CN106645687A - 一种食品中呋喃它酮代谢物的检测试剂盒 - Google Patents

一种食品中呋喃它酮代谢物的检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种食品中呋喃它酮代谢物的检测试剂盒，包括：包被有呋喃它酮代谢物抗原的酶标板、呋喃它酮代谢物单克隆抗体、绿过氧化物酶标记羊抗鼠抗抗体、标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液；呋喃它酮代谢物抗原为呋喃它酮代谢物半抗原与钥孔血蓝蛋白的偶联物；绿过氧化物酶标记羊抗鼠抗抗体是采用戊二醛交联法将标记酶绿过氧化物酶与羊抗鼠抗抗体偶联得到。本发明的试剂盒灵敏度高，稳定性强，适用于鱼、虾等水产品，鸡肉、猪肉等畜禽产品。

Description

一种食品中呋喃它酮代谢物的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，具体是一种食品中呋喃它酮代谢物的检测试剂盒。
背景技术
硝基呋喃类光谱抗生素（呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林）主要出现在动物性食品中。他们对人类健康有恶性影响，有致癌性，包括美国、加拿大和欧盟在内的很多国家都有对食物中应用的禁令。这些国家对所有含有硝基呋喃残留的进口食物都有禁令。
由于呋喃它酮代谢物在一般的烹调中不易分解，在温和的酸性条件下可以从组织中释放出来，因此可以用来做检测使用。为了人和动物的安全很有必要对水源和食品（如：肉）进行该类抗生素残留检测。
目前呋喃它酮代谢物的检测方法主要是高效液相色谱法，液质联用法等紫外仪器方法，但是这些方法存在操作繁琐，耗时，费用比较贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测。因此建立一种快速简便的呋喃它酮代谢物检测方法具有重要意义。酶联免疫法是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、操作简便的食品中呋喃它酮代谢物的检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种食品中呋喃它酮代谢物的检测试剂盒，包括：包被有呋喃它酮代谢物抗原的酶标板、呋喃它酮代谢物单克隆抗体、绿过氧化物酶标记羊抗鼠抗抗体、标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液；所述的呋喃它酮代谢物抗原为呋喃它酮代谢物半抗原与钥孔血蓝蛋白的偶联物；所述的呋喃它酮代谢物半抗原的制备步骤如下：5g呋喃它酮代谢物和25～30ml二甲基苯二胺的混合液，室温下缓慢滴加入含3.5～4.2g二甲氨基苯甲醛的75～85ml二甲基苯二胺溶液中，滴加完毕后，从室温升温至48～53℃反应1.2～1.5h，除去溶剂，柱层析纯化，得到；所述的绿过氧化物酶标记羊抗鼠抗抗体是采用戊二醛交联法将标记酶绿过氧化物酶与羊抗鼠抗抗体偶联得到。
作为本发明进一步的方案：所述的标准品溶液的浓度分别为0μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.2μg/L、0.4μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L、3.2μg/L、6.4μg/L。
作为本发明进一步的方案：所述的底物显色液由底物显色A液和底物显色B液组合而成；所述的底物显色A液为含1.5～2.0mmol/L的过氧化脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述的底物显色B液为四甲基联苯胺的乙醇溶液。
作为本发明进一步的方案：所述的终止液为1.4～1.6mol/L的硫酸溶液。
作为本发明进一步的方案：所述的浓缩洗涤液为20×浓缩洗涤液，具体是含0.6～0.7%的吐温-20、0.003～0.005%的大庆霉素防腐剂、浓度为0.1～0.15mol/L的pH值为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液。
作为本发明进一步的方案：所述的浓缩复溶液为20×浓缩复溶液，具体是浓度为0.5～0.55mol/L的pH值为7.6～7.8的磷酸盐缓冲液。
利用所述的食品中呋喃它酮代谢物的检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：
（1）将待测样品进行前处理，得到待测样品溶液；
（2）用所述的检测试剂盒检测待测样品溶液；
（3）分析检测结果。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的试剂盒灵敏度高，稳定性强，该试剂盒可用于呋喃它酮代谢物的快速检测，适用于鱼、虾等水产品，鸡肉、猪肉等畜禽产品；利用该试剂盒进行检测时，灵敏度均可达0.05μg/L；本发明的试剂盒操作简单，读取结果时间短，按试剂盒说明在5～8min内即可判定检测结果；可批量检测，一步到位，成本低廉，投资少，见效快。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，一种食品中呋喃它酮代谢物的检测试剂盒，包括：包被有呋喃它酮代谢物抗原的酶标板、呋喃它酮代谢物单克隆抗体、绿过氧化物酶标记羊抗鼠抗抗体、标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。
