CN102776151A - 一种检测氨基苷类抗生素单克隆抗体及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供的一种检测氨基苷类抗生素单克隆抗体及其试剂盒，获取保藏号为CCTCCC201135的杂交瘤细胞株Pami-SP20，并以该株所分泌单克隆抗体所建立的氨基苷类抗生素残留快检方法，即单克隆杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体可以直接用于氨基苷类抗生素残留的ELISA快检试剂制作及双抗夹心ELISA法检测氨基苷类抗生素残留的捕获抗体；本发明公开的氨基苷类抗生素检测试剂盒中包含包被有链霉素-BSA抗原的检测板、HRP标记的上述单克隆抗体和ELISA反应液；本发明公开的单克隆杂交瘤细胞株所分泌单克隆抗体具有特异性强、亲和力高的优点，为氨基苷类抗生素残留的快速检测提供了新的手段。

Description

一种检测氨基苷类抗生素单克隆抗体及其试剂盒

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其针对抗氨基苷类抗生素通用单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，已及获取对其残留的检测试剂盒。 

背景技术

氨基苷类抗生素是由二个或三个氨基糖分子和一个的氨基环醇通过醚键连接而成，主要包括链霉素、庆大霉素、新霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、奈替米星等，是一类广谱抗生素，对结核杆菌、钩端螺旋体、放线菌及多种革兰氏阴性杆菌具有较强的杀菌作用，在畜牧业生产中也常添加到饲料中促进生长发育。同时，氨基苷类抗生素极易产生交叉耐药性，例如，原先对1ug/ml浓度链霉素敏感的大肠杆菌，经过3-4天治疗后，可以耐受100ug/ml的浓度，因此在农副业生产中用量越来越大。而该类抗生素为对人脑、神经、听觉以及肾脏产生严重的副作用。例如，德国从2002年6月1日起，将链霉素残留限量标准由原来的0.2mg/kg提高到0.02mg/kg，导致目前所有的欧盟国家都将按此标准来控制，而对我国蜂蜜的检测情况看，绝大部分都高于这一标准，因而导致我国蜂蜜不能出口到欧盟国家或只能降价销售,使我蜂蜜出口商和生产商严重亏损。随着对食品安全问题的重视，我国在1990年11月颁布的 《乳与乳制品卫生管理办法》及农业部于2002年发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》的通知，均对氨基苷类抗生素的最高残留限量 （MRLs）作出了规定;因此加强对食品中各种药物残留的监控已成为重塑我国食品安全信心的重要手段。 

文献检索披露：2003年欧盟及第三方国家基准实验室(NRL)联合举行的使用ELISA方法来检测牛奶中的氨基糖苷类抗生素残留协同试验，各参加实验室使用内部ELISA方法或使用商业试剂盒（由Eurodiagnostica 、r-Biopharm和Tecna等公司提供）对提供的12支样本进行测试,通过对灵敏度、特异性、回和收率等参数的考核，证明所使用的ELISA方法可以用来初筛定性检测使用。 

本发明构思的制备方法，利用所制备的单克隆抗体，建立氨基苷类抗生素残留的ELISA快速检测技术及试剂盒；同时提供的单克隆杂交瘤细胞株已被中国典型生物保藏中心保藏，号为CCTCC C201135。该单克隆抗体具有特异性强、亲和力高的优点，与其它抗生素无交叉反应，而与链霉素、新霉素、庆大霉素，卡那霉素等氨基苷类抗生素具有极高亲和力。 

发明内容

本发明的目在于：提供的检测氨基苷类抗生素残留的方法，苷类抗生素残留检测试剂盒中的运用，[微软用户1] 能够保证氨基苷类抗生素残留检测过程中的灵敏度和特异性。 

本发明的目的是这样实现的：1）获得具有保藏号为CCTCC C201135的单克隆杂交瘤细胞株Pami-SP20；2）一种抗氨基苷类抗生素的单克隆抗体Pami-SP20-antibody，由杂交瘤细胞株Pami-SP20产生的抗体为IgG1亚型，可特异性识别氨基苷类抗生素，并具有较强的亲和力；3）一种检测氨基苷类抗生素残留的试剂盒，利用保藏号为CCTCC C201135的单克隆杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，获取氨基苷类抗生素的检测方法及试剂盒。 

