CN102766213A - 用于检测呋喃它酮残留标示物amoz的单抗及酶联免疫方法与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能识别呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的单克隆抗体，所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞AMOZ所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201188。本发明还公开了检测呋喃它酮残留标示物AMOZ的酶联免疫方法与试剂盒及其在呋喃它酮残留标示物AMOZ检测中的应用。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体、酶联免疫试剂盒以及提供的酶联免疫方法检测灵敏度、精密度高、准确度好，半抗原合成工艺简便，合成效率高，样品前处理使用的衍生试剂是苯甲醛，较其他常用的衍生试剂邻硝基苯甲醛相比，具有毒性小的优点。
Description
技术领域
本发明属于检测分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能检测呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒。
背景技术
呋喃它酮属于硝基呋喃类药物，具有5-硝基呋喃环的基本结构，是一种广谱抗菌药，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、原虫等均有效，曾在养殖业中被广泛使用。毒理学试验证明呋喃它酮及其代谢物均有显著的致癌、致突变等严重毒性作用。欧盟已于1993年禁止呋喃它酮在养殖业中使用，我国发布的193号公告《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》将硝基呋喃类药物列入禁用清单。
由于呋喃它酮价格便宜、药效快，目前仍有很多养殖户违禁使用。我国对硝基呋喃类药物的残留监控形势依然严峻，必须尽快完善筛选检测体系，以保证公众的生命健康安全和促进国内外经济贸易的顺利进行。
HPLC-MS/MS是目前公认的硝基呋喃类药物残留检测的确证手段，对牛奶、蛋类、猪肉、禽肉、及虾肉等样品的检测限可达0.1~0.3μg/kg。虽然该方法的灵敏度和精确度均很高，但需要配备昂贵的仪器和专业技术人员，不适合室外操作及高通量筛选。
用于高通量筛选的免疫学检测方法是基于抗原抗体的生物学反应，灵敏度高并且易于操作。Umaporn Pimpitak等(2009)等制备了AMOZ的单克隆抗体，抗体的IC50值(以CPAMOZ计算浓度)为0.023μg/L，采用直接竞争ELISA方法对虾肉样品中AMOZ残留进行了检测。但是，该方法需要先将AMOZ与对醛基苯甲酸进行反应后再进行检测，反应的效率低，不能得到广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种能识别呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的单克隆抗体和检测呋喃它酮残留标示物AMOZ的酶联免疫方法与试剂盒。本发明还提供所述单克隆抗体在制备检测呋喃它酮残留标示物AMOZ的酶联免疫试剂盒中的应用以及酶联免疫方法和试剂盒在呋喃它酮残留标示物AMOZ检测中的应用。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种能识别呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮的单克隆抗体，它是由杂交瘤细胞AMOZ所分泌的。
所述的杂交瘤细胞AMOZ，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C201188。
所述的单克隆抗体在制备检测呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮的酶联免疫试剂盒中的应用。
包含所述的单克隆抗体的试剂盒。
所述的试剂盒，是用于检测呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮的酶联免疫试剂盒。
所述的试剂盒在呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮检测中的应用。
一种检测呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮的酶联免疫方法，包括以下步骤：
(1)将3-对醛基苯甲酸基-5吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(CPAMOZ)与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原(CPAMOZ-BSA偶联物)；
(2)将3-对醛基苯甲酸基-5吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(CPAMOZ)与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原(CPAMOZ-OVA偶联物)；
(3)利用步骤(1)的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO:C201188的杂交瘤细胞AMOZ；
(4)用保藏号为CCTCC NO:C201188的杂交瘤细胞AMOZ制备单克隆抗体；
