX層析法 (F/T模式)
1)材料及方法 針對產生Mab A的CHO細胞培養液，藉由深層過濾器過濾而去除細胞，進行澄清化。藉由使用KanCapA樹脂的蛋白質A層析法純化細胞培養上清液。以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，將管柱進行平衡化後，裝填培養上清液，其後，先以包含1M氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)、接著以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)進行清洗。以乙酸緩衝液(pH3.6)，將Mab A從管柱析出。監控280mm的吸光度，取得包含Mab A的流份(親和層析池液)。在親和層析池液中添加鹽酸，將pH調整成3.5，進行1小時的病毒不活化處理。該步驟係在室溫實施。1小時的病毒不活化處理之後，使用Tris水溶液中和至pH5.0，以0.2μm的過濾器進行過濾並保存(病毒不活化液)。將病毒不活化液以約109L/m2 負載至已預先以乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗的深層過濾器(Millistak＋(註冊商標)Pod A1HC)，接著以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓，回收Mab A(深層過濾器過濾池液)。
將深層過濾器過濾池液以117L/m2 負載至已預先以乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗的活性碳過濾器(Millistak＋(註冊商標)Pod CR40)，接著以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓，回收Mab A。接著，以0.2μm的過濾器進行過濾並保存(活性碳材料池液)。在先以包含1M氯化鈉的乙酸緩衝液(pH5.0)、接著再以乙酸緩衝液(pH5.0)進行平衡化之填充POROS XS的CEX管柱中，將活性碳材料池液進行通液。對於CEX管柱的裝填密度設為約2000g/L樹脂。裝填後，以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓。監控280mm的吸光度，取得包含Mab A的流份，作為由F/T模式所致之CEX材料池液。
使用由實施例3所製備之Mab C的親和層析池液、深層過濾器過濾池液及活性碳材料池液，評價病毒清除。作為添加對象病毒，設為在使用CHO細胞的抗體醫藥品的病毒清除試驗中通常使用的4病毒(MLV、MMV、Reo3及PRV)。由病毒力價算出病毒對數去除值(LRV)。
2)結果 將改良方法1中之Mab A回收率、及雜質清除的結果示於表11及表12。又，針對Mab C，將改良方法1中之具有病毒清除能力的步驟的純化步驟總清除示於表13。
改良方法1中之Mab A的回收率為良好。獲得了HMWS及LMWS被去除且單體含量高的抗體。HCP含量被適當地減少。針對PLBL2含量，亦可減少。又，針對DNA，亦確認到被去除至小於定量極限。
改良方法1中之具有Mab C的病毒清除能力的步驟的純化步驟總清除亦顯示良好的結果。
因發現藉由與利用活性碳材料之處理加以組合，可純化至高純度，再者以利用活性碳材料之處理會去除病毒，故變得能從實施例2所示之方法將AEX層析法置換成活性碳材料。針對製造成本，藉由將CEX層析法從一般使用的B/E模式設為F/T模式，對於樹脂的裝填密度從約100g/L樹脂增加至約2000g/L樹脂，而能將高價的CEX樹脂成本設為約1/20。又，藉由將高價的AEX樹脂或膜設為便宜的活性碳材料，而達成製造成本減少。再者，藉由刪除AEX層析法，接續過濾器匣類型的深層過濾器而使用同類型的活性碳過濾器，而亦可將製造天數縮短1天。對於多數的醫藥品製造商而言，製造的效率化是必須的，藉由將年間的製造批量數最大化而謀求製造的效率化，因此製造天數可縮短1天具有重大的意義。
藉由該改良方法，能有效率地將抗體純化至對於作為人類治療用而言為充分的純度，且減少製造成本，縮短製造期間。
[表11] 表11改良方法1中之回收率(僅記載已改良的步驟)
純化步驟 回收率(%)
深層過濾器過濾 96
活性碳過濾器過濾 94
CEX層析法 (F/T模式) 94
[表12] 表12改良方法1中之雜質清除
步驟液 單體 含量(%) HCP含量 (ng/mg) PLBL2含量 (對數去除值) DNA含量 (pg/mg)
細胞培養上清液 N.T. N.T. - 1.52×102
親和層析池液 N.T. N.T. 0.42 5.50
病毒不活化液 97.99 2.12×103 0.13 2.40
深層過濾器過濾池液 98.34 6.12×102 0.15 ＜QL
活性碳材料池液 98.45 4.70×101 0.28 ＜QL
CEX材料池液 (F/T模式) 98.77 1.30×101 0.06 ＜QL
(QL：定量極限)
[表13] 表13改良方法1中之病毒清除(對數去除值)
純化步驟 MLV MMV Reo3 PRV
病毒不活化 5.71 N.T. N.T. N.T.
