CN114805558B - 强力地中和狂犬病毒和其它狂犬病毒属病毒的抗体和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及强力地中和RABV和非RABV狂犬病毒属病毒二者感染的抗体和其抗原结合片段。本发明还涉及与抗体和抗原结合片段结合的抗原位点，以及编码这样的抗体和抗体片段的核酸和产生这样的抗体和抗体片段的无限增殖化B细胞和培养的浆细胞。另外，本发明涉及本发明的抗体和抗体片段在筛选方法以及在诊断、预防和治疗RABV感染和非RABV狂犬病毒属病毒的感染中的用途。

Description

强力地中和狂犬病毒和其它狂犬病毒属病毒的抗体和其用途
本申请为分案申请，原申请的申请日是2015年11月8日，申请号是201580073641.2(PCT/EP2015/002305)，发明名称为“强力地中和狂犬病毒和其它狂犬病毒属病毒的抗体和其用途”。
本发明涉及强力地中和狂犬病毒(rabies virus)(RABV)和非RABV狂犬病毒属病毒(lyssavirus)二者的感染的抗体和其抗原结合片段。本发明还涉及与抗体和抗原结合片段结合的抗原位点，以及编码这样的抗体和抗体片段的核酸和产生这样的抗体和抗体片段的无限增殖化B细胞和培养的浆细胞。另外，本发明涉及本发明的抗体和抗体片段在筛选方法以及在诊断、预防和治疗RABV感染和非RABV狂犬病毒属病毒感染中的用途。
狂犬病是一种病毒感染，其引起脑部的急性炎症。狂犬病几乎在全世界都有分布并且主要影响野生动物和家畜，但是也牵涉人，导致毁灭性疾病，其在不接受暴露后预防(PEP)的个体中几乎是100％一定致死的。狂犬病的早期症状可以包括发烧和在暴露部位处的麻刺感。这些症状之后是下列症状中的一种或多种：剧烈运动、不受控制的兴奋、恐水、不能移动身体的组成部分、精神错乱和意识丧失。在症状出现之后，狂犬病几乎总是导致死亡。感染(contract)疾病和症状的开始之间的时期通常是一至三个月。但是，该时期可以在少于一周至多于一年之间变化。该时期取决于病毒必须行进到达中枢神经系统的距离。
狂犬病由许多狂犬病毒属病毒引起，包括狂犬病毒和其它狂犬病毒属病毒，例如欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒。
狂犬病毒属病毒具有螺旋状对称，具有大约180nm的长度和大约75nm的横截面。这些病毒是有包膜的并且具有单链负义RNA基因组。遗传信息被包装为核糖核蛋白络合物，其中RNA被病毒核蛋白紧密地结合。病毒的RNA基因组编码顺序高度保守的五种基因：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和病毒RNA聚合酶(L)。
狂犬病毒属被细分为三个遗传谱系(phylogroup)。遗传谱系I包括物种：狂犬病毒(RABV)、1型(EBLV-1)和2型(EBLV-2)欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒、杜文黑基病毒(DUVV)、澳大利亚蝙蝠狂犬病毒属病毒(ABLV)、阿拉万病毒(Aravan virus)(ARAV)、库詹德病毒(Khujand virus)(KHUV)、博克洛(Bokeloh)蝙蝠狂犬病毒属病毒(BBLV)和伊尔库特(Irkut)病毒(IRKV)。遗传谱系II包括拉哥斯蝙蝠病毒(LBV)、莫科拉病毒(MOKV)和希莫尼蝙蝠病毒(SHIV或SHIBV)。其余的病毒——西高加索蝙蝠病毒(WCBV)和伊科马(Ikoma)狂犬病毒属病毒(IKOV)不能包含在这些遗传谱系的任一种中，但是彼此系统发生地相关联，但是，它们的遗传距离大于遗传谱系I和II之间的距离(Bourhy,H.等.Journal of ClinicalMicrobiology 30,2419–2426,1992；Bourhy,H.等.Virology 194,70–81,1993；Amengual,B.等.J Gen.Virol 78,2319–2328,1997；Hooper,P.T.等.Bulletin de l'InstitutPasteur 95,209–218,1997；Kuzmin,I.V.等.Virus Res 149,197–210,2010；Badrane,H.等.J Virol 75,3268–3276,2001；Marston,D.A.等.Emerg Infect Dis 18,664–667,2012)。重要地，这些狂犬病毒属病毒的所有基因型本质上已经引起人和/或动物死亡(Badrane,H.等.J Virol 75,3268–3276,2001)。
狂犬病毒(RABV)是待鉴定的十四种狂犬病毒属病毒基因型中的第一种。狂犬病毒被分类为大的子弹状的、有包膜的、单链RNA病毒并且狂犬病毒的基因组编码五种病毒蛋白：RNA依赖性RNA聚合酶(L)；核蛋白(N)；磷酸化蛋白(P)；基质蛋白(M)，其位于病毒包膜的内侧上；和外表面糖蛋白(G)。G蛋白(62-67kDa)是由505个氨基酸组成的I型糖蛋白，其具有两个至四个潜在的N-糖基化位点。G蛋白覆盖病毒粒子包膜的外表面并且是唯一的靶抗原，其能够诱发中和病毒的抗体。
狂犬病在全球范围内是普遍的并且在暴露于狂犬病之后，通常在来自被感染动物(狗、蝙蝠、狐狸、猫、猴子、浣熊、臭鼬、牛、狼、土狼和其它家畜及野生动物)的咬伤之后，大约10×106个人/年被治疗。每年，一些40,000到70,000个人被估计死于该疾病，主要在非洲、中国和印度，并且在全世界50％的狂犬病病例在儿童中发生。这些数据强调了对于安全的、有效的和负担得起的狂犬病治疗的重要的、未满足的医疗需要。
狂犬病预防通过暴露前或暴露后接种疫苗来实现，主要使用现代的、基于组织培养的疫苗。对于处于高风险下的那些人而言，推荐暴露之前的免疫(暴露前预防(PrEP))，并且通过施用狂犬病疫苗(主动免疫接种)实现。高风险组包括与蝙蝠一起工作的人或者在狂犬病普遍的世界区域内度过长时间的人。而且，对于旅行至非洲和亚洲国家——在这里狂犬病是地方病——的人而言，推荐抗狂犬病疫苗。
当前可利用的狂犬病疫苗包括最广泛使用的但是高风险倾向的神经组织疫苗，或者更安全的但是成本更高的细胞培养和鸡胚培养(embryonated egg)疫苗(CCEEV)。在德国，例如，仅两种抗狂犬病疫苗处于市售中，和“Tollwut-Impfstoff(人二倍体细胞[HDC])inaktiviert”。这些疫苗包含灭活的狂犬病毒。对于暴露前和暴露后使用而言，两种疫苗均是推荐的。
在暴露于病毒之后，如果人在感染之后尽可能早的接受治疗，即在感染后的头几天期间，则利用狂犬病疫苗的暴露后预防(PEP)和狂犬病免疫球蛋白(RIG)是预防疾病的标准治疗。如果不治疗直到症状开始，则狂犬病几乎是100％致死的。因而，当前，不存在用于狂犬病的治疗。
当某人假定被病毒感染时，当前使用的“治疗”是暴露后预防(PEP)，其将狂犬病免疫球蛋白(RIG)——具体而言，人或马狂犬病免疫球蛋白(分别为HRIG和ERIG)——与狂犬病疫苗组合。具体而言，根据狂犬病疫苗制造商的信息，患者接受一个剂量的RIG(被动免疫接种)和若干剂量的狂犬病疫苗(主动免疫接种)。在广泛使用的标准疗法中，例如，五个剂量的疫苗在28天的时期内被施用，即第一剂量的狂犬病疫苗在暴露后尽快给予，优选地第0天时，另外的剂量在第一剂量之后的第3、7、14和28天时给予(见http://www.rki.de/DE/Content/Infekt/EpidBull/Merkblaetter/Ratgeber_Tollwut.html，在2014年11月12日检索)。相比之下，用于被动免疫接种的狂犬病免疫球蛋白(RIG)仅被施用一次，优选地在暴露后接种疫苗开始时，或者在暴露后接种疫苗开始之后尽快。由WHO提议的人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)的剂量是20IU/kg体重；对于马免疫球蛋白(ERIG)和F(ab’)2产品，其是40IU/kg体重(见http://www.who.int/rabies/human/WHO_strategy_prepost_exposure/en/index1.html#，在2014年11月12日检索)。具体而言，更高的剂量可能降低疫苗效力。所有狂犬病免疫球蛋白，或者在解剖学上尽可能避免可能的腔隙综合征的免疫球蛋白，应当被施用至创伤部位(一个或多个)内或其周围。其余的免疫球蛋白——如果有的话——应当在远离疫苗施用部位的部位被肌内注射。狂犬病免疫球蛋白可以被稀释至足以将有效地和安全地渗入所有创伤的体积(见http://www.who.int/rabies/human/WHO_strategy_prepost_exposure/en/index1.html#，在2014年11月12日检索)。如果在暴露之后的多达24-48小时施用，这通常是成功的。HRIG是广泛使用的，尤其在发达国家，并且被认为比ERIG安全。HRIG的高成本和其有限利用度阻止了其在发展中国家的广泛使用。而且，疫苗和HRIG或ERIG不有效地防护不同狂犬病毒属病毒物种的感染(保护与疫苗株的遗传距离负相关)。因而，用至少等效的和更安全的基于狂犬病抗体的产品来替代HRIG的需要被视为对改善狂犬病生物制剂的可及性是重要的，尤其在发展中国家。
为了这个目的，小鼠单克隆抗体以及人单克隆抗体已经在过去十年被研发，在先进的临床实验中研发了两个产品。即，研发了CL184(由Crucell生产)，其是被称为CR57和CR4098的两种人抗体的混合物，以在直到III期临床实验中替代HRIG(Bakker,A.B.H.等,JVirol 79,9062–9068,2005；Goudsmit J,Marissen WE,Weldon WC,Niezgoda M,HanlonCA,Rice AB,Kruif J,Dietzschold B,Bakker AB,Rupprecht CE(2006)Comparison of ananti-rabies humanmonoclonal antibody combination with human polyclonal anti-rabies immune globulin.J Infect Dis 193:796-801)。但是，最近，由于混合物或混合物的两种抗体中的一种针对一些循环的RABV分离群缺乏中和活性，实验被停止。最近在印度在III期临床中测试的另一种人单克隆抗体是RAB1，其由印度的Mass Biologicsand SerumInstitute生产并且其基于单个单克隆抗体(Sloan SE,Hanlon C,Weldon W,Niezgoda M,Blanton J,Self J,Rowley KJ,Mandell RB,Babcock GJ,Thomas WD,Jr等(2007)Identificationand characterization of a human monoclonal antibody thatpotently neutralizes a broad panel of rabies virus isolates.Vaccine 25:2800-2810；Nagarajan T,Marissen WE,Rupprecht CE(2014)Monoclonal antibodies for theprevention of rabies:theoryand clinical practice.Antibody TechnologyJournal4:1-12)。但是，不被这些单克隆抗体中的每一种中和的RABV分离群(CR57，CR4098和RAB1)已经被鉴定(Kuzimina NA,Kuzmin IV,Ellison JA,Rupprecht CE(2013)Conservation of binding epitopes for monoclonal antibodies on the rabiesvirus glycoprotein.Journal of Antiviral和Antiretrovirals 5:37-43,Marissen WE,Kramer RA,Rice A,Weldon WC,Niezgoda M,Faber M,Slootstra JW,Meloen RH,Clijsters-van der Horst M,Visser TJ等(2005)Novel rabies virus-neutralizingepitope recognized by human monoclonal antibody:fine mappingand escape mutantanalysis.J Virol 79:4672-4678)。在RAB1抗体的情况下，测试的25个分离群中的两个未被中和并且三个很差地被中和(Sloan SE,Hanlon C,Weldon W,Niezgoda M,Blanton J,Self J,Rowley KJ,Mandell RB,Babcock GJ,Thomas WD,Jr等(2007)Identificationandcharacterization of a human monoclonal antibody that potently neutralizes abroad panel of rabies virus isolates.Vaccine 25:2800-2810)。在这种情况下，PEP失败的风险至少理论上高于CR57和CR4098抗体混合物的情况。这些研究表明CR4098和RAB1针对非RABV分离群具有有限的反应宽度并且测试的RABV分离群的重要部分不被这些抗原位点III抗体中和或者被其很差地中和。的确，由于缺乏大的RABV覆盖度，CL184的开发最近被停止，而RAB1在印度仍然处于2/3期的研发中。
因此，仍然存在用至少等效的和更安全的基于抗体的产品来替代HRIG的需要。而且，对于能够以高效能和效力预防以及治疗或减轻不同狂犬病毒属病毒的感染的产品存在需要，即不仅仅被限制为中和RABV的产品，尤其是由于在一些国家，例如欧洲和澳大利亚，狂犬病主要通过蝙蝠传播。而且，重要的是具有靶向不同毒株上的不同表位和不同抗原位点的抗体，以便于避免抗性病毒株的出现并且阻止病毒的抗性变体的逃逸。
而且，由于当前不存在用于狂犬病的治疗，因此存在治疗或减轻感染有效的产品的需要，即使在利用该产品第一次治疗前暴露于病毒超过24至48小时。这样的治疗的研发对于至少两类患者将是尤其有利的：已知暴露于RABV但是由于一些情况未能接受迅速的暴露后预防并且处于发展RABV感染的增加的风险下的那些，和没有意识到与病毒接触和存在疾病的(不同严重性的)征兆的那些(例如，与被感染的蝙蝠通过不引人注意的接触而被感染的个体；在狗狂犬病被控制的地方，蝙蝠来源的RABV已经变成人狂犬病的起因)。对于人RABV感染，强力和广谱中和抗体的产品的研发因而可以有助于扩展暴露后治疗窗口，其当前限于感染后的头几天。在这些个体中，RABV可能已经到达CNS组织并且疾病的早期或晚期征兆可能也已经出现。这些患者可以受益于利用可以穿过血脑屏障(或者直接在CSN中施用的)渗漏的高度强力的中和抗体的治疗，递送能够有效地中和CNS组织中的病毒复制的足够量的抗体。
鉴于以上，本发明的目标是提供基于抗体的产品，其与HRIG相比是至少等效的，但是更安全和更划算的。而且，本发明的目标是提供能够以高效力和效能预防以及治疗或减轻不同狂犬病毒属病毒的感染的产品，即不仅仅被限制为中和RABV的产品。进一步，本发明的目标是提供在治疗或减轻感染中有效的产品，即使在利用该产品第一次治疗前暴露于病毒超过24至48小时。总之，本发明的目标是提供改进的抗体，或者其抗原结合片段，以及相关的核酸分子、载体和细胞以及药物组合物，其通过划算的和直接的途径克服了上面讨论的现有技术的劣势。
本发明的目标通过要求保护的主题来解决。
虽然下文详细描述了本发明，但是应当理解本发明不限于本文描述的具体方法、方案和试剂，因为它们可以改变。还应当理解，本文中使用的术语不意欲限制本发明的范围，其将仅由所附权利要求书限定。除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与具体实施方式一起被列举，但是应当理解，它们可以以任何方式和任何数目进行组合以产生另外的实施方式。多方面描述的实施例和优选的实施方式不应当被解释为将本发明限制为仅明确地描述的实施方式。本说明书应当被理解为支持和包含将明确地描述的实施方式与任意数目的公开的和/或优选的要素进行组合的实施方式。另外，在本申请中的所有描述的要素的任何排列与组合应当被视为被本申请的说明书公开，除非上下文另外指示。
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术语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，术语“基本上”可以从本发明的限定中省略。
涉及数值x的术语“大约”意思是x±10％。
如本文所使用的术语“疾病”与术语“紊乱”和“病症”(如在医疗状况下)意欲是通常同义的，并且可交换地使用，因为它们都反映人或动物体或者其身体部位之一的异常状况，该异常状况损害正常功能，通常由有区别的征兆和症状显示，并且使得人和动物具有降低的寿命或生活质量。
如本文所使用，提及对象或患者的“治疗”意欲包括阻止、预防、减轻、改善和疗法。术语“对象”或“患者”在本文中可交换地使用，意思是包括人的所有哺乳动物。对象的实例包括人、牛、狗、猫、马、山羊、绵羊、猪和兔。在一个实施方式中，患者是人。
如本文所使用，术语“抗原结合片段”、“片段”和“抗体片段”可交换地使用，指的是本发明的保留抗体的抗原结合活性的抗体的任何片段。抗体片段的实例包括但不限于单链抗体、Fab、Fab’、F(ab')2、Fv或scFv。进一步，如本文所使用的术语“抗体”包括抗体和其抗原结合片段二者。
如本文所使用，“中和抗体”是如此抗体：其可以中和，即阻止、抑制、降低、阻碍或干扰病原体引起和/或保持(perpetuate)宿主中的感染的能力。术语“中和抗体”和“中和的抗体(一种或多种)”在本文中可交换地使用。这些抗体可以单独或组合使用，在适当配制之后作为预防或治疗剂，与主动免疫接种联合，作为诊断工具，或者作为本文中描述的生产工具。
剂量通常涉及体重进行表达。因而，表达为[g、mg或其它单位]/kg(或g、mg等)的剂量通常指的是[g、mg或其它单位]“/kg(或g、mg等)体重”，即使术语“体重”没有没明确提及。
术语“特异性结合”和类似的引用对象不涵盖非特异性粘附。
如本文所使用的术语“疫苗”通常被理解为预防或治疗性物质，其提供至少一种抗原，优选地免疫原。抗原或免疫原可以来源于适合于接种疫苗的任何物质。例如，抗原或免疫原可以来源于病原体，比如来自细菌或病毒颗粒等，或者来自肿瘤或癌组织。抗原或免疫原刺激身体的适应性免疫系统以提供适应性免疫应答。具体而言，“抗原”或“免疫原”通常指的是如此物质：其可以被免疫系统，优选地被适应性免疫系统识别，并且其能够触发抗原特异性免疫应答，例如通过形成抗体和/或抗原特异性T细胞作为适应性免疫应答的一部分。通常，抗原可以是或者可以包括可以通过MHC呈递至T细胞的肽或蛋白质。
如本文所使用，“序列变体”指的是参比序列的任何变更，其中参比序列是在“序列的表格和SEQ ID编号”(序列表)中列举的序列即SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:218中的任一种。因而，术语“序列变体”包括核苷酸序列变体和氨基酸序列变体。值得注意的是，在本文中指出的序列变体具体而言是功能性序列变体，即维持例如抗体的生物学功能的序列变体。在本发明的背景下，这样的维持的生物学功能优选地是抗体与RABV(和非RABV)G蛋白的结合。
序列同一性通常关于参比序列(即在本申请中叙述的序列)的全长计算。如本文中提及的百分比同一性可以例如使用BLAST利用由NCBI规定的缺省参数来确定(theNational Center for Biotechnology Information；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)[Blosum 62矩阵；空位开放罚分(gap open penalty)＝11和空位扩展罚分(gap extensionpenalty)＝1]。
如本文所使用，“核苷酸序列变体”具有变更的序列，其中参比序列中的核苷酸的一个或多个缺失，或被置换，或者一个或多个核苷酸插入参比核苷酸序列的序列中。在本文中通过标准的一字母名称(A、C、G或T)来提及核苷酸。由于遗传密码的简并性，“核苷酸序列变体”可以导致各自的参比氨基酸序列的改变，即导致“氨基酸序列变体”，或者不导致“氨基酸序列变体”。优选的序列变体是这样的核苷酸序列变体，其不导致氨基酸序列变体(沉默突变)，但是其它非沉默突变也在本发明的范围内，尤其是突变的核苷酸序列，其导致氨基酸序列与参比序列具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％序列同一性。
“氨基酸序列变体”具有变更的序列，其中参比序列中的氨基酸的一个或多个缺失或被置换，或者一个或多个氨基酸插入参比氨基酸序列的序列中。作为变更的结果，氨基酸序列变体具有与参比序列具有至少80％同一性，优选地与参比序列具有至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，最优选地至少99％同一性的氨基酸序列。具有至少90％同一性的变体序列具有不多于10个变更/参比序列的100个氨基酸，即缺失、插入或置换的任何组合。
虽然具有非保守氨基酸置换是可能的，但是优选的置换是保守氨基酸置换，其中置换的氨基酸与参比序列中的相应氨基酸具有类似的结构或化学性质。举例而言，保守氨基酸置换涉及将一种脂肪族或疏水性氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸置换为另一种；将一种包含羟基的氨基酸例如丝氨酸和苏氨酸置换为另一种；将一种酸性残基例如谷氨酸或天冬氨酸置换为另一种；将一种包含酰胺的残基例如天冬酰胺和谷氨酰胺替换为另一种；将一种芳香族残基例如苯丙氨酸和酪氨酸替换为另一种；将一种碱性残基例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸替换为另一种；和将一种小氨基酸例如丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸替换为另一种。
氨基酸序列插入包括在从一个残基到包含一百个或更多个残基的多肽的长度范围内的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括氨基酸序列的N或C末端与报告分子或酶的融合。
重要地，序列变体的变更不废除各自参比序列的功能，在当前情况下，例如，抗体的序列或者其抗原结合片段结合至相同的表位和/或充分地中和RABV和非RABV狂犬病毒属病毒的感染的功能。确定哪些核苷酸和氨基酸残基分别可以被置换、插入或缺失而不废除这样的功能的指导通过使用本领域中熟知的计算机程序被发现。
贯穿本说明书的文本引用了数个文件。本文中引用的文件中的每个(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指示等)，无论上文或下文，都在此通过引用以其全部被并入。本文中的所有公开内容都将不被解释为承认由于先前的发明而导致本发明无权先于这样的公开内容。
将理解，本发明不限于本文描述的具体方法、方案和试剂，因为它们可以改变。还应当理解，本文中使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，并且不意欲限制本发明的范围，其将仅由所附权利要求书限定。除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
除其它发现之外，本发明基于在中和RABV和非RABV狂犬病毒属病毒中高度强力的抗体，以及与本发明的抗体结合的抗原位点和表位的发现和分离。这样的抗体是期望的，因为仅需要少量的抗体以便于通过一种单抗体中和RABV和非RABV狂犬病毒属病毒感染。根据本发明的每种单抗体在预防以及治疗或减轻RABV和非RABV狂犬病毒属病毒感染中是有效的。因此，降低了包括用于治疗RABV和非RABV狂犬病毒属病毒感染的抗体的药物的生产费用。而且，根据本发明的抗体以强力的和有效的方式不仅中和RABV，而且中和也引起狂犬病的非RABV狂犬病毒属病毒。关于RABV，根据本发明的抗体识别宽泛的变体——其在表位中自然地出现，因而避免了抗性RABV毒株。另外，包括由本发明的抗体识别的表位的肽抗原位点或免疫原性多肽可以是能够诱导防护RABV和非RABV狂犬病毒属病毒(反映主动免疫接种)的疫苗或组合疗法的组成。
在第一方面，本发明提供了分离的抗体、抗体变体和其抗原结合片段，其以低于10000ng/ml的IC50中和(i)RABV和(ii)至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV和WCBV。
其中，“以低于10000ng/ml的IC50”意思是通过发明的抗体中和的每个物种以上述IC50值被抑制。
“选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV和WCBV的至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒”指的是至少50％的下列物种：杜文黑基病毒(DUVV)、1型(EBLV-1)和2型(EBLV-2)欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒、澳大利亚蝙蝠狂犬病毒属病毒(ABLV)、伊尔库特病毒(IRKV)、库詹德病毒(KHUV)、阿拉万病毒(ARAV)、拉哥斯蝙蝠病毒(LBV)、莫科拉病毒(MOKV)、希莫尼蝙蝠病毒(SHIV或SHIBV)、博克洛蝙蝠狂犬病毒属病毒(BBLV)和西高加索蝙蝠病毒(WCBV)，即上面提及的12个物种中的至少6个物种。
优选地，分离的抗体、抗体变体和其抗原结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和(i)RABV和(ii)至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV、WCBV和IKOV。
“选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV、WCBV和IKOV的至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒”指的是至少50％的下列物种：杜文黑基病毒(DUVV)、1型(EBLV-1)和2型(EBLV-2)欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒、澳大利亚蝙蝠狂犬病毒属病毒(ABLV)、伊尔库特病毒(IRKV)、库詹德病毒(KHUV)、阿拉万病毒(ARAV)、拉哥斯蝙蝠病毒(LBV)、莫科拉病毒(MOKV)、希莫尼蝙蝠病毒(SHIV)、博克洛蝙蝠狂犬病毒属病毒(BBLV)、西高加索蝙蝠病毒(WCBV)和伊科马狂犬病毒属病毒(IKOV)，即上面提及的13个物种中的至少7个物种。
每个单一狂犬病毒属病毒物种被视为以低于10000ng/ml的IC50被中和，无论何时任何这样的狂犬病毒属病毒物种的至少一个分离群以低于10000ng/ml的IC50被中和。优选地，任何这样的狂犬病毒属病毒物种的至少两个分离群以低于10000ng/ml的IC50被中和。
优选地，低于10000ng/ml的IC50利用传染性病毒实现，即具体而言不利用假型病毒。
因而，根据本发明的抗体、抗体变体和其抗原结合片段能够中和广谱的狂犬病毒属病毒。
优选地，分离的抗体、抗体变体和其抗体结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和至少55％、更优选地至少60％、甚至更优选地至少65％、最优选地至少68％和尤其优选地至少70％的非RABV狂犬病毒属病毒的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV和WCBV。
更优选地，分离的抗体、抗体变体和其抗体结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和至少55％、更优选地至少60％、甚至更优选地至少65％、最优选地至少68％和尤其优选地至少70％的非RABV狂犬病毒属病毒的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV、WCBV和IKOV。
而且，本发明还提供了分离的抗体、抗体变体和其抗体结合片段，其以低于10000ng/ml的IC50中和(i)RABV和(ii)至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒的所有分离群的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV和WCBV。优选地，分离的抗体、抗体变体和其抗体结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和(i)RABV和(ii)至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒的所有分离群的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV、WCBV和IKOV。
其中，“选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV和WCBV的至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒的分离群”指的是考虑的上面12个物种的所有分离群，和“选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV、WCBV和IKOV的至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒的所有分离群”指的是考虑的上面13个物种的所有分离群(即考虑的所有分离群代表100％并且以低于10000ng/ml的IC50被中和的分离群的数目代表各自百分比)。优选地，下面的前31个分离群被视为反映100％分离群(参见表1，除了IKOV的所有分离群)，更优选地在表1中示出的所有32个分离群(包括IKOV)被视为反映100％分离群：
