CN103596975A - 针对狂犬病病毒的重组人二价双链抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了针对狂犬病病毒的重组人二价双链抗体及其制备方法，所述双链抗体能识别狂犬病病毒糖蛋白并中和狂犬病病毒。本发明还提供了编码重组二价双链抗体的多核苷酸。本发明公开的二价双链抗体还可用于量化狂犬病病毒糖蛋白以评价疫苗质量并预期疫苗效能。
Description
发明领域
本发明涉及免疫学领域，特别涉及产生重组抗体片段。本发明具体地涉及产生针对狂犬病病毒的重组人二价双链抗体蛋白。
发明背景
狂犬病是包括人类在内的恒温动物的神经系统的必定致命的病毒感染。其通过受感染的动物的咬伤而传播，通常来自狗的咬伤(Jackson,A.C.,(2003).Rabies virus infection:an update.Journal for Neurovirology,9;253-258)。估计每年在印度有两百五十万至三百万人需要暴露后疫苗接种(Hemachudha T,Phuapradit P.(1997).Rabies.Current Opinion inNeurology.10;260-267)。已描述了狂犬病疫苗的效能测定，其涉及小鼠体内测试的应用(WHO，1992)和基于对狂犬病病毒糖蛋白进行评估的体外方法(Perrin等人，(1990).In vitro rabies vaccine potency appraisalby ELISA:advantages of the immunocapture method with a neutralizinganti-glycoprotein monoclonal antibody,Biologicals.18:321-330,Nagarajan等人(2006),Molecular Epidemiology of Rabies Virus Isolatesin India Journal of Clinical Microbiology.44(9):3218-3224)。用于评估狂犬病病毒糖蛋白的单克隆抗体的应用涉及从杂交瘤细胞系产生抗体，该过程是昂贵的且需要复杂的生物过程。重组抗体片段(例如二价双链抗体)的应用将克服这些限制并提供狂犬病病毒糖蛋白检测所必需的均匀、纯净的试剂。
发明目的
本发明的第一个目的在于提供能够识别狂犬病病毒糖蛋白的重组人二价双链抗体蛋白。
本发明的第二个目的在于提供产生对狂犬病病毒糖蛋白为特异性的重组人二价双链抗体的方法。
本发明的第三个目的在于开发用于量化狂犬病病毒糖蛋白的ELISA。
发明简述
本发明的一方面提供了具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体，其中所述双链抗体与狂犬病病毒结合并中和所述病毒。
本发明的另一方面提供了编码重组人二价双链抗体的多核苷酸，其中所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。
附图简述
图1示出PCR扩增的可变重链(A)、可变轻链(B)和组装的双链抗体产物(C)的电泳分析。从分离自异源杂交瘤的总RNA扩增这些基因序列，所述异源杂交瘤分泌完全人单克隆抗体；泳道：M-分子量标记物、VH-可变重链、VL-可变轻链和D-组装的双链抗体产物。
图2示出纯化的二价双链抗体的SDS-PAGE分析。通过考马斯亮蓝染色来测定纯化的蛋白，并且通过与蛋白分子量标记物一同运行而测定为27KDa。
图3示出在柱色谱之后获得的纯化的二价双链抗体馏分的免疫印迹分析。该印记与对二价双链抗体的组氨酸标签为特异性的组氨酸探针反应。测定到27kDa的蛋白带。
道：第1-5道，从二价双链抗体的柱色谱纯化获得的馏分；M道：预染色的分子量标记物。
图4示出使用二价双链抗体的免疫捕获ELISA。试样B包含M5B4(抗狂犬病鼠科单克隆抗体)、PV Ag(Pasteur病毒抗原)、D06(二价双链抗体)和组氨酸探针，试样A和C为阴性对照。A没有双链抗体，并且C没有PV Ag。
A→M5B4+PV Ag+组氨酸探针
B→M5B4+PV Ag+D06+组氨酸探针
C→M5B4+D06+组氨酸探针
图5示出使用二价双链抗体和抗狂犬病鼠科单克隆抗体(M5B4)的竞争性ELISA。A包含PV Ag、大肠杆菌溶解产物、M5B4(抗狂犬病鼠科单克隆抗体)和抗小鼠HRP。B没有大肠杆菌溶解产物。
图6示出表示克隆的二价双链抗体片段的载体图。
图7示出在蛋白A琼脂糖柱上的亲合纯化之后，由异源杂交瘤克隆分泌的人单克隆抗体的SDS-PAGE分析。抗体与作为标准的BSA一同运行。
图8示出包含克隆到pET 28a细菌表达载体的EcoRI和NotI位点之间的双链抗体基因的构建的载体的示意图。
图9：(a)示出双链抗体与通过免疫印迹分析转移至PVDF膜上的狂犬病病毒结构蛋白的特异性结合；
(b)示出狂犬病病毒结构蛋白的SDS-PAGE分析。
图10示出通过免疫反应性分析的双链抗体的结合特异性；(1)阳性对照(Mab(小鼠单克隆抗体)，M5B4)，(2)双链抗体以及(3)阴性对照，大肠杆菌溶解产物。
图11a和11b：
(a)对于通过MAb M5B4-D06IC-ELISA和实际NIH效力值(IU)评估的GP含量，通过origin分析而回归的线拟合图。(b)对于通过MAb M5B4IC-ELISA和实际NIH效力值(IU)评估的GP含量，通过origin分析而回归的线拟合图。
发明详述
本文所用的术语“双链抗体”是指工程化的抗体和/或抗体片段，其为通过二聚化两种可变重片段-可变轻片段而产生的二价、单特异性或双特异性分子。
本文所用的术语“二价”是指具有两个抗原结合位点的抗体和/或抗体片段，所述两个抗原结合位点能以极大的亲合力与相同或不同抗原的两个分子结合。
本发明提供了产生针对狂犬病病毒的重组二价双链抗体的方法。本发明还提供了二价双链抗体狂犬病、包含所述二价双链抗体片段的组合物及其用途。本发明公开的二价双链抗体片段识别狂犬病病毒糖蛋白。
