KR20020066583A

KR20020066583A - 피토톡신을 특이적으로 인지하는 단일클론 항체 및 그의제조방법

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Publication number: KR20020066583A
Application number: KR1020010001761A
Authority: KR
Inventors: 장지연; 허장현; 차상훈; 함영일; 김점순; 임춘근
Original assignee: 대한민국(관리부서:농촌진흥청 고령지농업시험장); 임춘근
Priority date: 2001-01-12
Filing date: 2001-01-12
Publication date: 2002-08-21
Also published as: KR100458002B1

Abstract

이 발명은 식물 병원성 물질 (phytotoxin)을 특이적으로 인지하는 단일클론 항체, 그의 제조방법 및 그의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 스트렙토마이세스 스카비스 (Streptomyces scabies) 균주로부터 분리한 텍스토민 (thaxtomin)을 이용하여 생산한 단일클론 항체 및 그의 제조방법으로 구성되는데 이 발명의 단일클론 항체는 식물에서 텍스토민의 병원성 기작의 연구 및 감자 더뎅이병 등의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

피토톡신을 특이적으로 인지하는 단일클론 항체 및 그의 제조방법 {Monoclonal antibody specific for phytotoxins and process for preparation thereof}

이 발명은 식물 병원성 물질 (phytotoxin)을 특이적으로 인지하는 단일클론 항체, 그의 제조방법 및 그의 용도에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 이 발명은 감자 더뎅이병을 유발하는 스트렙토마이세스 스카비스 (Streptomyces scabies) 균주로부터 얻은 하기 화학식 1의 구조를 가지는 텍스토민 (thaxtomin)에 대한 단일클론 항체 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 단일클론 항체는 반응성이 탁월하여 텍스토민의 병원성 기작의 연구 및 식물 질병의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

감자에서 발생하는 세균병으로는 더뎅이병, 무름병, 흑각병, 썩음병 등이 있다. 이 중 더뎅이병은 북미·유럽·남아프리카·아시아 등 감자를 재배하는 거의 모든 지역에서 나타나는데, 특히이 병에 감염된 감자는 외관에 손상을 입어 감자의 상품성이 떨어져 큰 경제적인 손실을 가져온다.

이러한 감자 더뎅이병은 대부분 토양서식 세균인 스트렙토마이세스 스카비스 (Streptomyces scabies), 스트렙토마이세스 아시디스카비스 (Streptomyces acidiscabies), 스트렙토마이세스 터지디스카비스 (Streptomyces turgidiscabies)에 의해 감염되는 것으로 알려져 있다.

실제로 1926년 펠로우 (Fellow)가 더뎅이 병징으로부터 병원성 요인이라고 생각되는 물질을 최초로 분리하였고, 그것을 효소 또는 피토톡신 (phytotoxin)이라고 하였다. 또한, 1931년 죤스 (Jones) 등은 효소 또는 피토톡신이 단독으로 병을 일으키는 것이 아니라 균사나 균사 조직이 함께 존재함으로써 병을 유발한다고 보고한 바 있다. 그러나 1952년 슈마커 (shoemarker)에 의해 피토톡신이 단독으로 더뎅이병을 일으킬 수 있음이 알려졌고, 1989년 러셀 킹 (Russell R. King)에 의해 더뎅이병의 결정인자가 밝혀지게 되었다. 킹은 더뎅이병에 걸린 감자 괴경의 초기병징에서 스트렙토마이세스 스카비스 (Streptomyces scabies)를 분리하고, 분리된 균주를 숙주에 주입하여 반응시킨 결과 병원균이 분비하는 피토톡신이 감자 더뎅이병의 결정인자임을 확인하였다.

또한, 이 때 피토톡신은 디옥소피페라진 (dioxopiperizine)을 가지는 4-니트로인돌-3-일 (4-nitroindol-3-yl) 구조임을 밝히고 텍스토민이라 명명하였다. 그 후 1995년 로리아 (R. Loria)도 스트렙토마이세스 아시도스카비스 (S. acidiscabies)에서 텍스토민을 분리하였고, 1996년에는 킹 (Russell R. King)과 로렌스 (C. Harold Lawrence)도 스트렙토마이세스 스카비스 (S. scabies) 병원균으로부터 텍스토민 A를 분리하여 그 구조를 동정하였다. 이외에도 1998년 오고시 (A. Ogosi)는 스트렙토마이세스 터지디스카비스 (S. turgidiscabies)에서 텍스토민 A를 분리하였다. 이와 같이 텍스토민의 분리가 계속 진행되어 현재까지 11 계통의 텍스토민이 분리되었고, 이 중에서 텍스토민 A가 병원성 요인으로 가장 중요한 것이고, 현재까지 더뎅이병을 일으키는 모든 세균은 텍스토민 A를 생산하는 것이 보고되었다.

