CN102936583A - 呋喃它酮代谢物衍生物单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种单克隆抗体及其应用，尤其是呋喃它酮代谢物衍生物单克隆抗体及其应用，属于免疫化学技术领域。本发明的呋喃它酮代谢物衍生物单克隆抗体4B10’是由小鼠杂交瘤细胞株4B10产生，其亚型是IgG1型。本发明的有益效果是：通过小鼠杂交瘤细胞株4B10产生的单克隆抗体4B10’，能够大量生产，可用于制备检测呋喃它酮代谢物的酶联免疫分析法试剂盒和胶体金试纸条，达到快速且灵敏地检测肌肉、牛奶、及水产品中的呋喃它酮代谢物的目的。

Description

呋喃它酮代谢物衍生物单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体及其应用，尤其是呋喃它酮代谢物 

衍生物单克隆抗体及其应用，属于免疫化学技术领域。

背景技术

硝基呋喃类药物是人工合成的广谱抗生素，它有非常好的抗菌作用和药动力学的特征，曾经被广泛应用作为畜、禽、人工养殖水产品的促生长添加剂。但通过长期的实验室研究发现，硝基呋喃类药物和代谢物均可使实验动物发生癌变和基因突变，并由此推断，人类长期使用该类药物或长期食用添加该类促生长剂的畜、禽、人工养殖水产品，同样也可发生癌变和基因突变，所以此类药物禁止在治疗动物疾病和饲料中使用。 

我国于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令，在农业部发布的193号公告的《食品动物禁用兽药及其它化合物清单》中，硝基呋喃类抗生素在所有食品动物和所有用途中都被禁止使用。欧盟委员会于2003年通过了2003/181/EC委员会决议，建立了用于检测禽肉产品和水产品中硝基呋喃类药物的代谢物和各种方法的最小要求性能限值（Minimum Required Performance Limits，MRPL）为1μg/kg，欧盟从第三国进口的动物性产品中硝基呋喃类药物的代谢物的含量不得超过1μg/kg。2004年美国FDA公布了禁止在进口动物源性食品中使用的11种药物名单，其中包括呋喃它酮。因此，为确保动物源性食品的安全和对外出口贸易的发展，必须确立准确可靠，灵敏度高的定性定量方法。据申请人了解，申请号为200610127111.4，申请日为2006年9月7日，名称为《单克隆抗体介导的呋喃它酮残留检测方法及其应用》的中国发明专利申请中，公开了利用呋喃它酮的单克隆抗体检测呋喃它酮残留，由于呋喃它酮在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物是5-吗啉基甲基-3-氨基-2-恶唑烷酮（AMOZ）则能存留较长的一段时间，所以该方法不能够准确地检测呋喃它酮的残留。因此在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产物，检测监管部门就以检测代谢物为手段达到检测呋喃它酮残留的目的。目前用于呋喃它酮残留标示物AMOZ的检测方法有液液萃取-高效液相色谱、固相萃取-高效液相色谱法、液相色谱质谱联用仪方法等。由于仪器方法所需仪器价格昂贵，耗时长，对操作人员的要求较高，难于在基层单位推广，不适合高通量的样品快速筛选。 

发明内容

    本发明要解决技术问题是：针对以上现有技术存在的缺点，提 

出一种呋喃它酮代谢物衍生物的单克隆抗体，并将该单克隆抗体应用于检测呋喃它酮代谢物残留。该方法具有操作简便、成本低廉、高通量、特异性强的特点。

本发明所涉及的杂交瘤细胞株4B10已于2011年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC No.5073，分类命名为抗呋喃它酮代谢物衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

