ES2677650T3 - Métodos para reducir el nivel de una o más impurezas en una muestra durante la purificación de proteínas - Google Patents

Métodos para reducir el nivel de una o más impurezas en una muestra durante la purificación de proteínas Download PDF

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Abstract

Un proceso de purificación que comprende las etapas de: a) proporcionar un fluido de cultivo celular clarificado a un medio de afinidad de elución y unión; b) hacer salir el flujo de la etapa a) a través de carbón activado; c) hacer salir el flujo de la etapa b) a través de un medio de intercambio aniónico; y d) hacer salir el flujo de la etapa c) a través de un medio de intercambio catiónico, en donde se reduce el nivel de una o más impurezas.

Description

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DESCRIPCION
Metodos para reducir el nivel de una o mas impurezas en una muestra durante la purificacion de protemas Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos de cromatograffa mejorados y metodos para reducir el nivel de una o mas impurezas durante la purificacion de protemas.
Antecedentes
La cromatograffa es una tecnica de purificacion dominante en la purificacion de materiales biologicos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales.
Los metodos de cromatograffa usados comunmente incluyen uno o mas de medios de cromatograffa de afinidad, medios de cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de interaccion hidrofobica, de interaccion hidrofflica, de modo mixto y de exclusion de tamanos (es dear, combinacion de diversas interacciones de cromatograffa). Por ejemplo, para la purificacion de anticuerpos monoclonales, un proceso de purificacion ffpico incluye una etapa de captura de afinidad de Protema A inicial seguida de una o mas etapas de pulido de intercambio, cuyo proposito es reducir el nivel de una o mas impurezas tales como, por ejemplo, protema celu/ar huesped (HCP). Ademas, se pueden usar otras tecnicas cromatograficas, tales como: cromatograffa de interaccion hidrofobica de unir y eluir (HIC); cromatograffa de interaccion hidrofobica de flujo pasante (FTHIC); cromatograffa de intercambio anionico de flujo pasante (AEX); cromatograffa de particion debil con intercambio cationico, intercambio anionico o resinas de interaccion hidrofobica; tecnicas de cromatograffa de modo mixto, por ejemplo, intercambio anionico y cationico debil de unir y e/uir, interaccion de intercambio ionico e hidrofobico de unir y eluir e interaccion de modo mixto de intercambio ionico e hidrofobico de flujo pasante (FTMM), las cuales pueden utilizar resinas tales como Capto™ Adhere, Capto™ MMC, HEA Hypercel™, PPA Hypercel™. Adicionalmente, para el pulido se puede usar la cromatograffa de induccion de carga hidrofobica (HCI) junto con otras y combinaciones de diversas tecnicas.
Aunque la cromatograffa ofrece muchas ventajas para la purificacion de protemas a una escala menor, a una escala mayor, el relleno de columnas de cromatograffa es trabajoso y requiere tiempo, ademas de caro. Ademas, el ensuciamiento de las columnas de cromatograffa es un problema comun, dando como resultado que el usuario tiene que desechar columnas, lo que es indeseable, especialmente debido al elevado coste de las resinas de cromatograffa.
Recientemente, ha habido una tendencia notable en la industria para tratar de reducir el numero de etapas en los procesos de purificacion de protemas. Tambien, es una tendencia creciente en la industria el uso de tecnicas para la obtencion de un tftulo de expresion mas alto usando biorreactores. La combinacion de estas dos tendencias ha dado lugar a que se carga en una columna mas producto, lo que da como resultado una carga aumentada de medios de cromatograffa bastante caros asf como una menor pureza del producto, ambos de los cuales son indeseables.
Compendio de la invencion
La presente invencion describe procesos de purificacion de protemas segun el presente juego de reivindicaciones. La presente invencion se basa, al menos en parte, en el descubrimiento sorprendente e inesperado de que ciertos materiales (por ejemplo, material carbonoso tal como carbon activado) se pueden incorporar en los procesos de purificacion de protemas basadas en columna de cromatograffa en un modo de flujo pasante, lo que resulta en la reduccion de la carga de las columnas de cromatograffa, y por consiguiente el aumento de la vida util de las columnas de cromatograffa.
Ademas, la presente invencion se basa en el descubrimiento e inesperado de que los materiales carbonosos (por ejemp/o, carbon activado) se pueden usar bien corriente arriba o corriente abajo de una etapa de cromatograffa de captura para reducir el nivel de una o mas impurezas. En algunas realizaciones segun los metodos reivindicados, se pone en contacto una muestra con un material carbonoso antes de una etapa de cromatograffa de intercambio cationico (CEX). Tambien se describe, en donde se usa una etapa de cromatograffa de intercambio cationico (CEX) antes de poner en contacto una muestra con un material carbonoso. En aun otras realizaciones, se pone en contacto una muestra con un material carbonoso despues de la etapa de captura de afinidad de Protema A. Alternativamente, la etapa de cromatograffa de afinidad de Protema A se puede usar despues de poner en contacto la muestra con un material carbonoso. La etapa de captura de afinidad de Protema A puede estar seguida de una etapa de cromatograffa de flujo pasante de intercambio anionico (AEX) y con o sin una etapa de union/elucion de cromatograffa CEX. Aun en otras realizaciones, el material carbonoso se puede usar despues de una etapa de captura de no afinidad (por ejemp/o, usando cromatograffa de unir y e/uir CEX como una etapa de captura) y esta seguido de una etapa de cromatograffa AEX.
Ademas, la presente invencion proporciona procesos de purificacion de protemas basados en cromatograffa que incluyen menos etapas que los procesos convencionales.
En un aspecto segun la presente invencion, se proporciona un metodo para reducir la carga de una o mas columnas
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cromatograficas. En algunas realizaciones, tal metodo comprende poner en contacto una muestra que comprende una protema de interes y una o mas impurezas en un modo de flujo pasante con uno de: (i) un material carbonoso; (ii) una combinacion de un material carbonoso y medios CEX; (iii) una combinacion de un material carbonoso y medios AEX; (iv) una combinacion de un material carbonoso y medios de modo mixto; (v) una combinacion de un material carbonoso y medios HIC, y (vi) una combinacion de un material carbonoso y medios CEX, AEX y de modo mixto, antes de poner en contacto la muestra con uno o mas columnas cromatograficas que contienen medios de afinidad, medios AEX, medios CEX, medios HIC o medios en modo-mixto, para reducir de ese modo la carga de una o mas columnas cromatograficas.
En otro aspecto segun los metodos reivindicados, se proporciona un metodo para reducir el nivel de una o mas impurezas en una muestra que contiene una protema de interes y la una o mas impurezas de interes, en donde el metodo comprende las etapas de: (i) poner en contacto una muestra que comprende una protema de interes y una o mas impurezas con una o mas columnas de cromatograffa que contienen medios de afinidad, medios AEX, medios CEX, medios HIC o medios de modo mixto, en condiciones tales que la protema de interes se une a la columna; (ii) obtener un primer eluato de la muestra; (iii) poner en contacto el primer eluato en modo de flujo pasante con uno de: (a) un material carbonoso; y (b) una combinacion de un material carbonoso y uno o mas de medios CEX, medios AEX, medios de modo mixto y medios HIC; y (iv) obtener un segundo eluato de la muestra; donde el segundo eluato comprende un nivel menor o reducido de una o mas impurezas con relacion al nivel de una o mas impurezas en el primer eluato.
Aun en otro aspecto, se proporciona un metodo para reducir el nivel de una o mas impurezas en una muestra que comprende una protema de interes y una o mas impurezas, comprendiendo el metodo las etapas de: (i) poner en contacto una muestra que comprende una protema de interes y una o mas impurezas con una columna de cromatograffa que contiene medios de afinidad; (ii) obtener un primer eluato de la muestra; (iii) poner en contacto el primer eluato en modo de flujo pasante con un material carbonoso; (iv) obtener un segundo eluato de la muestra; (v) poner en contacto el segundo eluato con medios de cromatograffa de intercambio anionico; y (vi) obtener un tercer eluato de la muestra, en donde el tercer eluato comprende un nivel menor o reducido de una o mas impurezas con relacion al nivel de una o mas impurezas con relacion al nivel de una o mas impurezas cuando el primer eluato con esta en contacto con el material carbonoso.
Se describe un metodo que incluye una etapa de cromatograffa de unir y eluir CEX despues de la etapa de captura de afinidad y antes de poner en contacto la muestra con medios cromatograficos de intercambio anionico, lo que el algunas realizaciones es un adsorbente de membrana. En algunas realizaciones, un metodo segun la invencion reivindicada obvia la necesidad de etapas cromatograficas adicionales, por ejemplo, una etapa de cromatograffa de unir y eluir CEX usada despues de la etapa de captura de afinidad. Los medios cromatograficos de intercambio anionico disponibles comercialmente ejemplares son adsorbentes de membrana tales como ChromaSorb™ (MILLIPORE CORPORATION, Billerica, MA, EE.UU.), Mustang Q (PALL CORPORATION, Port Washington, NY, EE.UU.), Sartobind Q (SARTORIUS STEDIM, Alemania), asf como medios de lecho tales como Q Sepharose FF (GE HEALTHCARE, Filadelfia, PA, EE.UU.).
En algunas realizaciones, se proporcionan metodos segun la invencion reivindicada que emplean etapas cromatograficas no basadas en columnas.
Aun en otro aspecto, se proporciona un metodo para reducir el nivel de una o mas impurezas en una muestra que comprende una protema de interes, comprendiendo el metodo las etapas de: (i) obtener una fase proteica que comprende la protema de interes; (ii) reconstituir la fase proteica que comprende la protema de interes usando un tampon adecuado, para obtener asf una disolucion proteica reconstituida; (iii) poner en contacto la disolucion proteica reconstituida con un material carbonoso en modo de flujo pasante; (iv) obtener un primer elutato que comprende la protema de interes; (v) poner en contacto el primer eluato con medios de cromatograffa de intercambio anionico; y (vi) obtener un segundo eluato que comprende la protema de interes, en donde el segundo eluato comprende un nivel inferior o reducido de una o mas impurezas con relacion al nivel de una o mas impurezas cuando la disolucion proteica reconstituida de (iii) no se pone en contacto con el material carbonoso.
En algunas realizaciones, tal metodo obvia la necesidad de cualquier etapa cromatografica de unir y eluir, por ejemplo, una etapa cromatografica CEX o de afinidad de unir y eluir.
En algunos metodos segun la presente invencion, la fase proteica se obtiene usando uno o mas metodos seleccionados del grupo que consiste en precipitacion, floculacion, cristalizacion, cromatograffa en columna, uso de una molecula pequena soluble, uso de un ligando polimerico, o uso de un medio cromatografico suspendido.
En algunas realizaciones, la combinacion de un material carbonoso y uno o mas de medios AEX, medios CEX, medios HIC y medios mixtos implica mezclar el material carbonoso con uno o mas de tales medios. En otras realizaciones, la combinacion de un material carbonoso y uno o mas de medios AEX, medios CEX, medios HIC y medios mixtos conlleva el uso de materiales diferentes en la combinacion en tandem.
En diversas realizaciones segun los metodos de la presente invencion, los medios de afinidad se seleccionan de Protema A o Protema G.
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En algunas realizaciones, la protema de interes es un anticuerpo o una protema que contiene una region Fc. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
En algunas realizaciones, la muestra comprende una alimentacion de cultivo celular.
En algunas realizaciones, la muestra es una alimentacion de cultivo celular clarificado.
En algunas realizaciones, la alimentacion de cultivo celular clarificado se obtiene mediante filtracion y/o centrifugado profundo.
En algunas realizaciones, el cultivo celular clarificado se obtiene mediante precipitacion con una sal, un acido, un polfmero, o un polfmero sensible a estimulos.
En diversas realizaciones, el material carbonoso usado en los metodos segun la invencion reivindicada es carbon activado. En algunas realizaciones, el carbon activado comprende carbon vegetal activado.
En algunas realizaciones, la combinacion de un material carbonoso y uno o mas de medio CEX, medios AEX, medios de modo mixto y medios HIC comprende una mezcla de carbon activado y uno o mas de resina CEX, resina AEX, resina de modo mixto y resina HlC. En algunas realizaciones, tal mezcla se rellena en una columna cromatografica. En otras realizaciones, la mezcla se rellena en un disco. Aun en otras realizaciones, la mezcla se rellena en una vaina, cartucho o capsula.
En algunas realizaciones, el carbon activado se rellena en una columna de cromatograffa. En otras realizaciones, el carbon activado se rellena en un dispositivo sellado desechable tal como Millistak+® Pod. Aun en otras realizaciones, el carbon activado se rellena es un cartucho o una capsula.
En algunas realizaciones, el carbon activado se impregna en un material poroso, por ejemplo, el carbon activado se incorpora en medios fibrosos porosos. El material poroso puede estar contenido en una columna, un disco, un Millistak+® Pod, un cartucho o una capsula. En algunas realizaciones, el carbon activado se rellena en un medio celulosico.
En una realizacion particular, el medio AEX es una membrana que tiene un revestimiento superficial que comprende una o mas aminas primarias polimericas o copolfmeros de las mismas.
En algunas realizaciones, una muestra que comprende una protema de interes y una o mas impurezas se pone en contacto con carbon activado antes de someter la muestra a una etapa de captura de afinidad. En otras realizaciones, la muestra se pone en contacto con carbon activado despues de la etapa de captura de afinidad.
En diversos metodos segun la invencion reivindicada, la perdida de rendimiento de la protema de interes usando un proceso que emplea carbon activado es menor que 20% de la cantidad de protema total. En otras palabras, los procesos segun la invencion reivindicada dan como resultado un rendimiento del 80% o mayor de protema de interes, donde 100% es la cantidad de protema total. En una realizacion adicional, la perdida de rendimiento de la protema de interes usando un proceso que emplea carbon activado es menor que 10%. En otras palabras, los procesos segun la invencion reivindicada dan como resultado un rendimiento del 90% o mayor de protema de interes, donde 100% es la cantidad de protema total.
En una realizacion particular, el carbon activado se usa como parte de una operacion unitaria o etapa de un proceso de purificacion de flujo pasante en un metodo para purificar una molecula diana (por ejemplo. un anticuerpo o una protema que contiene una region Fc) a partir de una muestra (por ejemplo, un eluato tal cono un eluato de Protema A recuperado de una etapa de un proceso cromatografico de unir y eluir realizada antes de la etapa de purificacion de flujo pasante). En tal operacion unitaria o etapa de un proceso de purificacion de flujo pasante, el eluato a partir de una etapa cromatografica de unir y eluir (por ejemplo, una columna de afinidad de Protema A) fluye a traves de carbon activado seguido de un medio AEX seguido de un medio CEX y seguido de un filtro de virus, como se representa en la Figura 19. En algunas realizaciones, se realiza un cambio en la disolucion (por ejemplo, un cambio de pH) entre la etapa AEX y la etapa CEX, donde la disolucion emplea un tanque de compensacion y/o un mezclador estatico en lmea. En algunas realizaciones, la operacion unitaria o etapa del proceso de purificacion de flujo pasante que emplea carbon activado, como se describe en la presente memoria, es parte de un proceso continuo para purificar una molecula diana, en donde la etapa de purificacion de flujo pasante esta en comunicacion de fluidos con una etapa del proceso corriente arriba (por ejemplo, una etapa de captura cromatografica de unir y eluir y una etapa de proceso corriente abajo (por ejemplo, una etapa de formulacion) de la etapa de proceso de purificacion de flujo pasante, permitiendo asf que la muestra lfquida fluya a traves del proceso de forma continua.
En una realizacion particular, la operacion unitaria o etapa de proceso de flujo pasante entera emplea una plataforma unica (es decir, un equipamiento de control/monitorizacion).
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 representa un diagrama de barras que muestra los resultados de un experimento para medir el
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rendimiento IgG en un eluato de flujo pasante de una alimentacion CHO-S nulas con IgG policlonal anadida para cada uno de los medios adsorbentes comercialmente disponibles que se evaluaron, es decir, carbon activado (AC); una resina de intercambio cationico de agarosa, SP Sepharose™ Fastflow (SPFF); una resina de intercambio cationico polimerica, ProRes™-S; una resina de intercambio anionico de agarosa, Q Sepharose™ (QFF); y una resina HlC de agarosa, Phenyl Sepharose™ 6 Fastflow (ph FF). Como se muestra en la Figura 1, excepto para la resina HIC que muestra hasta ~5% de perdida de rendimiento IgG, todos los demas medios evaluados no mostraron perdidas detectables.
La Figura 2 representa un diagrama de barras que muestra los resultados de un experimento para medir la cantidad de especies activas a UV 280 nm en un eluato de flujo pasante de una alimentacion de CHO-S nulas con IgG policlonal anadida, para cada uno de los diversos medios adsorbentes comercialmente disponibles que fueron evaluados, es decir, un carbon activado, Nuchar® RGC, (AC), SPFF, ProRes™-S, QFF y ph FF, asf como la alimentacion clarificada sin tratar. Como se muestra en la Figura 2, el carbon activado redujo significativamente la cantidad de especies de color en comparacion a los otros medios adsorbentes.
La Figura 3 representa un diagrama de barras que muestra los resultados de un experimento para medir la concentracion de protema celular hospedante (HCP) en un eluato de flujo pasante de una alimentacion de CHO-S nulas con IgG policlonal anadida, para cada uno de los medios adsorbentes comercialmente disponibles listados anteriormente, asf como alimentacion clarificada sin tratar. La concentracion HCP se midio en ng/mL usando un kit Cygnus CHO-CM HCP ELISA. Como se muestra en la Figura 3, todos los medios evaluados, que inclrnan carbon activado, eliminaron HCP en alguna medida. Sin embargo, las resinas cationicas SPFF y ProRes™-S, eliminaron HCP de la forma mas eficaz.
La Figura 4 representa un diagrama de barras que muestra los resultados de un experimento para medir la concentracion de ADN en un eluato de flujo pasante de una alimentacion de CHO-S nulas con IgG policlonal anadida, para cada uno de los medios listados anteriormente, asf como la alimentacion clarificada sin tratar. La concentracion de ADN (pg/mL) se midio usando un ensayo PicoGreen. Como se muestra en la Figura 4, cada uno de los medios elimina ADN en alguna medida. Sin embargo, el medio de intercambio anionico elimina el ADN de la forma mas eficaz, seguido del carbon activado.
La Figura 5 representa un diagrama de dispersion x-y que muestra los resultados de un experimento para medir la concentracion de IgG en un eluato de flujo pasante de una alimentacion de CHO-S nulas con IgG policlonal anadida y ADN de esperma de arenque, para cada uno de los medios evaluados listados anteriormente, a cada 10 CV de alimentacion cargada, hasta 100 CV, incluyendo la alimentacion clarificada sin tratar. El volumen de columna (CV) se muestra en el eje x y la concentracion IgG en mg/mL se muestra en el eje y. Todos los medios evaluados, que inclrnan AC, SPFF, ProRes™-S y QFF, no mostraron una perdida de IgG significativa hasta una carga de 100 CV de alimentacion clarificada sin tratar.
La Figura 6 representa un diagrama de dispersion x-y que muestra los resultados de un experimento para medir el area del pico de la especies activas UV (que corresponde a la cantidad de especies activas UV) en un eluato de flujo pasante de una alimentacion de CHO-S nula con IgG policlonal anadida y DNA de esperma de arenque, para cada uno de los medios evaluados, a cada 10 CV de alimentacion cargada, hasta 100 CV, que inclrna la alimentacion clarificada sin tratar. El volumen de columna (CV) se muestra en el eje x y el area del pico de la especie activa UV en el flujo pasante de la columna analttica de Protema A se muestra en el eje y. De todos los materiales evaluados, AC elimino mas del 70% de la especie activa UV a traves de los 100 CV; QFF elimino aproximadamente 10% de la especie activa UV a traves de los 100 CV; y las dos resinas de intercambio cationico, SPFf y ProRes™-S eliminaron una cantidad minima de especie activa UV.
La Figura 7 representa un diagrama de dispersion x-y que muestra los resultados de un experimento para medir la concentracion de protema celular hospedante (HCP) en un eluato de flujo pasante de una alimentacion de CHO-S nulas con IgG policlonal anadida y aDn de esperma de arenque, para cada uno de los medios evaluados listados anteriormente, a cada 10 CV de alimentacion cargada, hasta 100 CV, incluyendo la alimentacion clarificada sin tratar. El volumen de columna (CV) se muestra en el eje x y la concentracion HCP en ng/mL se muestra en el eje y. SPFF y ProRes S eliminaron el maximo HCP a traves de los 100 CV. QFF elimino algo de HCP pero se rompio rapidamente. Para esta alimentacion espedfica que tema una concentracion elevada de ADN, el carbon activado elimino la ultima cantidad de HCP.
La Figura 8 representa un diagrama de dispersion x-y que muestra el resultado de un experimento para medir la concentracion de ADN en un eluato de flujo pasante de una alimentacion de CHO-S nulas con IgG policlonal anadida y ADN de esperma de arenque, para cada uno de los medios evaluados y listados anteriormente, a cada 10 CV de alimentacion cargada, hasta 100 Cv, incluyendo la alimentacion clarificada sin tratar. El volumen de columna (CV) se muestra en el eje x y la concentracion de ADN en pg/mL se muestra en el eje y. Cada uno de los medios evaluados, que inclrnan AC, SPFF, ProRes™-S y QFF, eliminaron el ADN a traves de los 100 CV, son embargo, a grados diferentes.
La Figura 9 es un esquema de los diferentes modos de operacion ejemplares que se pueden usar para la eliminacion de impurezas. El diagrama de flujos de la derecha representa un experimento representativo donde la
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alimentacion clarificada sin tratar se carga en una columna que contiene AC, seguido de una columna que contiene medios SPFF, ProRes™-S o QFF. El diagrama de flujos del medio representa un experimento representativo donde la alimentacion clarificada sin tratar se carga en una columna que contiene AC, seguido de una columna que contiene medios SPFF o ProRes™-S y despues seguido de QFF. El diagrama de flujos de la derecha representa un experimento representativo donde la carga clarificada sin tratar se carga en una columna que contiene una mezcla 1:1 (v/v) de AC y SPFF; o una mezcla 1:1 (v/v) de AC y ProRes™-S; o una mezcla 1:1:1 (v/v/v) de AC y ProRes™-S y QFF.
La Figura 10 representa un diagrama de barras que muestra el area del pico de la especie activa UV (que corresponde a la cantidad de especie activa UV) en un eluato de flujo continuo de una alimentacion de CHO-S nulas con IgG policlonal anadido, para cada una de las combinaciones de materiales mostrada en la Figura 9, que incluye la alimentacion clarificada sin tratar. El carbon activado y las mezclas que contienen carbon activado redudan significativamente la especie activa UV. En los casos donde se usaban tanto el carbon activado como la resina de intercambio anionico en un proceso, bien usado secuencialmente o como una mezcla, se eliminaron mas especies activas UV, demostrando un efecto sinergico de los diferentes materiales.
La Figura 11 representa un diagrama de barras que muestra la concentracion de protema celular hospedante (HCP) en un eluato de flujo pasante de una alimentacion de CHO-S nulas con IgG policlonal anadido, para cada una de las combinaciones de materiales mostrada en la Figura 9, que inclrnan alimentacion clarificada sin tratar. Todos los materiales eliminaron HCP en alguna extension; sin embargo, cuando se usa carbon activado en un proceso junto con una resina cationica, tal como SPFF o ProRes™-S, o con un resina anionica, tal como, QFF, bien cuando se usa secuencialmente con una resina o como una mezcla con una resina, eliminaba HCP de la manera mas eficaz, indicando un efecto sinergico de los materiales diferentes.
La Figura 12 representa un diagrama de barras que muestra la concentracion de ADN en un eluato de flujo pasante de una alimentacion de CHO-S nulas con IgG policlonal anadido, para cada una de las combinaciones de materiales mostrada en la Figura 9, que inclrnan alimentacion clarificada sin tratar. Todos los materiales eliminaron HCP ADN en alguna extension; sin embargo, cuando se uso carbon activado bien secuencialmente con QFF o como una mezcla con QFF, fue lo mas efectivo en la eliminacion de ADN en comparacion con los otros materiales y combinaciones evaluados.