表1：非RABV狂犬病毒属病毒分离群
*同样的分离群作为假病毒和传染性病毒测试。
表1中示出的非RABV狂犬病毒属病毒分离群(以及不同的RABV分离群)的更详细的描述在表1中示出。这包括-除了分离群名称，病毒物种和遗传谱系(如表1中示出的)-宿主物种、国家和起源年份、谱系和那个分离群的糖蛋白G的氨基酸和/或核苷酸序列的GenBank登录号，如果有的话(参见图1)。
因此，如果在表1中指定的前31个分离群(即除了IKOV之外的所有分离群)的至少16个以低于10000ng/ml的IC50被抗体、抗体变体或其抗原结合片段中和，则抗体、抗体变体或其抗原结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒的分离群的感染，该非RABV狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV和WCBV。而且，如果在表1中指定的32个分离群的至少16个以低于10000ng/ml的IC50被抗体、抗体变体或其抗原结合片段中和，则抗体、抗体变体或其抗原结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒的分离群的感染，该非RABV狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV、WCBV和IKOV。
优选地，分离的抗体、抗体变体和其抗体结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和至少55％、更优选地至少60％、甚至更优选地至少65％、最优选地至少68％和尤其优选地至少70％的非RABV狂犬病毒属病毒的分离群的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV和WCBV。更优选地，分离的抗体、抗体变体和其抗体结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和至少55％、更优选地至少60％、甚至更优选地至少65％、最优选地至少68％和尤其优选地至少70％的非RABV狂犬病毒属病毒的所有分离群的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV、WCBV和IKOV。
优选地，在表1提及的前12个分离群(即从ABLV/澳大利亚/蝙蝠/9810AUS-1998/V1039-2011到MOK/MOK)作为传染性病毒被测试，而表1中提及的其它分离群(即从希莫尼蝙蝠病毒/SHIV到伊科马狂犬病毒属病毒/IKOV)优选地作为假型病毒被测试。从而，如果IC50低于10000ng/ml，优选的是将分离群视为中和传染性病毒的某一病毒，并且如果IC90低于10000ng/ml，优选的是将分离群视为中和假型病毒的某一病毒。
因而，在优选的实施方式中，本发明提供了分离的抗体、抗体变体和其抗原结合片段，其中和(i)RABV和(ii)至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒的所有分离群的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV狂犬病毒属病毒选自ABLV/澳大利亚/蝙蝠/9810AUS-1998/V1039-2011/ABLV、98010/ABLV、1301博克洛蝙蝠狂犬病毒属病毒/BBLV、86132SA/DUVV、DUVV/南非/人/96132SA-1971/RS639-2012/DUVV、EBLV1a/法国/蝙蝠/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1、EBLV1b/法国/蝙蝠/8918-1989/EBLV-1、EBLV2/UK/蝙蝠/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2、94112/EBLV-2、02053/EBLV-2、8619/LBV、MOK/MOK、希莫尼蝙蝠病毒/SHIV、西高加索蝙蝠病毒/WCBV、澳大利亚蝙蝠狂犬病毒属病毒/RV634/ABLV、阿拉万病毒/ARAV、杜文黑基病毒RSA2006/DUVV、杜文黑基病毒ZIM86-RV131/DUVV、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒1.RV20/EBLV-1、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒1.RV9/EBLV-1、EBLV1a/法国/蝙蝠/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1、EBLV2/UK/蝙蝠/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒2.RV1787/EBLV-2、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒2.RV628/EBLV-2、伊尔库特病毒/IRKV、库詹德病毒/KHUV、8619/LBV、拉哥斯蝙蝠病毒NIG56-RV1/LBV、拉哥斯蝙蝠病毒SA2004/LBV、莫科拉病毒NIG68.RV4/MOK、莫科拉病毒98/071RA36/MOK和伊科马狂犬病毒属病毒/IKOV，对于作为传染性病毒测试的ABLV/澳大利亚/蝙蝠/9810AUS-1998/V1039-2011/ABLV、98010/ABLV、1301博克洛蝙蝠狂犬病毒属病毒/BBLV、86132SA/DUVV、DUVV/南非/人/96132SA-1971/RS639-2012/DUVV、EBLV1a/法国/蝙蝠/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1、EBLV1b/法国/蝙蝠/8918-1989/EBLV-1、EBLV2/UK/蝙蝠/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2、94112/EBLV-2、02053/EBLV-2、8619/LBV、MOK/MOK，具有低于10000ng/ml的IC50，并且对于作为假型病毒测试的希莫尼蝙蝠病毒/SHIV、西高加索蝙蝠病毒/WCBV、澳大利亚蝙蝠狂犬病毒属病毒/RV634/ABLV、阿拉万病毒/ARAV、杜文黑基病毒RSA2006/DUVV、杜文黑基病毒ZIM86-RV131/DUVV、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒1.RV20/EBLV-1、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒1.RV9/EBLV-1、EBLV1a/法国/蝙蝠/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1、EBLV2/UK/蝙蝠/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒2.RV1787/EBLV-2、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒2.RV628/EBLV-2、伊尔库特病毒/IRKV、库詹德病毒/KHUV、8619/LBV、拉哥斯蝙蝠病毒NIG56-RV1/LBV、拉哥斯蝙蝠病毒SA2004/LBV、莫科拉病毒NIG68.RV4/MOK、莫科拉病毒98/071RA36/MOK和伊科马狂犬病毒属病毒/IKOV，具有低于10000ng/ml的IC90。
本发明的以下描述，具体而言所有优选的实施方式和进一步的方面，涉及如下二者：分离的抗体或其抗原结合片段，其以如上面描述的低于10000ng/ml的IC50(包括上面描述的其优选的实施方式)中和(i)RABV和(ii)至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV和WCBV；以及分离的抗体或其抗原结合片段，其以如上面描述的低于10000ng/ml的IC50(包括上面描述的其优选的实施方式)中和(i)RABV和(ii)至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒的(所有)分离群的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV和WCBV。
优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段结合至RABV的G蛋白(糖蛋白G)。更优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段也结合至非RABV狂犬病毒属病毒的G蛋白(糖蛋白G)。
根据本发明的抗体、抗体变体或其抗原结合片段具有非常低的IC50值。具体而言，具有10000ng/ml或更高的IC50值的抗体在体内不可能有效。因而，根据本发明的抗体对于RABV和非RABV狂犬病毒属病毒具有特别高或强的亲和力，并且因而特别适合于对抗和/或至少部分地预防RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染和/或RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染的不利影响。
为了测定中和试验中的IC50值，可以使用假病毒和/或传染性病毒。各自的中和试验对于本领域技术人员而言是已知的。但是，优选地，根据Wright,E.等,Vaccine 27,7178–7186,2009——其通过引用被并入本文——的中和试验被用于评估假病毒(PV)。对于传染性病毒，优选地，使用根据Cliquet,F.等.,J.Immunol Methods 212,79–87,1998.——其通过引用被并入本文——的“荧光抗体病毒中和测试”(FAVN)，或者根据Smith,J.S.等.,Bull.World Health Organ.48,535–541,1973——其也通过引用被并入本文——的“快速荧光灶抑制试验”(RFFIT)。
一般而言，中和试验通常通过病毒与特异性抗体的反应来测量病毒的传染性的丧失。通常，传染性的丧失由结合的抗体(bound antibody)对病毒复制步骤——其包括结合至靶细胞、进入和/或病毒释放——的任一个的干扰引起。在下文，给出中和试验的非限制性实例来说明原理：给定量的病毒，例如50-100TCDID50(50％组织培养感染剂量)，和不同浓度的抗体在适合的条件下混合，例如在室温下持续1小时，然后接种入适合的靶细胞培养物，例如Hep-2细胞或BHK-21(幼仓鼠肾21)细胞。通常可以提供每ml细胞培养物的值。未中和的病毒的存在例如在预定的时间量，例如1、2、3、4、5、6或7天之后通过测量(未中和的)病毒对靶细胞的细胞致病作用，例如通过使用定量细胞存活力的比色测定，例如WST-1试剂来检测。越多的靶细胞从细胞死亡中营救或者被测量为有存活力的，越多的病毒被抗体中和。测量的作用通常是剂量依赖性的：抗体效价越高，营救的细胞越多。取决于抗体的中和特性，TCID50值改变，例如显著中和特性的抗体与较不明显中和特性的另一种抗体相比将需要加入的(抗体)的量更少(例如，用于实现试验中相同量的“营救的”靶细胞，即测量为有存活力的细胞)。
优选地，对于根据本发明的抗体，如上面描述的传染性病毒中和试验中的IC50值(即50％中和)低于10000ng/ml，即关于传染性病毒，而对于相同的抗体，如上面描述的假病毒中和试验中的IC90值(即90％中和)低于10000ng/ml，即关于假病毒。
而且，优选的是根据本发明的抗体或其抗原结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和至少70％的非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV和ARAV。从而，上面提及物种的“至少70％”意思是7个物种中的至少5个。如果一个狂犬病毒属病毒物种的至少一个分离群的感染以低于10000ng/ml的IC50被中和，则这个狂犬病毒属病毒物种的感染被视为以低于10000ng/ml的IC50被中和。优选地，分离的抗体、抗体变体和其抗原结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和至少70％的非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV和BBLV。从而，上面提及物种的“至少70％”意思是8个物种中的至少6个。如果一个狂犬病毒属病毒物种的至少一个分离群的感染以低于10000ng/ml的IC50被中和，则这个狂犬病毒属病毒物种的感染被视为以低于10000ng/ml的IC50被中和。
优选地，分离的抗体、抗体变体和其抗原结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和至少75％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少82％的非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV和ARAV。更优选地，分离的抗体、抗体变体和其抗原结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和至少75％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少82％的非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV和BBLV。
根据另一个优选的实施方式，根据本发明的抗体或其抗原结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和至少70％的非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒的分离群的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV和ARAV。从而，“选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV和ARAV的至少70％的非RABV狂犬病毒属病毒的分离群”指的是考虑的上面的7个物种的所有分离群(即考虑的所有分离群代表100％并且以低于10000ng/ml的IC50被中和的分离群的数目代表各自的百分比)。更优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和至少70％的非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒的分离群的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV和BBLV。从而，“选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV和BBLV的至少70％的非RABV狂犬病毒属病毒的分离群”指的是考虑的上面的8个物种的所有分离群(即考虑的所有分离群代表100％并且以低于10000ng/ml的IC50被中和的分离群的数目代表各自的百分比)。优选地，表1中关于遗传谱系I物种提及的22个分离群被考虑用于计算百分比。因此，如果表1中关于遗传谱系I物种提及的22个分离群中的至少16个被抗体、抗体变体或其抗原结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和，则抗体、抗体变体或其抗原结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和至少70％的非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒的分离群的感染，该非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV和优选地BBLV。优选地，分离的抗体、抗体变体和其抗原结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和至少75％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少82％的非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒的分离群的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV和优选地BBLV。
特别优选的是根据本发明的分离的抗体、抗体变体和其抗原结合片段中和至少70％的非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒的分离群的狂犬病毒属病毒感染，该非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒选自ABLV/澳大利亚/蝙蝠/9810AUS-1998/V1039-2011/ABLV、98010/ABLV、1301博克洛蝙蝠狂犬病毒属病毒/BBLV、86132SA/DUVV、DUVV/南非/人/96132SA-1971/RS639-2012/DUVV、EBLV1a/法国/蝙蝠/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1、EBLV1b/法国/蝙蝠/8918-1989/EBLV-1、EBLV2/UK/蝙蝠/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2、94112/EBLV-2、02053/EBLV-2、澳大利亚蝙蝠狂犬病毒属病毒/RV634/ABLV、阿拉万病毒/ARAV、杜文黑基病毒RSA2006/DUVV、杜文黑基病毒ZIM86-RV131/DUVV、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒1.RV20/EBLV-1、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒1.RV9/EBLV-1、EBLV1a/法国/蝙蝠/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1、EBLV2/UK/蝙蝠/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒2.RV1787/EBLV-2和欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒2.RV628/EBLV-2、伊尔库特病毒/IRKV、库詹德病毒/KHUV，对于作为传染性病毒测试的ABLV/澳大利亚/蝙蝠/9810AUS-1998/V1039-2011/ABLV、98010/ABLV、1301博克洛蝙蝠狂犬病毒属病毒/BBLV、86132SA/DUVV、DUVV/南非/人/96132SA-1971/RS639-2012/DUVV、EBLV1a/法国/蝙蝠/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1、EBLV1b/法国/蝙蝠/8918-1989/EBLV-1、EBLV2/UK/蝙蝠/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2、94112/EBLV-2和02053/EBLV-2，具有低于10000ng/ml的IC50，并且对于作为假型病毒测试的澳大利亚蝙蝠狂犬病毒属病毒/RV634/ABLV、阿拉万病毒/ARAV、杜文黑基病毒RSA2006/DUVV、杜文黑基病毒ZIM86-RV131/DUVV、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒1.RV20/EBLV-1、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒1.RV9/EBLV-1、EBLV1a/法国/蝙蝠/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1、EBLV2/UK/蝙蝠/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒2.RV1787/EBLV-2、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒2.RV628/EBLV-2、伊尔库特病毒/IRKV和库詹德病毒/KHUV，具有低于10000ng/ml的IC90。
在狂犬病毒属病毒并且具体而言遗传谱系I狂犬病毒属病毒之中，特别优选的是根据本发明的抗体或其抗原结合片段中和EBLV-1的感染。具体而言，根据本发明的抗体或其抗原结合片段以低于10000ng/ml的IC50中和EBLV-1的至少一个分离群、更优选地至少两个、甚至更优选地至少三个EBLV-1分离群的感染，例如在表1中提及的EBLV-1分离群。从而，特别优选的是一个或多个EBLV-1分离群在上面描述的假病毒中和试验和上面描述的传染性病毒中和试验二者中被中和。甚至更优选地，在传染性病毒中和试验中的IC50值低于10000ng/ml和在假病毒中和试验中的IC90值低于10000ng/ml。
值得注意的是，现有技术的人单克隆抗体CR57、CR4098和RAB1都不能中和EBLV-1(参见图5和6)。但是，由1型欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒导致的狂犬病在许多欧洲国家中存在并且在欧洲蝙蝠被列为受保护的物种。在蝙蝠咬伤之后，疾病在人中是致死的并且已经在Europe中描述。狂犬病暴露前接种疫苗和暴露后治疗对于职业地暴露的人而言是推荐的，并且在蝙蝠咬伤之后对国际旅行者的治疗也是推荐的(Stantic-Pavlinic M.(2005)Eurosurveillance,Volume 10,Issue 11)，但是如图5和图6中所示，HRIG几乎不中和EBLV-1。因此，存在对于中和EBLV-1的(人)抗体的需要。
还优选的是根据本发明的抗体或其抗原结合片段以400ng/ml或更低的IC90、更优选地以100ng/ml或更低的IC90、甚至更优选地以50ng/ml或更低的IC90和尤其优选地以1ng/ml或更低的IC90中和RABV CVS-11的感染。换句话说，对于90％中和(IC90)RABV分离群CVS-11(攻击病毒株11)需要的根据本发明的抗体或其抗原结合片段的浓度是400ng/ml或更低、优选地100ng/ml或更低、更优选地50ng/ml或更低、甚至更优选地1ng/ml或更低，尤其是在上面描述的假病毒中和试验中，并且优选地也在上面描述的RFFIT传染性病毒中和试验中。
一般而言，优选的是根据本发明的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。与多克隆抗体相比，单克隆抗体是单特异性抗体，即它们结合至特异性表位。因此，大大避免了意料之外的结合并且单克隆抗体与多克隆抗体相比被视为更安全。
优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段是人抗体、单克隆抗体、人单克隆抗体、纯化抗体、单链抗体、Fab、Fab’、F(ab')2、Fv或scFv。
因而本发明的抗体可以是人抗体、单克隆抗体、人单克隆抗体、重组抗体或纯化抗体。本发明还提供了本发明的抗体的片段，尤其是保留抗体的抗原结合活性的片段。这样的片段包括但不限于单链抗体、Fab、Fab’、F(ab')2、Fv或scFv。虽然说明书，包括权利要求书，在一些地方可能明确地涉及抗原结合片段(一种或多种)、抗体片段(一种或多种)、变体(一种或多种)和/或抗体的衍生物(一种或多种)，但是应当理解，术语“抗体”或“本发明的抗体”包括所有范畴的抗体，即抗原结合片段(一种或多种)、抗体片段(一种或多种)、变体(一种或多种)和抗体的衍生物(一种或多种)。
本发明的抗体的片段可以从抗体通过包括利用酶比如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶进行酶切的方法，和/或通过化学还原裂解二硫键获得。可选地，抗体的片段可以通过重或轻链的序列的一部分的克隆和表达来获得。抗体“片段”包括Fab、Fab’、F(ab')2和Fv片段。本发明还包括来源于本发明的抗体的重和轻链的单链Fv片段(scFv)。例如，本发明包括scFv，其包含来自本发明的抗体的CDR。还包括的是重或轻链单体和二聚体、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体以及单链抗体，例如单链Fv，在该单链Fv中重和轻链可变结构域通过肽连接体连接。
本发明的抗体片段可以赋予单价或多价相互作用并且包含在上面描述的多种结构中。例如，scFv分子可以被合成以创建三价“三链抗体”或四价“四链抗体(tetrabody)”。scFv分子可以包括导致二价微抗体(minibody)的Fc区的结构域。另外，本发明的序列可以是多特异性分子的组成，其中本发明的序列靶向本发明的表位并且分子的其它区结合至其它靶标。示例性的分子包括但不限于双特异性Fab2、三特异性Fab3、双特异性scFv和双抗体(Holliger和Hudson,2005,Nature Biotechnology9:1126-1136)。
一般而言，根据本发明的抗体或其抗原结合片段优选地包括在重链上的(至少)三种CDR和在轻链上的(至少)三种CDR。一般而言，互补决定区(CDR)是在重链可变结构域和轻链可变结构域中存在的高变区。典型地，抗体的重链和连接的轻链的CDR一起形成抗原受体。通常，三种CDR(CDR1、CDR2和CDR3)在可变结构域中非连续地排列。由于抗原受体通常由(两种不同的多肽链即重链和轻链上的)两种可变结构域组成，因此对于每种抗原受体存在六种CDR(重链：CDRH1、CDRH2和CDRH3；轻链：CDRL1、CDRL2和CDRL3)。单个抗体分子通常具有两种抗原受体并且因此包含十二种CDR。重和/或轻链上的CDR可以通过构架区分离，其中构架区(FR)是可变结构域中的区，其与CDR相比是较不“可变的”。例如，链(或者分别地每个链)可以由被三个CDR分离的四个框架区组成。
优选地，根据本发明的抗体的CDR，具体而言CDRH3来源于在人中发展的抗体。具体而言，根据本发明的抗体的CDR，具体而言CDRH3具有人起源或者其功能性序列变体。
已经确定了本发明的几种抗体的重链和轻链的序列，每种包括在重链上的三种CDR和在轻链上的三种CDR。CDR氨基酸的位置根据IMGT编号系统限定(IMGT:http://www.imgt.org/；cf.Lefranc,M.-P.等(2009)Nucleic Acids Res.37,D1006-D1012)。CDR、重链、轻链的序列以及编码本发明的抗体——即根据本发明的几种抗体——的CDR、重链、轻链的核酸分子的序列在序列表中公开。抗体重链的CDR也分别被称为CDRH1、CDRH2和CDRH3。同样地，抗体轻链的CDR也分别被称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。
优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段包括含有CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链和含有CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链，其中重链CDRH3包括与SEQ ID NO:3、21、39、57、77、95、113、131、149、167、185或203具有至少80％，优选地至少90％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO:95或167具有至少80％，优选地至少90％同一性的氨基酸序列是特别优选的。更优选地，抗体或其抗原结合片段的重链CDRH3包括SEQ ID NO:3、21、39、57、77、95、113、131、149、167、185或203的氨基酸序列，更优选地SEQ ID NO:95或167的氨基酸序列。在更一般的方面，本发明还包括抗体或其抗原结合片段，其包括含有CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链和含有CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链，其中重链CDRH3包括SEQ ID NO:3、21、39、57、77、95、113、131、149、167、185或203的氨基酸序列变体，其中SEQ ID NO:95或167的氨基酸序列变体是特别优选的。更优选地，重链包括至少两种CDRH3，其中一种重链CDRH3包括与SEQ IDNO:95具有至少80％，优选地至少90％同一性的氨基酸序列，和一种重链CDRH3包括与SEQID NO:167具有至少80％，优选地至少90％同一性的氨基酸序列。上面提及的序列变体具体而言是功能性序列变体，例如其中抗体与RABV(和非RABV)G蛋白(糖蛋白G)的结合被维持。