由以上杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体命名为4B10’，其制备步骤如下： 

a.制备免疫原和包被原：采用间醛基苯甲酸法将载体蛋白与呋喃它酮代谢产物小分子偶联，合成免疫原和包被原；

b.动物免疫注射：以Balb/c鼠作为免疫动物，免疫途径为颈背部皮下多点注射，融合前的超强免疫途径为腹腔免疫；

c.筛选动物免疫血清：用间接酶联免疫吸附法和竞争间接酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；

d.制备杂交瘤细胞：取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过亚克隆获得可以稳定分泌抗呋喃它酮代谢物衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞株4B10；

e. 制备并纯化单克隆抗体：对小鼠腹腔注射杂交瘤细胞4B10，采集腹水，对腹水进行液相层析纯化，获得呋喃它酮代谢物衍生物单克隆抗体4B10’。

其中，步骤a所述载体蛋白为牛血清白蛋白和卵清白蛋白，对应的免疫原为AMOZ-BSA，包被原为AMOZ-OVA；所述间醛基苯甲酸法中，交联剂活化载体小分子衍生物的时间为1~2 h，用呋喃它酮代谢物小分子衍生物与载体蛋白偶联反应10~15 h。所述步骤b中的各次免疫注射剂量为100 μg/只。所述步骤e中对免疫小鼠腹腔进行单克隆抗体细胞株的注射量为（1~5）×10⁶个/只。 

通过亚型鉴定得出本发明单克隆抗体的亚型为IgG1型。 

常规制备呋喃它酮代谢物衍生物单克隆抗体的方法主要是通过药物的羧基与载体蛋白的氨基偶联，本发明是将呋喃它酮代谢物小分子通过间醛基苯甲酸进行衍生化并将衍生产物的羧基通过混合多元酸酐法与载体蛋白的氨基偶联，这样，该法合成的完全抗原，通过“交联臂”间醛基苯甲酸的作用，可以将呋喃它酮代谢物小分子充分暴露出来，使机体更容易识别该抗原决定簇，提高抗原的免疫原性，在后期筛选过程中可以获得针对呋喃它酮代谢物衍生物的抗体。呋喃它酮代谢物衍生物结构式如下： 

 

本发明的再一个目的是提供该单克隆抗体在制备检测呋喃它酮代谢物中的应用，主要是将其应用于制备呋喃它酮代谢物残留的检测试剂盒和胶体金试条纸。

本发明的有益效果是：通过小鼠杂交瘤细胞株4B10产生的单克隆抗体4B10’，该抗体与其它呋喃类代谢物衍生物交叉反应率低，能够大量生产，并可用于制备检测呋喃它酮代谢物的酶联免疫分析法试剂盒和胶体金试纸条，达到快速、特异、且灵敏地检测牛奶，肌肉及水产品中的呋喃它酮代谢物残留的目的，为检测呋喃它酮代谢物残留的试剂盒研制奠定基础。 

附图说明

图1 为本发明实施例一中免疫原的OD₃₃₅标准曲线。 

图2为本发明实施例一中包被原的OD₃₃₅标准曲线。 

具体实施方式

实施例一 

试剂与材料准备

盐酸呋喃它酮（AM，上海安谱科学仪器有限公司，C13963000）呋喃它酮代谢物（AMOZ，上海安谱科学仪器有限公司，CDEO-NF003）；间醛基苯甲酸（ Alfa B21277）；DMF（sigma，D4551），牛血清白蛋白（BSA）（Jackson，001-000-173），卵清白蛋白（OVA）（Sigma, A5503），弗氏完全佐剂（Sigma, F5881），弗氏不完全佐剂（Sigma, F5506），四甲基联苯胺（TMB）（Amresco,0759），HAT(Sigma, H0262)和HT(Sigma, H0137)，氯化钠(Amresco, 0241)，氯化钾(Amresco, 0395)，磷酸二氢钾(Sigma, P9791)，磷酸氢二钠(Sigma, 71639)，羊抗鼠IgG-HRP(Jackson, 115-035-044)，二甲基亚砜（DMSO）（Applichem， 0231)，聚乙二醇4000（PEG4000） （Sigma，P7306），DMEM高糖培养基（Gibco，11995），胎牛血清（Gibco, C20270）。

