CN107056941A - 一种特异性识别山羊IFN‑γ的单克隆抗体制备方法 - Google Patents

一种特异性识别山羊IFN‑γ的单克隆抗体制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供一种特异性识别山羊IFN‑γ的单克隆抗体制备方法。IFN‑γ是动物体内的细胞因子，有许多重要的生物学功能，如抗病毒感染，抗肿瘤等，在机体免疫调节过程中担当着极其重要的角色。一方面，IFN‑γ可诱导巨噬细胞、T细胞、B细胞等细胞MHC II类分子表达，从而提升抗原呈递能力；另一方面能活化巨噬细胞释放过氧化氢促进杀伤细胞内寄生病原，活化巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的水平也明显提高。同时，在炎症反应中IL‑1β、IL‑17等细胞因子量的变化，也会引起IFN‑γ表达量的差异，这对研究炎症反应机制具有重大意义，为山羊IFN‑γ的后续相关研究奠定了基础。

Description

一种特异性识别山羊IFN-γ的单克隆抗体制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种特异性识别山羊IFN-γ的单克隆抗体制备方法，所得单克隆抗体仅识别山羊IFN-γ蛋白抗原，不与其他细胞因子发生交叉反应。
背景技术
IFN-γ作为生物体内抗病毒感染、抗肿瘤的重要细胞因子，在免疫应答中对APC、巨噬细胞、NK细胞、B细胞的膜分子表达、活化和分化都有非常积极地促进作用。现今，对于人类及小鼠的IFN-γ研究的比较透彻，但山羊IFN-γ的相关研究却鲜有报道，这极大地限制了对山羊疾病诊断和治疗及其体内炎症反应机制的研究，目前，市场上未见有山羊IFN-γ的相应产品。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种特异性识别山羊IFN-γ的单克隆抗体制备方法，其识别山羊IFN-γ的最低含量限度为0.2％，且不与其他细胞因子发生交叉反应，为山羊IFN-γ标记技术应用奠应基础。
实现上述发明目的所采用的技术方案是一种特异性识别山羊IFN-γ蛋白的单克隆抗体制备方法，用原核表达纯化的山羊IFN-γ作为免疫原，多次免疫BALB/c小鼠，分离脾细胞，与SP2/0瘤细胞进行细胞融合，筛选能稳定分泌特异性识别山羊IFN-γ蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
该方法以大肠杆菌原核表达并纯化的山羊IFN-γ为免疫原，设计免疫程序，免疫BALB/c小鼠。
所述设计免疫程序具体如下：
首次免疫，原核表达纯化山羊IFN-γ蛋白与完全弗氏佐剂等量混合，腹部皮下多点注射，200uL/只(1mg/mL)；两周后，第二次免疫，原核表达纯化山羊IFN-γ蛋白与不完全弗氏佐剂等量混合，腹部皮下多点注射，200uL/只；两周后，第三次免疫，直接免疫用无菌注射水溶解的原核表达纯化山羊IFN-γ蛋白，腹腔注射，100uL/只；融合前三天，加强免疫，直接用无菌注射水溶解的原核表达纯化山羊IFN-γ蛋白尾静脉注射，100uL/只。
采用本发明的方法制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能够特异性识别天然的山羊IFN-γ。
采用本发明的方法所获单克隆抗体可用于免疫组化试验、开发荧光抗体标记技术、检测试剂盒等，该株单抗识别山羊IFN-γ的最低含量限度为0.2％，且不与其他细胞因子发生交叉反应，为山羊IFN-γ标记技术应用奠应基础。
具体实施方式
本发明通过制备仅识别山羊IFN-γ的单克隆抗体，具体实施方式如下，以下实施用于说明本发明，但不限制本发明的使用范围。
实施例1一种特异性识别山羊IFN-γ的单克隆抗体制备方法，具体包括下列步骤：
1)制备免疫抗原
挑取IFN-γ-PET32-BL21(DE3)大肠杆菌(此菌为本实验室保留，可大量表达山羊IFN-γ蛋白)扩大培养，0.3Mol/L IPTG于30℃6小时诱导表达、10000rpm离心2min，PBS洗涤3次，40V 2s 2min超声破裂，11700rpm离心2min收集上清，再通过Ni-NAT法进行纯化，于冻干机内48小时冻干后保存备用，经测定1mg干粉中含有0.2mg蛋白，用无菌注射水溶解使其终浓度为1mg/mL，4℃备用。
2)设计免疫程序
取6-8周龄雌性BALB/c小鼠，进行免疫，共免疫4次。免疫方案如下：首次免疫，将纯化山羊IFN-γ溶液与完全弗氏佐剂等体积混匀，形成油包水状态，以200uL/只的剂量免疫小鼠，腹部皮下多点注射；二免于首免后2周进行，将纯化山羊IFN-γ溶液与不完全弗氏佐剂等量混合，形成油包水状态，剂量与方法同上；三免于二免后2周进行，直接注射纯化山羊IFN-γ溶液，100uL/只，腹腔注射；三免后一周，测其血清效价达到1∶106，尾静脉加强免疫，剂量同三免，三天后进行细胞融合。
3)制备杂交瘤细胞
细胞融合前一天，制备饲养层细胞：无菌条件下，抽取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞，铺于96孔细胞培养板备用。细胞融合：无菌条件下，将分离的脾细胞与SP2/0瘤细胞按108∶2×107个细胞数的比例进行混合，在2mL PEG1500的作用下进行细胞融合，将融合后的杂交瘤细胞铺于含有饲养层细胞的96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
4)筛选杂交瘤细胞