还优选的是，本发明的分离的抗体或其抗原结合片段包括含有CDR1、CDR2和CDR3的重链和含有CDR1、CDR2和CDR3的轻链，其中重链CDR3包括与SEQ ID NO:3、21、39、57、77、95、113、131、149、167、185或203，优选地与SEQ ID NO:95或167具有至少90％，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。更优选地，重链包括至少两种CDRH3，其中一种重链CDRH3包括SEQ ID NO:95的氨基酸序列，和一种重链CDRH3包括SEQ ID NO:167的氨基酸序列。上面提及的序列变体具体而言是功能性序列变体，例如其中抗体与RABV(和非RABV)G蛋白(糖蛋白G)的结合被维持。
表2提供了本发明的示例性抗体的重链和轻链的各自六种CDR的氨基酸序列的SEQID编号。
表2.本发明的示例性抗体的CDR多肽的SEQ ID编号。
变体抗体也包含在本发明的范围内。因而，在本申请中叙述的序列的变体也包含在本发明的范围内。在本文中提及的变体具体而言是功能性的，例如其中抗体与RABV(和非RABV)G蛋白(糖蛋白G)的结合被维持。这样的变体包括在体内免疫应答期间或者在体外培养无限增殖化B细胞克隆时通过体细胞突变生成的自然变体。可选地，由于遗传密码的简并性，变体可能出现，或者由于转录或翻译中的错误，变体可能产生。
具有改善的亲和力和/或效力的抗体序列的进一步变体可以使用本领域中已知的方法获得并且包含在本发明的范围内。例如，氨基酸置换可以被用于获得具有进一步改善的亲和力的抗体。可选地，核苷酸序列的密码子优化可以被用于改善用于产生抗体的表达系统中的翻译效率。进一步，包括通过将定向进化方法应用至本发明的核酸序列中的任一种来优化抗体特异性或中和活性的序列的多核苷酸也在本发明的范围内。
优选地，变体抗体序列可以与本申请中叙述的序列共享70％或更多(即75％、80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)氨基酸序列同一性。与构架区中相比，这样的变体通常与本文在重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)中列出的序列具有更大的同源性。如本领域技术人员已知的，在构架区中与在CDR中相比，突变是更加耐受的，即有限的或者不丧失功能(例如，特异性或中和能力)。
本发明因而包括抗体或其抗原结合片段，其中来自本文中提供的序列的变更优选地在抗体的构架区(一个或多个)中或者在编码抗体的构架区(一个或多个)的核酸残基中。
在本发明中，这样的(变体)抗体是优选的，其中体细胞突变的数目降低(即“种系(germlined)”抗体：回复至“种系”构型)。抗体的种系序列可以被确定，例如根据IMGT数据库(例如，根据IMGT VDJ和VJ分配和重排解释：http://www.imgt.org/；cf.Lefranc,M.-P.等(2009)Nucleic Acids Res.37,D1006-D1012)，并且例如通过基因合成或者通过定向诱变可以产生“种系”抗体变体。低水平的体细胞突变降低抗体免疫原性的潜在风险。优选地，体细胞突变的数目在构架区(FR)中减少(即“构架区种系”抗体，在本文中也被称为FR-GL变体)。分别地在构架区(FR)中没有任何体细胞突变的(变体)抗体或其抗原结合片段和FR-GL变体是更优选的。特别优选的是分别地具有尽可能少的体细胞突变的这样的(变体)抗体或其抗原结合片段，和FR-GL变体，其中在另一方面中和活性不受损(与包含(更多)体细胞突变的参比抗体/片段相比)。在一方面，这样的抗体的中和活性不受损，因而显示了非常高的效力和宽度。在另一方面，抗体免疫原性的潜在风险显著降低。
在优选的实施方式中，本发明的分离的抗体或抗体片段包括具有如下序列的至少一种CDR：该序列与SEQ ID NO:1-7、19-25、37-43、55-61、75-81、93-99、111-117、129-135、147-153、165-171、183-189或201-207的任一种具有至少95％序列同一性。本发明的抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列提供在下面的序列和SEQ ID编号的表格中。与六种CDR对应的氨基酸残基和编码它们的核酸残基以黑体文本强调。
优选地，根据本发明的分离的抗体或其抗原结合片段包括具有如下序列的多于一种CDR：该序列与SEQ ID NO:1-7、19-25、37-43、55-61、75-81、93-99、111-117、129-135、147-153、165-171、183-189或201-207的任一种具有至少95％序列同一性。
优选地，抗体或其抗原结合片段包括具有如下序列的两种CDR：该序列与SEQ IDNO:1-7、19-25、37-43、55-61、75-81、93-99、111-117、129-135、147-153、165-171、183-189或201-207的任一种具有至少95％序列同一性。因此，优选的是抗体或其抗原结合片段包括(i)CDRH1，其与SEQ ID NO:1、19、37、55、75、93、111、129、147、165、183或201的任一种具有至少95％序列同一性，和CDRL1，其与SEQ ID NO:4、22、40、58、78、96、114、132、150、168、186或204的任一种具有至少95％序列同一性；(ii)CDRH2，其与SEQ ID NO:2、20、38、56、76、94、112、130、148、166、184或202的任一种具有至少95％序列同一性，和CDRL2，其与SEQ ID NO:5、6、23、24、41、42、59、60、79、80、97、98、115、116、133、134、151、152、169、170、187、188、205或206的任一种具有至少95％序列同一性；或(iii)CDRH3，其与SEQ ID NO:3、21、39、57、77、95、113、131、149、167、185或203的任一种具有至少95％序列同一性，和CDRL3，其与SEQ IDNO:7、25、43、61、81、99、117、135、153、171、189或201的任一种具有至少95％序列同一性。
优选地，抗体或其抗原结合片段包括具有如下序列的三种CDR：该序列与SEQ IDNO:1-7、19-25、37-43、55-61、75-81、93-99、111-117、129-135、147-153、165-171、183-189或201-207的任一种具有至少95％序列同一性。因此，优选的是抗体或其抗原结合片段包括(i)CDRH1，其与SEQ ID NO:1、19、37、55、75、93、111、129、147、165、183或201的任一种具有至少95％序列同一性，CDRH2，其与SEQ ID NO:2、20、38、56、76、94、112、130、148、166、184或202的任一种具有至少95％序列同一性，和CDRH3，其与SEQ ID NO:3、21、39、57、77、95、113、131、149、167、185或203的任一种具有至少95％序列同一性；或(ii)CDRL1，其与SEQ ID NO:4、22、40、58、78、96、114、132、150、168、186或204的任一种具有至少95％序列同一性，CDRL2，其与SEQ ID NO:5、6、23、24、41、42、59、60、79、80、97、98、115、116、133、134、151、152、169、170、187、188、205或206的任一种具有至少95％序列同一性，和CDRL3，其与SEQ IDNO:7、25、43、61、81、99、117、135、153、171、189或201的任一种具有至少95％序列同一性。
优选地，抗体或其抗原结合片段包括具有如下序列的四种CDR：该序列与SEQ IDNO:1-7、19-25、37-43、55-61、75-81、93-99、111-117、129-135、147-153、165-171、183-189或201-207的任一种具有至少95％序列同一性。因此，优选的是抗体或其抗原结合片段包括(i)CDRH1，其与SEQ ID NO:1、19、37、55、75、93、111、129、147、165、183或201的任一种具有至少95％序列同一性，CDRH2，其与SEQ ID NO:2、20、38、56、76、94、112、130、148、166、184或202的任一种具有至少95％序列同一性，CDRH3，其与SEQ ID NO:3、21、39、57、77、95、113、131、149、167、185或203的任一种具有至少95％序列同一性，和CDRL，其与SEQ ID NO:4-6、20-22、36-38或52-54的任一种具有至少95％序列同一性；(ii)CDRL1，其与SEQ ID NO:4、22、40、58、78、96、114、132、150、168、186或204的任一种具有至少95％序列同一性，CDRL2，其与SEQ ID NO:5、6、23、24、41、42、59、60、79、80、97、98、115、116、133、134、151、152、169、170、187、188、205或206的任一种具有至少95％序列同一性，CDRL3，其与SEQ ID NO:7、25、43、61、81、99、117、135、153、171、189或201的任一种具有至少95％序列同一性，和CDRH，其与SEQ ID NO:1-3、19-21、37-39、55-57、75-77、93-95、111-113、129-131、147-149、165-167、183-185或201-203的任一种具有至少95％序列同一性，其中与SEQ ID NO:3、21、39、57、77、95、113、131、149、167、185或203的任一种具有至少95％序列同一性的CDRH3是特别优选的；(iii)CDRH1，其与SEQ ID NO:1、19、37、55、75、93、111、129、147、165、183或201的任一种具有至少95％序列同一性，CDRL1，其与SEQ ID NO:4、22、40、58、78、96、114、132、150、168、186或204的任一种具有至少95％序列同一性，CDRH2，其与SEQ ID NO:2、20、38、56、76、94、112、130、148、166、184或202的任一种具有至少95％序列同一性，和CDRL2，其与SEQ IDNO:5、6、23、24、41、42、59、60、79、80、97、98、115、116、133、134、151、152、169、170、187、188、205或206的任一种具有至少95％序列同一性；(iv)CDRH1，其与SEQ ID NO:1、19、37、55、75、93、111、129、147、165、183或201的任一种具有至少95％序列同一性，CDRL1，其与SEQ IDNO:4、22、40、58、78、96、114、132、150、168、186或204的任一种具有至少95％序列同一性，CDRH3，其与SEQ ID NO:3、21、39、57、77、95、113、131、149、167、185或203的任一种具有至少95％序列同一性，和CDRL3，其与SEQ ID NO:7、25、43、61、81、99、117、135、153、171、189或201的任一种具有至少95％序列同一性；或(v)CDRH2，其与SEQ ID NO:2、20、38、56、76、94、112、130、148、166、184或202的任一种具有至少95％序列同一性，CDRL2，其与SEQ ID NO:5、6、23、24、41、42、59、60、79、80、97、98、115、116、133、134、151、152、169、170、187、188、205或206的任一种具有至少95％序列同一性，CDRH3，其与SEQ ID NO:3、21、39、57、77、95、113、131、149、167、185或203的任一种具有至少95％序列同一性，和CDRL3，其与SEQ ID NO:7、25、43、61、81、99、117、135、153、171、189或201的任一种具有至少95％序列同一性。
优选地，抗体或其抗原结合片段包括具有如下序列的五种CDR：该序列与SEQ IDNO:1-7、19-25、37-43、55-61、75-81、93-99、111-117、129-135、147-153、165-171、183-189或201-207的任一种具有至少95％序列同一性。因此，优选的是抗体或其抗原结合片段包括选自如下的五种CDR：CDRH1，其与SEQ ID NO:1、19、37、55、75、93、111、129、147、165、183或201的任一种具有至少95％序列同一性，CDRH2，其与SEQ ID NO:2、20、38、56、76、94、112、130、148、166、184或202的任一种具有至少95％序列同一性，CDRH3，其与SEQ ID NO:3、21、39、57、77、95、113、131、149、167、185或203的任一种具有至少95％序列同一性，CDRL1，其与SEQ ID NO:4、22、40、58、78、96、114、132、150、168、186或204的任一种具有至少95％序列同一性，CDRL2，其与SEQ ID NO:5、6、23、24、41、42、59、60、79、80、97、98、115、116、133、134、151、152、169、170、187、188、205或206的任一种具有至少95％序列同一性，和CDRL3，其与SEQ ID NO:7、25、43、61、81、99、117、135、153、171、189或201的任一种具有至少95％序列同一性。
优选地，抗体或其抗原结合片段包括具有如下序列的六种CDR：该序列与SEQ IDNO:1-7、19-25、37-43、55-61、75-81、93-99、111-117、129-135、147-153、165-171、183-189或201-207的任一种具有至少95％序列同一性。因此，优选的是抗体或其抗原结合片段包括选自如下的六种CDR：CDRH1，其与SEQ ID NO:1、19、37、55、75、93、111、129、147、165、183或201的任一种具有至少95％序列同一性，CDRH2，其与SEQ ID NO:2、20、38、56、76、94、112、130、148、166、184或202的任一种具有至少95％序列同一性，CDRH3，其与SEQ ID NO:3、21、39、57、77、95、113、131、149、167、185或203的任一种具有至少95％序列同一性，CDRL1，其与SEQ ID NO:4、22、40、58、78、96、114、132、150、168、186或204的任一种具有至少95％序列同一性，CDRL2，其与SEQ ID NO:5、6、23、24、41、42、59、60、79、80、97、98、115、116、133、134、151、152、169、170、187、188、205或206的任一种具有至少95％序列同一性，和CDRL3，其与SEQ ID NO:7、25、43、61、81、99、117、135、153、171、189或201的任一种具有至少95％序列同一性。更优选地，抗体或其抗原结合片段包括：(i)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:1-5和7的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:1-4和6-7的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性；(ii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQID NO:19-23和25的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:19-22和24-25的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性；(iii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:37-41和43的氨基酸序列或者与SEQ IDNO:37-40和42-43的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性；(iv)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:55-59和61的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:55-58和60-61的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性；(v)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:75-79和81的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:75-78和80-81的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性；(vi)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:93-97和99的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:93-96和98-99的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性；(vii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:111-115和117的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:111-114和116-117的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性；(viii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:129-133和135的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:129-132和134-135的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性；(ix)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:147-151和153的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:147-150和152-153的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性；(x)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:165-169和171的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性；(xi)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:183-187和189的氨基酸序列或者与SEQID NO:183-186和188-189的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性；或(xii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:201-205和207的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:201-204和206-207的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性。
在特别优选的实施方式中，根据本发明的分离的抗体或其抗原结合片段包括重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQID NO:93-97和99的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:93-96和98-99的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性。
在另一特别优选的实施方式中，根据本发明的分离的抗体或其抗原结合片段包括重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:165-169和171的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性。
甚至更优选地，根据本发明的分离的抗体或其抗原结合片段包括：(i)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，分别地如在SEQ ID NO:1-5和7中或在SEQ ID NO:1-4和6-7中陈列的；(ii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，分别地如在SEQ ID NO:19-23和25中或在SEQ IDNO:19-22和24-25中陈列的；(iii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，分别地如在SEQ ID NO:37-41和43中或在SEQ ID NO:37-40和42-43中陈列的；(iv)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，分别地如在SEQ ID NO:55-59和61中或在SEQ ID NO:55-58和60-61中陈列的；(v)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，分别地如在SEQ ID NO:75-79和81中或在SEQ ID NO:75-78和80-81中陈列的；(vi)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，分别地如在SEQ ID NO:93-97和99中或在SEQ ID NO:93-96和98-99中陈列的；(vii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，分别地如在SEQ ID NO:111-115和117中或在SEQ ID NO:111-114和116-117中陈列的；(viii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，分别地如在SEQ ID NO:129-133和135中或在SEQ IDNO:129-132和134-135中陈列的；(ix)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，分别地如在SEQ ID NO:147-151和153中或在SEQ ID NO:147-150和152-153中陈列的；(x)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，分别地如在SEQ ID NO:165-169和171中或在SEQ ID NO:165-168和170-171中陈列的；(xi)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，分别地如在SEQ ID NO:183-187和189中或在SEQ ID NO:183-186和188-189中陈列的；或(xii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，分别地如在SEQ ID NO:201-205和207中或在SEQ ID NO:201-204和206-207中陈列的。
在本发明的抗体或其抗原结合片段——其具有至少一种CDR，即如上面描述的一种、两种、三种、四种、五种、六种CDR——的上面描述的实施方式中，抗体或其抗原结合片段的这样的实施方式是优选的，其包括与SEQ ID NO:3、21、39、57、77、95、113、131、149、167、185或203的任一种具有至少95％序列同一性的CDRH3。
还优选的是本发明的分离的抗体或其抗原结合片段包括重链CDR1，其具有SEQ IDNO:1、19、37、55、75、93、111、129、147、165、183或201的氨基酸序列或其序列变体；重链CDR2，其具有SEQ ID NO:2、20、38、56、76、94、112、130、148、166、184或202的氨基酸序列或其序列变体；和重链CDR3，其具有SEQ ID NO:3、21、39、57、77、95、113、131、149、167、185或203的氨基酸序列或其序列变体。在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗体片段包括含有如下的氨基酸序列的重链：(i)CDRH1的SEQ ID NO:1、CDRH2的SEQ ID NO:2和CDRH3的SEQID NO:3；(ii)CDRH1的SEQ ID NO:19、CDRH2的SEQ ID NO:20和CDRH3的SEQ ID NO:21；(iii)CDRH1的SEQ ID NO:37、CDRH2的SEQ ID NO:38和CDRH3的SEQ ID NO:39；(iv)CDRH1的SEQ ID NO:55、CDRH2的SEQ ID NO:56和CDRH3的SEQ ID NO:57；(v)CDRH1的SEQ ID NO:75、CDRH2的SEQ ID NO:76和CDRH3的SEQ ID NO:77；(vi)CDRH1的SEQ ID NO:93、CDRH2的SEQID NO:94和CDRH3的SEQ ID NO:95；(vii)CDRH1的SEQ ID NO:111、CDRH2的SEQ ID NO:112和CDRH3的SEQ ID NO:113；(viii)CDRH1的SEQ ID NO:129、CDRH2的SEQ ID NO:130和CDRH3的SEQ ID NO:131；(ix)CDRH1的SEQ ID NO:147、CDRH2的SEQ ID NO:148和CDRH3的SEQ IDNO:149；(x)CDRH1的SEQ ID NO:165、CDRH2的SEQ ID NO:166和CDRH3的SEQ ID NO:167；(xi)CDRH1的SEQ ID NO:183、CDRH2的SEQ ID NO:184和CDRH3的SEQ ID NO:185；或(xii)CDRH1的SEQ ID NO:201、CDRH2的SEQ ID NO:202和CDRH3的SEQ ID NO:203。
优选地，本发明的抗体或其抗原结合片段包括轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:4、22、40、58、78、96、114、132、150、168、186或204的氨基酸序列或其序列变体；轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:5、6、23、24、41、42、59、60、79、80、97、98、115、116、133、134、151、152、169、170、187、188、205或206的氨基酸序列或其序列变体；和轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:7、25、43、61、81、99、117、135、153、171、189或201的氨基酸序列或其序列变体。在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗体片段包括含有如下的氨基酸序列的轻链：(i)CDRL1的SEQ ID NO:4、CDRL2的SEQ ID NO:5或6和CDRL3的SEQ ID NO:7；(ii)CDRL1的SEQ ID NO:22、CDRL2的SEQID NO:23或24和CDRL3的SEQ ID NO:25；(iii)CDRL1的SEQ ID NO:40、CDRL2的SEQ ID NO:41或42和CDRL3的SEQ ID NO:43；(iv)CDRL1的SEQ ID NO:58、CDRL2的SEQ ID NO:59或60和CDRL3的SEQ ID NO:61；(v)CDRL1的SEQ ID NO:78、CDRL2的SEQ ID NO:79或80和CDRL3的SEQ ID NO:81；(vi)CDRL1的SEQ ID NO:96、CDRL2的SEQ ID NO:97或98和CDRL3的SEQ IDNO:99；(vii)CDRL1的SEQ ID NO:114、CDRL2的SEQ ID NO:115或116和CDRL3的SEQ ID NO:117；(viii)CDRL1的SEQ ID NO:132、CDRL2的SEQ ID NO:133或134和CDRL3的SEQ ID NO:135；(ix)CDRL1的SEQ ID NO:150、CDRL2的SEQ ID NO:151或152和CDRL3的SEQ ID NO:152；(x)CDRL1的SEQ ID NO:168、CDRL2的SEQ ID NO:169或170和CDRL3的SEQ ID NO:171；(xi)CDRL1的SEQ ID NO:186、CDRL2的SEQ ID NO:187或188和CDRL3的SEQ ID NO:189；或(xii)CDRL1的SEQ ID NO:204、CDRL2的SEQ ID NO:205或206和CDRL3的SEQ ID NO:207。