呋喃它酮代谢物抗原为呋喃它酮代谢物半抗原与钥孔血蓝蛋白的偶联物；呋喃它酮代谢物半抗原的制备步骤如下：5g呋喃它酮代谢物和25～30ml二甲基苯二胺的混合液，室温下缓慢滴加入含3.5～4.2g二甲氨基苯甲醛的75～85ml二甲基苯二胺溶液中，滴加完毕后，从室温升温至48～53℃反应1.2～1.5h，除去溶剂，柱层析纯化，得到。绿过氧化物酶标记羊抗鼠抗抗体是采用戊二醛交联法将标记酶绿过氧化物酶与羊抗鼠抗抗体偶联得到。标准品溶液的浓度分别为0μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.2μg/L、0.4μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L、3.2μg/L、6.4μg/L。底物显色液由底物显色A液和底物显色B液组合而成；底物显色A液为含1.5～2.0mmol/L的过氧化脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，底物显色B液为四甲基联苯胺的乙醇溶液。终止液为1.4～1.6mol/L的硫酸溶液。浓缩洗涤液为20×浓缩洗涤液，具体是含0.6～0.7%的吐温-20、0.003～0.005%的大庆霉素防腐剂、浓度为0.1～0.15mol/L的pH值为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液。浓缩复溶液为20×浓缩复溶液，具体是浓度为0.5～0.55mol/L的pH值为7.6～7.8的磷酸盐缓冲液。
1、呋喃它酮代谢物半抗原的制备
5g呋喃它酮代谢物和25～30ml二甲基苯二胺的混合液，室温下缓慢滴加入含3.5～4.2g二甲氨基苯甲醛的75～85ml二甲基苯二胺溶液中，滴加完毕后，从室温升温至48～53℃反应1.2～1.5h，除去溶剂，柱层析纯化，得到呋喃它酮代谢物半抗原。
2、呋喃它酮代谢物抗原的合成
取呋喃它酮代谢物半抗原15mg用1ml二甲基苯二胺溶解，得到溶液A；取钥孔血蓝蛋白39mg用6ml水溶解，得到溶液B；将溶液A滴加入溶液B中，得到溶液C，室温反应20h；取NaBH412mg，用0.15ml的0.12mol/L的NaOH溶解后，倒入溶液C中，在4℃温度下反应1h；用0.008mol/l磷酸盐缓冲液在4℃条件下透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20℃保存备用。
3、包被有呋喃它酮代谢物抗原的酶标板的制备
用包被缓冲液将呋喃它酮代谢物抗原稀释成0.25～0.28μg/ml，每孔加入150μL，37℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤工作液（用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释）洗涤3次，拍干，每孔中加入150μL封闭缓冲液，37℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体拍干，用铝膜真空密闭保存。其中所述的包被缓冲液为pH值9.0～9.2的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭缓冲液为pH值7.4的0.1～0.2%的鸡卵清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
4、羊抗鼠抗抗体的制备
以羊为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体。
5、绿过氧化物酶标记羊抗鼠抗抗体的制备
将标记酶绿过氧化物酶与羊抗鼠抗抗体采用戊二醛交联法进行偶联得到绿过氧化物酶标记羊抗鼠抗抗体。
6、呋喃它酮代谢物单克隆抗体的制备
动物免疫：呋喃它酮代谢物半抗原与载体蛋白偶联物免疫8～10周龄Balb/c小鼠。
细胞融合与克隆化：取免疫后的鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂聚乙二醇4000的作用下融合，筛选获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
经筛选得到呋喃它酮代谢物的单克隆杂交瘤细胞株。呋喃它酮代谢物的单克隆杂交瘤细胞株可以无限量的产生呋喃它酮代谢物特异性抗体，该抗体特异性是针对呋喃它酮代谢物的，灵敏度达到0.05μg/L。
细胞冻存和复苏：将杂交瘤细胞用冻存液制成1×109个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
利用所述的食品中呋喃它酮代谢物的检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：
1、样本的前处理
取1～3g待测样品于50ml离心管中，依次加入3～5ml去离子水，0.3～0.6ml的1mol/L盐酸，0.1～0.3ml衍生化试剂，震荡混匀3～5min，55～60℃水浴条件下孵育30min；取出后，依次加入3～6ml提取剂，0.3～0.5ml的1mol/L氢氧化钠，震荡混匀1～3min；4000转离心2～10min，取上层清液待测。
2、检测
（1）准备：使用之前将所有试剂和需用板条从冷藏环境中取出，置于室温放置60min，注意每种液体试剂使用前均须摇匀，取出所需的微孔条，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2～8℃。
（2）编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
（3）加标准品/样本：加标准品/样本50μl到对应的微孔中。
（4）抗体工作液和酶标记抗抗体浓缩液的混合（需要使用前才混合，混合均匀后立即使用）：将抗体工作液和酶标记抗抗体浓缩液按10：1体积比混合并混匀。
（5）加抗体工作液和酶标记抗抗体浓缩液的混合液：加抗体工作液和酶标记抗抗体浓缩液的混合液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。
