KR20200010321A - 세균성 다당류의 정제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 W 및 혈청군 Y 다당류의 신속한 정제에 관한 것이다. 본 발명의 엔. 메닌지티디스 다당류는 수막 구균성 감염에 대한 경제적인 다당류 단백질 접합체 백신(들)의 생산에 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 세균성 다당류의 개선된 정제 공정에 관한 것이다. 본 발명은 특히 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 혈청군 W 및 혈청군 Y 다당류의 정제에 관한 것이다. 본 발명의 엔. 메닌지티디스(N. meningitidis) 다당류는 수막 구균성 감염에 대한 경제적인 다당류 단백질 접합체 백신(들)의 생산에 사용될 수 있다.
종종 뇌척수막염균(meningococcus)이라 지칭되는 나이세리아 메닌지티디스는 수막염(meningitis) 및 수막구균혈증(meningococcemia)과 같은 수막 구균성 질환의 다른 형태를 일으킬 수 있는 그램-음성 세균이다.
엔. 메닌지티디스(Men)에 존재하는 캡슐 다당류의 유형에 기초하여, 13개의 혈청군이 동정되었고, 엔. 메닌지티디스의 13개의 동정된 캡슐 유형 중 6개(A, B, C, W135, X 및 Y)는 전세계 대부분의 수막 구균성 질환 사례를 차지한다. MenA는 아프리카와 아시아에서 가장 널리 알려졌지만, 북미에서는 드물고/실제로 존재하지 않는다. 유럽 및 미국에서, 혈청군 B(MenB)는 질환 및 사망의 주요 원인이며, 혈청군 MenC 및 MenW가 뒤따른다. 최근에, MenX 발생은 사하라 사막 이남의 아프리카에서 나타나기 시작했다. 다수의 혈청군은 수막 구균성 질환에 대한 범용 백신의 개발을 방해했다.
최초 수막염 다당류 백신의 생산은 이 치명적인 질환에 대항할 긴급한 필요성이 존재했기 때문에 1978년에 달성되었다. 이후, 일반적인 다당류 기반 백신은 2세 미만의 어린이에게는 매우 효과적이지 않은 것으로 관찰되었다. 이러한 관찰은 영아가 미성숙 면역계를 가지고 있고, 일반 다당류에 대한 면역 반응을 이끌어 낼 수 없음을 나타내는 추가 연구를 유도했다.
면역 반응은 T-세포 의존성(TD) 면역 반응 및 T-세포 독립적(TI) 면역 반응으로서 특징지워질 수 있다. 단백질 및 펩타이드는 헬퍼 T 림프구를 자극하고 기억 세포를 생성함으로써 TD 항원을 유도하는 것으로 공지되어 있다. 대조적으로, 다당류는 T-세포 활성화를 유도하지 않고 임의의 기억 B 세포를 형성하지 않는 TI 항원에 속하며, 이는 미성숙 면역계를 갖기 때문에 영아를 다루는 동안 주요 단점이다.
따라서, 영아들 사이에서 증가된 면역원성, 연장된 보호 기간 및 뇌척수막염균의 비인두 캐리지(carriage)의 감소를 특징으로 하는 T-세포 의존성 면역 반응을 유도하는 단백질 담체에 세균성 다당류를 접합시킬 필요가 있었다. 이러한 요구는 다당류-단백질 접합체 백신의 생산을 초래하는 독창적인 연구에 의해 충족되었고, 최초의 수막 구균성 접합체 백신이 1999년 영국에서 허가되었다.
백신의 제조에 사용되는 다당류, 특히 항원성 다당류는 각각 1개, 2개 또는 더 많은 다당류를 함유하는 1가, 2가 및 다가 (다중) 백신일 수 있다. 이들은 다양한 미생물에 의해 유발된 특정 질환 또는 감염의 예방을 위해 시장에서 쉽게 구입할 수 있다. 다가 다당류 백신은 수년 동안 사용되어 왔으며, 폐렴구균, 수막 구균 또는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 질환과 같은 질환을 예방하는 데 유용한 것으로 입증되었다.
정제된 엔. 메닌지티디스 캡슐 다당류의 생산은 담체 단백질과의 효과적인 접합 및 접합체 백신으로서의 이의 개발을 위한 가장 중요한 요건이다. 엔. 메닌지티디스의 배양 및 다당류의 정제 비용은 일반적으로 높고, 일련의 생산 및 정제 단계를 포함하기 때문에 작업 시간이 오래 걸린다.