本发明构思的技术路线： 

1）采用碳二亚胺（Carbodiimide，EDC）法，将链霉素（Streptomycin，SM)与卵清蛋白(ovalbumin，OVA) 偶联，合成了链霉素完全抗原SM-OVA，用于Balb/c小鼠免疫。

2）碳二亚胺（Carbodiimide，EDC）法，将链霉素（Streptomycin，SM)与牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)偶联，合成链霉素完全抗原SM-BSA，用于单克隆抗体的ELISA筛选； 

3）用PEG1500将经SM-OVA免疫的Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，经HAT选择培养基选择培养后，SM-BSA包被酶标板，筛选阳性克隆，阳性克隆经三轮有限稀释单克隆化后，扩大培养；

4）所获单克隆抗体，进一步western blot及ELISA验证其特异性，并采用SIGMA公司单抗亚型鉴定试剂盒进行亚型鉴定；

5）阳性单克隆杂交瘤细胞注射Balb/c小鼠制备所需单克隆抗体腹水。

本发明将系列抗生素与BSA偶联后，用所述单克隆抗体进行Western-blot检测，验证了单克隆抗体具有极高的特异性，并获取了能高效分泌抗氨基苷类抗生素单克隆抗体的单克隆杂交瘤细胞系，并同时进行的单克隆抗体的残留检测试剂盒的灵敏度试验及特异性试验，更进一步验证了本发明的单克隆抗体用于检测氨基苷类抗生素残留时表现出的高灵敏度、高特异性的优势，彰显技术进步。 

  

附图说明

本发明对照附图作进一步的说明。 

附图1是单克隆抗体与系列抗生素-BSA偶联抗原的western blot杂交结果的电泳图； 

如图所示： A:SDS PAGE电泳图；B：Wester blot结果；1.BSA；M.蛋白分子量标准(分子量由上至下分别为170、130、95、72、55、43、34、26、17kDa)；2.链霉素-BSA；3.庆大霉素-BSA；4.新霉素-BSA；5.氨苄霉素-BSA；6.卡那霉素-BSA；7.大观霉素-BSA；8.强力霉素-BSA。

附图2是ELISA方法的应用电泳图； 

如图所示： a: 抗原包被浓度实验，A1 -H1(A2-H2为重复)分别为链霉素-BSA抗原40 ug/ml-0.00571 ug/ml倍比稀释，H1、H2为未包被对照；b: ELISA特异性实验，A1、A2孔包被链霉素-BSA，B1，B2包被庆大霉素-BSA，C1，C2包被新霉素-BSA， D1，D2包被卡那霉素-BSA，E1，E2包被氨苄霉素-BSA，F1，F2包被强力霉素-BSA，G1，G2包被大观霉素-BSA, H1、H2包被BSA；c：ELISA敏感性实验，正交法法将链霉素进行稀释，测定ELISA方法敏感性：H4-A4：链霉素200 ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.5625ng/mlng/ml，随后依次由第4列向第1列倍比稀释。

  

具体实施方式

本发明将对照实施例作进一步的说明。 

实施例

利用保藏号为CCTCC C201135的单克隆杂交瘤细胞株Pami-SP20所分泌的单克隆抗体，获取氨基苷类抗生素的检测方法及试剂盒，实验步骤如下； 

1）抗体检测板的制备：

步骤一，碳二亚胺（Carbodiimide，EDC）法，将EDC置于室温下，放置3h；取10mg BSA溶于1mL MES缓冲液中，取20mg SM溶于2.5mL MES缓冲液中，两溶液混合；取5mg EDC溶于0.5mL灭菌蒸馏水中后，缓慢加入SM和BSA的混合溶液，室温下反应6h，在4 ℃冰箱中,用PBS0.01 moL/ L，pH 7.2, 透析4次，每次5h，偶联产物冷冻干燥保存备用；