（6）洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液（用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释）250μl/孔，充分洗涤3次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。
（7）显色：加入底物显色A液50μl/孔，底物显色B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min。
（8）测定：加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值。
3、检测结果分析
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值除以第一个标准的吸光度值，再乘以100%，即得到百分吸光率。以标准品百分吸光率为纵坐标，以呋喃它酮代谢物标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中呋喃它酮代谢物实际浓度。
上述检测试剂盒的灵敏度、特异性、精密度和准确度实验
1、试剂盒灵敏度测定
按照常规方法测定试剂盒灵敏度试验，试剂盒标准曲线最低点为0.05μg/L，标准曲线的范围为0.05～6.4μg/L，在鸡肉、猪肉、鸡肝、虾、鱼、蜂蜜样本中呋喃它酮代谢物检测限为0.05μg/kg。
2、试剂盒准确度和精密度
准确度是指测定值与真值间的符合程度，试剂盒的准确度常用回收率表示；精密度是反应测定方法对某一特定样品多次测定所得结果的重复程度，常用变异系数表示。分别向空白鸡肉、猪肉、鸡肝、虾、鱼、蜂蜜样本中添加呋喃它酮代谢物至终浓度为0.2μg/kg、0.4μg/kg，重复5次，分别取三个批次的试剂盒计算变异系数。结果表明，以0.2μg/kg呋喃它酮代谢物添加空白鸡肉、猪肉、鸡肝、虾、鱼时，样本添加回收率范围为75.6～100.0%，以0.4μg/kg呋喃它酮代谢物添加空白鸡肉、猪肉、鸡肝、虾、鱼时，样本添加回收率范围为74.8～99.9%；以0.2μg/kg呋喃它酮代谢物添加空白蜂蜜时，样本添加回收率范围为80.1～101.5%，以0.4μg/kg呋喃它酮代谢物添加空白蜂蜜时，样本添加回收率范围为81.4～102.3%；批内批间变异系数均小于20%，符合《农业部文件》农医发[2005]17号附件2试剂盒备案参考评判标准中第四点精密度和准确度的规定。
3、交叉反应率试验
选择呋喃它酮代谢物、呋喃唑酮代谢物、呋喃妥因代谢物、呋喃西林代谢物、呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林8种药物按照常规方法分别测定交叉反应率，结果显示除呋喃它酮代谢物外，其余各药物的交叉反应率均＜1%。
本发明的试剂盒灵敏度高，稳定性强，该试剂盒可用于呋喃它酮代谢物的快速检测，适用于鱼、虾等水产品，鸡肉、猪肉等畜禽产品；利用该试剂盒进行检测时，灵敏度均可达0.05μg/L；本发明的试剂盒操作简单，读取结果时间短，按试剂盒说明在5～8min内即可判定检测结果；可批量检测，一步到位，成本低廉，投资少，见效快。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.一种食品中呋喃它酮代谢物的检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有呋喃它酮代谢物抗原的酶标板、呋喃它酮代谢物单克隆抗体、绿过氧化物酶标记羊抗鼠抗抗体、标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液；所述的呋喃它酮代谢物抗原为呋喃它酮代谢物半抗原与钥孔血蓝蛋白的偶联物；所述的呋喃它酮代谢物半抗原的制备步骤如下：5g呋喃它酮代谢物和25～30ml二甲基苯二胺的混合液，室温下缓慢滴加入含3.5～4.2g二甲氨基苯甲醛的75～85ml二甲基苯二胺溶液中，滴加完毕后，从室温升温至48～53℃反应1.2～1.5h，除去溶剂，柱层析纯化，得到；所述的绿过氧化物酶标记羊抗鼠抗抗体是采用戊二醛交联法将标记酶绿过氧化物酶与羊抗鼠抗抗体偶联得到。
2.根据权利要求1所述的食品中呋喃它酮代谢物的检测试剂盒，其特征在于，所述的标准品溶液的浓度分别为0μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.2μg/L、0.4μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L、3.2μg/L、6.4μg/L。
3.根据权利要求1所述的食品中呋喃它酮代谢物的检测试剂盒，其特征在于，所述的底物显色液由底物显色A液和底物显色B液组合而成；所述的底物显色A液为含1.5～2.0mmol/L的过氧化脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述的底物显色B液为四甲基联苯胺的乙醇溶液。
4.根据权利要求1所述的食品中呋喃它酮代谢物的检测试剂盒，其特征在于，所述的终止液为1.4～1.6mol/L的硫酸溶液。
5.根据权利要求1所述的食品中呋喃它酮代谢物的检测试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗涤液为含0.6～0.7%的吐温-20、0.003～0.005%的大庆霉素防腐剂、浓度为0.1～0.15mol/L的pH值为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的食品中呋喃它酮代谢物的检测试剂盒，其特征在于，所述的浓缩复溶液为浓度为0.5～0.55mol/L的pH值为7.6～7.8的磷酸盐缓冲液。
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