在本发明的另一个实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其包括重链CDR1、CDR2和CDR3，和轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列，其分别与SEQ ID NO:1-7、19-25、37-43、55-61、75-81、93-99、111-117、129-135、147-153、165-171、183-189和201-207的氨基酸序列具有至少80％，例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
优选地，抗体或其抗原结合片段根据gRVA122、gRVA144、gRVB185、gRVB492、gRVC3、gRVC20、gRVC21、gRVC38、gRVC44、gRVC58、gRVC68或gRVC111，优选地，其根据gRVC20或gRVC58。更优选地，抗体或其抗原结合片段是RVA122、RVA144、RVB185、RVB492、RVC3、RVC20、RVC21、RVC38、RVC44、RVC58、RVC68或RVC111，优选地RVC20或RVC58。
本发明人已经分离了十二种单克隆抗体(mAb)，其在本文中被称为RVA122、RVA144、RVB185、RVB492、RVC3、RVC20、RVC21、RVC38、RVC44、RVC58、RVC68和RVC111(见实施例1-4)。基于抗体RVA122、RVA144、RVB185、RVB492、RVC3、RVC20、RVC21、RVC38、RVC44、RVC58、RVC68和RVC111，具体而言基于RVA122、RVA144、RVB185、RVB492、RVC3、RVC20、RVC21、RVC38、RVC44、RVC58、RVC68和RVC111的VH和VL基因，如本文所使用的术语gRVA122、gRVA144、gRVB185、gRVB492、gRVC3、gRVC20、gRVC21、gRVC38、gRVC44、gRVC58、gRVC68或gRVC111指的是各自的“通用”抗体或其抗原结合片段，具有特定的氨基酸序列，由特定的核苷酸序列编码，如下面概述的。
如本文所使用，“gRVA122”指的是抗体或其抗原结合片段，具有根据SEQ ID NO:1的CDRH1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:8的CDRH1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:2的CDRH2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:9的CDRH2核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:3的CDRH3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:10的CDRH3核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:4的CDRL1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:11的CDRL1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:5或6的CDRL2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:12或13的CDRL2核苷酸序列编码；和根据SEQ IDNO:7的CDRL3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:14的CDRL3核苷酸序列编码。“gRVA122”的重链可变区(VH)具有根据SEQ ID NO:15的氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:17的核苷酸序列编码；和“gRVA122”的轻链可变区(VL)具有根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列，其由根据SEQID NO:18的核苷酸序列编码。
如本文所使用，“gRVA144”指的是抗体或其抗原结合片段，具有根据SEQ ID NO:19的CDRH1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:26的CDRH1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:20的CDRH2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:27的CDRH2核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:21的CDRH3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:28的CDRH3核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:22的CDRL1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:29的CDRL1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:23或24的CDRL2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:30或31的CDRL2核苷酸序列编码；和根据SEQID NO:25的CDRL3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:32的CDRL3核苷酸序列编码。“gRVA144”的重链可变区(VH)具有根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:35的核苷酸序列编码；和“gRVA144”的轻链可变区(VL)具有根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:36的核苷酸序列编码。
如本文所使用，“gRVB185”指的是抗体或其抗原结合片段，具有根据SEQ ID NO:37的CDRH1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:44的CDRH1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:38的CDRH2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:45的CDRH2核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:39的CDRH3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:46的CDRH3核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:40的CDRL1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:47的CDRL1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:41或42的CDRL2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:48或49的CDRL2核苷酸序列编码；和根据SEQID NO:43的CDRL3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:50的CDRL3核苷酸序列编码。“gRVB185”的重链可变区(VH)具有根据SEQ ID NO:51的氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:53的核苷酸序列编码；和“gRVB185”的轻链可变区(VL)具有根据SEQ ID NO:52的氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:54的核苷酸序列编码。
如本文所使用，“gRVB492”指的是抗体或其抗原结合片段，具有根据SEQ ID NO:55的CDRH1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:62的CDRH1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:56的CDRH2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:63的CDRH2核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:57的CDRH3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:64的CDRH3核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:58的CDRL1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:65的CDRL1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:59或60的CDRL2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:66或67的CDRL2核苷酸序列编码；和根据SEQID NO:61的CDRL3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:68的CDRL3核苷酸序列编码。“gRVB492”的重链可变区(VH)具有根据SEQ ID NO:69或70的氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:72或73的核苷酸序列编码；和“gRVB492”的轻链可变区(VL)具有根据SEQ ID NO:71的氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:74的核苷酸序列编码。
如本文所使用，“gRVC3”指的是抗体或其抗原结合片段，具有根据SEQ ID NO:75的CDRH1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:82的CDRH1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:76的CDRH2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:83的CDRH2核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:77的CDRH3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:84的CDRH3核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:78的CDRL1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:85的CDRL1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:79或80的CDRL2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:86或87的CDRL2核苷酸序列编码；和根据SEQID NO:81的CDRL3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:88的CDRL3核苷酸序列编码。“gRVC3”的重链可变区(VH)具有根据SEQ ID NO:89的氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:91的核苷酸序列编码；和“gRVC3”的轻链可变区(VL)具有根据SEQ ID NO:90的氨基酸序列，其由根据SEQID NO:92的核苷酸序列编码。
如本文所使用，“gRVC20”指的是抗体或其抗原结合片段，具有根据SEQ ID NO:93的CDRH1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:100的CDRH1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:94的CDRH2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:101的CDRH2核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:95的CDRH3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:102的CDRH3核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:96的CDRL1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:103的CDRL1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:97或98的CDRL2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:104或105的CDRL2核苷酸序列编码；和根据SEQ ID NO:99的CDRL3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:106的CDRL3核苷酸序列编码。“gRVC20”的重链可变区(VH)具有根据SEQ ID NO:107的氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:109的核苷酸序列编码；和“gRVC20”的轻链可变区(VL)具有根据SEQ ID NO:108的氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:110的核苷酸序列编码。
如本文所使用，“gRVC21”指的是抗体或其抗原结合片段，具有根据SEQ ID NO:111的CDRH1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:118的CDRH1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:112的CDRH2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:119的CDRH2核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:113的CDRH3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:120的CDRH3核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:114的CDRL1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:121的CDRL1核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:115或116的CDRL2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:122或123的CDRL2核苷酸序列编码；和根据SEQ ID NO:117的CDRL3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:124的CDRL3核苷酸序列编码。“gRVC21”的重链可变区(VH)具有根据SEQ ID NO:125的氨基酸序列，其由根据SEQ IDNO:127的核苷酸序列编码；和“gRVC21”的轻链可变区(VL)具有根据SEQ ID NO:126的氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:128的核苷酸序列编码。
如本文所使用，“gRVC38”指的是抗体或其抗原结合片段，具有根据SEQ ID NO:129的CDRH1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:136的CDRH1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:130的CDRH2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:137的CDRH2核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:131的CDRH3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:138的CDRH3核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:132的CDRL1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:139的CDRL1核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:133或134的CDRL2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:140或141的CDRL2核苷酸序列编码；和根据SEQ ID NO:135的CDRL3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:142的CDRL3核苷酸序列编码。“gRVC38”的重链可变区(VH)具有根据SEQ ID NO:143的氨基酸序列，其由根据SEQ IDNO:145的核苷酸序列编码；和“gRVC38”的轻链可变区(VL)具有根据SEQ ID NO:144的氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:146的核苷酸序列编码。
如本文所使用，“gRVC44”指的是抗体或其抗原结合片段，具有根据SEQ ID NO:147的CDRH1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:154的CDRH1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:148的CDRH2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:155的CDRH2核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:149的CDRH3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:156的CDRH3核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:150的CDRL1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:157的CDRL1核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:151或152的CDRL2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:158或159的CDRL2核苷酸序列编码；和根据SEQ ID NO:153的CDRL3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:160的CDRL3核苷酸序列编码。“gRVC44”的重链可变区(VH)具有根据SEQ ID NO:161的氨基酸序列，其由根据SEQ IDNO:163的核苷酸序列编码；和“gRVC44”的轻链可变区(VL)具有根据SEQ ID NO:162的氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:164的核苷酸序列编码。
如本文所使用，“gRVC58”指的是抗体或其抗原结合片段，具有根据SEQ ID NO:165的CDRH1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:172的CDRH1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:166的CDRH2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:173的CDRH2核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:167的CDRH3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:174的CDRH3核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:168的CDRL1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:175的CDRL1核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:169或170的CDRL2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:176或177的CDRL2核苷酸序列编码；和根据SEQ ID NO:171的CDRL3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:178的CDRL3核苷酸序列编码。“gRVC58”的重链可变区(VH)具有根据SEQ ID NO:179的氨基酸序列，其由根据SEQ IDNO:181的核苷酸序列编码；和“gRVC58”的轻链可变区(VL)具有根据SEQ ID NO:180的氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:182的核苷酸序列编码。
如本文所使用，“gRVC68”指的是抗体或其抗原结合片段，具有根据SEQ ID NO:183的CDRH1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:190的CDRH1核苷酸序列编码；根据SEQ ID NO:184的CDRH2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:191的CDRH2核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:185的CDRH3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:192的CDRH3核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:186的CDRL1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:193的CDRL1核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:187或188的CDRL2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:194或195的CDRL2核苷酸序列编码；和根据SEQ ID NO:189的CDRL3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:196的CDRL3核苷酸序列编码。“gRVC68”的重链可变区(VH)具有根据SEQ ID NO:197的氨基酸序列，其由根据SEQ IDNO:199的核苷酸序列编码；和“gRVC68”的轻链可变区(VL)具有根据SEQ ID NO:198的氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:200的核苷酸序列编码。
如本文所使用，“gRVC111”指的是抗体或其抗原结合片段，具有根据SEQ ID NO:201的CDRH1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:208的CDRH1核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:202的CDRH2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:209的CDRH2核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:203的CDRH3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:210的CDRH3核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:204的CDRL1氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:211的CDRL1核苷酸序列编码；根据SEQ IDNO:205或206的CDRL2氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:212或213的CDRL2核苷酸序列编码；和根据SEQ ID NO:207的CDRL3氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:214的CDRL3核苷酸序列编码。“gRVC111”的重链可变区(VH)具有根据SEQ ID NO:215的氨基酸序列，其由根据SEQ IDNO:217的核苷酸序列编码；和“gRVC111”的轻链可变区(VL)具有根据SEQ ID NO:216的氨基酸序列，其由根据SEQ ID NO:218的核苷酸序列编码。
优选地，根据gRVA122、gRVA144、gRVB185、gRVB492、gRVC3、gRVC20、gRVC21、gRVC38、gRVC44、gRVC58、gRVC68或gRVC111，优选地根据gRVC20和gRVC58的抗体具有1型IgG。
优选地，根据本发明的分离的抗体或抗原结合片段包括含有一种或多种(即一种、两种或所有三种)重链CDR的重链，该重链CDR来自gRVA122、gRVA144、gRVB185、gRVB492、gRVC3、gRVC20、gRVC21、gRVC38、gRVC44、gRVC58、gRVC68或gRVC111，优选地其根据gRVC20和gRVC58。
还优选的是根据本发明的分离的抗体或抗原结合片段包括轻链CDR，该轻链CDR来自gRVA122、gRVA144、gRVB185、gRVB492、gRVC3、gRVC20、gRVC21、gRVC38、gRVC44、gRVC58、gRVC68或gRVC111，优选地其根据gRVC20和gRVC58。
优选地，根据本发明的分离的抗体或抗原结合片段包括在表2中列出的抗体RVC20的所有CDR或者在表2中列出的抗体RVC58的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的抗体或抗原结合片段也可以优选地包括在表2中列出的抗体RVA122的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的抗体或抗原结合片段也可以优选地包括在表2中列出的抗体RVA144的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的抗体或抗原结合片段也可以优选地包括在表2中列出的抗体RVB185的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的抗体或抗原结合片段也可以优选地包括在表2中列出的抗体RVB492的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的抗体或抗原结合片段也可以优选地包括在表2中列出的抗体RVC3的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的抗体或抗原结合片段也可以优选地包括在表2中列出的抗体RVC21的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的抗体或抗原结合片段也可以优选地包括在表2中列出的抗体RVC38的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的抗体或抗原结合片段也可以优选地包括在表2中列出的抗体RVC44的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的抗体或抗原结合片段也可以优选地包括在表2中列出的抗体RVC68的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的抗体或抗原结合片段也可以优选地包括在表2中列出的抗体RVC111的所有CDR。