생산 및 정제 단계에서의 개선은 효과적이고 경제적으로 실행 가능한 접합체 백신의 제형을 유도할 것이다.
다당류의 생산 및 정제 공정을 기재하는 다수의 특허 및 비특허 개시 내용이 있다. 이러한 개시 중 하나는 CTAB 및 에탄올 처리(50%-95%)를 사용하는 Men W, A 및 Y의 정제 및 CaCl2 및 탄소 여과의 용도에 관한 US2009/0182128 A1(Paolo Costantino et al)이다. 개시된 특허 출원은 미정제 다당류를 정제하기 위한 다단계 및 정제 공정을 위한 장시간을 사용한다.
또 다른 특허 출원 번호 제US 12/041,745호는 수막 구균성 수막염 백신을 생산하는 방법을 개시하고, 상기 방법은 엔. 메닌지티디스 까다로운 배지(NMFM)에서 혈청군 A, C, Y 및 W-135의 캡슐 다당류를 생산하기 위해 엔. 메닌지티디스를 배양하는 단계, 배양물로부터 캡슐 다당류를 단리시키는 단계, 임의의 잔류성 세포 바이오매스의 캡슐 다당류를 정제하는 단계 및 캡슐 다당류를 기계적으로 탈중합시키는 단계를 포함한다. 인용된 기술은 약 43시간의 정제 공정을 사용한다. 정제는 초음파 처리와 같은 기계적 수단에 의해 달성된다. 또한, 인용된 종래 기술에서 달성된 정제된 캡슐 다당류의 수율은 MenY의 경우 43mg/L 및 MenW의 경우 47mg/L이고, 이는 본 발명에서 달성된 것보다 비교적 훨씬 적다.
현재, 엔. 메닌지티디스 혈청군의 다당류 정제에 사용되는 다양한 방법은 비교적 긴 정제 시간 및 복잡한 공정 단계를 필요로 하므로 생산 비용이 증가하고, 비용 효율적이고 시기 적절한 방식으로 확장할 수 없기 때문에 공정을 상업적으로 덜 실현 가능하게 한다.
본 발명의 목적은 감소된 시간 및 높은 수율로 엔. 메닌지티디스 혈청군 W 및 Y의 개선된 정제 공정을 제공하는 것이다. 상기 개선은 보다 저렴한 가격으로 다당류 단백질 접합체 백신을 생성할 것이고, 이어서 백신을 개발 도상국 어린이들이 알맞은 가격으로 이용할 수 있게 할 수 있다.
본 발명의 주요 목적은 세균성 캡슐 다당류의 정제 공정을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 W 및 혈청군 Y 다당류의 정제 공정을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 W 및 혈청군 Y 다당류를 정제하면서, 간단하고 효율적이며 개선되고 상업적으로 확장 가능한 방법에 의해 매우 짧은 시간 내에 불순물을 제거하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 관련 품질 사양을 만족시키는 고품질 생성물을 더 나은 수율로 생산하는 것이다.
본 발명은 세균성 다당류, 바람직하게는 나이세리아 메닌지티디스의 생산을 위한 신속하고 산업적으로 확장 가능한 비용 효과적인 공정을 기재한다. 상기 공정은 엔. 메닌지티디스 다당류(PS)를 상당히 감소된 시간에 정제하기 위한 정제 방법을 제공한다. 정제 공정의 대부분은 실온에서 완료될 수 있고, 전체 공정은 임의의 크로마토그래피 단계를 필요로 하지 않는다.
본 발명은 고수율의 엔. 메닌지티디스 혈청군 W 및 Y 캡슐 다당류를 생산하기 위한 정제 단계를 기재한다. 발효 브로스(fermentation broth)로부터의 미정제 다당류는 MilliQ 물(MQW)에 대해 농축 및 정용여과(diafiltration)하여 불순물 수준이 감소된 농축물을 형성한다. 이렇게 수득된 농축물을 최적의 시간 동안 소정의 온도에서 1±0.2M의 NaOH와 같은 알칼리로 처리한다. 생성되는 부분 정제된 다당류를 MQW로 다시 정용여과 한 다음, 탄소 여과하고, 최종적으로 멸균 여과를 수행한다.
