CN108047156A - 一种螺环结构限定性5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮抗原、抗体及制备方法与应用 - Google Patents
一种螺环结构限定性5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮抗原、抗体及制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种螺环结构限定性5‑甲基吗啉‑3‑氨基‑2‑唑烷基酮抗原、抗体及其制备方法与应用。本发明首先对5‑甲基吗啉‑3‑氨基‑2‑唑烷基酮分子结构进行改造，合成了含螺环结构的5‑甲基吗啉‑3‑氨基‑2‑唑烷基酮半抗原，并以此基础制备了5‑甲基吗啉‑3‑氨基‑2‑唑烷基酮人工抗原和抗体，效价高、检测效率高；克服了传统仪器法存在周期长、专业性强、成本高，不适宜现场大批量快速检测等缺点问题。本发明的抗原抗体合成过程简单、成本低，为开发出成本低廉、检测效率高、操作简便的酶联免疫快速检测工具，奠定了基础，应用前景好。
Description
技术领域
本发明属于药物检测技术领域。更具体地，涉及一种螺环结构限定性5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮抗原、抗体及其制备方法与应用。
背景技术
呋喃它酮(furaltadone)，属于硝基呋喃类药物，是一类人工合成的广谱抗菌药物，在动物体内的代谢物是5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)。因为呋喃它酮能够干扰细菌体内的氧化还原酶系统，破坏细菌的糖代谢，使整个代谢系统紊乱，从而很好的起到杀菌作用。其作为一种药效显著的广谱抗菌药物，曾广泛应用于畜禽及水产养殖业，以治疗由大肠杆菌或沙门氏菌所引起的肠炎、疥疮、赤鳍病、溃疡病等或者作为促进水产动物生长的添加剂。呋喃它酮原药经动物服用后，在体内的代谢速度很快，一般数个小时就能转化成代谢物AMOZ，AMOZ能与动物体内蛋白质结合成稳定的残留物，在体内的代谢时间很长，当动物体内的这类药物残留量达到一定量时，会出现一系列的毒性症状，主要表现出腹泻、胃肠出血、周围神经炎、瘫痪、惊厥等反应，严重的造成动物死亡。另外，这类残留在动物体内的呋喃它酮代谢物通过我们普通的食品加工过程较难消除，如长时间的蒸煮、微波加热、烧烤等方式，都无法使其降解。当我们食用含有这类药物残留的食物后，残留物在人体酸性的胃液环境中释放，被人体吸收，进一步对人体的健康产生危害，如果长时间的蓄积则会诱导产生致畸、致癌和致突变等病变。最后，呋喃它酮原药本身也是一种致癌性较强的药物，能引起人体DNA一定程度的损伤以及真核细胞的诱变。
由于呋喃它酮及其代谢物的残留给人体及环境造成的危害之大，全球许多国家对它的使用做了限制。欧盟于1995年规定在动物性食品中禁止使用此类药物，并不得检出，在2007年将这类药物列为违禁药物。2010年，我国发布了《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单(第四批)》的通知，明确将硝基呋喃类药物呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因及呋喃西林列入可能违法添加的非食用物质名单。但是由于硝基呋喃类药物价格便宜且药效好，目前在畜牧、禽和水产养殖业中还在大范围的使用。同时也出现了相应的食品安全事件，如2015年，山东食品药品监督管理局在抽检的肉及肉制品中检出呋喃它酮代谢物。2017年，国家食药监局11月9日通报，该局抽检了鲜活水产品607批次，检出不合格样品66批次，其中硝基呋喃代谢物不合格样品16批次。针对以上情况，对于加强水产品等肉制品中的呋喃它酮类物质的检测亟不可待。因呋喃它酮在动物体内代谢快，若对其残留量进行检测，结果必定不够准确，而其代谢物因能和动物体内的蛋白形成稳定的结合物，所以检测其代谢物比检测原药更有意义。
目前常见的代谢物的检测方法有高效液相色谱技术及其联用技术、分光光度法、液相色谱－紫外法、原子吸收法、薄层色谱法等。然而，高昂的仪器设备，复杂繁琐的样品前处理，高额的检测成本以及需要专业人员操作使得上述方法越来越难以满足当前愈发高强度的食品安全监管的需求。因此建立快速、便捷的呋喃它酮类残留检测方法显得十分必要。基于抗原-抗体特异性识别的酶联免疫分析方法(ELISA)具有快速、灵敏、准确等优点，特别适用于现场进行高通量检测。另外，ELISA因其能弥补仪器法的上述不足，已在食品安全检测中发挥了重要作用。大多数农兽药、毒素、环境污染物分子量较小(<1000Da)，属于有反应原性而无免疫原性的小分子，但如果将小分子连接到具有免疫原性的大分子上，做成人工抗原，就可能使机体产生免疫应答，产生针对小分子结构的抗体。因为不是任何小分子与大分子载体连接都能产生特异性抗体，所以小分子半抗原结构的设计非常重要。对于半抗原结构的选择，如果小分子待测物本身含有-NH2，-COOH，-OH，-SH等功能基团，可直接活化后偶联载体蛋白，便可合成人工完全抗原。虽然5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮含有-NH2活性基团，但基于其结构为柔性线性结构，较为简单，不利于特异性抗体的产生。
发明内容
本发明要解决的技术问题是是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)结构限定性半抗原，同时提供由所述半抗原偶联载体蛋白制备的人工抗原，以及免疫实验动物后使机体产生特异的针对5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮的抗体。