步骤二，将经透析纯化后的完全抗原SM-BSA固定于酶联板，以梯级浓度包被酶联板，每孔100ul，4℃包被过夜，而后用磷酸盐吐温缓冲液洗涤2min；将其拍干后，用5%牛血清白蛋白溶液于 37℃封闭2h，晾干后即得到所述检测板。

步骤三，选用的牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)的纯度大于96％（Sigma A6003）；卵清蛋白(ovalbumin，OVA)的纯度大于98％（Sigma A5503）；链霉素（Streptomycin，SM)的纯度大于98％（Sigma S1277）。 

2）完全抗原的制备 

制备用于动物免疫及单抗筛选的完全抗原：

步骤一、SM-OVA的合成，将EDC置于室温下，放置3h；取10mg OVA溶于1mL MES缓冲液中，取20mg SM溶于2.5mL MES缓冲液中，两溶液混合；取5mg EDC溶于0.5mL灭菌蒸馏水中后，缓慢加入SM和OVA的混合溶液，室温下反应6h，在4 ℃冰箱中,用PBS0.01 moL/ L，pH 7.2, 透析4次，每次5 h，偶联产物冷冻干燥保存备用，用于Balb/c小鼠免疫。

3）单克隆杂交瘤细胞系的制备 

步骤一、动物免疫  分别以SM-OVA免疫8周龄Balb/c 小鼠：首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，多点皮下注射。初次免疫间隔21d，以后每隔14d用不完全佐剂乳化，加强免疫4 次；第4 次免疫7d后，尾静脉采血，分离血清，测定效价。

步骤二、细胞融合  取已经免疫的BALB/c小鼠，采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清,常规方法进行细胞融合，并经HAT培养基筛选，待杂交瘤细胞长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。 

步骤三、杂交瘤细胞克隆  SM-BSA抗原用包被液稀释至10ug/ml，包被酶标板，间接ELISA法对杂交瘤细胞培养上清进行检测;采用有限稀释法对抗体检测阳性孔进行三轮克隆，获较为均一的阳性克隆后，扩大培养，并液氮冻存。 

步骤四、抗体亚型鉴定  单克隆细胞培养液上清用PBS1:100倍稀释后，包被96孔酶标板（100ul/孔）;采用  Sigma公司的小鼠单克隆抗体分型试剂盒，按操作说明，间接ELISA法进行单克隆抗体亚型鉴定，每种抗体样品重复3次，并设阳性及空白对照。 

步骤五、单克隆腹水制备  8周龄Balb/c小鼠每只注射0.5ml降植烷，14d后分别注射Pami-SP20交瘤细胞0.5ml（1×107细胞/毫升），10d左右收集腹水，简单离心纯化后ELISA测定其效价。 

步骤六、 western-blot分析 参照分子克隆实验指南，配制各种溶液，积层胶浓度为4 % ，分离胶浓度为12 % ，BSA 、SM-BSA、SM-庆大霉素、SM-新霉素、SM-氨苄霉素、SM-卡那霉素、SM-大观霉素、SM-强力霉素50微克/孔分别点样，积层胶恒流10mA，分离胶恒流25mA电泳，电泳完毕后，电转硝酸纤维素膜，单克隆抗体1：2000稀释，western-blot验证其特异性。 

如图1所示，进行SDS-PAGE实验和蛋白质印迹，参照分子克隆实验指南，配制好反应液体，积层胶浓度为4 % ，分离胶浓度为12 % ，积层胶恒流10mA，分离胶恒流25mA电泳，电泳完毕后，电转硝酸纤维素膜，Pami-SP20-antibody单克隆抗体1：2000稀释，进行蛋白质印迹（western-blot），验证单克隆抗体的反应特异性。 

步骤七、 Pami-SP20-antibody单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记：称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜；反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱，流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液；待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中；用1M pH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3h；加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2h；在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h；3000rpm离心30min，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于3ml0.15M pH7.4的PBS中；将上述溶液装入透析袋中，用0.15M pH7.4的PB缓冲盐水透析，10,000rpm离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 