따라서, 정제된 다당류는 확장 가능하고 비용 효과적이며 효율적인 방법을 사용하여 상당히 감소된 시간으로 회수된다.
본 발명의 공정은 수막 구균성 다당류를 정제하는데 사용될 수 있다. 상기 공정은 보다 나은 수율로 목적하는 사양을 충족시키는 정제된 다당류를 생산하는 강력하고 신속한 방법을 제공하는 것과 같이 종래 기술에 비해 다수의 장점을 나타낸다. 추가의 이점은 이 공정이 완전히 확장 가능하다는 것이다.
도 1은 MenW 및 MenY 다당류 정제를 위한 공정 흐름을 도시한다.
도 2a 및 2b는 각각 MenW 및 MenY 다당류의 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 3a 및 3b는 각각 MenW 및 MenY 다당류의 NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 4는 기준 MenW 다당류 및 정제된 MenW 다당류 배치에 의한 항-MenW 폴리클로날 항체의 억제 백분율을 도시한다.
도 2a 및 2b는 각각 MenW 및 MenY 다당류의 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 3a 및 3b는 각각 MenW 및 MenY 다당류의 NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 4는 기준 MenW 다당류 및 정제된 MenW 다당류 배치에 의한 항-MenW 폴리클로날 항체의 억제 백분율을 도시한다.
본 발명은 도 1에 도시된 바와 같이 더 짧은 시간에 MenW 및 MenY 다당류의 정제를 가능하게 하도록 최적화된 단계를 개시한다.
MenW 및 MenY 다당류의 발효된 브로스는 농축시키고, 100KDa(0.1m2) 폴리에테르설폰(PES) 막을 사용하여 정용여과시킨다. 이렇게 수득된 생성되는 MenW 및 MenY 농축물은 알칼리로 처리한다. 보다 바람직하게는, MenW 및 MenY 농축물은 75±5℃의 온도 범위에서 2±0.5시간 범위의 시간, 바람직하게는 2시간 동안 1±0.2M NaOH로 처리한다.
이렇게 수득된 부분 정제된 다당류를 실온으로 냉각시킨다. 냉각시킨 후, 부분 정제된 다당류를 농축시키고, 20±2 용적의 MQW를 갖는 100 kDa PES 막으로 정용여과시킨다. 이 농축 및 정용여과 단계를 수행하여 NaOH를 제거한다. 농축 및 정용여과 단계는 부분 정제된 다당류가 광학 밀도 ≤ 0.2에 도달할 때까지 밀리스택 탄소 필터(Milistak® Pod Depth Filters, 0.027m2 이상 스케일)를 사용하는 탄소 여과가 이어진다.
이렇게 수득된 여액은 100 KDa PES 막으로 다시 농축시키고, 0.2㎛ PES 어셈블리로 멸균 여과시켜 정제된 MenW 및 MenY 다당류를 수득한다.
이렇게 수득된 정제된 다당류는 추가 사용을 위해 -20±2℃에서 저장한다. 정제된 다당류는 각각 MenW 및 MenY에 대해 최대 174mg/L 및 405mg/L의 발효 수확물 수율로 다양한 목적 사양을 충족시켰다.
본 발명의 실시예 1 내지 3은 본 발명을 수행하는 방법을 상세화한다. 실시예 1 및 2에 사용된 방법은 중간 단계에서의 사양을 충족시키지 않는 PS를 생성하고, 상이한 단계에 걸쳐 PS 손실이 관찰되었고, 결국 낮은 PS 수율이 검출되었다. 따라서, 프로토콜은 PS 정제를 위한 옵션으로 고려되지 않았지만, 실시예 3은 본 발명을 수행하는 최선의 방식을 개시하고, 여기서 이렇게 수득된 정제된 PS는 각각 MenW PS 및 MenY PS에 대해 최대 174mg/ml 및 405mg/L의 수율로 목적 사양을 충족시켰다. 또한, 정제는 7±1시간의 짧은 기간 내에 신속하게 완료된다.
정제된 MenW 및 MenY의 분석은 순도 및 동일성 분석에 대해 HPLC 및 1H-NMR 스펙트럼에 의해 수행되고, 이들의 결과는 각각 도 2 및 3에 도시되어 있다.