La Figura 13 representa un diagrama de barras que muestra los resultados de un experimento para medir el rendimiento IgG en un eluato de flujo pasante de un conjunto de fracciones de elucion de columna de Protema A para cada uno de los materiales evaluados, es decir, AC; SPFF; QFF; ph FF, asf como dos combinaciones de materiales, una mezcla 1:1:1 (v/v/v) de AC/SPFF/QFF, y una mezcla 1:1:1 (v/v/v) de PhFF/SPFF/QFF. La alimentacion para el eluato de flujo pasante de los diferentes materiales evaluados era un conjunto de fracciones de elucion de columna de Protema A generado usando resina de Protema A Prosep Ultra Plus a partir de una alimentacion de CHO-S nulas con IgG policlonal anadido. Todos los materiales evaluados mostraban mas del 80% de rendimiento.
La Figura 14 representa un diagrama de barras que muestra los resultados de un experimento para medir la concentracion de protema celular hospedante (HCP) en un eluato de flujo pasante de un conjunto de fracciones de elucion de columna de Protema A para cada uno de los materiales evaluados, es decir, AC; SPFF; QFF; ph FF, asf como dos combinaciones de materiales, una mezcla 1:1:1 (v/v/v) de AC/SPFF/QFF, y una mezcla 1:1:1 (v/v/v) de PhFF/SPFF/QFF. La alimentacion para el eluato de flujo pasante de los diferentes materiales evaluados era un conjunto de fracciones de elucion de columna de Protema A generado usando resina de Protema A Prosep Ultra Plus a partir de una alimentacion de CHO-S nulas con IgG policlonal anadido. Todos los materiales o mezclas de materiales eliminaron cierta cantidad de HCP a partir del conjunto de fracciones de elucion de Protema A; sin embargo, el carbon activado y la resina de intercambio cationico eran los mas eficaces, cuando se usaban solos. Cuando se usaron como una mezcla, AC/SPFF/QFF y PhFF/SPFF/QFF eliminaron mas HCP que cualquier componente individual solo. QFF y PhFF, cuando se usaron solos, eliminaron la ultima cantidad de HCP.
La Figura 15 representa un diagrama de barras que muestra los resultados de un experimento para medir la concentracion de ADN en un eluato de flujo pasante de un conjunto de fracciones de elucion de columna de Protema A para cada uno de los materiales evaluados, es decir, AC; SPFF; QFF; y ph FF, asf como dos combinaciones de materiales, una mezcla 1:1:1 de AC/SPFF/QFF y una mezcla 1:1:1 de PhFF/SPFF/QFF. La alimentacion para el eluato de flujo pasante de los diferentes materiales evaluados era un conjunto de fracciones de elucion de columna de Protema A generado usando resina de Protema A Prosep Ultra Plus a partir de una alimentacion de CHO-S nulas con IgG policlonal anadido. Todos los materiales o mezclas de materiales eliminaron cierta cantidad de ADN del conjunto de fracciones de elucion de Protema A con las mezclas de resinas AC/SPFF/QFF y PhFF/SPFF/QFF mostrando ligera ventaja sobre cualquier componente individual.
La Figura 16 es un grafico que muestra los resultados de un experimento para medir la concentracion de HCP con relacion a la del producto (es decir, un anticuerpo monoclonal) en ppm para las fracciones individuales de una disolucion de anticuerpo monoclonal, donde la disolucion se capturo a partir de un cultivo celular clarificado usando cromatograffa de Protema A (referida como eluato de Protema A) y se sometio posteriormente a tres trenes de purificacion de flujo pasante separados. El primer tren empleaba un dispositivo de membrana de intercambio
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anionico ChromaSorb™ de 0,2 mL compuesto de 5 capas; el segundo tren empleaba una columna de relleno de 1 mL de carbon activado HD Nuchar; y le tercer tren empleaba una columna de carbon activado de 1 mL seguido de una membrana de intercambio anionico ChromaSorb™ de 0,2 mL. Se recogieron fracciones de 10 mL del eluato de cada tren de purificacion y se analizaron las fracciones seleccionadas para determinar la concentracion de protema celular hospedante (HCP) e IgG. El eje X del grafico representa el punto final de recogida para la fraccion de 10 mL en volumenes de columna (CV) del eluato de la columna de carbon activado. El eje Y del grafico representa la concentracion de HCP con relacion a la del producto (es dedr, un anticuerpo monoclonal) en ppm para las fracciones individuales del eluato de carbon activado. El grafico muestra que el tratamiento de flujo pasante del eluato capturado por afinidad con carbon activado solo y en combinacion con medios de intercambio anionico era inesperadamente efectivo para la eliminacion de impurezas de la disolucion del anticuerpo monoclonal.
La Figura 17 es un grafico que muestra los resultados de un experimento para medir la concentracion de HCP con relacion a la del producto (es decir, un anticuerpo monoclonal) en ppm para las fracciones individuales de una disolucion de anticuerpo monoclonal, donde la disolucion se capturo a partir de un cultivo celular clarificado usando cromatograffa de intercambio cationico (CEX) (referido como eluato CEX) y se sometio posteriormente a purificacion con una columna de relleno de 1 mL de carbon activado HD Nuchar. Se recogieron siete fracciones de 10 mL del eluato, que se analizaron para determinar la concentracion de protema celular hospedante (HCP) e IgG. El eje X del grafico representa el punto final de recogida para la fraccion de 10 mL en volumenes de eluato (mL) del eluato de la columna de carbon activado. El eje Y del grafico representa la concentracion de HCP con relacion a la del producto (es decir, un anticuerpo monoclonal) en ppm para las fracciones individuales. El grafico muestra que se puede usar carbon activado para eliminar impurezas de una variedad de diferentes disoluciones proteicas.
La Figura 18 es un grafico que muestra los resultados de un experimento para medir la concentracion de HCP con relacion a la del producto (es decir, un anticuerpo monoclonal, MAb II) en ppm para las fracciones individuales de una disolucion de anticuerpo monoclonal, donde la disolucion es capturada a partir de un cultivo celular clarificado usando un sistema cromatografico de multi-cromatograffa continuo de tres columnas (CMC) equipado con columnas de Protema A, y posteriormente purificado con carbon activado HD Nuchar rellenado en una columna seguido de un dispositivo de cromatograffa de intercambio anionico (por ejemplo, ChromaSorb™). El eje X del grafico representa el punto final de la recogida de fracciones, medido en el pedo de anticuerpo cargado por unidad de volumen del dispositivo de intercambio anionico (kg/L). El eje Y del grafico representa la concentracion de HCP con relacion a la del producto (es decir, un anticuerpo monoclonal) en ppm para las fracciones individuales. El grafico muestra que mientras que tanto el carbon activado como ChromaSorb™ eliminan una parte significativa de HCP cuando se usan solos, cuando se usan en combinacion, aumentan la pureza de la disolucion de partida de 1,370 ppm HCP a por debajo de 10 ppm.
La Figura 19 muestra un esquema de la etapa conectada del proceso de purificacion de flujo pasante, como se describe en la presente memoria. un dispositivo que contiene carbon activado se conecta directamente a un dispositivo de intercambio anionico. El efluente del dispositivo de intercambio anionico pasa a traves de un mezclador estatico, donde se anade un acido acuoso para reducir el pH, y despues va a traves de un dispositivo de flujo pasante de intercambio cationico y un filtro de virus.
La Figura 20 es un grafico que representa los resultados de un experimento para medir el punto final HCP despues del dispositivo de cromatograffa de intercambio anionico (es decir, ChromaSorb™). El eje Y se refiere a la concentracion HCP (ppm) y el eje X se refiere a la carga AEX (kg/L).
La Figura 21 es un grafico que muestra los resultados de un experimento para medir la eliminacion de agregados MAb como una funcion de la carga del dispositivo de filtracion de virus en la etapa del proceso de purificacion de flujo pasante. El eje X se refiere a la carga de filtracion de virus (kg/m2) y el eje Y se refiere al porcentaje de agregados MAb en la muestra despues de la filtracion de virus.
La Figura 22 es un grafico que representa los resultados de un experimento para medir los perfiles de presion despues de la filtracion profunda, el carbon activado y la filtracion de virus. El eje Y se refiere a la presion (psi) y el eje X se refiere al tiempo en horas.
Descripcion detallada
La presente invencion proporciona procesos nuevos y mejorados para purificar una protema de interes a partir de una muestra que contiene la protema de interes y una o mas impurezas.
El carbon activado se ha usado previamente en los procesos de purificacion de agua. Ademas, el carbon activado se ha usado para eliminar pequenas moleculas de impurezas, tales como acidos grasos y bilirrubina, de suero de albumina (vease, por ejemplo, Chen et al., J. Biol. Chem., 242: 173-181 (1967); Nakano et al., Anal Biochem., 129: 64-71 (1983); Nikolaev et al., Int. J. Art. Org., 14:179-185 (1991)). El carbon activado tambien se ha usado para eliminar pigmentos, asf como protemas hospedantes, proteasas y ribonucleasas durante la purificacion de virus de plantas (vease, por ejemplo, Price, Am. J. Botany, 33: 45-54 (1946); Corbett, Virology, 15:8-15 (1961); McLeana et al., Virology, 31: 585-591 (1967).
De acuerdo con esto, en general, se ha informado que el carbon activado se une de forma no espedfica a moleculas
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en disolucion (por ejemplo, impurezas en una muestra de agua).
La presente invencion esta basada, al menos en parte, en el hallazgo sorprendente e inesperado de que el carbon activado puede eliminar de forma selectiva poblaciones de impurezas proteicas y ADN, haciendolo por tanto util en la purificacion de protemas producidas mediante la expresion recombinante en celulas.
Como se demuestra en los ejemplos en la presente memoria, el carbon activado se puede usar para la eliminacion selectiva de impurezas de protemas de celulas hospedantes (HCP) y ADN durante los procesos de purificacion de protemas sin afectar de forma significativa al rendimiento de la protema diana. Ademas como se demuestra en los Ejemplos indicados en la presente memoria, cuando se usa carbon activado en un proceso de purificacion de protemas en un modo de flujo pasante, bien solo o en mezcla con uno o mas medios de cromatograffa de diversos tipos, ello resulta en una reduccion significativa del nivel de una o mas impurezas en la muestra que contiene protemas asf como en la reduccion de la carga de columnas de cromatograffa corriente abajo. Ademas, en algunos casos, el carbon activado disminuye el numero de etapas que se pueden usar en un proceso de purificacion, reduciendo por lo tanto el coste global de operacion y ahorrando tiempo. Ademas, como se muestra en los Ejemplos indicados en la presente memoria, el carbon activado se puede usar antes o despues de la etapa de captura, reduciendo asf el nivel de una o mas impurezas en una muestra que contiene la protema de interes.
En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, el carbon activado se usa en una etapa de purificacion de flujo pasante de un proceso global para purificar una molecula diana, donde el proceso global asf como la etapa de purificacion de flujo pasante se realizan de forma continua.
Para que la presente descripcion se pueda entender mas facilmente, primero se definen algunos terminos. A traves de la descripcion detallada se indican definiciones adicionales.
I. Definiciones
El termino "material carbonoso," como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier sustancia compuesta de carbono o que contiene carbono. En algunas realizaciones, el material carbonoso usado en los metodos segun la invencion reivindicada es carbon activado. En algunas realizaciones, el carbon activado comprende carbon vegetal activado. En algunas realizaciones, el carbon activado se incorpora en un medio celulosico.
El termino "carbon activo" o "carbon activado," como se usa de forma intercambiable en la presente memoria, se refiere a un material carbonoso que se ha sometido a un proceso para mejorar su estructura porosa. Los carbonos activados son solidos porosos con areas superficiales muy elevadas. Se pueden derivar de una variedad de fuentes que incluyen carbon, madera, cascara de coco, cascaras de frutos con cascara y turba. El carbon activado se puede producir a partir de estos materiales usando activacion ffsica que implica calentar en una atmosfera controlada o activacion qmmica que utiliza acidos fuertes, bases, u oxidantes. Los procesos de activacion producen una estructura porosa con areas superficiales muy elevadas que proporcionan carbon activado con alas capacidades para la eliminacion de impurezas. Los procesos de activacion se pueden modificar para controlar la acidez de la superficie.
Los procesos tfpicos de activacion implican someter una fuente de carbono, tal como desechos de resina, carbon, carbon de coque, coque de petroleo, lignitos, materiales polimericos y materiales lignocelulosicos que incluyen pulpa y papel, residuos de la produccion de pulpa, madera (como virutas de madera, serrm, harina de madera), cascaras de frutos con cascara como cascara de almendra y cascara de coco), granos y semillas de frutas (como huesos de cereza y aceitunas) a un proceso termico (por ejemplo, con un gas oxidante) o a un proceso qmmico (por ejemplo, con acido fosforico o sales metalicas tales como cloruro de zinc). Una activacion qmmica ejemplar de carbono masado en madera con acido fosforico (H3PO4) se describe en la patente de EE.uU. No. Re. 31.093, que daba como resultado en una mejora de las capacidades de adsorcion de gas y decolorantes del carbono. Tambien, la patente de EE.UU. No. 5.162.286 ensena la activacion con acido fosforico de un material basado en madera que es particularmente denso y que tiene un contenido de lignina relativamente alto (30%), tal como cascara de frutos con cascara, huesos y granos. La activacion con acido fosforico de material lignocelulosico tambien se discute en la Patente de EE.UU. No. 5.204.310, como una etapa para preparar carbonos de actividad elevada y densidad elevada.
En contraste a la mayona de los otros materiales adsorbentes, se cree que el carbon activado interactua con moleculas que usan fuerzas de van der Waals o de dispersion de London relativamente debiles. Los productos de carbon activado tfpicamente comerciales presentan un area superficial de al menos 300 m2/g, medido mediante el metodo Brunauer-Emmett-Teller ("BET") basado en la adsorcion de nitrogeno, que es un metodo bien conocido en la tecnica.
Aunque el carbon activo o activado se ha empleado previamente en procesos para purificar lfquidos y gases, no se ha empleado previamente en procesos para purificar una protema expresada recombinantemente a partir de una o mas impurezas proteicas.
El termino "inmunoglobulina," "Ig" o "IgG" o "anticuerpo" (usado de forma intercambiable en la presente memoria) se refiere a una protema que tiene una estructura basica de cadena de cuatro polipeptidos que consiste en dos
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cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, estando estabilizadas dichas cadenas, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro intercadena, que tienen la habilidad de unirse al antigeno espedficamente. El termino "inmonoglobulina de cadena-sencilla," "o anticuerpo de cadena-sencilla" (usado de forma intercambiable en la presente memoria) se refiere a una protema que tiene una estructura de cadena de dos polipeptidos que consiste en una cadena ligera y una cadena pesada, estando estabilizadas dichas cadenas, por ejemplo, mediante ligantes peptfdicos intercadena, que tienen la habilidad de unirse al antigeno espedficamente. El termino "dominio" se refiere a una region globular de un polipeptido de cadena ligera o pesada que comprende bucles peptfdicos (por ejemplo, que comprende de 3 a 4 bucles peptfdicos) estabilizados, por ejemplo, por enlaces disulfuro intracadena y/o lamina p-plegada. Los dominios ademas son referidos en la presente memoria como "constantes" o "variables", basado en la falta relativa de variacion de secuencia dentro de los dominios de diversos miembros de clase en el caso de un dominio "constante", o la variacion significativa dentro de los dominios de diversos miembros de clase en el caso de un dominio "variable". "Dominios" de anticuerpo o de polipeptido a menudo se refieren en la tecnica de forma intercambiable como "regiones" de anticuerpo o de polipeptido. Los dominios "constantes" de cadenas ligeras de anticuerpo se refieren de forma intercambiable como "regiones constantes de cadena ligera", "dominios constantes de cadena ligera", regiones "CL" o dominios "CL". Los dominios "constantes" de cadenas pesadas de anticuerpo se refieren de forma intercambiable como "regiones constantes de cadena pesada", "dominios constantes de cadena pesada", regiones "CH" o dominios "CH". Los dominios "variables" de cadenas ligeras de anticuerpo se refieren de forma intercambiable como "regiones variables de cadena ligera", "dominios variables de cadena ligera", regiones "VL" o dominios "VL". Los dominios "variables" de cadenas pesadas de anticuerpo se refieren de forma intercambiable como "regiones variables de cadena pesada", "dominios variables de cadena pesada", regiones "VH" o dominios "VH".
Las inmunoglobulinas o anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden existir en forma monomerica o polimerica, por ejemplo, los anticuerpos IgM que existen en forma pentamerica y/o los anticuerpos IgA que existen en forma monomerica, dimerica o multimerica. Las inmunoglobulinas o anticuerpos pueden tambien incluir anticuerpos multiespedficos (por ejemplo, anticuerpos biespedficos), y fragmentos de anticuerpo siempre que retengan, o se modifiquen para comprender, un dominio de union espedfica a ligando. El termino "fragmento" o "fragmento funcional" de un anticuerpo se refiere a una parte o porcion de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos restos de aminoacido que una cadena de anticuerpo o anticuerpo completo o intacto. Los fragmentos se pueden obtener a traves de tratamiento qu/mico o enzimatico de una cadena de anticuerpo o anticuerpo completo o intacto. Los fragmentos tambien se pueden obtener por medios recombinantes. Cuando se producen de forma recombinante, los fragmentos se pueden expresar solos o como parte de una protema mas grande llamada una protema de fusion. Fragmentos ejemplares incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fc y/o Fv. Protemas de fusion ejemplares incluyen protemas de fusion Fc.
En una realizacion particular, los metodos de acuerdo con la invencion reivindicada se usan para purificar un fragmento de un anticuerpo que es un fragmento que contiene una region Fc.
El termino "region Fc" y "protema que contiene una region Fc" significa que la protema contiene regiones o dominios constantes de cadena ligera y/o pesada (regiones CH y CL como se han definido previamente) de una inmunoglobulina. Las protemas que contienen una "region Fc" pueden poseer las funciones efectoras de un dominio constante de inmunoglobulina. Una "region Fc" tal como las regiones CH2/CH3, se pueden unir selectivamente a ligandos de afinidad tales como la Protema A o variantes funcionales de la misma. En algunas realizaciones, una protema que contiene una region Fc se une espedficamente a la Protema A o un derivado, variante o fragmento funcional de la misma. En otras realizaciones, una protema que contiene una region Fc se une espedficamente a la Protema G o Protema L, o derivados, variantes o fragmentos funcionales de la misma.
Como se ha discutido anteriormente, en algunas realizaciones, una protema diana es una protema que contiene una region Fc, por ejemplo, una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, una protema que contiene una region Fc es una protema recombinante que incluye la region Fc de una inmunoglobulina condensada a otro polipeptido o fragmento del mismo.
Generalmente, una inmunoglobulina o anticuerpo se dirige frente a un "antigeno" de interes. Preferiblemente, el antfgeno es un polipeptido biologicamente importante y la administracion del anticuerpo a un mairnfero que padece una enfermedad o trastorno puede aportar un beneficio terapeutico a ese mai^ero.
El termino " anticuerpo monoclonal " o "Mab," como se usa de forma intercambiable en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales en la poblacion son identicos excepto para las mutaciones que se producen de forma natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente espedficos, estando dirigidos frente a un sitio antigenico unico. Ademas, en contraste a las preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonales) que incluyen tfpicamente diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epftopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige frente a un determinante unico sobre el antfgeno. El modificador "monoclonal" indica el caracter del anticuerpo como obtenido de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere la produccion del anticuerpo por cualquier metodo particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para usarse de acuerdo con la presente invencion se pueden obtener por el metodo hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o se puede
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obtener mediante metodos de ADN recombinante (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" tambien se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las tecnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).
Los anticuerpos monoclonales ademas incluyen anticuerpos "quimericos" (inmunoglobulinas) en los que una porcion de la cadena ligera y/o pesada es identica a u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es identico a u homologo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, asf como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten la actividad biologica deseada (Patente de EE.UU. No. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
El termino "region hipervariable" cuando se usa en la presente memoria se refiere a los restos de aminoacidos de un anticuerpo que son responsables de una union a antfgeno. La region hipervariable comprende restos de aminoacido de una "region determinante de la complementariedad" o "CDR" (es decir los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos restos de un "bucle hipervariable" (es decir los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) and 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los restos "marco" o "FR" son aquellos restos de dominio variable distintos de los restos de region hipervariable como se define en la presente memoria.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quimericos que contienen la secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de regiones hipervariables del receptor estan reemplazados por restos de regiones hipervariables de una especie no humana (anticuerpo donante) tales como raton, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la region de marco Fv (FR) de la inmunoglobulina humana estan reemplazados por los restos no humanos correspondientes. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para mejorar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todo de al menos uno, y tfpicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), tfpicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, vease Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
Los terminos "polinucleotido" y "molecula de acido nucleico," usados en la presente memoria de forma intercambiable, se refieren a formas polimericas de nucleotidos de cualquier longitud, bien ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos. Estos terminos incluyen un ADN de una unica hebra, de doble hebra o de triple hebra, ADN genomico, cADN, ARN, ADN-ARN hfbrido, o un polfmero que comprende las bases purina y pirimidina, u otras bases nucleotidas naturales, qrnmica o bioqmmicamente modificadas, no naturales o derivatizadas. El esqueleto del polinucleotido puede comprender azucares y grupos fosfato (como se pueden encontrar tfpicamente en ARN o ADN), o grupos fosfato o azucares modificados o sustituidos. Ademas, se puede obtener un polinucleotido de doble hebra a partir del producto de smtesis qrnmica del polinucleotido de cadena sencilla bien sintetizando la hebra complementaria y reasociando las hebras en condiciones apropiadas, o mediante smtesis de la hebra complementaria de novo usando una ADN polimerasa con un cebador apropiado. Una molecula de acido nucleico puede tomar diferentes formas, por ejemplo, un gen o fragmento de gen, uno o mas exones, uno o mas intrones, mARN, cADN, polinucleotidos recombinantes, polinucleotidos ramificados, plasmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de acido nucleico y cebadores. A polinucleotido puede comprenden nucleotidos modificados, tales como nucleotidos metilados y analogos de nucleotidos, uracilo, otros azucares y grupos ligantes tales como fluororribosa y tioato, y ramificaciones de nucleotidos. Como se usa en la presente memoria, "ADN" o "secuencia nucleotida" incluye no solo las bases A, T, C, y G, sino que tambien incluye cualquiera de sus analogos o formas modificadas de estas bases, tales como nucleotidos metilados, modificaciones internucleotidas tales como uniones no cargadas y tioatos, uso de analogos de azucares y estructuras de esqueleto alternativas y/o modificadas, tales como poliamidas
El termino "disolucion," "composicion" o "muestra," como se usa en la presente memoria, se refiere a una mezcla de una protema de interes o protema diana (por ejemplo, una protema que contiene una region Fc tal como un anticuerpo) y una o mas impurezas. En algunas realizaciones, la muestra se somete a una etapa de clarificacion antes de someterse a los metodos segun la invencion reivindicada. En algunas realizaciones, la muestra comprende alimentacion de cultivo celular, por ejemplo, alimentacion de un cultivo celular mairnfero (por ejemplo, celulas CHO). Sin embargo, las muestras tambien abarcan sistemas de expresion no mai^eras usados para producir una protema de interes.
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El termino "sistemas de expresion no mairnferos" como se usa en la presente memoria se refiere a todas las celulas u organismos huesped empleados para generar protemas terapeuticas, donde las celulas u organismos huesped son de origen no mairnfero. Ejemplos no limitantes de sistemas de expresion no mairnferos son E. coli y Pichia pastoris.
El termino "especie activa UV" como se usa en la presente memoria, se refiere a la composicion de la fraccion de flujo pasante de un cultivo celular clarificado despues de someter al cultivo a una columna analftica de Protema A, monitorizado por un espectrometro UV. En algunas realizaciones, el espectrofotometro UV monitoriza la fraccion a 280 nm. Esta fraccion generalmente consiste en impurezas tales como tintes (tales como indicadores de pH), protemas de celulas huesped, ADN y otros componentes de medios de cultivo celular que necesitan eliminarse de la fraccion, que tambien contiene la protema de interes (por ejemplo, un anticuerpo). El pico de impurezas de flujo pasante se integra manualmente o mediante un algoritmo predeterminado y se usa para cuantificar el nivel total de impurezas.
Como se usa en la presente memoria, el termino "polipeptido" se refiere generalmente a peptidos y protemas que tienen mas de aproximadamente diez aminoacidos. Los terminos "protema de interes" y "protema diana," como se unas de forma intercambiable en la presente memoria, se refieren a una protema o polipeptido, que incluyen, pero no se limitan a, una protema que contiene una region Fc tal como un anticuerpo que se va a purificar mediante un metodo de la invencion, de una o mas impurezas.