4）完全抗原的包被实验 在本实施例中需要对SM-BSA完全抗原的包被条件和浓度进行优化；为了达到此目的还需要先对试剂盒中ELISA反应液成分进行说明： 

试剂盒中ELISA反应液成分： 

酶结合物工作液: 辣根过氧化物酶标记的Pami-SP20-antibody单克隆抗体；

阳性对照：20ng/ml链霉素的PBS溶液；

阴性对照：无链霉素的PBS溶液；

样品稀释液：10mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中含有1％BSA，0.05％Tween-20和1mg/L庆大霉素；

浓缩洗涤液：0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中含有1%胎牛血清，0.5%Tween-20和20mg/L庆大霉素；

显色液A：0.02%H2O2 ；用0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠，pH 4.5稀释；

显色液B：0.4‰TMB-HCl：用50mM柠檬酸钠，浓HCl调pH值为2.8的溶液溶解；

终止液：2M H₂SO₄。

将上述实施例1中获取的SM-BSA抗原分别以40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.07534 ug/ml浓度包被酶联板，每孔用量100ul，4℃包被过夜，PBST洗涤3min，拍干，5%BSA 37℃封闭2h，Pami-SP20-antibody单克隆抗体1:5000倍稀释后取100 ul加入反应孔，37℃反应1h，PBST洗涤4次，每次1min，拍干，HRP标记抗鼠二抗1:10000倍稀释后，每孔加入100 ul，37℃反应40min，PBST洗涤4次，每次1min，拍干，每孔加入TMB底物溶液100 ul，37℃反应15min，加入50 ul 2M H₂SO₄终止反应，用酶标仪在450nm波长下测定OD值，如表2所示，结果显示在包被浓度1.25ug/ml范围内，实验OD值无明显差别，最终选择抗原包被浓度为10ug/ml。 

5）ELISA反应条件及其优化 

对抗原包被条件及ELISA反应条件进行系统优化，最终确定最佳ELISA反应条件为：用包被缓冲液将SM-BSA、BSA稀释至20 ug / mL，每孔加100μL，每组设3个重复，4 ℃包被过夜，弃去孔内的液体，PBST洗板1次，5%BSA 37℃封闭2h，弃上清，加入SM标准品50μL（浓度分别为0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL）和HRP标记的抗SM－OVA抗体50μL，使标准品中的SM和聚苯乙烯酶标板上的SM-BSA竞争抗SM抗体，37 ℃湿盒放置1 h，PBST洗板4次，每次1 min，拍干；加新鲜配置的TMB底物液100μL，37℃，避光显色15 min；空白对照组不加SM标准品50μL，其他操作同检测组。加50μL 2 mol/L  H₂SO₄终止反应，BIO-RAD2550型酶联免疫检测仪测OD450值。

6）试剂盒的特异性实验 

采用实施例3中的优化条件进行ELISA实验，选择链霉素、庆大霉素、新霉素、卡那霉素、大观霉素、氨苄霉素、强力霉素样品作为特异性实验参考样品，如表2所示，本发明的检测试剂盒及其采用的单克隆抗体具有良好的特异性，与上述参考样品均无交叉反应。

7）试剂盒的灵敏度实验 

将SM-BSA以20ug/ml包被酶联板，通过正交法法对SM标准品进行稀释，采用实施4中的优化条件进行ELISA实验，如表3所示，测定其检出下限为25ng/ml。

本发明选用weiCarbodiimide，EDC即为碳二亚胺，PIERCE公司,货号77652；Streptomycin，SM即为链霉素Sigma公司，货号S1277；ovalbumin，OVA即为卵清蛋白Sigma公司，货号A5503；Bovine Serum Albumin，BSA即为牛血清白蛋白Sigma公司，货号A6003； 

本发明选用Balb/c小鼠购自南方医科大学实验动物中心、SP2/0细胞由本实验室传代保存、PEG1500购自Merck公司，货号MK807489，辣根过氧化物酶购自Sigma，货号YA0989，TMB购自MBCHEM公司， Tween-20购自MBCHEM公司、小鼠单克隆抗体分型试剂盒购自Sigma公司，货号098k4823，弗氏不完全和完全佐剂购自美国Sigma公司。