使用由人X小鼠异源杂交瘤分泌的完全人单克隆抗体的基因序列，构建二价双链抗体。
本发明涉及开发针对狂犬病病毒糖蛋白为反应性的二价双链抗体片段及其在开发用于量化狂犬病病毒糖蛋白的ELISA中的用途，所述二价双链抗体片段从异源杂交瘤(人X小鼠)构建并具有两个抗原结合位点。
本发明提供了从异源杂交瘤产生重组二价双链抗体片段结构的方法及其在量化狂犬病糖蛋白中的用途。通过使由人X小鼠异源骨髓瘤介导的人免疫B细胞永生化来产生异源杂交瘤(Champion等人(2000).The development of monoclonal human rabies virus-neutralizingantibodies as a substitute for pooled human immune globulin in theprophylactic treatment of rabies virus exposure,Journal of ImmunologicalMethods 235(1-2):81-90)。
在本发明中，从异源杂交瘤构建重组二价双链抗体，并且该重组双链抗体用于开发在疫苗生产中量化狂犬病病毒糖蛋白所用的ELISA。
从异源杂交瘤分离总RNA并且通过RT-PCR合成cDNA。通过PCR分别扩增编码重链和轻链的可变结构域的DNA，并且通过剪接重叠延伸聚合酶链反应(SOE PCR)由短连接物组装入双链抗体。检验重组双链抗体的序列并克隆入pET 28a载体并转移进入大肠杆菌(E.coli)菌株(BL21-DE3)细胞，以用于双链抗体的可溶表达。使用固相金属亲合色谱法纯化可溶双链抗体蛋白。使用狂犬病病毒糖蛋白检查纯化蛋白的抗原结合活性，并发现与母体抗体几乎相同。
本发明还提供了本发明所公开的重组双链抗体在疫苗生产中测定和量化狂犬病病毒糖蛋白的用途。
在本发明中，从异源杂交瘤构建的重组人双链抗体是一种由缺乏恒定区域的两种抗原结合位点组成的最小重组双特异性抗体，并且因此提供了与母体抗体类似的对靶抗原的高结合亲合力和特异性。
本发明所公开的重组二价双链抗体可以在细菌中过表达，并且以低成本批量产生，从而保证恒定且良好表征的特异性试剂的供给，以量化能用于评价疫苗的效能的狂犬病病毒糖蛋白。
根据本发明，在一个实施方案中，提供了具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体，其中所述双链抗体与狂犬病病毒结合并中和所述病毒。
本发明的另一实施方案提供了具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体，其中所述双链抗体与狂犬病病毒结合并中和所述病毒，其中所述狂犬病病毒选自基因型(GT)1(GT1)(PV,FluryLEP,SAD,CVS-11)、GT4{杜文黑基病毒(DUV)}和GT7{澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒(ABLV)}。
本发明的另一实施方案提供了具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体，其中所述双链抗体与狂犬病病毒结合并中和所述病毒，其中所述双链抗体为单克隆抗体。
本发明的另一实施方案提供了具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体，其中所述双链抗体与狂犬病病毒结合并中和所述病毒，其中所述双链抗体为完全人单克隆抗体。
本发明的另一实施方案提供了具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体，其中所述双链抗体与狂犬病病毒结合并中和所述病毒，其中所述双链抗体为单特异性单克隆抗体。
本发明的另一实施方案提供了编码重组人二价双链抗体的多核苷酸，其中所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。
本发明的另一实施方案提供了编码重组人二价双链抗体的多核苷酸，其中所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体。
本发明的又一实施方案提供了重组DNA表达盒，其包含编码重组人二价双链抗体的多核苷酸，其中所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示，其中所述多核苷酸可操作地连接于启动子。
本发明的又一实施方案提供了重组载体，其包含重组DNA表达盒，所述表达盒包含编码重组人二价双链抗体的多核苷酸，其中所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示，其中所述多核苷酸可操作地连接于启动子。
本发明的又一实施方案提供了重组宿主细胞，其包含DNA表达盒，所述表达盒包含编码重组人类二价双链抗体的多核苷酸，其中所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。
本发明的又一实施方案提供了宿主细胞，其选自大肠杆菌、酵母和CHO细胞。
本发明还提供了组合物，其包含具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体，其中所述双链抗体与狂犬病病毒结合并中和所述病毒。
本发明还提供了组合物，其包含具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体和药物可接受的载体，其中所述双链抗体与狂犬病病毒结合并中和所述病毒。
本发明还提供了疫苗组合物，其包含具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体或SEQ ID NO:25所示的多核苷酸序列。