活性碳過濾器過濾 ＞=5.26 4.29 ＞=7.67 6.32
CEX層析法 (F/T模式) 6.09 2.62 8.03 ＞=5.71
純化步驟總清除 ＞=17.06 ＞=6.91 ＞=15.70 ＞=12.03
實施例5.由改良方法2所致之純化例(Mab A、Mab D) 本實施例係針對從實施例4的表10的純化流程省略深層過濾器過濾之以下的表14所示之純化流程中之被稱為Mab A及Mab D的單株抗體的雜質清除進行說明。此外，Mab D的胺基酸序列及結合的抗原與Mab A、Mab B或Mab C不同。
[表14]
培養液澄清化
↓
親和層析法
↓
病毒不活化
↓
活性碳過濾器過濾
↓
CEX層析法 (F/T模式)
1)材料及方法 1)-1)Mab A之情形 針對產生Mab A的CHO細胞培養液，藉由深層過濾器過濾而去除細胞，進行澄清化。藉由使用KanCapA樹脂的蛋白質A層析法純化細胞培養上清液。以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，將管柱進行平衡化後，裝填培養上清液，其後，先以包含1M氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，接著以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)進行清洗。以乙酸緩衝液(pH3.6)，將Mab A從管柱析出。監控280mm的吸光度，取得包含各抗體的流份(親和層析池液)。在親和層析池液中添加鹽酸，將pH調整成3.5，進行1小時的病毒不活化處理。該步驟係在室溫實施。1小時的病毒不活化處理之後，使用Tris水溶液中和至pH5.0，以0.2μm的過濾器進行過濾並保存(病毒不活化液)。將病毒不活化液以70L/m2 負載至已預先以乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗的活性碳過濾器(Millistak＋(註冊商標)Pod CR40)，接著以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓，回收各抗體。接著，以0.2μm的過濾器進行過濾並保存(活性碳材料池液)。在先以包含1M氯化鈉的乙酸緩衝液(pH5.0)、接著再以乙酸緩衝液(pH5.0)進行平衡化之填充POROS XS的CEX管柱中，將活性碳材料池液進行通液。對CEX管柱的裝填密度設定為約2000g/L樹脂。裝填後，以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓。監控280mm的吸光度，取得包含各抗體的流份，接著以0.2μm的過濾器進行過濾，作為由F/T模式所致之CEX材料池液。
1)-2)Mab D之情形 針對產生Mab D的CHO細胞培養液，藉由深層過濾器過濾而去除細胞，進行澄清化。藉由使用KanCapA樹脂的蛋白質A層析法純化細胞培養上清液。以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，將管柱進行平衡化後，裝填培養上清液，其後，先以包含1M氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，接著以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)進行清洗。以乙酸緩衝液(pH3.6)，從管柱析出Mab D。監控280mm的吸光度，取得包含各抗體的流份(親和層析池液)。在親和層析池液中添加鹽酸，將pH調整成3.4，進行1小時的病毒不活化處理。該步驟係在室溫實施。1小時的病毒不活化處理之後，使用Tris水溶液中和至pH5.0，並保存(病毒不活化液)。將病毒不活化液以178L/m2 負載至已預先以乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗的活性碳過濾器(Millistak＋(註冊商標)Pod CR40)，接著以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓，回收各抗體。接著，以0.2μm的過濾器進行過濾並保存(活性碳材料池液)。在先以包含1M氯化鈉的乙酸緩衝液(pH5.0)、接著再以乙酸緩衝液(pH5.0)進行平衡化之填充POROS XS的CEX管柱中，將活性碳材料池液進行通液。對於CEX管柱的裝填密度設為約1500g/L樹脂。裝填後，以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓。監控280mm的吸光度，取得包含各抗體的流份，接著以0.2μm的過濾器進行過濾，作為由F/T模式所致之CEX材料池液。
2)結果 將改良方法2中之Mab A回收率、及雜質清除的結果示於表15及表16，將Mab D回收率、及雜質清除的結果示於表17及表18。此外，針對改良方法2中之具有病毒清除能力的步驟的純化步驟總清除，因對象步驟與實施例4的表13相同，故可期待同等的清除。
Mab A及Mab D在改良方法2中之回收率皆良好。又，獲得了HMWS及LMWS被去除且單體含量高的抗體。針對HCP含量，亦以Mab D充分地去除。又，針對DNA，亦確認到被去除至小於定量極限。再者，PLBL2及浸出蛋白質A的含量亦可減少。由以上的結果可知，依據抗體，藉由該純化方法，即使不實施深層過濾器過濾亦可純化至高純度。
[表15] 表15改良方法2中之回收率(僅記載已改良的步驟，Mab A)
純化步驟 回收率(%)
活性碳過濾器過濾 93
CEX層析法 (F/T模式) 85
[表16] 表16改良方法2中之雜質清除(Mab A)
步驟液 單體 含量(%) HCP含量 (ng/mg) PLBL2含量 (對數去除值) DNA含量 (pg/mg) 浸出蛋白質A含量 (ng/mg)
細胞培養上清液 N.T. N.T. - 1.52×102 N.T.