(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；
(6)样品前处理：将待测样品用酸处理，加入苯甲醛超声衍生后，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层氮气吹干、正己烷净化和样品稀释液重新溶解得到待测物。
(7)对步骤(6)的待测物进行酶联免疫检测。
所述的酶联免疫方法在呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮检测中的应用。
本发明的有益效果是：
1．本发明制备的单克隆抗体能够识别3-苯甲醛基-5吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(PAMOZ)，而PAMOZ是呋喃它酮的残留标示物AMOZ与苯甲醛反应的衍生产物。
2、本发明不需要将AMOZ与对醛基苯甲酸进行反应后再进行检测，而是与苯甲醛进行反应后再进行检测，检测效率高。
3、本发明制备的单克隆抗体、酶联免疫试剂盒以及提供的酶联免疫方法检测灵敏度、精密度高、准确度好。
4.本发明设计的半抗原合成工艺简便，合成效率高，所用的试剂是毒性较小的对醛基苯甲酸，对操作者身体健康危害较小。样品前处理使用的衍生试剂是苯甲醛，较其他常用的衍生试剂邻硝基苯甲醛相比，具有毒性小的优点。
附图说明
图1为呋喃它酮残留标示物AMOZ ELISA检测的标准曲线图。其中，x轴以100倍添加浓度的对数值绘制，y轴以各药物浓度下测定孔与零药物孔的检测OD值的比值(B/B0)绘制。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。
实施例1：抗原的合成
1.1半抗原3-对醛基苯甲酸基-5吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(CPAMOZ)的合成
在棕色小瓶中加入对醛基苯甲酸37.5mg，缓慢加入甲醇至完全溶解，磁力搅拌。加入呋喃它酮残留标示物AMOZ 50mg，室温避光磁力搅拌反应48h。8000rpm，10min离心去上清，甲醇洗涤3次，去上清，沉淀烘干得白色产物CPAMOZ。
1.2免疫原(CPAMOZ-BSA偶联物)的合成
取CPAMOZ 0.0167g溶于1ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入N，N’二环己基碳二亚胺(DCC)0.0137g和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.0072g，4℃磁力搅拌过夜。5000rpm，10min，4℃离心取上清备用为A液。称取0.070g BSA溶于5ml0.01M PH9.5碳酸盐缓冲液(CBS)中，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)0.5ml搅拌溶解备用为B液。磁力搅拌下，A液逐滴加入B液中，4℃反应过夜。5000rpm，10min，4℃离心取上清，4℃下生理盐水透析3天，每天更换3次透析液。
1.3包被原(CPAMOZ-OVA偶联物)的合成
取CPAMOZ 0.0167g溶于1mlDMF中，加入DCC0.0137g和NHS 0.0072g，4℃磁力搅拌过夜。5000rpm，10min，4℃离心取上清备用为A液。称取0.070g OVA溶于5ml 0.01M PH9.5CBS中，加入DMF0.5ml搅拌溶解备用为B液。磁力搅拌下，A液逐滴加入B液中，4℃反应过夜。5000rpm，10min，4℃离心取上清，4℃下生理盐水透析3天，每天更换3次透析液。
1.4竞争半抗原3-苯甲醛基-5吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(PAMOZ)的合成
以AMOZ与苯甲醛为原料，合成PAMOZ。在置于磁力搅拌器上的小瓶中加入乙醇1.5ml，搅拌中加入苯甲醛21ul，AMOZ40mg，室温避光反应24小时，离心，乙醇洗涤3次，干燥，得白色产物PAMOZ。
实施例2：单克隆抗体的制备
杂交瘤细胞株的制备：参照薛庆善《体外培养的原理与技术》科学出版社2001年版中的方法：以实施例1制备的CPAMOZ-BSA偶联物免疫Balb/C小鼠，免疫程序为：基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点注射，以后每间隔2周加强免疫一次，换用不完全佐剂乳化，最后于融合前三天腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在体积比为75%的酒精中浸泡5min消毒。
将3~5×107SP2/0骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾脏细胞悬液加入到50mL离心管中，混匀，1500r/min离心5min。弃上清，并用灭菌的滤纸吸干。轻轻敲击管底，使管底细胞松动。将离心管置于37℃水浴中，1min内缓慢加入预温至37℃的50%聚乙二醇(PEG)0.8mL，边加边轻轻用吸管尖搅拌，加完后继续搅拌30sec，静置1min。
缓慢加入37℃预温的RPMI-1640基础液10mL。具体方法为：第1min逐滴加1mL，第2min加2mL，之后缓慢加入剩余的RPMI-1640基础液，边加边轻摇离心管。缓慢加入40mLRPMI-1640基础液，加完后，缓慢上下颠倒混匀，1500r/min离心5min。弃上清，10mL滴管吸取含饲养细胞HAT培养基，沿管壁缓慢滴加，用滴管缓慢机械搅拌，缓慢吸取融合细胞，接近饲养细胞液面滴加，机械搅拌混匀。接种于6块96孔培养板中，约150μL/孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。
