BR112019025019A2

BR112019025019A2 - polipeptídeo isolado de pilus de clostridium perfringens, polipeptídeo imunogênico, vetor, vacina, uso de um polipeptídeo imunogênico, método de tratamento, anticorpo, método para detectar infecção e método para detectar um polipeptídeo imunogênico

Info

Publication number: BR112019025019A2
Application number: BR112019025019-0A
Authority: BR
Inventors: Jianhua Gong; Dion LEPP
Original assignee: Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food
Priority date: 2017-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2020-06-30
Also published as: US20200093913A1; CA3064461A1; RU2019137515A; MX2019014450A; EP3630800A4; EP3630800A1; CN110691787A; US11318194B2; JP2020527051A; JP2023090702A; US20220226455A1; RU2019137515A3; WO2018218360A1

Abstract

Um polipeptídeo imunogênico selecionado a partir de um polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens, uma variante do polipeptídeo de pilus; um fragmento do polipeptídeo de pilus; e um fragmento da variante, é útil para a preparação de uma vacina para o tratamento ou a prevenção de necrose entérica em ave de capoeira (poultry). O polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens inclui um pilus montado ou as subunidades de pilus CnaA, FimA e/ ou FimB.

Description

POLIPEPTÍDEO ISOLADO DE PILUS DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS, POLIPEPTÍDEO IMUNOGÊNICO, VETOR, VACINA, USO DE UM POLIPEPTÍDEO IMUNOGÊNICO, MÉTODO DE TRATAMENTO, ANTICORPO, MÉTODO PARA DETECTAR INFECÇÃO E MÉTODO PARA

DETECTAR UM POLIPEPTÍDEO IMUNOGÊNICO Antecedentes

[0001] O presente pedido é direcionado a polipeptídeos úteis na preparação de uma vacina contra enterite necrótica em ave de capoeira (poultry). Mais especificamente, o presente pedido é direcionado a um polipeptídeo de pilus de Clostridium perfringens útil na preparação de uma vacina contra enterite necrótica relacionada à infecção por Clostridium perfringens em ave de capoeira.

[0002] A enterite necrótica é uma doença intestinal de ave de capoeira, como frangos de corte, que em 2015 foi estimado em USS 6 bilhões em perdas para a indústria avícola. A enterite necrótica é causada principalmente por certas cepas do tipo A de Clostridium perfringens que produzem a toxina formadora de poros NetB, que crescem demais e aderem à mucosa intestinal, causando eventualmente as lesões características da doença. O Clostridium perfringens é um habitante normal do trato intestinal, e normalmente apenas as cepas que carregam a toxina NetB podem causar enterite necrótica. A enterite necrótica é controlada principalmente pela aplicação de antibióticos na alimentação, uma prática que é cada vez mais desencorajada devido à possível propagação da resistência antimicrobiana e que atualmente está sendo desativada em alguns países. Portanto, é importante, do ponto de vista financeiro e de saúde pública, encontrar abordagens alternativas para controlar a enterite necrótica, tal como o desenvolvimento de uma vacina.

[0003] Um locus genético de aderência a Clostridium perfringens (VR-10B) foi recentemente identificado por sua associação com cepas NetB-positivas (Lepp D, Gong J, Songer JG, Boerlin P, Parreira VR, Prescott JF. 2013. Identification of Accessory Genome Regions in Poultry Clostridium perfringens Isolates Carrying the netB Plasmid. Journal of Bacteriology 195: 1152-1166). O locus genético identificado foi encontrado em 87% dos isolados netB positivos e 42% dos isolados netB negativos, dos 54 isolados de ave de capoeira examinados. Este locus genético (posteriormente renomeado como locus de adesão ao colágeno) foi posteriormente demonstrado estar envolvido na ligação do colágeno e necessário para a patogênese da enterite necrótica (Wade B, Keyburn AL, Haring V, Ford M, Rood JI, Moore RJ: The adherent abilities of Clostridium perfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necrotic enteritis. Vet Microbiol 2016, 197: 53-61; Wade B, Keyburn AL, Seemann T, Rood JI, Moore RJ: Binding of Clostridium perfringens to collagen correlates with the ability to cause necrotic enteritis in chickens. Vet Microbiol 2015, 180: 299-303).

[0004] Várias proteínas de Clostridium perfringens foram previamente avaliadas como candidatas a vacina. No entanto, essas proteínas oferecem, na melhor das hipóteses, proteção parcial contra enterite necrótica. Além disso, muitas dessas proteínas não são específicas para cepas causadoras de enterite necrótica e não são conhecidas por desempenhar um papel na patogênese da enterite necrótica. Portanto, é desejável identificar polipeptídeos alternativos de Clostridium perfringens que possam ser candidatos à produção de uma vacina contra enterite necrótica. Descrição Resumida

[0005] Um aspecto da presente invenção fornece um polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo imunogênico selecionado a partir de um polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens uma variante do polipeptídeo de pilus; um fragmento do polipeptídeo de pilus; e um fragmento da variante, em que o polipeptídeo de pilus, a variante, o fragmento do polipeptídeo e o fragmento da variante são imunogênicos em ave de capoeira. Em pelo menos uma forma de realização, O polipeptídeo de pilus é um polipeptídeo CnaA. Em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo de pilus é um polipeptídeo FimA. Em pelo menos uma forma de realização, O polipeptídeo de pilus é um polipeptídeo FimB. Em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo de pilus é um pilus montado.

[0006] Outro aspecto da presente invenção fornece um polinucleotídeo compreendendo uma sequência que codifica um polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens ou um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito. Em outro aspecto, o presente pedido fornece um vetor compreendendo um polinucleotídeo que possui uma sequência que codifica um polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens ou um polipeptídeo imunogênico,

conforme aqui descrito, em que o vetor é configurado para expressão do polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens ou polipeptídeo imunogênico em uma célula hospedeira.

[0007] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma vacina para o tratamento ou a prevenção de enterite necrótica em ave de capoeira, em que a vacina compreende um Ppolipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito. Em outro aspecto, o presente pedido fornece uma vacina para o tratamento ou a prevenção de infecção por Clostridium perfringens em ave de capoeira, em que a vacina compreende um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito.

[0008] Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito, na preparação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de enterite necrótica em ave de capoeira ou para o tratamento ou a prevenção de infecção por Clostridium perfringens em ave de capoeira.

[0009] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de enterite necrótica em ave de capoeira ou para o tratamento ou a prevenção de infecção por Clostridium perfringens em ave de capoeira, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito, ou uma vacina do mesmo em ave de capoeira.

[0010] Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito, como uma vacina para o tratamento ou a prevenção de enterite necrótica em ave de capoeira ou para o tratamento ou a prevenção de infecção por Clostridium perfringens em ave de capoeira.

[0011] Um outro aspecto da presente invenção fornece um anticorpo que se liga seletivamente a um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para detectar infecção por Clostridium perfringens em ave de capoeira, obtendo uma amostra biológica da ave de capoeira e detectando na amostra biológica a presença de um anticorpo que se liga seletivamente a um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito. Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um método para detectar um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito, compreendendo a exposição do polipeptídeo imunogênico a um anticorpo que se liga seletivamente ao polipeptídeo imunogênico e a detecção da ligação do polipeptídeo imunogênico ao anticorpo.

Descrição Resumida dos desenhos

[0012] Outras características da presente invenção se tornarão evidentes a partir da seguinte descrição escrita e das figuras anexas, nas quais:

[0013] A Figura 1 é uma representação esquemática do locus cromossômico de Clostridium perfringens VR-10B de 5,2 kilo de pares de base;

[0014] A Figura 2A é uma fotografia que ilustra a separação do polipeptídeo da subunidade de pilus recombinante marcada com histidina CnaA por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) visualizada por coloração com Coomassie;

[0015] A Figura 2B é uma fotografia que ilustra a separação do polipeptídeo da subunidade de pilus recombinante FimA por SDS-PAGE visualizado por coloração com Coomassie;

[0016] A Figura 2C é uma fotografia que ilustra a separação do polipeptídeo da subunidade de pilus recombinante FimB por SDS-PAGE visualizado por coloração com Coomassie;

[0017] A Figura 2D é uma fotografia que ilustra a visualização por coloração com SDS-PAGE e Coomassie de frações combinadas de CnaA, FimA e FimB após concentração e dessalinização;

[0018] A Figura 3A é um gráfico que ilustra a resposta do anticorpo IgY no soro (absorvância a 405 nm) contra o polipeptídeo recombinante CnaA de galinhas imunizadas apenas com adjuvante ou com CnaA em um primeiro ensaio de vacinação. Cada ponto representa um único indivíduo e as linhas horizontais representam as médias. * indica uma diferença significativa da amostra pré-imune (d8) de cada grupo no nível p < 0,05, ** indica uma diferença significativa no nível p < 0,01 e *** indica uma diferença significativa no nível p < 0,001 quando medido pelo teste de Tukey (Tukey, J. “Comparing Individual Means in the Analysis of Variance”. Biometrics (1949) 5(2): 99- 114);

[0019] A Figura 3B é um gráfico que ilustra a resposta do anticorpo IgY no soro (absorbância a 405 nm) contra o polipeptídeo recombinante FimA de aves imunizadas apenas com adjuvante ou com FimA no ensaio da Figura 3A. Cada ponto representa um único indivíduo e as linhas horizontais representam as médias. * indica uma diferença significativa da amostra pré-imune (d8) de cada grupo no nível p < 0,05, ** indica uma diferença significativa no nível p < 0,01 e *** indica uma diferença significativa no nível p < 0,001 quando medido pelo teste de Tukey;

[0020] A Figura 4 é um gráfico que ilustra as pontuações de lesões de enterite necrótica (NE) de grupos de galinhas imunizadas apenas com adjuvante ou com CnaÃ ou FimA no ensaio da Figura 3A, seguido de desafio na alimentação com a cepa CPl de Clostridium perfringens. Cada ponto representa um único indivíduo e as linhas horizontais representam a média da pontuação de lesão da enterite necrótica;

[0021] A Figura 5A é um gráfico que ilustra a resposta do anticorpo IgY no soro (absorvância a 405 nm) contra o polipeptídeo recombinante CnaA de galinhas imunizadas apenas com adjuvante, com CnaA ou com uma combinação de CnaA, FimA e FimB (Comb), em um segundo ensaio de vacinação. Cada ponto representa um único indivíduo e as linhas horizontais representam as médias. * indica uma diferença significativa da amostra pré-imune (d7) de cada grupo no nível p < 0,05, ** indica uma diferença significativa no nível p < 0,01 e *** indica uma diferença significativa no nível p < 0,001 quando medido pelo teste de Tukey;

[0022] A Figura 5B é um gráfico que ilustra a resposta do anticorpo IgY no soro (absorvância a 405 nm) contra o polipeptídeo recombinante FimA de galinhas imunizadas apenas com adjuvante ou com uma combinação de CnaA, FimA e FimB (Comb), no ensaio da Figura 5A. Cada ponto representa um único indivíduo e as linhas horizontais representam as médias. * indica uma diferença significativa da amostra pré-imune (d7) de cada grupo no nível p < 0,05, ** indica uma diferença significativa no nível p < 0,01 e *** indica uma diferença significativa no nível p < 0,001 quando medido pelo teste de Tukey;

[0023] A Figura 5C é um gráfico que ilustra a resposta do anticorpo IgY no soro (absorbância a 405 nm) contra o polipeptídeo recombinante FimB de galinhas imunizadas apenas com adjuvante, com FimB ou com uma combinação de CnaA, FimA e FimB (Comb), no ensaio da Figura 5A. Cada ponto representa um único indivíduo e as linhas horizontais representam as médias. * indica uma diferença significativa da amostra pré-imune (d7) de cada grupo no nível p < 0,05, ** indica uma diferença significativa no nível p < 0,01 e *** indica uma diferença significativa no nível p < 0,001 quando medido pelo teste de Tukey;

[0024] A Figura 6 é um gráfico que ilustra as pontuações de lesões de enterite necrótica (NE) de grupos de galinhas imunizadas apenas com adjuvante, CnaA, FimB ou uma combinação de CnaA, FimA e FimB (Comb), no ensaio da Figura 5A, seguido por desafio na alimentação com a cepa CPl de Clostridium perfringens. Cada ponto representa um único indivíduo e as linhas horizontais representam a média da pontuação de lesão da enterite necrótica. As letras (a, b) indicam grupos significativamente diferentes (Tukey; p < 0,01);

[0025] A Figura 7 é um gráfico que ilustra as pontuações das lesões de enterite necrótica (NE) de grupos de galinhas após desafio na alimentação da cepa CPl ou CPl mutantes nulos de Clostridium perfringens para genes fimA e fimB da subunidade de pilus (CPlAfimA e CPlAfimB). As linhas representam a média da pontuação de lesão por enterite necrótica;

[0026] A Figura 8A é uma fotografia que ilustra a separação por SDS-PAGE de polipeptídeos de superfície extraídos de genes da cepa CPl ou CPl de mutantes nulos de Clostridium perfringens para cada uma das subunidades pilus cnaA, fimA e fimB (CPlAcnaA, CPIAfimA e CPLlAfimB), visualizado com coloração de Coomassie;

