PL201982B1 - Przeciwciała poliklonalne przeciwko białkom Helicobacter pylori oraz sposób ich wytwarzania - Google Patents

Abstract

1. Przeciwciała poliklonalne przeciwko Helicobacter pylori są wyizolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego preparatami DNA zawierającymi fragmenty genomowego DNA o wysokiej specyficzności antygenowej oraz charakteryzują się ptasimi strukturalnymi cechami filogenetycznymi, zwłaszcza opornością na barierę gastryczną oraz zwiększoną masą cząsteczkową. 2. Przeciwciała według zastrz. 1, znamienne tym, że maja masę od 170000-174000 daltonów. 3. Przeciwciała według zastrz. 1, znamienne tym, że skierowane są przeciwko białkom zawierającym w swojej strukturze epitopy białka UreB Helicobacter pylori o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 1. 4. Przeciwciała według zastrz. 1, znamienne tym, że skierowane są przeciwko białkom zawierającym w swojej strukturze epitopy białka HspB Helicobacter pylori o strukturze aminokwasowej przedstawionej wzorem 2. 5. Sposób wytwarzania ptasich monospecyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom Helicobacter pylori o wysokiej specyficzności antygenowej i opornych na barierę gastryczną, z wykorzystaniem DNA immunizacji ptaków, znamienny tym, że immunizuje się drób, korzystnie kaczkę lub kurę hodowlaną, wyizolowanym z bakterii Helicobacter pylori fragmentem genomowego DNA kodującym antygen Helicobacter pylori, o odpowiedniej strukturze białkowej, a po potwierdzeniu wystąpienia specyficznej odpowiedzi immunologicznej na dany antygen w postaci obecności odpowiednich przeciwciał IgG w serum immunizowanego ptaka, wyizolowuje się z żółtka jaj danego osobnika przeciwciała IgY w czystej formie.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są ptasie monospecyficzne poliklonalne przeciwciała IgY skierowane przeciwko białkom Helicobacter pylori oraz sposób wytwarzania tych przeciwciał przez immunizację drobiu za pomocą DNA.

Dotychczas opisane były różne sposoby produkcji przeciwciał, zarówno poliklonalnych, jak i monoklonalnych, skierowanych przeciwko antygenom Helicobacter pylori.

Metody produkcji przeciwciał poliklonalnych najczęściej wiązały się z immunizacją ssaków (Hirota et al., 2001, Inf. Immun. 69, 6597; Casswall et al., Scnd. J. Gastroenterol, 2002, 3Z, 1380) lub drobiu (Shin et al. 2002, Clin. Diagn. Lab. Immunol., 1061) za pomocą zinaktywowanych całych komórek H. pylori. Uzyskane w ten sposób przeciwciała nie są przeciwciałami monospecyficznymi, tj. rozpoznają wiele białek Helicobacter pylori. Ponadto, mogą one rozpoznawać też białka innych bakterii, np. białka naturalnej flory bakteryjnej występującej w organizmach ludzkich. Wiąże się to z obniżeniem wydajności działania przeciwciał oraz zniszczeniem własnej flory bakteryjnej osobnika.

Tradycyjne metody produkcji przeciwciał monoklonalnych są bardzo żmudne i skomplikowane. Również stosowane ostatnio nowsze metody, prowadzące do wyizolowania fragmentów monoklonalnych przeciwciał (scFv) wymagają skonstruowania odpowiednich bibliotek cDNA oraz wielu następujących po sobie rund oczyszczania i sprawdzania specyficzności (Reiche al., 2002, Inf. Immun. 70, 4158).

Produkcja dużej ilości przeciwciał jest ograniczona w takim wypadku przez względy ekonomiczne wynikające np. z olbrzymiej pracochłonności początkowych etapów produkcji przeciwciał monoklonalnych, niskiej wydajności izolacji przeciwciał poliklonalnych z surowicy immunizowanych zwierząt (izolacja przeciwciał z krwi) lub z ograniczenia czasu produkcji przeciwciał tylko do krótkiego okresu przed i po porodzie (w przypadku izolacji przeciwciał z siary). Inne ograniczenia wynikają ze względów etycznych - uzyskanie ostatecznej ilości krwi do izolacji przeciwciał poliklonalnych wiąże się z koniecznością zabicia zwierząt produkujących te przeciwciała. A ponadto, podczas immunizacji preparatami zawierającymi białka lub całe komórki Helicobacter pylori pracownik narażony jest na bezpośredni kontakt z patogenem.