本发明保藏编号为CCTCC NO:C201135培养物的保藏时间是2011年6月22日。

保藏单位的地址：中国.武汉.武汉大学.“中国典型培养物保藏中心”；

邮编：430072；电话：027—68752319。

Claims (6)

1.有保藏号为CCTCC C201135的单克隆杂交瘤细胞株Pami-SP20。

2.一种抗氨基苷类抗生素的单克隆抗体Pami-SP20-antibody，其特征在于：由具有保藏号为CCTCC C201135的杂交瘤细胞株Pami-SP20产生，所述抗体为IgG1亚型，可特异性识别氨基苷类抗生素，并具有较强的亲和力。

3.一种检测氨基苷类抗生素残留的试剂盒，其特征在于：利用保藏号为CCTCC C201135的单克隆杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，获取氨基苷类抗生素的检测方法及试剂盒，步骤如下；

其中完全抗原的制备：

步骤1  SM-BSA的合成，将EDC置于室温下，放置2-3h；取10mg BSA溶于1mL MES缓冲液中，取20mg SM溶于2.5mL MES缓冲液中，两溶液混合；取5mg EDC溶于0.5mL灭菌蒸馏水中后，缓慢加入SM和BSA的混合溶液，室温下反应5-7h，在4 ℃冰箱中,用PBS0.01 moL/ L，pH 7.2, 透析4次，每次5-6 h，偶联产物冷冻干燥保存备用，用于单克隆抗体的ELISA筛选；

步骤2  SM-OVA的合成，将EDC置于室温下，放置2-3 h；取10mg OVA溶于1mL MES缓冲液中，取20mg SM溶于2.5mL MES缓冲液中，两溶液混合；取5mg EDC溶于0.5mL灭菌蒸馏水中后，缓慢加入SM和OVA的混合溶液，室温下反应5-7h，在4 ℃冰箱中,用PBS0.01 moL/ L，pH 7.2, 透析4次，每次5-6 h，偶联产物冷冻干燥保存备用，用于Balb/c小鼠免疫；

其中单克隆杂交瘤细胞系的制备：

步骤1动物免疫，分别以SM-OVA免疫8周龄Balb/c 小鼠；首次免疫取200ulSM-OVA加入等量弗氏完全佐剂乳化抗原，多点皮下注射，初次免疫间隔21d，以后每隔14d，用150ulSM-OVA加入等量不完全佐剂充分乳化，加强免疫4 次，第4 次免疫3d后，尾静脉采血，分离血清，测定效价；

步骤2 细胞融合，取免疫的BALB/c小鼠，采血，常规方法进行细胞融合，经HAT培养基筛选，期间视细胞生长情况，每3-5d换液一次，10d后改换HT培养液；

步骤3杂交瘤细胞克隆，待杂交瘤细胞长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测：将SM-BSA抗原分别以10 ug/ml浓度包被酶联板，每孔用量100ul，4℃包被过夜，用PBST洗涤3min，拍干，5%BSA 37℃封闭2h，待检细胞培养上清1:5倍稀释后，取100 ul加入反应孔，37℃、反应1h，PBST洗涤4次，每次1min，拍干，用HRP标记抗鼠二抗1:10000倍稀释后，每孔加入100 ul，37℃、反应40min，再用PBST洗涤4次，每次1min，拍干，每孔加入TMB底物溶液100 ul，37℃、反应15min，加入50 ul 2M H₂SO₄即终止反应；阳性克隆采用有限稀释法对抗体检测阳性孔进行三轮克隆，获阳性克隆后，扩大培养，并液氮冻存；

步骤4 抗体亚型鉴定，单克隆细胞培养液上清1:100倍稀释后，按100ul/孔包被96孔酶标板 ；采用Sigma公司小鼠单克隆抗体分型试剂盒，货号098k4823，进行单克隆抗体亚型鉴定，每种抗体样品重复3次；