[0027] A Figura 8B é uma fotografia que ilustra uma análise de Western blot de polipeptídeos de superfície separados por SDS-PAGE extraídos da cepa CPl ou CPl mutantes nulos de Clostridium perfringens de genes, para cada uma das subunidades pilus cnaA, fimA e fimB (CPlAcnah, CP1lAfimA, e CPLlAfimB), detectado usando anticorpos anti-FimA obtidos do soro de galinha como anticorpo primário;

[0028] A Figura 8C é uma fotografia que ilustra uma análise de Western blot de polipeptídeos de superfície separados por SDS-PAGE extraídos de cepa CPl ou CPl mutantes nulos de Clostridium perfringens para genes, para cada uma das subunidades pilus cnaA, fimA e fimB (CP1l (cnaA, CPIlAfimA e CPlAfimB), detectado usando anticorpos anti-FimA criados em coelhos como o principal anticorpo;

[0029] A Figura 9A é uma fotografia que ilustra a separação por SDS-PAGE de polipeptídeos de superfície extraídos de várias cepas de Clostridium perfringens visualizadas com coloração de Coomassie;

[0030] A Figura 93 é uma fotografia que ilustra uma análise de Western blot de polipeptídeos de superfície separados por SDS-PAGE extraídos de várias cepas de Clostridium perfringens visualizadas com anticorpos anti-FimA obtidos a partir de soro de galinha como anticorpo primário; e

[0031] A Figura 10 é uma série de fotografias obtidas por microscopia eletrônica de transmissão de células da cepa CPl ou CP1 de mutantes nulos de Clostridium perfringens CPlAfimA e CPlAfimB marcados com partículas de ouro usando anticorpo anti-FimA de coelho como anticorpo primário e 6 nm IgG anti-coelho de cabra marcada com imunogold como anticorpo secundário. Descrição Detalhada

[0032] Verificou-se pelos presentes depositantes que o locus genético VR-10B identificado em cepas de Clostridium perfringens associadas a enterite necrótica em ave de capoeira (Lepp D et al, Journal of Bacteriology (2013) 195: 1152-1166) contém seis genes putativos que foram encontrados para codificar um pilus adesivo: três genes (cnaA, fimA e fimB) que codificam subunidades estruturais do pilus e genes que codificam duas sortases e uma peptidase de sinal presumivelmente envolvida na montagem do pilus. Uma representação esquemática do locus VR-10B é mostrada na Figura 1.

[0033] Um pilus é uma estrutura semelhante a um cabelo, presente na superfície de muitas bactérias e frequentemente envolvida em virulência. Este tipo de pilus é composto por subunidades polipeptídicas principais e secundárias ligadas covalentemente que formam uma estrutura de superfície celular com um comprimento de aproximadamente 1 um. Pili tem sido extensivamente estudado em bactérias

Gram-negativas, mas várias espécies Gram-positivas, incluindo Corynebacterium diphtheriae, Streptococcus pneumoniae e Streptococcus pyogenes, demonstraram mais recentemente produzir um tipo específico de pilus que é montado por enzimas sortase. Este tipo de pilus Gram- positivo adesivo é montado na superfície da célula por meio de ligação covalente das subunidades da pilina pelas enzimas domésticas e da sortase específica da pilina e é eventualmente covalentemente ligado ao peptidoglicano da parede celular para formar o pilus montado.

[0034] Sem estar limitado pela teoria, é contemplado que os polipeptídeos de pilus de Clostridium perfringens aqui descritos podem ser um alvo viável e promissor para o desenvolvimento de uma vacina contra enterite necrótica por várias razões. O locus gênico está presente principalmente em cepas causadoras de enterite necrótica de Clostridium perfringens. Portanto, espera-se que a resposta imune provocada por uma proteína pilus imunogênica atinja especificamente cepas de Clostridium perfringens que causam doenças. Além disso, os pili estão presentes na superfície da célula bacteriana e geralmente estão envolvidos na ligação ao hospedeiro durante àa patogênese das infecções bacterianas, que podem expor o pili ao sistema imunológico do hospedeiro. Além disso, possivelmente devido ao seu papel na doença e sua localização na superfície celular bacteriana, o pili tem sido utilizado com sucesso no desenvolvimento de vacinas para várias outras doenças infecciosas.

[0035] Assim, um aspecto do presente pedido fornece um polipeptídeo imunogênico selecionado a partir de um polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens, uma variante do polipeptídeo de pilus; um fragmento do polipeptídeo de pilus; e um fragmento da variante, em que o polipeptídeo de pilus, a variante, oO fragmento do polipeptídeo e o fragmento da variante são imunogênicos em ave de capoeira.

[0036] Como usado aqui, o termo “ave de capoeira” é usado para se referir a espécies de aves ou aves criadas de maneira agrícola para produtos que incluem, entre outros, carne, ovos e penas. As aves de capoeira incluem, entre outras, galinhas, perus, patos, gansos, codornas, avestruzes, faisões e outras aves ou aves relevantes para a agricultura. São especialmente incluídas as aves de capoeira suscetíveis à enterite necrótica causada pela infecção por Clostridium perfringens. Em pelo menos uma forma de realização, as aves de capoeira são frangos de corte ou galinhas criadas para produção de carne.

[0037] Como usado aqui, o termo “polipeptídeo” pretende significar um composto contendo dois ou mais resíduos de aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas. Os polipeptídeos incluemy mas não estão limitados a, oligopeptídeos ou polipeptídeos nos quais dois ou mais resíduos de aminoácidos são ligados sequencialmente por ligações peptídicas covalentes para formar um único filamento polipeptídico e proteínas compreendendo dois ou mais filamentos polipeptídicos não covalentemente associados entre si ou ligados uns com os outros por ligações covalentes que não sejam ligações peptídicas, incluindo mas não se limitando a ligações dissulfeto e ligações isopeptídicas. Como usado aqui, o termo “ligação isopeptídica” pretende significar uma ligação amida formada entre um grupo amino de um aminoácido e um grupo carboxila de um segundo aminoácido, em que pelo menos um do grupo amino e o grupo carboxila estão localizados na cadeia lateral do respectivo aminoácido.

[0038] Como usado aqui, o termo “polipeptídeo de pilus de Clostridium perfringens” pretende significar um polipeptídeo que tem a função de um pilus ou uma subunidade de pilus e que é codificado por um ou mais genes encontrados em uma cepa de Clostridium perfringens associada a enterite necrótica em ave de capoeira. Em pelo menos uma forma de realização, o gene é o gene cnaA, o gene fimA ou o gene fimB encontrado no locus genético VR-10B identificado em Lepp D et al, Journal of Bacteriology (2013) 195: 1152-1166, conforme diagramaticamente representado na Figura 1.

[0039] Como usado aqui, o termo “variante”, quando usado em referência a um polipeptídeo, pretende se referir a um polipeptídeo que difere em sua sequência de aminoácidos da sequência de um polipeptídeo de referência ao qual a variante está sendo comparada por um ou mais resíduos de aminoácidos. As diferenças entre a sequência da variante e a sequência do polipeptídeo de referência podem incluir a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por diferentes resíduos de aminoácidos, inserção de resíduos adicionais de aminoácidos ou exclusão de resíduos de aminoácidos. Em certas formas de realização, uma variante pode diferir de um polipeptídeo de referência por substituição conservadora de um ou mais resíduos de aminoácidos por resíduos de aminoácidos de substituição que podem ter propriedades semelhantes, incluindo, mas não se limitando a carga, tamanho e hidrofilicidade, aos resíduos de aminoácidos que os novos resíduos substituem. Em certas formas de realização, as variantes podem reter total ou parcialmente uma ou mais funções biológicas do polipeptídeo de referência, incluindo, mas não se limitando a, imunogenicidade. Em pelo menos uma forma de realização, O polipeptídeo de referência é um polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens, conforme aqui descrito.

[0040] Em pelo menos uma forma de realização, a sequência de uma variante pode ter pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,9% de identidade para a sequência de um polipeptídeo de referência. Como usado aqui, o termo “identidade percentual” ou “% de identidade” quando usado em referência à sequência de um polipeptídeo ou polinucleotídeo pretende significar a porcentagem do número total de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos, respectivamente, na sequência que são idênticos aos da posição correspondente de uma sequência polipeptídica ou polinucleotídica de referência. Em pelo menos uma forma de realização, quando o comprimento da sequência variante e o comprimento da sequência de referência não são idênticos, a porcentagem de identidade pode ser calculada com base no número total de resíduos na sequência variante ou com base no número total ou resíduos na sequência de referência. A identidade percentual pode ser medida por vários algoritmos de alinhamento de sequência local ou global bem conhecidos no estado da técnica, incluindo, mas não se limitando, ao algoritmo Smith-Waterman e ao algoritmo Needleman-Wunsch. As ferramentas que utilizam esses ou outros algoritmos adequados incluemy mas não estão limitadas a, BLAST (Ferramenta de busca básica de alinhamento local) e outras ferramentas bem conhecidas no estado da técnica.

[0041] Como usado aqui, o termo “fragmento”, quando usado em relação a um polipeptídeo ou uma variante, se refere a um polipeptídeo menor contendo menos resíduos de aminoácidos que o polipeptídeo ou variante e possuindo uma sequência idêntica a uma porção da sequência do polipeptídeo ou variante. Em pelo menos uma forma de realização, o fragmento retém uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo ou variante, incluindo, mas não limitado a, imunogenicidade. Em pelo menos uma forma de realização, o fragmento compreende um epítopo do polipeptídeo ou variante. Em pelo menos uma forma de realização, o fragmento tem pelo menos 6 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 7 aminoácidos de comprimento, ou pelo menos 8 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 9 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 10 aminoácidos de comprimento.

[0042] Como usado aqui, o termo “imunogênico” pretende se referir a um agente, incluindo, mas não se limitando a, um polipeptídeo ou polinucleotídeo ou um fragmento do mesmo, que é capaz de provocar uma resposta imunoprotetora em um sujeito ao qual o agente imunogênico é administrado. Como usado aqui, o termo “resposta imunoprotetora” se refere a uma resposta imune que impede, reduz ou elimina um ou mais dos sintomas da doença em um indivíduo infectado.

[0043] O presente polipeptídeo imunogênico, incluindo o presente polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens, a variante do polipeptídeo de pilus, o fragmento do polipeptídeo de pilus e o fragmento da variante, são imunogênicos em ave de capoeira. Assim, em pelo menos uma forma de realização, aves de capoeira imunizadas com qualquer um ou mais do presente polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens, a variante do polipeptídeo de pilus, o fragmento do polipeptídeo de pilus e o fragmento da variante mostrarão uma resposta imunoprotetora ao desafio com um ou mais de uma célula de Clostridium perfringens, um pilus montado de Clostridium perfringens, um polipeptídeo de pilus de Clostridium perfringens, um fragmento de um polipeptídeo de pilus de Clostridium perfringens ou uma porção de uma célula de Clostridium perfringens, incluindo mas não se limitando a uma membrana ou porção celular do mesmo ou uma parede celular ou uma porção do mesmo, que possui um ou mais de um polipeptídeo de pilus de Clostridium perfringens montado, um polipeptídeo de pilus de Clostridium perfringens ou um fragmento de um polipeptídeo de pilus de Clostridium perfringens.

[0044] Outro aspecto do presente pedido fornece um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica um polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens ou um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito. Em pelo menos uma forma de realização, o polinucleotídeo é RNA mensageiro (mRNA) tendo uma sequência que pode ser traduzida para gerar o polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens ou o polipeptídeo imunogênico. Em pelo menos uma forma de realização, O polinucleotídeo é DNA, pelo menos uma cadeia pode ser transcrita para produzir mRNA que, por sua vez, pode ser traduzido para gerar o polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens ou o polipeptídeo imunogênico. Em pelo menos uma forma de realização, o DNA pode ser expresso por um sistema bioquímico, incluindo, mas não limitado a uma célula, para produzir o polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens ou o polipeptídeo imunogênico. Em pelo menos uma dessas formas de realização, o DNA pode ser incorporado em um vetor configurado para expressão do DNA em uma célula hospedeira, como bem conhecido no estado da técnica.