Kolejnym ograniczeniem jest całkowita nieodporność otrzymywanych przez immunizację ssaków przeciwciał na barierę gastryczną, a w przypadku Helicobacter pylori ma to zasadnicze znaczenie, ponieważ bakteria ta bytuje w przewodzie pokarmowym i tam musi być leczona.

Metody immunizacji zwierząt za pomocą szczepionek DNA były opisane już kilka lat temu (Gregersen, 2001, Naturwissenschaften, 88, 504). Znana była także immunizacja ssaków za pomocą samego DNA Helicobacter pylori, jednak była ona stosowana jedynie w celu uzyskania odporności immunizowanych zwierząt (szczepionka DNA), ale nie w celu uzyskania na skalę masową przeciwciał terapeutycznych czy diagnostycznych (Todoroki et al., 2000, BBRC 272, 159).

Dotychczas opisane były również metody immunizacji drobiu za pomocą DNA w celu uzyskania oporności na choroby drobiu wywoływane zakażeniem wirusowym (Rollier et al., 2000, J. Virol, 74, 4908).

Obecnie obserwuje się wzrost zainteresowania wykorzystaniem ptaków (drobiu) jako potencjalnych dostawców specyficznych przeciwciał.

Wiadomo, iż w przypadku ptaków, immunizacja lizatem komórkowym powoduje przechodzenie jednej klasy macierzystych immunoglobin z serum immunizowanego drobiu do jaj oraz ich akumulację w żółtkach jaj, co znacznie ułatwia i przyspiesza proces oczyszczania.

Z drugiej strony wiadomo, że istotną zaletą przeciwciał IgY jest fakt, że są one oporne na barierę gastryczną i w kilku przypadkach potwierdzono ich efektywność po podaniu doustnym w zapobieganiu chorobom wywoływanym przez patogeny przewodu pokarmowego takie jak: rotawirusy (Sarker et al., 2001, J. Pediatr. Gastroenterl. Nutr. 32, 19), bakterie Eschehchia coli (Marquardt al., 1999, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 23, 283).

Natomiast brak jest dotąd doniesień o wykorzystaniu metody immunizacji drobiu preparatem DNA w celu uzyskania przeciwciał IgY skierowanych przeciwko antygenom Helicobacter pylori.

Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest otrzymanie przeciwciał przeciwko antygenom Helicobacter pylori z dużą wydajnością, metodą według wynalazku, łączącą korzyści metod immunizacji drobiu preparatami DNA i produkcji przeciwciał w jajach. Metoda ta pozwala na szybkie wygenerowanie znaczących ilości specyficznych przeciwciał, korzystnie odróżniających się od dotychczas uzyskiwanych przeciwciał przeciwko antygenom Helicobacter pylori monospecyficznością oraz odznaczająPL 201 982 B1 cych się wysoką opornością na barierę gastryczną, mogących znaleźć zastosowanie w immunoterapii oraz immunodiagnostyce.

Przeciwciała poliklonalne IgY, przeciwko antygenom Helicobacter pylori, według wynalazku charakteryzują się opornością na barierę gastryczną oraz zwiększoną masą cząsteczkową.

Przeciwciała według wynalazku korzystnie maja masę od 170000-174000 daltonów.

Znane dotychczas ssacze przeciwciała rozpoznające antygeny Helicobacter pylori miały masę około 150 000 daltonów.

Wymienione cechy odróżniają przeciwciała według wynalazku od znanych dotychczas przeciwciał ssaczych rozpoznających antygeny Helicobacter pylori. Przeciwciała według wynalazku odróżniają się także od dotychczas znanych ptasich przeciwciał IgY rozpoznających antygeny Helicobacter pylori otrzymanych przez immunizację drobiu zinaktywowanymi komórkami Helicobacter pylori monospecyficznością, ponieważ otrzymuje się je w wyniku immunizacji drobiu zdefiniowanymi preparatami DNA kodującymi określone białko/antygen (lub epitop) Helicobacter pylori, a nie w wyniku immunizacji preparatami białkowymi lub lizatem komórkowym (zinaktywowanymi komórkami).

