BR112021000100A2 - Anticorpos contra agentes causadores de doença de aves domésticas e usos dos mesmos - Google Patents
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Abstract
são descritos, neste documento, métodos e anticorpos úteis para reduzir, eliminar ou prevenir uma infecção com uma população bacteriana em um animal. também são descritos, neste documento, antígenos úteis para o direcionamento por anticorpos de cadeia pesada e fragmentos vhh para reduzir uma população bacteriana em um animal.
Description
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US Nº 62/694.164, depositado em 5 de julho de 2018, cujo pedido é incorporado neste documento por referência. A prioridade é reivindicada de acordo com 35 USC §
119. O pedido de patente mencionado acima é incorporado por referência como se estabelecido totalmente neste documento.
[0002] Esta invenção se refere a métodos e composições para o controle de microrganismos associados à enterite necrótica e usos dos mesmos.
[0003] As perdas para a indústria agrícola após a contaminação do gado com patógenos são um fardo global. Com uma população global crescente e nenhum aumento significativo na quantidade de terras agrícolas disponíveis para a agricultura, há necessidade de produzir maiores quantidades de alimentos sem usar mais espaço. O tratamento tradicional de animais com antibióticos é o principal contribuinte para o surgimento de organismos multirresistentes a medicamentos e é amplamente reconhecido como uma solução insustentável para controlar a contaminação do gado. Há necessidade de desenvolvimento de moléculas específicas do patógeno que inibam a infecção ou associação do patógeno com o hospedeiro, sem estimular resistência. As perdas globais para a indústria avícola devido aos organismos patogênicos que causam a enterite necrótica foram estimadas em US$ 6 bilhões(1) por ano. A bactéria Clostridium perfringens é o agente causador da enterite necrótica em aves, em conjunto com uma variedade de fatores predisponentes(2).
[0004] Com referência às definições estabelecidas abaixo, são descritos neste documento polipeptídeos compreendendo fragmentos de região variável de cadeia pesada (VHHs), cujo uso pretendido inclui, mas não está limitado às seguintes aplicações na agricultura ou um campo não relacionado: diagnóstico, ensaios in vitro, alimentação, terapêutica, identificação de substrato, suplementação nutricional, pesquisa biocientífica e médica e diagnósticos associados. Também descritos neste documento são polipeptídeos compreendendo VHHs que se ligam e diminuem a virulência de agentes causadores de doenças na agricultura. Além dessas descrições, são apresentados a seguir os usos de polipeptídeos que compreendem VHHs em métodos de redução da transmissão e gravidade da doença em animais hospedeiros, incluindo seu uso como ingrediente em um produto. Mais descritos são os meios para produzir, caracterizar, refinar e modificar VHHs para esse propósito.
[0005] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são incorporados neste documento por referência na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse indicada específica e individualmente para ser incorporada por referência.
[0006] As características inovadoras da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações anexas. Uma melhor compreensão das características e vantagens da presente invenção será obtida por referência à seguinte descrição detalhada que estabelece modalidades ilustrativas, nas quais os princípios da invenção são utilizados, e as figuras anexas das quais:
[0007] FIGS. 1A-1B: O painel A mostra um esquema de anticorpos apenas com cadeia pesada de camelídeo e sua relação com os domínios V HH. O painel B ilustra as regiões estruturais (FRs) e as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do domínio VHH.
[0008] FIGS. 2A-2F: Mostra dados de ligação ELISA de fago para anticorpos VHH desta divulgação.
[0009] FIG. 3: Mostra que o CnaA não marcado pode superar a competição do CnaA marcado pela ligação ao colágeno
[0010] Ao descrever a presente invenção, a seguinte terminologia é usada de acordo com as definições abaixo.
[0011] Na descrição que se segue, determinados detalhes específicos são estabelecidos de modo a fornecer uma compreensão completa de várias modalidades. Entretanto, uma pessoa versada na técnica compreenderá que as modalidades fornecidas podem ser praticadas sem estes detalhes. A menos que o contexto exija de outra forma, ao longo do relatório descritivo e das reivindicações que seguem, a palavra “compreender” e variações das mesmas, tais como “compreende” e “compreendendo” devem ser interpretadas em um sentido aberto, inclusivo, que é como “incluindo, mas não limitado a". Conforme usado nesta especificação e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o(a)" incluem referentes plurais a menos que o contexto indique claramente de outra forma. Também deve ser notado que o termo “ou” é geralmente empregado em seu sentido incluindo “e/ou”, a menos que o conteúdo indique claramente o contrário. Além disso, os títulos fornecidos neste documento são apenas para conveniência e não interpretam o escopo ou significado das modalidades reivindicada. 1) Hospedeiro
[0012] Conforme referido neste documento, "hospedeiro", "organismo hospedeiro", "animal receptor", "animal hospedeiro" e variações dos mesmos referem-se ao receptor pretendido do produto quando o produto constitui um alimento. Em certas modalidades, o hospedeiro é da superordem Galloanserae. Em certas modalidades, o hospedeiro é um animal aviário. Em certas modalidades, o animal aviário é uma galinha, peru, pato, codorna, pombo ou ganso. Em certas modalidades, o animal aviário é uma galinha. 2) Patógenos
[0013] Conforme referido neste documento, "patógeno", "patogênico" e variações dos mesmos referem-se a microrganismos virulentos, que podem estar associados a organismos hospedeiros, que dão origem a um sintoma ou conjunto de sintomas nesse organismo que não estão presentes em organismos hospedeiros não infectados, incluindo a redução na capacidade de sobreviver, prosperar, reproduzir. Sem limitação, os patógenos abrangem parasitas, bactérias, vírus, príons, protistas, fungos e algas. Em certas modalidades, o patógeno é uma bactéria pertencente ao gênero Clostridium.
[0014] “Virulência”, “virulento” e suas variações referem-se à capacidade de um patógeno de causar sintomas em um organismo hospedeiro. "Fator de virulência" refere-se a ácidos nucleicos, plasmídeos, ilhas genômicas, genes, peptídeos, proteínas, toxinas, lipídios, maquinários macromoleculares ou complexos dos mesmos que têm um papel demonstrado ou putativo na infecção.
[0015] "Agente causador de doenças" refere-se a um microrganismo, patógeno ou fator de virulência com um papel demonstrado ou putativo na infecção. 3) Bactérias
[0016] Conforme referido neste documento, "bactérias", "bacteriana" e variações das mesmas referem-se, sem limitação, a espécies de Clostridium ou qualquer outra espécie bacteriana associada a organismos hospedeiros. Em certas modalidades, as bactérias podem não ser virulentas em todos os organismos hospedeiros aos quais está associada. 4) Anticorpos
[0017] Um esquema de anticorpos apenas com cadeia pesada de camelídeo e sua relação com domínios VHH e regiões determinantes de complementaridade (CDRs) é mostrado na FIG. 1. (Painel A). Um anticorpo apenas com cadeia pesada de camelídeo consiste em duas cadeias pesadas ligadas por uma ponte dissulfeto. Cada cadeia pesada contém dois domínios de imunoglobulina constantes (CH2 e CH3) ligados através de uma região de dobradiça a um domínio de imunoglobulina variável (VHH). (Painel B) são derivados de domínios VHH simples. Cada domínio VHH contém uma sequência de aminoácidos de aproximadamente 110-130 aminoácidos. O domínio VHH consiste nas seguintes regiões começando no terminal N (N): região estrutural 1 (FR1), região determinante de complementaridade 1 (CDR1), região estrutural 2 (FR2), região determinante de complementaridade 2 (CDR2), região estrutural 3 (FR3), região determinante de complementaridade 3 (CDR3) e região estrutural 4 (FR4). O domínio termina no terminal C (C). As regiões determinantes de complementaridade são altamente variáveis, determinam a ligação do antígeno pelo anticorpo e são mantidas juntas em uma estrutura em andaime pelas regiões estruturais do domínio VHH. As regiões estruturais consistem em sequências de aminoácidos mais conservadas; no entanto, existe alguma variabilidade nessas regiões.
[0018] Conforme referido neste documento, "VHH"; refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada simples que pode ser derivada de fontes naturais ou sintéticas. Os NBXs referidos neste documento são um exemplo de um VHH. Em um certo aspecto, um VHH pode não ter uma porção de uma região constante da cadeia pesada (CH2 ou CH3), ou uma região constante inteira da cadeia pesada.
[0019] Conforme referido neste documento, "anticorpo de cadeia pesada" se refere a um anticorpo que compreende duas cadeias pesadas e não tem as duas cadeias leves normalmente encontradas em um anticorpo convencional. O anticorpo de cadeia pesada pode ser originário de uma espécie da família Camelidae ou classe Chondrichthyes. Os anticorpos de cadeia pesada retêm a ligação específica a um antígeno na ausência de qualquer cadeia leve.
[0020] Conforme referido neste documento, "ligação específica", "liga-se especificamente" ou variações dos mesmos referem-se à ligação que ocorre entre um anticorpo e sua molécula alvo que é mediada por pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da região variável do anticorpo. A ligação que ocorre entre a região constante e outra molécula, como a Proteína A ou G, por exemplo, não constitui ligação específica.
[0021] Conforme referido neste documento, "fragmento de anticorpo" refere- se a qualquer porção de um anticorpo convencional ou de cadeia pesada que retém a capacidade de ligar-se especificamente a um antígeno alvo e pode incluir um anticorpo de cadeia simples, um fragmento de região variável de um anticorpo de cadeia pesada, um nanocorpo, um polipeptídeo ou um novo receptor de antígeno de imunoglobulina (IgNAR).
[0022] Conforme referido neste documento, um "anticorpo se origina de uma espécie" quando qualquer uma das regiões CDR do anticorpo foi criada em um animal da referida espécie. Os anticorpos que são produzidos em uma determinada espécie e, em seguida, otimizados por um método in vitro (por exemplo, exibição de fago) são considerados originários dessa espécie.
[0023] Conforme referido neste documento, "anticorpo convencional" refere- se a qualquer imunoglobulina de tamanho completo que compreende duas moléculas de cadeia pesada e duas moléculas de cadeia leve unidas por uma ligação dissulfeto. Em certas modalidades, os anticorpos, composições, alimentos, produtos e métodos descritos neste documento não utilizam anticorpos convencionais. 5) Sistema de Produção
[0024] Conforme referido neste documento, "sistema de produção" e suas variações referem-se a qualquer sistema que pode ser usado para produzir qualquer modalidade física da invenção ou formas modificadas da invenção. Sem limitação, isso inclui, mas não está limitado à produção biológica por qualquer um dos seguintes: bactérias, leveduras, algas, artrópodes, células de artrópodes, plantas, células de mamíferos. Sem limitação, a produção biológica pode dar origem a anticorpos que podem ser intracelulares, periplasmáticos, associados à membrana, secretados ou associados a fagos. Sem limitação, "sistema de produção" e variações do mesmo também incluem, sem limitação, qualquer sistema de produção sintético. Isso inclui, sem limitação, síntese de proteínas de novo, síntese de proteínas na presença de extratos celulares, síntese de proteínas na presença de enzimas purificadas e qualquer outro sistema alternativo de síntese de proteínas. 6) Produto
[0025] Conforme referido neste documento, "produto" refere-se a qualquer modalidade física da invenção ou formas modificadas da invenção, em que a ligação do VHH a qualquer molécula, incluindo a si mesma, define seu uso. Sem limitação, isso inclui uma ração, um aditivo para rações, um suplemento nutricional, uma pré-mistura, um medicamento, um terapêutico, uma droga, uma ferramenta de diagnóstico, um componente ou a totalidade de um ensaio in vitro, um componente ou a totalidade de um diagnóstico ensaio (incluindo ensaios de diagnóstico complementares). 7) Produto de alimentação
[0026] Conforme referido neste documento, "produto alimentício" refere-se a qualquer modalidade física da invenção ou formas modificadas da invenção, em que a ligação do VHH a qualquer molécula, incluindo a si mesma, define seu uso previsto como um produto a ser consumido por um organismo hospedeiro. Sem limitação, isso inclui um alimento, um pélete, um aditivo alimentar, um suplemento nutricional, uma pré-mistura, um medicamento, um produto terapêutico ou uma droga.