实验动物与细胞：Balb/c鼠（6-8周龄，雌性），购自扬州大学动物中心，SP2/0（小鼠骨髓瘤细胞）由中科院生物物理研究所感染与免疫研究中心唐捷教授惠赠。 

本发明的实验步骤如下： 

a.  制备免疫原AMOZ-BSA和包被原AMOZ-OVA：

本发明所述的人工抗原采用间醛基苯甲酸法将AOMZ衍生化，并利用AMOZ衍生物上的羧基和载体蛋白上的氨基进行偶联，从而合成呋喃它酮抗原。

一、完全抗原合成 

1、将2 mg 呋喃它酮代谢产物小分子标准品与2.7 mg间醛基苯甲酸在1.5 mL吡啶溶液中15℃震荡反应24 h。

2、将反应液经旋转蒸发仪蒸干后溶于400 μL DMF溶液中，加三丁胺5 μl，冰浴振荡10 min后，加氯甲酸异丁酯3 μl冰浴振荡1 h。 

3、于冰浴条件下将反应产物缓慢滴加入BSA溶液或OVA溶液，滴加完毕后4℃搅拌反应24 h 。 

4、在0.01 M pH 7.4的 PBS中透析。 

二、免疫原及包被原偶联比测定 

免疫原与包被原偶联比测定方法：三硝基苯磺酸法（TNBS法），具体过程如下：

1、将载体蛋白BSA或OVA溶解在0.1 M，pH 8.5碳酸氢钠溶液中，配制成0 μg/mL，20 μg/mL，40 μg/mL，60 μg/mL，80 μg/mL，100 μg/mL，120 μg/mL共7个浓度梯度（用于绘制标准曲线）；同时，将待测样品按同样的方法配制成150 μg/mL的浓度。

2、将TNBS溶解于0.1 M，pH 8.5碳酸氢钠溶液中，配制成0.01%（w/v）溶液。 

3、将0.5 mL TNBS溶液分别加入1 mL 6个标样和1个待测样品中，混匀，37℃下孵育2 h。 

4、在上述7个样品中加入0.5 mL 10% SDS和0.25 mL 1 N HCL。 

5、335 nm处测定各样品的OD值，绘制标准曲线并计算待测样品中伯胺含量。 

表1  BSA与OVA标准样的OD₃₃₅

BSA蛋白标准溶液浓度(μg/mL)	0	20	40	60	80	100	120
								OD值	0	0.014	0.031	0.046	0.06	0.075	0.09
OVA蛋白标准溶液浓度(μg/mL)	0	20	40	60	80	100	120
								OD值	0	0.015	0.032	0.045	0.06	0.076	0.092

按上表所列数据绘制标准曲线如图1和图2，不同浓度下BSA、OVA标准蛋白在335 nm处OD值标准曲线均为y=0.0008x

通过紫外测定，在335 nm处，AMOZ-BSA，AMOZ-OVA样品的OD值分别为0.052、0.059。

根据TNBS法抗原偶连比测定公式， 

n=B×（100-A/k）%

B：载体蛋白自由氨基数（BSA、OVA标准蛋白自由氨基数分别为35，20）

A：待测样品在335 nm处的OD值

K：不同浓度下标准蛋白在335 nm处OD值标准曲线斜率

样品AMOZ-BSA的偶联比为35×（100-0.052/0.0008）%=12

样品AMOZ-OVA的偶连比为20×（100-0.059/0.0008）%=5

通过该方法，计算得出免疫原AMOZ-BSA的偶联比为12，包被原AMOZ-OVA的偶联比为5。

动物免疫： 

采用Balb/c鼠作为免疫动物，免疫原是AMOZ-BSA，每次免疫剂量≥50 μg/只小鼠，免疫两次以上。

c.      筛选动物免疫血清： 

以上免疫鼠在第二次免疫后7-10天用ELISA法和间接竞争ELISA方法检测血清效价^[2]。选取血清效价高的小鼠进行加强免疫。

d.     制备杂交瘤细胞： 

取上述免疫Balb/c小鼠的脾细胞，以50%的PEG4000作融合剂，将免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按一定比例进行细胞融合。采用间接ELISA法检测融合后存活的细胞培养上清，对阳性克隆进行亚克隆，检测有单克隆生长孔的细胞培养上清，阳性率达到100%，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株4B10；