Szczególnie korzystnie, przeciwciała według wynalazku skierowane są przeciwko białkom zawierającym strukturę aminokwasową lub jej fragmenty (epitopy) przedstawione wzorem 1 albo przeciwko białkom zawierającym strukturę aminokwasową lub jej fragmenty (epitopy) przedstawione wzorem 2.

Sposób wytwarzania monospecyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom Helicobacter pylori o wysokiej specyficzności antygenowej i opornych na barierę gastryczną, według wynalazku polega na tym, że immunizuje się drób, korzystnie kaczkę lub kurę hodowlaną, wyizolowanym z bakterii Helicobacter pylori fragmentem DNA kodującym antygen Helicobacter pylori, a po potwierdzeniu wystąpienia specyficznej odpowiedzi immunologicznej na dany antygen wyizolowuje się z żółtka jaj danego osobnika przeciwciała IgY w czystej formie.

Korzystnie, jako fragment Helicobacter pylori stosuje się fragment DNA kodujący białko UreB o sekwencji genowej przedstawionej wzorem 3 albo o sekwencji genowej przedstawionej wzorem 4, kodującej białko HspB.

W sposobie wedł ug wynalazku uzyskuje się przeciwciał a specyficznie rozpoznają ce antygeny kodowane przez stosowane fragmenty DNA. Przeciwciała według wynalazku wyizolowuje się z wysoką wydajnością (60-100 mg/jajko) z żółtka jajka, gdzie są zakumulowane. Wyizolowane przeciwciała mają wysokie miano i dużą trwałość, ponadto w poszczególnych jajach od danego osobnika występują niewielkie indywidualne różnice w ich mianie, co gwarantuje odtwarzalność procesu otrzymywania przeciwciał zapewniającą jednoznaczność czynnika wywołującego odpowiedź immunologiczną. Ta odtwarzalność procesu jest znacznie wyższa niż w stosowanych dotychczas technikach wytwarzania przeciwciał.

Przeciwciała według wynalazku mają również wysoką specyficzność antygenową, będąc poliklonalnymi przeciwciałami monospecyficznymi mają zdolność do rozpoznawania („wyłapania”) mutacyjnie zróżnicowanych wersji antygenu.

Jedną z najważniejszych cech przeciwciał według wynalazku jest ich oporność na barierę gastryczną, ponieważ Helicobacter pylori bytuje w żołądku i ta właśnie oporność ma zasadnicze znaczenie w zapobieganiu i leczeniu chorób wywoływanych przez tę bakterię.

Sposób według wynalazku jest wysoko nieinwazyjny, a więc zgodny z duchem ustawy o ochronie zwierząt, ponieważ nie wymaga skrwawiania zdrowych zwierząt w celu otrzymania wymaganych przeciwciał.

Przy jednoczesnym dużym dziennym zbiorze jajek z immunizowanego genem drobiu, metoda według wynalazku jest szybką i nieinwazyjną metodą produkcji znaczącej ilości biologicznie aktywnych przeciwciał przeciwko Helicobactr pylori. Ponieważ DNA może być łatwo wprowadzone do plazmidowego DNA, genetyczne szczepienie drobiu hodowlanego pozwala na szybkie wygenerowanie specyficznych przeciwciał IgY przeciw wielu różnym białkom bakterii Helicobacter pylori, zwłaszcza białkom silnie immunogennym - antygenom.

Metoda według wynalazku pozwala na wytworzenie przeciwciał bez zbędnej straty czasu, to znaczy na produkcję dużej ilości antygenu (białka) do immunizacji oraz bez stosowania drogich procedur oczyszczania białek do immunizacji. Oczyszczanie przeciwciał IgY z żółtek jaj nie jest procesem skomplikowanym i dostępne metody zapewniają wysoką wydajność takiego oczyszczania. Co ważniejsze, drobiowe przeciwciała IgY okazują się być bardzo przydatne jako czynniki immunodiagnostyczne, ponieważ białka te nie dają akcji krzyżowej odpowiedzi immunologicznej z globulinami

PL 201 982 B1 ssaczymi, w przeciwieństwie do możliwości takiej reakcji np. w przypadku produkcji ssaczych monoklonalnych immunoglobulin opartej na ekspresji odpowiednio zaprojektowanego fragmentu DNA na podstawie znanych sekwencji immunoglobulin ssaczych. Dodatkowo, oralnie podawane przeciwciała według wynalazku przeciwko Helicobactr pylori mogą być zastosowane do pasywnej immunoterapii tej bakterii (in statu nascendi) znajdujących się w żołądku, ze względu na to, iż przeciwciała te są oporne na barierę gastryczną i nie ulegają szybkiej degradacji w przewodzie pokarmowym, jak podano wcześniej.