親和層析池液 N.T. N.T. 0.42 5.50 5.86×101
病毒不活化液 98.13 2.06×103 0.13 2.40 5.98×101
活性碳材料池液 98.31 6.05×102 0.30 ＜QL 2.32×101
CEX材料池液 (F/T模式) 98.79 4.00×101 0.14 ＜QL 1.55×101
[表17] 表17改良方法2中之回收率(僅記載已改良的步驟，Mab D)
純化步驟 回收率(%)
活性碳過濾器過濾 100
CEX層析法(F/T模式) 90
[表18] 表18改良方法2中之雜質清除(Mab D)
步驟液 單體 含量(%) HCP含量 (ng/mg) PLBL2含量 (對數去除值) DNA含量 (pg/mg) 浸出蛋白質A含量 (ng/mg)
細胞培養上清液 N.T. 7.13×104 - 3.1×103 N.T.
親和層析池液 98.49 8.70×101 0.94 ＜ QL 1.40×101
病毒不活化液 97.65 3.90×101 0.01 ＜ QL 1.10×101
活性碳材料池液 97.96 1.70×101 0.59 ＜ QL 7.40
CEX材料池液 (F/T模式) 99.02 3.00×100 -0.13 ＜ QL 4.25
實施例6.由改良方法3所致之純化例(Mab F、Mab G) 本實施例係例示在實施例4的表10的純化流程中之陽離子交換層析法之後追加疏水性相互作用層析法之由以下的表19所示之純化流程所致之抗體的雜質清除。此外，本實施例所使用之Mab E、Mab F及Mab G的胺基酸序列及結合的抗原各不相同，且與Mab A、Mab B、Mab C或Mab D亦不相同。
[表19]
培養液澄清化
↓
親和層析法
↓
病毒不活化
↓
深層過濾器過濾
↓
活性碳過濾器過濾
↓
CEX層析法 (F/T模式)
↓
疏水性相互作用層析法
1)疏水性相互作用層析法中之病毒清除(Mab E) 本實施例係針對疏水性相互作用層析法中之被稱為Mab E的單株抗體的病毒清除進行說明。使用POROS Benzyl Ultra HIC 樹脂，藉由對於Mab E的MLV、MMV的添加試驗而評價病毒清除。
針對產生Mab E的CHO細胞培養液，藉由深層過濾器過濾而去除細胞，進行澄清化。藉由使用KanCapA樹脂的蛋白質A層析法純化細胞培養上清液。以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，將管柱進行平衡化後，裝填培養上清液，其後，先以包含1M氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，接著以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)進行清洗。以乙酸緩衝液(pH3.6)，將Mab E從管柱析出。監控280mm的吸光度，取得包含Mab E的流份(親和層析池液)。在親和層析池液中添加鹽酸，將pH調整成3.4，進行1小時的病毒不活化處理。該步驟係在室溫實施。1小時的病毒不活化處理之後，使用Tris水溶液中和至pH5.0(病毒不活化液)。將病毒不活化液以114L/m2 負載至已預先以乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗的深層過濾器(Millistak＋(註冊商標) Pod A1HC)，接著以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓，回收Mab E(深層過濾器過濾池液)。將深層過濾器過濾池液以129L/m2 負載至已預先以乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗的活性碳過濾器(Millistak＋(註冊商標) Pod CR40)，接著以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓，以0.2μm的過濾器進行過濾並保存(活性碳材料池液)。在先以注射用水、接著再以乙酸緩衝液(pH5.0)進行平衡化之填充POROS Benzyl Ultra的HIC管柱中，將活性碳材料池液進行通液。對於HIC管柱的裝填密度設為約1000g/L樹脂。裝填後，以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓。監控280mm的吸光度，取得包含Mab E的流份，作為由F/T模式所致之HIC材料池液。由裝填液及池液的病毒力價算出病毒對數去除值(LRV)(表20)。此結果，明確得知疏水性相互作用層析法具有清除能力。
[表20] 表20疏水性相互作用層析法中之病毒清除(對數去除值)
Virus 病毒對數去除值 (LRV)
MLV 2.92
MMV 4.22
2)由改良方法3所致之雜質清除(Mab F) 本實施例係針對表19所示之純化流程中之被稱為Mab F的單株抗體的雜質清除進行說明。
針對產生Mab F的CHO細胞培養液，藉由深層過濾器過濾而去除細胞，進行澄清化。藉由使用KanCapA樹脂的蛋白質A層析法純化細胞培養上清液。以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，將管柱進行平衡化後，裝填培養上清液，其後，先以包含1M氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，接著以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)進行清洗。以乙酸緩衝液(pH3.6)，將Mab F從管柱析出。監控280mm的吸光度，取得包含Mab F的流份(親和層析池液)。在親和層析池液中添加鹽酸，將pH調整成3.7，進行1小時的病毒不活化處理。該步驟係在室溫實施。1小時的病毒不活化處理之後，使用Tris水溶液中和至pH5.0(病毒不活化液)。將病毒不活化液以約900g/m2 負載至已預先以乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗的深層過濾器(Millistak＋(註冊商標)Pod A1HC)，接著以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓，回收Mab F(深層過濾器過濾池液)。