Polipeptidos ejemplares incluyen, por ejemplo, renina; una hormona del crecimiento, que incluye la hormona del crecimiento humana y la hormona del crecimiento bovina; factor de liberacion de la hormona del crecimiento; hormona paratiroide; hormona estimulante tiroide; lipoprotemas; a-1-antitripsina; cadena a de insulina cadena p de insulina proinsulina; hormona estimulantes del folmulo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores coagulantes tales como el factor VIIIC, factor IX, factor tisular, y el factor von Willebrands; factores anti-coagulantes tales como la Protema C; factor natriuretico auricular; tensioactivo pulmonar; un activador plasminogeno, tal como uroquinasa u orina humana o activador del plasminogeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyetico; factor de necrosis tumoral -a y -p; encefalinasa; RANTES (celula T normal expresada, segregada y regulada en activacion, del ingles regulated on activation normally T-cell expressed and secreted); protema inflamatoria macrofaga humana (MIP-1-a); una albumina de suero tal como albumina de suero humano; sustancia inhibidora Mulleriana; cadena a de relaxina; cadena p de relaxina; prorrelaxina; peptido asociado a gonadotropina de raton; una protema microbiana, tal como p-lactamasa; ADNasa; IgE; un antfgeno citotoxico asociado con linfocito T (CTLA) (por ejemplo, CTLA-4); inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; Protema A o D; factores reumatoides; un factor neurotrofico tal como factor neurotrofico derivado del hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor del crecimiento del nervio, tal como NGF-p.; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento fibroblastico tal como aFGF y pFGF; factor de crecimiento epidermico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-p, que incluye TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4, o TGF- p5; factor de crecimiento de tipo insulina I y -II (IGF-I e IGF-Il); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebro), protemas de union al factor de crecimiento de tipo insulina (IGFBPs); protemas cD tales como CD3, CD4, CD8, CD19 CD20, CD34, y CD40; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una protema morfogenetica osea (BMP); un interferon tal como interferon-a, -p, y -y; factores estimulantes de colonia (CSFs), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; interleuquinas (ILs), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superoxido dismutasa; receptores de celulas T; protemas de membrana superficiales; factor acelerante del decaimiento; antfgeno viral tal como, por ejemplo, una porcion de la envoltura de SIDA; protemas de transporte; receptores de asentamiento; diriginas; protemas reguladoras; integrinas tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antfgeno asociado a tumor tal como el receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos y/o variantes de cualquiera de los polipeptidos anteriormente listados. Ademas, una protema o polipeptido de la invencion es un anticuerpo, fragmento o variante del mismo, que se une espedficamente a cualquiera del os polipeptidos anteriormente listados.
Los terminos "contaminante," "impureza," y "desecho," tal como se usan de forma intercambiable en la presente memoria, se refieren a cualquier molecula extrana o inaceptable, que incluye una macromolecula biologica tal como una ADN, un ARN, una o mas protemas celulares huesped (HCP), endotoxinas, lfpidos, y uno o mas aditivos que pueden estar presentes en una muestra que contiene la protema diana que se va a separar de una o mas de las moleculas extranas o inaceptables usando un proceso de la presente invencion. Adicionalmente, tal contaminante puede incluir un reactivo que se usa o se genera en una etapa que puede producirse antes del proceso de purificacion, tal como protema A lixiviada en los casos en los que se emplea una etapa de cromatograffa de afinidad de protema A.
Los terminos "protema celular de ovario de hamster chino" y "CHOP" se usan de forma intercambiable en la presente memoria para referirse a una mezcla de protemas celulares hospedantes ("HCP") derivadas de un cultivo celular de ovario de hamster chino ("CHO"). El HCP o CHOP esta presente generalmente presente como una impureza en un lisato o medio de cultivo celular (por ejemplo, un fluido de cultivo celular recolectado ("HCCF")) que comprende una protema de interes tal como un anticuerpo o inmunoadhesina expresada en una celula CHO). La cantidad de CHOP presente en una mezcla que comprende una protema de interes proporciona una media del grado de pureza para la protema de interes. HCP o CHOP incluye, pero no se limita a, una protema de interes expresada por la celula huesped, tal como la celula huesped cHo. Tfpicamente, la cantidad de CHOP en una
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mezcla proteica se expresa en partes por millon con relacion a la cantidad de la protema de interes en la mezcla. Se entiende que cuando la celula huesped es otro tipo de celula, por ejemplo, una celula de mairnfero aparte de CHO, una E. coli, una levadura, una celula de insecto o una celula vegetal, HCP se refiere a las protemas, distintas de la protema diana, encontradas en un lisado de la celula huesped.
El termino "partes por millon" o "ppm" se usan de forma intercambiable en la presente memoria para referirse a una medida de pureza de una protema diana purificadas mediante un metodo de la invencion. Las unidades ppm se refieren a la cantidad de HCP o CHOP en nanogramos/miligramos de protema de interes o en miligramos/mililitro (es dear, CHOP ppm=(CHOP ng/ml)/(protema de interes mg/ml), cuando las protemas estan en disolucion).
Los terminos "purificar," "separar," o "aislar," como se usan de forma intercambiable en la presente memoria, se refieren a aumentar el grado de pureza de una polipeptido o protema de interes de una protema diana de una composicion o muestra que comprende la protema de interes y una o mas impurezas. Tfpicamente, el grado de pureza de la protema de interes aumenta mediante eliminacion (completa o parcial) de al menos una impureza de la composicion. Una "etapa de purificacion" puede ser parte de un proceso global de purificacion que da como resultado una composicion o muestra "homogenea", que se usa en la presente memoria para referirse a un composicion o muestra que comprende menor que 100 ppm HCP en una composicion que comprende la protema de interes, alternativamente menor que 90 ppm, menor que 80 ppm, menor que 70 ppm, menor que 60 ppm, menor que 50 ppm, menor que 40 ppm, menor que 30 ppm, menor que 20 ppm, menor que 10 ppm, menor que 5 ppm, o menor que 3 ppm de HCP.
El termino "fase proteica," como se usa en la presente memoria, se refiere a la parte de una muestra donde la concentracion de la protema diana ha aumentado sustancialmente con relacion a la concentracion inicial de la protema diana en la muestra. El proceso de concentracion puede implicar la adsorcion de protema sobre un soporte solido poroso o no poroso; adsorcion de protema en una interfaz ffquido-aire o ffquido-gas; adsorcion de protema en la interfaz entre dos lfquidos inmiscibles o parcialmente miscibles; precipitacion de protema como un componente puro o como un resultado de formacion compleja con uno o mas moleculas o polfmeros diferentes; o usando cristalizacion de protemas.
El termino "fase lfquida" como se usa en la presente memoria, se refiere a esa parte de una muestra donde la concentracion de protema diana se ha reducido sustancialmente en comparacion con la concentracion inicial de protema en la muestra. La fase lfquida se puede crear en el mismo momento que la fase proteica definida anteriormente.
Los terminos "proceso de flujo pasante", "modo de flujo pasante" y "cromatograffa de flujo pasante", como se usan de forma intercambiable en la presente memoria, se refieren a una tecnica de separacion de producto en la se preve que al menos un producto en una muestra fluya a traves de una resina o un medio cromatografico, mientras que al menos un componente potencial se une a la resina o al medio cromatografico.
La muestra que se pretende hacer fluir a traves se refiere generalmente como la "fase movil." El "modo de flujo pasante" es generalmente una operacion isocratica (es dear, un proceso cromatografico durante el cual la composicion de la fase movil no cambia). El medio usado para el flujo pasante normalmente se pre-equilibra con la misma disolucion tampon que contiene la molecula de protema diana. Despues de la purificacion, el medio se puede sobrealimentar con una cantidad adicional del mismo tampon para aumentar la recuperacion de producto. En algunas realizaciones, la fase movil del "modo de flujo pasante" es una alimentacion de cultivo celular que contiene el producto de interes. En algunos casos, el pH o conductividad de la alimentacion se ajusta para maximizar la eliminacion de impurezas usando el proceso de flujo pasante.
En algunas realizaciones segun el metodo reivindicado y como se describe en los Ejemplos indicados en la presente memoria, los metodos emplean una etapa de intercambio anionico que se realiza en un modo de flujo pasante.
Los terminos "modo de elucion y union" y "proceso de elucion y union," como se usan de forma intercambiable en la presente memoria, se refieren a una tecnica de separacion de producto en la que al menos un producto contenido en una muestra se une a una resina o medio cromatografico y se eluye a continuacion.
El termino "cromatograffa" se refiere a cualquier clase de tecnica que separa un analito de interes (porejemplo, una protema que contiene una region Fc tal como una inmunoglobulina) de otras moleculas presentes en una mezcla donde el analito de interes se separa de otras moleculas como un resultado de diferencias en las velocidades a las que las moleculas individuales de la mezcla migran a traves de un medio estacionario bajo la influencia de una fase movil, o en procesos de elucion y union.
El termino "resina de cromatograffa" o "medio de cromatograffa" se usan de forma intercambiable en la presente memoria y se refieren a cualquier clase de fase solida porosa o no porosa que separa un analito de interes (por ejemplo, una protema que contiene una region Fc tal como una inmunoglobulina) de otras moleculas presenten en una mezcla. Normalmente, el analito de interes se separa de otras moleculas como un resultado de las diferencias de las velocidades a las que las moleculas individuales de la mezcla migran a traves de una fase solida estacionaria bajo la influencia de una fase movil, o en procesos de elucion y union. Ejemplos no limitantes incluyen resinas con modificaciones superficiales en modo mixto, cationico, anionico o HIC; membranas con modificaciones superficiales
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en modo mixto, cationico, anionico o HIC, fibras tejidas o no tejidas con modificaciones superficiales en modo mixto, cationico, anionico o HIC; y monolitos con modificaciones superficiales en modo mixto, cationico, anionico o HIC.
El termino "separacion por afinidad," o "purificacion por afinidad," como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier tecnica de purificacion o ensayo que implica la puesta en contacto de una muestra que contiene un analito diana (por ejemplo, una protema que contiene una region Fc tal como una inmunoglobulina) con un medio de afinidad (por ejemplo, un soporte solido que lleva sobre el un ligando de afinidad que se sabe que se une al analito como, por ejemplo, Protema A o una variante del mismo) que se sabe que se une al analito diana.
Los terminos "cromatograffa de afinidad" y " cromatograffa de afinidad de protemas", como se usan de forma intercambiable en la presente memoria, se refieren a una tecnica se separacion de protemas en la que una protema diana (por ejemplo, una protema que contiene una region Fc de interes o un anticuerpo) se une espedficamente a un ligando que es espedfico para la protema diana. En algunas realizaciones, tal ligando es Protema A o Protema G o una variante funcional de las mismas, que se une de forma covalente a un material cromatografico de fase solida y es accesible a la protema diana en disolucion mientras la disolucion se pone en contacto con el material cromatografico de fase solida. La protema diana generalmente retiene su afinidad de union espedfica por el ligando durante las etapas cromatograficas, mientras que otros solutos y/o protemas en la mezcla no se unen apreciablemente o espedficamente al ligando. La union de la protema diana al ligando inmovilizado permite que las protemas contaminantes o las impurezas de las protemas pasen a traves del medio cromatografico mientras que la protema diana permanece unida espedficamente al ligando inmovilizado sobre el material de fase solida. La protema diana espedficamente unida se elimina entonces en forma activa del ligando inmovilizado en condiciones adecuadas (por ejemplo, pH bajo, pH elevado, sal elevada, ligando competente, etc.), y se hace pasar a traves de la columna cromatografica con el tampon de elucion, libre de la protemas contaminantes o impurezas de protema a las que anteriormente se les permitio pasar a traves de la columna. Cualquier componente se puede usar como un ligando para purificar sus protemas de union espedficas respectivas, por ejemplo anticuerpo. Sin embargo, en diversos metodos segun la presente invencion, la Protema A se usa como un ligando para protema o anticuerpo que contienen una region Fc. Las condiciones de elucion del ligando (por ejemplo, Protema A) de la protema diana (por ejemplo, una protema que contiene una region Fc) pueden ser facilmente determinadas por un experto en la materia. En algunas realizaciones, se puede usar como ligando la Protema G o una variante funcional. En algunas realizaciones, se usa un ligando tal como la Protema A a un intervalo de pH de 5-9 para unirse a una protema que contiene una region Fc, lavar o re-equilibrar el conjugado ligando/ protema diana, seguido de elucion con un tampon que tiene pH de alrededor de o por debajo de 4.
Aunque la cromatograffa de afinidad es espedfica para unir la protema de interes, la cromatograffa de afinidad que emplea el uso de ligandos tales como la Protema A y la Protema G tiende a ser muy caro y el ensuciamiento rapido de las columnas de cromatograffa con materiales no espedficos (por ejemplo, una o mas impurezas) plantea un gran problema en la industria. Los metodos segun la presente invencion proporcionan una solucion a este problema mediante el uso de materiales (por ejemplo, carbon activado) que reducen la carga de las columnas de cromatograffa eliminando uno o mas de tales materiales no espedficos de la muestra, disminuyendo de ese modo el coste global, asf como aumentado la vida de las columnas. Ademas, algunos de los metodos segun la invencion reivindicada dan como resultado el uso de menos etapas de cromatograffa despues de la etapa de cromatograffa de afinidad, aumentado asf la eficacia del proceso global.
En una purificacion de multiples etapas de protemas producidas de forma recombinante, normalmente es beneficioso aislar la protema diana de un surtido diverso de impurezas solubles presentes en el fluido de cultivo celular tempranamente en el proceso. Este aislamiento se puede conseguir bien mediante captura cromatografica o mediante aislamiento no cromatografico de la protema diana.
Una etapa cromatografica de "captura", como se usa en la presente memoria, consiste en unir la protema diana a un medio de cromatograffa posicionado justo aguas abajo de la materia prima recolectada producida bien mediante fermentacion bacteriana o mediante expresion del cultivo celular. Tfpicamente, la materia prima recolectada se clarifica, sin embargo la captura puede realizarse tambien a partir de material prima sin clarificar. La funcion primaria de esta etapa es unir la protema diana desde la disolucion usando la menor cantidad de resina posible, permitiendo a las impurezas fluir a traves. La protema diana se eluye a continuacion en un volumen significativamente menor de tampon para el procesado adicional aguas abajo. Se selecciona el medio cromatografico que tiene la mejor combinacion de capacidad de union dinamica, recuperacion de masa y retencion de la actividad biologica de la diana. Para los anticuerpos que contienen una region de union a Fc, es habitual el uso de un medio cromatografico de afinidad, tal como los basados en la Protema A o Protema G.
Los medios cromatograficos usados para la captura se eligen del grupo que comprende resina porosa, membrana, monolito, materiales porosos tejidos o no tejidos.
El aislamiento no cromatografico de la protema diana se puede realizar mediante una o mas de las etapas siguientes: adsorcion de protema sobre un soporte solido poroso o no poroso; adsorcion de protema en una interfaz ffquido-aire o ffquido-gas; adsorcion de protema en la interfaz entre dos ffquidos inmiscibles o parcialmente miscibles; precipitacion de protema como un componente puro o como un resultado de formacion compleja con uno o mas moleculas o poffmeros diferentes; o usando cristalizacion de protemas.
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El termino "intercambio ionico" y "cromatograffa de intercambio ionico" se refieren al proceso cromatografico en el que un soluto o analito de interes (por ejemplo, una protema diana que contiene una region Fc) en una mezcla interactua con un compuesto cargado unido mediante, por ejemplo, union covalente, a un material de intercambio ionico de fase solida tal que el soluto o el analito de interes interactua de forma no espedfica con el compuesto cargado mas o menos que las impurezas o contaminantes solubles en la mezcla. Los solutos contaminantes en la mezcla se eluyen desde una columna del material de intercambio ionico mas rapido o mas espacio que el soluto de interes o estan unido a o excluidos de la resina con relacion al soluto de interes. "Cromatograffa de intercambio ionico" incluye espedficamente cromatograffa de intercambio cationico, de intercambio anionico, y de intercambio ionico de modo mixto. Por ejemplo, la cromatograffa de intercambio cationico puede unir la molecula diana (por ejemplo, una protema diana que contiene una region Fc) seguido de elucion (cromatograffa de union y elucion de intercambio cationico o "CIEX") o puede predominantemente unir las impurezas mientras la molecula diana "fluye a traves" de la columna (cromatograffa de flujo pasante de intercambio cationico FT-CIEX). La cromatograffa de intercambio anionico puede unir la molecula diana (por ejemplo, una protema diana que contiene una region Fc) seguido de elucion o puede predominantemente unir las impurezas mientras la molecula diana "fluye a traves" de la columna. En algunas realizaciones y como se muestra en los Ejemplos de la presente memoria, la etapa cromatografica de intercambio anionico se realiza en un modo de flujo pasante. En una realizacion particular, la etapa cromatografica de intercambio anionico emplea el uso de un medio de sorcion poroso que comprende un sustrato poroso y un revestimiento poroso sobre el sustrato, donde el revestimiento comprende uno o mas copoffmeros o aminas primarias polimericas del mismo.
El termino "cromatograffa de modo mixto" o " cromatograffa multi-modal" como se usa en la presente memoria, se refiere a un proceso que emplea una fase cromatografica estacionaria que lleva al menos dos tipos distintos de grupos funcionales, cada uno capaz de interactuar con una molecula de interes. Un ejemplo de modo cromatografico de modo mixto es Capto™ Adhere (GE Healthcare), que es una resina de modo mixto AEX. La cromatograffa de modo mixto emplea generalmente un ligando con mas de un modo de interaccion con impurezas y/o una protema diana. El ligando incluye ffpicamente ffpicamente al menos dos sitios diferentes pero cooperativos que interactuan con la sustancia que se va a unir. Por ejemplo, uno de estos sitios puede tener una interaccion de tipo carga-carga con la sustancia de interes, mientras que el otro sitio puede tener una interaccion de tipo aceptor-donante y/o interacciones hidrofobicas y/o hidrofflicas con la sustancia de interes. Los tipos de interaccion electronica aceptor- donante incluyen enlace de hidrogeno, n-n, cation-n, transferencia de carga, dipolo-dipolo e interacciones de dipolo inducidas. Generalmente, en base a las diferencias de la suma de interacciones, se pueden separar una protema diana y una o mas impurezas en un intervalo de condiciones.
El termino "cromatograffa de interaccion hidrofobica" o "HIC," como se usa en la presente memoria, se refiere a un proceso para separar moleculas basado en su hidrofobicidad, es dear, su capacidad de adsorber superficies hidrofobicas de disoluciones acuosas. HIC se diferencia normalmente de la cromatograffa de Fase Inversa (RP) por resinas HIC especialmente disenadas que tienen ffpicamente una hidrofobicidad o densidad menor de los ligandos hidrofobicos en comparacion a las resinas RP.
La cromatograffa HIC ffpicamente depende de las diferencias de grupos hidrofobicos sobre la superficie de las moleculas de soluto. Estos grupos hidrofobicos tienden a unirse a los grupos hidrofobicos sobre la superficie de una matriz insoluble. Debido a que HIC emplea un ambiente mas polar, menos desnaturalizante que la cromatograffa de fase inversa esta siendo mas popular para la purificacion de protemas, a menudo en combinacion con cromatograffa de intercambio ionico o de filtracion de gel.
Los terminos "resina de intercambio ionico," "medio de intercambio ionico" y "material de intercambio ionico" se refieren a una fase solida que esta cargada negativamente (es dear, una resina de intercambio cationico) o cargada positivamente (es dear, una resina de intercambio anionico). La carga puede proporcionarse adjuntando uno o mas ligandos cargados a la fase solida, por ejemplo mediante union covalente o revestimiento no covalente o adsorcion. Alternativamente, o en adicion, la carga puede ser una propiedad inherente de la fase solida.
Los terminos "CEX," "medio de intercambio cationico," "resina de intercambio cationico" y "material de intercambio cationico," como se usa en la presente memoria, ser refieren a una fase solida que esta cargada negativamente, y que asf tiene cationes libres para intercambio con cationes en una disolucion acuosa que pasa sobre o a traves de la fase solida. Un ligando cargado negativamente unido a la fase solida para formar la resina de intercambio cationico puede, por ejemplo, ser un carboxilato o sulfonato. Las resinas de intercambio cationico comercialmente disponibles incluyen carboxi-metilcelulosa, sulfopropilo (SP) inmovilizado sobre agarosa (por ejemplo, SP-SEPHAROSE FAST FLOW™ o SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™, de Pharmacia) y sulfonilo inmovilizado sobre agarosa (por ejemplo S-SEPHAROSE FAST FLOW™ de Pharmacia).
Los terminos "medio de modo mixto", "resina de modo mixto" y "resina de intercambio ionico de modo mixto," como se usa en la presente memoria, se refieren a una fase solida que esta modificada de forma covalente con restos cationicos, anionicos e hidrofobicos. Una resina de intercambio ionico de modo mixto comercialmente disponible es BAKERBOND ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) que contiene grupos de intercambio cationico debiles, una concentracion baja de grupos de intercambio anionico y ligandos hidrofobicos unidos a una matriz de soporte de fase solida de gel de sflice.
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El termino "medio HIC" o "resina HIC" o "material HIC," como se usa en la presente memoria, se refiere a material cromatografico usado para la separacion HIC. El medio HIC se deriva normalmente de resina porosa cromatografica modificada con ligandos hidrofobicos tales como grupos aromaticos o alifaticos cortos. Ejemplos de medios HIC incluyen Butyl Sepharose y Phenyl Sepharose FF, ambos comercialmente disponibles en GE Healthcare. Ejemplos adicionales de resinas HIC comercialmente disponibles incluyen Fractogel® Phenyl y Fractogel® Propyl (MERCK KGA, Darmstadt, Alemania), Butyl Sepharose® y Phenyl Sepharose® (GE HEALTHCARE).
Los terminos "AEX," "medios de intercambio anionico," "una resina de intercambio anionico" y "material de intercambio anionico," como se usan en la presente memoria, se refieren a una fase solida que esta cargada positivamente, por ejemplo que tiene uno o mas ligandos cargados positivamente, tales como grupos amino primarios, secundarios, terciarios o cuaternarios, unidos a ellos. Una resina de intercambio anionico comercialmente disponible incluye DEAE cellulose, QAE SEPHADEX™ y FAST Q SEPHAROSE™ (PHARMACIA).
Los terminos "Protema A" y "ProA" se usan de forma intercambiable en la presente memoria y abarcan la Protema A recuperada de una fuente nativa de la misma, la Protema A producida sinteticamente (por ejemplo, mediante smtesis peptfdica o mediante tecnicas recombinantes), y variantes de las mismas que retienen la capacidad de unirse a protemas que tienen una region CH2/CH3, tal como una region Fc. La Protema A se puede adquirir comercialmente de Repligen, GE Healthcare y Lonza. La Protema A se inmoviliza generalmente sobre un material de soporte de fase solida. El termino "ProA" tambien se refiere a una columna o resina de cromatograffa de afinidad que contiene una matriz de soporte cromatografico solido al que esta unido de forma covalente la Protema A.
Un derivado funcional, fragmento o variante de la Protema A usado en los metodos segun la presente invencion, se puede caracterizar por una constante de union de al menos K=10-8 M, y preferiblemente K=10-9 M, para la region Fc del raton IgG2a o IgG1 humana. Una interaccion que cumple con ese valor para la constante de union se denomina "union de elevada afinidad" en el presente contexto. Preferiblemente, tal derivado funcional o variante de la Protema A comprende al menos parte de un dominio de union a IgG funcional de la Protema A de tipo salvaje, seleccionado de los dominios naturales E, D, A, B, C o mutantes obtenidos por ingeniena genetica de los mismos que tienen funcionalidad de union a IgG retenida.