Sposób według wynalazku zapewnia wysokie bezpieczeństwo pracy, ponieważ na żadnym etapie pracy pracownik nie jest narażony na bezpośredni kontakt z patogenem.

Metoda stosowana według wynalazku pozwala na uzyskanie przeciwciał nawet przeciwko białkom występującym w niskich stężeniach lub białkom związanym z błonami komórkowymi i w związku z tym trudnym do wyizolowania w czystej formie, jak ma to miejsce w przypadku niektórych antygenów Helicobacter pylori.

Natomiast przeciwciała według wynalazku są szczególnie cenne do celów imunodiagnostycznych, ponieważ nie wykazują reakcji krzyżowej z białkami ssaków oraz są one autoagresywne w ssakach, w związku z filogenetyczną odległością pomiędzy ptakami i ssakami.

Rozwiązanie według wynalazku może znaleźć zastosowanie w immunoterapii ludzi i zwierząt przeciw infekcjom Helicobacter. Dodatkowo przeciwciała otrzymane metodą według wynalazku mogą być bardzo obiecujące w zastosowaniu w testach immunodiagnostycznych, np. ELISA oraz w badaniach mikroskopowych tkanek zakażonych osobników (immunolokalizacja bakterii).

W sposobie wywarzania przeciwciał z wykorzystaniem immunizacji genowej drobiu, wedł ug wynalazku prowadzi się DNA immunizację drobiu przez wprowadzenie domięśniowo odpowiednich plazmidów zawierających sekwencje kodujące wybrane białko (antygen) i uzyskanie specyficznej odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko temu białku w postaci poliklonalnych monospecyficznych przeciwciał.

Poza tym, w świetle zsekwencjonowania ostatnio ludzkiego genomu oraz dostępności sekwencji genomowych dla wielu organizmów eukariotycznych i prokariotycznych, metoda według wynalazku może pozwolić na szybkie wytwarzanie specyficznych przeciwciał dla nieznanych dotychczas protein kodowanych przez konkretne geny, a także na zlokalizowanie tych białek w komórkach i tkankach poprzez immunolokalizację.

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku.

P r z y k ł a d I

Konstrukcja plazmidu oraz immunizacja drobiu

W celu skonstruowania plazmidu mającego służ yć do DNA-immunizacji kaczki wybrano gen ureB, kodujący dużą podjednostkę ureazy, białko UreB Helicobacter pylori, będące silnym antygenem tej bakterii.

Jako materiały wyjściowe użyto: plazmid pCI (wektor dostępny z firmy Promega) oraz plazmid pAR3 niosący gen ureB H. pylori o sekwencji DNA przedstawionej wzorem 3.

Na matrycy plazmidu pAR3 przeprowadzono reakcję amplifikacji (PCR), stosując następujące oligonukleotydy jako startery dla polimerazy DNA:

UREBPC11 (5'-GCGAATTCCGCCATGGAAAAGATTA-3') oraz

UREBPC12 (5'-CGCTCTAGACTAGAAAATGCTAAAG-3').

Produkt reakcji amplifikacji sklonowano do wektora pCI, uzyskując plazmid pAR72, zawierający gen kodujący białko UreB H. pylori pod kontrolą promotora CMV (ang. cytomegalovirus immediateearly enhancer/promoter region) obecnego w plazmidzie pCI oraz sekwencje zapewniające wydajną translację genu ureB w komórkach drobiu, które wprowadzono przed kodonem inicjacji translacji (ATG) genu ureB. Sekwencje te są obecne w starterze UREBPC11. Prawidłowość klonowania została potwierdzona poprzez zsekwencjonowanie plazmidu i trawienia restrykcyjne. Plazmidowe DNA zostało namnożone oraz oczyszczone na kolumnach (firmy Qiagen) oraz użyte do immunizacji drobiu. Konstruktem (preparatem DNA) szczepiono domięśniowo kaczkę hodowlaną 5-krotnie w odstępach 2-4 tygodniowych, jednorazowo stosując 0,25-0,5 mg DNA.