本发明还提供了疫苗组合物，其包含具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体。
本发明的另一实施方案还提供了治疗性生物组合物，其包含具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体或具有SEQ IDNO:25所示核苷酸序列的多核苷酸。
此外，在本发明的另一实施方案中，提供了用于评估狂犬病病毒糖蛋白的试剂盒，其中所述试剂盒包括具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体。
本文还提供了用于治疗狂犬病病毒相关的疾病和/或病症的方法，其中所述方法包括向有需要的个体给予有效量的具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体。
本发明还提供了对于有需要的个体，具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体在制备用于治疗狂犬病相关的疾病或病症的药物中的用途。
本发明的又一实施方案提供了具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体，其中所述双链抗体在细菌中产生。
本发明的另一实施方案提供了具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体，其中所述双链抗体与狂犬病病毒糖蛋白结合。
本发明的另一实施方案提供了具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体，其中所述双链抗体与狂犬病病毒糖蛋白G结合。
本发明的又一实施方案提供了用于评估狂犬病病毒糖蛋白的测试试剂盒，其中所述试剂盒包含由SEQ ID NO:25所示多核苷酸编码的重组人二价双链抗体。
双链抗体保留了在疫苗制剂中量化RV GP的前景，这种量化与NIH小鼠效能良好相关。通过基于双链抗体的IC-ELISA检测的各种疫苗批次表现出与NIH小鼠效力研究的良好相关性，如基于MAb-M5B4的IC-ELISA所示(Nagarajan等人2006,WHO 1988)。使用基于双链抗体的IC-ELISA对RV GP的量化提供了疫苗制剂以及过程控制样品中的天然折叠RV GP抗原的准确信息，其能实现RV GP的可靠评估。该研究中描述的方法通过使用双链抗体提供了用于量化疫苗制剂中的RV GP而不损失抗原的简单、新型且有效的选择，有助于高质量疫苗的制备，这能降低成本并使得在狂犬病预防和控制受到挑战的发展中国家中疫苗变为能够负担得起的。基于双链抗体的IC-ELISA由于更好的试剂稳定性和易于生产而能够代替基于MAb的IC-ELISA。
实施例
应理解本文所述的下列实施例仅为例示目的，并且基于本说明书的各种修改或改变对于本领域技术人员而言是有启发性的，并且包括在本申请的精神和范围以及随附的权利要求书的范围内。
实施例1
产生人抗狂犬病病毒单克隆抗体的人X小鼠异源杂交瘤细胞
在本发明中使用的狂犬病病毒菌株为文献中描述的巴斯德病毒(PV)菌株。
通过融合人免疫B细胞与人X小鼠异源骨髓瘤来产生人X小鼠异源杂交瘤(Champion等人(2000);The development of monoclonal humanrabies virus-neutralizing antibodies as a substitute for pooled humanimmune globulin in the prophylactic treatment of rabies virus exposure,Journal of Immunological Methods 235(1-2):81-90)。通过融合初次免疫外周血B细胞和异源骨髓瘤细胞系K6H6/B5来发展异源杂交瘤(Carroll等人(1986);Mouse x human heterohybridomas as fusionpartners with human B cell tumors.Journal of Immunological Methods89(1):61-72))。选择K6H6/B5细胞系是因为其已成功地用于克隆人抗病毒抗体(Siemoneit等人(1994).Isolation and epitope characterization ofhuman monoclonal antibodies to hepatitis C virus core antigen.Hybridoma.13(1):9-13;Funaro等人(1999).Identification of a 220-kDamembrane tumor-associated antigen by human anti-UK114 monoclonalantibodies selected from the immunoglobulin repertoire of a cancerpatient.Experimental Cell Research 247(2):441-450)。在融合之前，用美洲商陆丝裂原刺激从人类个体分离的免疫B细胞，所述人类个体多次接种人狂犬病疫苗PVRV(Abhayrab,Human Biologicals Institute,Udhagamandalam)，该疫苗包括已知提供针对狂犬病街毒(SRV)隔离群的广泛覆盖的狂犬病病毒PV菌株(Badrane H,Bahloul C,Perrin P andTordo N(2001).Evidence of two Lyssavirus phylogroups with distinctpathogenicity and immunogenicity,Journal of Virology 75;3268-3276)。使用杂交瘤方法，克隆出8个新的结合狂犬病病毒糖蛋白的人IgG抗体(huMab)。