Una "Protema A contaminante" segun la presente invencion es cualquier tipo de progenie de union a IgG, funcional, de una Protema A o un derivado funcional de la misma como se define anteriormente, que se obtiene despues de eluir el anticuerpo unido de una columna cromatografica de afinidad de Protema A. Tal especie de Protema A contaminante puede ser el resultado por ejemplo de la hidrolisis de enlaces peptfdicos, lo que es muy probable que ocurra mediante la accion enzimatica, en particular en la fabricacion industrial. La cromatograffa de Protema A se aplica como una etapa temprana en el procesado corriente abajo cuando la disolucion de producto recien preparado, purificada en bruto, todavfa conserva una actividad proteasa considerable. Las celulas que mueren en el caldo de cultivo celular o las celulas afectadas en la centrifugacion inicial o las etapas de filtracion es probable que tengan proteasas libres; con proposito regulatorio, normalmente no se consigue la suplementacion del caldo de cultivo celular con inhibidores de proteasa antes o en durante el procesado corriente abajo, en contraste con la practica de la investigacion bioqmmica. Ejemplos son cloruro de fenilmetil-sulfonilo (PMSF) o acido e-caproico. Tales agentes qmmicos son indeseables como aditivos en la produccion de agentes biofarmaceuticos. Tambien es posible que los derivados funcionales recombinantes o fragmentos de Protema A sean menos resistentes a la proteasa que la Protema A de tipo salvaje, dependiendo de la estructura terciaria del pliegue de la protema. Los segmentos de aminoacidos que se unen a dominios de IgG individuales se pueden exponer una vez que el numero total de dominios de union se ha reducido. Los contactos entre dominios pueden contribuir posiblemente a la estabilidad del plegamiento del dominio. Tambien puede ser que la union del anticuerpo por la Protema A o dichos derivados funcionales de la misma ejerza influencia o facilite la susceptibilidad a la accion de la proteasa, debido a cambios conformacionales inducidos en la union del anticuerpo.
La "union" de una molecula a una resina cromatografica significa exponer la molecula a la resina cromatografica en condiciones apropiadas (pH/conductividad) de forma tal que la molecula se inmoviliza de forma reversible en o sobre la resina cromatografica en virtud de interacciones ligando - protema. Los ejemplos no limitantes incluyen interacciones ionicas entre las molecula y un grupo cargado o grupos cargados del material de intercambio ionico y una interaccion bioespedfica entre la Protema A y una inmunoglobulina.
El termino "tampon de lavado" o "tampon de equilibrado" se usa de forma intercambiable en la presente memoria, se refiere a un tampon usado para lavar o reequilibrar la resina cromatografica antes de eluir la molecula de polipeptido de interes. En algunos casos, el tampon de lavado y el tampon de carga pueden ser el mismo. "Lavar" un medio cromatografico quiere decir incluir hacer pasar un tampon apropiado a traves o sobre el medio.
Un "tampon de elucion" se usa para eluir la protema diana de la fase solida. La conductividad y/o pH del tampon es/son normalmente tal/tales que la protema diana se eluye de la resina cromatografica.
"Eluir" una molecula (por ejemplo, u polipeptido de interes o una impureza) de la reina cromatografica significa eliminar la molecula de allf alterando las condiciones de disolucion de forma tal que el tampon compite con la molecula de interes para unirse a la resina cromatografica. Un ejemplo no limitante es eluir una molecula de una resina de intercambio ionico alterando la fuerza ionica del tampon que rodea el material de intercambio ionico de
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forma tal que el tampon compite con la molecula por los sitios cargados sobre el material de intercambio ionico.
El termino "eluato", como se usa en la presente memoria, se refiere a una disolucion que contiene una molecula de interes obtenida v^a elucion, asf como a la fraccion de flujo pasante que contiene la protema diana de interes obtenida como resultado de la purificacion de flujo pasante. En algunas realizaciones, el termino "eluato" se refiere al conjunto de fracciones de elucion de una etapa de cromatograffa de unir y eluir (por ejemplo, una etapa de cromatograffa de afinidad de Protema A). En algunas realizaciones, el eluato de una etapa de cromatograffa de afinidad de Protema A fluye en un proceso de purificacion de flujo pasante que emplea carbon activado, con o sin una etapa intermedia de inactivacion de virus.
El termino "fase solida" o "sustrato poroso" o "matriz base" se refiere a un material no acuoso al que se puede adherir uno o mas ligandos cargados. La fase solida puede ser una columna de purificacion, una fase discontinua de parffculas discretas que es porosa o no porosa, una membrana, unas fibras tejidas o no tejidas, un monolito o un filtro. Ejemplos de materiales para formar la fase solida incluyen polisacaridos (tales como agarosa y celulosa); y otras matrices mecanicamente estables tales como sflice (por ejemplo vidrio de poro controlado), poli(estirenodivinil)benceno, poliacrilamida, eter polivimlico, nylon, polietileno de alto peso molecular (HDPE), polietersulfona, ceramicos y derivados de cualquiera de los anteriores.
Un "tampon" es una disolucion que resiste cambios de pH por la accion de sus componentes conjugados acido- base. Se describen diversos tampones que se pueden emplear dependiendo, por ejemplo, del pH deseado del tampon en Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975). En algunas etapas del os metodos dela invencion reivindicada, un tampon tiene un pH en el intervalo de 2,0 a 4,0, o de 2,8 a 3,8. En otras etapas de la invencion reivindicada, un tampon tiene un pH en el intervalo de 5,0 a 9,0. En otras etapas de la invencion reivindicada, un tampon tiene un pH en el intervalo de 4,0 a 6,5. Aun en otras etapas de los metodos de la invencion reivindicada, un tampon tiene un pH menor que 4,0. Ejemplos no limitantes de tampones que controlaran el pH es este intervalo incluyen tampones MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, fosfato, acetato, citrato, succinato y amonio, asf como combinaciones de estos.
El termino "conductividad" se refiere a la capacidad de una disolucion acuosa de conducir una corriente electrica entre dos electrodos. En disolucion, la corriente fluye por transporte ionico. Por lo tanto, con una cantidad en aumento de iones presente en la disolucion acuosa, la disolucion tendra una mayor conductividad. La unidad de medida de conductividad es milliSiemens por cenffmetro (mS/cm o mS), y se puede medir usando un conductivimetro comercialmente disponible (por ejemplo, comercializado por Orion). La conductividad de una disolucion se puede alterar cambiando la concentracion de iones en ella. Por ejemplo, la concentracion de un agente tamponante y/o la concentracion de una sal (por ejemplo NaCl o KCl) en la disolucion se puede alterar para alcanzar la conductividad deseada. Preferiblemente, la concentracion de la sal de los diversos tampones se modifica para conseguir la conductividad deseada como en los Ejemplos a continuacion.
El "pI" o "punto isoelectrico" de un polipeptido se refiere al pH al que la carga positiva del polipeptido equilibra su carga negativa. pi se puede calcular a partir de la carga neta del resto de aminoacido o resto de acido sialico de los carbohidratos unidos del polipeptido o se puede determinar mediante focalizacion isoelectrica.
Tal como se usa en la presente memoria, el termino "filtrado" se refiere a esa parte de una muestra que pasa a traves de un medio.
Tal como se usa en la presente memoria "retenido" se refiere a esa parte de una muestra que esta sustancialmente retenida por el medio
El termino "clarificacion" como se usa en la presente memoria, se refiere a un proceso para reducir la turbidez, medida en NTU, de una disolucion que contiene protema, por eliminacion de las parffculas suspendidas. La clarificacion se puede conseguir por una variedad de medios, que incluyen centrifugado continuo y discontinuo, filtracion profunda, filtracion de flujo normal y tangencial, y precipitacion , que incluye floculacion con especies polimericas y moleculas pequenas, o cualquiera de las combinaciones de los metodos anteriores.
La frase "reduciendo la carga de la columna cromatografica" se refiere a un tratamiento o procesado de una muestra que contiene protema, cuyo tratamiento o procesado da como resultado una disminucion del ensuciado de una columna de cromatograffa sobre la que la muestra proteica se carga a continuacion. En un experimento cromatografico ffpico, no debeffa haber sustancias no eluyentes o impurezas abandonadas en la fase estacionaria, dando como resultado por lo tanto en el ensuciado de una columna de cromatograffa. Este problema ademas se intensifica durante el escalado, donde el grado de ensuciado de la columna es mayor debido al mayor nivel de impurezas presente. El ensuciado de las columnas tambien da como resultado una disminucion significativa de la duracion de las columnas, que son normalmente muy caras. Los metodos segun la presente invencion proporcionan metodos mejorados para reducir significativamente la carga de las columnas cromatograficas, aumentando asf la duracion de las columnas, asf como dando como resultado un mayor rendimiento de protema. Los metodos segun la presente invencion dan como resultado una eliminacion de cantidades significativas de impurezas antes de cargar la muestra en una columna de cromatograffa, reduciendo la carga de la columna. Las impurezas ffpicas incluyen protema de celula huesped, ADN, acido graso (de restos de celulas), moleculas colorantes, agentes
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desespumantes, etc.
El termino "etapa del proceso" u "operacion unitaria," como se usan de forma intercambiable en la presente memoria, se refiere al uso de uno o mas metodos o dispositivos para conseguir un cierto resultado en un proceso de purificacion. Ejemplos de etapas de proceso u operaciones unitarias que se pueden emplear en los procesos y sistemas escritos en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, clarificacion, captura cromatografica de unir y eluir, inactivacion de virus, purificacion con flujo pasante y formulacion. Se entiende que cada una de las etapas del proceso u operaciones unitarias puede emplear mas de una etapa o metodo o dispositivo para conseguir el resultado pretendido de esa etapa del proceso u operacion unitaria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la etapa de purificacion de flujo pasante, como se describe en la presente memoria, puede emplear mas de una etapa o metodo o dispositivo para lograr esa la etapa del proceso u operacion unitaria, donde al menos tal etapa implica carbon activado. En algunas realizaciones, uno o mas dispositivos que se usan para realizar una etapa del proceso u operacion unitaria son de un solo uso o desechables y se pueden retirar y/o reemplazar sin tener que reemplazar otros dispositivos en el proceso o incluso teniendo que parar la marcha de un proceso.
Como se usa en la presente memoria, el termino "tanque de conjunto de fracciones" se refiere a cualquier contenedor, vasija, deposito, tanque o bolsa que se usa generalmente entre las etapas del proceso y tiene un tamano/volumen para permitir la recogida del volumen completo de salida de una etapa del proceso. Los tanques de conjunto de fracciones se pueden usar para contener o almacenar o manipular preparaciones de disoluciones del volumen completo de salida de una etapa del proceso. En algunas realizaciones, los procesos descritos en la presente memoria obvian la necesidad de usar uno o mas tanques de conjunto de fracciones.
El termino "tanque compensador" como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier contenedor o vasija o bolsa que se usa entre las etapas del proceso o en una etapa del proceso (por ejemplo, cuando una unica etapa del proceso comprende mas de una etapa); donde la salida de una etapa fluye a traves del tanque de compensacion hacia la siguiente etapa. De acuerdo con esto, un tanque de compensacion es diferente de un tanque de conjunto de fracciones, en que no tiene por objeto contener o almacenar el volumen completo de salida de una etapa; sino que permite el flujo pasante de salida de una etapa a la siguiente. En algunas realizaciones, el volumen de un tanque de compensacion usado entre dos etapas del proceso o en una etapa del proceso en un proceso o sistema descrito en la presente memoria, no es mas del 25% del volumen completo de salida de la etapa del proceso. En otra realizacion, el volumen de un tanque de compensacion no es mas del 10% del volumen completo de la salida de una etapa del proceso. En algunas otras realizaciones, el volumen de un tanque de compensacion es menor que 35%, o menor que 30%, o menor que 25%, o menor que 20%, o menor que 15%, o menor que 10% del volumen completo de un cultivo celular en un biorreactor, que constituye el material de partida a partir del cual se va a purificar una molecula diana. En algunas realizaciones, se emplea un tanque de compensacion durante una etapa del proceso de purificacion de flujo pasante que usa carbon activado seguida de cromatograffa AEX, seguida de cromatograffa CEX, seguida de filtracion de virus, donde el tanque de compensacion se usa para realizar el cambio de disolucion despues de la etapa de cromatograffa AEX.
El termino "proceso continuo," como se usa en la presente memoria, se refiere a un proceso para purificar una molecula diana, que incluye dos o mas etapas del proceso (u operaciones unitarias), de forma que la salida de una etapa del proceso fluye directamente hacia la etapa del proceso siguiente en el proceso, sin interrupcion, y donde dos o mas etapas del proceso se pueden realizar concurrentemente durante al menos na parte de su duracion. En otras palabras, un proceso continuo obvia la necesidad de completar una etapa del proceso antes de realizar la etapa del proceso siguiente en el proceso de purificacion. El termino "proceso continuo" tambien se aplica a las etapas dentro de una etapa del proceso, en cuyo caso, durante la realizacion de una etapa del proceso que incluye etapas multiples, la muestra fluye de forma continua a traves de diversas etapas que son necesarias para realizar la etapa del proceso. De acuerdo con esto, en algunas realizaciones, una etapa de purificacion de flujo pasante que emplea carbon activado se realiza de manera continua, donde el aluato de una etapa de cromatograffa de unir y eluir (por ejemplo, etapa de captura cromatografica de Protema A)), que precede la etapa de purificacion de flujo pasante, fluye hacia una etapa de carbon activado (rellenado en medio celulosico) seguido de una etapa de cromatograffa AEX, seguida de una etapa de cromatograffa CEX y seguida de una etapa de filtracion de virus
El termino "mezclador estatico" se refiere a un dispositivo para mezclar dos materiales fluidos ffpicamente ffquidos. El dispositivo consiste generalmente de elementos del mezclador (tambien referidos como elementos no moviles) contenidos en un alojamiento ciffndrico (tubo). Mientras las corrientes se mueven a traves del mezclador estatico, los elementos no moviles mezclan de forma continua los materiales. La mezcla completa depende de muchas variables que incluyen las propiedades de los fluidos, diametro interno del tubo, numero de elementos del mezclador y su diseno etc. En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, uno o mas mezcladores estaticos se usan en los procesos descritos en la presente memoria, por ejemplo, entre una etapa de cromatograffa AEX y una etapa de cromatograffa CEX.
Esta invencion se ilustra ademas mediante los ejemplos siguientes, que no debenan interpretarse como limitantes.
II. Mariales carbonosos ejemplares para Uso en los Metodos Reivindicados
En los metodos segun la presente invencion, algunos materiales carbonosos tales como carbon activado, se usan en
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la purificacion de protemas. El carbon activado se puede describir como un solido poroso con un area superficial muy elevada. En algunas realizaciones, el carbon activado comprende carbon vegetal activado. El carbon activado puede derivarse de una variedad de fuentes que incluyen, pero no se limitan a, carbon, madera, cascara de coco, cascara de nuez y turba. El carbon activado se puede producir a partir de estos materiales mediante activacion ffsica que implica calentar en una atmosfera controlada o mediante activacion qrnmica que utiliza acidos fuertes, bases, u oxidantes. Los procesos de activacion producen una estructura porosa con un area superficial elevada que proporciona al carbon activado una capacidad mayor para la eliminacion de impurezas. Los procesos de activacion se pueden modificar para controlar la acidez de la superficie.
El carbon activado esta disponible en una amplia variedad de fuentes comerciales y viene en una cantidad de calidades y formatos. Algunos de los proveedores comerciales de carbon activado incluyen companfas como MeadWestVaco Corp., Richmond, VA, Ee.UU; Norit Americas Inc., Marshall, TX, EE.UU.; Calgon Carbon Corp., Pittsburgh, PA, EE.UU..
Dos de los principales formatos de carbon activado son el polvo y granular. El carbon activado en polvo contiene partmulas pequenas y normalmente menores que 1 mm de diametro, y se usa lo mas comun para la purificacion de ifquidos. El carbon activado granular tiene un tamano de partmula mayor y por consiguiente un area superficial menor, asf que se prefiere para uso en la purificacion de gas donde la velocidad de difusion es mayor.
Una consideracion importante para la seguridad con el uso de carbon activado es aplicaciones de consumo (tales como la purificacion de agua, alimentos, bebidas y de productos farmaceuticos) es la reduccion y control de compuestos extrafbles. El carbon activado previsto para aplicaciones de agua potable y contacto alimentario se obtiene normalmente de acuerdo con la norma de seguridad ANSI/NSF Standard 61 que cubre todos los aditivos indirectos del agua. Tambien, el metodo de ensayo D6385 de la norma ASTM describe la determinacion del contenido extrafble de acido en el carbon activado mediante cenizas y se podna usar para estudiar y minimizar el nivel de extrafbles del carbon activado.
Esta disponible un intervalo de tipos de carbon activado para diversas aplicaciones. Por ejemplo, MeadWestVaco Corp. suministra al menos doce tipos de carbon activado en polvo que pueden varias por su capacidad, acidez superficial, accesibilidad de los poros a moleculas diana y aplicacion pretendida. Generalmente es deseable maximizar la capacidad del carbon activado de eliminar impurezas.
En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, el carbon activado se incorpora en un medio celulosico.
III. Procesos de Purificacion de Flujo Continuo Convencionales
La mayona de los procesos de purificacion de flujo pasante convencionales se basan claramente en diferentes interacciones superficiales entre la protema diana de interes y la impureza que se va a eliminar. Por ejemplo, la purificacion convencional de flujo pasante AEX de anticuerpos monoclonales se basa en el hecho de que el punto isoelectrico de la mayona de los anticuerpos es mayor que otras protemas y acidos nucleicos y esta normalmente por encima de 7.Por lo tanto, los procesos AEX de purificacion de flujo pasante se llevan a cabo a un pH que es menor que el pi del anticuerpo que se va a purificar con el fin de asegurarse de que la fase estacionaria y el anticuerpo tienen la misma carga y por lo tanto el anticuerpo fluye a traves del medio sin unirse de forma significativa a la superficie. Por otro lado, muchas impurezas proteicas, acidos nucleicos, y endotoxinas tienen un pi mas bajo que un anticuerpo, que es por lo general por debajo de 7, y en consecuencia, se unen a la superficie de un medio de AEX
Como la mayona de los procesos de cromatograffa de intercambio ionico, la purificacion de flujo pasante AEX es generalmente sensible a la conductividad de la disolucion y es generalmente menos eficaz a mayor salinidad. En un tfpico proceso de purificacion de un anticuerpo monoclonal, la purificacion de flujo pasante AEX, a veces referida como la "etapa de pulido," sigue una o mas etapas de cromatograffa en columna de unir y eluir.
A continuacion se muestran dos modelos de procesos comunmente mas utilizados:
1) captura de Protema A ^ purificacion y concentracion de unir y eluir CEX ^ Dilucion ^ flujo pasante AEX
2) captura de Protema A ^ flujo pasante AEX ^ purificacion y concentracion de unir y eluir CEX
Ademas de estos modelos de proceso empleados comunmente, a veces se emplean otros esquemas de purificacion, incluyendo la captura de CEX y el uso de resinas inorganicas de unir y eluir de modo mixto (tales como Hidroxiapatita Ceramica, CHT)En general, el objetivo de la purificacion de flujo pasante es eliminar niveles de trazas de impurezas, mientras que la mayor parte de la purificacion se realiza usando etapas de unir y eluir. Sin embargo, un cambio del uso principalmente de etapas de unir y eluir a un proceso de purificacion de flujo pasante puede ser una solucion muy rentable que ahorra tiempo, reactivos, asf como costes operativos. Por consiguiente, los procesos descritos en la presente memoria proporcionan una solucion viable a los procesos convencionales en que son mas rentables y reducen la fabricacion global y los costes operativos.
En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, se proporcionan procesos de purificacion de flujo
pasantes mejorados, que permiten que la purificacion de flujo pasante se realice de una manera continua.
IV. Uso de Material Carbonoso en Procesos de Purificacion
Como se ha discutido anteriormente, la presente invencion proporciona procedimientos de purificacion de nuevos y mejorados que emplean carbon activado. El carbon activado puede ser anadido directamente a una etapa de 5 purificacion y, posteriormente, se puede eliminar por sedimentacion o filtracion, o haciendo pasar una disolucion o gas a traves de un dispositivo que contiene carbon activado. El carbon activado o bien puede ser rellenado independientemente en un dispositivo adecuado o se puede mezclar con otros materiales que mejoren sus propiedades mecanicas, flujo, o separacion. Por ejemplo, el carbon activado puede incorporarse en un medio fibroso que contiene celulosa dejado en humedo, y luego sellado dentro de un dispositivo desechable tal como Millistak + ® 10 Pod CR disponible de Millipore Corporation, o Seitz® AKS Filter Media disponible de Pall Corporation, Port Washington, NY, EE.UU.. Otro formato de carbon activado es un bloque de carbon activado, donde el carbon activado se incorpora en un monolito poroso presionando junto con polvo termoplastico. La forma granular del carbon activado tambien se puede rellenar en columnas, similar al medio cromatografico, o puede rellenarse en un dispositivo adecuado. En general se acepta que activa el medio de carbon activado se utiliza para la decoloracion, la 15 eliminacion de pequenas impurezas de moleculas, etc. Por ejemplo, hay varias calidades de medios de carbon activado disponibles de Pall Corporation, que pueden ser seleccionados en base al peso molecular de impurezas diana. Estan disponibles tres intervalos de pesos moleculares: 200-400, 400-1,000, y 400-1,500 Dalton, siendo el ultimo el mas grande. Sin embargo, ninguno de los medios de carbon activado comercialmente disponibles se han descrito para la eliminacion selectiva de impurezas mucho mas grandes de muestras biologicas, que van desde 20 2.000 a 200.000 Dalton de peso molecular.
La presente invencion se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que el carbon activado es capaz de unirse selectivamente a impurezas indeseables (por ejemplo, HCP y ADN), mientras que al mismo tiempo muestra una union insignificante a una protema diana.
Esta invencion tambien se reconoce el hecho de que, similar a todo el material de adsorcion, la capacidad de 25 adsorcion del carbon activado no es ilimitada. Por ejemplo, en el caso de alimentacion CHO-S, el carbon activado ha mostrado que elimina eficazmente tanto HCP y aDn cuando estas especies estaban presentes a concentraciones que se observaron en alimentaciones representativas como se muestra en el Ejemplo 1.Sin embargo, la adicion de ADN a un nivel inusualmente alto se encontro que supriirna la eficacia de eliminacion de HCP del carbon activado como se muestra en el Ejemplo 2.
30 El carbon activado tambien puede ser altamente beneficioso en la eliminacion de los componentes potenciales de medios de cultivo celular que pueden estar presentes en la disolucion de la protema diana, tanto antes como despues de la etapa de captura de la protema diana. Los componentes tfpicos de medios de cultivo celular incluyen tensioactivos (por ejemplo, Pluronic® F68), insulina, antibioticos, metotrexato, y antiespumante. Debido a un riesgo de que algunos de estos componentes sean trasladados a una protema diana purificada, es ventajoso incorporar 35 una etapa en un tren de purificacion de protemas que sea capaz de eliminar estos componentes. El carbon activado se puede usar en un proceso de purificacion para eliminar tales componentes, como ademas es evidenciado por los Ejemplos de la presente memoria.
Los siguientes son ejemplos de procesos de purificacion de protemas que incorporan carbon activado como una o mas etapas intermedias, que se muestra mediante subrayado en la siguiente Tabla I siguiente. Se entiende que 40 pueden ser utilizadas muchas variaciones de estos procesos.
TABLAI
Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 Etapa 4 Etapa 5
Proceso A
Proporciona Fluido de Cultivo Celular Clarificado Carbon activado flujo pasante unir y eluir con medio de Afinidad unir y eluir con medio CEX Medio AEX flujo pasante
Proceso B
Proporciona Fluido de Cultivo Celular Clarificado unir y eluir con medio de Afinidad Carbon activado flujo pasante unir y eluir con medio CEX Medio AEX flujo pasante
Proceso C
Proporciona Fluido de Cultivo Celular Clarificado unir y eluir con medio de Afinidad unir y eluir con medio CEX Carbon activado flujo pasante Medio AEX flujo pasante
Proceso D
Proporciona Fluido de Cultivo Celular Clarificado unir y eluir con medio de Afinidad unir y eluir con medio CEX Medio AEX flujo pasante Carbon activado flujo pasante
Proceso
Proporciona Fluido de unir y eluir con Carbon activado Medio AEX flujo
Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 Etapa 4 Etapa 5
E
Cultivo Celular Clarificado medio de Afinidad flujo pasante pasante
Proceso F
Proporciona Fluido de Cultivo Celular Clarificado unir y eluir con medio CEX Carbon activado flujo pasante Medio AEX flujo pasante
Proceso G
Proporciona Fluido de Cultivo Celular Clarificado unir y eluir con medio de Afinidad Carbon activado flujo pasante Medio AEX flujo pasante Medio CEX flujo pasante
En general, en la tabla anterior, la etapa de unir y eluir con medio de Afinidad, y/o de unir y eluir con medio CEX se puede operar en cualquiera de tres modos: (1) el modo discontinuo, donde el medio se carga con la protema diana, la carga se para, el medio se lava y se eluye y se recoge el conjunto de fracciones; (2) modo semicontinuo, donde la 5 carga se realiza de forma continua, mientras que la elucion es intermitente (por ejemplo, en el caso de cromatograffa multicolumna continua); y (3) modo totalmente continuo, donde tanto la carga como la elucion se realizan de forma continua.