將深層過濾器過濾池液以約800g/m2 負載至已預先以乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗的活性碳過濾器(Millistak＋(註冊商標)Pod CR40)，接著以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓，以0.2μm的過濾器進行過濾並保存(活性碳材料池液)。在先以包含1M氯化鈉的乙酸緩衝液(pH5.0)、接著再以乙酸緩衝液(pH5.0)進行平衡化之填充POROS XS的CEX管柱中，將活性碳材料池液進行通液。對於CEX管柱的裝填密度設定為約1300g/L樹脂。裝填後，以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓。監控280mm的吸光度，取得包含Mab F的流份，接著以0.2μm的過濾器進行過濾，作為由F/T模式所致之CEX材料池液。在先以注射用水、接著再以乙酸緩衝液(pH5.0)進行平衡化之填充POROS Benzyl Ultra的HIC管柱中，將CEX材料池液進行通液。對於HIC管柱的裝填密度設為約300g/L樹脂。裝填後，以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓。監控280mm的吸光度，取得包含Mab F的流份，作為由F/T模式所致之HIC材料池液。
將改良方法3中之雜質清除的結果示於表21。藉由疏水性相互作用層析法，單體含量增加。在陽離子交換層析法後所殘留的HCP及PLBL2係藉由疏水性相互作用層析法而被去除，尤其PLBL2被去除至小於定量極限。
[表21] 表21改良方法3中之雜質清除(Mab F)
步驟液 單體含量 (%) HCP含量 (ng/mg) PLBL2含量 (ng/mg)
細胞培養上清液 N.T. 2.87×105 1.11×103
親和層析池液 98.17 2.74×102 4.21×102
病毒不活化液 96.60 N.T. N.T.
深層過濾器過濾池液 97.15 8.61×101 1.71×102
活性碳材料池液 97.77 7.75×101 1.14×102
CEX材料池液 (F/T模式) 98.30 2.12×101 9.74×101
HIC材料池液 (F/T模式) 98.55 1.14×101 ＜ 0.35
3)由改良方法3所致之雜質清除(Mab G) 本實施例係針對表19所示之純化流程中之被稱為Mab G的單株抗體的雜質清除進行說明。
針對產生Mab G的CHO細胞培養液，藉由深層過濾器過濾而去除細胞，進行澄清化。藉由使用KanCapA樹脂的蛋白質A層析法純化細胞培養上清液。以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，將管柱進行平衡化後，裝填培養上清液，其後，先以包含1M氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，接著以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)進行清洗。以乙酸緩衝液(pH3.6)，將Mab G從管柱析出。監控280mm的吸光度，取得包含Mab G的流份(親和層析池液)。在親和層析池液中添加鹽酸，將pH調整成3.7，進行1小時的病毒不活化處理。該步驟係在室溫實施。1小時的病毒不活化處理之後，使用Tris水溶液中和至pH5.0(病毒不活化液)。將病毒不活化液以約800g/m2 負載至已預先以乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗的深層過濾器(Millistak＋(註冊商標)Pod A1HC)，接著以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓，回收Mab G(深層過濾器過濾池液)。將深層過濾器過濾池液以約700g/m2 負載至已預先以乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗的活性碳過濾器(Millistak＋(註冊商標)Pod CR40)，接著以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓，以0.2μm的過濾器進行過濾並保存(活性碳材料池液)。在先以包含1 M氯化鈉的乙酸緩衝液(pH5.0)、接著再以乙酸緩衝液(pH5.0)進行平衡化之填充POROS XS的CEX管柱中，將活性碳材料池液進行通液。對於CEX管柱的裝填密度設定為約1500g/L樹脂。裝填後，以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓。監控280mm的吸光度，取得包含Mab G的流份，接著以0.2μm的過濾器進行過濾，作為由F/T模式所致之CEX材料池液。在先以注射用水、接著再以乙酸緩衝液(pH5.0)進行平衡化之填充POROS Benzyl Ultra的HIC管柱中，將CEX材料池液進行通液。對於HIC管柱的裝填密度設為約300g/L樹脂。裝填後，以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓。監控280mm的吸光度，取得包含Mab G的流份，作為由F/T模式所致之HIC材料池液。
將改良方法3中之雜質清除的結果示於表22。藉由疏水性相互作用層析法，單體含量增加。在陽離子交換層析法後所殘留的HCP及PLBL2係藉由疏水性相互作用層析法而被去除，尤其PLBL2被去除至定量極限附近。
[表22] 表22改良方法3中之雜質清除(Mab G)
步驟液 單體含量 (%) HCP含量 (ng/mg) PLBL2含量 (ng/mg)
細胞培養上清液 N.T. 3.51×105 1.39×103
親和層析池液 97.88 8.88×102 3.92×102
病毒不活化液 96.90 N.T. N.T.