[0045] Em pelo menos uma forma de realização, o polinucleotídeo pode incluir uma sequência polinucleotídica variante que hibrida com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência que codifica um polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens ou um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito, em condições pelo menos moderadamente rigorosas. Por “condições de hibridação pelo menos moderadamente rigorosas” significa que são selecionadas condições que promovem a hibridação seletiva entre duas moléculas de ácido nucleico complementares em solução. A hibridação pode ocorrer em toda ou em uma porção de uma molécula de sequência de ácido nucleico. A porção de hibridação é tipicamente de pelo menos 15 (por exemplo, 20, 25, 30, 40 ou 50) nucleotídeos de comprimento. Os técnicos no assunto reconhecerão que a estabilidade de um duplex de ácido nucleico, ou híbrido, é determinada pela temperatura de fusão (Tm), que em tampões contendo sódio é uma função da concentração do íon sódio ([Na]) e da temperatura (T, = 81,5 ºC - 16,6 (Login [Na ]) + 0,41(&(G+C) - 600/I), em que % de G + C é a porcentagem de nucleotídeos de citosina e guanina no ácido nucleico e l é o comprimento do ácido nucleico em pares de bases ou equação semelhante). Por conseguinte, os parâmetros nas condições de lavagem que determinam a estabilidade híbrida são a concentração e a temperatura do íon sódio. Para identificar moléculas que são semelhantes, mas não idênticas, a uma molécula de ácido nucleico conhecida, pode-se presumir que uma incompatibilidade de 1% resulte em uma diminuição de cerca de 1 ºC em Tr. Por exemplo, se se buscar moléculas de ácido nucleico com uma identidade > 95%, a temperatura final de lavagem poderá ser reduzida em cerca de 5 ºC. Com base nessas considerações, os técnicos no assunto serão capazes de selecionar rapidamente condições apropriadas de hibridação.

[0046] Em algumas formas de realização, condições rigorosas de hibridação são selecionadas. A título de exemplo, as seguintes condições podem ser empregadas para obter uma hibridação rigorosa: hibridação com 5x de cloreto de sódio/ citrato de sódio (SSC)/ 5x de solução de Denhardt/ 1,0% de dodecilsulfato de sódio (SDS) a Ti, - 5 ºC, com base na equação acima, seguido de uma lavagem de 0,2x de SSC/ SDS a 0,1% a 60 ºC. Condições de hibridação moderadamente rigorosas incluem uma etapa de lavagem em 3x de SSC a 42 ºC. Entende-se, no entanto, que restrições equivalentes podem ser alcançadas usando tampões, sais e temperaturas alternativas. Orientações adicionais sobre as condições de hibridação podem ser encontradas em: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 2002, e em: Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

[0047] Em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens é um polipeptídeo CnaA. Em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo CnaA tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID Nº: 10 e da SEQ ID Nº: 13. Em pelo menos uma forma de realização, O polipeptídeo CnaA é codificado por um polinucleotídeo possuindo uma sequência selecionada a partir da SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 4 e SEQ ID Nº: 7. Em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo CnaA é codificado por um polinucleotídeo que hibrida em condições pelo menos moderadamente rigorosas com um polinucleotídeo possuindo uma sequência selecionada a partir da SEQ ID Nº: 1, da SEQ ID Nº: 4 e da SEQ ID Nº: 7. Em pelo menos uma forma de realização, quando o polipeptídeo de pilus é um polipeptídeo CnaA, a variante tem pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 99,9% de identidade de sequência possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID Nº: 10 e da SEQ ID Nº: 13.

[0048] Em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens é um polipeptídeo FimA. Em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo FimA tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID Nº: 11 e da SEQ ID Nº: 14. Em pelo menos uma forma de realização, O polipeptídeo FimA é codificado por um polinucleotídeo possuindo uma sequência selecionada a partir da SEQ ID Nº: 2, da SEQ ID Nº: 5 e da SEQ ID Nº: 8. Em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo FimA é codificado por um polinucleotídeo que hibrida em condições pelo menos moderadamente rigorosas com um polinucleotídeo possuindo uma sequência selecionada a partir da SEQ ID Nº: 2, da SEQ ID Nº: 5 e da SEQ ID Nº: 8. Em pelo menos uma forma de realização, quando o polipeptídeo de pilus é um polipeptídeo FimA, a variante tem pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 99,9% de identidade de sequência possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID Nº: 11 e da SEQ ID Nº: 14.

[0049] Em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens é um polipeptídeo FimB. Em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo FimB tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID Nº: 12 e da SEQ ID Nº: 15. Em pelo menos uma forma de realização, O polipeptídeo FimB é codificado por um polinucleotídeo possuindo uma sequência selecionada a partir da SEQ ID Nº: 3, da SEQ ID Nº: 6 e da SEQ ID Nº: 9. Em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo FimB é codificado por um polinucleotídeo que hibrida em condições pelo menos moderadamente rigorosas com um polinucleotídeo possuindo uma sequência selecionada a partir da SEQ ID Nº: 3, da SEQ ID Nº: 6 e da SEQ ID Nº: 9. Em pelo menos uma forma de realização, quando o polipeptídeo de pilus é um polipeptídeo FimB, a variante tem pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 99,9% de identidade de sequência possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID Nº: 12 e da SEQ ID Nº; 15.

[0050] Em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens é um pilus montado. Em pelo menos uma forma de realização, o pilus montado compreende uma ou mais subunidades, cada uma individualmente selecionada a partir de um polipeptídeo CnaA, um polipeptídeo FimA e um polipeptídeo FimB. Em pelo menos uma forma de realização, a uma ou mais subunidades são ligadas covalentemente uma à outra. Em pelo menos uma forma de realização, o pilus montado é um pilus isolado de uma célula de Clostridium perfringens, ou uma porção do mesmo incluindo, mas não se limitando a, uma membrana celular ou uma porção do mesmo ou uma parede celular ou uma porção do mesmo. Em pelo menos uma forma de realização, O pilus montado é um fragmento de um pilus isolado de uma célula de Clostridium perfringens, ou uma porção do mesmo incluindo, mas não se limitando a, uma membrana celular ou uma porção do mesmo ou uma parede celular ou uma porção do mesmo, em que o fragmento compreende uma ou mais subunidades, cada uma selecionada individualmente a partir de um polipeptídeo CnaA, um Ppolipeptídeo FimA e um polipeptídeo FimB.

[0051] Em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens pode ser isolado de uma cultura de Clostridium perfringens. Assim, em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens pode ser parte de uma preparação contendo uma ou mais porções de uma célula de Clostridium perfringens, incluindo mas não se limitando a uma membrana celular ou uma porção do mesmo ou uma parede celular ou uma porção do mesmo, que possui o polipeptídeo de pilus ou um fragmento do mesmo, conforme aqui descrito. Em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens pode ser produzido de forma recombinante por expressão em uma célula hospedeira adequada de um vetor compreendendo um polinucleotídeo possuindo uma sequência que codifica o polipeptídeo de pilus. Em pelo menos uma forma de realização, quando o polipeptídeo de pilus é um pilus montado, o pilus montado pode ser produzido de forma recombinante por expressão em uma célula hospedeira adequada de um vetor compreendendo um polinucleotídeo possuindo uma sequência que codifica genes e outras sequências nucleotídicas necessárias para a montagem do conjunto pilus. Além disso, o polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens pode ser pelo menos parcialmente purificado após isolamento ou produção recombinante. Os vetores e células hospedeiras adequados, incluindo, mas não se limitando a, células hospedeiras Dprocarióticas e eucarióticas adaptados para a produção de polipeptídeos recombinantes, e métodos para isolar ou produzir recombinantemente esses polipeptídeos, incluindo métodos de purificação pelo menos parcial de tais polipeptídeos, são bem conhecidos no estado da técnica ou pode ser facilmente identificado e selecionado pelo técnico no assunto, com não mais do que um esforço experimental de rotina.

[0052] Em outro aspecto, o presente pedido fornece uma vacina para o tratamento ou a prevenção de enterite necrótica em aves de capoeira, ou para o tratamento ou a prevenção de infecção por Clostridium perfringens em aves de capoeira, em que a vacina compreende pelo menos um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito. Como usado aqui, o termo “vacina” pretende se referir a uma preparação imunogênica usada para prevenir, tratar ou reduzir os efeitos de infecção por Clostridium perfringens. As formulações de vacina contêm tipicamente uma quantidade imunologicamente eficaz de um agente imunogênico e também podem conter um adjuvante ou podem ser isentos de adjuvantes. No caso da presente vacina, o agente imunogênico pode ser um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito.

[0053] Como usado aqui, o termo “adjuvante” pretende se referir a um agente que é eficaz para melhorar uma resposta imune contra um agente imunogênico de um sujeito vacinado com uma vacina compreendendo o agente imunogênico. Os adjuvantes adequados são bem conhecidos no estado da técnica e incluem, mas não estão limitados a, compostos inorgânicos, incluindo mas não limitados a alúmen, hidróxido de alumínio e outros compostos contendo alumínio; saponinas incluindo mas não limitadas a Quil-A"”; Adjuvantes completos e incompletos de Freund; adjuvantes contendo lipídios ou óleos minerais, incluindo mas não se limitando a emulsões óleo em água; adjuvantes de polissacarídeos; adjuvantes proteicos; imunomoduladores; adjuvantes obtidos a partir de células bacterianas mortas ou atenuadas; e outros adjuvantes adequados conhecidos no estado da técnica.

[0054] As vacinas podem ser formuladas em um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Como usado aqui, o termo “farmaceuticamente aceitável” pretende se referir a entidades e composições moleculares que são fisiologicamente toleráveis e que normalmente não produzem reações indesejáveis quando administradas a um animal ou humano. De preferência, como usado aqui, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia dos EUA ou em outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais ou humanos. Como usado aqui, o termo “veículo” pretende se referir a um diluente, adjuvante, excipiente ou carreador com o qual um composto é administrado. Os veículos adequados são bem conhecidos no estado da técnica e, em pelo menos uma forma de realização, são descritos em “Remington's Pharmaceutical Sciences” por E. W. Martin, 18º Edição, ou outras edições.

[0055] As vacinas podem ser formuladas para administração por qualquer via conveniente conhecida no estado da técnica, incluindo, mas não se limitando a, oral, retal, nasal, transmucosal, transdermica, parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutanea, in ovo Ou por outras vias conhecidas. Em pelo menos uma forma de realização, é contemplado que a vacina possa ser administrada por via oral. Sem estar limitado pela teoria, é contemplado que a vacinação oral possa direcionar diretamente tecidos linfóides associados ao intestino, no local de infecção por cepas de Clostridium perfringens associadas à enterite necrótica. Em pelo menos uma forma de realização, é contemplado que a progênie pode ser imunizada pela vacinação de uma mãe e subsequente transferência da imunidade materna, incluindo, mas não se limitando a anticorpos maternos, à progênie.

[0056] Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito, na preparação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de enterite necrótica em ave de capoeira ou para o tratamento ou a prevenção de infecção por Clostridium perfringens em ave de capoeira. O medicamento pode ser uma vacina, conforme aqui descrito.

[0057] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de enterite necrótica em ave de capoeira ou para o tratamento ou a prevenção de infecção por Clostridium perfringens em ave de capoeira, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo imunogênico ou de uma vacina, conforme aqui descrito, para as aves. A administração pode ser por vias bem conhecidas no estado da técnica, incluindo, mas não se limitando a, via oral, retal, nasal, parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutânea ou por outras vias. Em pelo menos uma forma de realização, a administração pode ser por injeção subcutânea. Em pelo menos uma forma de realização, a administração pode ser oral. Em pelo menos uma forma de realização, a vacina pode ser administrada mais de uma vez às aves de capoeira, para fornecer uma imunização inicial seguida por uma ou mais imunizações de reforço, como entendido no estado da técnica. Em pelo menos uma forma de realização, uma ou mais imunizações iniciais e uma ou mais imunizações de reforço são administradas à ave de capoeira após o desaparecimento de anticorpos maternos na ave de capoeira. Em pelo menos uma dessas formas de realização,

uma ou mais imunizações iniciais e uma ou mais imunizações de reforço são administradas à ave de capoeira não antes de dias após a eclosão.

[0058] Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito, como uma vacina para o tratamento ou a prevenção de enterite necrótica em ave de capoeira ou para o tratamento ou a prevenção de infecção por Clostridium perfringens em ave de capoeira.

[0059] Um outro aspecto da presente invenção fornece um anticorpo que se liga seletivamente a um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito. Em pelo menos uma forma de realização, oO anticorpo é um anticorpo de aves de capoeira. Em pelo menos uma forma de realização, o anticorpo pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única ou um fragmento de anticorpo que retenha a propriedade de ligação seletiva a um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito. O termo “fragmento de anticorpo”, como usado aqui, pretende incluir, mas não se limita a, Fab, Fab', F(ab')», scFv, dsFv, ds-scFv, dímeros, minicorpos, diacorpos e seus multímeros e fragmentos de anticorpos biespecíficos. os anticorpos podem ser fragmentados usando técnicas convencionais. Por exemplo, os fragmentos F(ab'), podem ser gerados tratando o anticorpo com pepsina. O fragmento F(ab'!), resultante, pode ser tratado para reduzir pontes de dissulfeto para produzir fragmentos Fab'. A digestão da papaína pode levar à formação de fragmentos Fab. Fab, Fab' e F(ab')» scEFv, dsFv, ds-scFv, dímeros, minicorpos, diacorpos, fragmentos de anticorpos biespecíficos e outros fragmentos também podem ser sintetizados por técnicas recombinantes.