En algunas realizaciones, uno o mas procesos descritos en la Tabla anterior, se puede realizar una etapa de inactivacion de virus despues de la etapa de unir y eluir y antes de someter el eluato a una etapa de purificacion de 10 flujo pasante, como se describe en la presente memoria.
Se entiende que los procesos descritos en la presente memoria y en la Tabla anterior puede emplear ademas etapas adicionales, asf como etapas para el cambio de las condiciones de la disolucion en lmea o a traves de un tanque de compensacion. En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, un proceso incluye las etapas siguientes: clarificacion; unir y eluir con medio de afinidad de Protema A; inactivacion de virus en lmea; purificacion 15 de flujo pasante como se indica a continuacion: Carbon activado seguido de medio AEX de flujo pasante seguido de un cambio de disolucion usando un mezclador estatico y/o tanque de compensacion en lmea, seguido del medio CEX de flujo pasante seguido de filtracion de virus; y formulacion.
V. Ensayo de Niveles Reducidos de Una o Mas Impurezas
La presente invencion proporciona procesos para reducir el nivel de una o mas impurezas presentes en una muestra 20 que contiene una protema de interes. Las impurezas tfpicas contenidas en una muestra proteica derivada de una fuente biologica incluyen protemas de celulas huesped (HCP) y acidos nucleicos (ADN). Cuando una celula huesped es Ovario de Hamster Chino (CHO), la HCP se denomina comunmente como CHO HCP o CHOP. Los metodos inmunologicos que usan anticuerpos a HCP tales como Western Blot y ELISA se usan convencionalmente para la deteccion de tales impurezas. Los ensayos inmunoenzimetricos de placa de microtitulacion (ELISA) se emplean 25 tambien de forma rutinaria para proporcionar una alta sensibilidad de analisis. Tales ensayos son sencillos de usar, objetivos, y herramientas poderosas para medir el nivel de una o mas impurezas durante procesos de purificacion.
Algunos de los kits ELISA para medir HCP estan comercialmente disponibles de vendedores tales como, por ejemplo, Cygnus Technologies of Southport, NC, EE.UU.. Algunos de tales kits son "genericos" en el sentido de que estan previstos para reaccionar con esencialmente todas las HCPs que podnan contaminar el producto 30 independientemente del proceso de purificacion que se ha usado. En algunas realizaciones, se pueden usar kits comercialmente disponibles para detectar el nivel de una o mas impurezas en una muestra.
Esta invencion se ilustra ademas mediante los ejemplos siguientes.
Ejemplos
Ejemplo 1. Evaluacion de diversos materiales para la eliminacion de impurezas en modo de flujo pasante
35 En teste experimento, se evaluaron diferentes materiales de su capacidad de eliminar impurezas de una alimentacion CHO clarificada. Se ensayaron materiales, mostrados en la Tabla II, para la eliminacion de impurezas en modo de flujo pasante. Se uso disolucion salina de tampon fosfato (PBS, fosfato 10 mM, pH 7,4) como un tampon de equilibrio y lavado.
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Tabla II
Material
Acronimo Descripcion Vendedor/Catalogo
Carbon activado
AC RGC 80 MeadWestVado
SP sepharose FastFlow
SP FF Resina agarosa de cromatograffa de intercambio cationico (CIEX) GE Healthcare
ProRes™-S
ProRes™- S Resina polimerica de cromatograffa de intercambio cationico (CIEX) Millipore Corporation
Q sepharose FastFlow
Q FF Resina agarosa de cromatograffa de intercambio anionico (AIEX) GE Healthcare
Phenyl Sepharose FastFlow
Ph FF Resina agarosa de cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC) GE Healthcare
Se uso el metodo de flujo pasante por gravedad (FT) para ensayar la eliminacion de impurezas de la resina. Se dejo que se asentara un ml de cada material listado en la Tabla II (1 ml) y se relleno en una columna desechable de cromatograffa de 5 ml (Evergreen Scientific, LA, CA). Las columnas se equilibraron con 5 volumenes de columna (CV) de tampon de equilibrio (PBS), cargado con 20 CV de alimentacion y se lavaron con 5 CV de tampon de lavado (PBS) de nuevo. Se recogieron las fracciones de eluyente de flujo pasante. Se uso alimentacion CHO-S nula clarificada con la adicion de una IgG policlonal (~ 2,6 mg/ml, SeraCare).
El eluyente de flujo pasante y la alimentacion correspondiente se ensayaron para su rendimiento IgG, eliminacion de especies activas UV (280 nm), eliminacion de HCP y eliminacion de ADN. Se cuantifico el rendimiento IgG en una HpLC Waters Alliance (Milford, MA) usando columna analftica de Protema A Poros de 2,1mm X 30 mm (LIFE TECHNOLOGIES, Palo Alto, CA) segun las instrucciones del vendedor. Se cuantificaron las especies activas UV a 280 nm usando el area del pico de las especies no de retencion que se muestran como el pico de flujo pasante en el cromatograma del Protema A. Se detecto la protema de celula huesped usando el kit CHO-CM HCP ELISA (CYGNUS TECHNOLOGIES, Southport, NC). Se detecto el ADN usando reactivo Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA (LIFE TECHNOLOGIES, Foster City, CA). Todos los ensayos se realizaron segun los protocolos de fabricacion. Los resultados se representan en las Figuras 1-4.
Como se representa en la Figura 1, excepto para la resina HIC, que muestra ~5% IgG de perdida de rendimiento, todos los otros medios evaluados, es dear, carbon activado, SPFF, ProRes™-S, y QFF no mostraron una perdida de rendimiento detectable.
Ademas, como se representa en las Figuras 2, 3 y 4, el carbon activado ha resultado en una reduccion significativa de los niveles de especies activas UV a 280 nm. Esto incluye indicadores pH, alguna poblacion de HCP, ADN y algunos componentes de cultivo celular residuales. En el caso en que se ha usado IgG policlonal, esta fraccion tambien incluye la poblacion IgG 3 que la Protema A no une. Mientras que todos los materiales parecfa que eliminaban hCp en algun grado, incluyendo carbon activado, los dos materiales con funcionalidad de intercambio cationico, Sepharose FastFlow y ProRes™-S, eliminaron la mayor parte de HCP. Como para la eliminacion de ADN, aunque no fue sorprendente ver una eliminacion significativa de ADN mediante una resina de intercambio anionico, Q FastFlow, era inesperado ver que el carbon activado eliminaba el ADN con una capacidad similar. Todos los otros materiales eliminaban ADN en un menor grado.
Los datos de este ejemplo demuestran que el carbon activado, asf como los materiales con intercambio cationico, intercambio anionico y grupos funcionales de interaccion hidrofobica, pueden eliminar impurezas (HCP, ADN y especies activas UV) a diversos grados sin perdida de rendimiento significativa en modo de flujo pasante a partir de una alimentacion CHO.
Ejemplo 2. Capacidad de eliminacion de impurezas en flujo pasante
En un experimento significativo, se evaluo la cantidad de impurezas eliminada por diferentes materiales por unidad de volumen. El nivel de ADN en la alimentacion CHO-S aumento durante la adicion de ADN de esperma de arenque comercialmente disponible para entender el efecto de la competicion de adsorcion entre ADN y hCp. Los materiales que se evaluaron para la eliminacion de impurezas se listan en la Tabla III a continuacion.
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Tabla III
Material
Acronimo Descripcion Vendedor/Catalogo
Carbon activado
AC Carbon activado MeadWestVaco RGC 80
SP sepharose FastFlow
SP FF resina de cromatograffa de intercambio cationico (CIEX), matriz de base agarosa GE Healthcare, Cat# 170729-01
ProRes™-S
ProRes™- S resina de cromatograffa de intercambio cationico (CIEX), matriz de base polimerica Millipore Corporation
Q sepharose FastFlow
Q FF resina de cromatograffa de intercambio anionico (CIEX), matriz de base agarosa GE Healthcare, Cat# 170510-01
Cada uno de los materiales listados en la Tabla III (1 ml) se rellenaron en una columna Omnifit (0,66 cm d.i.). Las columnas se equilibraron con 5 CV PBS, se cargaron con 100 CV de alimentacion CHO-S clarificada nula sin tratar con la adicion de IgG policlonal y ADN de esperma de arenque y se lavaron con 20 volumenes de columna de PBS sobre un BioCad (APpLIED BIOSYSTEMS, Palo Alto, CA). Las fracciones de eluyente de flujo pasante durante la etapa de carga se recogieron cada 10 volumenes de columna. Las fracciones de eluyente de flujo pasante y las alimentaciones correspondientes se ensayaron para el rendimiento IgG, especies activas UV, eliminacion de HCP y ADN usando los mismos metodos que los descritos en el Ejemplo 1.
Como se representa en la Figura 5, todos los materiales evaluados no mostraban una perdida significativa de rendimiento IgG en la carga de 100 volumenes de columna de alimentacion. Como se representa en la Figura 6, el carbon activado elimino la mayor parte de las especies activas UV a traves de los 100 CV. El material de intercambio anionico tambien elimino especies activas UV en algun grado a traves de los 100 CV. Ademas, como se representa en la Figura 7, la capacidad de eliminacion de HCP por una resina de intercambio anionico, Q FastFlow, era limitada, ya que se derrumbaba desde las fracciones tempranas. Sin embargo, los materiales de intercambio cationico, Q FastFlow y ProRes™-S, eliminaron una cantidad significativa de HCP a traves de 100 volumenes de columna. Con la elevada concentracion de ADN (es dedr, unos 195 pg/mL adicionales) es este experimento espedfico, el carbon activado elimino menos HCP en comparacion a con las alimentaciones sin el ADN anadido. Por ejemplo, en un experimento similar con la alimentacion CHO-S nula original son la adicion de ADN, el carbon activado elimino cerca de 20% HCP a traves de los 100 CV (datos no mostrados). Esto demostro algun grado de competicion de ADN y HCP por la adsorcion al carbon activado. Ademas, como se representa en la Figura 8, todos los materiales eliminaron ADN en algun grado.
Los datos de este ejemplo demuestran que el carbon activado, asf como los materiales con intercambio cationico, intercambio anionico y grupos funcionales de interaccion hidrofobica, pueden eliminar impurezas (HCP, ADN y especies activas UV) a diversos grados sobre 100 volumenes de columna, sin perdida de rendimiento significativa en modo de flujo pasante a partir de una alimentacion de celulas CHO.
Ejemplo 3. Efecto de combinaciones de diferentes materiales en la eliminacion de impurezas
En otro experimento, se evaluaron para la eliminacion de impurezas diferentes combinaciones de materiales, mostrados en el diagrama de flujos representado en la Figura 9. Se dejo que los materiales (1 ml) se asentasen y se rellenaron en una columna de cromatograffa de 5 ml desechable. Las columnas se equilibraron con 5 CV de PBS, se cargaron con 20 CV de alimentacion y se lavaron con 5 CV de PBS.
La fraccion de eluyente de flujo pasante se cargo adicionalmente en la siguiente columna desechable del medio seleccionado (como se muestra en los dos diagramas de flujo representados en la izquierda en la Figura 9). Se analizo el ultimo eluyente de flujo pasante en el diagrama de flujo. En el caso del diagrama de flujo representado en la derecha, en el que una alimentacion coma a traves de una mezcla de medios, el eluyente se analizo directamente. La alimentacion se preparo usando alimentacion CHO-S sin expresar con adicion de IgG policlonal (~ 2,5 mg/ml) de SeraCare. Las fracciones de eluyente de flujo pasante y las alimentaciones correspondientes se ensayaron para el rendimiento IgG, especies activas UV, eliminacion de HCP y ADN usando los mismos metodos descritos anteriormente en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en las Figuras 10-12.
Como se representa en la Figura 10, el carbon activado y las mezclas que contienen carbon activado reducen significativamente el nivel de las especies activas UV. Ademas, aunque todos los materiales presentaban eliminacion de HCP en algun grado, la mezcla de carbon activado en combinacion con una resina cationica mostraba la eliminacion mas eficaz de HCP, como se representa en la Figura 11. Tambien, como se representa en la Figura 12, aunque todos los materiales eliminaban ADN en algun grado, la combinacion de carbon activado y una
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resina de intercambio anionico mostraba la eliminacion mas eficaz de ADN.
Los datos de este ejemplo demuestran que la combinacion de carbon activado y materiales con intercambio cationico, intercambio anionico y grupos funcionales con interaccion hidrofobica pueden eliminar impurezas (HCP, ADN y especies activas UV) de forma mas eficaz que cualquier componente unico en modo de flujo pasante a partir de una alimentacion CHO.
Ejemplo 4. Eliminacion de impurezas de un conjunto de fracciones de elucion de Protema A
En otro experimento, se uso el metodo estandar de flujo pasante por gravedad para investigar la eliminacion de impurezas en un conjunto de fracciones de post Proteina A . Se evaluaron los materiales evaluados en el Ejemplo 1, es dear, carbon activado, resinas de intercambio cationico (SP FF y ProRes™-S), resina de intercambio anionico, Q FF, y resina HIC, Phenyl FastFlow y diferentes combinaciones de estos materiales. Se dejo que se asentase el carbon activado o material de resina (1 ml) y se relleno en una columna de cromatograffa desechable de Evergreen. Cada columna se equilibraron con 5 CV de PBS, se cargo con 20 CV de alimentacion y se lavo con 5 CV de PBS. Se recogieron durante la etapa de carga las fracciones de eluyente de flujo pasante. La alimentacion usada era un conjunto de fracciones de Proteina A (ProSep Ultra Plus) (~ 3,2 mg/ml IgG) despues de ajustar el pH a 7,0. La alimentacion para la columna de Proteina A era CHO-S no expresante a la que se anadio IgG policlonal.
Las fracciones de eluyente de flujo pasante y el conjunto de fracciones de elucion de Proteina A se evaluaron para el rendimiento de IgG, eliminacion de especies activas UV, eliminacion de HCP y eliminacion de ADN. Todos los ensayos se realizaron como se describe en el Ejemplo 1, excepto que en el caso de HCP, se uso el kit CHO-3G HCP ELISA (CYGNUS TECHNOLOGIES, Southport, NC).
Como se representa en la Figura 13, todos los materiales evaluados generaron un rendimiento del ~85% o mayor. El carbon activado, resina de intercambio cationico, SP FastFlow, eliminaron el maximo HCP como un solo material. La mezcla de diferentes materiales proporciono la mayor eliminacion de HCP, como se representa en la Figura 14. La Figura 15 representa el hecho de que todo el material elimina una cantidad significativa de ADN, parcialmente debido al bajo nivel en la alimentacion. Globalmente, las mezclas de materiales eran generalmente mas eficaces en la eliminacion de impurezas en comparacion a un solo material.
Los datos de este ejemplo demuestran que el carbon activado y los materiales con intercambio cationico, intercambio anionico y grupos funcionales de interaccion hidrofobica, asf como la mezcla de estos materiales pueden eliminar impurezas (HCP, DNA y especies activas UV) a diferentes grados en el modo de flujo pasante de una mezcla de fracciones de elucion de Proteina A generada a partir de una alimentacion CHO.
Ejemplo 5. Preparacion de una alimentacion MAb capturada representativa basada en afinidad (Proteina A) para evaluar el comportamiento del carbon activado para la purificacion de MAb
Un anticuerpo monoclinal parcialmente purificado, referido como MAb I, se produjo usando una lmea de cultivo CHO para uso como una alimentacion de anticuerpo monoclonal capturada de afinidad representativa (Proteina A) para evaluar el comportamiento del carbon activado para purificar protemas. El cultivo celular era primero clarificado directamente de un biorreactor usando medios de filtracion profunda, disponibles como filtros Millistak+® POD (MILLIPORE CORPORATION, Billerica, MA, EE.UU.). El fluido de cultivo celular se filtro a traves de una serie de dos filtros, D0HC y X0HC a una turbidez final de < 10 NTU, y posteriormente se filtro de forma esteril con un filtro de capsula Millipore Express® SHC.
Se relleno una columna acnlica Quick-Scale® de 14 cm ID de Millipore Corporation, Billerica, MA, EE.UU. con un medio de Proteina A de capacidad elevada Millipore ProSep-vAcity a un volumen de lecho de aproximadamente 3,2 L. La columna se relleno usando una combinacion de rellenado por flujo con PBS y vibracion. Todas las etapas de cromatograffa se realizaron en un sistema Millipore K-Prime 40-1 con deteccion realizada usando absorcion UV a una longitud de onda de 280 nm. La columna se uso para la purificacion de MAb I durante al menos cinco ciclos y se almaceno en PBS a 4 °C. Antes de usar la columna, se limpio con al menos 2 volumenes de columna (CV) de acido fosforico 0,15 M pH 1,5-1,7 y despues se equilibro con PBS hasta que el pH se estabilizo (al menos 3 CV). Tfpicamente, el dfa despues de la clarificacion, el cultivo celular filtrado de forma esteril clarificado se cargo en la columna de Proteina A a un tiempo de permanencia de al menos 5 minutos (es dear, un caudal de 500 - 600 mL min'1). La columna se cargo para asegurar que no se excedfa la capacidad maxima de la columna, que se definio como 30 g de MAb I por litro de medio.
Despues de la carga de la columna, la columna se limpio con PBS al mismo tiempo de permanencia hasta que las trazas UV alcanzaron la lmea e base, tfpicamente en tres CV. Despues se lavo la columna con acetato de sodio 20 mM con NaCl 0,5 M a pH 6 durante al menos tres CV, pero no mas de cinco CV. A continuacion se eluyo el producto usando una etapa de cambio a acido acetico 20 mM pH 3,0, donde la captura del pico de elucion se realizo manualmente para reducir la dilucion del pico de elucion. Se dejo que el eluato incubase a temperatura ambiente (20-25 °C) durante al menos 30 minutos hasta un maximo de 1,5 horas. Despues de la incubacion, el pH de la mezcla de fracciones de elucion se titro a pH 5 ± 0,2 usando base Tris 2 M a pH 10 o mayor. El pH de partida de la mezcla de fracciones de elucion era tfpicamente proximo a 4,0 y requena menor que 5 % en volumen de adicion de la disolucion base Tris. Durante la titracion de la mezcla de fracciones de elucion se observo un precipitado visible.
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La eliminacion de los precipitados se realizo usando un Millipore Millistak+® X0HC POD escala lab antes de la filtracion en condiciones esteriles de mezcla de fracciones de elucion, donde al menos se requirieron dos vainas (POD) de 0,027 m2 para clarificar los precipitados de la mezcla de fracciones de elucion completa. Despues de la filtracion profunda, el eluato se filtro en condiciones esteriles usando unidades de filtro Millipore Express Plus Stericup y se almaceno a 4 °C hasta su uso.
Ejemplo 6. Preparacion de una alimentacion MAb capturada representativa basada en no-afinidad (intercambio cationico) para evaluar el comportamiento del carbon activado para la purificacion de MAb
Un anticuerpo monoclinal parcialmente purificado, referido como MAb I, se produjo usando una lmea de cultivo CHO para uso como una alimentacion de anticuerpo monoclonal capturada de no-afinidad representativa (intercambio cationico) para evaluar el comportamiento del carbon activado para purificar protemas. SE obtuvo un fluido clarificado de cultivo celular MAb I como se ha discutido en el Ejemplo 5. El fluido de cultivo celular se filtro a traves de una serie de dos filtros, D0HC y X0HC a una turbidez final de < 10 NTU, y posteriormente se filtro de forma esteril con un filtro de capsula Millipore Express® SHC.
Se relleno una columna de laboratorio de 22 cm ID glass Vantage® de Millipore Corporation, Billerica, MA, EE.UU. con el medio de intercambio cationico (CEX) Fractogel® SO3" (M). La columna se relleno usando PBS sobre un Akta® Explorer 100 (GE HEALTHCARE, Uppsala, Suecia) con velocidades lineales superficiales de aproximadamente 1000 cm h-1. La cafda de presion a traves de la columna se mantuvo por debajo de tres bar durando el rellenado y todos los ensayos de la columna posteriores. La compresion del lecho de la columna fue de aproximadamente 15 % con un volumen de lecho relleno de 75 mL. La eficacia de rellenado de la columna se midio usando una inyeccion de pulso de 500 pL de Tris 25 mM, NaCl 1M, acetona al 3 % (v/v) a pH 6,9 a una velocidad lineal superficial de 100 cm h-1 usando PBS como el tampon de ensayo. Se calculo la altura equivalente a un plato teorico (HETP) usando el pico de acetona usando metodos estandar despues de contar el volumen muerto del sistema y se calculo como 0,053 cm con una asimetna del pico de 1,3, indicando que la columna estaba rellenada suficientemente. El pico de NaCl mostraba un nivel mayor de asimetna del pico, pero esto es probable que este relacionado con la interaccion de los iones salinos con el medio y no una representacion de la eficacia de la columna.
Antes del primer uso de la columna, se realizo un ensayo en blanco completo sin una carga proteica para reducir y/o eliminar cualquier interaccion relacionada con la disolucion con el medio base. Antes de la carga, la columna se equilibro con acetato de sodio 20 mM pH 5 durante al menos cinco CV. La columna se cargo con un cultivo celular clarificado que contema MAb I que tema el pH disminuido a pH 5 usando acido acetico glacial. Cuando se disminuyo el pH del cultivo celular, se observaron a menudo precipitados y se eliminaron usando una combinacion de centrifugado y filtracion profunda usando un Millipore Millistak+® X0HC POC escala lab.
La disolucion de carga se filtro en condiciones esteriles antes de cargarla usando unidades de filtro Millipore Express Plus Stericup. La carga filtrada en condiciones esteriles se cargo en la columna usando un tiempo de permanencia de 10 min en un esfuerzo de maximizar la capacidad de la columna (aproximadamente 45 g MAb I por L de medio), al mismo tiempo que se minimizaba la cafda de presion a traves de la columna. Despues de la carga, la columna se lavo con tampon de equilibrado para cinco CV. La columna se lavo despues con tampon de acetato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M NaCl pH 5,0 para cinco CV. La elucion del a columna se realizo con un cambio de etapa a acetato de sodio 20 mM, NaCl 0,25 M pH 6,0 para al menos cinco CV. El eluato se fracciono y las fracciones de pico se reunieron y almacenaron a 4 °C para otro uso. Entonces, se lavo la columna con acetato de sodio 20 mM, NaCl 1 M pH 6,0 para eliminar las protemas fuertemente unidas, que se determino que eran principalmente protemas de celulas huesped (HCP). Entonces, la columna se lavo con NaOH 0,5 N para cinco CV a un caudal menor equivalente a un tiempo de permanencia de 30 minutos. A continuacion se lavo la columna con cinco CV del tampon de equilibrado y se almaceno a temperatura ambiente (20-25 °C) para un uso futuro.
Ejemplo 7. Evaluacion de diversos adsorbentes por tratamiento de flujo pasante de un eluato MAb capturado por afinidad
Se comparo el carbon activado en una aplicacion de flujo pasante con varios medios adsorbentes diferentes comercialmente disponibles que se usan habitualmente para la purificacion de protemas que inclman qmmicas de intercambio anionico (ChromaSorb™), intercambio cationico (HiTrap SP fF, HiTrap CM FF), e interaccion hidrofobica (HiTrap Phenyl FF, HiTrap Butyl FF) para la purificacion de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Protema A) para demostrar que el carbon activado es unico e inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas de disoluciones proteicas.
Se preparo un eluato capturado por afinidad parcialmente purificado MAb I (Protema A) segun el Ejemplo 5. El eluato de MAb I se ajusto de aproximadamente pH 5 a pH 7 con base Tris (2 M) y se filtro a traves de una unidad de filtro de 0,22 micras Millipore Express Plus Stericup. La disolucion es referida en la presente memoria como el eluato Protema A MAb I.