表征：表征8个新的人IgG抗体(huMab)以测定它们的同种型、特异性和交叉反应性。每一个huMab具有γ1(γ1)重链和λ(λ)轻链同种型(表1)。它们对RV的特异性通过使用不固定空白对照(mock)和RV感染的培养细胞的Cell-ELISA而说明。所有huMab表现出对所有固定RV的反应性，除了BHK-21-适应性CVS菌株(CVS-RV)。huMab没有一个表现出对宿主细胞蛋白的任何反应性(表2)。根据间接ELISA结果(表1)而显而易见的是，huMab与天然形式的全病毒抗原以及纯化的狂犬病病毒糖蛋白特异性结合，并且不与狂犬病病毒核蛋白反应。通过如其它文献所述((Nagarajan等人(2006),A simple immuno-captureELISA to estimate rabies viral glycoprotein antigen in vaccinemanufacture,Biologicals.34:21-27)的利用针对抗原位点III的小鼠Mab(D1)的竞争性ELISA所测定，huMab识别狂犬病病毒糖蛋白的抗原位点III。
huMab已被检测了它们在体外和体内中和各种街RV和固定RV的能力。在使用Swiss白化体小鼠的小鼠中和测试(MNT)中，huMab中和所有四种狗来源的印度狂犬病街毒(108、141、142和129)(表3)。所有8种huMab中和四种固定PV菌株，即巴斯德病毒(PV)、Flury LEP、SAD和CVS-11，而当通过快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测时，huMab没有一个中和BHK-21适应性CVS RV(表4)。检测具有最有效RFFIT滴定度的8种huMab中的最佳5种对中和狂犬病病毒属成员的能力。剩余的3种huMab未进行表征，因为它们不具有所需狂犬病病毒中和谱。来自5种huMab中的4种huMab还在RFFIT中有效地中和GT7(ABLV)和GT4(DUV)，尽管没有一种中和GT3(MOKV)或GT5(EBLV-1)(表5)。
实施例2
8种新的人IgG抗体(huMab)克隆的筛选
通过利用纯化失活狂犬病病毒抗原(PV菌株)的间接ELISA对克隆的特异性人Mab分泌进行筛选。
抗体纯化
通过异源杂交瘤克隆分泌的人单克隆抗体(Mab)已在蛋白A琼脂糖柱上亲合纯化。在凝胶上检查纯化的抗体(图7)。第1道示出作为标准品的BSA，其分子量为66Kda。第2-5道示出分子量为160KDa的纯化R16E5人单克隆抗体。从8种克隆中选择4种的主要标准是RFFIT所测定的狂犬病病毒中和谱。
确认异源杂交瘤细胞产生人抗狂犬病病毒单克隆抗体的检测
进行诸如间接ELISA、细胞ELISA、RFFIT和MNT的几个检测以确认由异源杂交瘤细胞分泌的huMab的狂犬病病毒特异性。
间接ELISA
通过间接ELISA对huMab的狂犬病全病毒抗原特异性活性进行筛选。用碳酸盐缓冲液中的带状纯化狂犬病全病毒抗原(1:100稀释)在2-8°C下过夜涂覆ELISA板。用PBST洗涤板三次，并且用1％牛明胶(bovine gelatin)封闭未饱和位点。用huMab探测涂在固相上的抗原，并且用山羊抗人IgG过氧物酶轭合物，然后添加TMB生色底物来测定免疫复合物的存在。在用1.25M H2SO4停止显色反应之后，在450nm波长处对板进行读数。生长培养基和免疫小鼠血清分别用作阴性对照和阳性对照。结果在表1中提供。从结果中明显地，huMab表现出狂犬病全病毒抗原特异性活性。
细胞ELISA
使用狂犬病病毒(PV菌株)感染的和空白对照感染的VERO单层细胞培养物，通过细胞ELISA筛选huMab的狂犬病病毒特异性活性。在用70％冷丙酮固定细胞层之后，使用1％牛明胶封闭未饱和位点。用PBST洗涤板三次，然后用huMab探测固定的细胞层。用山羊抗人IgG过氧化物酶轭合物，然后添加TMB生色底物来测定免疫复合物的存在。生长培养基和免疫小鼠血清分别用作阴性对照和阳性对照。结果在表2中提供。从结果中明显地，huMab表现出狂犬病病毒特异性活性而基本没有与宿主细胞蛋白的任何交叉反应性。
RFFIT
通过RFFIT筛选huMab的对中和狂犬病病毒固定菌株的能力。热失活huMab，然后通过在37°C下孵育90分钟，引起与50FFD50的狂犬病病毒(CVS-11菌株)的中和反应。孵育之后的混合物中未中和的病毒的存在是通过以下测定的：将混合物与指示剂细胞系(MNA细胞系)一同接种并孵育20小时。用70％冷丙酮固定细胞层并用兔抗狂犬病病毒核蛋白壳IgG-FITC轭合物探测，以表明狂犬病病毒的存在。来自NIBSC,UK的已知滴定度的人类血清用作内参照标准。结果在表4中提供。从结果中明显地，huMab可能表现出狂犬病病毒中和活性。
MNT
通过MNT筛选huMab的对中和狂犬固定病毒和狂犬街病毒的能力。热失活huMab，然后通过在37°C下孵育90分钟，引起与50LD50的狂犬固定病毒或狂犬街病毒的中和反应。通过颅内接种断奶小鼠并每天观察狂犬病征，例如典型的后肢麻痹，持续21天，从而测定孵育后混合物中未中和的病毒的存在。从商业供应商获得的已知滴定度的HRIG用作内参照标准。结果在表3中提供。从结果中明显地，huMab可能表现出中和狂犬病固定病毒和狂犬病街病毒的能力。
实施例3
双链抗体片段的构建
RNA提取和抗体可变域序列的扩增
从抗狂犬病异源杂交瘤(R16E5)分离总RNA并且通过RT-PCR合成DNA。在SEQ ID NO:25中示出扩增的c-DNA的核苷酸序列。RT-PCR扩增的cDNA用作模板利用通用引物以扩增抗体的可变结构域，所述引物具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列。利用重叠延伸PCR通过剪接组装扩增的可变结构域以形成双链抗体，并且克隆进TOPO载体中以用于序列检验(图1A、图1B和图1C)。