[0060] os métodos de preparação e caracterização de tais anticorpos e seus fragmentos são bem conhecidos no estado da técnica e podem ser facilmente executados pelo técnico, sem esforço indevido. Por exemplo, antisera policlonais ou anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando métodos padrões. Um mamífero (por exemplo, um camundongo, hamster ou coelho), pássaro (por exemplo, aves de capoeira) ou outro animal pode ser imunizado com uma forma imunogênica do presente polipeptídeo imunogênico que provoca uma resposta de anticorpo no mamífero. As técnicas para conferir imunogenicidade a um peptídeo incluem conjugação com veículos ou outras técnicas bem conhecidas no estado da técnica. Por exemplo, o peptídeo pode ser administrado na presença de adjuvante. O progresso da imunização pode ser monitorado pela detecção de títulos de anticorpos no plasma ou soro. ELISA padrão ou outros procedimentos de imunoensaio podem ser usados com o agente imunogênico como antígeno para avaliar os níveis de anticorpos. Após a imunização, podem ser obtidos antisera e, se desejado, anticorpos policlonais isolados dos soros.

[0061] Para produzir anticorpos monoclonais, as células produtoras de anticorpos (linfócitos) podem ser colhidas de um animal imunizado e fundidas com células de mieloma por procedimentos padrões de fusão de células somáticas, imortalizando essas células e produzindo células de hibridoma. Tais técnicas são bem conhecidas no estado da técnica. As células de hibridoma podem ser rastreadas imunoquimicamente para a produção de anticorpos especificamente reativos com um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito, e os anticorpos monoclonais podem ser isolados. Portanto, a divulgação também contempla células de hibridoma secretando anticorpos monoclonais com especificidade para um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito.

[0062] Anticorpos específicos, ou fragmentos de anticorpo reativos contra um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito, também podem ser gerados pelo teste de seleção de bibliotecas de expressão que codificam genes de imunoglobulina, ou porções dos mesmos, expressas em bactérias com peptídeos produzidos a partir de moléculas de ácido nucleico, conforme aqui descrito. Por exemplo, fragmentos Fab completos, regiões VH e regiões EV podem ser expressos em bactérias usando bibliotecas de expressão em fagos.

[0063] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para detectar a infecção de aves de capoeira por uma cepa de Clostridium perfringens associada a enterite necrótica, em que o método inclui obter uma amostra biológica da ave de capoeira e detectar na amostra biológica a presença de um anticorpo que se liga seletivamente a um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito. Em pelo menos uma forma de realização, a amostra biológica é uma amostra de sangue. Em pelo menos uma forma de realização, a amostra é uma amostra fecal. Em pelo menos uma forma de realização, a detecção inclui a medição da quantidade ou concentração de anticorpo presente na amostra biológica, usando métodos bem conhecidos pelos técnicos no assunto.

[0064] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um método para detectar um polipeptídeo imunogênico, conforme aqui descrito, compreendendo a exposição do polipeptídeo imunogênico a um anticorpo que se liga seletivamente ao polipeptídeo imunogênico e a detecção da ligação do polipeptídeo imunogênico ao anticorpo. Em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo imunogênico pode ser um polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens, conforme aqui descrito. Em pelo menos uma forma de realização, o polipeptídeo imunogênico pode ser um pilus montado ligado à superfície de uma célula bacteriana de Clostridium perfringens. Tais formas de realização do método podem ser úteis para identificar e detectar cepas de Clostridium perfringens que são capazes de produzir enterite necrótica em ave de capoeira.

[0065] Como usado aqui, os termos “cerca de” ou “aproximadamente”, aplicados a um valor numérico ou intervalo de valores, significam que os valores recitados podem variar dentro de um grau aceitável de erro para a quantidade medida, dada a natureza ou precisão das medições, de modo que a variação seja considerada no estado da técnica como equivalente aos valores citados e forneça a mesma função ou resultado. Por exemplo, o grau de erro pode ser indicado pelo número de figuras significativas fornecidas para a medição, como é entendido no estado da técnica, e inclui, mas não está limitado a uma variação de t+ l1 na figura significativa mais precisa relatada para a medição. Graus exemplares de erro típicos estão dentro de porcento (%), preferencialmente dentro de 10% e mais preferencialmente dentro de 5% de um dado valor ou intervalo de valores. De forma alternativa, e particularmente em sistemas biológicos, os termos “cerca de” e “aproximadamente” podem significar valores que estão dentro de uma ordem de grandeza, de preferência dentro de 5 vezes e mais preferencialmente dentro de 2 vezes de um determinado valor. As quantidades numéricas fornecidas neste documento são aproximadas, a menos que indicado de outra forma, o que significa que o termo “cerca de” ou “aproximadamente” pode ser inferido quando não expressamente indicado.

[0066] Conforme usado aqui, o termo “substancialmente” refere-se à extensão ou grau completo ou quase completo de uma ação, característica, propriedade, estado, estrutura, item ou resultado. Por exemplo, duas substâncias que possuem “substancialmente” as mesmas propriedades teriam propriedades completamente idênticas ou teriam propriedades que são quase completamente iguais que as diferenças não são mensuráveis ou significativas. O grau exato de desvio permitido da perfeição absoluta pode, em alguns casos, depender do contexto específico. No entanto, de um modo geral, a proximidade da conclusão será de modo a obter o mesmo resultado geral, como se a conclusão absoluta e total fosse obtida. O uso de “substancialmente” é igualmente aplicável quando usado em uma conotação negativa para se referir à falta completa ou quase completa de uma ação, característica, propriedade, estado, estrutura, item ou resultado.

EXEMPLOS

[0067] Outras características da presente invenção tornar-se-ão evidentes a partir dos seguintes exemplos não limitativos que ilustram, a título de exemplo, os princípios da invenção. Exemplo 1: Produção de polipeptídeos associados a pilus recombinantes purificados a partir de Clostridium perfringens

[0068] As regiões de codificação para as três subunidades de pilus (cnaAh, fimA e fimB) foram otimizadas por códon e truncadas para excluir os peptídeos de sinal N- terminal previstos e os domínios transmembranares LPXTG do sinal de classificação da parede celular do terminal C. O domínio do terminal C é uma região hidrofóbica prevista para ser removida durante a montagem do pilus. As regiões de codificação otimizadas por códon truncadas foram sintetizadas (Integrated DNA Technologies, Coralville, EUA), clonadas no vetor de expressão pET28a (MilliporeSigma, Etobicoke, Ontario, Canadá) por clonagem In-Fusion"", de acordo com as instruções do fabricante (Takara Bio USA, Mountain View, Califórnia, EUA), verificadas por sequência e depois transformadas em células E. coli BL21. As colônias transformadas foram cultivadas a 37 ºC durante 18 h com agitação em caldo LB de 1 L suplementado com 50 pg/ ml de canamicina e 1 mM de IPTG. A cultura foi sedimentada e ressuspensa em 20 ml de tampão de ligação (NaPO, 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 30 mM) e lisada por sonicação por 10 min em gelo (pulsos de 10 s, pausas de s). O lisado celular foi purificado sob condições nativas em uma coluna HisTrap" FF Crude (GE Healthcare, Montreal, Canadá) usando um gradiente de 50 a 500 mM de imidazol em um sistema ÁKTA"" prime plus. As frações de um ml foram coletadas e as frações exibindo um pico de 280 nm foram reunidas e concentradas com os concentradores de proteína Pierce" (corte de peso molecular de 9K) (Fisher Scientific, Unionville, Ontário, Canadá) e dessalinizados usando colunas de dessalinização com corte de peso molecular de Zeba"” Spin 7TK (Fisher Scientific). A quantificação das proteínas purificadas foi realizada usando o kit de ensaio de proteínas BCA (ácido bicinconínico) (Fisher) de acordo com as instruções do fabricante. os polipeptídeos foram visualizados por coloração com SDS-PAGE e Coomassie.

[0069] As sequências truncadas resultaram em altos níveis de expressão de polipeptídeos marcados com histidina (His), como evidenciado pelos géis de SDS-PAGE mostrados nas Figuras 2A (CnaA), 2B (FimA), 2C (FimB) e 2D (frações combinadas de CnaA, FimA e FimB, após concentração e dessalinização). Estes níveis aumentados de expressão podem ser devido ao aumento da solubilidade dos polipeptídeos resultantes.

[0070] A Tabela l mostra as sequências das sequências gênicas de comprimento total, otimizadas por códon e truncadas, juntamente com as sequências dos polipeptídeos da subunidade de comprimento total e os polipeptídeos da subunidade expressa truncada e marcada com His.

Tabela 1: Sequências de genes e polipeptídeos da subunidade de pilus

|ATGABAATAAATAAAAAAATTTTTAGCATGCTAT |ATGATABACAAGAAAAAA |ATGGAAACAAAG ITTATGGTTATTGTACTTTTTACATGCATATCATC |ITAAGTGCATTATTATTA AAAATAAGAAAC IAMATTTTTCTGITTCTGCITCTTICTATTCAMAGA |AGTGGAGCAATGTTTATG TCCTTATG IGGAAGAGATATCAGTAATGAGGTAGTTACAAGCC (AGTATGAATACAAATGTA /ccTATCGTAGCA ITAGTGGCTACTCCAAATAGTATAAATGATGGTGG |ITCGCATCAMATTTACCT |(TTGAGCTTTATA |AMACGTTCAGGTTCGTTTGGAATTTAAAGAAAAT |TCTGGAGGGGTAGAAGGT |TTGCTTCCAAAC |CATCAAAGAAATATACAAAGTGGAGATACTATAA |ACAGAACAGAATCCTGCA AACTAGAGTATAT lCTGTCAAATGGACAAATTCAGGGGAAGTATTTTT (AMAGCAACAATTACAAAG GCTACTGAAAAT GAAGGATATGAAAABAACAATTCCACTTTATATA J|AATTTTGAATTTCCAGAA |ACAGCABATATT IAMAGACCAAAATGTTGGTCAAGCAGTAATAGAGA /GGTATTAATACACCTAGT ccCTTTGATAGTT

IAAACAGGTGCAACACTTACATTTAATGATAAAAT GCAACATTCAAGTTTACA AGACAGGAATTT IAGATAAATTAGATGATGTTGGTGGATGGGCAACA /GCAGAAMAAAATAACTAAT IAATGTATATACG TTACTTTGCAAGGAAGAAACATTACCTCAGGTA /GATGCGCCAGATGCAACA |AAMAGATTCAAAA |IATCATGAACACACAGGAATAGCATATATTATATC |ATTGGAGATATTAATTAT GCAATAGACATG ITGGTTCAAAGCGGGCAGATGTAMATATAACCAAA |ACACAAGGGGATAATGGA AATTGGAAAATAC |CCAGAATCAGGTACAACTAGTGTATTCTATTATA |ACTTTATCABATGGAAAA GAGCTAAAGGCA IAMACAGGTAGTATGTATACCAATGATACAAMATCA |TATAGTGTAAAGAAAACA [ATAAGTGAARAT ITGTCAATTGGTGGTTACTGGTGAATCCAAGCAAG |ACTGAMATTACTTTTGGA ccccetATGCCA IGTATATTCTGAAAAAAACGTTTATATTCAAGATG |AATTTCCCACATGCAGGA GGAAGAAAGTARA [BAATCCAAGGCGGACAAACATTAGAACCTGATTC |GAATATGATTATAATGTA |[AATGGAAGTTTT ITTTTGAAATAGTAGTAACTTGGTATGATGGTTAT [ANAGARACGAATGAGGGA lATCTTTAATATA IGTAGAAAAGTTTAAAGGAAAAGAAGCGATAAGGG [GTAGGTGGTATTACATAT GATGGAAATGAT |AMATTCCATAATAAATATCCAAATTCAAATATATC GATACAAAAGAATACAAA |MAGCAGTTTACT IGGTATCAGAAAATAABAATAACAGTAABACATTTCA IGTTCATGTGTATGTTGCA |ATTCCATTAGCT |CAAGAGGATTCCACACAAMAGTTTATTAATATTT |AATAGTAACGCTATGGAT |TATACACATGGT TTTATAAAACTAAGATTACAAATCCGAAACAAAA /GGAAAAMACTTATGTAAAA GGTGTGTATATC I|AGAATTCGTTAATAATACAAAAGCATGGTTTAAA |GCCATTACATCAGAAAAT |TATCAAATTCAA IGAGTATAATAAGCCAGCTGTAAATGGAGAATCCT [GGAGGTGAAMAAAGCTCCA |cCaGATAACGCAA ITTAACCATAGCGTACAAAATATTAATGCAGATGC AATTGAGTTTGTTAATACA |TCTAMAGATAAT Gene de |rceaGTTAATGGAACTGTAMAAGGCGAATTAAAA |PATAAAAAGGACACTTCT |ITACATATATGAT comprime |ATCATAAAAACATTAAAAGATAAAAGTATTCCAA |TTACTTATAGAAAAGAAT |MARAATAGCTAT nto ITTARAGATGTTCAGTTTAAGATGAGAAGAGTTGA [(GTAATAGGAGATTTAGCT JAAGATAACTGTA ITAATACAGTTATCAAAGATGGTAAAAAAGAATTA GGACTTAACAAAACAGTTT |TATGTAAAAAAT total TACTAACAACTGATGATAAAGGTATTGCAAATG /GAGTTTCAGATTAATTTA GCAGAAAATAAT ITARAAGGTCTTCCTGTAGGAAAATATGAAGTAAA |ANAAMAATCAGCAACATCT |cCaTTTAATACCA