Sprawdzenie obecności przeciwciał w surowicy immunizowanych kaczek

Metodą dot-blot sprawdzono surowice kaczek szczepionych plazmidem pAR72 oraz konstruktem kontrolnym. Surowice rozcieńczono 500 x, 1000 x, 2000 x i 5000 x, a następnie inkubowano z membraną zawierającą nakroploną porcję oczyszczonego białka UreB (01 μg) i białka kontrolnego. Jako przeciwciała drugorzędowe zastosowano komercyjne przeciwciała anty-kacze IgG skoniugowaPL 201 982 B1 ne z HRP (Research Diagnostics, Inc.) Przeciwciała te zostały rozcieńczone 5000 x i 10000 x. Surowica z kaczki immunizowanej plazmidem pAR72 specyficznie wiązała białko UreB, natomiast w przypadku surowicy z kaczki immunizowanej konstruktem kontrolnym uzyskano wynik negatywny.

Charakterystyka przeciwciał oczyszczonych z żółtek jaj immunizowanych kaczek

Przeciwciała z żółtek jaj immunizowanych kaczek zostały wyekstrahowane oraz oczyszczone za pomocą komercyjnie dostępnych odczynników. Stężenie białka w preparacie zostało sprawdzone, a nastę pnie potwierdzono specyficzność przeciwciał IgY metodą dot-blot oraz metodą Western-blot używając oczyszczonego białka UreB oraz białka BSA (albuminy serum wołu), jako kontroli negatywnej. Następnie, w celu zmianowania przeciwciał przeprowadzono oznaczenie ELISA. Antygenem było białko UreB (0,5 μg/100 μΐ). Płytki (Costar, EIA/RIA 96 well plates, high binding, nr. kat. 9018) opłaszczano białkiem UreB przez noc. Kontrolnie, zamiast UreB używano BSA. Poszczególne czasy inkubacji: (1) z testowanymi przeciwciałami IgY, (2) blokowania BSA oraz (3) inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym (kozie, anty-kacze IgG sprzężone z HRP, Research Diagnostics, Inc.) wynosiły w każdym przypadku 60 min. Płytki płukano buforem PBS. Reakcję z przeciwciałami skoniugowanymi z HRP prowadzono przy użyciu kitu TMB Peroxidase EIA Substrate Kit, Bio-Rad. Przykładowe wyniki wstępnego zmianowania przeciwciał testem ELISA pokazano na fig. 1. Stwierdzono wysoką aktywność anty-UreB w preparacie zawierającym przeciwciała kaczki immunizowanej konstruktem pAR72. Największe użyte rozcieńczenie tych przeciwciał (8000 x) ciągle wykazywało bardzo dużą różnicę w sile wiązania przeciwciał do UreB oraz do BSA (białko kontrolne).

Stosując ekstrakt ze zrekombinowanych komórek Escherichia coli produkujących aktywną enzymatycznie ureazę Helicobacter pylori wykazano, że przeciwciała IgY nie mają właściwości neutralizujących aktywność enzymatyczną tej ureazy. Wynik ten nie jest wynikiem zaskakującym, ponieważ większość przeciwciał poliklonalnych skierowanych przeciwko białku UreB nie ma właściwości neutralizujących aktywność ureazy. Takie przeciwciała (nie neutralizujące) mogą jednak mieć właściwości profilaktyczne lub terapeutyczne (Blanchard et al., Inf. Immun. 63,1995, 1394).

P r z y k ł a d II

Konstrukcja plazmidu oraz immunizacja drobiu

W celu skonstruowania plazmidu mającego służyć do DNA-immunizacji kaczki wybrano gen hspB, kodujący białko HspB Helicobacter pylori, będące sinym antygenem tej bakterii.

Jako materiały wyjściowe użyto: plazmid pCI (wektor dostępny z firmy Promega) oraz plazmid pAR80 niosący gen hspB H. pylori o sekwencji DNA przedstawionej wzorem 4.

Na matrycy plazmidu pAR80 przeprowadzono reakcję amplifikacji (PCR), stosując następujące oligonukleotydy jako startery dla polimerazy DNA:

HSPB5 (5'- GCGAATTCCACCATGGCAAAAGAAATCAAATTTTCAGATAGC-3') oraz

HSPB6 (5'-GCGCGTCGACTTACATCATGCCGCCCATGC-3').