[0027] As descrições da invenção fornecidas devem ser interpretadas em conjunto com as definições e advertências fornecidas neste documento.
[0028] Por muitos anos, a indústria agrícola utilizou antibióticos para controlar bactérias patogênicas. Esses antibióticos também atuaram como promotores de crescimento. Essa abordagem contribuiu muito para a disseminação da resistência aos antibióticos entre os organismos patogênicos. Para eliminar gradualmente os antibióticos para fins não medicinais e limitar a resistência antimicrobiana, a utilização de antibióticos como promotores de crescimento na alimentação animal já foi proibida na Europa (a partir de 2006). A proteção generalizada de animais de criação por meio da vacinação falhou devido à curta vida útil de muitos animais importantes para a agricultura, desafios logísticos com a vacinação de rebanhos de tamanho industrial e altos custos. A retirada de antibióticos profiláticos na alimentação animal e a falha da vacinação em oferecer proteção generalizada reforçam a necessidade do desenvolvimento de produtos não antibióticos para administrar a animais agrícolas para prevenir infecções e promover o crescimento.
[0029] Patógenos significativos que afetam os animais domésticos incluem bactérias, como membros dos gêneros Clostridium e Salmonella, entre outros, bem como parasitas, como membros do gênero Eimeria.
[0030] As perdas devido ao Clostridium perfringens, o agente causador da enterite necrótica, são estimadas em US$ 6 bilhões(1) por ano. A enterite necrótica pode levar a uma mortalidade significativa em bandos de galinhas (3). Em níveis subclínicos, os danos à mucosa intestinal causados por C. perfringens levam à diminuição da digestão e absorção, redução do ganho de peso e aumento da taxa de conversão alimentar (3). Normalmente, a enterite necrótica ocorre após algum outro fator predisponente causar dano à mucosa do frango (2) . Os fatores de virulência de C. perfringens associados à enterite necrótica incluem a produção de toxinas e aderência ao colágeno(4).
[0031] A infecção subclínica por parasitas Eimeria é um dos fatores predisponentes mais comuns para enterite necrótica(2). Esses parasitas podem danificar fisicamente a camada epitelial e induzir a geração de mucosa (5). Além disso, os parasitas Eimeria também são o agente causador da coccidiose em galinhas, uma doença que é estimada em causar €10 bilhões em perdas de aves em todo o mundo(6). A coccidiose é caracterizada por redução do ganho de peso e conversão alimentar, má absorção, lise celular da ligação das células e diarreia (7).
[0032] Alterações na microbiota do trato gastrointestinal também podem servir para induzir enterite necrótica. Por exemplo, infecções precoces de pintinhos por Salmonella enterica podem resultar no desenvolvimento de enterite necrótica em modelos experimentais, possivelmente por meio da alteração da resposta imune do hospedeiro(8).
[0033] Outros fatores predisponentes propostos para o desenvolvimento de enterite necrótica incluem supressão imunológica por infecções virais, alterações físicas no intestino causadas por alterações na dieta e pecuária pobre (2).
[0034] Esforços anteriores no campo desta invenção dependem do organismo hospedeiro para gerar proteção contra agentes causadores de doenças. Essa abordagem é frequentemente limitada pela curta vida útil dos organismos hospedeiros afetados pelos patógenos listados acima, o que permite que o sistema imunológico do organismo hospedeiro tenha tempo suficiente para gerar imunidade de longa duração. Além disso, a eficácia das técnicas anteriores é limitada por desafios técnicos associados à vacinação generalizada de grandes bandos de organismos hospedeiros. Esses problemas são contornados pela introdução de peptídeos exógenos que neutralizam a virulência e a disseminação do agente causador da doença no hospedeiro por meio da alimentação, sem induzir a resposta imune do hospedeiro. Além disso, os métodos descritos neste documento fornecem escopo para a adaptação e refinamento de peptídeos neutralizantes, que fornecem funcionalidade sintética além do que o hospedeiro é naturalmente capaz de produzir.
[0035] Os fragmentos da região variável da cadeia pesada do anticorpo (VHHs) são proteínas pequenas (12-15 kDa) que compreendem regiões de ligação específicas a antígenos. Quando introduzidos em um animal, os VHHs se ligam e neutralizam o efeito dos agentes causadores de doenças in situ. Devido à sua menor massa, eles são menos suscetíveis do que os anticorpos convencionais, como IgYs previamente documentados, à clivagem por enzimas encontradas em organismos hospedeiros, mais resilientes às mudanças de temperatura e pH, mais solúveis, têm baixa absorção sistêmica e são mais fáceis de produzir de forma recombinante em grande escala, tornando-os mais adequados para uso na terapêutica animal do que os anticorpos convencionais. Anticorpos para prevenir ou reduzir a virulência (resumo)
[0036] Em um aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo ou pluralidades dos mesmos compreendendo um VHH ou VHHs que se ligam a agentes causadores de doenças para reduzir a gravidade e a transmissão de doenças entre as espécies. Em certas modalidades, o VHH é fornecido aos animais hospedeiros. Em certas modalidades, o VHH é um ingrediente de um produto. Vinculação para reduzir a virulência
[0037] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo ou pluralidades dos mesmos compreendendo um VHH ou VHHs que se ligam a agentes causadores de doenças e, ao fazer isso, reduzem a capacidade do agente causador de doenças de exercer uma função patológica ou contribuir para um fenótipo de doença. Em certas modalidades, a ligação do(s) VHH(s) ao agente causador da doença reduz a taxa de replicação do agente causador da doença. Em certas modalidades, a ligação do(s) VHH(s) ao agente causador da doença reduz a capacidade do agente causador da doença de se ligar ao seu receptor cognato. Em certas modalidades, a ligação do(s) VHH(s) ao agente causador da doença reduz a capacidade do agente causador da doença de interagir com outra molécula ou moléculas. Em certas modalidades, a ligação do(s) VHH(s) ao agente causador da doença reduz a taxa de replicação do agente causador da doença. Em certas modalidades, a ligação do(s) VHH(s) ao agente causador da doença reduz a capacidade do agente causador da doença de atingir o local da infecção. Em certas modalidades, a ligação do(s) VHH(s) ao agente causador da doença reduz a capacidade do agente causador da doença de causar morte celular. Anticorpos derivados de lhamas
[0038] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para a inoculação de Camelídeos ou outras espécies com fatores de virulência recombinantes, a recuperação de mRNA que codifica domínios VHH de linfócitos do organismo inoculado, a transcrição reversa de mRNA que codifica domínios VHH para produzir cDNA, a clonagem de cDNA em um vetor adequado e a expressão recombinante do VHH a partir do vetor. Em certas modalidades, o camelídeo pode ser um dromedário, camelo, lhama, alpaca, vicunha ou guacano, sem limitação. Em certas modalidades, as espécies inoculadas podem ser, sem limitação, qualquer organismo que pode produzir anticorpos de domínio único, incluindo peixes cartilaginosos, como um membro da classe de organismos Chondrichthyes, que inclui, por exemplo, tubarões, arraias e peixes-serra. Em certas modalidades, o anticorpo de cadeia pesada compreende uma sequência estabelecida na Tabela
1. Em certas modalidades, o anticorpo de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade com qualquer sequência divulgada na Tabela 1. Em certas modalidades, o anticorpo de cadeia pesada possui um CDR1 estabelecido na Tabela 2. Em certas modalidades, o anticorpo de cadeia pesada possui um CDR2 estabelecido na Tabela 2. Em certas modalidades, o anticorpo de cadeia pesada possui um CDR3 estabelecido na Tabela 2. Tabela 1 SEQ IDs exclusivas para anticorpos VHH desta divulgação SE NBX Sequência de aminoácidos Antígeno
ID 1 NBX0301 QVQLQESGGGVVQAGGSLSLSCSPYQRASSLF NetB
AAHRASFELGFATHDYDFWGQGTQVTVSS 2 NBX0302 QVQLQESGGGLVQTGGSLRLSCVASGSIFSISS NetB
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CAASTTSWGKFAHYIYWGQGTQVTVSS 13 NBX0317 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFSSY CnaA
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AKGLASTIRGQGTQVTVSS 50 NBX0354 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNS Cpb2
KGLASTIRGQGTQVTVSS 51 NBX0355 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNS Cpb2