En la presente memoria se usan intercambiablemente carbon activado HD y HD Nuchar de forma intercambiable y se refieren a la calidad de carbon activado en polvo obtenido de MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA,
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EE.UU.. Las columnas de cromatograffa Omnifit (diametro de 10 mm, longitud de 100 mm) se cargaron con 250 mg de carbon activado HD Nuchar en suspension en agua para proporcionar un volumen de columna rellena de 1 mL. Se fabricaron dispositivos de membrana de 0,2 mL ChromaSorb usando una membrana de polietileno de mdice de 0,65 micras modificada con polialil amina, disponible de Millipore Corporation, Billerica, MA, EE.UU., en dispositivos de diversos tamanos. La membrana se corto en discos de 25 mm; Se apilaron y sellaron 5 discos en un dispositivo de polipropileno sobremoldeado del mismo tipo que los dispositivos de filtro de capsulas desechables OptiScale 25 comercialmente disponibles en Millipore Corporation. Los dispositivos incluyen un respiradero para prevenir la falta de aire, y tienen un area efectiva de filtracion de 3,5 cm2 y un volumen de 0,2 mL.
Las columnas de cromatograffa de 1 mL pre-rellenas HiTrap SP FF, HiTrap CM FF, HiTrap Phenyl FF (sub elevada), y HiTrap Butyl FF se adquirieron de GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EE.UU., y se equilibraron con disolucion tampon (tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7) antes de usarse. Se ensamblaron seis trenes de purificacion de flujo pasante: a) carbon activado, b) ChromaSorb, c) HiTrap SP FF, d) HiTrap CM FF, e) HiTrap Phenyl FF, y f) HiTrap Butyl FF. Posteriormente, se pasan a traves de cada configuracion 96 mL del eluato de Protema A MAb I a un caudal de 0,25 mL/min. Despues de pasar a traves de los trenes de purificacion, las disoluciones se analizaron en cuanto a protema de celulas huesped (HCP), concentracion IgG y Protema A residual. El analisis HCP se realizo usando un kit ELISA comercialmente disponibles de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., numero de catalogo F550, siguiendo el protocolo del fabricante del kit. La concentracion IgG se midio usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna anafftica de Protema A Poros® A. El analisis de Protema A se realizo usando un kit ELISA comercialmente disponible de Meridian Life Sciences, Saco, ME, EE.UU., Kit C0Z51-188. Los resultados se resumen en la Tabla IV.
Los resultados muestran que el carbon activado elimino la mayor cantidad de impurezas con un valor de reduccion del log (LRV) de protema de celula huesped (HCP) de 0,87. El LRV del valor HCP para el carbon activado era significativamente mayor en comparacion al medio comercialmente disponible (intercambio anionico, intercambio cationico, interaccion hidrofobica) examinado, que tema LRV de HCP que oscilaba de 0,19 a 0,35. La Protema A residual de la etapa de captura de afinidad tambien se elimino de forma eficaz por debajo del ffmite detectable por el carbon activado. El unico medio comercialmente disponible que se observo que eliminaba cualquier cantidad significativa de Protema A residual era el medio de intercambio anionico (ChromaSorb™), que tambien disminma la concentracion de Protema A residual por debajo del ffmite detectable. A pesar de las elevadas cantidades de impurezas eliminadas por el carbon activado todavfa tema una recuperacion excelente (96%) del producto de anticuerpo monoclonal (MAb I), que era similar a las recuperaciones de producto (82-100%) observadas para los medios comercialmente disponibles que se examinaron.
Tabla IV
adsorbente de flujo pasante
MAb I (mg/m L) Recuperacion MAb I HCP (ng/mL) HCP (ppm) LRV de HCP Protema A (ng/mL) Protema A (ppm)
Sin tratar (control)
7,18 ND 869 121 ND 4.61 0,62
Carbon activado
6,88 96% 112 16 0,87 ND ND
ChromaSorb
5,92 82% 320 54 0,35 ND ND
HiTrap SP FF
6,09 85% 364 60 0,31 2,95 0,48
HiTrap CM FF
6,28 87% 463 74 0,22 2,72 0,43
HiTrap Phenyl FF
6,89 96% 385 56 0,33 3,21 0,47
HiTrap Butyl FF
7,21 100% 563 78 0,19 4,25 0,59
ND - No detectado NA - No aplicable
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Ejemplo 8. El tratamiento de empapado estatico de un eluato capturado por afinidad de un MAb con carbon activado y/o medio de intercambio anionico
El carbon activado solo y en combinacion con un medio de intercambio anionico se examino para la eliminacion de impurezas de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Protema A) para demostrar un metodo unico e inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas.
Se preparo un eluato capturado por afinidad parcialmente purificado MAb I (Protema A) segun el Ejemplo 5. El eluato de MAb I se ajusto de aproximadamente pH 5 a pH 7 con base Tris (2 M) y se filtro a traves de una unidad de filtro de 0,22 micras Millipore Express Plus Stericup. La disolucion es referida en la presente memoria como el eluato Protema A MAb I.
En la presente memoria se usan intercambiablemente carbon activado RGC y RGC Nuchar de forma intercambiable y se refieren a la calidad de carbon activado en polvo obtenido de MeadWestvaco Corporation, Richmond, VA, EE.UU.. En un experimento representativo, una porcion circular de 7 mm (5 jL) de la membrana ChromaSorb™ y/o 10 mg de carbon activado RGC Nuchar se anadieron a un tubo centnfugo de 1,5 mL con tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7 para equilibrar el medio adsorbente. Los tubos se centrifugaron y el tampon de equilibrado sobrenadante se elimino. Posteriormente, se anadio un volumen de 1 mL del eluato de Protema A MAb I a un tubo centnfugo de 1,5 mL que contema el(los) adsorbente(s) equilibrado(s). Se dejo que el medio adsorbente y el eluato interactuasen durante 18 horas a temperatura ambiente con rotacion suave. Los tubos se sometieron a centrifugado y las disoluciones de sobrenadante se analizaron con relacion a la concentracion de protema de celula huesped (hCp) e IgG.
El analisis HCP se realizo usando un kit ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., numero de catalogo F550, siguiendo el protocolo del fabricante del kit. La concentracion IgG se midio usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna analftica de Protema A Poros® A. Los resultados de uno de tales experimentos se resumen en la Tabla V.
Los resultados muestran que el carbon activado solo y en combinacion con un medio de intercambio anionico era inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas de la disolucion de anticuerpo monoclonal. La combinacion de carbon activado y el medio de intercambio anionico (ChromaSorb) elimino la mayor cantidad de impurezas con una reduccion del valor de reduccion del log (LRV) de protema de celula huesped (HCP) de 1,43. El carbon activado y el medio de intercambio anionico individuales teman LRV de HCP de 1,21 y 0.36 respectivamente. El carbon activado solo y en combinacion con un medio de intercambio anionico teman ambos expelentes recuperaciones del producto de anticuerpo monoclonal de 95% y 95% respectivamente.
Tabla V
Medio adsorbente
MAb I (mg/mL) Recuperacion MAb I HCP (ng/mL) HCP (ppm) LRV de HCP
Control (nada anadido)
6,92 ND 1748 252 ND
Carbon activado
6,58 95% 102 16 1,21
ChromaSorb
6,74 97% 743 110 0,36
Carbon Activado y ChromaSorb
6,58 95% 62 9 1,43
NA - No aplicable
Ejemplo 9. El tratamiento de empapado estatico de un eluato capturado por afinidad de un MAb con carbon activado y/o un medio de intercambio anionico
El carbon activado solo y en combinacion con un medio de intercambio anionico se examino para la eliminacion de impurezas de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Protema A) que contema un anticuerpo monoclonal diferente a MAb I (referido como MAb II) para demonstrar que el carbon activado solo y en combinacion con un medio de intercambio anionico proporciona un metodo unico e inesperadamente eficaz que se puede aplicar a la purificacion de una variedad de anticuerpos monoclonales diferentes.
Se preparo un segundo eluato capturado por afinidad parcialmente purificado MAb II (Protema A) segun el Ejemplo 5. El eluato de MAb II se ajusto de aproximadamente pH 5 a pH 7 con base Tris (2 M) y se filtro a traves de una unidad de filtro de 0,22 micras Millipore Express Plus Stericup. La disolucion es referida en la presente memoria como el eluato Protema A MAb II.
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Una porcion circular de 7 mm (5 pL) de la membrana ChromaSorb™ y/o 10 mg de carbon activado RGC Nuchar se anadieron a un tubo centnfugo de 1,5 mL con tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7 para equilibrar el medio adsorbente. Los tubos se centrifugaron y el tampon de equilibrado sobrenadante se elimino. Posteriormente, se anadio un volumen de 1 mL del eluato de Protema A MAb II con pH ajustado a un tubo centnfugo de 1,5 mL que contema el(los) adsorbente(s) equilibrado(s). Se dejo que el medio adsorbente y el eluato interactuasen durante 18 horas a temperatura ambiente con rotacion suave. Los tubos se sometieron a centrifugado y las disoluciones de sobrenadante se analizaron con relacion a la concentracion de protema de celula huesped (HCP) e IgG. El analisis HCP se realizo usando un kit ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., (numero de catalogo F550), siguiente el protocolo del fabricante del kit. La concentracion IgG se midio usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna analftica de Protema A Poros® A. Los resultados se resumen en la Tabla VI.
Los resultados muestran que el carbon activado solo y en combinacion con un medio de intercambio anionico era inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas de una disolucion que contema un segundo tipo de anticuerpo monoclonal. La combinacion de carbon activado y el medio de intercambio anionico (ChromaSorb™) elimino la mayor cantidad de impurezas con una reduccion del valor de reduccion del log (LRV) de protema de celula huesped (HCP) de 1,78. El carbon activado y el medio de intercambio anionico individuales teman LRV de HCP de 1,08 y 0.64 respectivamente. El carbon activado solo y en combinacion con un medio de intercambio anionico teman ambos buenas recuperaciones del producto de anticuerpo monoclonal de 95% y 87% respectivamente.
Tabla VI
Medio adsorbente
MAb II (mg/mL) Recuperacion de MAb II HCP (ng/mL) HCP (ppm) LRV de HCP
Control (nada anadido)
18,19 ND 23418 1287 ND
Carbon activado
15,89 87% 4681 295 0,64
ChromaSorb
16,08 88% 1711 106 1,08
Carbon Activado y ChromaSorb
15,44 85% 329 21 1,78
NA - No aplicable
Ejemplo 10. El tratamiento de empapado estatico de un eluato capturado por no-afinidad de un MAb I con carbon activado y/o medio de intercambio anionico
El carbon activado solo y en combinacion con un medio de intercambio anionico se examino para la eliminacion de impurezas de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por no-afinidad (intercambio cationico) para demostrar que el carbon activado solo y en combinacion con un medio de intercambio anionico proporciona un metodo unico e inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas. Con relacion al eluato capturado por no-afinidad, el eluato capturado por no-afinidad (intercambio cationico) contiene diferentes tipos de impurezas a niveles significativamente mayores. La aplicacion de carbon activado para la purificacion de un eluato capturado por no-afinidad demuestra que este metodo es general y se puede aplicar a la purificacion de una variedad de eluatos de protema diferentes.
En un experimento separado, se preparo el eluato CEX MAb I parcialmente purificado como se describe en el Ejemplo 6. El eluato se diluyo por un factor de 4 con una disolucion tampon (tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7) y despues se filtro a traves de una unidad de filtro de 0,22 micras Millipore Express Plus Stericup. La disolucion es referida en la presente memoria como el eluato CEX MAb I.
Dos porciones circulares de 10 mm (19,6 pL) de la membrana ChromaSorb™ y/o 20 mg de carbon activado RGC Nuchar se anadieron a un tubo centnfugo de 1,5 mL con tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7 para equilibrar el medio adsorbente. Los tubos se centrifugaron y el tampon de equilibrado sobrenadante se elimino. Posteriormente, se anadio un volumen de 1 mL del eluato de CEX MAb I a un tubo centnfugo de 1,5 mL que contema el(los) adsorbente(s) equilibrado(s). Se dejo que el medio adsorbente y el eluato interactuasen durante 18 horas a temperatura ambiente con rotacion suave. Los tubos se sometieron a centrifugado y las disoluciones de sobrenadante se analizaron con relacion a la concentracion de protema de celula huesped (HCP) e IgG. El analisis HCP se realizo usando un kit ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., numero de catalogo F550, siguiente el protocolo del fabricante del kit. La concentracion IgG se midio usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna analftica de Protema A Poros® A. Los resultados se resumen en la Tabla VII.
Los resultados muestran que el carbon activado solo y en combinacion con un medio de intercambio anionico era inesperadamente eficaz en la eliminacion de impurezas de una disolucion de anticuerpo monoclonal que se capturo a partir de un cultivo celular usando cromatograffa de no-afinidad (intercambio cationico). El medio de captura basado en no-afinidad (intercambio cationico) se une a mas impurezas junto con el anticuerpo monoclonal que el 5 medio de captura basado en afinidad mas espedfico (Protema A). Por lo tanto, el eluato capturado por no afinidad contiene diferentes tipos de impurezas a niveles significativamente mayores. La combinacion de carbon activado y membrana de intercambio anionico (ChromaSorb™) elimino la mayor cantidad de impurezas con una reduccion del valor de reduccion del log (LRV) de protema de celula huesped (HCP) de 1,45. El carbon activado y el medio de intercambio anionico individuales teman LRV de HCP de 1,20 y 0,55 respectivamente. El carbon activado solo y en 10 combinacion con un medio de intercambio anionico teman ambos buenas recuperaciones del producto de anticuerpo monoclonal de 95% y 74% respectivamente.
Tabla VII
MAb I (mg/mL) recuperacion de MAb I HCP (ng/mL) HCP (ppm) LRV de HCP
Referencia
3,14 ND 64,254 20,463 ND
Carbon activado
2,99 95% 17,091 5,716 0,55
ChromaSorb
2,93 93% 3,817 1,303 1,20
Carbon Activado y ChromaSorb
2,32 74% 1,676 722 1,45
NA - No aplicable
Ejemplo 11. Tratamiento por empapado estatico de un eluato capturado por afinidad de MAb I con carbon 15 activado a diferentes valores de pH
El carbon activado se examino para la eliminacion de impurezas de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Protema A) a diferentes Ph de la disolucion para demostrar que el carbon activado es eficaz en una variedad de diferentes condiciones de la disolucion.
En un experimento separado, se preparo un eluato capturado por afinidad de MAb I (Protema A) parcialmente 20 purificado segun el Ejemplo 5. El eluato de MAb I se ajusto de aproximadamente pH 5 a pH 7 con base Tris (2 M) y se filtro a traves de una unidad de filtro de 0,22 micras Millipore Express Plus Stericup. La disolucion es referida en la presente memoria como el eluato Protema A MAb I.
El pH del eluato de Protema A MAb I (20 mL) se ajusto a 5, 6, 7, u 8 mediante la adicion de base Tris base (2 M) o acido acetico (3 M). Los eluatos resultantes de Protema A MAb I con pH ajustado se filtraron a continuacion en 25 condiciones esteriles usando una membrana Millipore Express® de 0,22 micras para eliminar cualquier turbidez. A continuacion se anadio carbon activado RGC Nuchar (10 mg) a tubos centnfugos de 1,5 mL junto con tampon Tris- HCl, 25 mM, pH 7 para equilibrar el carbon activado. Los tubos se centrifugaron y el tampon de equilibrado sobrenadante se elimino. A continuacion se anadieron a los tubos 1 mL de los eluatos de Protema A MAb I con pH ajustado. Se dejo que el medio adsorbente y los eluatos interactuasen durante 18 horas a temperatura ambiente con 30 rotacion suave. Los tubos se sometieron despues a centrifugado y se eliminaron 0,5 mL de sobrenadante y se analizo con relacion a la concentracion de protema de celula huesped (HCP) e IgG. El analisis HCP se realizo usando un kit ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., numero de catalogo F550, siguiente el protocolo del fabricante del kit. La concentracion IgG se midio usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna analttica de Protema A Poros® A. Los resultados se resumen en la Tabla VII.
35 Los resultados muestran que el carbon activado era inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas de una disolucion de anticuerpo monoclonal en un intervalo amplio de pH. El valor de reduccion del log (LRV) de la protema de la celula huesped (HCP) era muy similar para pH 6, pH 7, y pH 8, oscilando de 1,27 a 1,30 LRV de HCP. El carbon activado aun proporcionaba eliminacion selectiva de impurezas a pH 5 aunque el LRV de HCP se redujo a 0,70. El carbon activado tema excelentes recuperacion es del producto de anticuerpo monoclonal que oscila de 90% 40 a 95% para todas las condiciones de pH examinadas.
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MAb I (mg/mL) HCP (ng/mL) HCP (ppm)
pH
Referencia Despues A.C. recuperacion de MAb I Referencia Despues A.C. Referencia Despues A.C. LRV de HCP
5
7.31 6,97 95% 5,505 1,048 753 150 0,70
6
7,26 6,88 95% 1,986 101 274 15 1,27
7
7,04 6,79 96% 1,889 91 268 13 1,30
8
8.63 7,76 90% 1,556 75 180 10 1,27
Ejemplo 12. El tratamiento de flujo pasante de un eluato capturado por afinidad de un MAb I con carbon activado y/o medio de intercambio anionico
El carbon activado solo y en combinacion con el medio de intercambio anionico se examino en una aplicacion de flujo pasante para la eliminacion de impurezas de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Protema A) para demostrar que el carbon activado solo y en combinacion con un medio de intercambio anionico proporciona un metodo unico e inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas en condiciones de flujo pasante usadas comunmente para la purificacion a gran escala de protemas.
Se preparo un eluato capturado por afinidad parcialmente purificado MAb I (Protema A) segun el Ejemplo 5. El eluato de MAb I se ajusto de aproximadamente pH 5 a pH 7 con base Tris (2 M) y se filtro a traves de una unidad de filtro de 0,22 micras Millipore Express Plus Stericup. La disolucion es referida en la presente memoria como el eluato Protema A MAb I.
Las columnas de cromatograffa Omnifit (diametro de 10 mm, longitud de 100 mm) se cargaron con 250 mg de carbon activado HD Nuchar en suspension en agua para proporcionar un volumen de columna rellena de 1 mL. Las columnas se equilibraron con disolucion tampon (tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7). Un dispositivo de 0,2 mL ChromaSorb, fabricado como se describe anteriormente en el Ejemplo 7, tambien se equilibro con disolucion tampon (tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7). Se ensamblaron subsiguientemente tres trenes de purificacion. El primero consistfa en un dispositivo ChromaSorb, el segundo consistfa en una columna de carbon activado y el tercero consistfa en una columna de carbon activado seguida de un dispositivo ChromaSorb. Se hicieron pasar 100 mL del eluato de Protema A MAb I a traves de cada montaje a un caudal de 0,25 mL/min. Se recogieron diez fracciones de 10 mL del eluato. Se analizaron las muestras reunidas de todas las diez asf como las fracciones individuales con relacion a la concentracion de protema de celula huesped (HCP) e IgG. El analisis HCP se realizo usando un kit ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., numero de catalogo F550, siguiente el protocolo del fabricante del kit. La concentracion IgG se midio usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna analttica de Protema A Poros® A. Los resultados se resumen en la Tabla IX.
Como se representa en la Figura 16 y se resume en la Tabla IX, los resultados muestran que el tratamiento de flujo pasante del eluato capturado por afinidad con carbon activado solo y en combinacion con un medio de intercambio anionico era inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas de la disolucion de anticuerpo monoclonal. La combinacion de carbon activado y membrana de intercambio anionico (ChromaSorb™) elimino la mayor cantidad de impurezas con una reduccion del valor de reduccion del log (LRV) de protema de celula huesped (HCP) de 1,95. El carbon activado y el medio de intercambio anionico individuales teman LRV de HCP de 0,96 y 0,23 respectivamente. El carbon activado solo y en combinacion con un medio de intercambio anionico teman ambos expelentes recuperaciones del producto de anticuerpo monoclonal que oscila entre 96% y 98% respectivamente.
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Tren de flujo pasante
MAb I (mg/mL) recuperacion de MAb I HCP (ng/mL) HCP (ppm) LRV de HCP
Sin tratar (control)
9,21 ND 6,259 679 ND
solo ChromaSorb
8,92 97% 3,538 397 0,23
Solo carbon activado
9,03 98% 1,330 148 0,96
Carbon activado seguido de ChromaSorb
8,81 96% 67 8 1,95
NA - No aplicable
Ejemplo 13. Tratamiento por flujo pasante de un eluato capturado por afinidad de MAb I con diversos medios de intercambio anionico solos o despues de tratamiento con carbon activado
El carbon activado se examino solo y en combinacion con una variedad de diferentes medios de intercambio anionico comercialmente disponibles para la eliminacion de impurezas de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Protema A) para demostrar que el carbon activado se puede combinar con diversos medios diferentes de intercambio anionico. Los medios de intercambio anionico comercialmente disponibles examinados inclman aminas primarias (ChomaSorb) y aminas cuaternarias (Sartobind Q, Mustang Q, HiTrap Q FF). Las qmmicas de intercambio anionico comercialmente disponibles se examinaron soportadas en una membrana (ChomaSorb, Sartobind Q, Mustang Q) y en una resina (HiTrap Q FF).
Se preparo un eluato capturado por afinidad parcialmente purificado MAb I (Protema A) segun el Ejemplo 5. El eluato de MAb I se ajusto de aproximadamente pH 5 a pH 7 con base Tris (2 M) y se filtro a traves de una unidad de filtro de 0,22 micras Millipore Express Plus Stericup. La disolucion es referida en la presente memoria como el eluato Protema A MAb I.
Las columnas de cromatograffa Omnifit (diametro de 10 mm, longitud de 100 mm) se cargaron con 250 mg de carbon activado HD Nuchar en suspension en agua para proporcionar un volumen de columna rellena de 1 mL. Las columnas se equilibraron con disolucion tampon (tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7). Se fabricaron dispositivos de membrana de 3 capas, 0,26 mL Sartobind Q usando discos de membrana Sartobind Q comercialmente disponibles (SIGMA-ALDRICH, St. Louis, MO, EE.UU.) (0,26 mL, 3 laminas) y la carcasa del dispositivo y los procesos usados para producir los dispositivos de 0,2 mL ChromaSorb se fabricaron como se describe anteriormente en el Ejemplo 7. Las unidades de 0,18 mL Acrodisc® con membrana Mustang Q se compraron de Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU. Estos dispositivos, junto con la columna pre-rellena de 1 mL HiTrap Q FF (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EE.UU.) y el dispositivo de 0,2 mL ChromaSorb, se equilibraron con disolucion tampon (tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7).
Se ensamblaron nueve trenes de purificacion de flujo pasante: a) carbon activado, b) ChromaSorb, c) carbon activado seguido de ChromaSorb, d) Sartobind Q, e) carbon activado seguido de Sartobind Q, f) Mustang Q, g) carbon activado seguido de Mustang Q, h) HiTrap Q FF, i) carbon activado seguido de HiTrap Q FF. 96 mL del eluato de Protema A MAb I se hicieron pasar a continuacion a traves de cada montaje a un caudal de 0,25 mL/min. Despues de pasar a traves de los trenes de purificacion, las disoluciones se analizaron con relacion a la concentracion de protema de la celula huesped (HCP) e IgG. El analisis HCP se realizo usando un kit ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., numero de catalogo F550, siguiente el protocolo del fabricante del kit. La concentracion IgG se midio usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna analttica de Protema A Poros® A. Los resultados se resumen en la Tabla X.
Los resultados muestran que el tratamiento de flujo pasante de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Protema A)con la combinacion de carbon activado con una variedad de medios de intercambio anionico diferentes esta inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas. El valor de reduccion del log (LRV) de la protema de la celula huesped (HCP) era 0,91 para el carbon activado solo. Los diferentes medios de intercambio anionico comercialmente disponibles solos teman LRV de HCP muy similares que oscilaban de 0,17 a 0,23. La combinacion de carbon activado seguida por los diferentes medios de intercambio anionico comercialmente disponibles tema LRV de HCP mucho mayores que oscilaban de 1,70 a 1,93. La combinacion de carbon activado seguida de los diferentes medios de intercambio anionico tema excelentes recuperaciones del anticuerpo monoclonal que oscilaban de 96% a 97%. Los datos demostraban que el carbon activado es inesperadamente eficaz para la purificacion de anticuerpos en combinacion con una variedad de diferentes medios de intercambio anionico
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comercialmente disponibles que incluyen aminas primarias (ChomaSorb™) y aminas cuaternarias (Sartobind Q, Mustang Q, HiTrap Q FF). La combinacion de carbon activado era altamente eficaz en combinacion con qmmicas de intercambio anionico comercialmente disponibles que se soportaron en una membrana (ChomaSorb, Sartobind Q, Mustang Q) y en una resina (HiTrap Q FF).