该步骤中建立间接ELISA法的步骤如下：

最佳抗原包被稀释度的选择，采用方阵滴定法确定包被原浓度：

(1) 包被：用pH9.6的碳酸盐缓冲液将包被原稀释成一系列浓度加入酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜；

(2) 洗涤：甩净包被液，洗涤液是含1‰吐温的pH7.4的PBS，用洗板机洗板3次，并在吸水纸上拍干；

(3) 封闭：每孔加入200μL的BSA封闭液，37℃孵育1h；

(4) 洗涤同步骤（2）；

(5) 一抗：加入系列浓度的抗体，100μL/孔，37℃孵育1h；

(6) 洗涤同步骤（2）；

(7) 酶标二抗：加入羊抗鼠-HRP，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤同步骤（2）；

(8) 显色：每孔加入100μL的TMB显色液，20-25℃显色10min； 

(9) 终止反应：加入2M的H₂SO₄终止液终止反应，50μL/孔，并于酶标仪上读取OD₄₅₀值。

判定标准：根据 OD值在1.0左右，确定包被原最佳包被稀释度为1:40000，抗体最佳稀释度为1:32000，结果见表2。 

表 2 抗原、抗体最佳稀释度 

该步骤中建立间接竞争ELISA法的步骤如下：

 (1) 包被：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将包被原稀释到合适浓度，加入酶标板中，100 μL/孔，包被过夜；

(2) 洗涤：甩净包被液，洗涤液是含1‰吐温的pH 7.4的PBS，用洗板机洗板3次，并在吸水纸上拍干；

(3) 封闭：每孔加入200 μL的BSA封闭液，37℃孵育1 h；

(4) 洗涤同上；

(5) 加样：先将相邻两孔酶标板孔内加入适当浓度的呋喃它酮代谢物衍生物标准品50 μL/孔;在加入稀释好的羊抗鼠-HRP 50 μL/孔；最后加入稀释好的抗体50 μL/孔，酶标板稍作震荡混匀，25℃孵育30min；

(6) 洗涤同上；

(7) 显色：每孔加入100 μL的TMB显色液，20-25℃显色15 min； 

(8) 终止反应：加入2 M的H₂SO₄终止液终止反应，50 μL/孔，并于酶标仪上读取OD₄₅₀值。

判定标准：首先，从肉眼可以看出，抑制孔与未抑制孔颜色的变化，若抑制孔颜色较浅或者无色，说明有特异性抗体产生，反之则无特异性抗体产生。其次，根据OD值可以判定，抑制孔OD值小于未抑制孔OD值，说明有特异性抗体产生。采用有抑制效果血清的免疫小鼠脾细胞进行细胞融合，并筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。 

抗体特异性的强弱可根据竞争抑制率的大小来判定。 

竞争抑制率=1－B/B0（B为加竞争物的抑制孔OD值，B0为不加竞争物的阳性对照孔OD值）。 

e.      制备并纯化单克隆抗体，效价测定: 

首先制备和鉴定单克隆抗体：细胞复苏时取出冻存管，立即于37℃水浴中融化，之后移入培养皿内扩大培养，培养基为含10%FBS的DMEM培养基。其中，冻存管内冻存的是对数生长期的能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4B10。

用灭菌石蜡免疫Balb/c小鼠， 7天后小鼠腹腔注射杂交瘤细胞4B10，注射剂量为1.5*10⁶个/只，7~10天采集腹水，随后进行单克隆抗体纯化。 

辛酸-硫酸铵盐析法纯化单克隆抗体，具体步骤如下： 

（1）取1倍体积的腹水，加入2倍体积的NaAC-HAc缓冲液；

（2）按每mL腹水加入10%的辛酸的量，加好后，室温于摇床上摇30 min，之后4℃静置2 h；

（3）以4℃ 12000 rpm离心30 min，取上清，加入1/10体积的0.1M PBS，随后用NaOH调pH至7.4；

（4）向上清中加等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃静置1 h后，4℃、12000 rpm离心10 min；