本发明的目的是提供一种5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮螺环结构限定性半抗原。
本发明另一目的是提供一种5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮人工抗原。
本发明的再一目的是提供所述5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮螺环结构限定性半抗原、人工抗原及其制备的抗体在免疫检测5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮含量中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原，具有式I所示结构：
其中，R为亚甲基(-CH2-)和羰基(-CO-)。
当R为亚甲基时，所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原的结构如式Ia所示：
当R为羰基时，所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原的结构如式Ib所示：
所述述5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原在制备5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮人工抗原或抗体方面的应用，也在本发明的保护范围之内。
一种5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮人工抗原，由上述半抗原与大分子载体偶联得到。
当R为亚甲基时，所述5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮人工抗原的结构如式II a所示：
当R为羰基时，所述5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮人工抗原的结构如式II b所示：
优选地，结构式中的载体为牛血清蛋白(BSA)、α-淀粉酶、藻蓝素、伴刀豆球蛋白A(ConA)或卵清蛋白(OVA)。其中，BSA、α-淀粉酶、藻蓝素和ConA用于制备免疫原，OVA用于制备包被原。
所述5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮人工抗原在制备抗5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮抗体方面的应用，也应在本发明的保护范围之内。
所述抗体为多克隆抗体、单克隆抗体或者基因工程抗体。
一种以上述人工抗原为免疫原和包被原制备得到的抗5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮抗体，也在本发明的保护范围之内。
以及所述抗体在免疫法检测5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮中的应用，也在本发明的保护范围之内。
另外，本发明上述提供的所述5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原的制备方法如下：
当R为亚甲基(-CH2-)时，即5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ia的制备方法：以乙腈为溶剂，四氢萘酮(beta-四氢萘酮)、三甲基硅氰和氟化铯混合反应16h，获得中间体2；中间体2与氢化铝锂反应制备中间体3，再与二(对硝基苯)碳酸酯反应12h，得到中间体4；最后氢化钠和中间体4发生反应得到目标产物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ia，其反应式为：
5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ia的制备方法中的关键因素为：
(1)所述的四氢萘酮、三甲基硅氰和氟化铯的摩尔比为：0.1:1.5:0.1，室温搅拌，期间用TLC监控，产物需经柱层析分离提纯，经浓缩可得中间体2；
(2)所述的中间体2和氢化铝锂反应的这一步中，氢化铝锂的量为1.5当量，溶剂四氢呋喃，在1小时内将温度从0℃升至室温，期间进行搅拌反应,，得到中间体3，产物浓缩后无需纯化直接用于下一步；
(3)在未纯化的中间体3中加入1.2当量的二(对硝基苯)碳酸酯，室温反应12h，期间用TLC监控，产物需经柱层析分离提纯，经浓缩可得中间体4；
(4)所述的中间体与氢化钠的摩尔比为1.5:2，室温反应12h，期间用TLC监控，产物需经柱层析分离提纯，经浓缩可得目标半抗原Ia。
当R为羰基(-CO-)时，即5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ib的制备方法：以乙腈为溶剂，四氢萘酮(beta-四氢萘酮)、三甲基硅氰和氟化铯混合反应16h，获得中间体2；将中间体2溶于适量乙腈中，逐滴加入盐酸溶液，反应1h可得中间体3；将中间体3与适量的碳酸铵反应以制备中间体4；最后，碳酸钾和中间体4发生反应得到目标产物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ib，其反应式为：
5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ib的制备方法中的关键因素为：
(1)所述的四氢萘酮、三甲基硅氰和氟化铯的摩尔比为：0.1:1.5:0.1，室温搅拌，期间用TLC监控，产物需经柱层析分离提纯，经浓缩可得中间体2；