상기 사용된 절차의 확증은 정제된 다당류가 목적하는 기준 사양을 충족시킨다는 것을 명백하게 보여주는 표 1 및 2로부터 편리하게 이해될 수 있다.
정제된 MenW 및 MenY 다당류 사양은 이하 표 1 및 표 2에 제시되어 있다.
상기 상세하게 기재된 본 발명의 다양한 양태는 이제 이하 논의된 바와 같은 비제한적인 실시예로 예시된다:
실시예-1:
페닐 세파로스를 사용하는 MenW 다당류(PS) 정제.
발효된 브로스(FB)는 100kDa 농축시키고, 10 내지 12용적의 MilliQ 물(MQW)로 정용여과시킨다. 상기 정용여과 및 농축 공정 후, 다당류는 75±5℃에서 2±0.5시간 동안 2M NaOH로 처리한다. 이어서, PS를 실온으로 냉각시킨다. 냉각시킨 후, 미정제 다당류의 100kDa 농축 및 정용여과는 20용적의 20mM 트리스 HCl(pH 8±0.2)로 수행한다. 이후, 20% w/v 황산암모늄을 농축되고 정용여과된 PS에 첨가한다. 이어서, 그것을 XK16/20 컬럼을 사용하여 페닐 세파로스 수지 상에 부하한다. 통과액을 수집한 후, 평형 완충제(20mM 트리스 HCl(pH 8±0.2) 및 20% 황산암모늄)로 5 내지 10 컬럼 용적(CV)을 세척한다. 이어서, 수집된 재료는 30kDa 농축시키고, 20용적의 MQW로 정용여과한 다음, 0.2μ 여과하였다.
실시예-2:
수산화나트륨(NaOH), 에탄올, CTAB, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 아세테이트를 사용하는 MenW PS 정제.
FB는 100kDa 농축시키고, 10 내지 12용적의 MilliQ 물(MQW)로 정용여과시킨다. 정용여과 및 농축 후, 부분 정제된 PS는 75±5℃에서 2±0.5시간 동안 1M NaOH로 처리한다. 이렇게 수득된 PS를 실온으로 냉각시킨다. 냉각시킨 후, PS의 농축 및 정용여과는 20용적의 MQW를 갖는 100 KDa PES 막(0.1m2)을 통해 수행한 후, 2 내지 8℃에서 밤새 배양하면서 100% v/v 무수 에탄올을 사용하여 에탄올 침전시킨다. 다음 날, 10550 x g에서 원심분리를 수행한 후, 수집된 펠렛을 MQW에 용해시킨다. 여기에, 80% v/v의 무수 에탄올을 실온(25±2℃)에서 2±0.5시간 동안 연속 혼합하면서 첨가한다. 10550 x g에서 원심분리를 수행한 후, 수집된 펠렛을 MQW에 용해시킨다. 이에, 실온(RT)에서 밤새 교반/혼합하면서 12% v/v의 10% 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 스톡 용액에 의한 처리가 이어진다. 10550 x g에서 원심분리를 수행한 후, 용해된 펠렛에 1% w/v 나트륨 데옥시콜레이트(DOC) 및 8% w/v 나트륨 아세테이트를 첨가하면서 이렇게 수집된 펠렛을 MQW 및 40% v/v 무수 에탄올에 용해시킨다. 생성되는 용액을 실온에서 2시간 동안 계속 교반하면서 유지시킨다. 10550 x g에서 원심분리를 수행하고, 이렇게 수득된 상청액을 수집하고, 100kDa로 추가로 정용여과하고 농축시킨 다음, 0.2μ 여과하였다.