IAGAGATTTCAGCTCCAGAATGGATTGCTTITAAT GACATAACAAMATTCGAA CAMATTATTGTG lCCTCTTATTGCACCAAMAATTGGAATTCACAATAT [GGAMATATTATTAGAAAA TGAAAAT |ICAGATCAGGACACAGAAGGCABATTGTGGGCTGT GATGGTAAAATAGAGCCT |[AATGAAAAATGT ITGAAAATGAATTAAAGACAATTTCAATTCCGGTT [GTAACATATACAGCTGAA GAAGAAATATGT

IGAAAAGGTCTGGGTAGGACAAACTAGTGAACGAG AATACAGAMACTTTITAAA ITTTTATAACATT |CAGAAATCAAGCTTTTTGCAGATGGTATTGAAGT |TTAGCAAATGGAGATAAA |TACAAACAAAAA |AGACAAAGTGATTTTAAATGCAGATAACAATTGG |CTTAAGTTTGAAAGTATT [AATAAAATTAAT IAMACACACATTTGAAAATAAACCTGAATATAATT |CCAGCAGGAACAAAATAT GAGATTTCTAARA |CAGARACAAAACAGAAAATCAATTATTCTGTGTC (GAAGTAAAAGAGATAGGT |ACACCATATAAG |AGAGACAACTATTTCTGGATATGAAAGCAATATC |GCTAGTGATGGATATACA |(CCAAATGGAATA |ACAGGCGATGCTAAGAATGGTTTTATTGTAACCA |lCCTTCTATAACAGTAATT [ANTGTTCCTAAA |IATACAGAACTTCCTGATTTGACTATTGGTAAAGA GGAARAATGGAAATGAGACT lACAGGCGATACC IAGTTATAGGAGAATTGGGTGACAAGACGAAGGTA |TCTAATAATCGTACGGTA |ACAMACATTGGA TTTAACTTTGAGCTTACATTARAGCAAGCAGATG |GCTGAAMAAAGATGGTATA |ITTTATATTGTA IGAARAGCCTATCAATGGTAMATTTAATTACATTGG [ICATCTAAGTCAMATTCT AATACTTATAATT ITAGTGTAGATGACAGGTACAAAAAAGAAAGCATA |AATGATAACTTAATTGGT |(ICACTTGGATTA |AAGCCTTCTGATGGTGAGATTACTTTTATAGAAG (GAAGGTGAAAACAABAGTA |CTTGTGGTATTG IGAAAAGCAACTATAACTTTATCACATGGACAAGA |ACATTTACAMACACATAT |AMATGGAAAGAA IGATTACARTCAAGGATTTACCATATGGGGTTACA (AATGACAAACCTATCACA |(TATAMARAGAGA ITATARAGTTATGGAAAAAGAAGCTAATGAMAATG [GGGTATTGTTATGAATAAT AMAMAAGAATAA GCTATTTAACTACCTATAATGGAAATAACGAAGT IATTCCATTTATTCTAATG| spo 1h Nº: |CACAACAGGTGAATTGAAACAGGATACAARAGTA |ATTAGTTTTGCTGTCCTT 3) |CAGGTAGTTAACAACAAAGAGTTTGTTCCAACAA [GGATTTGGTGCTTTAGCT ICTGGTATATCAACCACAACAGAGCAAGGTACAAT |ATTATAARAAMAGACGTAAA IGGTTGGAATGGTGATTTTTTCTATAGGAATACTT |ACTATAAGATAA IATGGTCATGATTGTAGTTCTTTTACAATTGAATA | (sEQ ID Nº: 2) |AAGGACTGAAAAGATGA (SEQ ID Nº: 1)

|ATGAAGATCAACAAGAAGATCTTCAGCATGTTAT |ATGATTAATAAABAGARA AATGGCTATTGTT

ITTATGGTCATTGTGCTGTTCACCTGTATCAGCTC CCTGTCGGCGCTGCTCTTA GCTTTGTCATTT TAACTTCAGTGTGAGCGCGTCAAGCATCCAGCGC AGCGGGECCATGTTTATG ATCCTGCTCCCG

EGCCGEGACATCAGCAACGAGGTGGTGACATCGC AAGCATGAACACGAATGTG AATACCCEGETC ITCGTAGCTACCCCGAATAGCATCAACGATGGTGG [TTCGCGTCTAACCTCCCA [TATGCGACGGAG 'AACGTCCAAGTGCGTCTGGAATTTAMAGAGAAT [FCGGGTGGTETGGAGGGC AAACACCGCTAAT |CACCAGCGGAACATTCAGTCCGGCGACACGATTA |ACCGAACAAMAACCCAGCG ATCCCGTTAATT CGGTCAAATGGACTAACTCAGGTGAGGTCTTTTT |AMAGCGACAATCACGAAA GTACGCCAAGAA GAAGGCTACGAAAAAACCATCCCGCTGTATATC |AACTTCGAGTTTCCGGAA |TITTAATGTTTAC IAAGGATCAGAACGTTGGCCAGGCGGTTATTGARA /GGTATTAATACACCCAGC AACTAMAGATTCT IRAACCGGTGCAACATTAACATTCAACGATAAGAT [GCGACATTCAMATTTACC AAAGCCATTGAC |CGACAAATTAGATGATGTCGGCEGCTEGECCAÇA IGCCGAAAAAATTACCAAC ATGATCGGAARAA TCACGCTCCAGGGTCGCAATATTACTTCAGGAA [GATGCGCCGGATGCTACT [TATGAATTARAA

IATCATGAGCATACTGGTATTGCGTACATTATCTC AATTGGCGACATCAATTAT GCCATTTCTGAG GGGTAGCAAMACGTGCGGACGTTAACATCACAAAA |ACCCAAGGTGATAATGGG AACGCTCCCATG ICCTGAATCCGGAACAACGTCTGTGTTTTACTACA |ACGTTAAGCAATGGCARA |CCGGAGGAATCA IAGACGGGTTCGATGTACACCAATGACACARATCA |TACAGTGTGAAAAAGACT [ANAAATGGTAGC |PETGAATTGGTGGCTGCTGETTAACCCGAGCAAA IACCGAGATTACCTTCGGG [PTTATTTTTAAC IGTATACTCTGAGAAAAATGTCTATATTCAGGATG |AACTTCCCGCATGCTGGT |ATCGACGGTAAT |AAMATTCAARGGCGGTCAGACCCTGGAGCCGGACAG GAGTATGATTATAACGTC |JGCATAAMACAGTTT TTTTGAAATCGTCGTTACATGGTACGATGGTTAT |AMAGARACCAATGAAGGC ACTATTCCGCTG

GTGGAAAAATTTAAAGGTAAAGAAGCGATCCGGG GTEGEGTEGGCATTACTTAC GCGTACACTCAC |IAGTTCCACAATAAATATCCGAATAGTAATATCTC /GATACGAAAGAATATARA GGTGGCETCTAC IGGTCAGTGAAAATAABAATCACGGTAABATATTTCG GTTCATGTGTATGTGGCC |ATCTATCAAATC |CAAGAAGATTCCACCCAAAAATICATTAACATCT IAACTCAAATGCGATGGAC CAGCAAMATTACC TTTACAAGACTAAAATCACCAACCCGAAGCAGAA |GGTAAGACATATGTTAAA CAGAGCAAGGAT |AGAATTTGTAAACAACACCAAAGCCTGGTTCAAA |GCGATTACTAGCGAAAAT |AACTACATCTAC lGAGTACAATAAGCCGGCGGTTAACGGTGAMAGTT [GGCGGGGAAAMAGCACCG [GATAMAAACAGC |PTAATCACAGTGTGCAGAATATCAACGCAGATGC IATCGAATTCGTTAACACC [TATAMAATCACG Gene — cCGGGGTAMATGGTACTGTTAAAGGTGAATTGAAA |TATARAAAAGATACGTCG GTATATGICAAG otimizad |ATTATCAAAACCCTGAAAGATAAAAGTATTCCGA |TTACTGATTGAAAAAAAT |AACGCAGAAAAC o or |ITCAAGGATGTGCAGTTTAAGATGCGCCGCGTGGA /GTAATTGGCGATCTGGCA J[AATCATCTGATC » ITAATACCGTTATTARAGACGGCAAGAAAGAGCTG GACCTCACCAAACAGTTT CCGCAGATTATT códon |CTGTTGACCACAGATGATAAAGGGATTGCAAACG |GAGTTTCAAATCAACTTG GTAAAAAATGAG |TGARAGGTCTGCCAGTCGGGAAATACGAAGTCAA |AMAAAGAGCGCGACTAGT ACAATGAAAAA IAGARATCAGTGCGCCTGAGTGGATCGCCTICAAT [GATATTACCAAGTTTGAA [IGTGAAGAMATC CCACTGATTGCGCCCAAACTTGAATTTACGATCA GGTAACATTATTCGCAAA [PGCTTCTACAAT IGCGATCAAGACACAGAGGGGAAATTATGGGCAGT [(GACGGTAAGATTGAACCC |ATCTACAAACAG |GGARAACGAACTCABAACCATCTCGATTCCGGTC [GTGACCTATACCGCGGAA AAAAACAAGATC |GAARAAGTCTGGGTAGGTCAGACGAGTGAACGEGG AATACCGAGACCTTTAAG AATGAGATCTCT |CGGAGATCAAACTGTTTGCGGATGGAATTGAAGT |TTAGCCAACGGAGACAAG AMAACCCCCTAT |ITGATAAGGTGATCCTGAACGCGGATAATAATTGG [TTAMAATTCGAGTCCATC AAGCCGAATGGT IRAGCACACCTTTGAGAATAMACCCGAATATAACT |CCCGCCGGTACAAAATAT AATTAATGTCCCG |CCGAGACTAMACAAAAAATCAACTATAGTGTGAG GAAGTCAAGGAAATCGGG CGGGTGAT |CGAAACTACCATCAGTGGCTATGAATCAAATATT [GGCGAGCGATGGGTACACG |ACCACGAACATC IACTGGCGATGCGAAARACGGATTTATTGTCACCA (CCCTCAATCACCGTTATC /EGATTCTACATT |IACACAGARCTGCCTGATTTGACGATCGGGAAMAGA (GARAATGGCAACGAAACC (ETGATCTTGATT IGGTAATCGGCGAACTCGGCGATAAAACCAAGGTA [TCAAATAACCGCACTGTA ATTTCCCTGGEC TTCAACTTTGAACTGACACTTAAGCAGGCTGACG (GCCGAMAAAGATGGAATC CTECTEGTEGTC IGAAAGCCCATTAACGGGAMATTTAACTATATTGG ITCTAGCAMAAGCAACTCG |TTGAAGTGGAAA |TTCGGTGGATGATCGTTATAAGAAGGAATCGATT IARCGACAATTTAATCGGC GAATATAAMARAA |AAGCCTAGCGATGGGGAAATTACGTTCATCGAGG /GAAGGCGAARAATAAAGTG (CGTAAGAAGGAA GAAAAGCAACGATTACCCTCTCCCACGGACAAGA IACCTTTACCAATACGTAC| sro ID Nº: IGATCACCATTAAGGACCTTCCGTATGGTGTGACC AMACGATAAMACCAATCACGE 6

ITATARAGTCATGGAAAAAGAAGCCAACGAGAATG IGGAATCGTAATGAATAAT

IGATATTTAACCACTTACAACGGAAATAACGAAGT IATTCCGTTCATTCTTATG |cCACCACCGGGGAGTTGAAACAGGATACGAAAGTA |ATTAGCTTTGCCGTTCTT |CAAGTGGTTAATAATAAAGAATTCGTCCCGACAA [GGCTTCEGTECATTAGCE CCGGGATCAGCACCACCACCGAACAGGGAACCAT lATCATTAAACGCCGCAAA |GGTCGGGATGGTGATCTTTAGCATCGGTATTCTC |ACCATCCGCCCCATCGAT IATGGTAATGATTGTCGTTCTGCTGCAGCTGAATA [ACGCGT IMAGGACTGAAACGC (SEQ ID Nº: 4) (SEQ ID Nº: 5)