(2)所述的盐酸溶液的浓度为1N，经反应所获得的粗产物中间体3需用乙酸乙酯萃取，然后经水洗后浓缩干燥，无需进一步提纯直接用于下一步；
(3)所述的碳酸铵与中间体3反应的这一步中，碳酸铵的量为5当量，溶剂为乙醇，室温搅拌反应12h，产物经乙酸乙酯萃取，水洗后干燥浓缩可得中间体4；
(4)所述的中间体4与碳酸钾的摩尔比为1.5:2，溶剂DMF，室温搅拌反应12h，期间用TLC监控，产物需经柱层析分离提纯，经浓缩可得半抗原Ib。
另外，所述5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮人工抗原的制备方法是采用戊二醛法将式I所述半抗原与大分子载体偶联制备得到；具体包括如下步骤：将式I所示半抗原溶于PBS缓冲溶液(0.01M，pH 7.4)，与含有10mg/mL载体的PBS缓冲溶液混合，搅拌过程中逐滴加入适量的2.5％的戊二醛水溶液，室温避光反应3h，4℃用PBS透析2天，每天更换透析液3次，得到5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮人工抗原，分装，并低温保存备用；所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原与载体蛋白的的摩尔比为40～100:1(优选60:1)。
另外，一种直接检测5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮的快速免疫分析方法，包括如下步骤：
(1)将所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮免疫原免疫动物制备抗5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮多克隆抗体；
(2)将所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮包被原包被在微孔板上，将上步制备得到的多克隆抗体加入微孔板中；
(3)采用间接竞争ELISA方法检测抗血清效价。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮结构限定性半抗原。本发明首先在5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮分子结构的基础上引入羰基结构使半抗原手臂结构自由旋转度下降，使半抗原呈现构象限定性以及增加结构复杂性，然后又通过与酸酐反应延长手臂，使5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮分子的特征结构更好的被免疫动物所识别，从而可大大增加制备抗体的成功几率。
同时，本发明提供了由所述半抗原偶联载体蛋白制备的人工抗原，以及免疫实验动物后使机体产生特异的针对5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮的抗体，效价高、检测效率高。克服了传统检测5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮的仪器法存在周期长、专业性强、成本高，不适宜现场大批量快速检测等缺点，无法实现5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮的快速检测的问题。
本发明的抗原抗体合成过程简单、成本较低，并为开发出成本低廉，检测效率高、操作简便的酶联免疫快速检测工具，奠定了基础，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备的5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ia的核磁图。
图2为5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ia的质谱图。
图3为本发明制备的5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ib的核磁图。
图4为5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ib的质谱图。
图5为5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ia的抗体性能鉴定图。
图6为5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ib的抗体性能鉴定图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1：5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ia的合成
在25mL单口圆底烧瓶中，依次加入1.46g(0.1eq)四氢萘酮、1.52g(0.1eq)CsF、15mL(1.5eq)TMSCN，搅拌使固体溶解，室温反应16h，期间用TLC监控，反应结束后，目标产物经层析(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)后旋蒸浓缩，获得油状产物中间体2。在装有中间体2的25mL圆底烧瓶中加入10mL四氢呋喃，5g(1.5eq)LAH，0℃到室温，反应一小时，得到中间体3，产物经浓缩后无需纯化直接用于下一步，然后批量加入30g(1.2eq)的二(对硝基苯)碳酸酯，室温反应12h，期间用TLC监控，反应结束后，目标产物经层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)后旋蒸浓缩，得到白色固体产物中间体4。最后，将4g(2eq)NaH、3g(1.5eq)中间体4、10mLDMF置于25mL单口圆底烧瓶，室温搅拌反应12h，期间用TLC监控，反应结束后，快速层析柱分离(ACN：水)，旋蒸除掉有机试剂后得到白色固体产物，终产物经核磁(如图1)和质谱(如图2)鉴定结构正确，即获得半抗原Ia。