用于扩增重链和轻链的可变结构域的引物如下：
人可变重链的正向引物
HuVH1a:SEQ ID NO:1
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG
HuVH2a:SEQ ID NO:2
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTCAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG
HuVH3a:SEQ ID NO:3
GGCGGCGGCGCCTCCGGTGGTGGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG
HuVH4a:SEQ ID NO:4
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG
HuVH5a:SEQ ID NO:5
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC
HuVH6a:SEQ ID NO:6
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG
人可变重链的反向引物
HuJH1-2:SEQ ID NO:7
GGAATTCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC
HuJH3:SEQ ID NO:8
GGAATTCTGAGGAGACGGTGACCATTGTCCC
HuJH4-5:SEQ ID NO:9
GGAATTCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC
HuJH6:SEQ ID NO:10
GGAATTCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTTCC
人可变轻链的正向引物
HuLAM1:SEQ ID NO:11
GCCATGGCGCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC
HuLAM2:SEQ ID NO:12
GCCATGGCGCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC
HuLAM3a:SEQ ID NO:13
GCCATGGCGTCCTATGTGCTGACTCAGCCACC
HuLAM3b:SEQ ID NO:14
GCCATGGCGTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC
HuLAM4:SEQ ID NO:15
GCCATGGCGCACGTTATACTGACTCAACCGCC
HuLAM5:SEQ ID NO:16
GCCATGGCGCAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC
HuLAM6:SEQ ID NO:17
GCCATGGCGAATTTTATGCTGACTCAGCCCCA’
人可变轻链的反向引物
HuJLAM1:SEQ ID NO:18
GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCACCT AGGACGGTGACCTTGGTCCC
HuJLAM2-3:SEQ ID NO:19
GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC
HuJLAM4-5:SEQ ID NO:20
GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCACCTAAAACGGTGAGCTGGGTCCC
用于扩增完整双链抗体片段的引物
可变重链的引物
正向:SEQ ID NO:21
GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTCAGGGTCAGCTGGTGCAG
可变轻链的引物
反向:SEQ ID NO:22
ACCACCACCAGAACCACCACCACCTAGGACGGTCAGCTTGGT
使用来自Invitrogen的thermoscript RT-PCR从总RNA合成的第一链cDNA用作扩增抗体可变结构域的模板。使用通用人可变引物从cDNA扩增可变重链(VH)和轻链(VL)。人可变重链(HuVH)正向引物和人连接重链(HuJH)反向引物用于扩增可变重链。人λ轻链(HuLam)正向引物和人连接轻链(HuJLam)反向引物用于扩增可变轻链。
使用Taq DNA聚合酶通过在标准条件下进行34个循环的PCR，分别扩增编码抗体可变重链(VH)和可变轻链(VL)的cDNA。使用上述如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10列举的引物扩增VH区域，并且SEQ IDNO:11至SEQ ID NO:20所示的引物用于VL区域。使用10μg逆转录产物、3U Taq DNA聚合酶、和1μl VH/VL引物混合物的总体积为50μl的混合物进行PCR。PCR反应条件保持在下列顺序：95°C×5分钟，92°C×1分钟，63°C×1分钟，72°C×1分钟且进行34次循环，以及72°C×10分钟。在通过凝胶电泳量化PCR产物之后，利用重叠延伸PCR通过剪接组装扩增的可变重链和可变轻链。PCR程序以下列顺序安排：95°C×5分钟，92°C×1分钟，63°C×1分钟，72°C×1分钟且进行14次循环，以及72°C×10分钟。获得的PCR产物用作模板，并且通过上述SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:17所列引物作为正向引物并且SEQ IDNO:7至SEQ ID NO:10所列引物作为反向引物而扩增。PCR条件如下：95°C×5分钟，92°C×1分钟，63°C×1分钟，72°C×1分钟且进行34次循环，以及72°C×10分钟。