本发明的示例性抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列的SEQ ID编号以及编码它们的核酸序列的SEQ ID编号在表3中列出。
表3.根据本发明的示例性抗体的VH和VL氨基酸和核酸残基的SEQ ID编号。
VH氨基酸 VL氨基酸 VH核酸 VL核酸
RVA122 15 16 17 18
RVA144 33 34 35 36
RVB185 51 52 53 54
RVB492 69或70 71 72或73 74
RVC3 89 90 91 92
RVC20 107 108 109 110
RVC21 125 126 127 128
RVC38 143 144 145 146
RVC44 161 162 163 164
RVC58 179 180 181 182
RVC68 197 198 199 200
RVC111 215 216 217 218
优选地，根据本发明的分离的抗体或抗原结合片段包括具有如此氨基酸序列的重链可变区：该氨基酸序列与在SEQ ID NO:15、33、51、69、70、89、107、125、143、161、179、197或215的任一种中叙述的序列具有大约70％、75％、80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在另一实施方式中，抗体或抗体片段包括具有如此氨基酸序列的轻链可变区：该氨基酸序列与在SEQ ID NO:16、34、52、71、90、108、126、144、162、180、198或216中叙述的序列具有大约70％、75％、80％、85％、90％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在又另一优选的实施方式中，抗体或抗体片段包括具有如下氨基酸序列的重链或轻链可变区，该氨基酸序列与在图22-33中提供的序列具有大约70％、75％、80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
图22-33分别显示了抗体RVA122、RVA144、RVB185、RVB492、RVC3、RVC20、RVC21、RVC38、RVC44、RVC58、RVC68和RVC111的重链和轻链的氨基酸序列，以及编码它们的核酸序列。CDR的氨基酸序列和编码CDR的核酸序列以黑体文本显示，而构架区的氨基酸序列和编码构架区的核酸序列以普通文本显示。
优选地，根据本发明的分离的抗体或抗原结合片段包括(i)重链可变区，其与SEQID NO:15的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；和轻链可变区，其与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或(ii)重链可变区，其与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；和轻链可变区，其与SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或(iii)重链可变区，其与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；和轻链可变区，其与SEQID NO:52的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或(iv)重链可变区，其与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；和轻链可变区，其与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或(v)重链可变区，其与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；和轻链可变区，其与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或(vi)重链可变区，其与SEQID NO:89的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；和轻链可变区，其与SEQ ID NO:90的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或(vii)重链可变区，其与SEQ ID NO:107的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；和轻链可变区，其与SEQ ID NO:108的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或(viii)重链可变区，其与SEQ ID NO:125的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；和轻链可变区，其与SEQ ID NO:126的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或(ix)重链可变区，其与SEQ ID NO:143的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；和轻链可变区，其与SEQ ID NO:144的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或(x)重链可变区，其与SEQID NO:161的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；和轻链可变区，其与SEQ ID NO:162的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或(xi)重链可变区，其与SEQ ID NO:179的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；和轻链可变区，其与SEQ ID NO:180的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或(xii)重链可变区，其与SEQ ID NO:197的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；和轻链可变区，其与SEQ ID NO:198的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或(xiii)重链可变区，其与SEQ ID NO:215的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；和轻链可变区，其与SEQ ID NO:216的氨基酸序列具有至少80％，例如85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
更优选地，根据本发明的抗体或抗原结合片段包括：(i)包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区；或(ii)包括SEQ IDNO:33的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链可变区；或(iii)包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链可变区；或(iv)包括SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链可变区；或(v)包括SEQ ID NO:70的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQID NO:71的氨基酸序列的轻链可变区；或(vi)包括SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区；或(vii)包括SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:108的氨基酸序列的轻链可变区；或(viii)包括SEQID NO:125的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链可变区；或(ix)包括SEQ ID NO:143的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:144的氨基酸序列的轻链可变区；或(x)包括SEQ ID NO:161的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:162的氨基酸序列的轻链可变区；或(xi)包括SEQ ID NO:179的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:180的氨基酸序列的轻链可变区；或(xii)包括SEQ ID NO:197的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:198的氨基酸序列的轻链可变区；或(xiii)包括SEQ IDNO:215的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:216的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明的抗体的实例包括但不限于RVA122、RVA144、RVB185、RVB492、RVC3、RVC20、RVC21、RVC38、RVC44、RVC58、RVC68或RVC111，优选地RVC20或RVC58。优选地，抗体或其抗原结合片段根据gRVA122、gRVA144、gRVB185、gRVB492、gRVC3、gRVC20、gRVC21、gRVC38、gRVC44、gRVC58、gRVC68或gRVC111，优选地其根据gRVC20或gRVC58。
根据本发明的抗体或其抗原结合片段可以用于预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒，优选地RABV和/或非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒，更优选地RABV和/或EBLV-1的感染。该用途的进一步细节在下文描述，例如直接在下文描述和在药物组合物和医疗用途的背景下描述。
优选地，上面描述的根据本发明的抗体或其抗原结合片段的用途包括将所述抗体与另一种分离的单克隆抗体联合使用，该分离的单克隆抗体中和狂犬病毒属病毒感染并包括含有如下氨基酸序列的重链CDRH3，该氨基酸序列与SEQ ID NO:95或与SEQ ID NO:167具有至少80％，优选地至少90％同一性，并且其中这两种抗体特异性地结合至RABV的糖蛋白G上的不同表位。另一种抗体——即如此抗体：其中和狂犬病毒属病毒感染并包括含有如下氨基酸序列的重链CDRH3，该氨基酸序列与SEQ ID NO:95或与SEQ ID NO:167具有至少80％，优选地至少90％同一性——也优选地是根据本发明的抗体。
优选地，另一种抗体——即如此抗体：其中和狂犬病毒属病毒感染并包括含有如下氨基酸序列的重链CDRH3，该氨基酸序列与SEQ ID NO:95或与SEQ ID NO:167具有至少80％，优选地至少90％同一性——优选地包括(i)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别与SEQ ID NO:93-97和99的氨基酸序列或与SEQ ID NO:93-96和98-99的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％同一性；或(ii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别与SEQ ID NO:165-169和171的氨基酸序列或与SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％同一性。更优选地，另一种抗体——即如此抗体：其中和狂犬病毒属病毒感染并包括含有如下氨基酸序列的重链CDRH3，该氨基酸序列与SEQ ID NO:95或与SEQ ID NO:167具有至少80％，优选地至少90％同一性——包括重链可变区，其与SEQ ID NO:107或SEQ ID NO:179的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％同一性。甚至更优选地，另一种抗体——即如此抗体：其中和狂犬病毒属病毒感染并包括含有如下氨基酸序列的重链CDRH3，该氨基酸序列与SEQ ID NO:95或与SEQ ID NO:167具有至少80％，优选地至少90％同一性——包括(i)与SEQ ID NO:107的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:108的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的轻链可变区；或(ii)与SEQ ID NO:179的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重链可变区和与SEQID NO:180的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的轻链可变区。
从而，抗体与至少一种广谱抗体的组合被提供用于预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒，优选地RABV和/或非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒，更优选地RABV和/或EBLV-1的感染，包括EBLV-1中和。
优选地，如本文描述的根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段结合至RABV的糖蛋白G上的抗原位点I或III，并且以组合施用的另一种抗体结合至RABV的糖蛋白G上的抗原位点I或III的另一个。
有趣地，人抗狂犬病抗体最常识别RABV的糖蛋白G上的抗原位点I或III，而例如小鼠抗狂犬病抗体最常识别RABV的糖蛋白G上的抗原位点II。认为，抗原位点II的免疫原性优势在人中比在小鼠中低(Kramer RA,Marissen WE,Goudsmit J,Visser TJ,Clijsters-Vander Horst M,Bakker AQ,de Jong M,Jongeneelen M,Thijsse S,Backus HH,Rice AB,Weldon WC,Rupprecht CE,Dietzschold B,Bakker AB,de Kruif J(2005)The humanantibody repertoire specific for rabies virus glycoprotein as selected fromimmune libraries.Eur J Immunol.35(7):2131-45)。因此，识别RABV的糖蛋白G上的抗原位点I和III的抗体的组合被认为比例如包含识别RABV的糖蛋白G上的抗原位点II的抗体的组合更有效。
优选地，如本文描述的根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包括含有如此氨基酸序列的重链CDRH3，该氨基酸序列与SEQ ID NO:95具有至少80％，优选地至少90％同一性，并且其中以组合施用的另一种抗体包括含有如此氨基酸序列的重链CDRH3，该氨基酸序列与SEQ ID NO:167具有至少80％，优选地至少90％同一性。
优选地，如本文描述的根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包括重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ IDNO:93-97和99的氨基酸序列或与SEQ ID NO:93-96和98-99的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％同一性，和以组合施用的另一种抗体包括重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:165-169和171的氨基酸序列或与SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％同一性。更优选地，如本文描述的根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包括与SEQ IDNO:107的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:108的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的轻链可变区，和以组合施用的另一种抗体包括与SEQ IDNO:179的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:180的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的轻链可变区。甚至更优选地，如本文描述的根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段根据gRVC20并且其中以组合施用的另一种抗体根据gRVC58。
优选地，如本文描述的根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段和以组合施用的另一种抗体被同时或连续施用。
值得注意的是，如本文描述的根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段和以组合施用的另一种抗体可以单独地被施用，例如以单独的药物组合物，或者一起被使用，即作为抗体“混合物”，例如以相同的药物组合物。
优选地，如本文描述的根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段和以组合施用的另一种抗体单独地被施用。从而，如本文描述的根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段和以组合施用的另一种抗体可以同时或连续被施用。对于两种抗体的连续施用，第一种抗体施用(结束)和第二种抗体施用(开始)之间的时间，例如在暴露前预防或治疗狂犬病毒属病毒感染中，优选地不多于一周、更优选地不多于5天、甚至更优选地不多于3天、最优选地不多于2天和特别优选地不多于一天(24h)。在其优选的实施方式中，第一种抗体施用(结束)和第二种抗体施用(开始)之间的时间不多于12h、优选地不多于6h、更优选地不多于3h、甚至更优选地不多于1h、最优选地不多于30min和特别优选地不多于10min。在施用另一种抗体之后立即施用一种抗体的连续施用是特别优选的(具体而言，这意思是一种抗体的施用在施用另一种抗体结束之后少于10min时开始)。在上面描述的连续施用中，优选的是如本文描述的根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段首先被施用，并且以组合使用的另一种抗体在其后被施用。在上面描述的连续施用中，还优选的是以组合施用的另一种抗体首先被施用，并且如本文描述的根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段在其后被施用。在其一个优选的实施方式中，根据gRVC20的抗体首先被施用，并且根据gRVC58的抗体在其后被施用，如上面描述的。在其另一个优选的实施方式中，根据gRVC58的抗体首先被施用，并且根据gRVC20的抗体在其后被施用，如上面描述的。
还优选的是如本文描述的根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段和以组合施用的另一种抗体作为抗体混合物被施用，例如在本文描述的相同药物组合物中。
优选地，如本文描述的根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段和以组合施用的另一种抗体以等摩尔量被施用。
本发明进一步包括结合至与本发明的抗体或抗原结合片段相同的表位的抗体或其片段，或与本发明的抗体或抗原结合片段竞争的抗体。
优选地，该表位是RABV G蛋白(糖蛋白G)的抗原位点III.2、B或C。抗体CR57和CR4098都不结合至这些表位，但是它们分别结合至抗原位点I和III。但是根据本发明的几种抗体，即RVB181、RVC56、RVB185、RVC21、RVB161和RVC111结合至RABV G蛋白的抗原位点III.2。新型抗原位点III.2很可能靠近RABV G蛋白上的抗原位点III(见实施例3)。按照相同标准，三种另外的新型抗原位点被限定为名称A、B和C。位点B由抗体RVC44限定，其结合不被该组(panel)的任何其它抗体阻断。同样，位点C由抗体RVB143和RVC68限定，其与所有其它抗体相比也识别唯一的和独特的表位。值得注意的是，RVC44、RVB143和RVC68是该组仅有的能够通过蛋白质印迹在还原条件下结合至G蛋白的抗体，这暗示它们识别RABV G蛋白上的线性表位(见实施例3)。
优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段——其结合至与上面描述的抗体相同的表位——也以低于10000ng/ml的IC50中和RABV的感染和至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV和WCBV的感染，其中根据本发明的抗体或其抗原结合片段——其以低于10000ng/ml的IC50中和RABV的感染和至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV和WCBV的感染——的上面描述的优选实施方式也应用至根据本发明的抗体或其抗原结合片段，其结合至与上面描述的抗体相同的表位。
本发明的抗体还包括杂合抗体分子，其以低于10000ng/ml的IC50中和RABV的感染和至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIV、BBLV和WCBV的感染，如上面描述的，并且其包括来自本发明的抗体的一种或多种CDR和来自另一种抗体的相同表位的一种或多种CDR。在一个实施方式中，这样的杂合抗体包括来自本发明的抗体的三种CDR和来自另一种抗体的相同表位的三种CDR。示例性的杂合抗体包括(i)来自本发明的抗体的三种重链CDR和来自另一种抗体的相同表位的三种轻链CDR，或(ii)来自本发明的抗体的三种轻链CDR和来自另一种抗体的相同表位的三种重链CDR。
在另一方面，本发明还提供了包括多核苷酸的核酸分子，该多核苷酸编码根据本发明的如上面所描述的抗体或其抗原结合片段。编码本发明的抗体的轻和重链以及CDR的一部分或全部的核酸序列是优选的。因而，优选地，本文提供了编码本发明的示例性抗体的轻和重链以及CDR的一部分或全部的核酸序列。上面的表3提供了编码本发明的抗体的一些实例的重链和轻链可变区的核酸序列的SEQ ID编号。下面的表4提供了编码本发明的抗体的一些实例的CDR的核酸序列的SEQ ID编号。由于遗传密码的冗余性，编码相同氨基酸序列的这些核酸序列的变体将存在。
因而，本发明还包括含有编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的核酸分子。
核酸分子是包括核酸成分，优选地由核酸成分组成的分子。术语核酸分子优选地指DNA或RNA分子。其优选地与术语“多核苷酸”同义使用。优选地，核酸分子是包括核苷酸单体或由核苷酸单体组成的聚合物，这些核苷酸单体通过糖/磷酸骨架的磷酸二酯键彼此共价地连接。术语“核酸分子”也包括修饰的核酸分子，比如碱修饰的、糖修饰的或骨架修饰的等DNA或RNA分子。
表4.根据本发明的示例性抗体的CDR多核苷酸的SEQ ID编号。
优选地，根据本发明的核酸分子的多核苷酸序列与SEQ ID NO:8-14、17、18、26-32、35、36、44-50、53、54、62-68、72-74、82-88、91、92、100-106、109、110、118-124、127、128、136-142、145、146、154-160、163、164、172-178、181、182、190-196、199、200、208-214、217或218的任一种的核酸序列具有至少75％同一性。优选地，根据本发明的核酸分子的核苷酸序列根据SEQ ID NO:8-14、17、18、26-32、35、36、44-50、53、54、62-68、72-74、82-88、91、92、100-106、109、110、118-124、127、128、136-142、145、146、154-160、163、164、172-178、181、182、190-196、199、200、208-214、217或218的任一种，或其序列变体。
还优选的是根据本发明的核酸序列包括与编码本发明的抗体的重或轻链的可变区的核酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。在另一个实施方式中，本发明的核酸序列具有编码本发明的抗体的重或轻链CDR的核酸的序列。例如，根据本发明的核酸序列包括如此序列，该序列与SEQ ID NO:8-14、17、18、26-32、35、36、44-50、53、54、62-68、72-74、82-88、91、92、100-106、109、110、118-124、127、128、136-142、145、146、154-160、163、164、172-178、181、182、190-196、199、200、208-214、217或218的核酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在又另一优选的实施方式中，根据本发明的核酸序列包括与编码本发明的抗体的重或轻链的核酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，如图22-33中提供的。
一般而言，核酸分子可以被操作以插入、缺失或变更某些核酸序列。来自这样的操作的改变包括但不限于引入限制位点、修改密码子使用、添加或优化转录和/或翻译调控序列等的改变。也可能的是改变核酸以变更编码的氨基酸。例如，可以有用的是将一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)氨基酸置换、缺失和/或插入引入抗体的氨基酸序列。这样的点突变可以修饰效应子功能、抗原结合亲和力、翻译后修饰、免疫原性等，可以引入氨基酸用于附接共价基团(例如标记)或者可以引入标记物(例如，用于纯化目的)。突变可以被引入特定位点或者可以被随机引入，然后选择(例如，分子进化)。例如，编码本发明的抗体的CDR区、重链可变区或轻链可变区中的任一种的一种或多种核酸可以随机地或定向地产生突变以在编码的核酸中引入不同的性质。这样的改变可以是迭代过程的结果，其中最初改变被保留和在其它核苷酸位置处的新改变被引入。进一步，在独立步骤中实现的改变可以被组合。引入编码的核酸的不同性质可以包括但不限于加强的亲和力。
进一步包含在本发明的范围内的是载体，例如表达载体，其包括根据本发明的核酸序列。优选地，载体包括根据本发明的核酸分子，例如上面描述的核酸分子。
术语“载体”指的是核酸分子，优选地指的是人工核酸分子，即天然不存在的核酸分子。在本发明的背景下的载体适合于合并或具有期望的核酸序列。这样的载体可以是贮藏载体、表达载体、克隆载体、转移载体等。贮藏载体是允许方便贮藏核酸分子的载体。因而，载体可以包括例如与根据本发明的期望的抗体或其抗体片段对应的序列。表达载体可以被用于产生表达产物比如RNA，例如mRNA，或肽，多肽或蛋白质。例如，表达载体可以包括对于载体的序列延伸的转录需要的序列，比如启动子序列。克隆载体通常是包含克隆位点的载体，该克隆位点可以被用于将核酸序列并入载体。克隆载体可以是例如质粒载体或噬菌体载体。转移载体可以是适合于将核酸分子转移入细胞或生物体的载体，例如病毒载体。在本发明的背景下的载体可以是例如RNA载体或DNA载体。优选地，载体是DNA分子。例如，在本申请的意义下的载体包括克隆位点、选择标志比如维生素抗性因子、和适合于载体的操作的序列比如复制起点。优选地，在本申请的背景下的载体是质粒载体。
转化有这样的载体的细胞也包含在本发明的范围内。这样的细胞的实例包括但不限于真核细胞，例如酵母细胞、动物细胞或植物细胞。在一个实施方式中，细胞是哺乳动物，例如人、CHO、HEK293T、PER.C6、NS0、骨髓瘤或杂交瘤细胞。因此，本发明还涉及表达根据本发明的抗体或其抗原结合片段的细胞；或者包括根据本发明的载体的细胞。
具体而言，细胞可以转染有根据本发明的载体，优选地转染有表达载体。术语“转染”指的是将核酸分子比如DNA或RNA(例如，mRNA)分子引入细胞，优选地引入真核细胞。在本发明的背景下，术语“转染”包括用于将核酸分子引入细胞，优选地引入真核细胞，比如引入哺乳动物细胞的对于本领域技术人员而言已知的任何方法。这样的方法包括，例如，电穿孔、例如基于阳离子脂质和/或脂质体的脂质转染法、磷酸钙沉淀、基于纳米颗粒的转染、基于病毒的转染或基于阳离子聚合物的转染，比如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺等。优选地，引入是非病毒的。