（5）弃上清，用适量的PBS悬浮沉淀；

（6）将单抗悬液透析3次，每次不少于2 h；

（7）透析后的单抗做进一步纯化，液相柱层析洗脱缓冲液为20 mM Tris-HCl，1 M NaCl，pH 8.2，1 mL/管收集单抗。

（8）纯化后的单抗进行SDS-PAGE电泳检测其纯度。利用紫外分光光度计测定其浓度，ELISA方法测定单抗效价，分装，低温保存； 

（9）单抗效价的测定：以0.1μg/mL的包被原AMOZ-OVA包被ELISA板，将纯化的4B10’单抗进行1：10000，1:20000，1:40000，1:80000，1:160000，1:320000，1:640000稀释，加入酶标板孔内，反应后加入HRP标记的羊抗鼠IgG，最后用TMB显色，4B10’的效价测定

结果见表3。

表3抗体效价测定 

阳性判定标准：P/ N≥2.1

4B10’抗体检测结果：当纯化抗体浓度为1mg/mL时，效价可达3.2×10⁵以上；

（10）单克隆抗体亲和力的测定

根据 Gosling介绍的ELISA方法进行抗体亲和力的测定，其亲和力的大小用亲和常数Ka的大小来表示，公式为：

亲和常数的单位为浓度的倒数，即：克分子浓度 (L／moL)，其值越高表示抗原抗体结合的紧密程度越高。其检测过程如下： 

第一步、确定抗原，抗体最佳作用浓度：

1、将人工抗原分别进行10000，20000，40000，80000，160000，320000倍稀释后各包被 4条，100 μL／孔，37℃，温育 2 h，洗涤、封闭； 

2、将抗体进行8000，16000，32000，64000，128000，256000倍稀释，分别加于2条中，100μL／孔，室温温育 1 h； 

3、将这两条中的抗体分别移入第二条中，室温温育1 h； 

4、将这两条洗涤加酶标二抗，继续做 ELISA，最后测定 OD值 A1；

5、后两条按上述步骤，最后测定 OD值A2。

6、根据公式 

计算f值，选取所有f值都小于10%的抗原，抗体稀释度，根据OD值大小确定最佳抗原浓度为80000倍稀释，最佳抗体浓度为128000倍稀释。

第二步、测定亲和力 

1、配制一系列浓度抗原 6个； 

2、在加有最佳浓度抗体的EP管内加入等量系列浓度抗原，共7管，最后一管加入抗原稀释液，室温下过夜； 

3、同时将抗原进行80000倍稀释后进行包被，室温下过夜，洗板，封闭； 

4、将第二步的反应产物取 100μL加入以上封闭的板孔内，室温下进行ELISA，最后测定 OD值 A； 

5、根据 Scatchard公式  

 计算其斜率值，

其中，α为游离抗原的浓度，V为结合抗体位点与总抗体位点的比，所得亲和力的大小即亲和常数Ka，为斜率值的负数。得到的结果是 单克隆抗体4B10’的亲和力为1.4×10¹⁰。

实施例二 

药物交叉反应试验

按实施例一中建立的单抗筛选间接竞争ELISA方法进行，呋喃它酮代谢物衍生物的单克隆抗体与呋喃它酮半抗原结构类似物如呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮进行竞争试验，将这些标准品稀释成不同浓度进行间接竞争ELISA，绘制抑制曲线，计算竞争物的IC₅₀值和交叉反应率，结果显示该抗体与呋喃它酮四种结构类似代谢衍生物的交叉反应都很低，具体结果见表4。

表4呋喃它酮代谢物衍生物与其它呋喃类药物衍生物交叉反应率 

种类	%CR	种类	%CR
				呋喃它酮代谢物衍生物	100%	呋喃妥因代谢物衍生物	<0.1%
呋喃西林代谢物衍生物	<0.1%	呋喃唑酮代谢物衍生物	<0.1%