使用SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所列引物扩增所得PCR产物，从而获得用于构建双链抗体的714个碱基对(SEQ ID NO:25)的PCR产物。
使用SOE，用多肽连接物将扩增的可变重链和轻链连接在一起，并且将所得的714碱基对(SEQ ID NO:25)的PCR产物克隆进TOPO-TA载体。表现出在质粒的酶分析之后714碱基对(bp)产物的释放的阳性克隆被测序，且使用NCBI同源比对搜索同源比对所述序列，表现出存在363bp的可变重链、327bp的可变轻链和24bp的连接物区域，其形成714bp的具有SEQ ID NO:25所示多核苷酸的双链抗体。
使用SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示引物进一步扩增所得的714碱基对(SEQ ID NO:25)的PCR产物，从而将用于克隆的限制位点添加进pET载体。
用于将双链抗体克隆入pET28a载体的引物
引物1：SEQ ID NO:23
ATGCATGAATTCTCAGATTGCCATGGCGTC
引物2：SEQ ID NO:24
ATGCGCGGCCGCCGCATCCTGCAGACGCGT
实施例4
载体构建和将双链抗体片段克隆进pET载体
将具有SEQ ID NO:25所示多核苷酸的双链抗体片段克隆进pET28a细菌表达载体的EcoR1和NotI位点之间。通过在37°C下孵育12小时，分别用EcoRI和NotI消化载体pET 28a和涉及大小为714bp的双链抗体的插入物。使用由QIAGEN提供的试剂盒纯化消化的产物，并保持载体与插入物的各种比例(即，1:3和1:6)，平端连接并在22°C下孵育2小时。将连接的产物在65°C下进一步孵育20分钟，从而使酶失活。pET 28a载体携带N-端组氨酸标签/凝血酶/T7标签结构加上优选的C-端组氨酸标签序列。位于两端的T7启动子和T7终止子用于对双链抗体的单链插入DNA片段进行测序。使用T7启动子和T7终止子引物，通过对来自载体骨架的克隆进行测序，从而检验插入物。获得的714碱基对序列在SEQ ID NO:25所示。
大肠杆菌转化
将过夜生长的XL-Blue菌株培养物再培养，并且在37°C下生长，摇动直至培养物在600nm处的OD达到0.6nm。在进行转化之前，通过在4°C下，5000×rpm离心10分钟获得培养物，再悬浮在冰冷的0.1mM CaCl2，并在冰上孵育过夜。
在冰上，化学竞争性XL-Blue细胞与质体DNA孵育30分钟。在向细胞添加培养基之前，在42°C下，给予细胞热振动90秒，并且立即放置在冰上2分钟。在37°C下，孵育细胞1小时以恢复，并置于含50mg/ml卡那霉素的半固体培养基上。将板孵育过夜，并且通过分离质粒来筛选阳性克隆，并且经过EcoRI和NotI消化。测序检验阳性克隆，然后将质粒转化进大肠杆菌的BL-21DE3细胞以用于抗体基因的可溶表达。
实施例5
大肠杆菌中双链抗体蛋白的核酸序列的表达
具有SEQ ID NO:25所示多核苷酸序列的重组双链抗体片段在大肠杆菌中表达以产生具有SEQ ID NO:26所示多肽序列的重组人单克隆双链抗体蛋白。此外，使用固相金属亲合色谱法(IMAC)，从溶解产物的可溶部分纯化双链抗体蛋白。分析纯化的重组人双链抗体蛋白，并且在考马斯亮蓝染色之后，在12％还原性SDS-PAGE上观察到27KDa大小的带(图2)，并在免疫印迹中用组氨酸探针进行测定(图3)。使用双辛丁酸试剂盒量化亲和纯化的蛋白的产量，并发现平均为5mg/10L。
实施例6
重组人二价双链抗体蛋白的体外检测
免疫捕获ELISA
进行免疫捕获ELISA以检查重组人二价双链蛋白的结合亲合力。使在碳酸盐缓冲液中的小鼠单克隆抗体(Mab)M5B4(100ng/孔)通过在4°C下孵育过夜而涂覆微滴定板。将板用PBST洗涤三次，并且用1％牛明胶封闭孔中的未结合位点。将纯化的狂犬病病毒糖蛋白(巴斯德病毒菌株)以不同稀释度加入并允许与M5B4反应。添加标记有组氨酸的双链抗体蛋白并允许与捕获的抗原反应。通过添加组氨酸探针和产色底物TMB来测定双链抗体与狂犬病病毒糖蛋白的亲合结合。在用1.25M H2SO4停止反应之后，在450nm处对板进行读数。
从图表(图4)中明显地，双链抗体特定地结合至狂犬病PV抗原。该图表说明对于在抗原存在下使用的双链抗体浓度，在光学密度中存在下降，并且在抗原不存在下未显示这样的信号。
用于量化人狂犬病疫苗中狂犬病病毒糖蛋白的免疫捕获ELISA
根据Nagarajan等人{Nagarajan,T.,G.S.Reddy,B.MohanaSubramanian,S.Rajalakshmi,D.Thiagarajan,N.Tordo,C.Jallet,和V.A.Srinivasan.2006.A simple immuno-capture ELISA to estimate rabiesviral glycoprotein antigen in vaccine manufacture.Biologicals 34:21–27}所述方法，进行少量修改，进行IC-ELISA以量化狂犬病疫苗制剂中的狂犬病病毒糖蛋白(RV GP)含量，其中双链抗体(450ng/孔)用于测定。