Tabla X
MAb I (mg/mL) recuperacion de MAb I HCP (ng/mL) HCP (ppm) LRV de HCP
Medio AEX
AEX solo AEX despues A.C. AEX solo AEX despues A.C. AEX solo AEX despues A.C. AEX solo AEX despues A.C. AEX solo AEX despues A.C.
no medio AEX
ND 8,82 ND 96% 5,701 738 618 84 ND 0,91
ChromaSorb
9,20 8,89 100% 96% 3,660 70 398 8 0,23 1,93
Sartobind Q
9,26 8,99 100% 97% 4,103 98 443 11 0,19 1,80
Mustang Q
9,17 8,86 99% 96% 4,001 120 436 14 0,19 1,70
Q Fast Flow
9,20 8,76 100% 95% 4,245 81 462 9 0,17 1,86
NA - No aplicable
Ejemplo 14. Tratamiento de flujo pasante de un eluato capturado por afinidad de MAb I con carbon activado seguido de medios de intercambio anionico con medios de intercambio anionico seguidos de carbon activado
El orden de carbon activado y medio de intercambio anionico para la eliminacion de impurezas por flujo pasante de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Protema A) se examino para demostrar que el orden de los dos adsorbentes ejercfa inesperadamente influencia sobre su eficacia. El experimento ilustra que la colocacion del carbon activado antes del medio de intercambio anionico es importante para maximizar la capacidad de la combinacion de adsorbentes para eliminar las impurezas de disoluciones proteicas.
Se preparo un eluato capturado por afinidad parcialmente purificado MAb I (Protema A) segun el Ejemplo 5. El eluato de MAb I se ajusto de aproximadamente pH 5 a pH 7 con base Tris (2 M) y se filtro a traves de una unidad de filtro de 0,22 micras Millipore Express Plus Stericup. La disolucion es referida en la presente memoria como el eluato Protema A MAb I.
Las columnas de cromatograffa Omnifit (diametro de 10 mm, longitud de 100 mm) se cargaron con 250 mg de carbon activado HD Nuchar en suspension en agua para proporcionar un volumen de columna rellena de 1 mL. Las columnas se equilibraron con disolucion tampon (tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7). Un dispositivo de membrana de 0,2 mL ChromaSorb, fabricado como se describe anteriormente en el Ejemplo 7, tambien se equilibro con disolucion tampon (tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7). Se ensamblaron dos trenes de flujo pasante. El primero tema la columna de carbon activado seguida del dispositivo de membrana ChromaSorb, mientras que el segundo tema el orden inverso con el dispositivo de membrana ChromaSorb seguido de la columna de carbon activado. 96 mL del eluato de Protema A MAb I se hicieron pasar a traves de cada montaje a un caudal de 0,25 mL/min. Despues de pasar a traves de los trenes de purificacion, las disoluciones se analizaron con relacion a la concentracion de protema de la celula huesped (HCP) e IgG. El analisis HCP se realizo usando un kit ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., numero de catalogo F550, siguiente el protocolo del fabricante del kit. La concentracion IgG se midio usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna analftica de Protema A Poros® A. Los resultados se resumen en la Tabla XI.
Los resultados muestran el resultado inesperado de que el orden del carbon activado y un medio de intercambio anionico (ChromaSorb) aes importante para la eficacia de la purificacion de flujo pasante de un eluato capturado por afinidad (Protema A). El valor de reduccion del log (LRV) de la protema de la celula huesped (HCP) era 1,87 cuando se colocaba el carbon activado en frente del medio de intercambio anionico. El LRV de HCP se redujo a 1,38 cuando el medio de intercambio anionico se coloco en frente del carbon activado. El orden el carbon activado y el medio de intercambio anionico no tema influencia en la recuperacion del anticuerpo, que era del 97% para ambos ordenes de
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los adsorbentes. Los resultados revelan una importante comprension de que colocar el carbon activado antes del medio de intercambio anionico es importante para maximizar la efectividad de la combinacion de dos adsorbentes para eliminar impurezas de disoluciones proteicas.
Tabla XI
Tren de flujo pasante
MAb I (mg/mL) recuperacion de MAb I HCP (ng/mL) HCP (ppm) LRV de HCP
Sin tratar (control)
9,24 ND 4,986 540 ND
ChromaSorb seguido de carbon activado
8,95 97% 202 23 1,38
Carbon activado seguido de ChromaSorb
8,95 97% 65 7 1,87
NA - No aplicable
Ejemplo 15. Tratamiento por flujo pasante de un eluato capturado por no-afinidad de MAb I con carbon activado
Se examino el carbon activado en una aplicacion de flujo pasante para la eliminacion de impurezas de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por no-afinidad (Protema A) para demostrar que el carbon activado proporciona un metodo unico e inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas. Con relacion a un eluato capturado por no-afinidad, el eluato capturado por no-afinidad (intercambio cationico) contiene diferentes tipos de impurezas a niveles significativamente mayores. La aplicacion de carbon activado para la purificacion de un eluato capturado por no-afinidad demuestra que este metodo es general y se puede aplicar a la purificacion de una variedad de diferentes disoluciones proteicas.
Se preparo un eluato parcialmente purificado de CEX MAb I como se escribe en el Ejemplo 6. El eluato se diluyo por un factor de 4 con disolucion tampon (tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7). El eluato diluido de MAb I se ajusto de aproximadamente pH 6 a pH 7 con base Tris (2 M) y se filtro a traves de una unidad de filtro de 0,22 micras Millipore Express Plus Stericup. La disolucion es referida en la presente memoria como el eluato CEX MAb I.
La columna de cromatograffa Omnifit (diametro de 10 mm, longitud de 100 mm) se cargo con 250 mg de carbon activado HD Nuchar en suspension en agua para proporcionar un volumen de columna rellena de 1 mL. La columna se equilibro con una disolucion tampon (tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7).
A continuacion se hicieron pasar 70 mL del eluato CEX MAb I a traves de la columna de carbon activado a un caudal de 0,25 mL/min. Se recogieron siete fracciones de 10 mL del eluato. Se analizaron las muestras reunidas de todas las siete asf como las fracciones individuales con relacion a la concentracion de protema de celula huesped (HCP) e IgG. El analisis HCP se realizo usando un kit ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., numero de catalogo F550, siguiente el protocolo del fabricante del kit. La concentracion IgG se midio usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna analftica de Protema A Poros® A. Los resultados se resumen en la Tabla XI.
Como se representa en la Figura 16 y se resume en la Tabla XII a continuacion, los resultados muestran que la purificacion por flujo pasante con carbon activado era inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por no-afinidad (Protema A). El medio de captura basado en no- afinidad (intercambio cationico) se une a mas impurezas junto con el anticuerpo monoclonal que el medio de captura basado en afinidad mas espedfico (Protema A). Por lo tanto, el eluato capturado por no afinidad contiene diferentes tipos de impurezas a niveles significativamente mayores. El carbon activado proporcionaba un valor de reduccion de log (LRV) de protema de la celula huesped (HCP) de 0,76 y tema 89% de recuperacion del producto de anticuerpo monoclonal. Estos resultados sugieren que se puede usar carbon activado para eliminar impurezas de una variedad de diferentes disoluciones proteicas.
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Tren de flujo pasante
MAb I (mg/mL) recuperacion de MAb I HCP (ng/mL) HCP (ppm) LRV de HCP
Sin tratar (control)
3,13 ND 66,269 21,172 ND
Columna de carbon activado
2,79 89% 10,343 3,707 0,76
NA - No aplicable
Ejemplo 16. Purificacion por flujo pasante de un eluato capturado por afinidad de MAb I con una columna rellena de carbon activado y un dispositivo de celulosa-carbon activado
Se examino el carbon activado rellenado en una columna o mezclado en una lamina de celulosa en una aplicacion de flujo pasante para la eliminacion de impurezas de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Protema A) para demostrar que el carbon activado proporciona un metodo unico e inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas en diferentes formatos.
Se preparo un eluato capturado por afinidad parcialmente purificado MAb I (Protema A) segun el Ejemplo 5. El eluato de MAb I se ajusto de aproximadamente pH 5 a pH 7 con base Tris (2 M) y se filtro a traves de una unidad de filtro de 0,22 micras Millipore Express Plus Stericup. La disolucion es referida en la presente memoria como el eluato Protema A MAb I.
Las columnas de cromatograffa Omnifit (diametro de 15 mm, longitud de 100 mm) se cargaron con 600 mg de carbon activado HD Nuchar en suspension en agua para proporcionar un volumen de columna rellena de 2.4 mL. El medio de carbon activado-lamina de celulosa impregnada, comercialmente disponible en un dispositivo Millistak+ Pod CR de Millipore Corporation, Billerica, MA, se coloco en un dispositivo de jeringa de polipropileno sobremoldeado, con 25 mm de area de filtracion interna, 4,6 mL de volumen de lecho, equipado con conectores Luer para entrada y salida.
La columna y el dispositivo de carbon activado-celulosa se equilibraron con disolucion tampon (tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7). Se ensamblaron dos trenes de flujo pasante. El primero tema la columna de carbon activado mientras que el segundo tema el dispositivo carbon activado-celulosa. 315 mL del eluato de Protema A MAb I se hicieron pasar a continuacion a traves de cada montaje a un caudal de 0,75 mL/min. Despues de pasar a traves de los trenes de purificacion, las disoluciones se analizaron con relacion a la concentracion de protema de la celula huesped (HCP) e IgG. El analisis HCP se realizo usando un kit ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., (numero de catalogo F550), siguiente el protocolo del fabricante del kit. La concentracion IgG se midio usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna analftica de Protema A Poros® A. Los resultados se resumen en la Tabla XIII.
Los resultados muestran que la purificacion por flujo pasante con carbon activado era inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Protema A) cuando se rellenaba en una columna o se mezclaba en una lamina de celulosa. El carbon activado rellenado en una columna o mezclado en una lamina de celulosa teman ambos valores de reduccion de log (LRV) de protema de la celula huesped (HCP) muy similares de 0,95 y 0,97 respectivamente. Tambien teman recuperaciones muy similares de producto de anticuerpo monoclonal de 9l % para la columna y 87% para la lamina de celulosa. Estos resultados sugieren que el carbon activado se puede usar de forma eficaz para la eliminacion de impurezas de disoluciones proteicas cuando se mezcla en una lamina de celulosa.
Tabla XIII
Tren de flujo pasante
MAb I (mg/mL) recuperacion de MAb I HCP (ng/mL) HCP (ppm) LRV de HCP
Sin tratar (control)
9,79 ND 6,229 642 ND
Columna de carbon activado Nuchar
8,92 91% 682 76 0,95
dispositivo de carbon activado-celulosa
8,53 87% 620 73 0,97
NA - No aplicable
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Ejemplo 17. Purificacion por flujo pasante de un eluato capturado por afinidad de MAb I con otros dos tipos de carbon activado
Se examinaron otros dos tipos de carbon activado comercialmente disponibles en una aplicacion de flujo pasante para la eliminacion de impurezas de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Protema A) para demostrar el resultado inesperado de que se pueden usar una variedad de diferentes carbones activados para la eliminacion de impurezas de disoluciones proteicas.
Se preparo un eluato capturado por afinidad parcialmente purificado MAb I (Protema A) segun el Ejemplo 5. El eluato de MAb I se ajusto de aproximadamente pH 5 a pH 7 con base Tris (2 M) y se filtro a traves de una unidad de filtro de 0,22 micras Millipore Express Plus Stericup. La disolucion es referida en la presente memoria como el eluato Protema A MAb I.
Se cargaron columnas de cromatograffa Glass Omnifit (5 mm de diametro, 100 mm de longitud) con 125 mg de carbon activado Chemviron Pulsorb PGC (Chemviron Carbon, Feluy, Belgica) o carbon activado Norit A Supra USP (Norit Americas Inc., Marshall, Texas, EE.UU.) en suspension en agua para dar un volumen de columna rellena de 0,24 mL. Las columnas se equilibraron con disolucion tampon (tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7). Se ensamblaron dos trenes de flujo pasante. El primero tema la columna de carbon activado Chemviron Pulsorb PGC mientras que el segundo tema la columna de carbon activado Norit A Supra USP. 96 mL del eluato de Protema A MAb I se hicieron pasar a traves de cada montaje a un caudal de 0,25 mL/min. Despues de pasar a traves de los trenes de purificacion, las disoluciones se analizaron con relacion a la concentracion de protema de la celula huesped (HCP) e IgG. El analisis HCP se realizo usando un kit ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., (numero de catalogo F550), siguiendo el protocolo del fabricante del kit. La concentracion IgG se midio usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna analftica de Protema A Poros® A. Los resultados se resumen en la Tabla XIV.
Los resultados muestran que la purificacion por flujo pasante con otros dos tipos de carbon activado era inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Protema A). La Chemviron Pulsorb PSG y Norit A Supra USP ambos eliminaban impurezas con valores de reduccion de log (LRV) de protema de la celula huesped (HCP) de 0,40 y 0,48 respectivamente. Tambien teman recuperaciones excelentes del producto de anticuerpo monoclonal de 100% para Chemviron Pulsorb PSG y 100% para Norit A Supra USP. Estos resultados sugieren que se pueden usar diversos tipos diferentes de carbon activado para la eliminacion de impurezas de disoluciones proteicas.
Tabla XIV
Tren de flujo pasante
MAb I (mg/mL) recuperacion de MAb HCP (ng/mL) HCP (ppm) LRV de HCP
Sin tratar (control)
7,15 ND 1026 144 ND
Chemviron Pulsorb PGC
7,18 100% 409 57 0,40
Norit A Supra USP
7,17 100% 341 48 0,48
NA - No aplicable
Ejemplo 18. Purificacion por flujo pasante de un eluato capturado por afinidad de MAb I en presencia de diferentes sales tampon
Se examino el carbon activado en una aplicacion de flujo pasante para la eliminacion de impurezas de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Protema A) con diversas sales diferentes anadidas para demostrar que el carbon activado proporciona un metodo unico e inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas en presencia de muchas sales diferentes. La investigacion ilustra que este metodo es general y se puede aplicar a la purificacion de protemas en una variedad de sales tampon diferentes.
Se preparo un eluato capturado por afinidad parcialmente purificado MAb I (Protema A) segun el Ejemplo 5. El eluato de MAb I se ajusto de aproximadamente pH 5 a pH 7 con base Tris (2 M) y se filtro a traves de una unidad de filtro de 0,22 micras Millipore Express Plus Stericup. La disolucion es referida en la presente memoria como el eluato Protema A MAb I.
A una parte de 50 mL del eluato de Protema A MAb I, se anadieron 10 mL de disolucion acuosa que contema 300 mM de diversas sales, donde las sales eran sulfato de amonio, sal de disodio de acido etilendiaminotetraacetico deshidratada (EDTA), acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico (MES), cloruro de sodio, citrato de trisodio deshidratado,
fosfato de sodio dibasico heptahidratado y cristales Trizma® Pre-set, pH 7,0 (Tris-HCl).
Se uso como control una disolucion diluida con 10 mL de agua. El pH del eluato de Protema A con adicion de sal se ajusto a de nuevo a pH 7 con base Tris 2 M o acido acetico 3 M. La disolucion es referida en la presente memoria como el eluato Protema A MAb I con sal anadida.
5 Las columnas de cromatograffa Omnifit (diametro de 5 mm, longitud de 100 mm) se cargaron con 125 mg de carbon activado HD Nuchar en suspension en agua para proporcionar un volumen de columna rellena de 0.5 mL. Las columnas se equilibraron con disolucion tampon (tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7). 40 mL del eluato de Protema A MAb I con sal anadida se hace pasar a traves de las columnas de carbon activado a un caudal de 0,125 mL/min. Despues de pasar a traves de las columnas, las disoluciones se analizaron con relacion a la concentracion de 10 protema de la celula huesped (HCP) e IgG. El analisis HCP se realizo usando un kit ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., (numero de catalogo F550), siguiendo el protocolo del fabricante del kit. La concentracion IgG se midio usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna analftica de Protema A Poros® A. Los resultados se resumen en la Tabla XV.
Los resultados muestran que la purificacion por flujo pasante de un eluato de anticuerpo monoclonal capturado por 15 afinidad (Protema A) con carbon activado era inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas en presencia
de una variedad de diferentes aditivos de sales. Las impurezas eliminadas con carbon activado en presencia de todas las sales anadidas con valores de reduccion de log (LRV) de protema de la celula huesped (HCP) oscilaban de 0,63 a 1,00. Tambien teman excelentes recuperaciones del producto de anticuerpo monoclonal que oscilaba entre 92% a 96%. Estos resultados sugieren que el carbon activado se puede usar para la eliminacion de impurezas 20 de disoluciones proteicas en una variedad de diferentes tampones salinos.
Tabla XV
MAb I (mg/mL) HCP (ng/mL) HCP (ppm) LRV de HCP
sal anadida
antes A.C. Despues A.C. recuperacion de MAb I antes A.C. Despues A.C. antes A.C. Despues A.C.
solo agua (control)
7,33 6,86 94% 987 76 135 11 1,08
Tris
6,99 6,68 96% 1,194 119 171 18 0,98
Cloruro sodico
6,58 6,33 96% 1,151 111 175 17 1,00
sulfato de amonio
6,93 6,66 96% 1,359 177 196 27 0,87
fosfato de disodio
6,92 6,59 95% 1,293 153 187 23 0,90
citrato de sodio
6,53 6,03 92% 1,351 241 207 40 0,71
EDTA
6,71 6,39 95% 1,304 293 194 46 0,63
MES
6,90 6,54 94% 1,110 132 161 20 0,90
Ejemplo 19. Purificacion por flujo pasante de eluato de Protema A a pH 5 y pH 7
Se examino el carbon activado en una aplicacion de flujo pasante para la eliminacion de impurezas de un eluato de 25 anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Protema A) a dos condiciones de pH diferentes para demostrar que el carbon activado proporciona un metodo unico e inesperadamente eficaz para la eliminacion por flujo pasante de impurezas a diferentes condiciones de pH de la disolucion. La investigacion ilustra que este metodo es general y se puede aplicar a la purificacion de protemas en diferentes condiciones de pH.
Se preparo un eluato capturado por afinidad parcialmente purificado MAb I (Protema A) segun el Ejemplo 5. La 30 disolucion es referida en la presente memoria como el eluato Protema A MAb I pH 5.
Una parte del eluato de MAb I preparado segun el Ejemplo 5 se ajusto de aproximadamente pH 5 a pH 7 con base
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Tris (2 M) y se filtro a traves de una unidad de filtro de 0,22 micras Millipore Express Plus Stericup. La disolucion es referida en la presente memoria como el eluato Protema A MAb I pH 7.
Las columnas de cromatograffa Omnifit (diametro de 15 mm, longitud de 100 mm) se cargaron con 1,25 g de carbon activado HD Nuchar en suspension en agua para proporcionar un volumen de columna rellena de 5 mL. Las columnas se equilibraron con disolucion tampon (tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 7). A continuacion se hacen pasar a traves de la columna activada 500 mL del eluato de Protema A MAb I de pH 5 o el eluato de Protema A MAb I de pH 7 a un caudal de 1,25 mL/min. Despues de pasar a traves de los trenes de purificacion, las disoluciones se analizaron con respecto a la concentracion de protema de la celula huesped (HCP) e IgG. El analisis HCP se realizo usando un kit ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., (numero de catalogo F550), siguiendo las instrucciones del fabricante del kit. La concentracion IgG se midio usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna anafftica de Protema A Poros® A. Los resultados se resumen en la Tabla XVI.
Los resultados muestran que la purificacion por flujo pasante de eluato de anticuerpo monoclonal capturado por afinidad (Protema A) con carbon activado era inesperadamente eficaz para la eliminacion de impurezas tanto a pH 5 como a pH 7.El carbon activado eliminaba impurezas con valores de reduccion del log (LRV) de protema de la celula huesped (HCP) de 0,85 a pH 5 y 1,15 a pH 7. El carbon activado tambien tema excelentes recuperaciones del anticuerpo monoclonal con 97% a pH 5 y 101% a pH 7. Estos resultados sugieren que se pueden usar diversos tipos diferentes de carbon activado para la eliminacion de impurezas de disoluciones proteicas a diferentes condiciones de pH.
Tabla XVI
MAb I (mg/mL) HCP (ng/mL) HCP (ppm)
pH
antes A.C. Despues A.C. recuperacion de MAb I antes A.C. Despues A.C. antes A.C. Despues A.C. LRV de HCP
5
9,22 8,98 97% 3,429 486 371 54 0,85
7
8,61 8,68 101% 1,774 124 206 14 1,15
Ejemplo 20. La purificacion por flujo pasante de un eluato de Protema A preparado usando cromatograffa continua.
Este experimento representativo demuestra que el carbon activado y un dispositivo de cromatograffa de intercambio anionico se puede usar para purificar un eluato de Protema A obtenido usando cromatograffa multicolumna continua (CMC).
En este ejemplo, se purifica un anticuerpo monoclonal (MAb II) usando un metodo de cromatograffa multicolumna continua (CMC) de tres columnas usando resina Protema A Prosep® Ultra Plus, como se describe en la Solicitud de Patente Europea No. EP12002828.7, en tramitacion con la presente. El eluato de Protema se reune y se procesa a traves de un dispositivo de carbon activado seguido de un dispositivo de cromatograffa de intercambio anionico (es decir, ChromaSorb™), como se describe en el Ejemplo 12.
Como se demuestra en la Figura 18, se obtiene la purificacion exitosa del anticuerpo monoclonal, media por la reduccion de la concentracion de HCP por debajo de 10 ppm, cuando se usa una combinacion de carbon activado y un dispositivo de cromatograffa de intercambio anionico.
Ejemplo 21. Conectando varias etapas de eliminacion de impurezas por flujo pasante
En este experimento representativo, se demuestra la viabilidad de conectar varias etapas de eliminacion de impurezas en modo de flujo pasante para operar como una etapa de proceso o de procedimiento unitaria unica, al mismo tiempo que se cumplen los objetivos de pureza y rendimiento.
En este ejemplo, estan conectados dispositivos individuales, es decir, un dispositivo de carbon activado, un dispositivo de cromatograffa de intercambio anionico (es decir, ChromaSorb™), un dispositivo de intercambio cationico y un dispositivo de filtracion de virus (es decir, Viresolve® Pro) para operar en modo de flujo pasante. Ademas, estan posicionados un tanque de compensacion y/o un mezclador en lmea estatico entre los dispositivos de cromatograffa de intercambio anionico y de cromatograffa de intercambio cationico, para conseguir un cambio del pH. Por ultimo, se posiciona un filtro opcional corriente arriba del dispositivo de carbon activado, en caso de que la nuestra que se va a purificar este turbia.
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La Figura 19 muestra una representacion esquematica de la instalacion experimental para realizar una etapa del proceso de purificacion de flujo pasante, que incluye los dispositivos descritos siguientes.
Adicionalmente, tambien se pueden incluir en una instalacion las bombas, valvulas, sensores, etc.
Todos los dispositivos se pueden humedecer individualmente en una estacion diferente, y ensamblarse despues. Los dispositivos se humedecen y se pre-tratan segun el protocolo del fabricante. Brevemente, el filtro profundo (calidad A1HC) se sobrealimenta con 100 L/m2 de agua seguido de 5 volumenes de tampon de equilibrado 1 (EB1; tampon de elucion de Protema A ajustado a pH 7,5 con Tris-base1 M, pH 11). Se rellenan 2,5 mL de carbon activado en una columna de 2,5 cm Omnifit como se describe en el Ejemplo 12, para producir la carga del anticuerpo de 0,55 kg/L. La columna se sobrealimenta con 10 CV de agua, y despues se equilibra con EB1 hasta que el pH se estabiliza a pH 7,5. Dos dispositivos ChromaSorb (0,2 y 0,12 mL) se conectan en serie para conseguir una carga de 4,3 kg/L. Los dispositivos se humedecen con agua a 12,5 CV/min durante al menos 10 min, seguido de 5 DV (Volumenes del Dispositivo) de EB1. Se usan un mezclador estatico helicoidal desechable (Koflo Corporation, Cary, IL) con 12 elementos para realizar los ajustes de pH en finea. Se conectan en paralelo dos dispositivos de intercambio cationico de 1,2 mL para la eliminacion de los agregados. La carga MAb en los dispositivos CEX es de aproximadamente 570 mg/mL. Estos dispositivos se humedecen con 10 DV de agua, seguido de 5 DV de tampon de equilibrado 2 (EB2; EB1 Ajustado a pH 5,0 usando acido acetico 1 M). Los dispositivos se tratan adicionalmente con 5 DV (volumenes del dispositivo) de EB2 + NaCl 1 M, y despues se equilibran con 5 DV de EB2. Un dispositivo de A 3,1 cm2 VireSolve® Pro se humidifica con agua presurizada a 30 psi durante al menos 10 min. El caudal se monitoriza a continuacion cada minuto hasta que el caudal permanece constante durante 3 minutos consecutivos. Despues de que todos los dispositivos se humedecen y equilibran, se conectan como se muestra en la Figura 19. EB1 se hace pasar a traves de todo el sistema hasta que todas las lecturas de presion y todas las lecturas de pH se estabilizan. Despues del equilibrado, la alimentacion se hace pasar a traves del tren de flujo pasante. Durante el paso, las muestras se recogen antes del tanque de compensacion y despues de Viresolve® Pro para monitorizar la concentracion IgG y los niveles de impurezas (HCP, ADN, PrA lixiviado y agregados). Despues de que se procesa la alimentacion, el sistema se sobrealimenta con 3 volumenes muertos de EB1 para recuperar la protema en los dispositivos y en las tubenas.