CAAGCATCCAGCGCGGCCGGGACATCAGCAACG |ITCTAACCTCCCATCGGGT JACGGAGAACACC |IAGGTGGTGACATCGCTCGTAGCTACCCCGAATAG GGTGTGGAGGGCACCGAA GCTAATATCCCG |CATCAACGATGGTGGTAACGTCCAAGTGCGTCTG (CARAACCCAGCGAAAGCG |TTAATTGTACGC IGAATTTABAGAGAATCACCAGCGGAACATTCAGT |ACAATCACGAAMAAACTTC CAAGAATTTAAT |ICCGGCGACACGATTACGGTCAAATGGACTAACTC |GAGTTTCCGGAAGGTATT IGTTTACACTARA |AGGTGAGGTCTTTTTTGAAGGCTACGAAAAAACC |AATACACCCAGCGCGACA GATTCTAAAGCC |IATCCCGCTGTATATCAAGGATCAGAACGTTGGCC |TTCAAATTTACCGCCGAA ATTGACATGATC |IAGGCGGTTATTGAAAAAACCGGTGCAACATTAAC |AMAATTACCAACGATGCG GGARAATATGAA |ATTCAACGATAAGATCGACAAATTAGATGATGTC (CCGGATGCTACTATTGGC |ITABAAGCCATT IGGCGGCTEGGECCACATTCACGCTCCAGGGTCGCA [GACATCAATTATACCCAA |TCTGAGAACECT |IATATTACTTCAGGAARATCATGAGCATACTGGTAT (GGTGATAATGGGACGTTA CCCATGCCEGAÇG |ITGCGTACATTATCTCGGGTAGCAAACGTGCGGAC |AGCAATGGCAAATACAGT /(GAARTCABAAAAT |IGTTAACATCACAAAACCTGAATCCGGAACAACGT |GTGAAAAAGACTACCGAG /GGTAGCTTTATT |CTGTGTTTTACTACAAGACGGGTTCGATGTACAC |ATTACCTTCGGGAACTTC |TTTAACATCGAC |ICAATGACACAAATCATGTGAATTGGTGGCTGCTGE |CCGCATGCTGGTGAGTAT GGTAATGATARA |IETTAACCCGAGCAAAGTATACTCTGAGAAAAATG GATTATAACGTCAAAGAA CAGTTTACTATT |ITCTATATTCAGGATGAAATTCAAGGCGGTCAGAC |ACCAATGAAGGCGTGGGT CCECTEGCGTAC |CCTGGAGCCGGACAGTTTTGAAATCGTCGTTACA |GGCATTACTTACGATACG IAACTCACGETGEGC TGGTACGATGGTTATGTGGAAAAATTTAAAGGTA |MAAGAATATAAAGTTCAT IGTCTACATCTAT |AAGAAGCGATCCGGGAGTTCCACAATAAATATCC (GTGTATGTGGCCAACTCA (CARATCCAGCAA IGAATAGTAATATCTCGGTCAGTGAAAATARBAATC |AATGCGATGGACGGTAAG |ATTACCCAGAGC |IACGGTAAATATTTCGCAAGAAGATTCCACCCAAA |ACATATGTTAAAGCGATT PAAGGATAACTAC |AATTCATTAACATCTTTTACAAGACTAAAATCAC |ACTAGCGAAAATGGCGGG |ATCTACGATAAA |CAACCCGAAGCAGAAAGAATTTGTABACAACACC |GARAAAGCACCGATCGAA JAACAGCTATARA |IARAGCCTGGTTCAAAGAGTACAATAAGCCGGCGG [TTCGTTAACACCTATARMA ATCACGGTATAT TTAACGGTGAAAGTTTTAATCACAGTGTGCAGAA |MAAMAGATACGTCGTTACTG IGTCAAGAACGCA |ITATCAACGCAGATGCCGGGGTAABATGGTACTGTT |ATTGARAAAAATGTAATT GGARAACAATCAT Gene |IAAMAGGTGAATTGAAAATTATCABAACCCTGAAAG GGCGATCTGGCAGACCTC CTEATCCCGCAG truncado ATAMAAGTATTCCGATCAAGGATGTGCAGTTTAA |ACCAAACAGTTTGAGTTT IATTATTGTAAAA IGATGCGCCGCGTGGATAATACCGTTATTABAGAC |(CARATCAACTTGAAAAAG AATGAGAACAAT |IGGCAAGAABAGAGCTGCTGTTGACCACAGATGATA |AGCGCGACTAGTGATATT GGARAAATGTGAA |IAAGGGATTGCAMACGTGABAGGTCTGCCAGTCGG ACCAAGTTTGAAGGTAAC GARATCTGCTTC IGAAATACGAAGTCABAGABATCAGTGCGCCTGAG |ATTATTCGCAAMAGACGGT |TACAATATCTAC GGATCGCCTTCAATCCACTGATTGCGCCCAAAC |AAGATTGAACCCGTGACC JAMACAGAAAAAC |ITTGAATTTACGATCAGCGATCAAGACACAGAGGG |TATACCGCGGAAAATACC JAAGATCAATGAG IGAAATTATGGGCAGTGGARAACGAACTCARBAACC |GAGACCTTTAAGTTAGCC |ATCTCTAAAACC |IATCTCGATTCCGGTCGAAAAAGTCTGGGTAGETC CGGAGACAAGTTAAAA CCCTATAAGCCG |AGACGAGTGAACGGGCGGAGATCAAACTGTTTGC |TITCGAGTCCATCCCCGCC AATGGTATTAAT IGSGATGGAARTTGAAGTTGATAAGGTGATCCTGAAC |GGTACAMAATATGAAGTC GTCCCGAAAACG IGCGGATAATAATTGGAAGCACACCTTTGAGAATA GGAAATCGGGGCGAGC (sEQ ID Nº: |IAACCCGAATATAACTCCGAGACTAAACAAAAAAT GATGGGTACACGCCCTCA |CAACTATAGTGTGAGCGABACTACCATCAGTGGC |ATCACCGTTATCGAAAAT 2) ITATGAATCAAATATTACTGGCGATGCGAAAAACG |GGCAACGAAACCTCAAAT

IGATTTATTGTCACCAACACAGAACTGCCTGATTT CCGCACTGTAGCCGAA IGACGATCGGGAARAGAGGTAATCGGCGAACTCGGC |MAAAGATGGAATCTCTAGC IGATABAACCAAGGTATTCAACTTTGAACTGACAC |ARAAGCAACTCGAACGAC

KINKKIFSMLEMVIVLFTCISSNFSVSASSIOR MINKKKLSALLLSGAMFM METKKIRNKILM IGRDI SNEVVTSLVATPNSINDGGNVOVRLEFKEN [SMNTNVFASNLPSGGVEG |AIVALSFILLPN |[HORNIOSGDTITVKWINSGEVFFEGYEKTIPLYI |TEQNPAKATITKNFEFPE |TRVYATENTANI IKDONVGOAVIEKTGATLTFNDKIDKLDDVGGWAT [GINTPSATFKFTAEKITN [PLIVROEFNVYT |FTLOGRNITSGNHEHTGIAYIISGSKRADVNITK [DAPDATIGDINYTOGDNG |IKDSKAIDMIGKY PESGTTSVFYYKTGSMYTNDTNHVNWWLLVNPSK |TLSNGKYSVKKTTEITFG |[ELKAISENAPMP YSEKNVY IQDEIQGGOTLEPDSFEIVVTWYDGY NNFPHAGEYDYNVKETNEG |EESKNGSFIFNI

KFKGKEAIREFHNKYPNSNISVSENKITVNIS MGGITYDTKEYKVHVYVA DGNDKQFTIPLA Polipept JEDSTOKFINIFYKTKITNPKQOKEFVNNTKAWFK NSNAMDGKTYVKAITSEN [YTHGGVYIYQIO ídeo de |EYNKPAVNGESFNHSVONINADAGVNGTVKGELK [(GGEKAPIEFVNTYKKDTS |OITOSKDNYIYD comprime ||IKTLKDKSIPIKDVOFKMRRVDNTVIKDGKKEL [.LIEKNVIGDLADLTKOF KNSYKITVYVKN

ILLTTDDKGIANVKGLPVGKYEVKEISAPENWIAFN EFOINLKKSATSDITKFE AENNHLIPOIIV nto PLIAPKLEFTISDQDTEGKLWAVENELKTISIPV |GNITRKDGKIEPVTYTAE |KNENNEKCEEIC total [EKVWGQOTSERAEIKLFADGIEVDKVILNADNNW NTETFKLANGDKLKFESI |FYNIYKQOKNKIN IKHTFENKPEYNSETKOKINYSVSETTISGYESNI |PAGTKYEVKEIGASDGYT EEISKTPYKPNGI TGDAKNGF IVTNTELPDLTIGKEVIGELGDKTKV |[PSITVIENGNETSNNRTV NVPKTGDTTNIG IFNFELTLKQADGKPINGKFNY IGSVDDRYKKESI |AEKDGISSKSNSNDNLIG |FYIVILIISLGL IKPSDGEITFIEGKATITLSHGOEITIKDLPYGVT EGENKVIFTNTYNDKPIT [LVVLKWKEYKKR |IYKVMEKEANENGY LTTYNGNNEVTTGELKQDTKV |GIVMNNIPFILMISFAVL |KKE |OVVNNKEFVPTTGISTTTEQGTMVGMVIFSIGIL |GFGALAIIKRRKTIR (SEQ ID Nº: |MVMIVVLLOLNKGLKR (SEQ ID Nº: 10) | (sEQ ID Nº: 11) 12)

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQOQMGRGS MGSSHHHHHHSSGLVPRG MGSSHHHHHHSS [EFSSTIQORGRDISNEVVTSLVATPNSINDGGNVQV |SHMASMTGGQQMGRGSEF GLVPRGSHMASM IRLEFKENHORNIOSGDTITVKWINSGEVFFEGYE |SNLPSGGVEGTEQNPAKA [TGGOQMGRGSEF IKTIPLYIKDONVGOAVIEKTGATLTFNDKIDKLD |TITKNFEFPEGINTPSAT |TENTANIPLIVR |IDVGGWATFTLOGRNITSGNHEHTGIAYIISGSKR |FKFTAEKITNDAPDATIG (QEFNVYTKDSKA IADVNITKPESGTTSVFYYKTGSMYTNDTNHEVNWW |DINYTOGDNGTLSNGKYS |[IDMIGKYELKAI |LLVNPSKVY SEKNVY IQDEIOGGQOTLEPDSFEIV MVKKTTEITFGNFPHAGEY |SENAPMPEESKN |VTWYDGYVEKFKGKEAIREFHNKYPNSNISVSEN |DYNVKETNEGVGGITYDT |ESFIFNIDGNDK Polipept IKITVNISQEDSTOKFINIFYKTKITNPKQKEFVN |KEYKVHVYVANSNAMDGK (QFTIPLAYTHGG £ d INTKAWFKEYNKPAVNGESFNHSVONINADAGVNG |TYVKAITSENGGEKAPIE VYIYQIQQITOS +1deo |TVKGELKIIKTLKDKSIPIKDVQFKMRRVDNTVI |FVNTYKKDTSLLIEKNVI KDNYIYDKNSYK truncado KDGKKELLLTTDDKGIANVKGLPVGKYEVKEISA /GDLADLTKQFEFOINLKK |ITVYVKNAENNH expresso |PENIAFNPLIAPKLEFTISDODTEGKLWAVENEL [SATSDITKFEGNIIRKDG LIPOIIVKNENN

IKTISIPVEKVWVGOTSERAEIKLFADGIEVDKVI KIEPVTYTAENTETFKLA EKCEEICFYNIY |LNADNNWKHTFENKPEYNSETKQKINYSVSETTI NGDKLKFESIPAGTKYEV KOKNKINEISKT |ISGYESNITGDAKNGFIVTNTELPDLTIGKEVIGE KEIGASDGYTPSITVIEN |PYKPNGINVPKT ILGDKTKVFNFELTLKQADGKPINGKFNYIGSVDD [GNETSNNRTVAEKDGISS VDKLAAALEHHH IRYKKESIKPSDGEITFIEGKATITLSHGQEITIK KSNSNDNLIGEGENKVTF [HHH DLPYGVTYKVMEKEANENGYLTTYNGNNEVTTGE |[INTYNDKPITVDKLAMAL| (spo ID Nº: LKQDTKVOVVNNKEFVPTTVDKLAAALEHHHHHH |EHHHHHH 15) : (SEQ ID Nº: 13) (SEQ ID Nº: 14) Exemplo 2: Preparação de mutantes nulos da subunidade de pilus da cepa CPl de Clostridium perfringens

[0071] Os três genes da subunidade de pilus (cnaA, fimA e fimB) foram inativados por inserção na cepa CPl virulenta de Clostridium perfringens pela mutagênese ClosTron (Heap, J.T., et al, Methods Mol. Biol. (2010), 646: 165-182), essencialmente como descrito anteriormente (Yu, Q., Lepp, D., Mehndizadeh Gohari, I., Wu, T., Zhou, H., Yin, X., Yu, H., Prescott, J.F., Nie, S.P., Xie, M.Y., Gong, J., 2017. The Agr-like quorum sensing system is required for necrotic enteritis pathogenesis in poultry caused by Clostridium perfringens.

Infection and Immunity 85(6): e00975-16), para gerar mutantes nulos de CPl para cada um dos genes da subunidade de pilus (CPlAhcnal, CP1lAfima e CPIAfimB) . Resumidamente, as regiões de direcionamento de íntron ClosTron foram projetadas para inserir nas seguintes posições genéticas usando o algoritmo Perutka implementado em www.clostron.com: par de bases (bp) 183 da cadeia de sentido cnaA, bp 231 da cadeia de sentido fimA e pb 273 da cadeia de sentido fimB.

