CN116621953A - 副猪嗜血杆菌Omp P2蛋白基因型特异性B细胞线性表位及其应用 - Google Patents

副猪嗜血杆菌Omp P2蛋白基因型特异性B细胞线性表位及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开两对副猪嗜血杆菌Omp P2蛋白基因型特异性B细胞线性表位及其应用，第1对表位的序列为：基因I型特异性表位YETRLGRNSKNDAGWGDVTTDEAY，基因II型特异性表位YETRLGSGSKNAAKWGDVTTDEAY。进一步研究发现成熟Omp P2蛋白第65‑88氨基酸组成的多肽几乎都可以作为基因型特异性表位。第2对表位的序列为：基因I型特异性表位NYNVANERDNKGEVKVDSTKSGFGLGA，基因II型特异性表位NYNVANEREKADVKVDSIKSGFGLGA。上述表位诱导产生的单克隆抗体表现出明显的型特异性，能够区分检测出基因I型和基因II型菌株的感染。本发明发现副猪嗜血杆菌Omp P2蛋白表位，为Omp P2蛋白基因I型或II型的特异性表位，可实现猪血清中不同基因型副猪嗜血杆菌抗体的特异性检测，可以初步判定所感染副猪嗜血杆菌的致病性，有助于副猪嗜血杆菌病的准确诊断。

Description

副猪嗜血杆菌Omp P2蛋白基因型特异性B细胞线性表位及其 应用
技术领域
本发明涉及免疫学领域，特别是涉及两对副猪嗜血杆菌Omp P2蛋白基因型特异性B细胞线性表位及其应用。
背景技术
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)隶属于巴斯德菌科(Pastewellaceae)嗜血杆菌属〔Haemophilus)，猪是唯一的天然宿主，一般作为共生菌定植在猪的上呼吸道中，但是当宿主免疫力下降或者和其它病原混合感染时，一些致病力较高的HPS也可以突破粘膜屏障侵入机体内，引起以纤维性多发性浆膜炎、关节炎、肺炎、脑膜炎等炎症为特征的病。HPS的流行范围非常广，全球几乎所有的猪场都存在副猪嗜血杆菌感染，是引起猪呼吸系统疾病的主要病原菌；像中国28.54％、美国46.7％和意大利20.3％的呼吸系统疾病是由HPS参与引起的。各阶段的猪均可感染HPS；但主要是2周龄到4月龄的猪，尤其是5-8周龄断奶前后和处于保育阶段的猪最为易感，感染发病率一般为10-36％，死亡率可达到50％；并且在和免疫抑制类病毒混合感染后，此病的发病率和死亡率会进一步上升，已成为引起仔猪保育期死亡的主要原因之一，给全球生猪养殖业造成了巨大的经济损失。
科学家根据HPS菌体热稳定抗原的免疫扩散试验，将HPS分为15种血清型，不同血清型的致病力有一定的区别。因为致病株和非致病株没有明显的特征区别，所以目前只是根据血清型代表株对SPF猪的致病力进行简单的分类，一般把血清型1、5、10、12、13和14认为是高毒力血清型，2、4、15和8认为是轻度毒力血清型，血清型3、6、7、9和11则被认为是无毒的血清型。不过研究显示强毒力血清型菌株从健康猪上呼吸道分离的几率与患病猪的实质器官中分离的概率没有明显区别，说明这种分组并不完善，HPS中存在血清型之外的毒力决定因子。到目前为止，已经鉴定出副猪嗜血杆菌的多种毒力因子，包括介导细菌定值、入侵、繁殖、免疫逃逸或引起炎症反应的脂寡糖、荚膜多糖、外膜蛋白、转运蛋白、功能酶等。另外研究发现无毒或低毒菌株激发的免疫保护作用无法抵御有毒力菌株的感染发病，但猪一旦耐过有毒力菌株的感染，则对其他异源菌株也具有免疫保护作用。这表明HPS致病菌株的毒力因子可能也是保护性抗原。
有研究者比较了健康猪鼻腔和病猪病变组织中分离HPS外膜蛋白SDS-PAGE图，推测一个36.6～38.5kDa范围内的外膜蛋白可能与毒力存在联系，进一步研究发现，外膜蛋白P2(OmpP2)全长359～401aa，大小正好在这个范围。OmpP2是HPS中丰度最高的外膜蛋白，属膜孔蛋白家族，是细菌主要的膜结构蛋白和营养物质的流通通道。OmpP2缺失的HPS致病株不仅在生长繁殖方面存在明显缺陷；而且粘附和入侵细胞、抵抗血清杀伤等方面的能力明显弱于亲本株；另外OmpP2蛋白还具有细胞毒性，并能诱导细胞分泌促炎症细胞因子。这些都说明OmpP2是HPS的主要的毒力因子，参与了HPS在宿主体内转移和致病的多个过程。
对30株国内外参考株的OmpP2蛋白基因序列进行分析，发现OmpP2蛋白存在两种明显不同的蛋白结构，分为基因I型和II型。与致病性对比后显示20株强毒株和中等毒株的OmpP2蛋白基因都属于基因I型，其他10株弱毒株或者非致病株都属于基因型II型。而且大部分临床分离株的OmpP2蛋白都属于基因I型，存在两个不连续的基因缺失；而大部分健康猪分离株都不存在该缺失结构，属于基因II型。动物和细胞毒力实验也显示，存在缺失的OmpP2蛋白具有更高的细胞毒性和血清抵抗力，说明OmpP2蛋白的结构与细菌毒力直接相关。所以可通过建立两基因型的通用表位及差异表位的多肽ELISA诊断方法及其诊断试剂对OmpP2蛋白的结构进行鉴定，实现致病性菌株和非致病性菌株的区分。