按照常规间接ELISA检测细胞培养上清：分别用经Con-A刺激后的山羊淋巴细胞上清液、纯化后的IFN-γ蛋白、PET32-BL21(DE3)大肠杆菌空载体表达的标签蛋白(标签蛋白)分别作为包被抗原，200uL/孔，包被后，4℃过夜，PBST(PBS与吐温20以2000∶1混匀)洗涤3遍，加入细胞培养上清，以阴性小鼠血清作为阴性对照，100uL/孔，每个稀释度做3个重复，37℃孵育1h，PBST洗涤3遍，加入辣根过氧化物酶标记的抗体，1∶5000稀释，100uL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3遍，加入TMB显色液，37℃孵育20min，加入终止液，置于酶标仪检测各孔OD450值，以S/P＞2.1为阳性判断标准，标记并筛选含有阳性杂交瘤细胞的细胞培养孔。
将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行单克隆化培养，单克隆化培养采用有限稀释法：首先，进行细胞计数，根据细胞计数结果，对细胞悬液进行适当稀释；如取230个活细胞悬浮于4.6mL的培养液中，此时，平均每0.1mL溶液含有5个细胞，接种于96孔板，每孔0.1mL，共36孔；剩余1mL，再加4mL培养基，共5mL，此时，平均每0.1mL溶液含1个细胞，接种于其次的36孔，每孔0.1mL；最后剩余1.4mL，再补加1.4mL，共2.4mL，接种于剩余24孔，每孔0.1mL，此时每孔0.5个细胞。铺板结束后，置于显微镜下，标记出只含有一个细胞的细胞培养孔。
5)制备小鼠腹水
扩大培养单克隆化的杂交瘤细胞，制备小鼠腹水，操作如下：小鼠注射液体石蜡，一周后，每只小鼠注射105个细胞，约7-12天后，小鼠大量产生腹水，将抽取的腹水，3000rpm离心10min，去除上层油脂及下层沉淀，收集澄清的腹水，置于-80℃保存。
试验例1单克隆抗体鉴定
1)单克隆抗体亚型鉴定：
亚型鉴定采用Sigma公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒进行鉴定，
具体步骤按试剂盒的说明书操作。主要步骤如下：
将待测细胞培养上清加入已包被抗原的酶标板中，100uL/孔，室温下作用2h，PBST洗涤3次。同型特异试剂IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，分别用PBST缓冲液1000倍稀释，100ul/孔，室温作用30min，PBST洗涤3遍。辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG，用PBST以1∶2500稀释，100uL/孔，室温作用15min，PBST洗涤3遍。加入新配底物，100uL/孔，室温下作用10-15min。用3mol/L的NaOH终止反应，50uL/孔，观察结果。本发明单克隆抗体亚型为IgG1。
2)单克隆抗体效价测定
取经Con-A刺激后的山羊淋巴细胞上清，200uL/孔，包被后，4℃过夜，PBST洗涤3遍，加入10倍连续稀释的腹水，以阴性小鼠血清作为阴性对照，以PBST作为空白对照，100uL/孔，每个稀释度做3个重复，37℃孵育1～2h，PBST洗涤3遍，加入辣根过氧化物酶标记的抗体，1∶5000稀释，100uL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3遍，加入TMB显色液，37℃孵育20min，加入终止液，置于酶标仪检测各孔OD450值，以S/P＞2.1为阳性判断标准，以阳性反应的最大稀释度作为腹水的检测效价。
注：淋巴细胞培养上清效价检测，将细胞培养上清倍比稀释，其余方法同上。
ELISA检测结果如下：细胞培养上清效价为29；小鼠腹水效价为108。细胞培养上清检测结果：
小鼠腹水检测结果：
3)单克隆抗体特异性鉴定
分别以淋巴细胞培养上清，IL-17重组蛋白、IL-1β重组蛋白(本实验室制备)作为包被抗原，包被后，4℃过夜。PBST洗涤3遍，将小鼠腹水1∶1000稀释后，100ul/孔，另设阴性血清、空白对照，孵育1～2h。PBST洗涤3遍，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体，1∶5000稀释，100ul/孔，孵育1h。PBST洗涤3遍，加入TMB显色液，避光孵育20min。加入终止液100ul/孔，置于酶标仪中检测OD450值。
具体检测结果如下：所得小鼠腹水仅特异性识别含有IFN-γ的淋巴上清，不识别IL-17重组蛋白和IL-1β重组蛋白。
4)单克隆抗体灵敏度测定
称取原核表达的IFN-γ纯化蛋白包被，使其包被浓度为1ug/孔，做3个重复，之后进行2倍比稀释，按照如上所述ELISA检测方法进行操作，置于酶标仪检测各孔OD450值，以S/P＞2.1为阳性判断标准，以阳性反应的最大稀释度作为小鼠腹水检测的最低限度。
灵敏度检测结果如下：当上清液稀释比例为1∶210时，其OD450值与阴性培养基OD450值差异不显著，则小鼠腹水的最低检测限度为0.2％。
小鼠腹水检测结果：
试验例2
取淋巴细胞培养上清液、血乳(确诊严重乳房炎)、空白载体纯化蛋白及RPMI1640不完全培养基，包被于96孔酶标板上，200uL/孔，每个样品做3个重复，置于4℃，过夜。PBST洗涤3遍，将1∶1000稀释的小鼠腹水加入各孔，100uL/孔，37℃孵育1～2h。PBST洗涤3遍，加入辣根过氧化物酶标记的抗体，1∶5000稀释，100uL/孔，37℃孵育1h。PBST洗涤3遍，加入TMB显色液，37℃避光孵育20min。加入终止液，置于酶标仪检测各孔OD450值，取样品平均值与已知标签蛋白值进行比较，所得结果如下：
所检样品 淋巴上清 血乳 培养基 标签蛋白
平均OD450值 1.092 1.099 0.078 0.071
结果判定：1号、2号样品OD450值显著高于后者，说明淋巴上清和血乳中含有大量IFN-γ蛋白；而新鲜培养基和空白载体蛋白OD450值接近空白值，说明其不含有IFN-γ蛋白。