Produkt reakcji amplifikacji sklonowano do wektora pCI, uzyskując plazmid pAR97, zawierający gen kodujący białko HspB H. pylori pod kontrolą promotora CMV (ang. cytomegalovirus immediateearly enhancer/promoter region) obecnego w plazmidzie pCI oraz sekwencje zapewniające wydajną translację genu ureB w komórkach drobiu, które wprowadzono przed kodonem inicjacji translacji (ATG) genu hspB. Sekwencje te są obecne w starterze HSPB5. Prawidłowość klonowania została potwierdzona poprzez zsekwencjonowanie plazmidu i trawienia restrykcyjne.

Plazmidowe DNA zostało namnożone oraz oczyszczone na kolumnach (firmy Qiagen) oraz użyte do immunizacji drobiu. Konstruktem (preparatem DNA) szczepiono domięśniowo kaczkę hodowlaną jednorazowo stosując 0,25-0,5 mg DNA jak w przykładzie I.

PL 201 982 B1

MEKISRKEYVSMYGPITGDKVRLGDTDLIAEVEHDYTIYGEELKFGGGKTLREGMSQ SNNPSKEELDLIITNALIVDYTGIYKADIGIKDGKIAGIGKGGNKDMQDGVKNNLSVGPA TEALAGEGLIVTAGGIDTHIHFISPQQIPTAFASGVTTMIGGGTGPADGTNATTITPGRRN LKWM LRAAEEYSM N LGFLAKGNTSN DASLADQIEAGAIGFKIH EDWGTTPSAIN HALDV ADKYDVQVAIHTDTLNEAGCVEDTMAAIAGRTMHTFHTEGAGGGHAPDIIKVAGEHNIL PASTNPTIPFTVNTEAGHMDMLMVCHHLDKSIKEDVQFADSRIRPQTIAAEDTLHDMGIF SITSSDSQAMGRVGEVITRTWQTADKNKKEFGRLKEEKGDNDNFRIKRYLSKYTINPAIA HGISEYVGSVEVGKVADLVLWSPAFFGVKPNMIIKGGFIALSQMGDANASIPTPQPVYYR EMFAHHGKAKYDANITFVSQAAYDKGIKEELGLERQVLPVKNCRNITKKDMQFNDTTAH IEVNPETYHVFVDGKEVTSKPANKVSLAQLFSIF