从融合当天起计为0d，3d后每个培养孔滴加1滴HAT培养基，5d后有规律地每隔2d吸去l/2体积的培养基，换入等量HT培养基。在融合后4d，开始对融合细胞进行跟踪观察，标记和记录有杂交瘤细胞生长的培养孔，并计算融合率。在融合后6~7d，待孔内细胞长至孔底1/10～1/5时，取培养上清，用间接竞争ELISA方法筛选阳性细胞孔。包被原浓度为10mg/L。每个细胞培养孔设置0孔和200μg/L药物孔，每孔中加入50μL培养上清进行间接竞争ELISA检测。
选择4~6个上清检测呈强阳性且只有1~2个形态良好集落生长的孔，用有限稀释法进行亚克隆。经过3～4次克隆，最终筛选出分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株。申请人将该杂交瘤细胞命名为AMOZ，并于2011年9月8日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO:C201188。
腹水单抗制备与鉴定：在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI–1640基础培养基悬浮由保藏号为CCTCC NO:C201188的杂交瘤细胞AMOZ扩大培养的细胞，并将细胞数调至1×106个/mL，每只小鼠腹腔接种0.5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水。按照文献方法(朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法.北京：人民军医出版社，2000)，纯化获得单克隆抗体。采用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG1亚型。
实施例3：ELISA检测方法的建立
3.1ELISA条件的优化
准确吸取稀释好的CPAMOZ-OVA包被原工作液100μL于各孔，每个浓度包一行，于4℃冰箱过夜。取出酶标板，每孔加入洗涤液(PBST)250μL于各孔，摇床振动1min，甩净洗涤液，在吸水纸(或干净毛巾)上拍干。重复洗涤2次。准确吸取封闭液(1%OVA)250μL于各孔，37℃培养箱孵育2h。甩净封闭液，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，摇床振动1min，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤2次。
取已包被好的酶标板，每孔加入50μL 20mM pH7.4的PBS缓冲液，再每列行加入同一浓度稀释好的一抗50μL，37℃反应30min，洗涤3次、拍干。每孔加入1：5000的HRP标记的羊抗兔IgG工作液100μL，37℃反应30min，洗涤3次、拍干。加入底物(A：B＝1：100)各100μL，37℃避光反应15min，用50μL终止液终止反应，于450nm测定吸光值。
表1最佳包被原浓度的确定
| 6400 | 12800 | 25600 | 51200 | 102400 | 204800 | |
| 16 | 3.796 | 3.775 | 3.703 | 3.204 | 2.339 | 1.575 |
| 8 | 3.914 | 3.802 | 3.617 | 3.193 | 2.288 | 1.494 |
| 4 | 3.42 | 3.704 | 3.648 | 3.046 | 2.251 | 1.456 |
| 2 | 3.808 | 3.642 | 3.423 | 2.73 | 2.049 | 1.313 |
| 1 | 3.668 | 3.578 | 3.35 | 2.677 | 1.801 | 1.109 |
| 0.5 | 3.595 | 3.419 | 3.006 | 2.205 | 1.514 | 0.901 |
| 0.25 | 3.366 | 2.991 | 2.538 | 1.801 | 1.115 | 0.602 |
| 0.125 | 2.82 | 2.324 | 1.868 | 1.305 | 0.728 | 0.439 |
如表1所示，确定0.25mg/L为包被原的最佳工作浓度。以0.25μg/mL包被浓度包被酶标板，将抗体稀释度等差设计为1:40000、1:45000、1:50000、1:60000，进行间接竞争ELISA，绘制标准曲线，计算IC50(见表2)。从表2中确定抗体最佳稀释度为1:50000。
表2最佳抗体稀释度优化
| 抗体稀释度(1∶X) | “0”孔OD值 | IC50(μg/L) |
| 40000 | 2.108 | 1.02 |
| 45000 | 1.934 | 0.98 |
| 50000 | 1.825 | 0.89 |
| 60000 | 1.730 | 0.92 |
3.2标准曲线的建立
用DMF将竞争半抗原3-苯甲醛基-5吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(PAMOZ)配制成1mg/mL的母液，然后用PBS将其依次稀释至8.1、2.7、0.9、0.3、0.1、0μg/L等5个浓度，进行间接竞争ELISA，绘制标准曲线，计算IC50。如附图1所示，本发明标准曲线的回归方程为y＝-0.615x+1.9538，相关指数r＝0.9961，IC50值为0.848±0.0757μg/L(n＝5)，线性范围为0.1～8.1μg/L。