As regiões alvo do íntron foram sintetizadas e clonadas no plasmídeo ClosTron PMTLOO7C-E2 pelo DNA 2.0 (Menlo Park, CA, EUA) . os plasmídeos resultantes foram eletroporados separadamente no CPl, como descrito anteriormente com pequenas modificações (Jirásková A, Vítek L, Fevery J, Ruml T, Branny P. 2005. Rapid protocol for electroporation of Clostridium perfringens.

J Microbiol Methods 62:125-127). Por um lado, após o crescimento a 37 ºC anaerobicamente durante a noite em 5 ml de caldo TGY (triptona a 3%, glicose a 2%, extrato de levedura a 1%), o CPl foi subcultivado em 50 ml de TGY e cultivado até a fase exponencial (densidade óptica a 600 nm [OD 600], 0,8). As células foram colhidas por centrifugação a 6.000 gq por 10 min a 20 ºC e lavadas uma vez em 10 ml de tampão de eletroporação de sacarose (SEB) (272 mM de sacarose, 1 mM de MgCl2, 5 mM de Na2HPO4, pH 7,4) e depois ressuspensas em 5 ml de SEB.

Alíquotas (0,2 ml) foram misturadas com 2 upug de DNA plasmídico concentrado em cubetas pré-resfriadas (intervalo de 0,2 cm) e o DNA plasmídico foi introduzido nas células por eletroporação (1.000 V, 25F) usando um aparelho Bio-Rad GenePulser Xcell (Bio- Rad, Hercules, CA, EUA). Imediatamente após a transformação, a mistura foi transferida para 1 ml de caldo TGY e incubada anaerobicamente a 37 ºC por 3 h, seguida de plaqueamento em ágar TGY contendo 15 ug/ ml de tiamfenicol anaerobicamente a 37 ºC durante a noite para selecionar transformantes. As colônias resultantes foram subcultivadas em ágar TGY contendo 10 pg/ ml de eritromicina para seleção de integrantes e depois passadas por 10 dias consecutivos para curar o vetor de transporte. Os clones resistentes à eritromicina, mas sensíveis ao tiamfenicol, foram escolhidos para análise posterior. Exemplo 3: Ensaios em animais

[0072] Dois ensaios de vacinação foram realizados para avaliar a capacidade das três subunidades de pilus recombinantes marcadas com His purificadas para proteger contra enterite necrótica (NE) em um modelo de desafio de galinha. As galinhas comerciais White Plymouth Rock, com um dia de idade, foram divididas aleatoriamente em grupos experimentais (n = 15-17) e alojadas em salas separadas dentro de uma unidade de isolamento. Um resumo dos desenhos dos ensaios é mostrado na Tabela 2. Além disso, os mutantes CPIlAfimA e CPIlAfimB foram avaliados quanto à virulência no mesmo modelo. Tabela 2: Resumo dos desenhos dos ensaios de vacinação Dias Dias ; Antígenos Dias de Local ae de : Dia da Ensaio x da colet | desafi | eutanási testados vacinação 2 injeção| a de o do a soro CP1l 8, 1 CnaA, FimA 8, 20 i.m. 20, |28, 29 31 31 CnaA, FimB, 7, 2 CnaA+FimA+F|7, 14, 19 s.c. 19, 26, 27 29 imB 29 Ensaio 1:

[0073] O primeiro ensaio incluiu três grupos de 18 aves vacinadas com controle somente adjuvante, CnaÃ ou FimA. Cada ave foi injetada por via intramuscular (im) no músculo peitoral com 200 pl de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo adjuvante Quil-A ** (50 ug) e polipeptídeo de pilus recombinante (50 ug) nos dias 8 e 20, e as aves foram sacrificadas no dia 31.

[0074] O soro foi coletado de cinco aves de cada grupo nos dias 8 (antes da imunização) e nos dias 20 e 31 (após a imunização). Os títulos de IgY sérica contra Cnaa e FimA foram determinados por ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima). Os polipeptídeos de pilus recombinantes de C. perfringens foram diluídos para 10 pg/ ml em tampão de revestimento de carbonato/ bicarbonato 50 mM a pH 9,6 e foram adicionados 100 ul a cada poço de uma placa MaxiSorp" Immuno de 96 poços (Fisher Scientific). Os poços foram revestidos por 1 h a 37 ºC, seguidos de um dia para o outro a 4 ºC, lavados três vezes com tampão de lavagem (PBS contendo 0,05% de Tween 20) e depois bloqueados em tampão de lavagem contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA) (Sigma) durante 2 h a 37 ºC. Diluições em série de duas vezes de cada amostra de soro diluída em tampão de lavagem contendo BSA a 1% (1/64 a 1/ 65.536) foram incubadas em poços separados por 2 h a 37 ºC e depois lavadas três vezes em tampão de lavagem. Os poços foram incubados com anticorpo policlonal conjugado com peroxidase de rábano (HRP) IgY anti-galinha de cabra, diluído 1: 5.000 em tampão de lavagem por l1 h em temperatura ambiente e depois lavado três vezes em tampão de lavagem. Solução de substrato (0,2 mg/ ml de ácido 2,2'-azino-bis (ácido 3- etilbenzotiazolina-6-sulfônico (ABTS) (Sigma) em tampão ABX 1X (Sigma)) foi adicionada a cada poço e incubada por 30 min à temperatura ambiente. Depois que a reação foi interrompida com dodecilsulfato de sódio a 0,5% (SDS), a absorvância foi medida em um leitor de placas BioTek"" a 405 nm. Os títulos foram calculados como o valor log, da menor diluição sérica com uma absorvância superior a duas vezes a dos poços de fundo, nos quais foi utilizado PBS contendo 1% de BSA no lugar do soro. As diferenças estatísticas entre os títulos pré-imune e pós-imune para cada antígeno entre os diferentes grupos de vacinação foram determinadas por ANOVA de uma via, seguida pelo teste post-hoc de Tukey.

[0075] Os resultados são mostrados nas Figuras 3A e B, respectivamente. A resposta sérica média contra CnaA no grupo imunizado com CnaA foi significativamente maior no d3l em comparação com as aves pré-imunes (d8), no entanto, o aumento geral foi pequeno. No grupo imunizado com FimA, a resposta média contra FimA não aumentou significativamente após a imunização. No entanto, duas das aves exibiram um título alto em d31.

[0076] As aves foram alimentadas com uma ração inicial isenta de antibióticos contendo 20% de proteína até a indução experimental de enterite necrótica (NE). No dia 27, as aves foram submetidas a jejum por 24 horas e depois foram transferidas para uma ração de peru sem antibióticos (28% de proteína) contendo cultura de C. perfringens CPl nos dias 28 e 29 antes da eutanásia no dia 31. A ração infectada foi preparada diariamente, de manhã e à tarde, misturando-se com a cultura de C. perfringens CPl cultivada em meio tioglicolato fluido (FTG) (Difco), a 37 ºC por 15 h ou 24 h, respectivamente, na proporção de 2: 1 (v/ m). Após a eutanásia, o intestino delgado (duodeno para íleo) da ave foi examinado grosseiramente em busca de lesões de enterite necrótica e pontuado às cegas de 1 a 6 usando o sistema descrito por Keyburn et al. (Keyburn AL, Boyce JD, Vaz P, Bannam TL, Ford ME, Parker D, Di Rubbo A, Rood JI, Moore RJ. 2008. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLOS Pathog. 4:e26), como segue: 0, sem lesões grosseiras; 1, paredes finas ou friáveis; 2, necrose focal ou ulceração (1 a 5 focos); 3, necrose focal ou ulceração (6 a 15 focos); 4, necrose focal ou ulceração (16 ou mais focos); 5, manchas de necrose de 2 a 3 cm de comprimento; 6, necrose difusa, típica dos casos de campo.

[0077] As diferenças estatísticas entre as pontuações de enterite necrótica (NE) entre os grupos foram determinadas pela ANOVA de uma via (análise de variância seguida pelo teste post-hoc de Tukey. Os resultados, mostrados na Figura 4, indicam que todos os grupos tiveram pontuações médias igualmente altas de lesões. As pontuações médias de enterite necrótica para os grupos controle, somente adjuvante, imunizados com CnaA e imunizados com FimA foram de 3,1, 3,0 e 3,3, respectivamente.

[0078] Sem estar limitado pela teoria, está contemplado que a imunização no dia 8 pode ter sido sujeita a interferências de anticorpos maternos e pode não ter havido tempo para a imunização no dia 20 induzir resposta imunológica suficiente antes do desafio com C. perfringens CPl. Portanto, foi realizado um segundo ensaio de vacinação incluindo uma imunização adicional antes do desafio com C. perfringens CPl.

Ensaio 2:

[0079] O segundo ensaio consistiu em quatro grupos de 18 aves vacinadas por via subcutânea (s.c.) com controle somente adjuvante, CnaA, FimB ou uma combinação de CnaA, FimA e FimB. Neste ensaio, cada ave foi imunizada por via subcutânea com 50 pg de polipeptídeo recombinante combinado com 50 pg de adjuvante Quil-A” nos dias 7, l4 e 19, e o soro foi coletado nos dias 7, 19 e 29 para medição dos títulos de anticorpos. As aves foram desafiadas na alimentação com a cepa CPl de Clostridium perfringens nos dias 26 e 27, conforme descrito para o ensaio 1, e no dia 29, as aves foram sacrificadas e as lesões intestinais foram pontuadas.

[0080] Uma resposta significativa (p < 0,001) ao anticorpo sérico (IgY) foi observada nos dias 19 e 29 em todos os grupos imunizados em comparação aos controles pré- imunes (com exceção do grupo imunizado com FimB no dia 19), e a magnitude da resposta também foi muito maior do que no ensaio 1. Os resultados são mostrados nas Figuras 5A (resposta sérica anti-CnaA), 5B (resposta sérica anti-FimA) e 5C (resposta sérica anti-FimB) .

[0081] Além disso, como visto na Figura 6, os grupos imunizados com CnaA e FimB apresentaram pontuações de enterite necrótica significativamente mais baixas (2 e 2,06, respectivamente) em comparação ao controle adjuvante (3,75), quando medidos e pontuados como no Ensaio 1, indicando que esses antígenos ofereciam pelo menos proteção parcial contra enterite necrótica. Para o antígeno FimB, o número de aves com doença grave (índice de enterite necrótica > 2) foi de 33,3% em comparação com 93,7% no controle. A imunização com as subunidades combinadas não pareceu reduzir a gravidade da doença (pontuação média na enterite necrótica = 3,7), apesar de provocar uma forte resposta sérica contra todas as três subunidades, como visto nas Figuras 5A-C.

Desafio de galinhas com mutantes nulos da subunidade de pilus da cepa CP1 de Clostridium perfringens

[0082] Três grupos de 18 aves no Ensaio 2 que não haviam sido imunizados foram desafiados na alimentação duas vezes ao dia nos dias 26 e 27 com CPl, CPIAfimA ou CPlAfimB preparado como descrito no Exemplo 2. No dia 29, as aves foram sacrificadas e lesões de enterite necrótica foram pontuadas como descrito no Exemplo 3. Como visto nos resultados apresentados na Figura 7, nem a cepa mutante CPIlAfimA nem CPlIlAfimB causou doença nas aves desafiadas, indicando que um pilus funcional parece ser necessário para patogênese da enterite necrótica.

Exemplo 4: Caracterização de polipeptídeos de superfície de pilus de Clostridium perfringens Mutantes das subunidades das cepas CP1 e CP1 pilus de Clostridium perfringens:

[0083] Os polipeptídeos de superfície foram extraídos da cepa CPl de Clostridium perfringens e os mutantes da subunidade de pilus CPlAcnaA, CPIAfimA e CPlAfimB descritos no Exemplo 3, usando o método de Chang, C., Huang, I.-H., Hendrickx, A.P.A., Ton-That, H. 2013. Visualization of Gram-positive Bacterial Pili, In: Delcour, H.A. (Ed.) Bacterial Cell Surfaces: Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ, 77-95. As cepas foram cultivadas durante a noite em meio TGY (3% de triptona, 2% de glicose, 1% de extrato de levedura) anaerobicamente a 37 “ºC, subcultivadas 1: 100 em 10 ml de meio TGY e crescidas até um ODeoo - 1. As células foram agregadas por centrifugação a

6.000 x g por 5 min e lavado uma vez em tampão SMM, pH 6,8 (sacarose 0,5 M, MgCl; 10 mM, maleato 10 mM). O agregado bacteriano foi ressuspenso em 1 ml de tampão SMM, ao qual foram adicionados 60 pl de 5U/ ul de mutanolisina (Sigma) em tampão muramidase (ácido acético 2 mM, acetato de sódio 48 mM) e 10 pl de fluoreto de fenilmetilsulfonil 0,1 M

(PMSF) (Sigma). Após pelo menos 4 h de incubação a 37 ºC com rotação constante, os protoplastos foram agregados por centrifugação a 20.000 x 9g por 5 min e a fração sobrenadante contendo proteínas da parede celular foi removida. As proteínas foram precipitadas por adição de 81 pl de ácido tricloroacético a 100% (p/ v) (TCA) (Sigma) por ml e incubação a 4 ºC durante a noite. Após centrifugação a

20.000 x g a 4 ºC por 20 min, o agregado de proteínas foi lavado com acetona e ressuspenso lentamente em 50 ul de tampão de carregamento de amostras (Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,8, SDS a 2%, 20% de glicerol, 4% de B -mercaptoetanol, uréia 3M, azul de bromofenol a 0,01%) à temperatura ambiente por pelo menos 15 min.