KGLASTIRGQGTQVTVSS 52 NBX0356 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGKFTLY Cpb2
53 NBX0357 QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTASM Cpb2
TMSGSSRYSSDYAYWGQGTQVTVSS 54 NBX0358 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNS Cpb2
KGLASTIRGQGTQVTVSS 55 NBX0359 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGRRFTLY Cpb2
CAVDRLIESFSDPTAWPRMDYWGKGALVTVSS 56 NBX0360 QVQLQQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGRRFSL Cpb2
CAVDRLIESFSDPTAWPRMDYWGKGALVTVSS 212 NBX0361 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSIRV NetB
LLDSYYWGQGTQVTVSS 213 NBX0362 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVVSGSIMSIR NetB
ALLDSYYWGQGTQVTVSS 214 NBX0363 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASASIISIRV NetB
LLDSYYWGQGTQVTVSS 215 NBX0364 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVVSGSIMSIR NetB
216 NBX0365 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSIRV NetB
LLDSYYWGQGTQVTVSS 217 NBX0366 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVVSGSIMSIR NetB
ALLDSYYWGQGTQVTVSS 218 NBX0367 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSIRV NetB
LLDSYYWGQGTQVTVSS 219 NBX0368 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVVSGSIMSIR NetB
ALLDSYYWGQGTQVTVSS 220 NBX0369 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASASIFSIRV NetB
LLDSYYWGQGTQVTVSS 221 NBX0370 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVVSGSIMSIR NetB
ALLDSYYWGQGTQVTVSS 222 NBX0371 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASASIISIRV NetB
LLDSYYWGQGTQVTVSS 223 NBX0372 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASASIISIRV NetB
224 NBX0373 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASASIMSIRV NetB
LLDSYYWGQGTQVTVSS 225 NBX0374 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASASIMSIRV NetB
LLDSYYWGQGTQVTVSS 226 NBX0375 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVVSGSIMSIR NetB
ALLDSYYWGQGTQVTVSS 227 NBX0376 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASASIISIRV NetB
LLDSYYWGQGTQVTVSS 228 NBX0377 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVVSGSIMSIR NetB
ALLDSYYWGQGTQVTVSS 229 NBX0378 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASASIMSIRV NetB
LLDSYYWGQGTQVTVSS 230 NBX0379 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVVSGSIMSIR NetB
ALLDSYYWGQGTQVTVSS 231 NBX0380 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVVSGSIISIRV NetB
232 NBX0381 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASASIISIRV NetB
LLDSYYWGQGTQVTVSS 233 NBX0501 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINV NetB
QSRTSWLFPDEYDYWGQGTQVTVSS 234 NBX0502 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSIY NetB
ADRVTDTYYYLNPESYDYWGQGTQVTVSS 235 NBX0503 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSGRRV NetB
ASLIDAGTYWGQGTQVTVSS 236 NBX0504 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSIY NetB
ADRVTDTYYYLNPESYDYWGQGTQVTVSS 237 NBX0505 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGMSFSL NetB
ATSWGQGTQVTVSS 238 NBX0506 QVQLQESGGGLVQAGGSLRVSCAASGSGRRV NetB
ASVFDAGTYWGQGTQVTVSS 239 NBX0507 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSGRRV NetB
240 NBX0508 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSGSRIN NetB
SYLGAGAYWGQGTQVTVSS 241 NBX0509 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSTY NetB
MGAAGQGWRYWGQGTQVTVSS 242 NBX0510 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSGSRIN NetB
ASYLGAGTYWGQGIQVTVSS 243 NBX0511 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRN NetB
KEGGLRGQGTQVTVSS 244 NBX0512 QVQLQQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGSGRRV NetB
ASVFDAGTYWGQGTQVTVSS 245 NBX0513 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSGRRV NetB
ASLFDAGTYWGQGTQVTVSS 246 NBX0514 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSG CnaA
SDGPWRATTPDAYDYWGQGTQVTVSS 247 NBX0515 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIGTIDS CnaA
248 NBX0517 QVQLQQSGGGLVQPGGSLRLSCAASEFSLLFG CnaA
ATRCTVVPGITWGQGTQVTVSS 249 NBX0518 QVQLQESGGGVVQAGGSLRLSCVAPGSITRVG CnaA
PPIPWGQGTQVTVSS 250 NBX0519 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCATSPFSLRLG CnaA
TRCTVVPGITWGQGTQVTVSS 251 NBX0520 QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASARTSSSR CnaA
ARRSDFTGDYAYSGRSAYDYWGQGTQVTVSS 252 NBX0521 QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGSTFIFD CnaA
RAGERVYWGQGTQVTVSS 253 NBX0522 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSG CnaA
AAKYGGSLSYMHPTGYTYWGQGTQVTVSS 254 NBX0523 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASRIVFTIST CnaA
SKANMPALPANYDYWGQGTQVTVSS 255 NBX0524 QVQLQESGGGVVQAGGSLRLSCVAPGSITRLG CnaA
256 NBX0525 QVQLQESGGGVVQAGGSLRLSCVAPGSITRLG CnaA
PPIPWGQGTQVTVSS 257 NBX0526 QVQLQESGGGLVQAGDSLTLSCVASERAFMYN CnaA
TTRVWPTQHQMGQIEYWGQGTQVTVSS 258 NBX0527 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASSSFNTM CnaA
WQYGSTWNYWGQGTQVTVSS 259 NBX0528 QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRNFDY CnaA
AAASSSSRLLEPIGYNYWGQGTQVTVSS 260 NBX0529 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSMFSIN CnaA
NLKRSETSYYWKTGQGIQVTVSS 261 NBX0530 QVQLQESGGGLVQTGGSLKLSCATSGRTFSRY CnaA
ADRHEWGRLMKGDYWGQGTQVTVSS 262 NBX0531 QVQLQESGGGSVQAGGSLTVSCSASGRTSNS CnaA
AATSRSLTSAMTREIRAYDYWGQGTQVTVSS 263 NBX0532 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTFSFN CnaA
264 NBX0533 QVQLQESGGGLVQPGGSLTLSCATSPLTLRLG CnaA
TRCTVVPGISWGQGTQVTVSS 265 NBX0534 QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRNFGY CnaA
AASSSSRPLEPIGYNYWGQGTQVTVSS 266 NBX0535 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCTASGDIFSAA CnaA
AAGNTGPFNLLHSSAQYAYWGQGTQVTVSS 267 NBX0536 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCATSPLTLRLG CnaA
RCTVVPGISWGQGTQVTVSS 268 NBX0537 QVQLQESGGGVVQAGGSLRLSCVAPGSITRIG CnaA
IPPLPWGQGTQVTVSS 269 NBX0538 QVQLQQSGGGLVQAGGSLRLSCTASGRSFSR NetB
AARYDMDYEYKTWGPGTQVTVSS 270 NBX0539 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSGSRIG NetB
SVVDAGTYWGQGTQVTVSS 271 NBX0540 QVQLQESGGGLVQPGGSLRVSCAASGLTFSDY NetB
272 NBX0541 QVQLQQSGGGSVQTGGSLALSCAASGTISIFDP NetB
RYYNSNIYWGQGTQVTVSS 273 NBX0542 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASRNIYGIN NetB
AELYTLQHNYEYWGQGTQVTVSS 274 NBX0543 QVQLQESGGGSVQTGGSLALSCVASGTLSLFD NetB
RYYNSNIYWGQGTQVTVSS 275 NBX0544 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRVLSIN NetB
AEERPYYGGPLEYWGQGTQVTVSQ 276 NBX0545 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASRTTFRVG NetB
IVDRPVSWGQGTQVTVSS 277 NBX0546 QVQLQQSGGGAVQAGGSLTLSCVASGSGSRIG NetB
SVLGAGTYWGQGTQVTVSS 278 NBX0547 QVQLQESGGGSVQTGGSLALSCAASGTISLFD NetB
RYYNSNIYWGQGTQVTVSS 279 NBX0548 QVQLQQSGGGLVQSGGSLRLSCAASETSLNFD NetB
280 NBX0549 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCTASGSDSSIN NetB
VDPLGRVPRWGQGTQVTVSS 281 NBX0550 QVQLQESGGGAVQAGGSLTLSCVASGTVNLM NetB
LGAGTYWGQGTQVTVSS 282 NBX0551 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSRNI NetB
SLGYWGQGTQVTVSS 283 NBX0552 QVQLQQSGGGLVQAGGSLRLSCVASGSGSINY NetB
ALGAGVYWGQGTQVTVSS 284 NBX0553 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSGWRV NetB
ASIIDAGTYWGQGTPVTVSS 285 NBX0561 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCTASGENFSTY CnaA
CAARSGGSYTYTGSYHYWGQGTQVTVSS 286 NBX0801 QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAAAGRTFSSY CnaA
ANRYGSSSYQGQYASWGQGTQVTVSS 287 NBX0802 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSY CnaA
288 NBX0803 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLACAASGRTFINY CnaA
AAKAGHWGRDANYDYWGQGTQVTVSS 289 NBX0804 QVQLQQSGGGLVQAGGSLRLSCSASGRTLTAY CnaA
AAKAGQWGRDAKYDYWGQGTQVTVSS 290 NBX0805 QVQLQQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSTY CnaA
ADLKGLWALGLPGHYASWDSWGQGTQVTVSS 291 NBX0806 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIGSINI CnaA
RRGWAIYWGQGTQVTVSS 292 NBX0807 QVQLQQSGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSY CnaA
ADSGGSWGRGTTYDYWGQGTQVTVSS 293 NBX0808 QVQLQQSGGGSVQAGGSLRLSCRASARASSIG CnaA
AAYNTAGWGEPHQSYRYWGQGTQVTVSS 294 NBX0809 QVQLQESGGGLVQAGGSLKLSCVASGLTFGNY CnaA
RRSVVVRSFDYDYWGQGTQVTVSS 295 NBX0810 QVQLQQSGGGLVHPGGSLRLSCAASGRIFNAN CnaA
296 NBX0811 QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASERTFSSD CnaA
ANSGGHWWRGATYDYWGQGTQVTVSS 297 NBX0812 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCTASGTIFSAN CnaA
VNWALHDSWGQGTQVTVSS 298 NBX0847 QVQLQESGGGVVQAGDSLRLSCTASTRASIVG CnaA
AAYNTANWGQPHQSYRHWGQGIQVTVSS 299 NBX0866 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSAAASGSILNINV CnaA