另外，OmpP2蛋白还是HPS中的优势抗原。能够迅速诱导高效价的特异性抗体产生，并在补体存在的情况下能有效的杀伤细菌，抑制细菌在宿主体内生长，表明OmpP2蛋白的B淋巴细胞表位与抗HPS感染的保护性免疫也有关系。所以OmpP2的B淋巴细胞表位不仅与HPS的致病性有关，还有可能是HPS中和抗体的结合位点。筛选B淋巴细胞线性表位，认清表位与致病性的关系，针对关键表位进行突变，就能够在降低毒力的同时保留大部分保护性抗原表位，构建减毒疫苗。并可通过建立突变表位的多肽ELISA诊断方法及其诊断试剂，实现疫苗接种和自然感染阳性猪的区分。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白基因I型的特异性B细胞线性表位，表位序列为YETRLGRNSKNDAGWGDVTTDEAY(SEQ ID NO：1)，处于成熟基因I型OmpP2蛋白序列的第65-88氨基酸。
本发明的另一个目的在于提供一种副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白基因II型的特异性B细胞线性表位，表位序列为YETRLGSGSKNAAKWGDVTTDEAY(SEQ ID NO：2)，同样处于成熟基因II型OmpP2蛋白序列的第65-88氨基酸。
本发明的再一个目的在于其它成熟基因I型OmpP2蛋白序列中的第65-88氨基酸组成的同源多肽同样具有OmpP2蛋白基因I型特异性，可用于基因I型的区分检测，包括但不限于YETRLGRNSKNDAGWGDVTTEKAY(SEQ ID NO：5)，
YETRLGRNSKNDAGWGDVTTEEAY(SEQ ID NO：6)，
YETRLGRNSKNDAGWGDVTTEENAY(SEQ ID NO：7)等。
本发明的再一个目的在于提供一种副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白基因I型的特异性B细胞线性表位，表位序列为NYNVANERDNKGEVKVDSTKSGFGLGA(SEQ ID NO：3)，处于成熟基因I型OmpP2蛋白(rP2-I2)序列的第164-190氨基酸。
本发明的再一个目的在于提供一种副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白基因II型的特异性B细胞线性表位，表位序列为NYNVANEREKADVKVDSIKSGFGLGA(SEQ ID NO：4)，处于成熟基因II型OmpP2蛋白(rP2-II)序列的第180-205氨基酸。
本发明的又一个目的在于提供上述OmpP2蛋白表位及其同源多肽在制备副猪嗜血杆菌病诊断试剂中的应用，可以特异性区分检测出抗OmpP2基因I型蛋白抗体和抗OmpP2基因II型蛋白抗体。
本发明的又一个目的在于提供直接证据证明了含上述表位的OmpP2蛋白可以诱导宿主产生对应表位的基因型特异性抗体，这些型特异性抗体也可以用区分检测基因I型和II型OmpP2蛋白。
本发明的再一个目的是提供上述OmpP2蛋白表位及其同源多肽在预防或治疗副猪嗜血杆菌病诊断试剂或药物中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
1)重组表达不同基因型的OmpP2蛋白，并进行纯化；
2)以不同基因型的重组OmpP2蛋白为抗原，免疫动物；
3)取经免疫的动物脾细胞与瘤细胞融合，得到可稳定分泌抗副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白抗体的杂交瘤细胞；
4)筛选基因型特异性单克隆抗体；
5)合成基因I型和II型OmpP2蛋白的重叠多肽与基因型特异性单克隆抗体进行ELISA检测，筛选基因型特异性B细胞线性表位。
本发明的有益效果是：
本发明的副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白的B细胞线性表位，为基因I型和II型的基因型特异性B细胞线性表位，疫苗株中该段序列突变或缺失后获得的突变OmpP2蛋白在免疫猪之后，无法诱导产生抗该表位的抗体，从而达到自然感染与疫苗接种免疫的鉴别诊断，可为新型分子标记疫苗的研制提供依据。
本发明的副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白的B细胞线性表位可作为亚单位疫苗的候选表位。尤其是基因I型特异性表位，它可以实现在预防致病性基因I型副猪嗜血杆菌感染的同时保护呼吸道内正常寄生的基因II性副猪嗜血杆菌。
本发明的副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白基因I型和II型的基因型特异性B细胞线性表位，其中基因I型特异性表位包被酶标板之后可用于检测猪血清中的抗副猪嗜血杆菌基因I型OmpP2蛋白抗体。基因II型特异性表位包被酶标板之后可用于检测猪血清中的抗副猪嗜血杆菌基因II型OmpP2蛋白抗体。由此建立Peptide-ELISA检测方法，既可区分检测基因I型和基因II型副猪嗜血杆菌的感染，实现猪血清中不同基因型副猪嗜血杆菌抗体的区分检测，初步判定所感染副猪嗜血杆菌的致病性。