MAKEIKFSDSARNLLFEGVRQLHDAVKVTMGPRGRNVLIQKSYGAPSITKDGVSVA

KEIELSCPVANMGAQLVKEDASKTADAAGDGTTTATVLAYSIFKEGLRNITAGANPIEVK

RGMDKAPEAIINELKKASKKVGGKEEITQVATISANSDHNIGKLIADAMEKVGKDGVITV

EEAKGIEDELDVVEGMQFDRGYLSPYFVTNAEKMTAQLDNAYILLTDKKISSMKDILPLLE

KTMKEGKPLLIIAEDIEGEALTTLVVNKLRGVLNIAAVKAPGFGDRRKEMLKDIAVLTGGQ

VISEELGLSLENAEVEFLGKAKIVIDKDNTTIVDGKGHSHDVKDRVAQIKTQIASTTSDY

DKEKLQERLAKLSGGVAVIKVGAASEVEMKEKKDRVDDALSATKAAVEEGIVIGGGAALI

RAAQKVHLNLHDDEKVGYEIIMRAIKAPLAQIAINAGYDGGVVVNEVEKHEGHFGFNAS

NGKYVDMFKEGIIDPLKVERIALQNAVSVSSLLLTTEATVHEIKEEKAAPAMPDMGGMGG

MGGMGGMM

PL 201 982 B1

ATGGAAAAGATTAGCAGAAAAGAATATGTTTCTATGTATGGCCCTACCACAGG

CGATAAAGTGAGATTGGGCGATACAGACTTGATCGCTGAAGTAGAACATGACTACAC

CATTTATGGCGAAGAGCTTAAATTCGGTGGCGGTAAAACCCTAAGAGAAGGCATGAG

CCAATCCAACAACCCTAGCAAAGAAGAACTGGATTTGATCATCACTAACGCTTTAATC

GTGGATTACACCGGTATTTATAAAGCGGATATTGGTATTAAAGACGGCAAAATCGCTG

GCATTGGTAAAGGCGGTAACAAAGACATGCAAGATGGCGTTAAAAACAATCTTAGCG

TGGGCCCTGCTACTGAAGCGCTAGCTGGTGAAGGCTTGATCGTAACGGCTGGTGGTA

TTGACACACACATCCACTTCATTTCACCCCAACAAATCCCTACAGCTTTTGCAAGCGGT

GTAACAACCATGATTGGTGGCGGAACCGGTCCTGCTGATGGCACTAATGCGACTACT

ATCACTCCAGGTAGAAGAAACTTAAAATGGATGCTCAGAGCGGCTGAAGAATATTCTA

TGAACTTAGGTTTCTTGGCTAAAGGTAACACTTCTAACGATGCGAGCTTAGCGGATCA

AATTGAAGCCGGTGCGATTGGCTTTAAAATCCACGAAGACTGGGGCACCACTCCTTCT

GCAATCAATCATGCGTTAGACGTTGCGGACAAATACGATGTGCAAGTCGCTATCCACA

CAGACACTTTGAATGAGGCTGGTTGCGTGGAAGACACTATGGCTGCTATTGCCGGGC

GCACTATGCACACTTTCCACACTGAAGGCGCTGGCGGCGGACACGCTCCTGATATTA

TTAAAGTGGCCGGTGAACACAACATCCTACCCGCTTCCACTAACCCCACTATCCCTTT

CACCGTGAATACAGAAGCCGGACACATGGACATGCTCATGGTGTGCCACCACTTGGA

TAAAAGCATTAAAGAAGATGTCCAGTTCGCTGATTCAAGGATCCGCCCTCAAACCATT

GCGGCTGAAGACACTTTGCATGACATGGGGATTTTCTCCATCACCAGTTCTGACTCTC

AAGCAATGGGCCGTGTGGGTGAGGTTATCACTAGGACTTGGCAAACAGCTGACAAAA

ACAAAAAAGAATTTGGCCGCTTGAAAGAAGAAAAAGGCGATAACGACAACTTCAGGA

TCAAACGCTACTTGTCTAAATACACCATTAACCCAGCGATCGCTCATGGGATTAGCGA

GTATGTAGGTTCAGTAGAAGTGGGCAAAGTGGCTGACTTGGTATTGTGGAGTCCAGC

ATTCTTTGGCGTGAAACCCAACATGATCATCAAAGGCGGATTCATTGCGTTAAGTCAA

ATGGGCGATGCGAACGCTTCTATCCCTACCCCACAACCGGTTTATTACAGAGAAATGT

TCGCTCACCATGGTAAAGCTAAATACGATGCAAACATCACTTTTGTGTCTCAAGCGGC

TTATGACAAAGGCATTAAAGAAGAATTAGGGCTTGAAAGACAAGTGTTGCCGGTTAAA

AATTGCAGAAACATCACCAAAAAAGACATGCAATTCAACGACACTACCGCTCACATTG

AAGTCAATCCTGAAACTTACCATGTGTTCGTGGATGGCAAAGAAGTAACTTCTAAACC

AGCTAATAAAGTGAGCTTGGCGCAACTCTTTAGCATTTTCTAG,

PL 201 982 B1

ATGGCAAAAGAAATCAAATTTTCAGATAGCGCAAGAAACCTTTTATTTGAAGGC

GTAAGACAACTCCATGACGCTGTCAAAGTAACCATGGGGCCAAGAGGCAGGAACGTG

TTGATCCAAAAAAGCTATGGCGCTCCAAGCATCACCAAAGACGGCGTGAGCGTGGCT

AAAGAGATTGAATTAAGTTGCCCCGTGGCTAACATGGGCGCTCAGCTCGTTAAAGAA

GATGCGAGCAAAACCGCTGATGCCGCCGGCGATGGCACGACCACAGCGACCGTGCT

GGCTTATAGCATTTTTAAAGAGGGCTTGAGGAATATCACGGCTGGGGCTAACCCTATT

GAAGTGAAACGAGGCATGGATAAAGCGCCTGAAGCGATCATTAATGAGCTTAAAAAA

GCGAGCAAAAAAGTGGGCGGTAAAGAAGAAATCACCCAAGTAGCGACCATTTCTGCA

AACTCCGATCACAATATCGGGAAACTCATCGCTGACGCTATGGAAAAAGTGGGTAAA

GACGGCGTGATCACCGTTGAAGAAGCTAAGGGCATTGAAGATGAATTAGATGTCGTA

GAAGGCATGCAATTTGATAGAGGCTACCTCTCCCCTTACTTTGTAACCAACGCTGAGA

AAATGACCGCTCAATTGGATAACGCTTACATCCTTTTAACGGATAAAAAAATCTCTAGC