VTYGSNRRDFWGQGTQVTVST 300 NBX0867 QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSY CnaA
ANRYGSSSYQGQYGSWGQGTQVTVSS 301 NBX0868 QVQLQQSGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSY CnaA
ANRYGSSSYQGQYDYWGQGTQVTVSS 302 NBX0869 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCTASGTIFSING CnaA
NWALQDSWGQGTQVTVSS 303 NBX0870 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASTSDGSIN CnaA
304 NBX0871 QVQLQQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNIY CnaA
S 305 NBX0872 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSS CnaA
QLGRTVLDYFKGQGTQVTVSS 306 NBX0873 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFINY CnaA
AAAKAGQWGRYANYDYWGQGTQVTVSS 307 NBX0874 QVQLQQSGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSY CnaA
ANPYGSSSYQGQYGSWGQGTQVTVSS 308 NBX0875 QVQLQQSGGGLVQAGDSLRLSCAASGRAFSG CnaA
AANRYGSSSYQGQYGSWGQGTQVTVSS 309 NBX0876 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFINY CnaA
AAAKAGHWGRDANYDYWGQGTQVTVSS 310 NBX0877 QVQLQESGGGMVEPGGSLRLSCAASGSISSITF NetB
311 NBX0878 QVQLQQSGGGLVEPGGSLRLSCAASGSISSITF NetB
RRDVVPTWGQGTQVTVSS 312 NBX0879 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGTGFPIIT NetB
DRFSGSPTWGQGTQVTVSS 313 NBX0880 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASVSSIGTM NetB
VISGPVYWGQGTQVTVSS 314 NBX0881 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASTRFFSNY NetB
ASRQGNPYAQTSYDYWGQGTQVTVSS 315 NBX0883 QVQLQESGGEVVAPGGSLSLSCVASGSADSIKI NetB
VSRRDSAAYFAWGQGTQVTVSS 316 NBX0884 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASESIVSITP NetB
RKDSHDYWGQGTQVTVSS 317 NBX0885 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASETIGSIQR NetB
HIREYYSTYDYWGQGTQVTVSS 318 NBX0886 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCSASGSISRIR NetB
319 NBX0887 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCSASGSISRIYD NetB
LFNPVDGTARYYWGQGTQVTVSS 320 NBX0888 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGTIFSINV NetB
ASSTWPPRDYDYWGQGTQVTVSS 321 NBX0889 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSISSIAA NetB
DERPYYGDSVLSWGQGTQVTVSS 322 NBX0890 QVQLQQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGTGFPIIT NetB
DRFSGSPTWGQGTQVTVSS 323 NBX0891 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNY NetB
ADADRSTTIYSRDIYDYWGQGTQVTVSS 324 NBX0892 QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASEGTFSNY NetB
ASRQGLPYVETSYDYWGQGTQVTVSS 325 NBX0893 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSISSITF NetB
DRRDEVPTWGQGTQVTVSS 326 NBX0894 QVQLQQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFSS NetB
327 NBX0895 QVQLQQSGGGLVEPGGSLRLSCAASGSISEITY NetB
QRGVVPTWGQGTQVTVSS 328 NBX0896 QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCRASARASSIG CnaA
AAYNTAGWGEPHQSYRYWGQGIQVTVSS 329 NBX0897 QVQLQESGGGLVQPGGSLSLSCAASGSIFIIST CnaA
EVHVWGVPGPRDYWGQGTQVTVSS 330 NBX0898 QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSY CnaA
ANPYGSSSYQGQYASWGQGTQVTVSS 331 NBX0899 QVQLQQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSSN CnaA
VNWALHDSWGQGTQVTVSS 332 NBX0810 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSAY CnaA 0 GMAWFRQSPGKEREFVAAVSGGGGGTAYAEP
AAATAGHWGRDANYDYWGQGTQVTVSS 333 NBX0810 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSSN CnaA 1 GMYWYRQAPGKQRELVASLFRSGSTNYADSV
VNWALHDSWGPGTQVTVSS 334 NBX0810 QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSY CnaA 2 AMGWFRQAPGKEREFVAAISRSGGTTYYADSV
335 NBX0810 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIIHSINV CnaA 3 MGWYRQAPGKQRELVAIISSGGRTTYADSVKG
WGLRYYWGQGTQVTVSS 336 NBX0810 QVQLQQSGGGFVRPGESLTLSCAASTSIFSSN CnaA 4 GMYWYRQAPGKRRELVASLFRSGSTNYADSV
VNWALHDSWGQGTQVTVSS 337 NBX0810 QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSY CnaA 5 AMAWFRQAPGKEREFVAAISRGGGTTYYADSV
ANPYGSSSYQGQYGSWGQGTQVTVSS 338 NBX0810 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSSN CnaA 6 GMYWYRQAPGKQRELVASLYRSGSTNYADSV
VNWALHDSWGQGTQVTVSS 339 NBX0810 QVQLQQSGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSSN CnaA 7 GMYWYRQAPGKQRELVASLYRSGSTNYADSV
VNWALHDSWGQGTQVTVSS 340 NBX0810 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSILSAN CnaA 8 GMYWYRQAPGKQRELVASLYRSGSTDYADSV
NVNWALHDSWGQGTQVTVSS Tabela 2 SEQ IDs exclusivas para anticorpos VHH desta divulgação CDR1 CDR CDR2 CDR CDR3 CDR Sequênc 1 Sequênc 2 Sequênc 3 Antígen NBX ia de SEQ ia de SEQ ia de SEQ o aminoáci ID aminoáci ID aminoáci ID dos NO: dos NO: dos NO:
NBX0 QRASSL 57 ISWNGD 107 AAHRAS 157 NetB 301 FAM KS FELGFA
THDYDF NBX0 GSIFSIS 58 IFSDGST 108 AVDGY 158 NetB 302 SA NBX0 GRTLSY 59 INWSSG 109 AAHRAS 159 NetB 303 WTM T FGLGYQ
THEYDF NBX0 GGTFSS 60 ITWNSE 110 AAGRAG 160 NetB 304 YTM VT SGFTS NBX0 GFTLDK 61 ISSIDDS 111 MTIPLPY 161 NetB 305 YAV T GSTCDI
LAINY NBX0 GFTVPY 62 IASSSGK 112 AALRKY 162 NetB 306 YYI A GSTCYL
Y NBX0 GSTFNN 63 ISGSGA 113 ARRMSR 163 NetB 309 YMI GT SGIFGLR
DYDS NBX0 GRTFSN 64 ISWSGG 114 AAGGYS 164 NetB 311 ADM RT NLPTSY
GY NBX0 GRAFST 65 ISSSGA 115 AASTTS 165 CnaA 316 YGM GS WGKFAH
YIY NBX0 GGTFSS 66 ISWSGG 116 AADSRIS 166 CnaA 317 YIM VT AGGSYY
EADFGS NBX0 GSIMSIR 67 MSRGNT 117 AALLDS 167 NetB 318 VM I YY
NBX0 ASIISIRV 68 MSRGGT 118 TALLDS 168 NetB 319 M I YY NBX0 GSIFSIR 69 MSRGGT 119 AALLDS 169 NetB 320 VM I YY NBX0 GFTLDK 70 ISSIDDS 120 MTIPLPY 170 NetB 321 YAV T GSTCRI
LAINY NBX0 GRTFST 71 ITRGGN 121 AADRIIV 171 NetB 322 YAM T PRDPMD
Y NBX0 GRTFSAI 72 ISWSGG 122 AASDTD 172 CnaA 326 HM GT WGRSA
SYDY NBX0 GGTFSS 73 ISWSGG 123 AADSRIS 173 CnaA 327 YVM VT AGGSYY
EADFGS NBX0 GRTFSS 74 ISWSGT 124 AVGSRR 174 Cpa 328 YTM LYYSSDI
NY NBX0 GLTVSR 75 ISWSGT 125 AAGSRR 175 Cpa 329 YTM LYYSNDI
NY NBX0 SRTFSN 76 INGDTTF 126 AARQW 176 Cpa 330 YAM T NPTMRE
RDYGY NBX0 GRVFEN 77 TNWNTA 127 AATGSR 177 Cpb2 331 YFM TNWNT TYDVVD
YYDY NBX0 GRTFSS 78 ITYSGIT 128 AASYSA 178 Cpb2 332 YSM T SRSYPF
NBX0 GRTFSS 79 ITYSGIS 129 AASYSA 179 Cpb2 333 YSM T SRSYPF
GEYDY NBX0 GFTFSN 80 INIGGDS 130 AKGLAS 180 Cpb2 334 SAM R TI NBX0 GFTFSN 81 IEVGGG 131 SKGLAS 181 Cpb2 335 SAM R TI NBX0 GFTFSN 82 IGIDGGR 132 AKGLAS 182 Cpb2 336 SAM TI NBX0 GFTFSN 83 IGIGGGT 133 AKGLAS 183 Cpb2 337 SAM T TI NBX0 GRSFSS 84 ISWSGT 134 AVGSRR 184 Cpa 338 YTM LYYSSDI
NY NBX0 GLTVSR 85 ISWSGT 135 AAGSRR 185 Cpa 339 YTM LHYSSDI
NY NBX0 GRTFST 86 IRYTSDY 136 AAAKYG 186 Cpa 340 STL TARTT MGYSDP
SGYTY NBX0 SRTFSN 87 ITGDTAF 137 AARQW 187 Cpa 341 YAM T NPTMRE
RDYGY NBX0 GRRFRL 88 ISWSGG 138 AVDRLIE 188 Cpb2 342 YHM TT SFSDPT
AWPRM NBX0 GFTFSN 89 INIGGGT 139 AKGLAS 189 Cpb2 343 SAM T TI NBX0 GFTFSN 90 INIGGGT 140 AKGLAS 190 Cpb2 344 SAM R TI
NBX0 GRKFRL 91 ISWSGG 141 AVDRLIE 191 Cpb2 345 YHM ST SFSDPT
AWPRM NBX0 GFTFSN 92 INIGGGT 142 AKGLAS 192 Cpb2 346 SAM TI NBX0 GRTFSS 93 ISYNI 143 AAVQRR 193 Cpb2 347 YDM GSYSYD
Y NBX0 GFTFSN 94 IEIGGTR 144 AKGLAS 194 Cpb2 348 SAM TI NBX0 GFTFSN 95 INIGAGT 145 AKGLAS 195 Cpb2 349 SPM T TI NBX0 GFTFSN 96 INIGGGD 146 AKGLAS 196 Cpb2 350 SAM K TI NBX0 GFTFSN 97 IETGGTK 147 AKGLAS 197 Cpb2 351 SAM TI NBX0 GFTFSN 98 INIGEGT 148 AKGLAS 198 Cpb2 352 SPM T TI NBX0 GFTFSN 99 INIGGDT 149 AKGLAS 199 Cpb2 353 SPM R TI NBX0 GFTFSN 100 VNIDGG 150 AKGLAS 200 Cpb2 354 SAM R TI NBX0 GFTFSN 101 ISIDGGR 151 AKGLAS 201 Cpb2 355 SAM TI NBX0 GGKFTL 102 ISWSGR 152 AVDRLIE 202 Cpb2 356 YHM ST KFSDPT
DS NBX0 GRTASM 103 ITRSSIY 153 AADSTM 203 Cpb2 357 T SGSSRY
NBX0 GFTFSN 104 IDIGGNR 154 AKGLAS 204 Cpb2 358 SPM TI NBX0 GRRFTL 105 ISWSGG 155 AVDRLIE 205 Cpb2 359 YHM ST SFSDPT
DY NBX0 GRRFSL 106 ISWSGG 156 AVDRLIE 206 Cpb2 360 YHM TT SFSDPT
DY NBX0 ASIISIRV 341 MSRGGT 459 AALLDS 577 NetB 363 M I YY NBX0 GSIMSIR 342 MSRGGT 460 TALLDS 578 NetB 364 VM I YY NBX0 GSIFSIR 343 MSRGGT 461 TALLDS 579 NetB 365 VM I YY NBX0 ASIFSIR 344 MSRGNT 462 AALLDS 580 NetB 369 VM I YY NBX0 GSIMSIR 345 MSRGGT 463 AALLDS 581 NetB 370 VM I YY NBX0 ASIMSIR 346 MSRGNT 464 AALLDS 582 NetB 373 VM I YY NBX0 ASIMSIR 347 MSRGGT 465 AALLDS 583 NetB 374 VM I YY NBX0 GSIMSIR 348 MSRGNT 466 AALLDS 584 NetB 379 VM I YY NBX0 GSIISIRV 349 MSRGGT 467 AALLDS 585 NetB 380 M I YY NBX0 ASIISIRV 350 MSRGNT 468 AALLDS 586 NetB 381 M I YY
NBX0 GSIFSIN 351 ITSGGST 469 NAAQSR 587 NetB 501 VM TSWLFP
DEYDY NBX0 GRTFSIY 352 INRGGG 470 AADRVT 588 NetB 502 AM TT DTYYYL
Y NBX0 GSGRRV 353 ISRAGAT 471 FASLIDA 589 NetB 503 GYM GTY NBX0 GRTFSIY 354 INRSGG 472 AADRVT 590 NetB 504 AM TT DTYYYL
Y NBX0 GMSFSL 355 ITNADTT 473 NTATS 591 NetB 505 GTI NBX0 GSGRRV 356 ISRAGAT 474 FASVFD 592 NetB 506 GYM AGTY NBX0 GSGRRV 357 ISRAGAT 475 FASIFDA 593 NetB 507 GYM GTY NBX0 GSGSRI 358 INRTGA 476 FASYLG 594 NetB 508 NYM A AGAY NBX0 GRTFST 359 ITWNGG 477 VMGAAG 595 NetB 509 YTV TI QGWRY NBX0 GSGSRI 360 INRTGA 478 WASYLG 596 NetB 510 NYM A AGTY NBX0 GFTFSR 361 IYSDDST 479 SKEGGL 597 NetB 511 NYM NBX0 GSGRRV 362 ISRAGAT 480 FASVFD 598 NetB 512 GYM AGTY NBX0 GSGRRV 363 ISRAGAT 481 FASLFD 599 NetB 513 GYM AGTY