本发明还涉及单克隆抗体，其结合至能够结合本发明的抗体或抗原结合片段的表位。因此，本发明包括分离的或纯化的免疫原性多肽，其包括特异性地结合至根据本发明的抗体或其抗原结合片段的表位。根据本发明的这样的免疫原性肽也可以被用于疫苗，例如用于与根据本发明的抗体组合使用的疫苗。
本发明提供了与本发明的中和抗体结合的新型表位。这些表位，具体而言抗原位点III.2、B和C，在RABV G蛋白(糖蛋白G)上发现，如上面描述的。
与本发明的抗体结合的表位可以是线性的(连续的)或构象的(不连续的)。优选地，本发明的抗体和抗体片段结合构象表位，更优选地，构象表位仅在非还原条件下存在。但是，具体而言，对于上面描述的抗原位点B和C，本发明的抗体和抗体片段也可以结合线性表位，更优选地，线性表位在非还原条件和还原条件二者下存在。
单克隆和重组抗体在鉴定和纯化针对它们的个别多肽或其它抗原中是特别有用的。本发明的抗体具有另外的实用性，因为它们可以被用作免疫测定、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)中的试剂。在这些应用中，抗体可以被标记有分析可检测的试剂比如放射性同位素、荧光分子或酶。抗体也可以被用于抗原的分子鉴定和表征(表位作图)。
本发明的抗体也可以偶联至递送至治疗位点的药物或者偶联至可检测标记以促进位点的成像，该位点包括感兴趣的细胞，比如感染了RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒的细胞。用于偶联抗体至药物和可检测标记的方法在本领域中是熟知的，如使用可检测标记的成像方法。标记的抗体可以在采用多种标记的多种试验中采用。本发明的抗体和感兴趣的表位(RABV和/或非RABV的表位)之间的抗体-抗原络合物的形成的检测可以通过将可检测的物质附接至抗体来促进。适合的检测方式包括使用标记比如放射性核素、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂、色原、酶底物或辅因子、酶抑制剂、辅基络合物、自由基、颗粒、染料等。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基络合物的实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例是鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；和适合的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。这样标记的试剂可以在多种熟知的试验中使用，比如放射免疫测定、酶免疫测定，例如ELISA、荧光免疫测定等。(参见例如，US 3,766,162；US 3,791,932；US 3,817,837和US 4,233,402)。
根据本发明的抗体可以缀合至治疗部分比如细胞毒素、治疗剂、或放射性金属离子或放射性同位素。放射性同位素的实例包括但不限于I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、Bi-213、Pd-109、Tc-99、In-111等。这样的抗体缀合物可以被用于修饰给定的生物反应；药物部分将不被解释为限于传统的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望的生物学活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质可以包括，例如毒素，比如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素。
用于缀合这样的治疗部分至抗体的技术是熟知的。参见，例如，Arnon等(1985)“Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy,”inMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy,ed.Reisfeld等(Alan R.Liss,Inc.),pp.243-256；ed.Hellstrom等(1987)“Antibodies for Drug Delivery,”in ControlledDrug Delivery,ed.Robinson等(2d ed；Marcel Dekker,Inc.),pp.623-653；Thorpe(1985)"Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy:A Review,"inMonoclonal Antibodies'84:Biological and Clinical Applications,ed.Pinchera等，pp.475-506(Editrice Kurtis,Milano,Italy,1985)；“Analysis,Results,and FutureProspective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in CancerTherapy,”in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,ed.Baldwin等(Academic Press,New York,1985),pp.303-316；和Thorpe等(1982)Immunol.Rev.62:119-158。
可选地，抗体或其抗体片段可以缀合至第二抗体或其抗体片段以形成抗体复共轭对配合物(heteroconjugate)，如在US 4,676,980中描述的。此外，连接体可以在本发明的标记和抗体之间使用(例如，US 4,831,175)。抗体或其抗原结合片段可以直接地用本领域中已知的放射性碘、铟、钇或其它放射性颗粒(例如，US 5,595,721)标记。治疗可以由利用同时或随后施用的缀合的或非缀合的抗体的治疗的组合组成(例如，WO00/52031；WO00/52473)。
本发明的抗体也可以附接至固相支持体。另外，本发明的抗体或其功能性抗体片段可以通过共价缀合至聚合物而被化学修饰以例如增加它们的循环半衰期。聚合物的实例和将它们附接至肽的方法在US 4,766,106；US 4,179,337；US 4,495,285和US 4,609,546中示出。在一些实施方式中，聚合物可以选自聚氧乙烯化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温下在水中是可溶的并且具有通式：R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R可以是氢，或保护基团比如烷基或烷醇基。优选地，保护基团可以具有1-8个碳原子。例如，保护基团是甲基。符号n是正整数。在一个实施方式中，n在1与1,000之间。在另一实施方式中，n在2与500之间。优选地，PEG的平均分子量在1,000和40,000之间，更优选地，PEG的分子量在2,000和20,000之间，甚至更优选地，PEG的分子量在3,000和12,000之间。而且，PEG可以具有至少一个羟基，例如PEG可以具有末端羟基。例如，其是被活化以与抑制剂上的游离氨基反应的末端羟基。但是，将理解，反应基团的类型和量可以改变以实现本发明的共价缀合的PEG/抗体。
水溶性聚氧乙烯化多元醇在本发明中也是有用的。它们包括聚氧乙烯化山梨醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化丙三醇(POG)等。在一个实施方式中，使用POG。不受任何理论的束缚，由于聚氧乙烯化丙三醇的丙三醇骨架是在例如动物和人中在单、二、三酸甘油酯中天然存在的相同的骨架，因此该分支将不一定被视为体内的外来物。POG可以具有与PEG相同范围的分子量。可以用于增加循环半衰期的另一种药物递送系统是脂质体。制备脂质体递送系统的方法对于本领域技术人员而言是已知的。其它药物递送系统在本领域中是已知的并且在例如引用的Poznansky等(1980)和Poznansky(1984)中描述。
本发明的抗体可以以纯化形式提供。通常，抗体将存在于基本上不含其它多肽的组合物中，例如，其中少于90％(按重量计)、通常地少于60％和更通常地少于50％的组合物由其它多肽组成。
本发明的抗体在非人(或者异源的)宿主，例如在小鼠中可以是免疫原性的。具体而言，抗体可以具有如此个体基因型，其在非人宿主是免疫原性的，但是在人宿主中不是免疫原性的。本发明的用于人用途的抗体包括不能容易地从宿主比如小鼠、山羊、兔、大鼠、非灵长类哺乳动物等分离并且通常不能通过人源化或从异种小鼠获得的那些。
本发明的抗体可以具有任何同种型(例如，IgA、IgG、IgM，即α、γ或μ重链)，但是将优选地是IgG。在IgG同种型内，抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类，其中IgG1是优选的。本发明的抗体可以具有κ或λ轻链。
抗体的产生
根据本发明的抗体可以通过本领域中已知的任何方法制造。例如，使用杂交瘤技术制造单克隆抗体的一般方法是熟知的(Kohler,G.和Milstein,C,.1975；Kozbar等1983)。在一个实施方式中，使用在WO2004/076677中描述的可选的EBV无限增殖化方法。
使用在WO 2004/076677中描述的方法，产生本发明的抗体的B细胞可以转化有EBV和多克隆B细胞活化剂。细胞生长和分化的另外的刺激剂可以任选地在转化步骤期间添加以进一步增强效率。这些刺激剂可以是细胞因子比如IL-2和IL-15。在一方面，IL-2在无限增殖化步骤期间添加以进一步提高无限增殖化效率，但是其使用不是必需的。使用这些方法产生的无限增殖化B细胞然后可以使用本领域中已知的方法培养并且自其分离抗体。
使用在WO 2010/046775中描述的方法，浆细胞可以以有限数目培养，或者在微孔培养板中作为单一浆细胞培养。抗体可以分离自浆细胞培养物。进一步，从浆细胞培养物，可以使用本领域中已知的方法提取RNA和进行PCR。抗体的VH和VL区可以通过RT-PCR(反转录PCR)扩增，测序并克隆入表达载体，该表达载体然后被转染入HEK293T细胞或其它宿主细胞。表达载体中核酸的克隆、宿主细胞的转染、转染的宿主细胞的培养和产生的抗体的分离可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。
如果需要，可以使用过滤、离心和各种色谱法比如HPLC或亲和色谱法进一步纯化抗体。用于纯化抗体比如单克隆抗体的技术，包括用于产生药用级别抗体的技术，在本领域中是熟知的。
本发明的抗体的片段可以通过如下方法从抗体获得：所述方法包括利用酶比如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶进行消化，和/或通过化学还原裂解二硫键。可选地，抗体的片段可以通过重或轻链的序列的一部分的克隆和表达获得。抗体“片段”包括Fab、Fab’、F(ab')2和Fv片段。本发明还包括来源于本发明的抗体的重和轻链的单链Fv片段(scFv)。例如，本发明包括含有来自本发明的抗体的CDR的scFv。还包括的是重或轻链单体和二聚体、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体以及单链抗体，例如，如此单链Fv：在该单链Fv中重和轻链可变结构域通过肽连接体连接。
本发明的抗体片段可以赋予单价或多价相互作用并且可以包含在如上面所描述的多种结构中。例如，scFv分子可以被合成以创建三价“三链抗体”或四价“四链抗体”。scFv分子可以包括导致二价微抗体的Fc区的结构域。另外，本发明的序列可以是多特异性分子的成分，其中本发明的序列靶向本发明的表位和分子的其它区结合至其它靶标。示例性分子包括但不限于双特异性Fab2、三特异性Fab3、双特异性scFv和双抗体(Holliger和Hudson,2005,Nature Biotechnology 9:1126-1136)。
分子生物学的标准技术可以被用于制备编码本发明的抗体或抗体片段的DNA序列。期望的DNA序列可以使用寡核苷酸合成技术完全地或部分地合成。定向诱变和聚合酶链反应(PCR)技术可以酌情使用。
任何适合的宿主细胞/载体系统可以被用于表达编码本发明的抗体分子或其片段的DNA序列。细菌，例如大肠杆菌和其它微生物系统可以部分地用于表达抗体片段比如Fab和F(ab’)2片段，并且尤其是Fv片段和单链抗体片段，例如单链Fv。真核，例如哺乳动物，宿主细胞表达系统，可以被用于产生更大的抗体分子，包括完整抗体分子。适合的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、HEK293T、PER.C6、NS0、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本发明还提供了用于产生根据本发明的抗体分子的方法，其包括在适合于由编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白质的条件下培养包括编码本发明的核酸的载体的宿主细胞，和分离抗体分子。
抗体分子可以包括仅重或轻链多肽，在该情况下仅重链或轻链多肽编码序列需要被用于转染宿主细胞。对于包括重和轻链二者的产物的产生，细胞系可以被转染有两种载体，编码轻链多肽的第一载体和编码重链多肽的第二载体。可选地，可以使用单一载体，所述载体包括编码轻链和重链多肽的序列。可选地，根据本发明的抗体可以通过如下过程产生：(i)在宿主细胞中表达根据本发明的核酸序列，和(ii)分离表达的抗体产物。另外，该方法可以包括(iii)纯化分离的抗体。可以筛选转化的B细胞和培养的浆细胞，用于产生期望特异性或功能的抗体的那些。
筛选步骤可以通过任何免疫测定，例如ELISA，通过组织或细胞(包括转染的细胞)的染色，通过中和试验或通过本领域中已知的用于鉴定期望特异性或功能的许多其它方法中的一种进行。试验可以基于一种或多种抗原的简单识别进行选择，或者可以另外基于期望的功能进行选择，例如以选择中和抗体而不仅仅是抗原结合抗体，以选择可以改变靶向的细胞的特性的抗体，比如它们的信号传导级联、它们的形状、它们的生长速率、它们影响其它细胞的能力、它们对其它细胞或其它试剂或在一些条件下的改变的影响的应答、它们的分化状态等。
个别转化的B细胞克隆体然后可以从阳性转化的B细胞培养物产生。用于从阳性细胞的混合物分离个别克隆的克隆步骤可以使用有限稀释、显微操作、单细胞沉积，通过细胞分选或本领域中已知的其它方法进行。
来自培养的浆细胞的核酸可以使用本领域中已知的方法在HEK293T细胞或其它已知的宿主细胞中分离、克隆和表达。
本发明的无限增殖化B细胞克隆或转染的宿主细胞可以以多种途径使用，例如，作为单克隆抗体的来源、作为编码感兴趣的单克隆抗体的核酸(DNA或mRNA)的来源、用于研究等。
本发明还提供了包括产生根据本发明的抗体的无限增殖化B记忆细胞或转染的宿主细胞的组合物。
本发明的无限增殖化B细胞克隆或培养的浆细胞也可以被用作克隆随后重组表达的抗体基因的核酸的来源。来自重组来源的表达比来自B细胞或杂交瘤的表达在制药目的方面是更普遍的，例如由于稳定性、再现性、易培养性(culture ease)等的原因。
因而，本发明还提供了用于制备重组细胞的方法，其包括如下步骤：(i)从编码感兴趣的抗体的B细胞克隆或者培养的浆细胞获得一种或多种核酸(例如，重和/或轻链mRNA)；(ii)将核酸插入表达载体和(iii)将载体转染入宿主细胞以便允许感兴趣的抗体在所述宿主细胞中表达。
类似地，本发明提供了用于制备重组细胞的方法，其包括如下步骤：(i)对来自编码感兴趣的抗体的B细胞克隆或者培养的浆细胞的核酸(一种或多种)进行测序；和(ii)使用来自步骤(i)的序列信息制备插入宿主细胞的核酸(一种或多种)以便于允许感兴趣的抗体在所述宿主细胞中的表达。核酸可以但不必在步骤(i)和(ii)之间操作以引入限制位点、以改变密码子使用、和/或以优化转录和/或翻译调控序列。
而且，本发明还提供了制备转染的宿主细胞的方法，其包括将宿主细胞转染有编码感兴趣的抗体的一种或多种核酸的步骤，其中核酸是来源于本发明的无限增殖化B细胞克隆或培养的浆细胞的核酸。因而，首先制备核酸(一种或多种)，然后使用其转染宿主细胞的过程可以在不同的时间通过不同的人在不同的地方(例如，在不同的国家)进行。
本发明的这些重组细胞然后可以被用于表达和培养目的。它们具体地可用于表达抗体用于大规模药物生产。它们也可以被用作药物组合物的活性成分。可以使用任何适合的培养技术，包括但不限于静置培养、滚瓶培养、腹水液、中空纤维型生物反应器筒、模块化微型发酵罐、搅拌釜、微载体培养、陶瓷芯灌注等。
用于从B细胞或浆细胞获得并测序免疫球蛋白基因的方法在本领域中是熟知的(例如，参见Kuby Immunology的第4章，第4版，2000)。
转染的宿主细胞可以是真核细胞，包括酵母和动物细胞，特别是哺乳动物细胞(例如CHO细胞、NS0细胞、人细胞比如PER.C6或HKB-11细胞、骨髓瘤细胞)，以及植物细胞。优选的表达宿主可以使本发明的抗体糖基化，具体地利用其自身在人中没有免疫原性的糖类结构。在一个实施方式中，转染的宿主细胞可以能够在无血清培养基中生长。在进一步实施方式中，转染的宿主细胞可以能够在不存在动物来源的产品的情况下在培养中生长。转染的宿主细胞也可以被培养以产生细胞系。
本发明还提供了用于制备编码感兴趣的抗体的一种或多种核酸分子(例如，重和轻链基因)的方法，其包括如下步骤：(i)根据本发明制备无限增殖化B细胞克隆或培养浆细胞；(ii)从B细胞克隆或培养的浆细胞获得编码感兴趣的抗体的核酸。进一步，本发明提供了用于获得编码感兴趣的抗体的核酸序列的方法，其包括如下步骤：(i)根据本发明制备无限增殖化B细胞克隆或培养浆细胞；(ii)对来自编码感兴趣的抗体的B细胞克隆或培养的浆细胞的核酸进行测序。
本发明进一步提供了制备编码感兴趣的抗体的核酸分子(一种或多种)的方法，其包括获得核酸的步骤，该核酸获得自本发明的转化的B细胞克隆或者培养的浆细胞。因而，首先获得B细胞克隆或者培养的浆细胞，然后从B细胞克隆或者培养的浆细胞获得核酸(一种或多种)的过程可以在不同的时间通过不同的人在不同的地方(例如，在不同的国家)进行。
本发明还包括用于制备根据本发明的抗体(例如，用于制药用途)的方法，其包括如下步骤：(i)获得和/或测序来自表达感兴趣的抗体的选择的B细胞克隆或者培养的浆细胞的一种或多种核酸(例如，重和轻链基因)；(ii)将核酸(一种或多种)插入表达载体或使用核酸(一种或多种)序列(一种或多种)制备表达载体；(iii)转染能够表达感兴趣的抗体的宿主细胞；(iv)在表达感兴趣的抗体的条件下培养或传代培养转染的宿主细胞；和任选地(v)纯化感兴趣的抗体。
本发明还提供了制备抗体的方法，其包括如下步骤：在表达感兴趣的抗体的条件下培养或传代培养转染的宿主细胞群，和任选地纯化感兴趣的抗体，其中所述转染的宿主细胞群已经通过如下过程制备：(i)提供编码感兴趣的选择抗体的核酸(一种或多种)，该感兴趣的选择抗体由上面描述的B细胞克隆或培养的浆细胞产生，(ii)将核酸(一种或多种)插入表达载体，(iii)在可以表达感兴趣的抗体的宿主细胞中转染载体，和(iv)培养或传代培养包括插入的核酸的转染的宿主细胞以产生感兴趣的抗体。因而，首先制备重组宿主细胞，然后培养其以表达抗体的过程可以在不同的时间通过不同的人在不同的地方(例如，在不同的国家)进行。
表位
如上面所提及，本发明的抗体可以被用于对与它们结合的表位进行作图。本发明提供了结合至已知表位的抗体，和结合至RABV G蛋白(糖蛋白G)上的新型表位的抗体。RABVG蛋白的这些表位和结合至表位的每一种的抗体的实例在实施例3和5中详细描述，并且更具体地涉及实施例6中的RABV G蛋白上的抗原位点I和III的保守。
一般而言，与本发明的抗体结合的表位可以是线性的(连续的)或构象的(不连续的)。在一个优选的实施方式中，本发明的抗体和抗体片段结合构象表位。还优选的是构象表位仅在非还原条件下存在。
即，两种参比抗体CR57和CR4098先前显示为分别识别RABV G蛋白抗原位点I和III(Bakker,A.B.H.等,J Virol 79,9062–9068,2005)。根据本发明的示例性抗体可以群集为6个组。RVA125、RVC3、RVC20和RVD74结合至抗原位点I组。值得注意的是，抗原位点I抗体与G蛋白的结合通过非抗原位点I抗体的亚组增强。RVA122、RVA144、RVB492、RVC4、RVC69、RVC38和RVC58结合至抗原位点III，其中RVC58表位可能仅部分地与抗原位点III重叠。由抗体RVB181、RVC56、RVB185、RVC21、RVB161和RVC111组成的第三个集群结合至抗原位点III.2，其可能接近G蛋白上的抗原位点III。三种另外的位点被命名为A、B和C。位点A由唯一抗体RVB686限定，其中RVB686结合可能诱导对G蛋白的变构效应，其损害(compromise)大多数其它抗体的结合。位点B由抗体RVC44限定。类似地，位点C由抗体RVB143和RVC68限定，与所有其它抗体相比，抗体RVB143和RVC68还识别唯一的和独特的表位。值得注意的是，RVC44、RVB143和RVC68是在还原条件下能够结合至G蛋白的该组仅有的抗体，这暗示它们识别RABVG蛋白上的线性表位。
结合至本发明的抗体的多肽可以具有许多用途。以纯化的或合成形式的多肽和其多肽变体可以被用于提升免疫应答(即，作为疫苗，或者用于产生抗体，用于其它用途)或者用于筛选血清的与表位或其模拟表位(mimotope)免疫反应的抗体。在一个实施方式中，这样的多肽或多肽变体，或包括这样的多肽或多肽变体的抗原，可以被用作提升免疫应答的疫苗，该疫苗包括与本发明中描述的那些具有相同品质的抗体。
而且，本发明还涉及根据本发明的抗体或其抗原结合片段在用于通过检查所述疫苗的抗原包含正确构象的特定表位来监测抗RABV和/或抗非RABV狂犬病毒属病毒疫苗的品质中的用途。
本发明的抗体和抗体片段也可以用在监测疫苗品质的方法中。具体而言，抗体可以被用于检查疫苗中的抗原包含正确构象的正确免疫原性表位。本发明的抗体或其抗原结合片段在用于通过例如检查所述疫苗的抗原包含正确构象的特定表位来监测疫苗抗RABV和/或抗非RABV狂犬病毒属病毒的品质中的用途也包含在本发明的范围内。
结合至本发明的抗体的多肽也可以用于筛选结合至所述多肽的配体。这样的配体包括但不限于抗体；包括来自骆驼、鲨鱼和其它物种的那些，抗体的片段、肽、噬菌体展示技术产物、适配体、adnectins或其它病毒或细胞蛋白的片段，其可以阻断表位并且从而阻止感染。这样的配体包含在本发明的范围内。
药物组合物
本发明提供了包括下列的一种或多种的药物组合物：本发明的抗体或抗体片段；编码这样的抗体或片段的核酸；编码核酸的载体；表达抗体或包括载体的细胞；或由本发明的抗体或抗原结合片段识别的免疫原性多肽。药物组合物也可以包含药学上可接受的运载体或赋形剂。优选地，药物组合物包括根据本发明的抗体或其抗原结合片段、根据本发明的核酸、根据本发明的载体、根据本发明的细胞或根据本发明的免疫原性多肽，和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或运载体。
虽然运载体或赋形剂可以促进施用，但是其自身不应当诱导对接受组合物的个体有害的抗体的产生。其也不应当有毒。适合的运载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，比如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物和灭活的病毒颗粒。
可以使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，比如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸的盐，比如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗组合物中的药学上可接受的运载体可以另外地包含液体比如水、盐水、丙三醇和乙醇。另外，辅助物质，比如湿润剂或乳化剂或pH缓冲物质可以存在于这样的组合物中。这样的运载体使得药物组合物能够配制为片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂和悬浮液，用于对象摄入。
本发明的组合物可以以多种形式制备。例如，组合物可以被制备为可注射剂，为液体溶液或悬浮液。也可以制备在注射之前适合于溶解在液体媒介或者悬浮在液体媒介中的固体形式(例如，冻干的组合物，如SynagisTM和HerceptinTM，用于利用包含防腐剂的无菌水重构)。组合物可以被制备用于外用施用，例如作为药膏、霜剂或粉末。组合物可以被制备用于口服施用，例如作为片剂或胶囊，作为喷雾剂，或作为糖浆剂(任选地调味的)。组合物可以被制备用于肺部施用，例如作为吸入剂，使用细粉末或喷雾剂。组合物可以被制备为栓剂或子宫托。组合物可以被制备用于鼻部、耳部或眼部使用，例如作为滴剂。组合物可以是试剂盒形式，其被设计使得组合的组合物刚好在施用至对象之前被重构。例如，冻干的抗体可以以含有无菌水或无菌缓冲剂的试剂盒形式提供。
将领会的是组合物中的活性成分将是抗体分子、抗体片段或其变体和衍生物。这样，其对于在胃肠道中的降解将是敏感的。因此，如果组合物通过使用胃肠道的途径施用，则组合物将需要包含保护抗体免受降解的药剂，但是一旦该药剂从胃肠道吸收，它立即释放抗体。
药学上可接受的运载体的全面讨论在Gennaro(2000)Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,20th edition,ISBN:0683306472中可获得。
本发明的药物组合物通常具有在5.8到8.5之间的pH，在一些实施方式中，其可以在6到8之间，并且在其它实施方式中，大约7。pH可以通过使用缓冲剂来维持。组合物可以是无菌的和/或无致热源的。相对于人，组合物可以是等渗的。在一个实施方式中，本发明的药物组合物在密闭容器中供应。
在本发明的范围内的是以几种施用形式存在的组合物；这些形式包括但不限于适合于肠胃外施用的那些形式，例如，通过注射或输注，例如通过快速浓注或连续输注。在产品用于注射或输注的情况下，其可以采取在油性或水性媒介中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且其可以包含配方剂(formulatory agent)，比如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，抗体分子可以是干燥形式，在使用之前利用适合的无菌液体重构。媒介通常被理解为如此材料：其适合于储存、运输和/或施用化合物，比如药学活性化合物，具体而言根据本发明的抗体。例如，媒介可以是生理学上可接受的液体，其适合于储存、运输和/或施用药学上活性化合物，具体而言根据本发明的抗体。一旦被配制，本发明的组合物可以直接地被施用至对象。在一个实施方式中，组合物适合于施用至哺乳动物，例如人对象。
本发明的药物组合物可以通过许多途径施用，包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、腹膜内、鞘内、心室内、透皮(transdermal)、经皮(transcutaneous)、外用、皮下、鼻内、肠内、舌下、阴道内或直肠途径。无针注射器(hypospray)也可以被用于施用本发明的药物组合物。通常，治疗组合物可以被制备为可注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可以制备在注射之前适合于溶解在液体媒介或者悬浮在液体媒介中的固体形式。
组合物的直接递送将通常通过皮下注射、腹膜内注射、静脉注射或肌肉内注射，或者递送至组织的胞间隙完成，其中静脉注射或者肌肉内注射是优选的，并且肌肉内注射是更优选的。组合物也可以被施用至损伤部位(lesion)。特别优选地，在暴露后预防中，根据本发明的组合物类似于已知狂犬病免疫球蛋白(RIG)被施用。例如，WHO推荐施用所有的RIG，或者解剖学上尽可能多的RIG至创伤部位(一个或多个)(例如，咬伤部位)或其周围以避免可能的腔隙综合征。剩余的免疫球蛋白，如果有的话，应当在远离疫苗施用的部位的部位处肌肉内施用(见http://www.who.int/rabies/human/WHO_strategy_prepost_exposure/en/index1.html#，在2014年11月12日检索)。因此，对于根据本发明的抗体和药物组合物，该施用方法也是特别优选的，至少在暴露后预防和可能地也在治疗或其它应用中。
剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。已知的基于抗体的药物关于施用频率提供了指导，例如，药物是否应当每日、每周、每月等递送。频率和剂量也可以取决于症状的严重程度。具体而言，狂犬病免疫球蛋白的治疗方案关于施用频率提供了指导。对于RIG，在暴露后预防中推荐的是仅一次施用RIG用于被动免疫接种，优选地在暴露后接种疫苗开始时，或者在暴露后接种疫苗开始之后尽快。因此，该治疗方案对于根据本发明的抗体和药物组合物也是特别优选的，至少在暴露后预防中。更一般而言，即对于所有应用，优选的是根据本发明的抗体或药物组合物以单剂量方案施用，即仅一次单剂量。因此，药物组合物优选地被提供为单剂量产品，即为包括仅一次单剂量的产品。但是，由于剂量可以取决于体重，因此在这种情况下，与最大体重对应的剂量被视为“单剂量”。
具体而言，优选的是根据本发明的药物组合物中抗体或其抗原结合片段的量不超过100mg，优选地不超过50mg，更优选地不超过20mg，甚至更优选地不超过10mg，和特别优选地不超过5mg。该量的抗体优选地指上面描述的单剂量。根据本发明的抗体的剂量——其在例如暴露后预防中是有效的——因而是非常低的，而HRIG的推荐量是20IU/kg体重，对于ERIG和F(ab’)2，其甚至是40IU/kg体重。根据本发明的抗体的这样低的量可以以稳定形式(即，冻干制剂，其中例如先前的研究已经显示了通过冻干保存的单克隆抗体在40℃下稳定33个月和在50℃下稳定5个月)和以对发展中国家也负担得起的成本生产和配制。