ATGAAAGACATTCTCCCGCTACTAGAAAAAACCATGAAAGAGGGCAAACCGCTTTTAA

TCATCGCTGAAGACATTGAGGGCGAAGCTTTAACGACTCTAGTGGTGAATAAATTAAG

AGGCGTGTTGAATATCGCAGCGGTTAAAGCTCCAGGCTTTGGGGACAGGAGAAaAGA

AATGCTCAAAGACATCGCTGTTTTAACCGGCGGTCAAGTCATTAGCGAAGAATTGGGC

TTGAGTCTAGAAAACGCTGAAGTGGAGTTTTTAGGCAAAGCGAAGATTGTGATTGACA

AAGACAACACCACGATCGTAGATGGCAAAGGCCATAGCCATGACGTCAAAGACAGAG

TCGCGCAAATCAAAACCCAAATTGCAAGCACGACAAGCGATTACGACAAAGAAAAATT

GCAAGAAAGATTGGCCAAACTCTCTGGCGGTGTGGCTGTGATTAAAGTGGGCGCTGC

GAGTGAAGTGGAAATGAAAGAGAAAAAAGACCGGGTGGATGACGCGTTGAGCGCGA

CTAAAGCGGCGGTTGAAGAAGGCATTGTGATTGGGGGCGGTGCGGCCCTCATTCGC

GCGGCCCAAAAAGTGCATTTGAATTTACACGATGATGAAAAAGTGGGCTATGAAATCA

TCATGCGCGCCATTAAAGCCCCATTAGCTCAAATCGCTATCAATGCCGGTTATGATGG

CGGTGTGGTCGTGAATGAAGTAGAAAAACACGAAGGGCATTTTGGTTTTAACGCTAG

CAATGGCAAGTATGTGGACATGTTTAAAGAAGGCATTATTGACCCCTTAAAAGTAGAA

AGGATCGCTTTACAAAATGCGGTTTCGGTTTCAAGCCTGCTTTTAACCACAGAAGCCA

CCGTGCATGAAATCAAAGAAGAAAAAGCGGCCCCAGCAATGCCTGATATGGGTGGCA

TGGGCGGAATGGGAGGCATGGGCGGCATGATGTAA

Claims (7)

1. Przeciwciała poliklonalne przeciwko Helicobacter pylori są wyizolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego preparatami DNA zawierającymi fragmenty genomowego DNA o wysokiej specyficzności antygenowej oraz charakteryzują się ptasimi strukturalnymi cechami filogenetycznymi, zwłaszcza opornością na barierę gastryczną oraz zwiększoną masą cząsteczkową.

2. Przeciwciała według zastrz. 1, znamienne tym, że maja masę od 170000-174000 daltonów.

3. Przeciwciała według zastrz. 1, znamienne tym, że skierowane są przeciwko białkom zawierającym w swojej strukturze epitopy białka UreB Helicobacter pylori o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 1.

PL 201 982 B1

4. Przeciwciała według zastrz. 1, znamienne tym, że skierowane są przeciwko białkom zawierającym w swojej strukturze epitopy białka HspB Helicobacter pylori o strukturze aminokwasowej przedstawionej wzorem 2.

5. Sposób wytwarzania ptasich monospecyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom Helicobacter pylori o wysokiej specyficzności antygenowej i opornych na barierę gastryczną, z wykorzystaniem DNA immunizacji ptaków, znamienny tym, że immunizuje się drób, korzystnie kaczkę lub kurę hodowlaną, wyizolowanym z bakterii Helicobacter pylori fragmentem genomowego DNA kodującym antygen Helicobacter pylori, o odpowiedniej strukturze białkowej, a po potwierdzeniu wystąpienia specyficznej odpowiedzi immunologicznej na dany antygen w postaci obecności odpowiednich przeciwciał IgG w serum immunizowanego ptaka, wyizolowuje się z żółtka jaj danego osobnika przeciwciała IgY w czystej formie.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako fragment genomowego DNA Helicobacter pylori stosuje się fragment DNA kodujący białko UreB, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej wzorem 3.

7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako fragment genomowego DNA Helicobacter pylori stosuje się fragment DNA kodujący białko HspB, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej wzorem 4.