实施例2：5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ib的合成
在25mL单口圆底烧瓶中，依次加入1.46g(0.1eq)四氢萘酮1.52g(0.1eq)CsF、15mL(1.5eq)TMSCN，搅拌使固体溶解，室温反应16h，期间用TLC监控，反应结束后，目标产物经层析(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)后旋蒸浓缩，获得油状产物中间体2。在装有中间体2的25mL圆底烧瓶中加入5mL乙腈，使产物完全溶解，然后逐滴加入1mol/mL的盐酸调节pH至中性，室温反应一小时，产物经乙酸乙酯萃取，水洗后干燥浓缩，得到中间体3。在装有中间体3的25mL的圆底烧瓶中加入15mL乙醇溶解，然后批量加入5g(5eq)的碳酸铵，室温搅拌反应12h后，用乙酸乙酯萃取，经水洗后干燥浓缩，得到白色固体产物中间体4。最后，将3g(1.5eq)中间体4、2g(2eq)碳酸钾和10mL DMF置于25mL的圆底烧瓶中，室温反应12h，期间用TLC监控，反应结束后，目标产物经快速层析柱分离(ACN：水)，旋蒸除掉有机试剂后得到白色固体产物，终产物经核磁(如图3)和质谱(如图4)鉴定结构正确，即获得半抗原Ib。
实施例3：人工抗原的合成
本发明提供5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮人工抗原的制备方法，主要包括免疫原和包被原的合成。免疫原与包被原的制备不同之处在于载体种类，所述的免疫原采用的载体为牛血清蛋白(BSA)、α-淀粉酶、藻蓝素、伴刀豆球蛋白A(ConA)；所述的包被原采用的载体蛋白为卵清蛋白(OVA)。免疫原的制备方法。本发明采用的合成免疫原/包被原的方法为戊二醛法。
(1)免疫原的合成
将实施例1所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ia 1.7mg(0.008mmol)，溶于1mL的PBS缓冲溶液(0.01M，pH 7.4)中，与1mL 10mg/mL载体的PBS缓冲溶液混合，搅拌过程中逐滴加入100μL的2.5％的戊二醛水溶液，室温避光反应3h，4℃用PBS透析2天，每天更换透析液3次，得到5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮免疫原Ia-BSA，Ia-α-淀粉酶，Ia-藻蓝素，Ia-ConA。用PBS调整浓度为1mg/mL，每管500μL分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中，备用。
将上一步中的半抗原换成实施例2所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ib 1.84mg，其它合成步骤相同，可得5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮免疫原Ib-BSA，Ib-α-淀粉酶，Ib-藻蓝素，Ib-ConA，用PBS调整浓度为1mg/mL，每管500μL分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中，备用。
(2)包被原的合成
对于实施例1和2中所述的半抗原对应的包被原的合成方法，其合成步骤与免疫原的合成步骤一致，唯一不同的是将所用的载体换成OVA，由此可得包被原Ia-OVA、Ib-OVA。用PBS调整浓度为1mg/mL，每管500μL分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中，备用。
实施例4：5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮单克隆抗体、基因工程抗体和多克隆抗体的制备
1、单克隆抗体的制备
动物免疫：将实施例3制备的Ia和Ib的四种免疫原分别与等量的佐剂(第一次用完全弗氏佐剂，之后均用不完全弗氏佐剂)混合乳化，对Balb/c小鼠进行间隔免疫，间接免疫分析检测并得到血液中含有5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮特异性抗体的小鼠脾脏。
细胞融合与克隆：取产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融合，采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法或显微克隆法对阳性孔进行克隆化，得到并建立产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
细胞冻存与复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油，7～14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸胺法或亲和层析法进行腹水纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装，-20℃保存。
2、基因工程抗体的制备