本发明还初步确定了与上述基因型特异性表位的氨基酸序列同源的多肽，都具有基因型的特异性，一样可用于不同基因型副猪嗜血杆菌抗体的区分检测。
本发明表位所对应的单克隆抗体，对OmpP2蛋白基因I型或II型具有特异性识别能力，可以精确地识别各自基因型的副猪嗜血杆菌。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1A为rP2-I1、rP2-I2、rP2-I3、rP2-II重组蛋白的SDS-PAGE电泳检测图；其中M为蛋白Marker，条带大小由大到小分别为97.2、66.4、44.3、29、20.1、14.3KDa；1-4号泳道依次为rP2-I1、rP2-I2、rP2-I3、rP2-II复性浓缩后蛋白上清。
图1B为rP2-I1、rP2-I2、rP2-I3、rP2-II重组蛋白抗HIS标签抗体的Western Blot检测结果图；1-4号泳道依次为rP2-I1、rP2-I2、rP2-I3、rP2-II复性浓缩后蛋白上清。
图2为基因型特异性抗体与4个重组蛋白的间接ELISA结果图(A图为1A10和2F1抗体，B图为2C5和5F1抗体)；其中S/CO值为样品OD450nm与阈值的比值，大于1为阳性。
图3为基因型特异性抗体与4个重组蛋白的Western Blot检测结果图(A图为1A10和2F1抗体，B图为2C5和5F1抗体)；其中NC为阴性对照，使用的是非洲猪瘟病毒的重组P30蛋白(表达载体同为PET-28a)。
图4为基因型特异性抗体与天然OmpP2蛋白的间接ELISA结果图(A图为1A10和2F1抗体，B图为2C5和5F1抗体)；其中DT3和ZS7为用于提取天然OmpP2蛋白的菌株。S/CO值为样品OD450nm与阈值的比值，大于1为阳性。
图5为1A10抗体与天然OmpP2蛋白的Western Blot检测结果图；其中DT3和ZS7为用于提取天然OmpP2蛋白的菌株。
图6为基因型特异性抗体与肽池的间接ELISA结果图(A图为1A10和2F1抗体，B图为2C5和5F1抗体)；其中S/CO值为样品OD450nm与阈值的比值，大于1为阳性。
图7为基因型特异性抗体与多肽的间接ELISA结果图(A图为1A10和2F1抗体，B图为2C5和5F1抗体)；其中S/CO值为样品OD450nm与阈值的比值，大于1为阳性。
图8为OmpP2蛋白中65-88氨基酸序列区域的多重比对结果图；其中DT3、ZS7为本实验室分离保存的副猪嗜血杆菌菌株，Hs-DY01～Hs-DY15依次为中国来源副猪嗜血杆菌1～15血清型的代表株，No.4等其它菌株为国际上公认副猪嗜血杆菌各血清型的代表株，毒力一栏中“++”表示强毒性，可引起明显病变及实验动物死亡；“+”表示中等毒性，可引起明显病变但不致死；“±”表示弱毒性，引起的症状轻微，呈一过性感染；“-”为无毒性，不能引起明显症状。
图9为成熟rP2-I2蛋白中161-190氨基酸序列区域的多重比对结果图；其中DT3、ZS7为本实验室分离保存的副猪嗜血杆菌菌株，Hs-DY01～Hs-DY15依次为中国来源副猪嗜血杆菌1～15血清型的代表株，No.4等其它菌株为国际上公认副猪嗜血杆菌各血清型的代表株，毒力一栏中“++”表示强毒性，可引起明显病变及实验动物死亡；“+”表示中等毒性，可引起明显病变但不致死；“±”表示弱毒性，引起的症状轻微，呈一过性感染；“-”为无毒性，不能引起明显症状。
图10为小鼠血清中抗Pt5、Pt5-I3、Pt5-II抗体的效价检测图(A图为rP2-I2免疫小鼠血清，B图为rP2-II免疫小鼠血清)；其中S/CO值为样品OD450nm与阈值的比值，大于1为阳性。
图11为小鼠阳性血清中抗Pt11a、Pt11a-II抗体的效价检测(A图为rP2-I2免疫小鼠血清，B图为rP2-II免疫小鼠血清)；其中S/CO值为样品OD450nm与阈值的比值，大于1为阳性。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步说明本发明。
副猪嗜血杆菌重组外膜蛋白OmpP2的制备
1)表达载体构建
经过SignalP 4.1Server软件预测，OmpP2蛋白含有一个19氨基酸的信号肽，成熟蛋白不含有该序列。为探索OmpP2蛋白的所有抗原表位，所以我们设计了一队引物用于重组表达全长的成熟蛋白(第20位氨基酸开始)。引物的序列为前引物omp2/F：CATGCCATGGTAACAGTTTATGAAAATGAAGGT；后引物omp2/R：
CCGCTCGAGCCATAATACACGTAAACC。表达载体选用PET-28a表达质粒，前引物选用NcoI酶切位点，后引物为Xho I酶切位点；这样就能最大限度减少表达蛋白的外源片段，只在目的蛋白序列的C端连接1个6×His标签；即表达的重组蛋白序列应为：全长成熟OmpP2蛋白序列+酶切位点序列(LE)+6×His标签(HHHHHH)+终止密码子，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司(下简称生工)合成。
2)重组蛋白的诱导表达