최근에는 국내에서도 더뎅이병의 발생이 주목되고 있으며, 1998년 김 등에 의해 스트렙토마이세스 스카비스 (S. scabies), 스트렙토마이세스 아시도스카비스 (S. acidiscabies), 스트렙토마이세스 터지디스카비스 (S. turgidiscabies)가 더뎅이병의 병원균으로 보고되었다. 그러나 병원성 관련 독소에 대한 연구는 이루어지지 않아 감자 더뎅이병에 대한 근본적인 해결책을 제시하지 못하고 있는 실정이다.

현재 국내 감자의 주생산지인 제주도와 강원도에서 더뎅이병의 발병률이 증가하고 있는 추세이므로, 병원성 관련 독소에 대한 연구 특히 감자 더뎅이병의 결정인자인 텍스토민 A (thaxtomin A)에 대한 연구가 절실히 필요하다.

이에 이 발명자들은 텍스토민의 작용 기작 등의 연구에 유용한 텍스토민을 특이적으로 인지하는 단일클론 항체를 생산하기 위하여, 국내산 감자 더뎅이 병원균으로부터 텍스토민 A를 정제하고 소혈청 알부민 (bovine serum albumin; BSA)을 결합시킨 항원을 사용하여 텍스토민에 특이적인 단일클론 항체 (monoclonal antibodies)를 얻은 다음 효소면역측정방법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA)으로 텍스토민에 대한 탁월한 반응성을 확인함으로써 이 발명을 완성하였다.

이 발명은 식물 병원성 물질인 텍스토민 (thaxtomin)의 작용 기작 및 질병의 조기 진단 등에 유용한 단일클론 항체 및 그의 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다.

도 1은 감자 더뎅이병의 병징을 나타낸 것이고,

도 2a는 스트렙토마이세스 스카비스 (Streptomyces scabies) 균주의 포자색을 나타낸 것이며,

도 2b는 스트렙토마이세스 스카비스 (Streptomyces scabies) 균주의 포자쇄를 나타낸 것이고,

도 3은 텍스토민을 소혈청 알부민 (BSA)과 결합시킨 것을 나타낸 모식도이며,

도 4는 단일클론 항체의 제조 과정을 개략적으로 나타낸 것이고,

도 5는 이 발명의 단일클론 항체를 텍스토민 A 및 소혈청 알부민과 반응시킨 효소면역측정 (ELISA) 검사 결과를 나타낸 것이며,

도 6a는 상기 단일클론 항체의 정제 과정을 나타낸 모식도를 나타낸 것이고,

도 6b는 면역항체 (Ig G)의 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-PAGE) 사진을 나타낸 것이며,

도 7은 이 발명의 단일클론 항체를 다양한 병원성 물질과 반응시킨 효소면역측정 (ELISA) 검사 결과를 나타낸 것이고,

도 8은 상기 단일클론 항체를 다양한 병원균에서 분리한 물질 (phytotoxin)과 반응시킨 효소면역측정 (ELISA) 검사 결과를 나타낸 것이며,

도 9는 상기 단일클론 항체의 각 병원성 물질에 대한 시간에 따른 반응성을 효소면역측정 (ELISA) 검사 결과로 조사한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 이 발명은 식물 병원성 물질 (phytotoxin)을 특이적으로 인지하는 단일클론 항체를 제공한다.

구체적으로, 이 발명의 단일클론 항체는 식물 병원성 물질인 텍스토민 (thaxtomin) 등을 인지하고, 상기 텍스토민은 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.) 균주에서 정제한 것을 포함한다.