深層過濾器過濾池液 97.44 1.52×102 2.18×102
活性碳材料池液 97.94 9.76×101 1.53×102
CEX材料池液 (F/T模式) 98.32 1.84×101 1.52×102
HIC材料池液 (F/T模式) 98.63 8.14×100 0.44
實施例7.由改良方法4所致之純化例(Mab F、Mab G) 本實施例係例示在實施例4的表10的純化流程中之陽離子交換層析法之前追加疏水性相互作用層析法之由以下的表23所示之純化流程所致之抗體的雜質清除。
[表23]
培養液澄清化
↓
親和層析法
↓
病毒不活化
↓
深層過濾器過濾
↓
活性碳過濾器過濾
↓
疏水性相互作用層析法
↓
CEX層析法 (F/T模式)
1)由改良方法4所致之雜質清除(Mab F) 本實施例係針對表23所示之純化流程中之被稱為Mab F的單株抗體的雜質清除進行說明。
針對產生Mab F的CHO細胞培養液，藉由深層過濾器過濾而去除細胞，進行澄清化。藉由使用KanCapA樹脂的蛋白質A層析法純化細胞培養上清液。以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，將管柱進行平衡化後，裝填培養上清液，其後，先以包含1M氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，接著以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)進行清洗。以乙酸緩衝液(pH3.6)，將Mab F從管柱析出。監控280mm的吸光度，取得包含Mab F的流份(親和層析池液)。在親和層析池液中添加鹽酸，將pH調整成3.7，進行1小時的病毒不活化處理。該步驟係在室溫實施。1小時的病毒不活化處理之後，使用Tris水溶液中和至pH5.0(病毒不活化液)。將病毒不活化液以約900g/m2 負載至已預先以乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗的深層過濾器(Millistak＋(註冊商標) Pod A1HC)，接著以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓，回收Mab F(深層過濾器過濾池液)。將深層過濾器過濾池液以約800g/m2 負載至已預先以乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗的活性碳過濾器(Millistak＋(註冊商標) Pod CR40)，接著以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓，以0.2μm的過濾器進行過濾並保存(活性碳材料池液)。在先以注射用水、接著再以乙酸緩衝液(pH5.0)進行平衡化之填充POROS Benzyl Ultra的HIC管柱中，將活性碳材料池液進行通液。對於HIC管柱的裝填密度設為約300g/L樹脂。裝填後，以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓。監控280mm的吸光度，取得包含Mab F的流份，作為由F/T模式所致之HIC材料池液。在先以包含1M氯化鈉的乙酸緩衝液(pH5.0)、接著再以乙酸緩衝液(pH5.0)進行平衡化之填充POROS XS的CEX管柱中，將HIC材料池液進行通液。對於CEX管柱的裝填密度設定為約1300g/L樹脂。裝填後，以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓。監控280mm的吸光度，取得包含Mab F的流份，接著以0.2μm的過濾器進行過濾，作為由F/T模式所致之CEX材料池液。
將改良方法4中之雜質清除的結果示於表24。藉由疏水性相互作用層析法，單體含量增加。活性碳材料池液中殘留的HCP及PLBL2係藉由疏水性相互作用層析法而被去除，尤其PLBL2被去除至定量極限附近。
[表24] 表24改良方法4中之雜質清除(Mab F)
步驟液 單體含量 (%) HCP含量 (ng/mg) PLBL2含量 (ng/mg)
細胞培養上清液 N.T. 2.87×105 1.11×103
親和層析池液 98.17 2.74×102 4.21×102
病毒不活化液 96.60 N.T. N.T.