我们使用上述引物从4份副猪嗜血杆菌阳性样品中扩增出4条不同的OmpP2蛋白序列，其中1条为基因II型，3条为基因I型。扩增获得的目的片段经过双酶切后与PET-28a载体连接，构建原核表达载体PET-28a-OmpP2，转化入大肠杆菌感受态BL21(DE3，货号B528414，生工)。随后将重组菌摇至菌液OD600值为0.8时，以终浓度0.5mM IPTG(货号A100487，生工)加入菌液继续培养诱导目的蛋白表达。4条目的OmpP2蛋白序列构建的重组表达菌均有目的蛋白表达，分别将各自的重组蛋白标记为rP2-I1、rP2-I2、rP2-I3、rP2-II。
3)包涵体洗涤
对诱导表达后的重组菌进行超声破碎，离心分离破碎后菌体的沉淀和上清，发现目的蛋白主要处于沉淀中，即4个重组蛋白都是以包涵体的形式存在。用30mL包涵体洗涤缓冲液(0.5％ TritonX-100，50mM Tris-HCl PH8.0，300mM NaCl，2mM EDTA，2M尿素)充分重悬破碎后菌体沉淀；超声破碎仪超声洗涤后离心去除上清，并相同的方法重复洗涤2次。用30mL包涵体重悬缓冲液(50mM Tris-HCl PH8.0，300mM NaCl，2mM EDTA)超声洗涤一次。洗涤后包涵体沉淀按照每30mg加入1mL包涵体溶解缓冲液(8M尿素，10％甘油，50mM Tris-HClPH8.0，150mM NaCl，2mM EDTA)，溶解包涵体，4℃搅拌过夜后15000rpm 4℃离心20min，收集溶解上清即为洗涤后包涵体。SDS-PAGE检测上清液中发现4个重组蛋白的纯度可以达到50％-68％。
4)包涵体复性及浓缩
采用尿素梯度透析的方法对4个重组蛋白的溶解包涵体进行复性，具体步骤如下：取2mL包涵体溶解液加入50mL含6M尿素的复性液①(6M尿素，10％甘油，50mM Tris-HClPH8.0，150mM NaCl，2mM EDTA，0.1％吐温-20)中，4℃下重复混匀后装入10KDa截留的透析袋内，用透析袋夹夹紧透析袋两端；将透析袋放入含4M尿素的复性液②(4M尿素，10％甘油，50mM Tris-HCl PH8.0，150mM NaCl，2mM EDTA)中，4℃低速搅拌透析8h；然后将透析袋放入含2M尿素的复性液③(2M尿素，10％甘油，50mM Tris-HCl PH8.0，150mM NaCl，2mM EDTA)中，4℃低速搅拌透析8h；随后将透析袋放入分子筛缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0，50mMNaCl)中透析8h；最后将透析袋内液体15000rpm离心20min，收集上清进行蛋白浓缩。浓缩我们选用10KDa截留的Millipore超滤离心管(货号UFC9010，默克生命科学技术有限公司)，浓缩时的离心力选用3000g，将复性液浓缩至1-1.5mL结束；浓缩液用13000rpm离心10min收集浓缩上清，即为复性及浓缩后的重组OmpP2蛋白。
5)重组蛋白的鉴定
对浓缩后蛋白Western Blot检测，一抗选用鼠抗His标签抗体(货号D191001，生工)，二抗选用HRP标记兔抗鼠IgG多克隆抗体(货号D110097，生工)，以检测浓缩后的蛋白上清是否为含His标签的目的OmpP2蛋白。结果如图1B所示，四个浓缩后的蛋白都能够和抗His标签抗体特异性结合，说明浓缩后上清的主要蛋白为我们需要的目的重组OmpP2蛋白。然后对浓缩后的重组蛋白进行SDS-PAGE检测，结果如图1A所示，复性浓缩所得的重组蛋白分子量大小在44.3KDa左右，基因I型的3个重组蛋白大小相似，基因II型的重组蛋白条带分子量大小稍高于基因I型。经过检测，浓缩后rP2-I1、rP2-I2、rP2-I3、rP2-II重组蛋白的浓度分别是2.9mg/mL、5.8mg/mL、5mg/mL、1.9mg/mL；纯度分别为90％、94.6％、93.2％、88.4％；复性率分别为48.3％、68.6％、56.9％和34.4％。均达到作为抗原免疫动物的纯度和浓度要求。
在本实施例中，还可以使用其他方法制备得到的副猪嗜血杆菌重组外膜蛋白OmpP2，或直接购买纯化的副猪嗜血杆菌重组外膜蛋白OmpP2。
制备重组外膜蛋白OmpP2的单克隆抗体
1.小鼠免疫
选择6只6周龄的纯系雌性BALB/c小鼠(购自广东省医学实验动物中心)，分为2组(3只/组)，分别用浓缩的重组rP2-I2和rP2-II蛋白作为抗原免疫各组小鼠。将两基因型重组蛋白用PBS稀释至终浓度为0.5mg/mL，并与完全福氏佐剂(CFA，货号F5881，默克生命科学技术有限公司)等体积混匀乳化后，小鼠腹腔皮下多点注射，进行初次免疫；每只小鼠总共注射200μL乳化悬液，即每只小鼠100μg抗原。
初次免疫后2周，将重组rP2-I2和rP2-II蛋白分别与非完全福氏佐剂(货号F5506，默克生命科学技术有限公司)乳化后，同样腹部皮下多点注射；进行常规免疫，每只小鼠注射50μg抗原蛋白。