또한, 이 발명은 스트렙토마이세스 속 균주의 배양액에서 식물 병원성 물질 (phytotoxin)을 정제하고, 이를 소혈청 알부민 (BSA)과 결합시킨 항원을 쥐에 주입하여 항체를 형성시키는 과정으로 하이브리도마 (hybridoma) 세포를 얻는 단일클론 항체의 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 이 발명의 제조방법은 스트렙토마이세스 스카비스 S33 (Streptomyces scabies S33) 균주로부터 하기 화학식 1의 구조를 가지는 텍스토민을 정제하여 사용하는 것을 포함한다.

화학식 1

이 발명은 상기 단일클론 항체로 식물 병원성 물질 (phytotoxin)을 조사하여 그 작용 기작을 연구하고 식물 전염병을 조기에 진단하는 등의 용도를 제공한다. 이 때 식물 전염병은 감자 더뎅이병 등을 포함한다.

이하, 이 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

이 발명은 식물 병원성 물질 (phytotoxin)을 특이적으로 인지하는 단일클론 항체를 제공한다. 이 때 식물 병원성 물질은 디옥소피페라진 (dioxopiperazine)을 가지는 4-니트로인돌-3-일 (4-nitroindol-3-yl) 구조의 텍스토민을 포함하고, 바람직하게는 하기 화학식 1의 텍스토민 A를 포함한다.

이 발명은 우선 식물 병원성 물질을 대량 생산하는 균주를 선발하여 식물 질병을 유발하는 물질을 분리한다.

구체적으로, 국내에서 감자 더뎅이병 (도 1 참조)의 유발율이 높은 스트렙토마이세스 속 균주를 이용하여 피토톡신의 생성 여부를 조사하고, 이로부터 텍스토민을 대량 생산하는 균주를 선별한다. 실제로 스트렙토마이세스 스카비스 (Streptomyces scabies) 균주S28,S32,S33,S49,S51 등은 텍스토민을 대량 생산한다 (표 1 및 도 2 참조). 이 때 병원성 검정은 감자 디스크 실험(PTD; Potato Disk Tests)방법을 사용한다.

또한, 이 발명은 상기에서 선발한 균주를 오트밀 배지 등을 사용하여 배양하고 이로부터 텍스토민을 푸미오 다나까 (Fumio Tanaka)의 방법 등으로 추출한다. 상기 텍스토민 추출물 (crude extract)을 다시 컬럼 크로마토그래피 (column chromatography) 과정으로 정제하고 박막 크로마토그래피 (TLC; thin layer chromatography)와 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC; high pressure liquid chromatography) 그리고 병원성 검정 (PTD) 등을 수행하여 분석한다. 그 결과, 상기 식물 병원성 물질이 표준 텍스토민 A (standard thaxtomin A)와 동일하고 감자 디스크를 갈변시키는 병원성이 있음을 확인한다.

이 발명은 상기에서 분리한 텍스토민이 단일클론 항체를 얻기 위한 항원으로는 분자량이 너무 작은 단점을 보완하기 위하여, 소혈청 알부민을 결합 단백질 (carrier protein)로 이용한다 (도 3 참조). 구체적으로 텍스토민을 소혈청 알부민과 결합시킨 항원을 쥐에 주사하고 효소면역측정방법 (ELISA; enzyme linkedimmunosorbent assays)으로 항체의 형성을 확인한 다음 비장 세포로부터 마이엘로마 세포 (myeloma cell)를 얻어 하이브리도마 세포 (hybridoma cell)을 제작한다 (도 4 참조). 이러한 과정으로 이 발명은 텍스토민과 특이적으로 반응하는 항체를 생산하는 7가지 이상의 세포주를 선발한다 (도 5 및 표 2 참조).

또한 이 발명은 상기 세포주로부터 텍스토민을 특이적으로 인지하는 항체를 얻기 위하여, 상기 과정에서 얻은 항체 중 면역항체 Ig G 만을 정제한다 (도 6 참조). 또한 상기에서 정제한 단일클론 항체의 반응성을 확인하기 위하여, 텍스토민을 생산하는 균주에서 분리한 물질을 이용하여 효소면역측정방법 등을 수행한다. 그 결과 도 7 및 표 3에서 보는 바와 같이, 상기 면역 항체는 대조구인 소혈청 알부민과 비병원성 균주에서 분리한 물질과 비교하여 특이적으로 높은 반응성을 나타냄을 확인한다.