但是，根据本发明的抗体或药物组合物也可以例如在治疗方案中以多于一个剂量被施用，例如在严重的情况下。
优选地，根据本发明的组合物在RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒的感染已经发生之后被施用至对象。
药物组合物将包括有效量的本发明的一种或多种抗体和/或包含结合本发明的抗体的表位的多肽，即足以治疗、改善、减轻或预防期望疾病或病症，或足以展现可检测的治疗效果的量。治疗效果也包括致病效力和身体症状的降低或减轻。任何具体对象的精确有效量将取决于它们的尺寸、体重和健康、病症的性质和程度、以及选择用于施用的治疗剂或治疗剂的组合。对于给定情形，有效量由常规实验确定并且在临床医师的判断内。出于本发明的目的，在其被施用至的个体中，有效剂量通常是从大约0.005到大约100mg/kg、优选地从大约0.0075到大约75mg/kg、更优选地从大约0.01到大约60mg/kg、甚至更优选地从大约0.03到大约50mg/kg的本发明的抗体。
优选地，根据本发明的药物组合物包括根据本发明的至少两种抗体或其抗原结合片段，其中两种抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RABV的糖蛋白G上的不同表位。例如，根据本发明的药物组合物包括根据本发明的第一抗体或其抗原结合片段和根据本发明的第二抗体或其抗原结合片段，其中第一抗体或其抗原结合片段特异性地结合至与第二抗体或其第二抗原结合片段不同的RABV的糖蛋白G上的另一种表位。
即，根据本发明的两种抗体特异性地结合至RABV G蛋白，但是结合至RABV G蛋白上的不同表位。例如，一种抗体可以特异性地结合至RABV G蛋白上的抗原位点I，并且另一种抗体可以特异性地结合至RABV的糖蛋白G上的表位，其至少部分地与RABV的糖蛋白G上抗原位点III重叠。根据本发明的示例性抗体的抗原位点在实施例3中概述。而且，两种抗体是否结合至RABV G蛋白上的相同或不同表位可以由本领域技术人员容易地确定，例如通过使用任何竞争研究，其中竞争研究的实例在实施例3中显示。
优选地，由根据本发明的这样的药物组合物包括的至少两种抗体中的一种抗体(特异性地)结合至RABV的糖蛋白G上的抗原位点I，并且由根据本发明的这样的药物组合物包括的至少两种抗体中的另一种抗体(特异性地)结合至RABV的糖蛋白G上的抗原位点III。
更优选地，由根据本发明的这样的药物组合物包括的至少两种抗体中的至少一种或其抗原结合片段包括含有与SEQ ID NO:95或与SEQ ID NO:97具有至少80％、优选地至少90％同一性的氨基酸序列的重链CDRH3。
在根据本发明的优选的药物组合物中，至少两种抗体中的一种或其抗原结合片段包括(i)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别与SEQ ID NO:93-97和99的氨基酸序列或与SEQ ID NO:93-96和98-99的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性；或(ii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:165-169和171的氨基酸序列或与SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性。更优选地，至少两种抗体中的一种或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:107或SEQ ID NO:179的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％序列同一性的重链可变区。
在根据本发明的特别优选的药物组合物——其包括本文描述的根据本发明的至少两种抗体——中，至少两种抗体中的一种或其抗原结合片段包括重链CDRH3，其包括与SEQ ID NO:95具有至少80％、优选地至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中至少两种抗体中的另一种包括重链CDRH3，其包括与SEQ ID NO:167具有至少80％、优选地至少90％同一性的氨基酸序列。优选地，至少两种抗体中的一种或其抗原结合片段包括重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ IDNO:93-97和99的氨基酸序列或与SEQ ID NO:93-96和98-99的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％序列同一性，并且至少两种抗体的另一种包括重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:165-169和171的氨基酸序列或与SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％序列同一性。更优选地，至少两种抗体中的一种或其抗原结合片段根据gRVC20并且其中至少两种抗体中的另一种根据gRVC58。
根据本发明的两种抗体——其特异性地结合至RABV的糖蛋白G上的不同表位——的特别优选的实例是RVC20和RVC58。
而且，药物组合物也可以包含根据本发明的多于两种例如3、4、5、6种抗体等，其中包含的至少两种，优选地多于两种，更优选地所有抗体结合至RABV G蛋白上的不同表位。
优选地，根据本发明的(至少)两种抗体以等摩尔量存在于药物组合物中，优选地作为等摩尔混合物。
根据本发明的两种这样的抗体——其结合至RABV G蛋白的不同表位——的组合代表具有史无前例的反应宽度和具有降低风险的逃逸(escape)突变体选择的治疗。具体而言，根据本发明的两种或更多种单克隆抗体的组合，其中抗体结合至RABV G蛋白上的不同表位或位点，增加保护作用并且阻止病毒的抗性变体的逃逸。
优选地，组合物可以包括本发明的两种或更多种(例如，2、3、4、5种等)抗体以提供叠加的或协同的治疗效果。术语“协同”被用于描述两种或更多种活性药剂的组合效果，其比每种各自活性药剂的单一效果的总和更强。因而，在两种或更多种药剂的组合效果导致活性或过程的“协同抑制”的情况下，意图是活性或过程的抑制比每种各自活性药剂的抑制效果的总和更强。术语“协同治疗效果”指的是利用两种或更多种疗法的组合观察到的治疗效果，其中该治疗效果(如通过许多参数中的任一种测量的)比利用各自单独疗法观察到的单独治疗效果的总和更强。
在另一实施方式中，组合物可以包括本发明的一种或多种(例如，2、3种等)抗体，和针对RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒的一种或多种(例如，2、3种等)另外的抗体。进一步，本发明的抗体连同特异于其它病原体的抗体的施用在本发明的范围内。本发明的抗体可以组合/同时施用或者在与特异于除了RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒之外的病原体的抗体不同的时间处施用。
在另一实施方式中，本发明提供了包括两种或更多种抗体的药物组合物，其中第一抗体是本文描述的本发明的抗体，并且第二抗体对于不同病原体具有特异性，该不同病原体可能已经同时感染正在向其施用药物组合物的对象。
在特别优选的实施方式中，根据本发明的药物组合物与狂犬病疫苗联合施用(主动免疫接种)，具体而言在暴露后预防中。当前可利用的狂犬病疫苗包括最广泛使用的但是高风险倾向的神经组织疫苗，或者更安全的但是成本更高的细胞培养和鸡胚培养疫苗(CCEEV)。在德国，例如，仅两种抗狂犬病疫苗处于市售中，和“Tollwut-Impfstoff(人二倍体细胞[HDC])inaktiviert”。这些疫苗包含灭活的狂犬病毒。对于暴露前和暴露后使用而言，两种疫苗都是推荐的。狂犬病疫苗的另一个实例是Imovax(Sanofi-Pasteur)，其是商业的灭活的人二倍体细胞疫苗。狂犬病疫苗一般根据制造商的信息施用，其中典型的暴露后预防方案包括在感染后的第0、3、7、14和28天时施用疫苗。根据本发明的药物组合物(被动免疫接种)优选地仅施用一次，优选地同时或在接种疫苗开始后立即。优选地，根据本发明的药物组合物在远离疫苗的部位处施用。
对于RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒具有特异性并中和其的本发明的抗体的实例包括但不限于RVA122、RVA144、RVB185、RVB492、RVC3、RVC20、RVC21、RVC38、RVC44、RVC58、RVC68和RVC111。
根据gRVC20和gRVC58的抗体，更优选地抗体RVC20和RVC58的组合，具体而言等摩尔组合是特别优选的。RVC20结合至RABV G蛋白的抗原位点I和RVC 58结合至RABV的糖蛋白G上的表位，其至少部分地与RABV的糖蛋白G上的抗原位点III重叠。因而，包括如下的药物组合物是优选的：抗体RVC58和RVC20或其抗原结合片段，优选地以等摩尔量，和药学上可接受的运载体。
而且，包括根据gRVA122的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gRVA144的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gRVB185的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gRVB492的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gRVC3的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gRVC20的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gRVC21的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gRVC38的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gRVC44的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gRVC58的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gRVC68的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gRVC111的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。
另外，包括抗体RVA122或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体RVA144或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体RVB185或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体RVB492或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体RVC3或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体RVC20或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体RVC21或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体RVC38或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体RVC44或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体RVC58或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体RVC68或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体RVC111变体3或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。
抗体可以被施用至先前已经显示了对RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染无应答，即已经显示为对于治疗RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染失效(refractive)的那些对象。这样的治疗可以包括利用抗病毒药剂的先前治疗。这可以是由于例如被RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒的抗病毒抗性株的感染。
在一个实施方式中，本发明的组合物可以包括本发明的抗体，其中抗体可以占按组合物中的总蛋白质的重量计至少50％(例如，60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)。在这样的组合物中，抗体是纯化形式。
本发明提供了制备药物组合物的方法，其包括如下步骤：(i)制备本发明的抗体；和(ii)将纯化的抗体与一种或多种药学上可接受的运载体进行掺合。
在另一实施方式中，制备药物组合物的方法包括如下步骤：将抗体与一种或多种药学上可接受的运载体进行掺合，其中抗体是从本发明的转化的B细胞或培养的浆细胞获得的单克隆抗体。因而，首先获得单克隆抗体，然后制备药物的过程可以在不同的时间通过不同的人在不同的地方(例如，在不同的国家)进行。
作为出于治疗目的递送抗体或B细胞的替代方案，可能的是递送编码来源于B细胞或培养的浆细胞的感兴趣的单克隆抗体(或其活性片段)的核酸(通常地DNA)至对象，使得核酸可以在对象中原位表达以提供期望的治疗效果。适合的基因疗法和核酸递送载体是本领域中已知的。
本发明的组合物可以是免疫原性组合物，并且在一些实施方式中可以是包括抗原的疫苗组合物，该抗原包括由本发明的抗体或其抗原结合片段识别的表位，具体而言包括根据本发明的免疫原性多肽的药物组合物。根据本发明的这样的“疫苗”可以是预防性的(即，阻止感染)或治疗性的(即，治疗或减轻感染)。本发明的这样的疫苗组合物可以引起细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答二者从而有效地解决RABV和非RABV狂犬病毒属病毒感染。这种免疫应答可以诱导持久的(例如中和)抗体和细胞介导的免疫力，其在暴露于RABV和非RABV狂犬病毒属病毒时可以快速响应。
组合物可以包括抗菌剂，特别是如果以多剂量形式包装时。它们可以包括清洁剂，例如吐温(聚山梨醇酯)，比如吐温80。清洁剂通常以低水平存在，例如，低于0.01％。组合物也可以包括钠盐(氯化钠)以给予张度。10±2mg/ml NaCl的浓度是典型的。
进一步，组合物可以包括例如大约15-30mg/ml(例如，25mg/ml)的糖醇(例如，甘露醇)或二糖(例如，蔗糖或海藻糖)，特别是如果它们将被冻干或者如果它们包括已经由冻干材料重构的材料。用于冻干的组合物的pH在冻干之前可以调节至5和8之间，或5.5和7之间，或者大约6.1。
本发明的组合物也可以包括一种或多种免疫调节剂。在一个实施方式中，一种或多种免疫调节剂包括佐剂。
组分试剂盒(kit of parts)
在进一步方面，本发明提供了组分试剂盒，其包括本文描述的根据本发明的至少一种抗体或其抗原结合片段、本文描述的根据本发明的至少一种核酸、本文描述的根据本发明的至少一种载体、本文描述的根据本发明的至少一种细胞、本文描述的根据本发明的至少一种免疫原性多肽、和/或本文描述的根据本发明的至少一种药物组合物。
优选地，这样的组分试剂盒包括本文描述的根据本发明的至少两种不同的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RABV的糖蛋白G上的不同表位。这样的组分试剂盒对于本文描述的根据本发明的两种抗体的组合是特别有用的。该至少两种抗体可以作为单独实体存在于组分试剂盒中或者以组合例如作为混合物存在于组分试剂盒中，例如如果两种抗体包含在相同的药物组合物中。优选地，该至少两种不同的抗体在组分试剂盒中是单独实体，其可以由使用者根据需要进行混合。还优选的是该至少两种不同的抗体被组合，例如为混合物，例如如果两种抗体包含在相同的药物组合物中。
优选地，在这样的组分试剂盒中，至少两种抗体中的一种抗体结合至RABV的糖蛋白G上的抗原位点I，并且至少两种抗体中的另一种抗体结合至RABV的糖蛋白G上的抗原位点III。
还优选的是，在这样的组分试剂盒中，至少两种抗体中的至少一种或其抗原结合片段包括重链CDRH3，其包括与SEQ ID NO:95或与SEQ ID NO:167具有至少80％、优选地至少90％同一性的氨基酸序列。更优选地，在这样的组分试剂盒中，至少两种抗体中的至少一种或其抗原结合片段包括(i)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:93-97和99的氨基酸序列或与SEQ ID NO:93-96和98-99的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性；或(ii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:165-169和171的氨基酸序列或与SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性。甚至更优选地，在这样的组分试剂盒中，至少两种抗体中的一种或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:107或SEQ ID NO:179的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％序列同一性的重链可变区。
优选地，至少两种抗体中的一种或其抗原结合片段包括含有与SEQ ID NO:95具有至少80％、优选地至少90％同一性的氨基酸序列的重链CDRH3，和至少两种抗体中的另一种包括含有与SEQ ID NO:167具有至少80％、优选地至少90％同一性的氨基酸序列的重链CDRH3。更优选地，在这样的组分试剂盒中，至少两种抗体中的一种或其抗原结合片段包括重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:93-97和99的氨基酸序列或与SEQ ID NO:93-96和98-99的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性，和至少两种抗体中的另一种包括重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:165-169和171的氨基酸序列或与SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性。甚至更优选地，在这样的组分试剂盒中，至少两种抗体中的一种或其抗原结合片段根据gRVC20，和其中至少两种抗体中的另一种根据gRVC58。
医学治疗和用途
在进一步方面，本发明提供了根据本发明的抗体或其抗原结合片段、根据本发明的核酸、根据本发明的载体、根据本发明的细胞、根据本发明的免疫原性多肽或根据本发明的药物组合物在(i)预防具体而言暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染中；在(ii)针对RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染的接种疫苗中；或在(iii)诊断RABV和/或其它狂犬病毒属病毒感染中的用途。
优选地，本发明的抗体和抗体片段或其衍生物和变体可以被用于暴露后预防和治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染，即RABV感染或非RABV狂犬病毒属病毒感染或RABV和非RABV狂犬病毒属病毒的共同感染；用于阻止RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒的感染；或用于诊断RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染。优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可以用在暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒的感染中。
根据本发明的两种或更多种抗体的组合，例如根据本发明的2、3、4、5、6、7种等抗体的组合特别优选地在(i)预防具体而言暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染中使用；和在(ii)针对RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染的接种疫苗中使用。这样的组合可以是例如下文描述的组合疗法。而且，等摩尔量的两种或更多种抗体的施用是优选的。具体而言，分别包括根据RVC20和RVC58的六种CDR区的两种抗体的组合是优选的，根据RVC20和RVC58的两种抗体的组合是更优选的，和抗体RVC20和RVC58的组合是特别优选的。
而且，在两种或更多种抗体的这样的组合中，优选的是组合的至少两种、优选地多于两种、更优选地所有抗体结合至上面描述的RABV G蛋白上的不同表位。例如，组合中的第一抗体可以特异性地结合至RABV G蛋白上的抗原位点I，和第二抗体可以特异性地结合至RABV的糖蛋白G上的表位，其至少部分地与RABV的糖蛋白G上的抗原位点III重叠。根据本发明的示例性抗体的抗原位点在实施例3中概述。而且，两种或更多种抗体结合至RABV G蛋白上的相同或不同表位可以由本领域技术人员容易地确定，例如通过使用任何竞争研究，其中竞争研究的实例在实施例3中显示。根据本发明的两种或更多种抗体的组合的特别优选的实例是根据gRVC20和gRVC58的抗体的组合，优选地RVC20和RVC58的组合。而且，根据本发明的两种或更多种抗体的组合可以例如包括根据gRVA122、gRVA144、gRVB185、gRVB492、gRVC3、gRVC20、gRVC21、gRVC38、gRVC44、gRVC58、gRVC68和gRVC111的两种或更多种抗体的任意组合，优选地gRVA122、gRVA144、gRVB185、gRVB492、gRVC3、gRVC20、gRVC21、gRVC38、gRVC44、gRVC58、gRVC68和gRVC111的两种或更多种的任意组合。
优选地，根据本发明的两种或更多种抗体以等摩尔量的组合施用。
如本文所使用的“(两种或更多种)抗体的组合”指的是任意组合，例如该两种或更多种抗体可以包含在一种药物组合物中，或优选地，该两种或更多种抗体作为组合疗法被施用，具体而言，它们可以彼此单独地被施用，例如在单独的抗体制品中，例如在单独的药物组合物中。这意思是，在组合中，优选地组合抗体中的至少一种，更优选地组合抗体中的2、3、4、5或6种，更优选地组合抗体中的每种，单独地被施用。在组合疗法中，本发明的抗体可以组合/同时或连续地——即一种抗体，然后另一种抗体——被施用。
在另一实施方式中，组合可以包括本发明的一种或多种(例如，2、3种等)抗体和针对RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒的一种或多种(例如，2、3种等)另外的抗体。进一步，本发明的抗体与特异于其它病原体的抗体一起施用在本发明的范围内。
根据本发明的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞、免疫原性多肽或药物组合物可以被提供用作药物，用于(i)预防具体而言暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染；(ii)针对RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染的接种疫苗；或(iii)诊断RABV和/或其它狂犬病毒属病毒感染。
在本发明的范围内的是抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞、免疫原性多肽或药物组合物的几种施用形式和途径，如上面关于药物组合物描述的。这在本文描述的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞、免疫原性多肽的用途的背景下也适用，具体而言关于优选的施用形式和途径。
诊断方法可以包括将抗体或抗体片段与样本接触。这样的样本可以是组织样本，其取自例如鼻道、鼻窦(sinus cavity)、唾液腺、肺、肝、胰腺、肾脏、耳朵、眼睛、胎盘、消化道、心脏、卵巢、垂体、肾上腺、甲状腺、脑或皮肤。诊断方法也可以包括抗原/抗体络合物的检测。
因此，本发明提供了(i)根据本发明的抗体、抗体片段、或其变体和衍生物，(ii)根据本发明的无限增殖化B细胞克隆，(iii)能够结合本发明的抗体的表位，或(iv)配体，优选地抗体，其能够结合与本发明的抗体结合的表位，用于治疗。
优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段、根据本发明的核酸、根据本发明的载体、根据本发明的细胞、根据本发明的免疫原性多肽或根据本发明的药物组合物用在暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染中，其中抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞或药物组合物在感染后多达七天，优选地多达五天被施用。
如本文所使用的术语“暴露后预防”指的是一种治疗方案，其在暴露于病毒之后和狂犬病的首发症状可检测之前开始。但是，由于当前不存在真实(real)治疗，即在症状开始之后，对于狂犬病而言，也可以在狂犬病的首发症状可检测之后应用暴露后预防，但是，在这样的晚的时间进行常规暴露后预防已知是几乎无效的。
一般而言，暴露后预防在暴露于或者疑似暴露于病毒之后尽快，优选地在暴露后几小时直到多达24小时或多达48小时内开始。在该有限的时间窗中，暴露后预防已知是更有效的。
但是，根据本发明的抗体当在稍后的时间点，大概甚至在首发症状开始之后施用时也是有效的。因此，根据本发明的抗体相当地扩大了开始暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染的时间窗。优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞或药物组合物在感染后至少多达七天，优选地至少多达五天被施用。
还优选的是根据本发明的抗体或其抗原结合片段、根据本发明的核酸、根据本发明的载体、根据本发明的细胞、根据本发明的免疫原性多肽或根据本发明的药物组合物用在暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染中，其中抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞或药物组合物与疫苗优选地狂犬病疫苗、抗病毒药优选地利巴韦林、干扰素-α和/或氯胺酮组合施用。
如上面所描述，当前可利用的狂犬病疫苗包括包括最广泛使用的但是高风险倾向的神经组织疫苗，或者更安全的但是成本更高的细胞培养和鸡胚培养疫苗(CCEEV)。在德国，例如，仅两种抗狂犬病疫苗处于市售中，和“Tollwut-Impfstoff(人二倍体细胞[HDC])inaktiviert”。这些疫苗包含灭活的狂犬病毒。对于暴露前和暴露后使用而言，两种疫苗都是推荐的。狂犬病疫苗的另一个实例是Imovax(Sanofi-Pasteur)，其是商业的灭活的人二倍体细胞疫苗。狂犬病疫苗一般根据制造商的信息施用，其中典型的暴露后预防方案包括在感染后的第0、3、7、14和28天时施用疫苗。
抗病毒药指的是特定地用于治疗病毒感染的一类药物。与用于细菌的抗生素相同，特定的抗病毒药被用于特定的病毒。与大多数抗生素不同，抗病毒药物不破坏它们的靶病原体；相反它们抑制它们的发展。特别优选的是抗病毒药利巴韦林。
在优选的实施方式中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段、根据本发明的核酸、根据本发明的载体、根据本发明的细胞、根据本发明的免疫原性多肽或根据本发明的药物组合物用在暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染中，其中抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞或药物组合物以标准的PEP方案施用，优选地与疫苗组合施用，优选地仅在标准PEP方案的首次治疗中施用。
“标准PEP方案”通常指的是由WHO推荐的暴露后预防方案(见http://www.who.int/rabies/human/WHO_strategy_prepost_exposure/en/index1.html#，在2014年11月12日检索)，其中根据本发明的抗体代替RIG，即HRIG或ERIG。即，暴露后接种疫苗在暴露后利用本文描述的狂犬病疫苗尽快开始，其遵循制造商的方案，通常地至少两次注射。例如，标准方案包括暴露后第0、3、7、14和28天时注射疫苗。伴随(Concomittantly)首次注射或在其后尽快，施用仅有的和单一剂量的抗体。