NBX0 GRTFSG 364 ITWSGG 482 ASDGP 600 CnaA 514 RTM TT WRATTP
DAYDY NBX0 GSIGTID 365 IMFSGR 483 YSNQY 601 CnaA 515 SM T NBX0 EFSLLF 366 VSSSDG 484 ATRCTV 602 CnaA 517 GTI ST VPGIT NBX0 GSITRV 367 INEVGN 485 WIPPIP 603 CnaA 518 GGM T NBX0 PFSLRL 368 ISSSEGS 486 ATRCTV 604 CnaA 519 GVV T VPGIT NBX0 ARTSSS 369 ISWSGG 487 AARRSD 605 CnaA 520 RAM RT FTGDYA
YDY NBX0 GSTFIFD 370 LMSRGD 488 RGRAGE 606 CnaA 521 KM P RVY NBX0 GRTFSG 371 TLWSGG 489 AAKYGG 607 CnaA 522 VIV ST SLSYMH
PTGYTY NBX0 RIVFTIS 372 INRSGAL 490 AASKAN 608 CnaA 523 TM T MPALPA
NYDY NBX0 GSITRLG 373 ITAVGNT 491 WIPPIP 609 CnaA 524 SM NBX0 GSITRLG 374 IDTVGNT 492 WIPPIP 610 CnaA 525 GM NBX0 ERAFMY 375 RNWNV 493 ATTRVW 611 CnaA 526 NM ERT PTQHQM
NBX0 SSFNTM 376 ITSGGTI 494 VADWQ 612 CnaA 527 YGSTWN
Y NBX0 GRNFDY 377 INWRGA 495 AAASSS 613 CnaA 528 YSM VI SRLLEPI
GYNY NBX0 GSMFSI 378 ISSGGTT 496 AGNLKR 614 CnaA 529 NDM SETSYY
WK NBX0 GRTFSR 379 ISLSGG 497 TADRHE 615 CnaA 530 YHM GT WGRLM
KGDY NBX0 GRTSNS 380 ISWTGG 498 AATSRS 616 CnaA 531 YNM FT LTSAMT
DY NBX0 GSTFSF 381 FMNDGN 499 RGRAG 617 CnaA 532 NKM T MEVY NBX0 PLTLRL 382 ISSRDD 500 ATRCTV 618 CnaA 533 GPI K VPGIS NBX0 GRNFGY 383 ITWRGVI 501 AAASSS 619 CnaA 534 YTM SRPLEPI
GYNY NBX0 GDIFSAA 384 VTWDG 502 AAGNTG 620 CnaA 535 GM GTT PFNLLH
Y NBX0 PLTLRL 385 ITSTEDK 503 ATRCTV 621 CnaA 536 GAI VPGIS NBX0 GSITRIG 386 INTVGNT 504 WIPPLP 622 CnaA 537 GM
NBX0 GRSFSR 387 IAPSGG 505 AARYDM 623 NetB 538 YIM SA DYEYKT NBX0 GSGSRI 388 INRTGAT 506 FASVVD 624 NetB 539 GFM AGTY NBX0 GLTFSD 389 ISLTAAS 507 AAQGRI 625 NetB 540 YAM T LRGRGL
DY NBX0 GTISIFD 390 ISEGST 508 RLSRYY 626 NetB 541 PM NSNIY NBX0 RNIYGIN 391 SANGGT 509 KAELYTL 627 NetB 542 VI T QHNYEY NBX0 GTLSLF 392 ISGLST 510 HLSRYY 628 NetB 543 DPM NSNIY NBX0 GRVLSIN 393 ITNGGS 511 LAEERP 629 NetB 544 AM T YYGGPL
EY NBX0 RTTFRV 394 ITSGGST 512 FANIVDR 630 NetB 545 GTM PVS NBX0 GSGSRI 395 IKGTGTT 513 FASVLG 631 NetB 546 GLM AGTY NBX0 GTISLFD 396 ITEGST 514 RLSRYY 632 NetB 547 SM NSNIY NBX0 ETSLNF 397 INTFPAG 515 NAGDY 633 NetB 548 DDM TTA NBX0 GSDSSI 398 ISRDGR 516 YVDPLG 634 NetB 549 NYM S RVPR NBX0 GTVNLM 399 IKGTGTT 517 FASVLG 635 NetB 550 AGTY NBX0 GSIFSR 400 INTGGR 518 NAPSLG 636 NetB 551 NII T Y
NBX0 GSGSIN 401 INRTGA 519 FASALG 637 NetB 552 YM A AGVY NBX0 GSGWR 402 ISRAGAT 520 FASIIDA 638 NetB 553 VGYM GTY NBX0 GENFST 403 HNWRG 521 AARSGG 639 CnaA 561 YVM GGT SYTYTG
SYHY NBX0 GRTFSS 404 ISRSGG 522 AANRYG 640 CnaA 801 YAM ST SSSYQG
QYAS NBX0 GRTFSS 405 ISRSGG 523 AAQQW 641 CnaA 802 YHM FT PDPRNP
NGYDY NBX0 GRTFINY 406 VSISGA 524 AAAKAG 642 CnaA 803 GM GT HWGRD
ANYDY NBX0 GRTLTA 407 VSLSGA 525 AAAKAG 643 CnaA 804 YGM ST QWGRD
AKYDY NBX0 GRTFST 408 ISWSGG 526 TADLKG 644 CnaA 805 YAM RI LWALGL
WDS NBX0 GSIGSIN 409 FTSGGS 527 RARRG 645 CnaA 806 IM T WAIY NBX0 GRTFSS 410 ISRTGS 528 AADSGG 646 CnaA 807 YGM GT SWGRG
TTYDY NBX0 ARASSI 411 VTAGAD 529 AAYNTA 647 CnaA 808 GAM TT GWGEP
NBX0 GLTFGN 412 ISSSGAY 530 AGRRSV 648 CnaA 809 YDM T VVRSFD
YDY NBX0 GRIFNA 413 LYRSGS 531 NVNWAL 649 CnaA 810 NGM T HDS NBX0 ERTFSS 414 ISRTGSA 532 AANSGG 650 CnaA 811 DGM T HWWRG
ATYDY NBX0 GTIFSAN 415 LYRDGS 533 NVNWAL 651 CnaA 812 GM T HDS NBX0 TRASIVG 416 IAAGSPS 534 AAYNTA 652 CnaA 847 AM TP NWGQP
HQSYRH NBX0 GSILNIN 417 IYRDGS 535 NVVTYG 653 CnaA 866 VM T SNRRDF NBX0 GRTFSS 418 ISRSGG 536 AANRYG 654 CnaA 867 YAM ST SSSYQG
QYGS NBX0 GRTFSS 419 ISRSGG 537 AANRYG 655 CnaA 868 YAM ST SSSYQG
QYDY NBX0 GTIFSIN 420 LYRGGS 538 NVNWAL 656 CnaA 869 GM T QDS NBX0 TSDGSI 421 ITSLGSQ 539 RARRG 657 CnaA 870 NVM WAIY NBX0 GRTFNIY 422 ISDSGG 540 AADLTG 658 CnaA 871 AM SA LWALGL
WDS NBX0 GFTFRS 423 IGSDGE 541 QLGRTV 659 CnaA 872 SAM NI LDYF
NBX0 GRTFINY 424 VSSSGA 542 AAAKAG 660 CnaA 873 GM GT QWGRY
ANYDY NBX0 GRTFSS 425 ISRSGG 543 AANPYG 661 CnaA 874 YAM TT SSSYQG
QYGS NBX0 GRAFSG 426 ISRGGG 544 AANRYG 662 CnaA 875 YAM TT SSSYQG
QYGS NBX0 GRTFINY 427 VSSSGA 545 AAAKAG 663 CnaA 876 GM GT HWGRD
ANYDY NBX0 GSISSIT 428 IARSGTT 546 YVDRRG 664 NetB 877 FM AVPT NBX0 GSISSIT 429 IARSGTT 547 YVDRRD 665 NetB 878 FM VVPT NBX0 GTGFPII 430 ISRGGV 548 YADRFS 666 NetB 879 TFM A GSPT NBX0 VSSIGT 431 ISRVGTT 549 FANVISG 667 NetB 880 M PVY NBX0 TRFFSN 432 ISRDGA 550 AASRQG 668 NetB 881 YAM VP NPYAQT
SYDY NBX0 GSADSI 433 ITSGGTT 551 NALVSR 669 NetB 883 KIM RDSAAY
FA NBX0 ESIVSIT 434 TTRDGA 552 KARKDS 670 NetB 884 PM P HDY NBX0 ETIGSIQ 435 RTNGGT 553 NAHIRE 671 NetB 885 RM T YYSTYD
NBX0 GSISRIR 436 ISSGGS 554 NALFNPI 672 NetB 886 DM T DGPARY
Y NBX0 GSISRIY 437 ISRGGS 555 TALFNP 673 NetB 887 DM T VDGTAR
YY NBX0 GTIFSIN 438 ITSGGQI 556 NAASST 674 NetB 888 VM WPPRDY
DY NBX0 RSISSIA 439 ITNGGS 557 NADERP 675 NetB 889 AM T YYGDSV
LS NBX0 GTGFPII 440 INRGGV 558 YADRFS 676 NetB 890 TFM A GSPT NBX0 GRTFSN 441 ISRGTST 559 AADADR 677 NetB 891 YHM T STTIYSR
DIYDY NBX0 EGTFSN 442 ISRDGA 560 AASRQG 678 NetB 892 YRM VP LPYVET
SYDY NBX0 GSISSIT 443 SARRGT 561 YVDRRD 679 NetB 893 FM T EVPT NBX0 GGTFSS 444 IRWSRG 562 AADGNP 680 NetB 894 YVM ST AKLVLD
Y NBX0 GSISEIT 445 IARVGTT 563 YVDQRG 681 NetB 895 YM VVPT NBX0 ARASSI 446 VNAGAD 564 AAYNTA 682 CnaA 896 GAM TT GWGEP
NBX0 GSIFIIST 447 ITSGGST 565 NAEVHV 683 CnaA 897 M WGVPG
PRDY NBX0 GRTFSS 448 ISRSGG 566 AANPYG 684 CnaA 898 YAM ST SSSYQG
QYAS NBX0 GSIFSSN 449 LYRSGS 567 NVNWAL 685 CnaA 899 GM T HDS NBX0 GRTFSA 450 VSGGG 568 AAATAG 686 CnaA 8100 YGM GGT HWGRD
ANYDY NBX0 GSIFSSN 451 LFRSGS 569 NVNWAL 687 CnaA 8101 GM T HDS NBX0 GRTFSS 452 ISRSGG 570 AANPYG 688 CnaA 8102 YAM TT SSSYQG
QYGS NBX0 GIIHSINV 453 ISSGGR 571 TMVWGL 689 CnaA 8103 M T RYY NBX0 TSIFSSN 454 LFRSGS 572 NVNWAL 690 CnaA 8104 GM T HDS NBX0 GRTFSS 455 ISRGGG 573 AANPYG 691 CnaA 8105 YAM TT SSSYQG
QYGS NBX0 GSIFSSN 456 LYRSGS 574 NVNWAL 692 CnaA 8106 GM T HDS NBX0 GSIFSSN 457 LYRSGS 575 NVNWAL 693 CnaA 8107 GM T HDS NBX0 RSILSAN 458 LYRSGS 576 NVNWAL 694 CnaA 8108 GM T HDS Anticorpos expressos de forma recombinante
[0039] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir VHH em um organismo produtor adequado. Organismos produtores adequados incluem, sem limitação, bactérias, leveduras e algas. Em certas modalidades, a bactéria produtora é Escherichia coli. Em certas modalidades, a bactéria produtora é um membro do gênero Bacillus. Em certas modalidades, a bactéria produtora é um probiótico. Em certas modalidades, a levedura é Pichia pastoris. Em certas modalidades, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em certas modalidades, a alga é um membro dos gêneros Chlamydomonas ou Phaeodactylum. Anticorpos adicionados à ração
[0040] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo ou pluralidades dos mesmos compreendendo um V HH ou VHHs que se ligam a agentes causadores de doenças e são administrados a animais hospedeiros através de qualquer via adequada como parte de um produto alimentício. Em certas modalidades, o animal é selecionado a partir da lista de animais hospedeiros descrita, com essa lista sendo representativa, mas não limitante. Em certas modalidades, a via de administração a um animal receptor pode ser, mas não está limitada a: introdução ao canal alimentar por via oral ou retal, fornecida à superfície externa (por exemplo, como um spray ou submersão), fornecida ao meio em que o animal habita (incluindo meio à base de ar), fornecido por injeção, fornecido por via intravenosa, fornecido através do sistema respiratório, fornecido via difusão, fornecido através da absorção pelo endotélio ou epitélio, ou fornecido através de um organismo secundário, como uma levedura, bactérias, algas, bacteriófagos, plantas e insetos. Em certas modalidades, o hospedeiro é da superordem Galloanserae. Em certas modalidades, o hospedeiro é um animal aviário. Em certas modalidades, o animal aviário é uma galinha, peru, pato, codorna, pombo ou ganso. Em certas modalidades, o animal aviário é uma galinha. Produto alimentício
[0041] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um polipeptídeo ou pluralidades dos mesmos compreendendo um V HH ou VHHs que se ligam a agentes causadores de doenças e são administrados a animais hospedeiros na forma de um produto. A forma do produto não é limitada, desde que retenha a ligação ao agente causador da doença na forma desejada. Em certas modalidades, o produto é ração, pélete, suplemento nutricional, pré-mistura, produto terapêutico, medicamento ou aditivo alimentar, mas não está limitado a essas formas.