深層過濾器過濾池液 97.15 8.61×101 1.71×102
活性碳材料池液 97.77 7.75×101 1.14×102
HIC材料池液 (F/T模式) 98.26 4.31×101 6.50×10-1
CEX材料池液 (F/T模式) 98.60 ＜ 10.52 6.60×10-1
2)由改良方法4所致之雜質清除(Mab G) 本實施例係針對表23所示之純化流程中之被稱為Mab G的單株抗體的雜質清除進行說明。
針對產生Mab G的CHO細胞培養液，藉由深層過濾器過濾而去除細胞，進行澄清化。藉由使用KanCapA樹脂的蛋白質A層析法純化細胞培養上清液。以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，將管柱進行平衡化後，裝填培養上清液，其後，先以包含1M氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，接著以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)進行清洗。以乙酸緩衝液(pH3.6)，將Mab G從管柱析出。監控280mm的吸光度，取得包含Mab G的流份(親和層析池液)。在親和層析池液中添加鹽酸，將pH調整成3.7，進行1小時的病毒不活化處理。該步驟係在室溫實施。1小時的病毒不活化處理之後，使用Tris水溶液中和至pH5.0(病毒不活化液)。將病毒不活化液以約800g/m2 負載至已預先以乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗的深層過濾器(Millistak＋(註冊商標) Pod A1HC)，接著以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓，回收Mab G(深層過濾器過濾池液)。將深層過濾器過濾池液以約700g/m2 負載至已預先以乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗的活性碳過濾器(Millistak＋(註冊商標)Pod CR40)，接著以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓，以0.2μm的過濾器進行過濾並保存(活性碳材料池液)。在先以注射用水、接著再以乙酸緩衝液(pH5.0)進行平衡化之填充POROS Benzyl Ultra的HIC管柱中，將活性碳材料池液進行通液。對於HIC管柱的裝填密度設為約300g/L樹脂。裝填後，以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓。監控280mm的吸光度，取得包含Mab G的流份，作為由F/T模式所致之HIC材料池液。在先以包含1M氯化鈉的乙酸緩衝液(pH5.0)、接著再以乙酸緩衝液(pH5.0)進行平衡化之填充POROS XS的CEX管柱中，將HIC材料池液進行通液。對於CEX管柱的裝填密度設定為約1300g/L樹脂。裝填後，以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓。監控280mm的吸光度，取得包含Mab G的流份，接著以0.2μm的過濾器進行過濾，作為由F/T模式所致之CEX材料池液。
將改良方法4中之雜質清除的結果示於表25。藉由疏水性相互作用層析法，單體含量增加。活性碳材料池液中殘留的HCP及PLBL2係藉由疏水性相互作用層析法而被去除，尤其PLBL2被去除至定量極限附近。
[表25] 表25改良方法4中之雜質清除(Mab G)
步驟液 單體含量 (%) HCP含量 (ng/mg) PLBL2含量 (ng/mg)
細胞培養上清液 N.T. 3.51×105 1.39×103
親和層析池液 97.88 8.88×102 3.92×102
病毒不活化液 96.90 N.T. N.T.
深層過濾器過濾 池液 97.44 1.52×102 2.18×102
活性碳材料池液 97.94 9.76×101 1.53×102
HIC材料池液 (F/T模式) 98.31 7.05×101 1.11×100
CEX材料池液 (F/T模式) 98.62 5.05×100 1.03×100
實施例8.由活性碳材料所致之雜質清除(Mab A) 本實施例係針對以下的表26所示之純化流程中之被稱為Mab A的單株抗體之由活性碳材料所致之雜質清除進行說明。
[表26]
培養液澄清化
↓
親和層析法
↓
病毒不活化
↓
深層過濾器過濾
↓
活性碳過濾器過濾
1)材料及方法 針對產生Mab A的CHO細胞培養液，藉由深層過濾器過濾而去除細胞，進行澄清化。藉由使用KanCapA樹脂的蛋白質A層析法純化細胞培養上清液。以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，將管柱進行平衡化後，裝填培養上清液，其後，先以包含1M氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)，接著以包含20mM氯化鈉的磷酸緩衝液(pH7.5)進行清洗。以乙酸緩衝液(pH3.6)，將Mab A從管柱析出。監控280mm的吸光度，取得包含Mab A的流份(親和層析池液)。在親和層析池液中添加鹽酸，將pH調整成3.5，進行1小時的病毒不活化處理。該步驟係在室溫實施。1小時的病毒不活化處理之後，使用Tris水溶液中和至pH5.0(病毒不活化液)。將病毒不活化液以124L/m2 負載至已預先以乙酸緩衝液(pH5.0)進行清洗的深層過濾器(Millistak＋(註冊商標)Pod A1HC)，接著以乙酸緩衝液(pH5.0)實施擠壓，回收Mab A(深層過濾器過濾池液)。將深層過濾器過濾池液藉由鹽酸或Tris水溶液而調整成pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5，以0.2μm的過濾器進行過濾並保存(pH調整活性碳材料裝填液)。將深層過濾器過濾池液藉由超過濾・透析過濾而調整成導電率2mS/cm、4mS/cm、5mS/cm、6mS/cm、8mS/cm、10mS/cm，以0.2μm的過濾器進行過濾並保存(導電率調整活性碳材料裝填液)。