提取5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮单克隆细胞或经5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮免疫原免疫后的小鼠脾脏细胞的RNA，反转录为cDNA，设计抗体轻重链扩增引物，利用PCR技术扩增出抗体的轻重链基因，插入表达质粒TGI菌株，在大肠杆菌中表达，利用免疫亲和方法进行纯化得到基因工程抗体，纯度由SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装，-20℃保存。
3、多克隆抗体的制备
将实施例3制备的免疫原Ia-BSA，Ia-α-淀粉酶，Ia-藻蓝素，Ia-ConA和免疫原Ib-BSA，Ib-α-淀粉酶，Ib-藻蓝素，Ib-ConA分别与等量的佐剂(第一次用完全弗氏佐剂，之后均用不完全弗氏佐剂)混合乳化，采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫体重为2.5～3kg的健康新西兰大白兔，每种免疫原对应注射两只。第一次免疫间隔四周后每三周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接ELISA测定血清效价，当效价不在上升时，采用耳缘静脉加强免疫。两天后心脏采血，室温静置0.5～1h，于4℃，12000r/min下离心10min，取上清分装于离心管中，于-20℃下保存备用。
间接竞争ELISA测定抗体效价以吸光值在1.0～1.5之间为准，结果表明，如图5所示，式Ia所对应的5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮免疫原Ia-ConA对应的多克隆抗血清的效价是1:32000，抑制率83％；如图6所示，式Ib所对应的5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮免疫原Ib-ConA对应的多克隆抗血清的效价是1:32000，抑制率82％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原，其特征在于，具有式I所示结构：
；
其中，R为亚甲基（-CH2-）和羰基（-CO-）。
2.权利要求1所述5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原在制备5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮人工抗原或抗体方面的应用。
3.一种5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮人工抗原，其特征在于，结构如式II a或式IIb所示：
。
4.根据权利要求3所述的人工抗原，其特征在于，结构式中的载体为牛血清蛋白、α-淀粉酶、藻蓝素、伴刀豆球蛋白 A或卵清蛋白。
5.权利要求3或4所述5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮人工抗原在制备抗5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮抗体方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体、单克隆抗体或者基因工程抗体。
7.一种抗5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮抗体，其特征在于，是以权利要求3或4所述人工抗原为免疫原和包被原制备得到。
8.权利要求7所述抗体在免疫法检测5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮中的应用。
9.权利要求1所述5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原的制备方法，其特征在于，当R为亚甲基（-CH2-）时，半抗原的制备方法为：以乙腈为溶剂，beta-四氢萘酮、三甲基硅氰和氟化铯混合反应16h，获得中间体2；中间体2与氢化铝锂反应制备中间体3，再与二（对硝基苯）碳酸酯反应12h，得到中间体4；最后氢化钠和中间体4发生反应得到目标产物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ia，其反应式为：
；
当R为羰基（-CO-）时，半抗原的制备方法为：以乙腈为溶剂，四氢萘酮、三甲基硅氰和氟化铯混合反应16h，获得中间体2；将中间体2溶于适量乙腈中，逐滴加入盐酸溶液，反应1h可得中间体3；将中间体3与碳酸铵反应得中间体4；最后，碳酸钾和中间体4发生反应得到目标产物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原Ib，其反应式为：
。
10.权利要求3或4所述5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮人工抗原的制备方法，其特征在于，采用戊二醛法将权利要求1所述半抗原与大分子载体偶联制备得到；具体包括如下步骤：将权利要求1所示半抗原溶于PBS缓冲溶液，与含有10 mg/mL载体的PBS缓冲溶液混合，搅拌过程中逐滴加入适量的2.5%的戊二醛水溶液，室温避光反应3h，4℃用PBS透析2天，每天更换透析液3次，得到5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮人工抗原，分装，并低温保存备用；所述的5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮半抗原与载体蛋白的的摩尔比为40～100：1。
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