2周后，取少许小鼠尾静脉血，离心获得血清。用免疫用的重组rP2-I2和rP2-II蛋白包被，用间接ELISA检测血清中的抗体效价，效价高于1:12800时即可进行融合前加强免疫。融合前3天分别对两组中效价最高的小鼠直接腹腔注射含50μg对应重组蛋白的PBS缓冲液加强免疫，注意这次抗原无需乳化。
2.细胞融合
加强免疫后第3天，眼角取血后断颈处死上述已免疫的BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞(购自广州华拓生物科技有限公司)按3:1在50％ PEG1450融合剂(货号E607052，生工)下融合，融合后以HAT选择培养基(货号H0262，默克生命科学技术有限公司)铺板置于37℃5％ CO2培养。
在本实施例中，还可以使用其他实验动物，取免疫后脾脏与对应的瘤细胞融合获得该动物种属的杂交瘤细胞。
3.阳性克隆筛选及克隆
分别利用重组rP2-I2或rP2-II蛋白包被酶标板，以间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株，将阳性孔扩大培养后，用有限稀释法进行细胞克隆，经过3次克隆获得多株能稳定传代并分泌抗rP2-I2或rP2-II蛋白的特异性单克隆抗体细胞株。
基因型特异性单克隆抗体的筛选鉴定
1)单克隆抗体细胞株上清与重组OmpP2蛋白的间接ELISA
为筛选基因型特异性单克隆抗体，我们以不同基因型的重组OmpP2为抗原进行ELISA检测，如果抗体只和某一种基因型的蛋白结合，则定义为该基因型的特异性单克隆抗体。分别以重组的OmpP2蛋白rP2-I1、rP2-I2、rP2-I3、rP2-II为抗原包被酶标板，包被浓度为5μg/mL，每孔100μL 4℃包被过夜；第二天PBST洗涤3次后，每孔加入200μL含4％ BSA的PBS，37℃培养箱封闭2小时；随后PBST洗涤3次，每孔加入50μL抗体稀释液(含1％ BSA的PBST)，然后加入对应的待检测单克隆抗体细胞株上清50μL，作为一抗37℃孵育1小时；然后PBST洗涤5次，加入1:10000抗体稀释液稀释的HRP标记兔抗鼠IgG抗体(货号D110097，生工)为二抗，每孔100μL，37℃孵育45min；PBST洗涤5次后，加入100μL先配置的TMB显色液(货号C520026，生工)，每孔100μl，37℃避光显色20min，最后每孔加入50μl 2M H2SO4终止反应。使用Thermo Multiskan GO全波长酶标仪测量450nm波长下每孔的光密度(OD)。以免疫P2-I2蛋白的小鼠血清作为阳性对照，阴性对照为非洲猪瘟病毒P30蛋白的杂交瘤细胞上清，阳性的判定标准为：以阴性对照OD450nm值的2.1倍为阈值，各待测孔OD450nm值(S)与阈值(CO)对比，计算S/CO。以S/CO值大于1的为阳性。
结果如图2所示，来自rP2-I2免疫小鼠的单克隆抗体细胞株1A10和2C5只和基因I型的重组蛋白具有产生阳性反应，与基因2型的rP2-II不反应，是株基因I型型特异性单克隆抗体。其中单抗1A10可与基因I型的rP2-I1和rP2-I2反应，但不与rP2-I3不反应；单抗2C5则只与rP2-I2反应，与rP2-I1和rP2-I3都不反应。另外，来自rP2-II免疫小鼠的单克隆抗体细胞株2F1和5F1只和rP2-II产生阳性反应，与基因I型的rP2-I1、rP2-I2、rP2-I3不反应，是基因II型型特异性单克隆抗体。
2)单克隆抗体细胞株上清与重组OmpP2蛋白的Western Blot检测重组OmpP2蛋白按1:1加入2×蛋白质上样缓冲液(货号：C508319，生工)，沸水煮沸10min，12000rpm离心5min，取上清10μl进行SDS-PAGE电泳，其中分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％。电泳结束后将分离的条带电转移至PVDF膜(货号:03010040001，罗氏集团)。转印后的PVDF膜在含5％脱脂奶粉TBST中4℃封闭过夜。第二天将单克隆抗体的细胞上清与TBST 1：1稀释作为一抗，室温震荡孵育1h，TBST洗膜三次，每次震荡洗涤10min；辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鼠IgG作为二抗孵育1h，TBST洗膜5次，每次震荡洗涤8min，然后使用ECL显色液(货号：WBKLS0100，默克生命科学技术有限公司)发光显影。试验中以非洲猪瘟的P30蛋白作为抗原的阴性对照。
试验结果如图3所示，单抗1A10能够与变性后的rP2-I1、rP2-I2蛋白都结合，而不与rP2-I3、rP2-II和阴性对照P30蛋白反应，既单抗1A10识别的是rP2-I1、rP2-I2蛋白上相同的B细胞线性表位，而这个表位在rP2-I3、rP2-II中不存在或者存在差异，即该表位可能是基因I型特异性表位。相似的，单抗2C5只与rP2-I2结合，但不与rP2-I1、rP2-I3、rP2-II和阴性对照P30结合，即单抗2C5识别的是rP2-I2蛋白上的B细胞表位，而这个表位在rP2-I1、rP2-I3、rP2-II不存在或者存在差异。