將pH調整活性碳材料裝填液以60L/m2 或100L/m2 負載至已預先以與裝填液相同pH的乙酸緩衝液(pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5)分別進行清洗的活性碳過濾器(Millistak＋(註冊商標)Pod CR40)，接著以與裝填液相同pH的乙酸緩衝液(pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5)分別實施擠壓，回收Mab A，作為pH調整活性碳材料池液。將導電率調整活性碳材料裝填液以60L/m2 負載至已以乙酸緩衝液(pH5.0)分別進行清洗的活性碳過濾器(Millistak＋(註冊商標) Pod CR40)，接著以乙酸緩衝液(pH5.0)分別實施擠壓，回收Mab A，作為導電率調整活性碳材料池液。
2)結果 將表26所示之純化流程中負載量60L/m2 的活性碳過濾器過濾中之雜質清除的結果示於表27及表28。依據pH及導電率，HCP去除率受到很大的影響。PLBL有pH愈低或導電率愈低則去除率愈大的傾向。浸出蛋白質 A有pH愈低則去除率愈大的傾向。MLV及MMV有pH愈低或導電率愈低則去除率愈大的傾向。表26所示之純化流程所得之活性碳材料裝填液的pH及導電率的條件已確認為在活性碳過濾器過濾中顯示高的雜質清除率的條件。
[表27] 表27活性碳過濾器過濾中之pH與雜質清除(對數去除值)
pH HCP PLBL2 浸出蛋白質A MLV MMV
4.5 0.16 0.42 0.31 ＞2.43 1.69
5.0 0.25 0.27 0.24 2.74 2.31
5.5 0.16 0.09 0.12 1.19 1.94
6.0 0.16 0.03 0.16 1.38 1.19
6.5 0.17 0.07 0.05 1.56 0.56
7.0 0.17 0.07 0.05 1.00 0.19
7.5 0.17 0.00 0.01 1.06 0.25
[表28] 表28活性碳過濾器過濾中之導電率與雜質清除(對數去除值)
導電率 HCP PLBL2 浸出蛋白質A MLV MMV
2 mS/cm 0.20 0.93 ＞0.20 4.92 4.64
4 mS/cm 0.22 0.63 ＞0.09 5.24 5.14
5 mS/cm 0.18 0.51 ＞0.11 4.14 5.20
6 mS/cm 0.21 0.34 ＞0.16 3.77 4.36
8 mS/cm 0.16 0.24 ＞0.08 3.03 4.20
10 mS/cm 0.19 0.13 ＞-0.06 3.04 4.22
[產業上的可利用性]
藉由本發明的抗體純化法，除了縮短純化期間，更能有效率地去除雜質，將抗體純化至能使用作為人類治療用的充分純度為止，且減少製造成本。
無。
無。
無。

Claims (47)

  1. 一種方法，其係用於從包含一或複數的雜質之組合物純化抗體的手法，其包含a1.至e1.的步驟， a1.準備含有抗體的細胞培養上清液； b1.藉由親和層析樹脂處理該細胞培養上清液，獲得包含抗體的親和層析池液； c1.在該親和層析池液中，將病毒進行不活化，獲得病毒不活化液； d1.藉由活性碳材料處理該病毒不活化液，獲得活性碳材料池液； e1.藉由陽離子交換材料處理該活性碳材料池液，獲得陽離子交換材料池液。
  2. 如請求項1之方法，其係用於從包含一或複數的雜質之組合物純化抗體的手法，其包含a2.至f2.的步驟， a2.準備含有抗體的細胞培養上清液； b2.藉由親和層析樹脂處理該細胞培養上清液，獲得包含抗體的親和層析池液； c2.在該親和層析池液中，將病毒進行不活化，獲得病毒不活化液； d2.藉由深層過濾器處理該病毒不活化液，獲得深層過濾器過濾池液； e2.藉由活性碳材料處理該深層過濾器過濾池液，獲得活性碳材料池液； f2.藉由陽離子交換材料處理該活性碳材料池液，獲得陽離子交換材料池液。
  3. 如請求項1或2之方法，其中，親和層析樹脂為蛋白質A樹脂。
  4. 如請求項3之方法，其中，蛋白質A樹脂為KanCapA、KanCapA3G、MabSelect SuRe、MabSelect SuRe pcc、MabSelect PrismA、或Amsphere A3。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中，病毒不活化係選自包含利用酸、界面活性劑、化學物質、核酸交聯劑、紫外線、加馬射線及熱的處理之群組中的至少任一者。
  6. 如請求項5之方法，其中，病毒不活化包含使親和層析池液的pH降低至3~4。
  7. 如請求項6之方法，其中，在病毒不活化中，將親和層析池液培養60~120分鐘。
  8. 如請求項6或7之方法，其中，在病毒不活化中，將親和層析池液培養在15~30℃。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中，裝填至活性碳材料的溶液、活性碳材料的平衡化緩衝液及清洗緩衝液的pH為4.5~7.5。
  10. 如請求項9之方法，其中，裝填至活性碳材料的溶液、活性碳材料的平衡化緩衝液及清洗緩衝液的pH為4.5~5.5。
  11. 如請求項1至10中任一項之方法，其中，裝填至活性碳材料的溶液、活性碳材料的平衡化緩衝液及清洗緩衝液的導電率為2~10mS/cm。