Dosagem de alimentação
[0042] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um polipeptídeo ou pluralidades dos mesmos compreendendo um V HH ou VHHs que se ligam a agentes causadores de doenças e são administrados a animais hospedeiros como parte de um produto em qualquer regime de dosagem adequado. Na prática, a dosagem adequada é a dosagem na qual o produto oferece qualquer grau de proteção contra um agente causador de doenças e depende do método de entrega, cronograma de entrega, o ambiente do animal receptor, o tamanho do animal receptor, a idade do animal receptor e a condição de saúde do animal receptor, entre outros fatores. Em certas modalidades, os VHHs são administrados a animais receptores em uma concentração superior a 1 mg/kg de peso corporal. Em certas modalidades, os VHHs são administrados a animais receptores em uma concentração superior a 5 mg/kg de peso corporal. Em certas modalidades, os VHHs são administrados a animais receptores em uma concentração superior a 10 mg/kg de peso corporal. Em certas modalidades, os VHHs são administrados a animais receptores em uma concentração superior a 50 mg/kg de peso corporal. Em certas modalidades, os VHHs são administrados a animais receptores em uma concentração superior a 100 mg/kg de peso corporal. Em certas modalidades, os VHHs são administrados a animais receptores em uma concentração inferior a 1 mg/kg de peso corporal. Em certas modalidades, os VHHs são administrados a animais receptores em uma concentração inferior a 500 mg/kg de peso corporal. Em certas modalidades, os VHHs são administrados a animais receptores em uma concentração inferior a 100 mg/kg de peso corporal. Em certas modalidades, os VHHs são administrados a animais receptores em uma concentração inferior a 50 mg/kg de peso corporal. Em certas modalidades, os VHHs são administrados a animais receptores em uma concentração inferior a 10 mg/kg de peso corporal. Frequência de alimentação
[0043] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um polipeptídeo ou pluralidades dos mesmos compreendendo um V HH ou VHHs que se ligam a agentes causadores de doenças e são administrados a animais hospedeiros como parte de um produto em qualquer frequência de dosagem adequada. Na prática, a frequência de dosagem adequada é aquela na qual o produto oferece qualquer grau de proteção contra um agente causador de doenças e depende do método de distribuição, cronograma de distribuição, o ambiente do animal receptor, o tamanho do animal receptor, a idade do animal receptor e a condição de saúde do animal receptor, entre outros fatores. Em certas modalidades, a frequência de dosagem pode ser, mas não está limitada a: constantemente, em frequências especificadas consistentes dentro de uma hora, a cada hora, em frequências especificadas ao longo de um ciclo de 24 horas, diariamente, em frequências especificadas ao longo de uma semana, semanalmente, em frequências ao longo de um mês, mensalmente, em frequências especificadas ao longo de um ano, anualmente e em qualquer outra frequência especificada superior a 1 ano. Aditivos alimentares
[0044] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um polipeptídeo ou pluralidades dos mesmos compreendendo um V HH ou VHHs que se ligam a agentes causadores de doenças e são administrados a animais hospedeiros como parte de um produto que também compreende outros aditivos ou revestimentos. Na prática, o revestimento ou aditivo mais adequado depende do método de distribuição, o animal receptor, o ambiente do receptor, as necessidades dietéticas do animal receptor, a frequência de distribuição, a idade do animal receptor, o tamanho do animal receptor e a condição de saúde do animal receptor. Em certas modalidades, esses aditivos e revestimentos podem incluir, mas não estão limitados à seguinte lista e misturas dos mesmos: uma vitamina, um antibiótico, um hormônio, um peptídeo antimicrobiano, um esteroide, um probiótico, um bacteriófago, quitina, quitosana, B-1,3-glucano, extratos vegetais, peptona, farinha de camarão, krill, algas, B-ciclodextrano, alginato, goma, tragacanto, pectina, gelatina, um spray aditivo, um aglutinante de toxina, um ácido graxo de cadeia curta, um ácido graxo de cadeia média, levedura, um extrato de levedura, açúcar, uma enzima digestiva, um composto digestivo, um mineral essencial, um sal essencial ou fibra. Usos não alimentícios
[0045] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um polipeptídeo ou pluralidades dos mesmos compreendendo um V HH ou VHHs que se ligam a agentes causadores de doenças e podem ser usados em um uso não alimentar, tal como, mas não limitado a: um kit de diagnóstico, um ensaio de imunoabsorção enzimática ligado (ELISA), um ensaio de western blot, um ensaio de imunofluorescência ou um ensaio de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), em sua forma atual e/ou como um polipeptídeo conjugado a outra molécula. Em certas modalidades, a molécula conjugada pode ser, mas não está limitada a: um fluoróforo, um substrato quimioluminescente, um peptídeo antimicrobiano, um ácido nucleico ou um lipídio. Antígenos
[0046] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um polipeptídeo ou pluralidades dos mesmos compreendendo um V HH ou VHHs que se ligam a agentes causadores de doenças, incluindo toxinas, produzidos por uma espécie de Clostridium. Em certas modalidades, a espécie não pertence ao gênero Clostridium, mas é capaz de abrigar agentes causadores de doenças compartilhados por espécies de Clostridium. Em certas modalidades, a espécie Clostridium se refere a organismos atuais e reclassificados. Em certas modalidades, a espécie Clostridium é Clostridium perfringens.
[0047] Em certas modalidades, o VHH ou sua pluralidade é capaz de se ligar a um ou mais agentes causadores de doenças, originários da mesma espécie ou de espécies diferentes. Em certas modalidades, o agente causador da doença é um polipeptídeo com 80% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com NetB (SEQ ID 207). Em certas modalidades, o agente causador da doença é um polipeptídeo com 80% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com Cpa (SEQ ID 208). Em certas modalidades, o agente causador da doença é um polipeptídeo com 80% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com Cbp2 (SEQ ID 209). Em certas modalidades, o agente causador da doença é um polipeptídeo com 80% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com CnaA (SEQ ID 210). Em certas modalidades, o agente causador da doença é um polipeptídeo com 80% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com o domínio de ligação ao colágeno de CnaA (SEQ ID 211). Em certas modalidades, o agente causador da doença é um peptídeo exposto, proteína, complexo de proteína, ácido nucleico, lipídio ou combinação dos mesmos, que está associado à superfície da bactéria Clostridium. Em certas modalidades, o agente causador da doença é um pilus, fímbria, flagelo, sistema de secreção ou porina. Em certas modalidades, o agente causador da doença é a bactéria Clostridium.
[0048] Em certas modalidades, o agente causador da doença ou um derivado do mesmo pode ser fornecido em excesso e superar a atividade do agente causador da doença expresso pelo patógeno. Em certas modalidades, um polipeptídeo com 80% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com CnaA (SEQ ID 210) ou o domínio de ligação ao colágeno de CnaA (SEQ ID 211) pode ser fornecido em excesso para superar a atividade de CnaA expressa pela bactéria Clostridium perfringens. Sequências de Antígenos
[0049] NetB (SEQ ID 207) > ABW71134.1 precursor da toxina B da enterite necrótica [Clostridium perfringens]
[0050] Cpa (SEQ ID 208) > WP_057230321.1 fosfolipase [Clostridium perfringens]
[0051] Cpb2 (SEQ ID 209) > AEP94971.1 Beta2-toxina (plasmídeo) [Clostridium perfringens]
[0052] CnaA (SEQ ID 210) > ALJ54440.1 adesina de colágeno putativa [Clostridium perfringens]
[0053] Domínio de ligação de colágeno CnaA (SEQ ID 211)
[0054] Os seguintes exemplos ilustrativos são representativos das modalidades dos aplicativos, sistemas e métodos descritos neste documento e não se destinam a ser limitantes de qualquer forma.
[0055] Embora as modalidades preferíveis da presente invenção sejam mostradas e descritas neste documento, será óbvio para aqueles versados na técnica que tais modalidades são fornecidas somente a título de exemplo. Diversas variações, alterações e substituições ocorrerão agora àqueles versados na técnica, sem que haja afastamento da invenção. Deve-se entender que diversas alternativas às modalidades da invenção descritas neste documento podem ser empregadas na prática da invenção.
1. Produção de antígenos
[0056] Os antígenos recombinantes podem ser purificados a partir de um sistema de expressão de E. coli. Por exemplo, um antígeno pode ser expresso a 18 °C em células de E. coli BL21 (DE3) cultivadas durante a noite em meio de autoindução (Formedium). As células são então lisadas por sonicação em tampão A (250 mM de NaCl, 50 mM de CaCl2, 20 mM de imidazol e 10 mM de HEPES, pH 7,4) com 12,5 μg/ml de DNase I e 1X coquetel de inibidor de protease (Bioshop). O lisado é limpo por centrifugação a 22000 xg durante 30 minutos a 4 °C, aplicado a uma coluna HisTrap HP de 5 ml (GE Healthcare) pré-equilibrada com tampão A, lavada com dez volumes de coluna de tampão A e eluída com um gradiente de 0% a 60% (vol/vol) de tampão B (NaCl 250 mM, CaCl2 50 mM, imidazol 500 mM e HEPES 10 mM, pH 7,4). A proteína é então dialisada durante a noite na presença de TEV contra tampão C (250 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4 e 5 mM β- mercaptoetanol) a 4 °C. A proteína dialisada é aplicada a uma coluna HisTrap HP (GE Biosciences) pré-equilibrada com tampão C. 6xHis-tag TEV e 6xHis-tag são ligados à coluna e o antígeno é coletado no fluxo direto. A amostra é dialisada durante a noite contra o tampão D (NaCl 5 mM e Tris 10 mM pH 8,8) e depois aplicada a uma coluna HiTrap Q HP de 5 ml (GE Healthcare). A proteína é eluída com um gradiente de 0% a 50% (vol/vol) de tampão E (NaCl 1,0 M e Tris 10 mM pH 8,8). Por último, o eluato é carregado em uma coluna de filtração em gel Superdex 75 Aumentar 10/300 GL (GE Healthcare) usando tampão F (NaCl 400 mM e HEPES 20 mM pH 7,4). A amostra de proteína é então concentrada para 1 mg/mL usando concentradores Amicon com corte de peso molecular apropriado (MWCO; Millipore). A proteína purificada é armazenada a −80 °C.
2. Produção de NBXs e panning Imunização de lhama
[0057] Uma única lhama é imunizada com agentes causadores de doenças purificados, como os antígenos listados, que podem ser acompanhados por adjuvantes. A imunização de lhama é realizada usando 100 µg de cada antígeno que são combinados e injetados para um total de quatro injeções. No momento da injeção, os antígenos são descongelados e o volume aumentado para 1 ml com
PBS. A mistura de 1 ml de antígeno-PBS é então misturada com 1 ml de adjuvante Completo de Freund (CFA) ou adjuvante Incompleto de Freund (IFA) para um total de 2 ml. Um total de 2 ml é imunizado por injeção. Sangue total de lhama e soros são então coletados do animal imunizado nos dias 0, 28, 49, 70. Os soros dos dias 28, 49 e 70 são então fracionados para separar VHH dos anticorpos convencionais. O ELISA pode ser usado para medir a reatividade contra antígenos alvo em frações policlonais e enriquecidas com VHH. Os linfócitos são coletados de soros colhidos nos dias 28, 49 e 70. Panning
[0058] RNA isolado de linfócitos de lama purificados é usado para gerar cDNA para clonagem em fagemídeos. Os fagemídeos resultantes são usados para transformar células TG-1 de E. coli para gerar uma biblioteca de genes VHH expressos. O tamanho da biblioteca de fagemídeos pode ser de ~2,5 x 107 transformantes totais e o número estimado de fagemídeos contendo inserções de VHH pode ser estimado em ~100%. Os anticorpos de alta afinidade são então selecionados por panning contra os antígenos usados para a imunização de lhama. Duas rodadas de panning são realizadas e os clones de ligação ao antígeno decorrentes da rodada 2 são identificados usando ELISA de fago. Os clones de ligação ao antígeno são sequenciados, agrupados de acordo com suas regiões CDR e priorizados para expressão solúvel em E. coli e purificação de anticorpos.