实施例三

本实施例是本发明中单克隆抗体4B10’在建立检测呋喃它酮代谢物残留的ELISA方法的应用举例，可以用于肌肉，水产品，牛奶中呋喃它酮代谢物残留的检测。以虾肉（市场购买）为例，说明检测虾肉中呋喃它酮代谢物残留的主要步骤如下：

一、样品前处理

(1)虾肉样，用均质器均质样本，称取1.0±0.05 g均质物（虾肉样），加入15 mL离心管。

(2) 加入4.0 mL的蒸馏水,0.5 mL 1 M HCl和100 μL衍生化试剂，充分振荡。 

(3)在37℃孵育16 h（过夜）。 

(4) 分别加入1.0 mL 0.5 M K₂HPO₄，0.4 mL 1M NaOH, 2 g NaCl和6 mL的乙酸乙酯，剧烈振荡5分钟。 

(5) 在室温下（20~25℃）4000 rpm离心10min。 

(6) 取出3 mL的乙酸乙酯上层到另一个15 mL离心管中，于50℃水浴中用氮气吹干。 

(7) 用1.0 mL正己烷溶解干燥物，加入1.0 mL复溶液充分震荡混合5min；在室温下（20~25℃）4000 rpm离心5min。 

(8) 取50μL下层溶液用于分析。 

二、    检测 

本发明中试剂盒的检测原理是间接竞争ELISA方法，将包被原AMOZ-OVA包被于微孔板上，分别加入50 μL的4.05，1.35，0.45，0.15,0.05和0 ng/mL的呋喃它酮代谢物衍生物或者样品，加入50 μL抗呋喃它酮代谢物衍生物的单克隆抗体4B10’，样品中残留的呋喃它酮代谢物衍生物与包被的抗原同时与抗呋喃它酮代谢物衍生物的抗体竞争性结合，加入50 μL酶标二抗，TMB显色，显色后在酶标仪上读取OD₄₅₀，样品中呋喃它酮代谢物含量与样本吸光度值呈负相关，与标准曲线相比，当OD值低于提供的参考值时可判定样品中含有的呋喃它酮代谢物残留超过检测限。

实施例四 

本实施例是本发明中的单克隆抗体4B10’在制备呋喃它酮代谢物残留的胶体金试纸条中的应用举例，主要是应用于检测肌肉、牛奶及水产品中的呋喃它酮代谢物残留。

反应原理采用竞争法对呋喃它酮代谢物进行半定量检测，样品中存在的呋喃它酮代谢物衍生物分子在沿试纸条上移过程中先与金颗粒标记的抗体4B10’结合，固定在NC膜上的包被原与呋喃它酮代谢物衍生物同时竞争结合金标抗体，T线的显色强弱与样品中残留呋喃它酮代谢物的含量成反比，若样品中无呋喃它酮代谢物残留，则金标抗体全部与包被原反应，试纸条的T线显色。当C、T线均显色时表示阴性，当C线显色T线不显色时则表示为阳性，当C线不显色，T线显色或不显色都表示试纸条失效。 

（1） 具体操作步骤如下： 

1、样品前处理：本方法中各种样品的处理方法同ELISA方法中的样品前处理方法；

2、将试纸条放于干净平整的台面上，用滴管吸取待测样品溶液，滴加1～2滴于样品垫上； 

3、等待紫红色条带的出现，静置反应5-10分钟时读取测试结果，10分钟以后判定无效。

除上述实施例外，本发明还可以有其它实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。 

参考文献 

1、Greg T. Hermanson. Bioconjugate techniques. Academic Press,2008:216-219.

2、杨利国，《酶免疫测定技术》，南京大学出版社，1998.

3. Gary C. Howard. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. CRC Press，2006.127-130。

Claims (4)

1.一种产生呋喃它酮代谢物衍生物的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4B10，是小鼠杂交瘤细胞系CGMCC No.5073。

2.根据权利要求1所述杂交瘤细胞株4B10产生的单克隆抗体4B10’。

3.根据权利要求2所述单克隆抗体4B10’，其特征在于：所述单克隆抗体亚型为IgG1型。

4.根据权利要求2所述单克隆抗体4B10’在检测呋喃它酮代谢物中的应用。

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