使用小鼠单克隆抗体(MAb)M5B4在4°C下过夜涂覆ELISA板，并且使用1％牛明胶封闭未反应位点。将测试疫苗和已知的RV GP的内参照标准(IRS)疫苗在PBS-T中进行8次连续的2倍稀释。使用双链抗体，然后添加抗-1组氨酸探针，测定由MAb M5B4捕获的RV GP。在室温下，使用TMB使所述板显影10分钟。通过添加1.25M H2SO4停止反应，使用酶标仪(micro titre plate reader)(BIO-TEK,USA)在450nm波长处测量吸光度。以一式三份的形式来进行分析。使用参照标准疫苗，同样通过之前Nagarajan等人(2006)所述的MAb-M5B4IC-ELISA评估RVGP含量。使用下述方程评估RV GP含量
RV GP评估值(微克/剂)=(X×Z×A×10)/Y
其中，X-样品的光学密度；Y-IRS光学密度，其等于阴性对照光学密度平均值的两倍；Z-末端稀释度的倒数；A-以纳克计的Y的GP评估值。
狂犬病疫苗制剂的NIH效能测试
使用标准过程在小鼠中对不同的狂犬病疫苗试剂进行NIH效能测试(Wilber,L.A.和M.F.A.Aubert.1996.The NIH test for potency,p.360–368.In F.X.Meslin,M.M.Kaplan和H.Koprowski(ed.),Laboratory techniques in rabies,4th ed.WHO,Geneva,Switzerland)。
统计分析
将源自使用MAb-M5B4(Nagarajan,T.,G.S.Reddy,B.MohanaSubramanian,S.Rajalakshmi,D.Thiagarajan,N.Tordo,C.Jallet和V.A.Srinivasan.2006.A simple immuno-capture ELISA to estimate rabiesviral glycoprotein antigen in vaccine manufacture.Biologicals 34:21–27)和双链抗体D06的IC-ELISA的RV GP抗原的评估值和预计效能与使用利用原点回归模型(Regression Through the Origin(RTO)model)(Snedecor,G.W.和W.G.Cochran.1989.Statistical methods applied toexperiments in agriculture and biology,8th ed.Iowa State UniversityPress,Ames,IA.)的ANOVA的体内NIH效能结果进行比较。
在各种疫苗制剂中的PV-GP评估值
使用IC-ELISA，在65批次的实验人狂犬病疫苗制剂中评估PV GP，并且将评估值与那些各个批次的NIH效能值进行比较。进行利用原点回归模型的ANOVA以比较由之前Nagarajan等人(2006)所述的M5B4-D06IC-ELSIA和MAb-M5B4IC-ELISA导出的效能评估值。使用Microsoft Excel 2003中的数据分析程序进行回归分析以比较M5B4D06IC-ELSIA和MAb-M5B4IC-1ELISA导出的效能评估值与NIH评估值。所得的校正R2值为0.902，并且基于M5B4-D06的IC-ELISA和MAb-M5B4IC-ELISA的预计效能值方程分别为0.5651x和0.8044x，其中x为以μg计的IC-ELISA的RV GP评估值(图11a和11b)。ANOVA结果显示两种对比方法的评估值高度显著不同(P<0.001)，而两个测试的预计效能未显著不同(P>0.05)。
竞争性ELISA
使用小鼠单克隆抗体(M5B4)进行竞争性ELISA，以观察重组人二价双链抗体是否能竞争相同的表位或不同的表位。通过在4°C下孵育过夜，使用碳酸盐缓冲液中的纯化狂犬病病毒抗原(巴斯德病毒菌株)(100ng/孔)涂覆微滴定板。然后，用PBST洗涤板，并且使用1％牛明胶封闭孔中的未结合位点，然后用PBST洗涤，并且通过连续稀释添加双链抗体，同时大肠杆菌溶解产物作为阴性对照，并在37°C下孵育1小时。将恒定量的小鼠Mab(M5B4)加入含有双链抗体和大肠杆菌溶解产物的每个孔中，并且将板在37°C下孵育1小时。用PBS洗涤板，如上所述。将具有1:5000工作稀释(为制造商所推荐)的山羊抗-小鼠IgG HRP轭合物加入每个孔，并且将板在37°C下再孵育1小时。在加入生色底物TMB之前，使用PBST洗涤板五次。通过将一个TMB片剂和3μl的H2O2溶解在柠檬酸盐缓冲液中制备TMB底物，并且向每个孔添加100μl的等分部分。通过向每个孔添加100μl的1.25MH2SO4来停止反应，并且在450nm处对板进行读数(图5)。
竞争研究表明(图5)，当与大肠杆菌溶解产物相比时，重组人二价双链抗体和鼠科单克隆抗体对相同的表位进行竞争。
实施例7
重组人二价双链抗体对狂犬病病毒的反应性
免疫印迹分析用于测定由双链抗体识别的狂犬病病毒抗原的性质。在非还原条件下，在10％SDS-PAGE中，分离狂犬病病毒结构蛋白，并转移在PVDF膜上并且用双链抗体探测。双链抗体显示与65kDa的蛋白带的特异性结合，所述65kDa对应于狂犬病病毒糖蛋白的分子量(图9)。
点印记分析
将等分(50μg/10μl)的狂犬病病毒糖蛋白抗原施加于PVDF膜并风干。在封闭之后，用双链抗体探测膜。通过组氨酸探针测定免疫反应性，并使用3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)显影(图10)。发现双链抗体特定地结合狂犬病病毒的糖蛋白，如图10所示。大肠杆菌溶解产物被包括在内作为阴性对照。
表1：人抗狂犬病病毒单克隆抗体的表征
表2：在细胞-ELISA中人抗狂犬病病毒单克隆抗体对多种RV固定菌株的反应性a
a狂犬病不固定病毒感染的和空白对照感染的细胞培养物用作进行细胞-ELISA的固相抗原以说明huMab对狂犬病病毒的特异性。
表4：人抗狂犬病病毒单克隆抗体对狂犬病病毒的中和
a使用狂犬病病毒菌株CVS-11通过RFFIT测定VNA滴定度，基本如Smith等人(1996)所述。
b使用热失活之后的包含huMab的异源杂交瘤培养物上清液。测试的huMab没有一个能中和狂犬病病毒菌株CVS-BHK。