步骤5单克隆腹水制备，8周龄Balb/c小鼠每只注射0.5ml降植烷，14-20d分别注射Pami-SP20交瘤细胞0.5ml，即为1×10⁷细胞/毫升；8-12 d收集腹水，离心纯化经ELISA测定其效价；

步骤6 western-blot即蛋白质印迹检测，参照分子克隆实验指南，配制好反应液体，用BSA 、SM-BSA、SM-庆大霉素、SM-新霉素、SM-氨苄霉素、SM-卡那霉素、SM-大观霉素、SM-强力霉素50微克/孔分别点样，积层胶恒流10mA，分离胶恒流25mA电泳，电泳完毕后，电转硝酸纤维素膜， Pami-SP20-antibody单克隆抗体1：2000稀释，进行western-blot反应，验证单克隆抗体的反应特异性；

步骤7 Pami-SP20-antibody单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记：称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜；反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱，流速控制在1ml/1min，收集棕色流出液；待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中；用1M pH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3h；加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2h；在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h；3000rpm离心30min，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于3ml0.15M pH7.4的PBS中；将上述溶液装入透析袋中，用0.15M pH7.4的PB缓冲盐水透析，10,000rpm离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。

4.根据权利要求2、3所述，其特征在于：采用了保藏编号为CCTCC C201135单克隆杂交瘤细胞株Pami-SP20所分泌的单克隆抗体Pami-SP20-antibody；

试剂盒的ELISA检测板：

将上述实施例1中获取的SM-BSA抗原以10ug/ml浓度包被酶联板，每孔用量100ul，4℃包被过夜，PBST洗涤3min，拍干，5%BSA 37℃封闭2h，晾干，即为所述ELISA检测板；

试剂盒的ELISA反应液： 

酶结合物工作液:辣根过氧化物酶标记的Pami-SP20-antibody单克隆抗体10ml；阳性对照：20ng/ml链霉素的PBS溶液；阴性对照：无链霉素的PBS溶液；样品稀释液：10mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中含有1％BSA，0.05％Tween-20和1mg/L庆大霉素；浓缩洗涤液：0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中含有1%胎牛血清，0.5%Tween-20和20mg/L庆大霉素；显色液A：0.02% H₂O₂ ；用pH 4.5的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠稀释；显色液B：0.4‰TMB-HCl：用50mM柠檬酸钠，浓HCl调pH值为2.8的溶液溶解；终止液：2M H₂SO₄；

试剂盒的ELISA反应条件:

ELISA反应条件为：用包被缓冲液将SM-BSA、BSA稀释至20 ug / mL，每孔加100μL，4 ℃包被过夜，弃去孔内的液体，PBST洗板1次，5%BSA 37℃封闭2h，弃上清，加入SM标准品50μL，使标准品中的SM和聚苯乙烯酶标板上的SM-BSA竞争抗SM抗体，37 ℃湿盒放置1 h，PBST洗板4次，每次1 min，拍干；加TMB底物液100μL，37℃，避光显色15 min；加50μL 2 mol/L  H₂SO₄终止反应，用BIO-RAD2550型酶联免疫检测仪检测OD 450值。

5.根据权利要求2、3所述，其特征在于：所用weiCarbodiimide，EDC即为碳二亚胺，PIERCE公司,货号77652；Streptomycin，SM即为链霉素Sigma公司，货号S1277；ovalbumin，OVA即为卵清蛋白Sigma公司，货号A5503；Bovine Serum Albumin，BSA即为牛血清白蛋白Sigma公司，货号A6003。

6.根据权利要求2、3所述，其特征在于：所用Balb/c小鼠购自南方医科大学实验动物中心、SP2/0细胞由本实验室传代保存、PEG1500购自Merck公司，货号MK807489，辣根过氧化物酶购自Sigma，货号YA0989，TMB购自MBCHEM公司， Tween-20购自MBCHEM公司、小鼠单克隆抗体分型试剂盒购自Sigma公司，货号098k4823，弗氏不完全和完全佐剂购自美国Sigma公司。

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