실시예-3:
NaOH 처리 및 탄소 여과를 사용하는 MenW 또는 MenY PS 정제:
MenW 또는 MenY의 발효 브로스를 100kDa (0.1m2) PES 막으로 농축시키고 정용여과시킨다. 2.5L의 발효 작업 용적이 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 W 및 혈청군 Y의 정제 공정에 사용된다. 이렇게 수득된 MenW/MenY의 농축물을 75±5℃에서 2±0.5시간 동안 1±0.2M NaOH를 사용하여 알칼리 처리한다. 이이서, 이렇게 수득된 부분 정제된 다당류를 실온으로 냉각시킨다. 냉각시킨 후, 부분 정제된 PS의 농축 및 정용여과는 20±2 용적의 MQW를 갖는 100KDa PES 막을 통해 수행하여 NaOH를 제거한 다음 OD260nm ≤0.2가 달성될 때까지 MQW 프라이밍된 밀리스탁 포드 뎁쓰 필터(Millistak+® Pod Depth Filter, 0.027 m2)로 탄소 여과한다. 수집된 여액을 100kDa PES 막으로 농축시키고, 0.2㎛ PES 어셈블리로 멸균 여과하여 정제된 MenW 또는 MenY PS를 수득한다. 정제된 다당류는 추가 사용을 위해 -20±2℃에서 저장한다. 정제된 PS의 수율은 각각 MenW 및 MenY에 대해 최대 174mg/ml 및 405mg/L이다. 또한, 이렇게 수득된 PS는 표 1 및 표 2에 개시된 바와 같은 목적 사양을 충족시켰다.
도 2a 및 2b는 각각 RI 검출기를 사용하여 대표적인 정제된 MenW 및 MenY 다당류의 HPLC-SEC 크로마토그램을 도시한다. 정제된 다당류의 HPLC-SEC 분석은 TSK 4000-5000 PWXL HPLC 컬럼을 연속으로 사용하여 수행하고, 작동 완충제로서 질산나트륨을 사용하여 RI 검출기로 모니터링한다. HPLC-SEC 크로마토그램 및 다른 물리화학적 분석(표 1, 2)에서 단일 주요 피크는 MenW 및 MenY 다당류의 순도를 목적하는 수준으로 확인한다.
도 3a 및 3b는 각각 대표적인 정제된 MenW 및 MenY 다당류의 1H-NMR 스펙트럼을 도시한다. 정제된 MenW 및 MenY 다당류에 대한 1H-NMR은 용매로서 중수소 산화물(D2O)을 사용하여 Bruker Avance 500 MHz 기기에서 기록된다. 도 3a의 스펙트럼 피크는 MenW 다당류의 동일성을 확인한다. 스펙트럼 중 2ppm에서의 피크는 다당류 단량체 구조에 존재하는 N-아세틸 그룹(NH-Ac)으로부터의 CH3 그룹의 3개의 양성자에 상응한다. 1.6ppm에서의 피크는 축 방향 H-3 양성자를 나타내고, 2.8ppm에서의 피크는 시알산 환의 적도 H-3을 나타낸다. 3.5 내지 4.1ppm에서 광범위한 다중선은 시알산 및 갈락토스 환 상의 모든 다른 양성자에 상응한다. 5ppm에서의 피크는 갈락토스 환의 알파 H-1에 상응한다.
도 3b의 스펙트럼 피크는 MenY 다당류의 동일성을 확인한다. 스펙트럼 중 1.9ppm에서의 피크는 다당류 단량체 구조에 존재하는 N-아세틸 그룹(NH-Ac)으로부터의 CH3 그룹의 3개의 양성자에 상응한다. 1.6ppm에서의 피크는 축 방향 H-3 양성자를 나타내고, 2.8ppm에서의 피크는 시알산 환의 적도 H-3 양성자를 나타낸다. 3.3 내지 4.1ppm에서 광범위한 다중선은 시알산 및 글루코스 환 상의 모든 다른 양성자에 상응한다. 5ppm에서의 피크는 글루코스 환의 알파 H-1에 상응한다.
스펙트럼은 다당류의 순도를 나타내는 주요 불순물 피크가 없음을 나타낸다.
실시예-4: 억제 ELISA에 의한 MenW 및 MenY PS 동일성
혈청군 W 또는 Y의 수막 구균성 캡슐 다당류를 함유하는 정제된 샘플을 특이적 다클론성 항체(1차 항체)와 함께 배양하여 샘플에서 항체와 항원 사이에 복합체가 형성되도록 한다. 이어서, 이들 복합체는 경쟁자 항원이 고정된 용기에 첨가한다. 다당류 샘플로부터의 에피토프와 복합체화되지 않은 항체는 이들 고정된 경쟁자 항원에 결합한다. 이어서, 고정된 경쟁자 항원에 결합된 항체(일반적인 세척 단계 등 후)는 1차 항체에 결합하는 효소 표지된 2차 항체를 첨가하여 검출할 수 있다. 표지는 발색 기질을 사용하여 고정된 1차 항체와 2차 항체의 반응을 동정하는 데 사용된다. 대조군 웰(임의의 시험 샘플 없음)과 비교하여 시험 웰에서 흡광도의 감소는 시험 샘플에서 특정 항원의 존재를 확인한다.