表3：经受小鼠中和测试b的Swiss白化体小鼠的存活，以说明人单克隆抗体在体内对中和各种狂犬病固定病毒和街病毒的能力
*未完成
a将包含huMabs的热失活异源杂交瘤培养物上清液用于中和反应。
b雌性Swiss白化体小鼠(3-4周龄)颅内接种有30μl的(50MICLD50/30μl)狂犬病病毒感染的培养物流体或来自天然感染狂犬病的流浪狗的脑匀浆。每天观察接种的小鼠的典型狂犬病症状，持续21天。结果表达为在21天观察期之后存活的小鼠的百分率。
表5：抗狂犬病病毒的人单克隆抗体对狂犬病相关病毒的中和
a在CDC,Atlanta，通过RFFIT测定VNA滴定度，基本如Smith等人(1996)所述。快速荧光灶抑制试验(RFFIT)用于测定狂犬病病毒-中和抗体。在Meslin FX,Kaplan MM,Koprowski H,editors.Laboratorytechniques in rabies.4th ed.Geneva:WHO;1996.p.181-191中.
b使用部分纯化的huMAb制剂。
SEQ ID NO:25双链抗体片段的核苷酸序列(714个核苷酸)轻链
TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCACGATTACCTGTGGGGGAAACAACATTGGACGTAAAAGTGTCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGCAACACGGCCACCCTGATCATCAGTAGGGTCGAGGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGCAGTAGTGAGGATTT
连接物
TTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGT
重链
GGTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAAACCTGGTGCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGAAGCCTCTGGATTCACCTTCGGAAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAGCTATTAGTGGCAGTGGTCTTCACACATACTACGCGGACGCTGTGAAGGGCCGGTTCAGCATCTCCAGAGACAACTCCAAGAACACACTGTATTTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGGGGACACGGCCATTTATTACTGTGCGAAGGATAAGGGCATAGTAGTGGCTACCATCTTCTTCTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:26双链抗体片段的氨基酸序列(238a.a.)轻链
SYVLTQPPSVSVAPGQTATITCGGNNIGRKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLIISRVEAGDEADYYCQV
连接物
WDSSSEDFWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGQVQLVQSGGNLVQPGGSLRLSCEASGFTFGSYAMSWVRQAPGKGLEWVAAISGSGLHTYYADAVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAGDTAIYYCAKDKGIVVATIFFSWGQGTLVTVSS
重链
Claims (15)
1.具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体，其中所述双链抗体与狂犬病病毒结合并中和所述病毒。
2.如权利要求1所述的重组抗体，其中所述狂犬病病毒选自基因型(GT)1(GT1)(PV,Flury LEP,SAD,CVS-11)、GT4{杜文黑基病毒(DUV)}和GT7{澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒(ABLV)}。
3.如权利要求1所述的重组抗体，其中所述双链抗体为单克隆抗体。
4.编码重组人二价双链抗体的多核苷酸，其中所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重组人二价双链抗体。
6.重组DNA表达盒，其包含权利要求4所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸与启动子可操作地连接。
7.重组载体，其包含权利要求6所述的重组DNA表达盒。
8.重组宿主细胞，其包含权利要求6所述的重组DNA表达盒。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其选自大肠杆菌、酵母和CHO细胞。
10.组合物，其包含权利要求1所述的重组人二价双链抗体。
11.如权利要求10所述组合物，其还包含药物可接受的载体。
12.疫苗组合物，其包含权利要求1所述的重组人二价双链抗体或权利要求4所述的多核苷酸。
13.用于评估狂犬病病毒糖蛋白的试剂盒，其中所述试剂盒包括权利要求1所述的重组人二价双链抗体。
14.用于治疗狂犬病病毒相关的疾病和/或病症的方法，所述方法包括向有需要的个体给予有效量的权利要求1所述的重组人二价双链抗体。
15.权利要求1所述的重组人二价双链抗体在制备用于治疗狂犬病相关的疾病或病症的药物中的用途。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140219 |