另外，结果还显示单抗2F1和单抗5F1只和变性后的rP2-II蛋白结合，而和rP2-I1、rP2-I2、rP2-I3蛋白不结合，说明单抗2F1和单抗5F1识别的是rP2-II蛋白中特有的B细胞线性表位，并且可能是基因II型特异性表位。
3)单克隆抗体细胞株上清与天然OmpP2蛋白的ELISA及Western Blot检测
对患病猪鼻腔分离的副猪嗜血杆菌DT3株和ZS7株的外膜进行提取，具体的步骤如下：挑取单菌落至10mL TSB培养基(含10％马血清和50μg/mL NAD)中，37℃厌氧培养过夜；隔天按照1：100比例接种于200mL TSB培养基(含10％马血清和50μg/mL NAD)37℃，180rpm/min扩大培养。待培养到一定浓度时收集菌体，用20mL PBS重悬菌体，5000rpm/min离心洗涤3次，去除培养基中残余蛋白；加入10mL TE(PH＝7.8)重悬菌体，然后加入50μL溶菌酶(20mg/mL)37℃摇床(50rpm)孵育30min；加入400μL 1M氯化镁，12μLDNA酶(25mg/mL)，15μLRNA酶(20mg/mL)，37℃37℃摇床(50rpm)孵育1h；5000rpm/min离心20min收集沉淀，10mL TE(PH＝7.8)重悬沉淀后5000rpm/min离心洗涤，重复洗涤1次；加入10mL TEX缓冲液(含2％Triton X-100的TE PH＝7.8)重选沉淀，然后加入100μL胰酶(100ng/mL)37℃消化30min；5000rpm/min离心20min收集沉淀，10mL PBS重悬洗涤沉淀，5000rpm/min离心15min；去上清，沉淀加入5mL含0.25％ SLS的HEPES(PH＝7.4)充分溶解沉淀，即为提取的OmpP2蛋白悬液。经序列测序发现，两分离菌的外膜OmpP2蛋白都是基因I型的蛋白。使用提取的外膜蛋白悬液作为抗原，各基因型特异性单抗分别作为一抗进行ELISA及Western Blot检测；结果如图4和图5显示，单抗1A10与菌株DT3和ZS7的天然外膜蛋白的ELISA和WB都出现阳性反应，并且WB显示不与其它的外膜蛋白产生交叉反应；而单抗2C5、2F1、5F1都不与这两各基因I型蛋白反应，同时也不与副猪嗜血杆菌其它的外膜蛋白发生交叉反应。
重叠多肽初步筛选基因型特异性抗体识别的抗原表位
根据rP2-I2的测序获得的蛋白序列设计重叠多肽，每条肽长度为21-24个氨基酸，相邻多肽之间重叠8个氨基酸，共21条。另外根据rP2-I2蛋白序列中多出的插入片段，设计了3条多肽，具体序列如表1所示(其中Pt10由于序列结构合成未成功)，所有多肽都由生工合成。为初步筛选出各单抗识别的表位，我们将多肽分为了10个肽池，具体分组如表2所示，这样阳性的X肽池和Y肽池交叉就能快速确定阳性多肽，具体如表3所示。以各肽池作为抗原进行包被，每条多肽包被浓度均为5μg/mL，进行Peptide-ELISA检测。具体步骤与重组蛋白的间接ELISA相似，结果如图6A显示，单抗1A10可以和Pool X5与Pool Y1都产生阳性反应，而这两个肽池的交叉多肽是Pt5，随后将Pt5、与Pt5存在重叠的多肽Pt4和Pt6作为抗原进行Peptide-ELISA(图7A)，显示单抗1A10只与Pt5产生阳性反应，而不与相邻的Pt4、Pt6反应。即单抗1A10所识别的B细胞线性表位的关键序列存在于多肽Pt5中(74-81aa)，而不在与Pt4或Pt6相重叠的序列中。同时结果(图6B)还显示，单抗2C5可以和Pool X1与Pool Y3都产生阳性反应，而这两个肽池的交叉多肽是Pt11，随后将Pt11、与Pt11存在重叠的多肽Pt12作为抗原进行Peptide-ELISA，发现单抗2C5不与Pt12反应，说明单抗2C5所识别的B细胞线性表位的关键序列存在于多肽Pt11中(161-184aa)，而不在与Pt12相重叠的序列中。
另外，肽池peptide-ELISA还显示单抗2F1和5F1与基因I型多肽组成的所有肽池都不存在阳性反应，进一步证明单抗2F1和5F1识别的是基因II型OmpP2蛋白的型特异性表位。
表1.OmpP2重叠多肽的序列
表2.多肽分组及肽池信息
表3.交叉肽池所对应的多肽
单抗1A10及2F1识别的基因型特异性表位序列的确定及保守性分析
为进一步确定OmpP2蛋白65-88氨基酸的基因型特异性，并筛选基因型特异性单克隆抗体，我们对rP2-I3、rP2-II重组蛋白中该位置的差异序列进行合成，分别为Pt5-I3：YETRLDSNSENAAGWGDVKTKYAY(SEQ ID NO：31)，Pt5-II：YETRLGSGSKNAAKWGDVTTDEA(SEQ IDNO：2)。分别以Pt5、Pt5-I3和Pt5-II为抗原包被进行Peptide-ELISA，结果如图7所示，单抗1A10只与基因I型的Pt5反应，而与基因I型的Pt5-I3以及基因II型的Pt5-II多肽不反应，说明单抗1A10识别表位的关键氨基酸只存在于Pt5，并且是与Pt5-I3及Pt5-II的差异氨基酸中。而rP2-II免疫后小鼠融合获得的单抗2F1识别的是基因II型蛋白中的同源序列多肽Pt5-II，并且与基因I型蛋白中的同源序列多肽Pt5和Pt5-I3不反应，说明单抗2F1识别表位的关键氨基酸存在于Pt5-II与Pt5及Pt5-I3的差异氨基酸中。