  12. 如請求項11之方法，其中，裝填至活性碳材料的溶液、活性碳材料的平衡化緩衝液及清洗緩衝液的導電率為2~5mS/cm。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中，利用活性碳材料之處理係使用包含活性碳材料的過濾器而進行。
  14. 如請求項13之方法，其中，過濾器為Millistak＋Pod CR40、Zeta Plus活性碳吸附深層過濾器、或SUPRAcap 50 Seitz AKS濾器。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法，其中，對於陽離子交換材料，裝填超過該陽離子交換材料的吸附容量的活性碳材料池液。
  16. 如請求項15之方法，其中，活性碳材料池液對於陽離子交換材料的裝填密度為500~2000g/L。
  17. 如請求項16之方法，其中，活性碳材料池液對於陽離子交換材料的裝填密度為1000~1500g/L。
  18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中，陽離子交換材料為樹脂、整體管柱、或膜。
  19. 如請求項18之方法，其中，陽離子交換材料的官能基為磺丙基、磺乙基、磺異丁基(sulfoisobutyl)、或羧基。
  20. 如請求項19之方法，其中，陽離子交換材料為POROS XS、Eshmuno CPX、Eshmuno CP-FT、或CaptoS ImpAct。
  21. 如請求項1至20中任一項之方法，其中，裝填至陽離子交換材料之溶液的pH為4~6。
  22. 如請求項21之方法，其中，裝填至陽離子交換材料之溶液的pH為4.5~5.5。
  23. 如請求項1至22中任一項之方法，其中，裝填至陽離子交換材料之溶液的導電率為3~7mS/cm。
  24. 如請求項23之方法，其中，裝填至陽離子交換材料之溶液的導電率為3~5mS/cm。
  25. 如請求項1至24中任一項之方法，其中，進一步藉由疏水性相互作用層析法處理陽離子交換材料池液，獲得池液。
  26. 如請求項25之方法，其中，疏水性相互作用層析法為流通模式。
  27. 如請求項26之方法，其中，疏水性相互作用層析法係使用樹脂或膜而實施。
  28. 如請求項27之方法，其中，疏水性相互作用層析樹脂或膜具有苯基、苄基或己基。
  29. 如請求項28之方法，其中，疏水性相互作用層析材料為POROS Benzyl Ultra、POROS Benzyl、Hexyl-650C、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow、Phenyl Sepharose High Performance、Sartobind Phenyl或ReadyToProcess Adsorber Phenyl。
  30. 如請求項1至14中任一項之方法，其中，藉由疏水性相互作用層析法處理活性碳材料池液，獲得池液，再藉由陽離子交換材料進行處理，獲得池液。
  31. 如請求項30之方法，其中，疏水性相互作用層析法為流通模式。
  32. 如請求項31之方法，其中，疏水性相互作用層析法係使用樹脂或膜而實施。
  33. 如請求項32之方法，其中，疏水性相互作用層析樹脂或膜具有苯基、苄基或己基。
  34. 如請求項33之方法，其中，疏水性相互作用層析材料為POROS Benzyl Ultra、POROS Benzyl、Hexyl-650C、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow、Phenyl Sepharose High Performance、Sartobind Phenyl或ReadyToProcess Adsorber Phenyl。
  35. 如請求項30至34中任一項之方法，其中，對於陽離子交換材料，裝填超過該陽離子交換材料的吸附容量的疏水性相互作用層析池液。
  36. 如請求項35之方法，其中，疏水性相互作用層析池液對於陽離子交換材料的裝填密度為500~2000g/L。
  37. 如請求項36之方法，其中，疏水性相互作用層析池液對於陽離子交換材料的裝填密度為1000~1500g/L。
  38. 如請求項30至37中任一項之方法，其中，陽離子交換材料為樹脂、整體管柱、或膜。
  39. 如請求項38之方法，其中，陽離子交換材料的官能基為磺丙基、磺乙基、磺異丁基、或羧基。
  40. 如請求項39之方法，其中，陽離子交換材料為POROS XS、Eshmuno CPX、Eshmuno CP-FT、或CaptoS ImpAct。
  41. 如請求項30至40中任一項之方法，其中，裝填至陽離子交換材料之溶液的pH為4~6。
  42. 如請求項41之方法，其中，裝填至陽離子交換材料之溶液的pH為4.5~5.5。
  43. 如請求項30至42中任一項之方法，其中，裝填至陽離子交換材料之溶液的導電率為3~7mS/cm。
  44. 如請求項43之方法，其中，裝填至陽離子交換材料之溶液的導電率為3~5mS/cm。
  45. 如請求項1至44中任一項之方法，其中，至少一種雜質係選自包含源自宿主細胞的蛋白質(宿主細胞蛋白(Host cell protein；HCP))、類磷脂酶B 2(phospholipase B-like 2；PLBL2)、病毒、類病毒粒子、高分子量體(高分子量物種(high molecular weight species；HMWS))、低分子量體(低分子量物種(low molecular weight species；LMWS))、培養基成分、浸出蛋白質A及/或DNA之群組。
  46. 如請求項1至45中任一項之方法，其中，步驟為連續的。
  47. 一種抗體，其係藉由如請求項1至46中任一項之方法而純化。
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