[0059] FIG. 2 mostra os resultados de ELISA de fago para anticorpos desta divulgação. As barras pretas mostram a ligação aos poços revestidos com o antígeno especificado nas Tabelas 1 e 2 dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (PBS). As barras cinzas são controles negativos que mostram ligação apenas a poços revestidos com PBS. Em todos os casos, a ligação ao antígeno alvo está pelo menos duas vezes acima da ligação aos poços revestidos com PBS. Os dados de NBX0301 a NBX0332 são mostrados no painel A. Os dados de NBX0333-NBX0360 são mostrados no painel B. Os dados de NBX0501-NBX0515 e NBX0517-NBX0528 são mostrados no painel C. Os dados de NBX0529-NBX0553 são mostrados no painel D. NBX0561, NBX0801-NBX0812, NBX0847 e NBX0866- NBX0880 são mostrados no painel E. Os dados para NBX0881 e NBX0883- NBX08108 são mostrados no painel F. Purificação de VHHs de E. coli
[0060] As proteínas de fusão 6xHis-tioredoxina-NBX cliváveis por protease de TEV são expressas no citoplasma de E. coli cultivado em meio autoindutor (Formedium) por 24 horas a 30oC. As bactérias são recolhidas por centrifugação, ressuspensas em tampão A (HEPES 10 mM, pH 7,5, NaCl 250 mM, Imidazol 20 mM) e lisadas usando sonicação. O material insolúvel é removido por centrifugação e a fração solúvel restante é aplicada a uma coluna HisTrap (GE Biosciences) pré- equilibrada com tampão A. A proteína é eluída da coluna usando um FPLC com um gradiente linear entre o tampão A e o tampão B (10 HEPES mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, Imidazol 500 mM). A proteína eluída é dialisada durante a noite na presença de protease TEV para tampão C (HEPES 10 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM). A proteína dialisada é aplicada a uma coluna HisTrap (GE Biosciences) pré-equilibrada com tampão C. TEV marcado com 6xHis e tiorredoxina marcada com 6xHis são ligados à coluna e NBX altamente purificado é coletado no fluxo direto. As proteínas NBX são dialisadas durante a noite para PBS e concentradas para ~10 mg/ml.
[0061] A cepa GS115 de Pichia pastoris com construtos para a expressão e secreção de VHH marcado com 6xHis são cultivados por 5 dias a 30 oC com indução diária de 0,5% (vol/vol) de metanol. As células de levedura são removidas por centrifugação e o sobrenadante contendo NBX é enriquecido com imidazol 10 mM. O sobrenadante é aplicado a uma coluna HisTrap (GE Biosciences) pré-equilibrada com tampão A (HEPES 10 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM). A proteína é eluída da coluna usando um FPLC com um gradiente linear entre o tampão A e o tampão B (HEPES 10 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, Imidazol 500 mM). As proteínas NBX são dialisadas durante a noite para PBS e concentradas para ~10 mg/ml.
3. Neutralização com NBX da citotoxicidade de NetB
[0062] As células epiteliais derivadas do carcinoma hepatocelular (células LMH) de Gallus gallus cepa Leghorn são aderidas à superfície de uma placa de microtitulação de 96 poços tratada com cultura de tecidos e revestida com gelatina a 64.000 células/poço durante a noite a 37 oC e 5% de CO2. NetB expresso de forma recombinante é pré-incubado com NBX a uma gama de concentrações ou o tampão no qual os NBXs são dissolvidos (HEPES 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM) por 15 minutos a 37 oC e 5% de CO2. Após 15 minutos, as misturas de toxina/NBX são adicionadas a poços em triplicado de células LMH. A concentração final de NetB é de 5 nM. As concentrações finais de NBXs são 1, 3, 9, 27, 81, 243, 729 e
2187 nM. As células LMH com misturas de toxina/NBX são incubadas por 5 horas a 37 oC e 5% de CO2. A citotoxicidade induzida por NetB é medida usando o Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit (Thermo Scientific), seguindo as instruções do fabricante. A citotoxicidade percentual de NetB na presença de NBX é determinada em relação à citotoxicidade de NetB na ausência de NBX. Um ajuste não linear da concentração do inibidor versus resposta é determinado usando GraphPad Prism 8 que gera a concentração inibitória de 50% (IC50) que se aproxima da concentração de NBX necessária para bloquear 50% da citotoxicidade de NetB 5 nM.
[0063] A Tabela 3 indica, para todos os NBXs testados, se o NBX pode neutralizar a atividade de NetB contra células LMH com um valor de IC 50 inferior a 1 M e/ou inferior a 50 nM. Tabela 3 Tabela de resumo para NBXs que neutralizam NetB IC50 < 1 IC50 < 50 Número IC50 < 1 IC50 < 50 Número NBX M nM NBX M nM NBX0301 Sim Não NBX0503 Sim Sim NBX0303 Sim Sim NBX0504 Não Não NBX0304 Não Não NBX0505 Sim Sim NBX0305 Sim Sim NBX0506 Sim Sim NBX0307 Sim Sim NBX0507 Sim Sim NBX0308 Sim Não NBX0508 Sim Não NBX0309 Sim Sim NBX0509 Não Não NBX0310 Sim Sim NBX0510 Sim Sim NBX0311 Sim Não NBX0511 Sim Sim NBX0318 Sim Sim NBX0512 Sim Não NBX0319 Sim Sim NBX0513 Sim Não NBX0322 Sim Não NBX0538 Sim Sim NBX0323 Sim Não NBX0539 Sim Sim NBX0324 Sim Sim NBX0540 Sim Sim NBX0362 Sim Não NBX0541 Sim Não NBX0364 Sim Sim NBX0542 Sim Sim NBX0365 Sim Sim NBX0543 Sim Não
NBX0366 Sim Sim NBX0544 Sim Sim NBX0370 Sim Não NBX0545 Sim Sim NBX0371 Sim Sim NBX0546 Sim Sim NBX0372 Sim Não NBX0547 Sim Não NBX0373 Sim Não NBX0548 Sim Sim NBX0375 Sim Sim NBX0549 Sim Sim NBX0376 Sim Não NBX0550 Sim Sim NBX0378 Sim Não NBX0551 Sim Sim NBX0379 Sim Não NBX0552 Sim Sim NBX0501 Sim Sim NBX0553 Sim Sim NBX0502 Não Não
4. Redução com NBX da ligação ao colágeno CnaA
[0064] Em uma placa de microtitulação de 96 poços, 2 µg de colágeno são incubados em 100 µl de PBS por poço durante a noite a 4 °C. A placa é lavada com 200 µl de PBS e depois bloqueada com 200 µl de leite desnatado a 5% em PBS durante 2 horas a 37 °C. Durante a etapa de bloqueio, 200 nM ou 2 µM de NBXs individuais são misturados com ou sem 100 nM de 6X-Histidina e CnaA marcado com proteína de ligação à maltose (MBP) em PBS por 30 minutos a 37 °C. A placa é lavada com 200 µl de PBS três vezes e 100 µl de NBXs ou mistura de NBX/MBP- CnaA são adicionados a cada poço para uma incubação de 2 horas a 37 °C. Após lavagem com 200 µl de PBS três vezes, 100 µl de 0,125 µg/ml de anti-His conjugado com HRP são adicionados a cada poço e incubados durante 1 hora em temperatura ambiente. A placa é então lavada com 200 µl de PBS três vezes e 100 µl de substrato TMB são adicionados a cada poço e deixados a desenvolver durante 30 minutos. Para parar a reação, 50 µl de HCl 1 M são adicionados a cada poço. A absorvância da placa a 450 nm é lida para quantificar a ligação. Para quantificar a redução da ligação de CnaA ao colágeno na presença de NBX, uma redução percentual é calculada em relação à ligação de CnaA na ausência de NBX (100% de ligação).
[0065] A Tabela 4 indica, para todos os NBXs testados, se o NBX pode reduzir a ligação de CnaA ao colágeno em mais de 50% quando o NBX é fornecido a 2 M e/ou a 200 nM.
Tabela 4 Tabela de resumo para NBXs que neutralizam CnaA A ligação A A ligação ao ligação ao colágeno A ligação ao ao colágeno foi Número colágeno foi colágeno Número NBX foi reduzida NBX reduzida em foi reduzida em >50% >50% a 2 M reduzida em >50% a 200 nM em >50% a 2 M a 200 nM NBX0316 Sim Sim NBX0807 Sim Sim NBX0317 Sim Sim NBX0808 Sim Não NBX0325 Sim Sim NBX0809 Sim Sim NBX0326 Sim Sim NBX0811 Sim Sim NBX0327 Não Não NBX0812 Sim Sim NBX0514 Não Não NBX0847 Sim Não NBX0515 Não Não NBX0866 Sim Sim NBX0518 Não Não NBX0867 Sim Não NBX0520 Sim Não NBX0868 Sim Não NBX0521 Não Não NBX0869 Sim Sim NBX0522 Sim Sim NBX0870 Não Não NBX0523 Não Não NBX0871 Não Não NBX0524 Não Não NBX0872 Sim Não NBX0526 Não Não NBX0873 Sim Sim NBX0527 Não Não NBX0874 Sim Sim NBX0528 Sim Sim NBX0875 Sim Sim NBX0529 Não Não NBX0876 Sim Sim NBX0530 Sim Sim NBX0896 Sim Não NBX0531 Sim Sim NBX0897 Sim Não NBX0532 Não Não NBX0898 Sim Não NBX0533 Não Não NBX0899 Sim Sim NBX0534 Sim Sim NBX08100 Sim Sim NBX0535 Sim Sim NBX08101 Sim Sim
NBX0537 Não Não NBX08102 Sim Sim NBX0801 Sim Não NBX08103 Sim Não NBX0802 Sim Não NBX08104 Sim Sim NBX0803 Sim Sim NBX08105 Sim Sim NBX0804 Sim Sim NBX08106 Sim Sim NBX0805 Não Não NBX08107 Sim Sim NBX0806 Não Não NBX08108 Sim Sim
5. Neutralização com NBX da atividade da lecitinase Cpa
[0066] Cpa é misturado com NBX ou PBS para atingir uma concentração final de 100 nM (Cpa) e 1 uM (NBX) em um total de ovos caipiras comprados em loja por separação dos brancos. A gema é perfurada cuidadosamente, em seguida, 5 ml são removidos e misturados completamente com 45 ml de PBS para criar uma solução a 10%. A solução é centrifugada a 500 g para remover grandes agregados e, em seguida, passada por um filtro de seringa GD/X de 0,45 um. 60 µL da solução de gema filtrada são adicionados aos poços com Cpa ou Cpa/NBX para atingir uma concentração final de 5% v/v de gema de ovo. A placa é incubada por 1 hora a 37 oC, e então, a densidade óptica da placa é medida a 620 nm. A neutralização com NBX da atividade da lecitinase Cpa é determinada em relação à atividade da lecitinase Cpa na ausência de NBX (100%).