对rP2-I1、rP2-I2、rP2-I3、rP2-II 4个重组蛋白和DT3、ZS7及国内外各血清型代表株的OmpP2蛋白序列进行多重比对，结果如图8所示，显示所有OmpP2蛋白内65-88氨基酸对应的序列在不同菌株之间具有多态性，可以分为3簇，簇内的序列都比较相似。3簇序列显示出明显的基因型特异性，第1和2簇都是基因I型，而第3簇只有NO.4菌株的序列为基因I型，其余的都是基因II型的蛋白序列。经过查找，与NO.4菌株序列具有相同突变的序列在数据库中只有4条，为罕见序列；而且都是外国分离株，在中国不存在相同的突变序列。所以OmpP2蛋白内65-88氨基酸存在一个基因型特异性的B细胞线性表位，可以用来区分OmpP2蛋白的基因I型和基因II型。同时与这些基因型特异性表位结合的单克隆抗体也同样具有基因型特异性，比如单抗1A10就能够特异性识别第1簇中的rP2-I1、rP2-I2、DT3、ZS7的表位，说明单抗1A10识别的关键氨基酸可能是第1簇中保守的70GR71、D76、G78和T83；而高频突变的85、86位氨基酸并不是关键氨基酸，其突变不影响抗体对差异表位的结合；所以单抗1A10可以特异性识别第1簇中的所有序列，为基因I型特异性抗体。另外，单抗2F1能够识别第3簇中的rP2-II序列，结合第1簇中85、86位氨基酸突变不影响表位结合，所以可以推测出单抗2F1可能识别所有第3簇的序列，为基因II型特异性抗体。由于并没有使用rP2-I3作为抗原免疫小鼠，所以未能筛选出能够与Pt5-I3特异性结合的单克隆抗体，但结合Pt5和Pt5-II的情况，我们可以推测出Pt5-I3代表的第2簇所有同源序列多肽同样也是基因型特异性的表位，也能够诱导产生基因型特异性抗体。
再结合图8中代表株致病性的分布，可以看出基因I型(20/20)的菌株都为高致病株和中等毒株，而基因II型(10/10)都为弱毒株或者无毒株，所以OmpP2蛋白65-88氨基酸代表的表位不仅可以用来区分基因型，也可以用来区分感染菌株的致病性。同样的，该区域表位对应的单克隆抗体不仅可以用于区分基因型，也可以用来区分致病性。
单抗2C5及5F1识别的基因型特异性表位序列的确定及保守性分析
为进一步确定Omp P2蛋白161-184氨基酸的基因型特异性及表位的关键氨基酸，并筛选基因型特异性单克隆抗体，我们对rP2-I2重组蛋白中该位置的序列进行B细胞线性表位预测。根据结果和Pt11序列设计了一条新序列Pt11a，序列为NYNVANERDNKGEVKVDSTKSGFGLGA(SEQ ID NO：3)，并对Pt11的序列进行截短，设计两条短肽，分别为Pt11b：NERDNKGEV(169-177aa，SEQ ID NO：32)和Pt11c：VKVDSTKS(177-184aa，SEQID NO：33)。分别以Pt11、Pt11a、Pt11b和Pt11c为抗原包被进行Peptide-ELISA，结果如图7所示，单抗2C5不仅和Pt11反应，而且可与Pt11a反应，说明Omp P2-2C5抗体识别表位的关键氨基酸位于Pt11和Pt11a的重叠氨基酸中，即第164-184氨基酸中。但在对截短多肽的ELISA检测中发现单抗2C5与Pt11b和Pt11c都不反应，说明截短后的多肽丢失了部分关键氨基酸，破坏了表位的完整性。我们的结果还显示，单抗2C5与Pt11a的S/CO值高于Pt11，反映出Pt11a的表位完整性更好。
另外，同样对Omp P2蛋白序列中与Pt11及Pt11a的同源序列进行多重比对，结果如图9所示，显示Pt11及Pt11a对应的序列在不同菌株之间具有多态性，同样出明显的基因型特异性。根据基因II型rP2-II的序列特点，我们有设计了一条代表基因II型特点并与Pt11a表位相似的多肽Pt11a-II：NYNVANEREKADVKVDSIKSGFGLGA(SEQ ID NO：4)。Peptide-ELISA结果(图7)显示，基因II型特异性抗体5F1可以和Pt11a-II结合，但不和基因I型的Pt11、Pt11a、Pt11b及Pt11c结合。而单抗2C5能够与Pt11a结合但不和Pt11a-II结合。说明单抗2C5为基因I型特异性抗体，识别的是基因I型特异性表位Pt11a，而单抗5F1是基因II型特异性抗体，识别的是基因II型特异性表位Pt11a-II；表位的关键氨基酸极有可能就在差异氨基酸173N/K及182T/I。
再结合图9中代表株致病性的分布，同样显示Pt11a和Pt11a-II含有的表位及对应的单抗不仅可以用来区分基因型，也可以用来区分感染菌株的致病性。
基因型特异性表位多肽检测阳性鼠血清
将Pt5、Pt5-I3、Pt5-II、Pt11a、Pt11a-II表位多肽分别作为抗原，5μg/mL包被过夜；rP2-I2、rP2-II免疫后小鼠的血清(融合前收集)作为一抗，HRP标记兔抗鼠IgG抗体为二抗进行ELISA检测；并且对鼠血清进行梯度稀释检测鼠血清中各表位多肽IgG抗体的效价，设定为2倍梯度稀释，稀释倍数范围为1:50～1:12800。