간략하게, ELISA 플레이트 A는 동일한 용적의 내부 PS 및 mHSA를 갖는 100㎕의 코팅 용액으로 코팅하고, 2 내지 8℃에서 밤새 배양한다. 항원 부재 대조군이 대조군으로서 포함되었다. 코팅된 플레이트를 실온에서 200μl의 차단 완충제로 차단한다. 정의된 농도의 품질 관리 다당류(NIBSC 기준)는 세균 배양 상청액(시험 샘플)과 같이 연속적으로 3배 희석시키고, 37℃에서 1시간 동안 혈청군 특이적 시판 다클론성 1차 항체와 함께 플레이트 B에서 배양한다. 플레이트 B로부터의 항원-항체 혼합물을 차단된 플레이트 A로 옮기고, 2시간 동안(37℃에서 1.5시간 및 실온에서 30분) 추가로 배양한다. 반응물을 1시간 동안 최적화된 2차 항체 희석물과 함께 추가로 배양하고, 반응은 TMB 기질 100㎕를 사용하여 발생시키고, 10분 동안 배양한다. 반응은 630㎚를 참조로 450nm에서 광학 밀도(OD)가 관찰되기 전에 웰당 50㎕의 2M H2SO4로 정지시킨다. 억제 백분율은 항원 부재 대조군 웰의 OD와 관련하여 기준 또는 시험 샘플 희석물에서 OD의 억제로부터 계산된다. MenW 동일성 검정에 대한 PS 농도 대 억제율 곡선은 본 발명을 사용하여 정제된 MenW 다당류가 다당류 기준만큼 우수한 혈청군 특이적 항체를 억제하고, 따라서 다당류의 동일성을 확인한다는 것을 나타내는 도 4에 제시되어 있다.
Claims (9)
- 엔. 메닌지티디스(N. meningitidis) 혈청군 W(MenW) 및 혈청군 Y(MenY) 캡슐 다당류의 정제 공정으로서, 상기 공정이
(a) 발효 브로스(fermentation broth)를 농축 및 정용여과(diafiltration)하는 단계;
(b) 고온에서 단계 (a)의 농축되고 정용여과된 농축 브로스를 알칼리 처리하여 부분 정제된 다당류를 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)의 부분 정제된 다당류를 농축 및 정용여과하고, 탄소 여과하여 여액을 수득하는 단계:
(d) 단계 (c)에서 수득된 여액을 멸균 여과하여 정제된 MenW 또는 MenY 다당류를 수득하는 단계를 포함하고;
상기 정제 공정이 7±1시간 이내에 신속하게 완료되는, 공정. - 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 농축 및 정용여과가 100KDa PES 막으로 수행되는, 공정.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 알칼리 처리가 75±5℃에서 2±0.5시간 동안 1±0.2 M NaOH로 수행되는, 공정.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (c)의 부분 정제된 다당류의 농축 및 정용여과가 100KDa PES 막으로 수행된 후, 밀리스탁 포드 뎁쓰 필터(Millistak Pod depth filter)를 사용하여 탄소 여과하는, 공정.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (d)의 멸균 여과가 0.2㎛ PES 막으로 수행되는, 공정.
- 제1항에 있어서, 상기 공정이 목적하는 품질 기준(quality standard)을 충족시키는 정제된 다당류를 생성하는, 공정.
- 제1항에 있어서, 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 W 및 Y의 정제된 다당류의 수율이 각각 최대 174mg/ml 및 405mg/L 발효 브로스인, 공정.
- 제1항에 있어서, 상기 완전한 정제 공정이 6 내지 8시간 내에 수행되는, 공정.
- 제1항에 있어서, 상기 공정이 수막 구균성 감염에 대한 경제적인 다당류 단백질 접합체 백신(들)의 생산에 사용될 수 있는 엔. 메닌지티디스 혈청군 W(MenW) 및 혈청군 Y(MenY) 캡슐 다당류를 생성하는, 정제 공정.
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