또한, 이 발명은 상기 단일클론 항체를 사용하여 다양한 균주로부터 분리한 피토톡신의 반응성을 확인한다 (표 4 참조). 그 결과, 이 발명의 단일클론 항체는 표준 텍스토민 A(standard thaxtomin A) 및 텍스토민 A를 생산하는 병원성 균주에서 높은 반응성을 보이나 대조적으로 텍스토민 A를 생산하지 않는 비병원성 균주나 소혈청 알부민 (BSA)에서는 낮은 반응성을 보임을 확인한다 (도 8 참조).

또한, 이 발명은 다양한 균주의 병원성 물질에서 시간에 따라 변화하는 반응성을 효소면역측정으로 조사한다 (도 9 참조). 그 결과 반응 후 약 4-5분에서 텍스토민의 생성 여부를 알아내는 것이 바람직함을 확인한다.

따라서, 이 발명의 단일클론 항체는 텍스토민의 병원성 기작을 연구하고 식물 전염병을 조기에 진단하고 예방하는데 유용하다.

이하, 이 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명한다.

단 이들 실시예는 이 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 텍스토민 A를 대량 생산하는 국내산 균주 선발

국내에서 감자 더뎅이병 (도 1 참조)의 유발 확률이 높은 것으로 보고된 스트렙토마이세스 스카비스 (Streptomyces scabies) 균주의 추출물질을 이용하여, 병원성을 검정하고 이로부터 텍스토민 A를 많이 생산하는 균주를 선발하였다. 스트렙토마이세스 스카비스 균주의 포자색 및 포자쇄 모양은 도 2에 나타내었다.

상기 균주의 병원성 검정은PTD (Potato Disk Tests)방법으로 실시하였다. 페트리 디쉬 (petridish)에 멸균된 필터 페이퍼 (filter paper)를 넣고, 멸균수 500 ㎖ 가한 뒤 10∼15분 동안 멸균조 (clean bench)에서 건조시켰다. 건조 후 멸균된 필터 페이퍼 위에 직경 1cm인 멸균된 감자를 놓고, 표준 텍스토민 A (standard thaxtomin A)와 5종 (S28,S32,S33,S49,S51)의 추출물질을 각각 10 ㎕씩 가한 다음 파라필름 (parafilm)으로 봉하여 28℃ 항온기 (incubator)에서 7일 동안 배양하였다. 이 발명에서 사용한 균주는 표 1에 정리하여 나타내었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 이 발명의 단일클론 항체는 텍스토민을 포함한 식물 병원성 물질을 특이적으로 인지하여 텍스토민 등에 의하여 유발되는 감자 더뎅이병 등을 용이하게 검사하게 하므로, 식물에서 텍스토민의 병원성 기작 연구, 식물 질병의 조기 진단 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

식물 병원성 물질 (phytotoxin)을 특이적으로 인지하는 단일클론 항체.
청구항 1에 있어서,

식물 병원성 물질은 텍스토민 (thaxtomin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
청구항 2에 있어서,

텍스토민은 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.) 균주로부터 정제한 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
청구항 3에 있어서,

텍스토민은 스트렙토마이세스 스카비스 S 33 (Streptomyces scabies S 33) 균주에서 정제한 하기 화학식 1의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 (수탁번호 : ).

화학식 1
스트렙토마이세스 속 균주의 배양액에서 식물 병원성 물질 (phytotoxin)을 정제하고 이를 소혈청 알부민 (BSA)과 결합시킨 항원을 쥐에 주입하여 항체를 형성시키는 과정으로 하이브리도마 세포를 얻고 효소면역측정방법 (ELISA)으로 선별하는 청구항 1의 단일클론 항체의 제조방법.
청구항 5에 있어서,

식물 병원성 물질 (phytotoxin)은 화학식 1의 구조를 가지는 텍스토민 A (thaxtomin A)를 포함하는 것을 특징으로 하는 청구항 1의 단일클론 항체의 제조방법.
청구항 1의 단일클론 항체를 이용한 효소면역측정방법을 수행하여 식물 병원성 물질을 검사함으로 식물의 전염병을 조기에 진단하는 방법.
청구항 7에 있어서,

식물 전염병은 감자 더뎅이병을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.