同源表位Pt5、Pt5-I3、Pt5-II结果如图10所示，rP2-I2重组蛋白免疫后的鼠阳性血清含有识别Pt5表位的特异性抗体，效价可以达到1:12800以上，反映出Pt5表位在OmpP2蛋白中具有较强的免疫原性。不过虽然效价高，但不与Pt5-I3和Pt5-II结合，反映出Pt5表位诱导出的抗体具有较强的基因I型特异性。另外，rP2-II重组蛋白免疫后的阳性血清含有识别Pt5-II表位的特异性抗体，效价可以达到1:3200，也反映出Pt5-II表位在OmpP2蛋白中具有一定的免疫原性；同时这个阳性血清不与Pt5和Pt5-I3结合，反映出Pt5-II表位诱导出的抗体具有较强的基因II特异性。
同源表位Pt11a和Pt11a-II结果如图11所示，rP2-I2重组蛋白免疫后的阳性血清含有识别Pt11a表位的特异性抗体，但效价较低，只有1:50；另外不具有Pt11a-II表位的抗体。反映出Pt11a表位在Omp P2蛋白中具一定的免疫原性；能够诱导产生基因I型特异性的抗体。rP2-II重组蛋白免疫后的阳性血清含有识别Pt11a-II表位的特异性抗体，效价可以达到1:400，但不含有抗Pt11a表位的抗体。反映出Pt11a-II表位在Omp P2蛋白中具有一定的免疫原性，能够诱导宿主产生基因II型特异性抗体。
基因型特异性表位多肽与猪血清样品ELISA
将Pt5、Pt5-I3、Pt5-II、Pt11a、Pt11a-II表位多肽分别作为抗原，5μg/mL包被过夜；抗副猪嗜血杆菌抗体阳性的猪血清为一抗，HRP标记兔抗猪IgG抗体为二抗(货号：D111051，生工)进行ELISA检测。其中阳性猪血清58份，都是商品化副猪嗜血杆菌抗体ELISA试剂盒(购自深圳子科生物科技有限公司)检测为阳性的血清，检测时1:400稀释作为一抗与表位多肽进行孵育。结果如表4所示，58份子科生物检测阳性样品中，Pt5、Pt5-I3、Pt5-II、Pt11a、Pt11a-II表位多肽检出阳性样品分别是3、15、9、10、29份，阳性检出率为5.17％、25.86％、15.51％、17.24％、50％。说明含有这些基因型特异性表位的副猪嗜血杆菌感染猪之后也能够诱导产生对应的基因型特异性抗体。而我们也可以通过检测这些同源基因型特异性的表位或抗体，来实现对菌株基因型和致病性的初步判断；包括Pt5、Pt5-I3、Pt5-II为一组的同源特异性表位，或Pt11a、Pt11a-II为一组的同源特异性表位。另外可以证明基因I型特异性表位可以用于亚单位疫苗的研制，这样就能够实现在预防致病性菌株感染的同时不损伤呼吸道内正常寄生的副猪嗜血杆菌常在菌。
表4.副猪嗜血杆菌病猪阳性血清检测
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，则本发明也意图包含这些改动和变形。

Claims (6)

1.一种副猪嗜血杆菌Omp P2蛋白，其特征在于：所述副猪嗜血杆菌Omp P2蛋白包括基因I型蛋白B细胞线性表位，所述表位序列为YETRLGRNSKNDAGWGDVTTDEAY，处于成熟基因I型Omp P2蛋白序列的第65-88氨基酸。
2.一种副猪嗜血杆菌Omp P2蛋白，其特征在于：所述副猪嗜血杆菌Omp P2蛋白包括基因II型B细胞线性表位，所述表位序列为YETRLGSGSKNAAKWGDVTTDEAY，处于成熟基因II型Omp P2蛋白序列的第65-88氨基酸。
3.一种具有OmpP2蛋白基因I型特异性的同源多肽，其特征在于：所述同源多肽由成熟副猪嗜血杆菌基因I型OmpP2蛋白中第65-88氨基酸组成，所述同源多肽的氨基酸序列包括但不限于YETRLGRNSKNDAGWGDVTTEKAY，YETRLGRNSKNDAGWGDVTTEEAY，YETRLGRNSKNDAGWGDVTTEENAY。
4.一种副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白，其特征在于：所述副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白包括基因I型特异性B细胞线性表位，所述表位序列为NYNVANERDNKGEVKVDSTKSGFGLGA，处于成熟基因I型OmpP2蛋白序列的第164-190氨基酸。
5.一种副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白，其特征在于：所述副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白包括基因II型特异性B细胞线性表位，所述表位序列为NYNVANEREKADVKVDSIKSGFGLGA，处于成熟基因II型OmpP2蛋白序列的第180-205氨基酸。
6.权利要求1、2、3、4、5所述副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白及同源多肽在副猪嗜血杆菌病诊断、预防或制备副猪嗜血杆菌病试剂或药物中的应用。
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