La alimentacion para el proceso de flujo pasante conectado es eluato de protema A de MAb II, producido en un proceso de protema A discontinuo. El nivel natural de agregados en este MAb no excede 1%, asf que se desarrollo un procedimiento especial para aumentar el nivel de agregados. El pH de la disolucion pH se eleva a 11 con NaOH acuoso NaOH, con agitacion suave, y se mantuvo durante 1 hora. A continuacion el pH se baja lentamente a pH 5 con HCl acuoso con agitacion suave. El ciclo de pH se repite 4 veces mas. El nivel final de agregados es de aproximadamente 5%, consistiendo la mayor parte en dfmeros y tnmeros de MAb medidos por SEC. A continuacion se dializa la alimentacion en tampon Tris-HCl, pH 7,5, conductividad de aproximadamente 3 mS/cm.
La cantidad de alimentacion de MAb procesada para este ensayo es 102 mL de 13,5 mg/mL de MAb a un caudal de 0,6 mL/min.
El punto final HCP como una funcion del tiempo despues de ChromaSorb™ esta por debajo del fimite superior de 10 ppm (Figura 20). Los agregados son reducidos de 5% a 1,1% por el dispositivo CEX (Figura 21). El rendimiento de MAb II del proceso conectado es 92%. La produccion en el dispositivo Viresolve® Pro es >3,7 kg/m2.
De acuerdo con esto, el ejemplo anterior demuestra que se pueden conectar diversos dispositivos para operar en un modo de flujo pasante satisfactoriamente, alcanzando de ese modo la pureza deseada del producto y los rendimientos deseados.
Ejemplo 22. Etapa del proceso de purificacion de flujo pasante conectora con etapa de captura de cromatografia de elucion y union continua.
En este experimento representativo, un proceso de purificacion de flujo pasante, como se describe en la presente memoria, se unio directamente a un proceso de captura de cromatografia union y elucion, que precede la purificacion de flujo pasante.
En este ejemplo, se produce un anticuerpo monoclonal basado en CHO (MAbII) en un biorreactor de alimentacion discontinua. Se pone en contacto un total de 7 L de cultivo celular con una disolucion de pofimero de respuesta de esfimulos para obtener una concentracion de pofimero de respuesta de esfimulos final de 0,2 % v/v. Se deja que el cultivo celular se mezcle durante aproximadamente 10 minutos. Se anaden 175 mL de disolucion K2HPO4 2M y se deja que se mezcle durante 10 minutos mas. El pH se eleva despues a 7,0 con base tris 2 M y se deja que se mezcle durante 15 minutos. A continuacion se centrifuga la disolucion en aficuotas de 2 L a 4,500 x g durante 10 minutos y el sobrenadante se decanta y se retiene. Los solidos se separan. El sobrenadante del cultivo celular se vierte y despues se mezcla con NaCl 5 M en una proporcion 1:10 en modo discontinuo con agitacion continua. La conductividad final de la disolucion se mide en este punto y es a 55 ± 5 mS/cm. La disolucion resultante de NaCl con concentracion mas elevada se filtra en condiciones esteriles a traves de un filtro Express de 0,22 pm. La disolucion filtrada esteril es el material de carga para la cromatografia de Protema A.
La etapa de captura de protema A consiste en dos columnas de protema A que operan con un metodo en un Akta
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Explorer 100. Las columnas de protema A tienen 10 mL de medio de protema A ProSep® Ultra Plus rellenado en columnas de cromatograffa de 1,6 cm de DI Vantage-L (EMD Millipore) a alturas de lecho de 10,25 y 10,85 cm. Las columnas se equilibran con 1X TBS, NaCl 0,5 M para 5 volumenes de columna, CV (todos los volumenes de columna se basan en la columna mas pequena). A traves del ensayo, el caudal de carga se fija para tener un tiempo de residencia de aproximadamente un minuto. Durante la carga inicial, ambas columnas se colocan en serie, donde el efluente de la columna primaria se carga directamente en la columna secundaria hasta que se alcanza un volumen de carga espedfico. Despues de que se pasa sobre las columnas un volumen de carga espedfico, se para la alimentacion y se pasan dos CV del tampon de equilibrado a traves de la columna primaria a la columna secundaria. La columna primaria se posiciona a continuacion para sufrir un lavado, elucion, limpieza y reequilibrado, mientras que la columna secundaria se carga como la columna primaria. Despues del reequilibrado de la primera columna, esa columna se mueve a la posicion secundaria para residir en serie con la ahora columna primaria. Esta serie de sucesos se repite con cada columna tomado la posicion primaria despues de que la columna en posicion primaria original se carga a un volumen fijado. Cada columna se carga un total de siete veces. Las eluciones para cada columna se recogen con un recogedor de fracciones, usando un desencadenante UV para controlar el tiempo de comienzo de la elucion y recogido a un volumen constante de aproximadamente 3,5 CV.
El tren de purificacion de flujo pasante consiste en seis dispositivos principales: filtro profundo opcional (para precipitar lo eliminado despues del ajuste de pH a 7,5); carbon activado; ChromaSorb™; mezclador estatico y/o tanque de compensacion para el ajuste del pH en lmea; dispositivo de intercambio cationico de flujo pasante para la eliminacion de agregados (dispositivo CEX); y dispositivo de filtracion de virus (es decir, Viresolve® Pro).
La Figura 19 ilustra el orden en que se conectan estos dispositivos.
Todos los dispositivos se humedecen individualmente en una estacion diferentes, y despues de ensamblan como se muestra en la Figura 19. Los dispositivos se humedecen y se pretratan segun el protocolo del fabricante como se describe antes. Brevemente, el filtro profundo (AIHC) se sobrealimenta con 100 L/m2 de agua seguido de 5 volumenes de tampon de equilibrado 1 (EB1; tampon de elucion de PrA ajustado a pH 7,5 con Tris-base1 M , pH 11). 10 mL de carbon activado se rellenan en una columna Omnifit de 2,5 cm como se describe en el Ejemplo 12. La columna se sobrealimenta con 10 CV de agua, y despues se equilibra con EB1 hasta que el pH se estabiliza a pH 7,5. 1,2 mL de membrana ChromaSorb (7 capas) se amontonan en un dispositivo de 47 mm de diametro Swinex. El dispositivo se humedece con agua a 12,5 CV/min durante al menos 10 min, seguido de 5 volumenes de dispositivo (DV) de EB1.1 Se usan un mezclador estatico helicoidal desechable (Koflo Corporation, Cary, IL) con 12 elementos para realizar los ajustes de pH en lmea. Un dispositivo de cromatograffa de intercambio cationico de 3 capas (0,12 mL de volumen de membrana) se humedece con 10 DV de agua, seguido de 5 DV de tampon de equilibrado 2 (EB2: EB1 Ajustado a pH 5,0 usando acido acetico 1 M). El dispositivo se ajusta adicionalmente con 5 DV de EB2 + NaCl 1M, y despues de equilibra con 5 DV de EB2. Un dispositivo de filtracion de 3,1 cm2 Viresolve® Pro virus se humedece con agua presurizada a 30 psi durante al menos 10 minutos. El caudal se monitoriza despues cada minuto hasta que el caudal permanece constante durante 3 minutos consecutivos. Despues de que todos los dispositivos se humedecen y equilibran, se conectan como se muestra en la Figura 19. EB1 se hace pasar a traves de todo el sistema hasta que todas las lecturas de presion y todas las lecturas de pH se estabilizan. Despues del equilibrado, la alimentacion (elucion de PrA ajustada a pH 7,5) se hace pasar a traves del tren de purificacion de flujo pasante. Durante el paso, las muestras se recogen antes del tanque de compensacion y despues de Viresolve® Pro para monitorizar la concentracion IgG y los niveles de impurezas (HCP, ADN, PrA lixiviado y agregados). Despues de que se procesa la alimentacion, el sistema se sobrealimenta con 3 volumenes muertos de EB 1para recuperar la protema en los dispositivos y en las tubeffas.
La Figura 22 muestra las lecturas de presion antes de la filtracion profunda, carbon activado y ViresolvePro. La presion en el filtro profundo permanece sin cambiar durante la mayor parte del ensayo, pero aumenta hacia el final sugiriendo algo de precipitacion de las fracciones de alimentacion de elucion de protema A hacia el final del ensayo de Protema A. La columna de carbon activado permanece bastante protegida de cualquier precipitado debido al filtro profundo aguas arriba del carbon activado. La presion ViresolvePro aumenta despacio con el tiempo, pero esta muy por debajo del lfmite de operacion maximo (50 psi).
El HCP final en el conjunto de fracciones ViresolvePro es < 1 ppm (Tabla XVI). La Protema A lixiviada media en las fracciones de elucion es de 32 ppm. La Protema A lixiviada en el conjunto de fracciones Viresolve® Pro es 4 ppm. Los agregados se reducen de 1% a 0,4%. La tabla XVII a continuacion representa los resultados de un experimento para investigar el comportamiento de la purificacion de flujo pasante cuando se conecta con una etapa de proceso de cromatograffa de union y elucion continua.
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Tabla XVII
Rendimiento de la Purificacion de Flujo Pasante (%)
97.8%
HCP medio de todas las eluciones PrA al conjunto de fracciones ViresolvePro (ppm)
172 ^ 1,75
Agregados en el conjunto de fracciones ViresolvePro (%)
1 ^ 0,4%
PrA lixiviada en el conjunto de fracciones ViresolvePro (ppm)
t CM CO
Produccion de ViresolvePro (kg/m2)
>6,1
Factor de dilucion post-Protema A
1,15x
Ejemplo 23. Eliminacion de una impureza de un componente de cultivo celular usando carbon activado.
En este experimento representativo, se demuestra que las impurezas potenciales del cultivo celular que pueden persistir durante la etapa de captura de afinidad de Protema A son eliminadas por el carbon activado.
Un componente comun del medio de cultivo celular, la insulina, un estimulador del crecimiento de las celulas mairnferas, esta presente tfpicamente en el medio de cultivo celular en concentraciones de 1-20 mg/L. La Insulina Humana Recombinante (Incelligent AF de EMD Millipore Corp.) se disuelve en tampon Tris 50mM pH 7,0 a 1 mg/mL, se anaden anticuerpo monoclonal MAb II a una concentracion de 7g/L. Se rellena una columna de vidrio Omnifit con carbon activado HD Nuchar. La disolucion se hace fluir a traves de la columna a una velocidad constante de 0,25 CV/min, a una carga de MAb II total de 1kg/L. El conjunto de fracciones de flujo pasante se analiza para determinar la concentracion de insulina y anticuerpos. Para el analisis, se uso un sistema Agilent HPLC equipado con una columna HC18 (Cadenza); disolvente A: 0,1% TFA en agua; disolvente B 0,1 % TFA en Acetonitrilo; Se uso un gradiente optimizado de 5%-30% B durante 15 minutes para detectar la insulina mediante absorbancia UV A214. Primero, se creo una curva de calibracion usando disoluciones estandar de insulina en presencia de anticuerpo. No se ha detectado insulina en el efluente de la columna de carbon activado, lo que indicaba que el carbon activado tema capacidad para la insulina en presencia de MAb, en exceso de 240 mg/g.
Ejemplo 24. Eliminacion de impurezas de flujo pasante de una disolucion turbia de eluato capturado por afinidad de MAb II con medio celulosico de carbon activado
En este experimento representativo, se ha demostrado que el carbon activado es unico e inesperadamente eficaz para la eliminacion de HCP derivado de alimentaciones microbianas. Una disolucion de lisado de E. coli se mezclo con anticuerpo monoclonal mAb a 1,5 mg/mL. La alimentacion mezclada se trato con carbon activado rellenado en una columna en condiciones de flujo pasante.
Las celulas de un cultivo de E. coli se recuperaron por centrifugado. El sobrenadante se separo por decantacion y el pelet celular remanente se suspendio en un tampon de lisis (Tris 25 mM, EDTA 0,1 mM a pH 7) mediante agitacion y sacudidas vigorosas. Despues se anadio una porcion de 0,4 mL de una disolucion madre de PMSF 100 mM en etanol. La suspension se separo en fracciones (~100 mL cada una) y se sometio a sonicacion con 3 s de encendido y 4 s de apagado durante 5 min. Despues de la sonicacion el material se reunio y se almaceno a - 80 grados durante 48 horas. Despues la disolucion se descongelo y centrifugo a 4.500 x g durante 2 horas para eliminar las celulas lisadas. El sobrenadante se filtro con una membrana Stericup-HV de 0,45 pm Durapore (1000 mL, numero de catalogo: SCHVU11RE, Millipore Corp. Billerica, MA, 01821, eE.UU.). Despues se filtro a traves de una membrana Stericup-GP 0,22 pm Millipore Express PLUS (1000 mL, numero de catalogo: SCGPU11RE, Millipore Corp. Billerica, MA, 01821, EE.UU.). El lisado filtrado se combino despues con 7,5 mL de 10 mg/mL de una disolucion de mAb para proporcionar una disolucion mezclada con 1,5 mL del mAb. El pH de la disolucion medido era 7,7.
Una columna de cromatograffa de vidrio Omnifit (diametro 10 mm, longitud 100 mm) se cargo con 250 mg de carbon activado Nuchar HD (MeadWestvaco Corporation, Richmond, VA, EE.UU.) en suspension en agua para dar un volumen de columna rellena de 1 mL. La columna se equilibro con tampon Tris 25 mM a pH 7. Despues 42 mL del lisado de E coli mezclado con mAb se hizo pasara traves de la columna de carbon activado a un caudal de 0,25 mL/min dando un tiempo de residencia de 4 minutos en el carbon activado. El control y una muestra del conjunto de fracciones se enviaron para analisis de concentracion de protema de la celula huesped (HCP) e IgG.
El analisis HCP se realizo usando un kit E. Coli HCP ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., (numero de catalogo F410), siguiendo las instrucciones del fabricante del kit. La concentracion IgG se midio usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna analftica de Protema A Poros® A. Los resultados muestran que el carbon activado era inesperadamente eficaz para la eliminacion selectiva
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de HCP derivado de una alimentacion microbiana. La concentracion de HCP en el lisado se redujo de 206.000 ng/mL (133.00 ppm) a 119.000 ng/mL (77.800 ppm) mientras que la recuperacion del mAb era 99% comenzando a una concentracion de 1,55 g/L y recuperado a 1,53 g/L. Este ejemplo demuestra que el carbon activado se puede usar para eliminar HCP de celulas no mairffferas.
Ejemplo 25. Eliminacion de impurezas de una disolucion turbia de eluato capturado por afinidad de MAb II con medio de carbon activado-celulosa y un medio de intercambio anionico
En este experimento, se demostro que el carbon activado solo y en combinacion con un medio de intercambio ionico es unico e inesperadamente eficaz para la eliminacion de HCP derivado de alimentaciones microbianas despues de una etapa de captura.
Una disolucion de lisado de E. coli se mezclo con anticuerpo monoclonal mAb a 1,5 mg/mL y despues se capturo con cromatograffa de Protema A. La alimentacion capturada se trato con carbon activado rellenado en una columna en condiciones de flujo pasante y despues por una membrana ChromaSorb™ AEX.
Las celulas de un cultivo de E. coli se recuperaron por centrifugado. El sobrenadante se separo por decantacion y el pelet celular remanente se suspendio en un tampon de lisis (Tris 25 mM, EDTA 0,1 mM a pH 7) mediante agitacion y sacudidas vigorosas. Despues se anadio una porcion de 0,4 mL de una disolucion madre de PMSF 100 mM en etanol. La suspension se separo en fracciones (~100 mL cada una) y se sometio a sonicacion con 3 s de encendido y 4 s de apagado durante 5 min. Despues de la sonicacion el material se reunio y se almaceno a - 80 grados durante 48 horas. Despues la disolucion se descongelo y centrifugo a 4.500 x g durante 2 horas para eliminar las celulas lisadas. El sobrenadante se filtro con una membrana Stericup-HV de 0,45 pm Durapore (1000 mL, numero de catalogo: SCHVU11RE, Millipore Corp. Billerica, MA, 01821, eE.UU.). Despues se filtro a traves de una membrana Stericup-GP 0,22 pm Millipore Express PLUS (1000 mL, numero de catalogo: SCGPU11RE, Millipore Corp. Billerica, MA, 01821, EE.uU.). El lisado filtrado se combino despues con 7,5 mL de 10 mg/mL de una disolucion de mAb para proporcionar una disolucion mezclada con 1,5 mL del mAb. El pH de la disolucion medido era 7,7. El mAb en el lisado mezclado se capturo despues con cromatograffa de Protema A. Despues se eluyeron 30 mL del mAb capturado a un pH bajo. El pH de elucion se elevo de 3-4 a 7 mediante la adicion gota a gota de Tris 1M y despues se filtro a traves de una membrana Stericup-GP 0,22 pm Millipore Express PLUS (250 mL, numero de catalogo: SCGPU02RE, Millipore Corp. Billerica, MA, 01821, EE.Uu.). 1 mL de la elucion con pH ajustado se dejo a un lado para analisis.
Una columna de cromatograffa de vidrio Omnifit (diametro 10 mm, longitud 100 mm) se cargo con 250 mg de carbon activado Nuchar HD (MeadWestvaco Corporation, Richmond, VA, EE.UU.) en suspension en agua para dar un volumen de columna rellena de 1 mL. La columna se equilibro con tampon Tris 25 mM a pH 7. Despues se hicieron pasar 29 mL de la elucion de cromatograffa de Protema A mAb a traves del carbon activado a 0,2 mL/min proporcionando un tiempo de residencia de 4 min. 1 mL de la elucion tratada con carbon activado se dejo a un lado para analisis.
Despues se humidifico con agua un dispositivo de 0,08 mL ChromaSorb™ (EMD Millipore Corp. Billerica, MA, 01821, EE.UU.) segun las instrucciones y despues se sobrealimento con Tris pH 7 25 mM. Despues se hicieron pasar 27 mL de la elucion tratada de carbon activado a traves del dispositivo ChromaSorb a un caudal de 0,5 mL/min dando un tiempo de residencia de 0,16 minutos. 1 mL de la elucion tratada con carbon activado y ChromaSorb se dejo a un lado para analisis.
Cada muestra se analizo de concentracion de protema de la celula huesped (HCP) e IgG. El analisis HCP se realizo usando un kit E. Coli HCP ELISA comercialmente disponible de Cygnus Technologies, Southport, NC, EE.UU., (numero de catalogo F410), siguiendo las instrucciones del fabricante del kit. La concentracion IgG se midio usando un sistema Agilent HPLC equipado con una columna anafftica de Protema A Poros® A.
Los resultados muestran que el carbon activado solo y en combinacion con una membrana AEX era inesperadamente eficaz para la eliminacion selectiva de HCP de la elucion capturada de una alimentacion microbiana. La concentracion de HCP en la elucion se redujo por el carbon activado de 86 ng/mL (7 ppm) a 8 ng/mL (0,7 ppm) mientras que la recuperacion del mAb era 97% comenzando a una concentracion de 11,5 g/L y recuperado a 11,2 g/L. La concentracion de HCP en la elucion tratada con carbon activado fue adicionalmente reducida por la membrana ChromaSorb AEX a 3 ng/mL (0,3 ppm) con una recuperacion global de 96% del mAb para dar una concentracion final de 11,1 g/L. Este ejemplo demuestra que el carbon activado solo y en combinacion con un medio AEX se puede usar para eliminar HCP derivado de celulas no mairffferas despues de una etapa de captura.
A menos que se indique otra cosa, todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes, cultivo celular, condiciones de tratamiento, etc., usadas en la memoria descriptiva, incluyendo reivindicaciones, deben entenderse como modificados en todos los casos por el termino "aproximadamente". En consecuencia, a menos que se indique lo contrario, los parametros numericos son aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretenden obtener mediante la presente invencion. A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el termino "al menos" que precede a una serie de elementos se refiere a cada elemento de la serie.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Un proceso de purificacion que comprende las etapas de:
    a) proporcionar un fluido de cultivo celular clarificado a un medio de afinidad de elucion y union;
    b) hacer salir el flujo de la etapa a) a traves de carbon activado;
    c) hacer salir el flujo de la etapa b) a traves de un medio de intercambio anionico; y
    d) hacer salir el flujo de la etapa c) a traves de un medio de intercambio cationico,
    en donde se reduce el nivel de una o mas impurezas.
  2. 2. El proceso de purificacion de protemas segun la reivindicacion 1, en donde la etapa de unir y eluir con un medio de afinidad se opera en:
    i) modo discontinuo donde el medio de afinidad se carga con protema diana, se detiene la carga, el medio se lava y se eluye, y se recoge el conjunto de fracciones de elucion;
    ii) modo semi-continuo, donde la carga se realiza de forma continua, mientras que la elucion es intermitente; o
    iii) modo completamente continuo, donde tanto la carga como la elucion se realizan de forma continua.
  3. 3. El proceso de purificacion de protemas segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se realiza una etapa de inactivacion despues de la etapa a).
  4. 4. El proceso de purificacion de protemas segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incluye ademas etapas para cambiar las condiciones de disolucion en lmea o mediante tanque de compensacion.
  5. 5. El proceso de purificacion de protemas segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa a) comprende unir y eluir con un medio de afinidad de protema A.
  6. 6. El proceso de purificacion de protemas segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incluye ademas inactivacion en lmea del virus.
  7. 7. El proceso de purificacion de protemas segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la purificacion de flujo pasante comprende: carbon activado seguido de medio de intercambio anionico de flujo pasante seguido de cambio de disolucion usando un mezclador estatico y/o tanque de compensacion en lmea, seguido de medio de intercambio cationico de flujo pasante, seguido de filtracion de virus y formulacion.
  8. 8. Un proceso de purificacion de flujo pasante que comprende: proporcionar un eluyente de protema A que se ha sometido a una inactivacion de virus a, en orden, un dispositivo de carbon activado, un dispositivo de cromatograffa de intercambio anionico, un dispositivo de cromatograffa de intercambio cationico y una filtracion de virus que estan conectadas juntas en un modo de flujo pasante; en donde un mezclador estatico en lmea y/o tanque de compensacion esta entre los dispositivos de cromatograffa de intercambio anionico y cromatograffa de intercambio cationico para conseguir un cambio de pH.
  9. 9. El proceso de purificacion de flujo pasante segun la reivindicacion 8, en donde se proporciona un filtro profundo corriente arriba del dispositivo de carbon activado en caso de que la muestra que se va a purificar este turbia.
    imagen1
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    ALIMENTACION
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    Ph FF Q FF ProRes S SP FF AC
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    Area del pico de especie activa UV
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    Carbon activado
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    Aliment. CHO + IgG
    imagen6
    Carbon activado
    imagen7
    Carbon activado
    SP FF
    Carbon activado i
    Pro Res S
    Carbon activado
    Q FF
    Figura 9
    20000000
    c mezcla AC-SP FF-Q FF
    c mezcla AC-ProRes S-Q FF
    , mezcla AC-ProRes
    □ mezcla AC-SP FF
    □ mezcla AC-Q FF
    AC-SP FF-Q FF
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    AC-SP FF AC-ProRes S
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    ALIMENTACION
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    Area del pico de especie activa UV
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    DNA (ug/ml) Figura 15
    Pureza HCP (ppm)
    Oi
    -v|
    imagen11
    HCP (ppm)
    imagen12
    HCP (ppm)
    Oi
    CD
    imagen13
    imagen14
    Flow-through purification
    X
    o
    imagen15
    imagen16
    Figura 21
    imagen17
    Tiempo (h)
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