[0067] A Tabela 5 indica, para todos os NBXs testados, se o NBX pode reduzir a atividade da lecitinase Cpa em mais de 40% quando o NBX é fornecido a 1 M. Tabela 5 Tabela de resumo para NBXs que neutralizam Cpa Atividade da Atividade da lecitinase Cpa lecitinase Cpa Número NBX Número NBX reduzida em >40% a reduzida em >40% a 1 M 1 M NBX0329 Sim NBX0339 Sim NBX0330 Não NBX0340 Não NBX0338 Sim NBX0341 Não
6. CnaA não marcado fornecido em excesso supera a competição de CnaA marcado pela ligação ao colágeno
[0068] Em uma placa de microtitulação de 96 poços, 2 µg de colágeno são incubados em 100 µl de PBS por poço durante a noite a 4 °C. A placa é lavada com 200 µl de PBS e depois bloqueada com 200 µl de leite desnatado a 5% em PBS durante 2 horas a 37 °C. Durante a etapa de bloqueio, 100 nM de 6X-Histidina e CnaA marcado com proteína de ligação à maltose (MBP) é misturado com entre 0 e 2000 nM de CnaA não marcado em PBS por 30 minutos a 37 °C. A placa é lavada com 200 µl de PBS três vezes e 100 µl de MBP-CnaA ou mistura de MBP- CnaA/CnaA não marcado são adicionados a cada poço para uma incubação de 2 horas a 37 °C. Após lavagem com 200 µl de PBS três vezes, 100 µl de 0,125 µg/ml de anti-His conjugado com HRP são adicionados a cada poço e incubados durante 1 hora em temperatura ambiente. A placa é então lavada com 200 µl de PBS três vezes e 100 µl de substrato TMB são adicionados a cada poço e deixados a desenvolver durante 30 minutos. Para parar a reação, 50 µl de HCl 1 M são adicionados a cada poço. A absorvância da placa a 450 nm é lida para quantificar a ligação.
[0069] FIG. 3 mostra a redução da ligação de MBP-CnaA ao colágeno na presença de concentrações crescentes de CnaA não marcado.
[0070] Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes expedidas e outros documentos citados neste relatório descritivo são incorporados neste documento por referência como se cada publicação individual, pedido de patente, patente expedida, ou outro documento seja específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência na sua totalidade. Definições que estão contidas em texto incorporado por referência estão excluídas na medida em que elas estão em contradição com definições nesta divulgação.
[0071] As seguintes referências são incorporadas por referência em sua totalidade.
1. Wade, B. & Keyburn, A. (2015). The true cost of necrotic enteritis. World Poultry, 31, pp. 16-17
2. Moore, R. J. (2016). Necrotic enteritis predisposing factors in broiler chickens. Avian Pathology, 45(3), pp. 275-281.
3. Abid, S. A. et al. (2016). Emerging threat of necrotic enteritis in poultry and its control without use of antibiotics: a review. The Journal of Animal and Plant Sciences, 26(6), pp. 1556-1567.
4. Prescott, J. F. et al. (2011). The pathogenesis of necrotic enteritis in chickens: what we know and what we need to know: a review. Avian Pathology, 45(3), pp. 288-294.
5. Collier, C. T. et al. (2008) Coccidia-induced mucogenesis promotes the onset of necrotic enteritis by supporting Clostridium perfringens growth. Veterinary Immunology and Immunopathology, 122(1-2), pp. 104-115.
6. Van Meirhaeghe, H. & De Gussem, M. (2014). Coccidiosis a major threat to the chicken gut. Obtido em 25 de maio de 2018 em: https://www.poultryworld.net/Home/General/2014/9/Coccidiosis-a-major-threat-to- the-chicken-gut-1568808W/?dossier=35765&widgetid=1.
7. Chapman, HD (2014). Milestones in avian coccidiosis research: a review. Poultry Science, 93(3), pp. 501-511.
8. Shivaramaiah, S. et al. (2011). The role of an early Salmonella Typhimurium infection as a predisposing factor for necrotic enteritis in a laboratory challenge model. Avian Diseases, 55(2), pp. 319-323.
[0072] Embora as modalidades preferíveis da presente invenção tenham sido mostradas e descritas neste documento, será óbvio para aqueles versados na técnica que tais modalidades são fornecidas somente a título de exemplo. Diversas variações, alterações e substituições ocorrerão agora àqueles versados na técnica, sem que haja afastamento da invenção. Deve-se entender que diversas alternativas às modalidades da invenção descritas neste documento podem ser empregadas na prática da invenção. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas dentro do escopo destas reivindicações e seus equivalentes sejam abrangidos.
Claims (44)
1. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que é capaz de reduzir a citotoxicidade de NetB contra células LMH com um valor de IC50 menor que 50 nM.
2. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que é capaz de reduzir a citotoxicidade de NetB contra células LMH com um valor de IC50 menor que 1 mM.
3. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que é capaz de reduzir a ligação de CnaA nM em colágeno em mais de 50% a 200 nM.
4. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que é capaz de reduzir a ligação de CnaA nM em colágeno em mais de 50% a 2 µM.
5. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que é capaz de reduzir a atividade da Cpa lecitinase em mais de 40% a 1 µM.
6. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um fragmento de região variável de um anticorpo de cadeia pesada (VHH), em que a pelo menos uma VHH se liga especificamente a um agente causador de doença.
7. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma pluralidade de VHHs.
8. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende pelo menos três VHHs.
9. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que qualquer uma da pluralidade de VHHs é idêntica a outra VHH da pluralidade de VHHs.
10. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de VHHs é covalentemente acoplada entre si por um ligante peptídico, com o ligante peptídico compreendendo um ou mais aminoácidos.
11. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o fragmento de região variável do anticorpo de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das SEQ ID Nos: 1 a 56 ou 212 a 340.
12. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10,
caracterizado pelo fato de que o fragmento de região variável do anticorpo de cadeia pesada compreende uma região determinante de complementariedade 1 (CDR1) conforme indicado em qualquer uma das SEQ ID Nos: 57 a 106 ou 341 a 458, uma região determinante de complementariedade 2 (CDR2) conforme indicado em qualquer uma das SEQ ID Nos: 107 a 156 ou 459 a 576, e uma região determinante de complementariedade 3 (CDR3) conforme indicado em qualquer uma das SEQ ID Nos: 157 a 206 ou 577 a 694.
13. Complexo polipeptídico caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende um primeiro polipeptídeo componente e um segundo polipeptídeo componente, em que o primeiro polipeptídeo componente e o segundo polipeptídeo componente não são covalentemente ligados e acoplados por uma interação proteína-proteína, uma interação molécula pequena-proteína, ou uma interação molécula pequena-molécula pequena, em que cada um dentre o primeiro e segundo polipeptídeos componentes compreende uma VHH que se liga especificamente a um patógeno.
14. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o patógeno é uma bactéria associada a aves domésticas.
15. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a bactéria associada a aves domésticas compreende uma espécie de Clostridium.
16. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a espécie de Clostridium é Clostridium perfringens.
17. Polipeptídeo ou complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a VHH se liga especificamente a um fator de virulência de Clostridium.
18. Polipeptídeo ou complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a VHH se liga especificamente a um antígeno ou polipeptídeo pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntico às SEQ IDs Nos: 207 a 211 ou combinações destas.
19. Polipeptídeo ou complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o fator de virulência de Clostridium é o polipeptídeo NetB, poliepeptídeo de toxina tipo NetB, polipeptídeo Cpa, polipeptídeo de toxina tipo Cpa, polipeptídeo Cpb2, polipeptídeo de toxina tipo Cpb2, polipeptídeo CnaA, polipeptídeo tipo CnaA, polipeptídeo do domínio de ligação a colágeno de CnaA ou polipeptídeo semelhante ao domínio de ligação a colágeno de CnaA.
20. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a VHH pode neutralizar a citotoxicidade de NetB em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100%.
21. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a VHH pode inibir a ligação ao colágeno pelo CnaA em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100%.
22. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a VHH pode neutralizar a citotoxicidade de Cpa em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100%.
23. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a VHH pode neutralizar a citotoxicidade de Cpb2 em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100%.
24. Uso de um polipeptídeo pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntico às SEQ IDs Nos: 207 a 211, ou combinações destas, caracterizado pelo fato de que é para reduzir a atividade de um fator de virulência de Clostridium perfringens.
25. Polipeptídeo da SEQ ID 210 ou 211, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo pode superar a ligação do CnaA expresso na superfície de Clostridium perfringens ao colágeno em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100%.
26. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 14 a 25, ou o complexo polipeptídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 23.
27. Pluralidade de ácidos nucleicos caracterizada pelo fato de que codifica o complexo polipeptídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 23.
28. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 26, ou a pluralidade de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 27, que podem ser usados para produzir o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 14 a 25, ou o complexo polipeptídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 23, em qualquer sistema de produção.
29. Célula caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 26, ou a pluralidade de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 27.
30. Célula, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de levedura.
31. Célula, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a levedura é do gênero Pichia.
32. Célula, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a levedura é do gênero Saccharomyces.
33. Célula, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula bacteriana.
34. Célula, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a bactéria é do gênero Escherichia.
35. Célula, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a bactéria é uma bactéria probiótica.
36. Célula, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a bactéria probiótica é selecionada do grupo consistindo no gênero Bacillus, no gênero Lactobacillus, no gênero Bifidobacterium.
37. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 14 a 25, ou complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 23, caracterizado pelo fato de que é sintetizado em qualquer sistema de síntese de novo de proteínas.
38. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 14 a 25, ou complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende uma vitamina, um antibiótico, um hormônio, um peptídeo antimicrobiano, um esteroide, um probiótico, um probiótico, um bacteriófago, quitina, quitosano, B-1,3-glucano, extratos vegetais, peptona, farinha de camarão, krill, algas, B-ciclodextrano, alginato, goma, tragacanto, pectina, gelatina, um spray aditivo, um aglutinante de toxina, um ácido graxo de cadeia curta, um ácido graxo de cadeia média, levedura, um extrato de levedura, açúcar, uma enzima digestiva, um composto digestivo, um mineral essencial, um sal essencial, ou fibra.
39. Método de produção do polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 14 a 25, ou do complexo polipeptídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende (a) incubar uma célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 36, em um meio adequado para secreção do polipeptídeo da célula; e (b) purificar o polipeptídeo do meio.
40. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 14 a 25, ou complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 23, caracterizado pelo fato de que é para uso na redução ou prevenção de uma infecção bacteriana associada a aves domésticas em uma ave, outra espécie animal ou indivíduo humano.
41. Polipeptídeo, de acordo com qualquer um de 1 a 12 ou 14 a 25, ou complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 23, caracterizado pelo fato de que é para uso na redução da transmissão ou prevenção da transmissão de uma bactéria associada a aves domésticas a partir de uma espécie aviária para outra ave, outra espécie animal, ou um indivíduo humano.
42. Uso, de acordo com a reivindicação 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que a ave é uma espécie de galinha, peru, pato, codorna, pombo, pombo jovem, avestruz ou ganso.
43. Uso, de acordo com a reivindicação 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que a espécie animal não aviária é um porco, ovelha, cabra, cavalo, vaca, lhama, alpaca, vison, coelho, cão, gato ou humano.
44. Uso, de acordo com a reivindicação 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é adaptado para introdução no canal alimentar por via oral ou retal, fornecido à superfície exterior (por exemplo, como um spray ou submersão), fornecido ao meio no qual o animal habita (incluindo meios de base aérea), fornecido por injeção, fornecido por via intravenosa, fornecido através do sistema respiratório, fornecido através de difusão, fornecido através de absorção pelo endotélio ou epitélio, ou fornecido através de um organismo secundário, tal como uma levedura, bactéria, alga, bacteriófagos, plantas e insetos a um hospedeiro.
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