3.3特异性选择硝基呋喃类药物原型及其代谢物以及结构类似物，替代PAMOZ，测定其标准曲线，并计算IC50，计算交叉反应率。结果如表3所示，该单克隆抗体对PAMOZ有特异性。
表3本发明试剂盒交叉反应率
| 药物名称 | IC50(μg/L) | 交叉反应率(％) |
| PAMOZ | 0.84 | 100 |
| 呋喃它酮 | 17.9 | 4.68 |
| AMOZ | ＞1000 | ＜0.1 |
| AHD | ＞1000 | ＜0.1 |
| SEM | ＞1000 | ＜0.1 |
| CBA | ＞1000 | ＜0.1 |
| CPAOZ | ＞1000 | ＜0.1 |
| CPAHD | ＞1000 | ＜0.1 |
| CPSEM | ＞1000 | ＜0.1 |
| 呋喃唑酮 | ＞1000 | ＜0.1 |
| AOZ | ＞1000 | ＜0.1 |
| 呋喃西林 | ＞1000 | ＜0.1 |
| 呋喃妥因 | ＞1000 | ＜0.1 |
实施例4：本发明ELISA检测试剂盒的组装
4.1试剂盒组成成分
(1)包被有包被原CPAMOZ-OVA偶联物的酶标板；
(2)PAMOZ标准品溶液6瓶，浓度分别为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1μg/L；
(3)杂交瘤细胞AMOZ单克隆抗体工作液；
(4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；
(5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.0g，KH2PO42.0g，Na2HPO4·12H2O 29.0g，KCl 2.0g，加双蒸水至1000mL；
(6)浓缩洗涤液：NaCl 80.0g，KH2PO42.0g，Na2HPO4·12H2O 29.0g，KCl 2.0g，Tween-205mL，加双蒸水至1000mL
(7)底物混合液：准确吸取底物B液(购自武汉市飞远科技有限公司)10mL，加入100μL底物A液(购自武汉市飞远科技有限公司)，混匀，现配现用。
(9)终止液：2mol/L硫酸溶液。
4.2酶标板的制备
(1)包被：用碳酸盐缓冲液将CPAMOZ–OVA稀释成0.25μg/mL包被原溶液，准确吸取100μL包被原溶液于各酶标孔，水平放置于湿盒，4℃孵育12h。
(2)洗板：甩出酶标板内包被原溶液，拍干，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。
(3)封闭：准确吸取250μL封闭液于各酶标孔，水平置于湿盒内，37℃培养箱孵育2h。
(4)洗板：甩出封闭液，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。
(5)烘干：在吸水纸上拍干后；将酶标板于37℃培养箱中倒置烘干0.5h。
(6)封装：酶标板烘干后和干燥剂一起装入铝箔袋，用真空封装机封装。所述的干燥剂为硅胶或无水氯化钙其中的一种。
实施例5：试剂盒在检测动物可食性组织中AMOZ残留的应用
5.1试剂配制
洗涤液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用双蒸水10倍稀释后使用。
样品稀释液：准确称取NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，KCl 0.2g于500mL烧杯中，加少量双蒸水溶解，双蒸水定容至1000mL。
1M盐酸：准确吸取浓盐酸8.2ml，双蒸水定容至100mL。
10mM苯甲醛溶液配制：准确称取苯甲醛1.06g，甲醇定容至1000mL。
0.1M K2HPO4溶液：准确称取K2HPO4·3H2O 22.8g，加少量双蒸水溶解，双蒸水定容至1000mL。
1M NaOH：准确称取NaOH 4g，加少量蒸馏水溶解，蒸馏水定容至100mL。
底物混合液配制：根据每次所需用量，取适量的底物A液与B液按1:100的比例混匀，现配现用。
5.2组织样品处理
(1)称取2.00±0.02g均质的组织样品于50mL具塞离心管内，加入4mL双蒸水，1M盐酸溶液0.5mL；和10mM苯甲醛200uL，漩涡震荡1min，50℃超声2h；
(2)分别加入0.1M K2HPO4 5mL,1M NaOH 0.5mL；和6mL的乙酸乙酯，涡旋2min。在室温下(20-25℃)4000r/min以上离心10min,取出1.5mL的乙酸乙酯到另一洁净容器中于50℃氮气吹干；
(3)用1mL正己烷溶解干燥物，然后加入1mL PBS,涡旋2min,室温下(20-25℃)4000r/min以上离心10min；
(4)取下层水相50uL用于分析。(稀释倍数：2)。
5.3ELISA测定程序
(1)取出试剂盒，平衡至室温，将足够标准品和样品所用数量的孔条插入微孔架。
(2)加PAMOZ标准品溶液或样品液50μL到各自微孔中；标准品和样品做两个平行实验，记录下标准品和样品的位置。加抗体液50μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min。
(3)甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30s左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤4次。
(4)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min。