[0084] Extratos proteicos de superfície (5 ul) foram carregados em géis Novex" NuPAGE"” 3 a 8% de Tris- acetato (Fisher Scientific) e submetidos a eletroforese a 150V por 1 h. Os géis foram corados com a mancha Bio-Safe"" de Coomassie (BioRad) ou foram transferidos para uma membrana de difluoreto de polivinileno (PVDF) a 350V por lh em tampão de transferência 1X (48 mM de Tris, 39 mM de glicina, 20% de metanol, 0,1% de SDS). A detecção quimioluminescente foi realizada com o kit quimioluminescente WesternBreeze" (Life Technologies), de acordo com as instruções do fabricante, usando soro de galinha anti-FimA (1: 200) como anticorpo primário e um anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina IgY (AP) anti-galinha de cabra (1: 2.000). O soro usado como Ab primário foi obtido no sacrifício de uma galinha imunizada com FimA do Ensaio 1 (Exemplo 3) que exibiu subsequentemente um alto título anti-FimA ou anticorpos policlonais criados em coelhos contra os polipeptídeos de pilus recombinantes descritos no Exemplo 1. Os resultados são mostrados nas Figuras 8A-C.

[0085] Sabe-se que a análise de Western blot de pili dependente de sortase de SDS-PAGE pode produzir um padrão do tipo escada de alto peso molecular (HMW) refletindo diferentes comprimentos de polímero, refletindo o mecanismo pelo qual o pilus é montado na superfície da célula. As subunidades da pilina são ligadas covalentemente pelas enzimas domésticas e da sortase específica da pilina, resultando em uma crescente estrutura heteropolimérica, que é eventualmente ligada covalentemente ao peptidoglicano da parede celular. A terminação da montagem e, portanto, o comprimento do polímero, é variável, dando origem a um padrão característico de escada de alto peso molecular, quando esses pili são visualizados por Western blot. Como visto nas Figuras 8B e C, um padrão semelhante a uma escada indicativo de uma estrutura de pilus foi observado em uma mancha Western de polipeptídeos de superfície extraídos da cepa CPl de Clostridium perfringens, mas não em uma mancha Western correspondente de polipeptídeos de superfície extraídos das cepas mutantes, visualizados com anticorpos obtidos de soro de galinha ou criados em coelhos.

Várias cepas de Clostridium perfringens:

[0086] A extração de polipeptídeos de superfície de cinco isolados de C. perfringens que se originaram de fontes de aves de capoeira (CPl, JGS4141 e JGS4120) ou de aves que não de capoeira (cepa 13 ATCC13124) foi realizada como descrito acima. Extratos proteicos de superfície (5 nl) foram carregados em dois géis Novex" NuUPAGE”" 3 a 8% de Tris-acetato (Fisher Scientific) e submetidos a eletroforese a 150V por 1 h. Um gel foi utilizado para a coloração com a coloração Bio- Safe"" de Coomassie (BioRad) e o segundo gel foi transferido para uma membrana de difluoreto de polivinileno (PVDF) a

350V por lh em tampão de transferência 1X (48 mM de Tris, 39 mM de glicina, 20% de metanol, 0,1% de SDS). A detecção quimioluminescente foi realizada com o kit quimioluminescente WesternBreeze" (Life Technologies), de acordo com as instruções do fabricante, usando soro de galinha anti-FimA (1: 200) como anticorpo primário e um anticorpo secundário IgY conjugado com fosfatase alcalina (AP) anti-galinha de cabra (1: 2.000). O soro usado como Ab primário foi obtido no sacrifício de uma galinha imunizada com FimA que posteriormente exibiu um alto título anti- FimA.

[0087] Os resultados são mostrados nas Figuras 9A-B. A presença (+) ou ausência (-) do locus genético (locus VR-10B (CA)) para os genes da subunidade de pilus cnaAh, fimA e fimB em cada cepa de Clostridium perfringens havia sido previamente determinada pela análise de microarrays e pela reação em cadeia da polimerase (PCR) (Lepp D et al, Journal of Bacteriology (2013) 195: 1152- 1166). Como visto nas Figuras 9A-B, cepas que carregam o locus genético pilus em seus genomas (JGS4141 e CPl) mostraram o padrão característico em forma de escada de uma estrutura pilus em polipeptídeos de superfície extraídos (indicado pela linha vertical à direita da imagem em gel na Figura 9B), quando o Western blot foi visualizado com anticorpo anti-FimA de galinha, enquanto outras cepas que não carregam o locus genético pilus em seu genoma não mostram esse padrão. A visualização de bandas de menor peso molecular nos extratos é provavelmente devida a anticorpos não relacionados presentes no soro de galinha bruto. Nenhum dos extratos mostrou uma banda correspondente ao próprio polipeptídeo FimA, cuja localização esperada é indicada por uma seta à direita da imagem em gel na Figura 9B. Isso não é surpreendente, já que não seria de esperar que as proteínas associadas à superfície incluíssem o monômero FimA, que é encontrado apenas nas células. Marcação de imunogold dos mutantes das subunidades das cepas CP1 e CP1 pilus de Clostridium perfringens:

[0088] As células da cepa CPl de Clostridium perfringens ou dos CPI mutantes nulos CPIAfimA e CPIAfimB foram marcadas com partículas de ouro usando uma técnica de imunogold incluindo coelho anti-FimA como anticorpo primário e anticorpo coloidal Gold-AffiniPure" Goat Anti- Rabbit de 6 nm IgG (H + L) (min X Hu, Ms, Rat Sr Prot) (Cedarlane) como anticorpo secundário e examinado por microscopia eletrônica de transmissão, essencialmente como descrito anteriormente (Chang, C., Huang, I.-H., Hendrickx, A.P.A., Ton-That, H. 2013. Visualization of Gram-positive Bacterial Pili, In: Delcour, H.A. (Ed.) Bacterial Cell Surfaces: Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ, 77-95). Como visto na Figura 10, as células da cepa CPl nativa mostram a presença de uma estrutura pilus na superfície celular, enquanto as células dos mutantes CPIlAfimA e CPIAfimB não possuem essas estruturas.

[0089] As formas de realização descritas neste documento pretendem ser ilustrativas das presentes composições e métodos e não pretendem limitar o escopo da presente invenção. Várias modificações e alterações consistentes com a descrição como um todo e que são prontamente aparentes para o técnico no assunto devem ser incluídas. As reivindicações anexas não devem ser limitadas pelas formas de realização específicas estabelecidas nos exemplos, mas devem receber a interpretação mais ampla consistente com a descrição como um todo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. POLIPEPTÍDEO ISOLADO DE PILUS DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS.

2. POLIPEPTÍDEO ISOLADO de pilus de Clostridium perfringens, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de pilus é um polipeptídeo de CnaaA.

3. POLIPEPTÍDEO ISOLADO de pilus de Clostridium perfringens, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CnaA é selecionado a partir de um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID Nº: 10 e da SEQ ID Nº: 13; um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo possuindo uma sequência nucleotídica selecionada a partir da SEQ ID Nº: 1, da SEQ ID Nº: 4 e da SEQ ID Nº: 7; e um polipeptídeo codificado por um polinucleotiídeo que hibridiza sob condições pelo menos moderadamente rigorosas com um polinucleotídeo possuindo uma sequência selecionada a partir da SEQ ID Nº: 1, da SEQ ID Nº: 4 e da SEQ ID Nº: 7.

4, POLIPEPTÍDEO ISOLADO de pilus de Clostridium perfringens, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de pilus é um polipeptídeo FimA.

5. POLIPEPTÍDEO ISOLADO de pilus de Clostridium perfringens, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo FimA é selecionado a partir de um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID Nº: 11 e da SEQ ID Nº: 14; um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo possuindo uma sequência nucleotídica selecionada a partir da SEQ ID Nº: 2, da SEQ ID Nº: 5 e da SEQ ID Nº: 8; e um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições pelo menos moderadamente rigorosas com um polinucleotídeo possuindo uma sequência selecionada a partir da SEQ ID Nº: 2, da SEQ ID Nº: 5 e da SEQ ID Nº: 8.

6. POLIPEPTÍDEO ISOLADO de pilus de Clostridium perfringens, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de pilus é um polipeptídeo FimB.

7. POLIPEPTÍDEO ISOLADO de pilus de Clostridium perfringens, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo FimB é selecionado a partir de um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID Nº: 12 e da SEQ ID Nº: 15; um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo possuindo uma sequência nucleotídica selecionada a partir da SEQ ID Nº: 3, da SEQ ID Nº: 6 e da SEQ ID Nº: 9; e um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições pelo menos moderadamente rigorosas com um polinucleotídeo possuindo uma sequência selecionada a partir da SEQ ID Nº: 3, da SEQ ID Nº: 6 e da SEQ ID Nº: 9.

8. POLIPEPTÍDEO ISOLADO de pilus de Clostridium perfringens, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de pilus é um pilus montado.

9. POLIPEPTÍDEO ISOLADO de pilus de Clostridium perfringens, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o pilus montado compreende uma ou mais subunidades, cada uma individualmente selecionada a partir de um polipeptídeo CnaA, um polipeptídeo FimA e um polipeptídeo FimB.

10. POLIPEPTÍDEO IMUNOGÊNICO selecionado a partir de um polipeptídeo isolado de pilus de Clostridium perfringens, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, uma variante do polipeptídeo de pilus; um fragmento do polipeptídeo de pilus; e um fragmento da variante, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de pilus, a variante, o fragmento do polipeptídeo e o fragmento da variante são imunogênicos em ave de capoeira (poultry).

11. POLIPEPTÍDEO IMUNOGÊNICO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a variante tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequência ao polipeptídeo de pilus.

12. POLINUCLEOTÍDEO caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência que codifica um polipeptídeo imunogênico, de acordo com a reivindicação 10 ou 11.

13. VETOR, compreendendo um polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o vetor é configurado para expressão do polipeptídeo imunogênico em uma célula hospedeira.

14. VACINA para o tratamento ou a prevenção de enterite necrótica em ave de capoeira, a vacina caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um polipeptídeo imunogênico, de acordo com a reivindicação 10 ou 11.

15. VACINA para o tratamento ou a prevenção de infecção por Clostridium perfringens em ave de capoeira, a vacina caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um polipeptídeo imunogênico, de acordo com a reivindicação ou 11.

16. USO DE UM POLIPEPTÍDEO IMUNOGÊNICO, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para oO tratamento ou a prevenção de enterite necrótica em ave de capoeira.

17. USO DE UM POLIPEPTÍDEO IMUNOGÊNICO, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para oO tratamento ou a prevenção de infecção por Clostridium perfringens em ave de capoeira.

18. MÉTODO DE TRATAMENTO ou prevenção de enterite necrótica em ave de capoeira, o método caracterizado pelo fato de compreender administrar à ave de capoeira uma quantidade eficaz de um polipeptídeo imunogênico, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, ou uma quantidade eficaz de uma vacina, de acordo com a reivindicação 14.

19. MÉTODO DE TRATAMENTO ou prevenção de infecção por Clostridium perfringens em ave de capoeira, O método caracterizado pelo fato de compreender administrar à ave de capoeira uma quantidade eficaz de um polipeptídeo imunogênico, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, ou uma quantidade eficaz de uma vacina, de acordo com a reivindicação 15.

20. USO DE UM POLIPEPTÍDEO IMUNOGÊNICO, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de ser como uma vacina para o tratamento ou a prevenção de enterite necrótica em ave de capoeira.

21. USO DE UM POLIPEPTÍDEO IMUNOGÊNICO, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de ser como uma vacina para o tratamento ou a prevenção de infecção por Clostridium perfringens em ave de capoeira.

22. ANTICORPO caracterizado pelo fato de que se liga seletivamente a um polipeptídeo imunogênico, de acordo com a reivindicação 10 ou 11.

23. MÉTODO PARA DETECTAR INFECÇÃO por Clostridium perfringens em ave de capoeira, caracterizado pelo fato de ser através da obtenção de uma amostra biológica da ave de capoeira e detectando na amostra biológica a presença de um anticorpo, de acordo com a reivindicação 22.

24. MÉTODO PARA DETECTAR UM POLIPEPTÍDEO IMUNOGÊNICO, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de compreender expor o polipeptídeo imunogênico a um anticorpo, de acordo com a reivindicação 22, e detectar a ligação do polipeptídeo imunogênico ao anticorpo.