Claims (3)

1.一种特异性识别山羊IFN-γ蛋白的单克隆抗体制备方法，其特征在于，用原核表达纯化的山羊IFN-γ作为免疫原，多次免疫BALB/c小鼠，分离脾细胞，与SP2/0瘤细胞进行细胞融合，筛选能稳定分泌特异性识别山羊IFN-γ蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
2.根据权利要求1的一种特异性识别山羊IFN-γ蛋白的单克隆抗体制备方法，以大肠杆菌原核表达并纯化的山羊IFN-γ为免疫原。
3.根据权利要求2的特异性识别山羊IFN-γ蛋白的单克隆抗体制备方法，其特征在于，所述设计免疫程序具体如下：
首次免疫，原核表达纯化山羊IFN-γ蛋白与完全弗氏佐剂等量混合，腹部皮下多点注射，200uL/只(1mg/mL)；两周后，第二次免疫，原核表达纯化山羊IFN-γ蛋白与不完全弗氏佐剂等量混合，腹部皮下多点注射，200uL/只；两周后，第三次免疫，直接免疫用无菌注射水溶解的原核表达纯化山羊IFN-γ蛋白，腹腔注射，100uL/只；融合前三天，加强免疫，直接用无菌注射水溶解的原核表达纯化山羊IFN-γ蛋白尾静脉注射，100uL/只。
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