(5)甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30s左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤5次。
(6)加底物混合液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育15min。
(7)加终止液50μL至各孔；充分混合；30min内在450nm处测量吸光值。
5.4结果判定
将PAMOZ标准品溶液或样品液吸光值的平均值除以“0”标准孔的吸光值再乘以100%，即为抑制率。在0.1~8.1μg/L范围内，以抑制率为纵坐标，标准液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程。按照公式1计算样品的抑制率，将抑制率代入回归方程，计算出测定浓度，乘以稀释系数，即为样品中AMOZ的残留浓度。
实施例6：本发明试剂盒的灵敏度、精密度、准确度
6.1本发明试剂盒的灵敏度
以最低检测限作为本发明试剂盒的灵敏度指标。取20份空白组织样品，进行ELISA检测，测定OD值，计算空白样品OD值的平均值
将
代入标准曲线上查出对应的浓度(C)，并计算标准差(SD)。根据公式Z＝C+3×SD计算Z值，此即为组织方法的最低检测限(LOD)，结果见表4。
表4AMOZ在各种动物组织样品中的最低检测限
| 组织样品 | 空白样品测定平均值(μg/kg，n=20) | SD(n=20) | LOD(μg/kg) |
| 猪肉 | 0.21 | 0.02 | 0.27 |
| 虾肉 | 0.23 | 0.01 | 0.26 |
| 鱼肉 | 0.25 | 0.01 | 0.28 |
| 蜂蜜 | 0.28 | 0.01 | 0.31 |
6.2本发明试剂盒的精密度
将PAMOZ标准品稀释成0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1μg/L，各浓度3个平行孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，将各标准品浓度对应的OD值代入其标准曲线方程求出ELISA检测的测定值，以标准品浓度测定值计算间接竞争ELISA标准曲线的板内板间变异系数，以此判断试剂盒的精密度，结果见表5。可见，本发明试剂盒的精密度良好。
表5本发明试剂盒的板内与板间变异系数
6.3本发明试剂盒的准确度
在匀质好的各种组织样品中加入AMOZ标准溶液，使其终浓度分别为0.5μg/kg和1μg/kg。每个浓度5个平行样，然后进行样品处理，ELISA测定药物浓度，重复3批，计算回收率，回收率按公式2计算，并计算批内和批间变异系数，结果见表6～9。可见，本发明试剂盒的添加回收均在60%~130%，批内批间变异＜20％，表明准确度良好。
表6猪肌肉中AMOZ添加回收率及变异系数
表7鱼肉中AMOZ添加回收率及变异系数
表8虾肉中AMOZ添加回收率及变异系数
表9蜂蜜中AMOZ添加回收率及变异系数
Claims (8)
1.一种能识别呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮的单克隆抗体，其特征在于：它是由杂交瘤细胞AMOZ所分泌的。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞AMOZ，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201188。
3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮的酶联免疫试剂盒中的应用。
4.包含权利要求1所述的单克隆抗体的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是用于检测呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮的酶联免疫试剂盒。
6.权利要求4或5所述的试剂盒在呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮检测中的应用。
7.一种检测呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮的酶联免疫方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将3-对醛基苯甲酸基-5吗琳代甲基-2-恶唑烷酮与牛血清白蛋白偶联得到免疫原；
（2）将3-对醛基苯甲酸基-5吗琳代甲基-2-恶唑烷酮与卵清蛋白偶联得到包被原；
（3）利用步骤（1）的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO:C201188的杂交瘤细胞AMOZ；
（4）用保藏号为CCTCC NO:C201188的杂交瘤细胞AMOZ制备单克隆抗体；
（5）用步骤（2）的包被原包被固相载体；
（6）样品前处理：将待测样品用酸处理，加入苯甲醛超声衍生后，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层氮气吹干、正己烷净化和样品稀释液重新溶解得到待测物。
（7）对步骤（6）的待测物进行酶联免疫检测。
8.权利要求7所述的酶联免疫方法在呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮检测中的应用。
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