当在暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染中使用时，优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段优选地以0.005到100mg/kg的剂量，优选地以0.0075到50mg/kg的剂量，更优选地以0.01到10mg/kg的剂量，甚至更优选地以0.01到1mg/kg的剂量，和特别优选地以0.01到0.1mg/kg的剂量施用。这样的剂量在上面描述的标准PEP方案中是特别优选的。
还优选的是，用于暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染的根据本发明的抗体或其抗原结合片段、根据本发明的核酸、根据本发明的载体、根据本发明的细胞、根据本发明的免疫原性多肽或根据本发明的药物组合物在感染后的1到6天，优选地2到5天时施用。
在另一个优选的不涉及标准PEP方案的实施方式中，用于暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染的根据本发明的抗体或其抗原结合片段在不伴随和/或随后施用疫苗的情况下被施用。
除了与疫苗组合施用之外，例如在标准PEP方案中，当在没有疫苗的情况下例如作为治疗狂犬病施用时，例如如果在暴露后的多于一天或两天施用，根据本发明的抗体也是有效的。
而且，优选的是，在用于暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染的根据本发明的抗体或其抗原结合片段中，或者在根据权利要求21-24中任一项的药物组合物中，抗体或其抗原结合片段以0.01到100mg/kg的剂量，优选地以0.1到75mg/kg的剂量，更优选地以1到60mg/kg的剂量，和甚至更优选地以10到50mg/kg的剂量施用。如果暴露是严重的和/或如果治疗在暴露后晚于1或2天开始，这样的“较高”剂量是特别优选的。
本发明还提供了治疗对象的方法，其包括给对象施用根据本发明的抗体、抗体片段、或其变体和衍生物，或者能够结合与本发明的抗体结合的表位的配体，优选地抗体。在一个实施方式中，方法导致对象中的RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染降低。在另一个实施方式中，方法阻止、降低风险或延迟对象中的RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染。
具体而言，本发明提供了预防和/或治疗对象中的RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染的方法，其中该方法包括给需要其的对象施用本文描述的根据本发明的抗体或其抗原结合片段、本文描述的根据本发明的核酸、本文描述的根据本发明的载体、本文描述的根据本发明的细胞、本文描述的根据本发明的免疫原性多肽和/或本文描述的根据本发明的药物组合物。这样的方法优选地包括本文描述的暴露后预防。还优选的是这样的方法包括针对RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染的接种疫苗。
本发明还提供了诊断对象中的RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染的方法，其中该方法包括给需要其的对象施用本文描述的根据本发明的抗体或其抗原结合片段、本文描述的根据本发明的核酸、本文描述的根据本发明的载体、本文描述的根据本发明的细胞、本文描述的根据本发明的免疫原性多肽和/或本文描述的根据本发明的药物组合物。
优选地，在根据本发明的上面描述的方法中，本文描述的根据本发明的至少两种抗体或其抗原结合片段被施用至对象，该抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RABV的糖蛋白G上的不同表位。优选地，至少两种抗体中的一种抗体结合至RABV的糖蛋白G上的抗原位点I，和至少两种抗体中的另一种抗体结合至RABV的糖蛋白G上的抗原位点III。优选地，至少两种抗体中的至少一种或其抗原结合片段包括重链CDRH3，其包括与SEQ ID NO:95或与SEQ ID NO:167具有至少80％、优选地至少90％同一性的氨基酸序列。更优选地，至少两种抗体中的至少一种或其抗原结合片段包括(i)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:93-97和99的氨基酸序列或与SEQ ID NO:93-96和98-99的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性；或(ii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:165-169和171的氨基酸序列或与SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性。甚至更优选地，至少两种抗体中的一种或其抗原结合片段包括重链CDRH3，其包括与SEQ ID NO:95具有至少80％、优选地至少90％同一性的氨基酸序列，并且至少两种抗体中的另一种包括重链CDRH3，其包括与SEQ ID NO:167具有至少80％、优选地至少90％同一性的氨基酸序列。特别优选地，至少两种抗体中的一种或其抗原结合片段包括重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:93-97和99的氨基酸序列或与SEQ ID NO:93-96和98-99的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性，并且至少两种抗体中的另一种包括重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地与SEQ ID NO:165-169和171的氨基酸序列或与SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％同一性。
本发明还提供了(i)根据本发明的抗体、抗体片段、或其变体和衍生物，(ii)根据本发明的无限增殖化B细胞克隆，(iii)能够结合本发明的抗体的表位，(iv)结合至能够结合本发明的抗体的表位的配体，优选地抗体，或(v)本发明的药物组合物在(i)制造用于治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒的感染的药物，(ii)疫苗，或(iii)诊断RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染中的用途。
本发明提供了被用作药物的本发明的组合物，所述药物用于预防或治疗RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染。其还提供了本发明的抗体和/或包括与这样的抗体结合的表位的蛋白质在制造用于治疗对象和/或对象中诊断的药物中的用途。其还提供了用于治疗对象的方法，包括给对象施用本发明的组合物的步骤。在一些实施方式中，对象可以是人。检查治疗处理的效率的一种方式包括在施用本发明的组合物之后监测疾病症状。治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
在一个实施方式中，根据本发明的抗体、抗体片段、无限增殖化B细胞克隆、表位或组合物被施用至需要这样的治疗的对象。这样的对象包括但不限于特别是处于RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染的风险下或者对RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染敏感的对象。
在本发明中描述的抗体和其片段也可以在用于诊断RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染的试剂盒中使用。进一步，能够结合本发明的抗体的表位可以在试剂盒中使用，该试剂盒用于通过检测保护性抗RABV或抗非RABV狂犬病毒属病毒抗体的存在监测接种疫苗过程的效率。在本发明中描述的抗体、抗体片段、或其变体和衍生物也可以在用于监测疫苗制品具有期望免疫原性的试剂盒中使用。
在本发明中描述的抗体和其片段也可以被用于通过检查抗RABV或抗非RABV狂犬病毒属病毒疫苗的抗原包含正确构象的特异性表位来监测所述疫苗的质量。
本发明还提供了特异性地结合至本发明的抗体或其抗原结合片段的表位，其用于(i)疗法中，(ii)制造用于治疗或减轻RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染的药物，(iii)作为疫苗，或(iv)筛选能够中和RABV和/或非RABV狂犬病毒属病毒感染的配体。
本发明还提供了制备药物组合物的方法，其包括将单克隆抗体与一种或多种药学上可接受的运载体掺合的步骤，其中该单克隆抗体是获得自本发明的转染的宿主细胞的单克隆抗体。因而，首先获得单克隆抗体(例如，表达它和/或纯化它)，然后将其与药物运载体(一种或多种)掺合的过程可以在不同的时间通过不同的人在不同的地方(例如，在不同的国家)进行。
从本发明的转化的B细胞或培养的浆细胞开始，可以进行培养、传代培养、克隆、亚克隆、测序核酸制品等的各个步骤，从而使由转化的B细胞或培养的浆细胞表达的抗体永存(perpetuate)，在每个步骤中任选的优化。在一个实施方式中，上述方法进一步包括应用至编码抗体的核酸的优化技术(例如，亲和力成熟或优化)。本发明包括在这样的步骤期间使用和制备的所有细胞、核酸、载体、序列、抗体等。
在所有这些方法中，在表达宿主中使用的核酸可以被操作以插入、缺失或变更某些核酸序列。来自这样的操作的改变包括但不限于引入限制位点、修改密码子使用、添加或优化转录和/或翻译调控序列等的改变。也可能的是改变核酸以变更编码的氨基酸。例如，可以有用的是将一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)氨基酸置换、缺失和/或插入引入抗体的氨基酸序列。这样的点突变可以修饰效应子功能、抗原结合亲和力、翻译后修饰、免疫原性等，可以引入氨基酸用于附接共价基团(例如标记)或者可以引入标记物(例如，用于纯化目的)。突变可以被引入特定位点或者可以随机引入，然后选择(例如，分子进化)。例如，编码本发明的抗体的CDR区、重链可变区或轻链可变区中的任一种的一种或多种核酸可以随机地或定向地产生突变以在编码的核酸中引入不同的性质。这样的改变可以是迭代过程的结果，其中原始改变被保留和在其它核苷酸位置处的新改变被引入。进一步，在独立步骤中实现的改变可以被组合。引入编码的核酸中的不同性质可以包括但不限于加强的亲和力。
下面的附图、序列和实施例意欲进一步阐明本发明。它们不意欲将本发明的主题限制于此。
附图描述
图1显示了本文提及的RABV和非RABV狂犬病毒属病毒分离群的特征的总结。这包括分离群名称、病毒种类和遗传谱系(如表1中显示的非RABV狂犬病毒属病毒分离群的)以及宿主种类、起源国家和年份、谱系和那个分离群的糖蛋白G的氨基酸和/或核苷酸序列的GenBank登录号，如果有的话。
图2分别显示了来自RABV疫苗的一组90和29个血浆样本的RABV G蛋白结合(A)和中和(B)的结果。黑色符号表示HRIG灰色符号表示针对记忆B细胞询问(interrogation)选择的4种供体。
图3显示了一组21种分离的人RABV中和抗体的所有遗传和功能特征的总结。显示了VH、VL和VK使用，与相应的种系基因的核苷酸同一性的百分比，对CVS-11 RABV假病毒(pp)的中和效力，其表达为能够中和90％的病毒传染性的ng/ml的IgG的浓度(IC90)，和在非还原或还原条件下蛋白质印迹(WB)中抗体的反应性。
图4显示了通过对21种分离的抗体和已知表位特异性的两种参比抗体(CR57和CR4098)进行ELISA执行的单克隆抗体交叉竞争矩阵(cross-competition matrix)的结果。显示了在上列中示出的生物素化抗体与左栏中列出的抗体的结合的抑制百分比。
图5显示了与三种参比抗体RAB1、CR57和CR4098以及多克隆人免疫球蛋白(HRIG，)相比，13种不同的狂犬病毒属病毒物种(22个病毒分离群)的中和的结果，其通过从分离组选择12种人单克隆抗体作为假病毒测试。显示了ng/ml的IC90值，其中IC90>10’000评分为阴性(如果IC90>50’000ng/ml，则/>中和的值评分为阴性)。
图6显示了与三种参比抗体RAB1、CR57和CR4098以及多克隆人免疫球蛋白(HRIG，)相比，8种不同的狂犬病毒属病毒物种(16个病毒分离群)的中和的结果，其通过从分离组选择12种人单克隆抗体作为传染性病毒测试。显示了ng/ml的IC50值，其中IC50>10’000评分为阴性(如果IC50>50’000ng/ml，则/>中和的值评分为阴性)。
图7显示了与两种参比CR57和CR4098抗体以及多克隆人免疫球蛋白(HRIG，)相比，13种不同的狂犬病毒属病毒物种的中和的结果，其通过从分离组选择12种人单克隆抗体作为假病毒(A，22个病毒分离群)或病毒(B，16个病毒分离群)测试。/>
图8显示了通过RVC20、RVC58、RAB1、CR57、CR4098单克隆抗体，或RVC20与RVC58或CR57与CR4098的组合以低于10000ng/ml的IC50(对于病毒)或IC90(对于假病毒)中和非RABV狂犬病毒属病毒分离群(n＝32)(A)和遗传谱系I非RABV狂犬病毒属病毒分离群(n＝22)(B)的百分比的总结。用于该分析的分离群(和它们的遗传谱系)的列举在图5和6中显示。N，在中和的分离群的计算中使用的分离群的数目。*，当IC50或IC90>50’000ng/ml时，HRIG评分为阴性；**，RAB1分别针对26个非RABV分离群和16个非RABV遗传谱系I分离群测试。
图9显示了通过来自我们组的选择的RVC20和RVC58抗体和两种参比CR57和CR4098抗体中和作为假病毒(实心圆，n＝2)或病毒(空心圆，n＝24)测试的RABV分离群的结果。
图10显示了RVC20和RVC58强力地中和多谱系RABV分离群。(A)通过来自我们组的选择的RVC20和RVC58抗体，参比CR57、CR4098和RAB1抗体以及HRIG中和作为假型病毒(实心圆，n＝8；显示了IC90值)或活病毒(空心圆，n＝27；显示了IC50值)测试的RABV分离群。CVS-11株中和使用活病毒(RFFIT试验，参见图11)显示。虚线表示高于1’000ng/ml的中和的阈值。显示了每个数据集的几何平均值。显示了Wilcoxon配对符号秩检验(****P<0.0001；***P<0.001)的P值。(B)从公共数据库检索的2215种G蛋白序列的系统树。用圆点强调的是在该工作中测试的RABV分离群的序列(两种G蛋白序列，即CV9.13和毛里塔尼亚/狗/2019-2006/V6235-2007，其是不可获得的并且因此不包含在树中)，包括通过FACS测试结合的那些(见图11)。
图11显示了测试的43种RABV分离群的总结。如图10中图解的RVC20、RVC58、CR57、CR4098和RAB1单克隆抗体以及HRIG的中和活性(病毒的IC50和假病毒的IC90，ng/ml)。RFFIT，快速荧光灶抑制试验；FAVN，荧光抗体病毒中和测试；PV，基于假病毒的中和试验。*，通过FACS测试结合至G蛋白转染子的病毒。
图12显示了作为病毒或假病毒测试的26种选择的RABV分离群的特征，以及如图9和10中图解的RVC20、RVC58、CR57、CR4098单克隆抗体和HRIG的ng/ml的中和活性。RFFIT，快速荧光灶抑制试验；FAVN，荧光抗体病毒中和测试；PV，基于假病毒的中和试验。显示了FAVN和RFFIT结果的IC50和PV结果的IC90。
图13显示了作为病毒或假病毒测试的28种选择的非RABV狂犬病毒属病毒分离群的特征，以及如图5、6和7中图解的RVC20、RVC58、CR57、CR4098单克隆抗体和HRIG的ng/ml的中和活性。RFFIT，快速荧光灶抑制试验；FAVN，荧光抗体病毒中和测试；PV，基于假病毒的中和试验。显示了FAVN和RFFIT结果的IC50和PV结果的IC90。
图14显示了通过根据本发明的一组12种选择的单克隆抗体和参比抗体RAB1、CR57和CR4098中和CVS-11和不同的CVS-11突变体的结果。黑色单元格表示完全中和，灰色单元格表示部分中和，并且白色单元格表示不中和。Nd，未测试。
图15显示了RVC20和RVC58靶向抗原位点I和III中高度保守的表位。抗原位点I和III中的氨基酸残基保守的水平通过分析来自2566种RABV的G蛋白序列来计算。饼状图显示在每个位置处氨基酸使用的详细分布。加下划线的残基表示在那个位置中携带相应残基的病毒通过RVC20或RVC58中和。(A)抗原位点I中氨基酸残基的频率；(B)抗原位点III中氨基酸残基的频率。
图16显示了来自所有测试的和测序的狂犬病毒属病毒的G蛋白的抗原位点序列的比对。分别显示了遗传谱系I非RABV和遗传谱系II-IV非RABV狂犬病毒属病毒。Nd，未测试。(A)在第一列中具有箭头的抗原位点I指示缺乏通过CR57的中和，并且在第二列(图版A的最右列)中的箭头指示缺乏通过RVC20的中和。(B)在第一列中具有箭头的抗原位点III指示缺乏通过CR4098的中和，在第二列中的箭头指示缺乏通过RAB1的中和，和在第三列(图版B的最右列)中的箭头指示缺乏通过RVC58的中和。虚线箭头指示弱的或部分的中和。
图17显示了用RABV CVS-11分离群感染，然后不处理或用标准PEP(HRIG和接种疫苗)或用两种不同剂量的RVC20+RVC58单克隆抗体的混合物(和接种疫苗)处理的叙利亚仓鼠中的百分比存活。RABV病毒肌肉内施用(50μl，105.7TCID50/ml)在左后腿的腓肠肌中。使用的疫苗是商业上灭活的人二倍体细胞疫苗(Imovax；Sanofi-Pasteur)并且肌肉内施用(0.05ml)在右后腿的腓肠肌中。
图18显示了通过ELISA测量的结合至G蛋白的仓鼠IgG抗体的水平(A)，仓鼠血清中和抗体的水平(B)和残余人IgG抗体的水平(C)，如对在未受攻击的叙利亚仓鼠中在利用RABV疫苗的免疫之后42天收集的血清测量的。
图19显示了用从被感染的狐狸(意大利/红狐狸/673/2011)的唾液腺分离的野生(field)RABV病毒感染，然后不处理，第1天时用标准PEP(即HRIG和接种疫苗)处理，或在感染后的第1、5或9天时用单一剂量的40mg/kg的RVC58+RVC20处理的叙利亚仓鼠的百分比存活。
图20显示了通过对死后CNS样本进行RT-PCR测量的RABV NP mRNA量(A)，和通过ELISA测量的结合至G蛋白的仓鼠IgG抗体的水平(B)，其来自图18中示出的实验。星号表示经不住感染的动物，方块动物显示为病毒攻击的位点的后腿的永久麻痹，和圆圈表示无症状动物。
图21显示了来自在感染后第5天时用RVC58和RVC20处理(A)或未处理(B)的两个有代表性的动物的脑、延髓和脊髓组织的组织学分析。具体而言，免疫组织化学分析旨在揭示RABV N抗原的存在以鉴定示病性包涵体(狂犬病包涵体)。
图22显示了抗体RVA122的重和轻链的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列。加黑强调的序列是CDR区(核苷酸或aa)，和加下划线的残基与“种系”序列相比是突变残基。
图23显示了抗体RVA144的重和轻链的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列。加黑强调的序列是CDR区(核苷酸或aa)，和加下划线的残基与“种系”序列相比是突变残基。
图24显示了抗体RVB185的重和轻链的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列。加黑强调的序列是CDR区(核苷酸或aa)，和加下划线的残基与“种系”序列相比是突变残基。
图25显示了抗体RVB492的重和轻链的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列。加黑强调的序列是CDR区(核苷酸或aa)，和加下划线的残基与“种系”序列相比是突变残基。
图26显示了抗体RVC3的重和轻链的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列。加黑强调的序列是CDR区(核苷酸或aa)，和加下划线的残基与“种系”序列相比是突变残基。
图27显示了抗体RVC20的重和轻链的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列。加黑强调的序列是CDR区(核苷酸或aa)，和加下划线的残基与“种系”序列相比是突变残基。
图28显示了抗体RVC21的重和轻链的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列。加黑强调的序列是CDR区(核苷酸或aa)，和加下划线的残基与“种系”序列相比是突变残基。
图29显示了抗体RVC38的重和轻链的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列。加黑强调的序列是CDR区(核苷酸或aa)，和加下划线的残基与“种系”序列相比是突变残基。
图30显示了抗体RVC44的重和轻链的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列。加黑强调的序列是CDR区(核苷酸或aa)，和加下划线的残基与“种系”序列相比是突变残基。
图31显示了抗体RVC58的重和轻链的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列。加黑强调的序列是CDR区(核苷酸或aa)，和加下划线的残基与“种系”序列相比是突变残基。
图32显示了抗体RVC68的重和轻链的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列。加黑强调的序列是CDR区(核苷酸或aa)，和加下划线的残基与“种系”序列相比是突变残基。
图33显示了抗体RVC111的重和轻链的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列。加黑强调的序列是CDR区(核苷酸或aa)，和加下划线的残基与“种系”序列相比是突变残基。
实施例
本发明的示例性实施方式在下面的实施例中提供。下面的实施例仅通过说明的方式提供并且用于帮助使用本发明的普通技术人员。这些实施例绝不意欲以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：
选择分离广谱中和抗体的狂犬病疫苗
为了分离不仅能够中和RABV分离群而且能够中和非RABV狂犬病毒属病毒的广谱中和抗体，通过ELISA筛选来自疫苗的90个血浆样本中结合至RABV G蛋白(CVS-11株)的高效价的抗体的存在(图2A)，并选择具有最高结合效价(EC50>50)的29个样本用于进一步分析。具体而言，测试选择的29个血浆样本中和一组12种假型狂犬病毒属病毒的能力，该组12种假型狂犬病毒属病毒包括遗传谱系I病毒RABV、DUVV、KHUV、EBLV1、ARAV、EBLV2、IRKV、ABLV，遗传谱系II病毒LABV、SHIBV、MOKV，和遗传谱系III WCBV(图2B)。人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)(Zydus Cadila)被包括作为参比。如预期的，所有样本中和，虽然具有可变的效价，同源RABV CVS-11分离群。其它狂犬病毒属病毒物种的中和概况在测试的所有供体——在一些情况下，所有物种被中和——中相当大地变化。值得注意的是，HRIG/>显示了仅针对非RABV遗传谱系I物种的适度活性，并且与遗传谱系II和III病毒没有交叉反应。该分析允许选择四种疫苗作为血液供体，用于随后分离和表征强力的广谱中和抗体。
实施例2：
分离和表征狂犬病广谱中和抗体
使用CD22微珠(Miltenyi Biotec)从四种选择疫苗的冷藏的PBMC分离IgG+记忆B细胞，然后通过细胞分选排除携带IgM、IgD和IgA的细胞。来自四种选择疫苗的记忆B细胞然后在如前面所描述(Traggiai,E.等,Nat.Med.10,871–875,2004)的多个复制孔中无限增殖EBV(爱泼斯坦-巴尔病毒)和CpG(CpG寡脱氧核苷酸2006)，并且培养物上清液然后使用基于384-孔的CSV-11RABV假型中和试验(CVS-11参比分离群，疫苗株)在初次筛选中测试。人胚肾293T细胞被用于产生慢病毒假型(狂犬病毒属病毒替代品(surrogate))。中和试验对幼仓鼠肾脏21细胞克隆13(BHK)进行。在384-孔板中，导致50-100×104相对光单位(RLU)输出的CVS-11假病毒用二倍稀释的血清在37％(5％CO2)下培育1h，然后加入3’000个BHK-21细胞。这些被培育进一步的48h，然后移除上清液并加入15μl Steadylite试剂(PerkinElmer)。5min后通过阅读Synergy微孔板光度计(microplate luminometer)(BioTek)(Wright,E.等,J Gen.Virol 89,2204–2213,2008)上的板来检测萤光素酶活性。收集并扩展阳性培养物。从这些阳性培养物，VH和VL序列通过RT-PCR恢复。RVC20和RVC58抗体被克隆入人IgG1和Igκ或Igλ表达载体(由Michel Nussenzweig,Rockefeller University,NewYork,US友好地提供)，基本上如描述的(Tiller T,Meffre E,Yurasov S,Tsuiji M,Nussenzweig MC,Wardemann H(2008)Efficient generation of monoclonal antibodiesfrom single human B cells by single cell RT-PCR and expression vectorcloning.J Immunol Methods329:112-124)。单克隆抗体由EBV无限增殖化的B细胞或通过293自由式细胞(Invitrogen)的瞬时转染产生。来自B细胞或转染细胞的上清液被收集并且IgG通过蛋白A或蛋白G色谱分析(GE Healthcare)进行亲和纯化并且针对PBS脱盐。
五百种人单克隆抗体由于它们中和RABV的能力被分离。筛选针对CVS-11RABV具有高中和效力的二十一种人单克隆抗体，IC90(中和90％病毒传染性的抗体浓度)范围在0.01到317ng/ml内(图3)，该人单克隆抗体由EBV无限增殖化B细胞产生并且通过蛋白A或蛋白G(在IgG3的情况下)色谱分析进行亲和纯化。也测试参比HRIG和两种其它人单克隆抗体(CR57和CR4098)——其被研发到III期以代替RIG(但是最近失败，这是由于针对一些循环野生RABV分离群缺乏中和活性)。另外，然后通过ELISA，所有抗体显示了结合至RABV G蛋白(CVS-11)。为了此目标，使用标准ELISA。简言之，将ELISA板涂覆有5μg/ml的RABV G蛋白，用在PBS中的10％FCS阻断，用血清或人抗体培育并洗涤。结合抗体通过用AP缀合的山羊抗人IgG(Southern Biotech)培育来检测。然后洗涤板，加入底物(p-NPP,Sigma)并且在405nm下阅读板。血清结合或单克隆抗体结合的相对亲和力通过测量在饱和下实现50％最大结合所需要的血清的稀释(ED50)或抗体的浓度(EC50)来确定。
为了理解关联表位是否是构象的，RABV G蛋白在还原(RED)或非还原(NR)条件下在SDS-PAGE凝胶上运行，并通过利用所有分离的人单克隆抗体的蛋白质印迹探测。除了有些例外(RVB143、RVC44和RVC68)，在还原条件下所有抗体都不结合至RABV G蛋白，这暗示识别的表位是构象的(图3)。
实施例3：
抗体竞争研究：确定RABV G蛋白上的抗原位点
然后进行竞争研究以确定由该组的所有抗体识别的构象表位中每种的空间接近性。两种参比抗体CR57和CR4098先前显示为分别识别G蛋白抗原位点I和III(Bakker,A.B.H.等,J Virol 79,9062–9068,2005；de Kruif,J.等,Annu Rev Med 58,359–368,2007)，并且因此在该试验中被用作探针以映射(map)我们组的每种抗体的特异性。具体而言，选择的CR57、CR4098和所有21种抗体被纯化并用生物素标记，然后在全矩阵竞争试验中通过ELISA测试，其中未被标记的抗体首先在10μg/ml的浓度下在RABV G蛋白涂覆的板上培育，接着加入100ng/ml浓度的生物素化抗体(即100倍低于未被标记的抗体)，其结合用碱性磷酸酶缀合的链霉抗生物素揭示。结果在图4中示出，并且表示以所有可能组合(即21×21)的标记抗体的结合的阻断百分比并用于将抗体群集为6个组。当解释竞争结果时，应当考虑如果两种表位重叠，或者由两种抗体的臂(arm)覆盖的区域重叠，则竞争应当是几乎完全的。弱的抑制性或增强作用可以反映亲和力的降低，这是由于空间或别构效应。
RVA125、RVC3、RVC20和RVD74根据与CR57的竞争和它们的相互竞争被分配到抗原位点I组。值得注意的是，抗原位点I抗体与G蛋白的结合通过非抗原位点I抗体的亚组加强。RVA122、RVA144、RVB492、RVC4、RVC69、RVC38和RVC58根据与CR4098的竞争和它们的相互竞争被分配到抗原位点III。RVC58显示了仅与CR4098的部分竞争(即64％)以及与非抗原位点I和III抗体的竞争，因而暗示了RVC58表位可能仅部分地与抗原位点III重叠。由抗体RVB181、RVC56、RVB185、RVC21、RVB161和RVC111组成的第三簇被命名为III.2，因为所有这些生物素化抗体的结合被所有抗原位点III抗体阻断，但是相互地，所有这些抗体不能够阻断几种抗原位点III抗体比如CR4098、RVC4和RVC69的结合。在解释竞争结果中，应当考虑当两种表位重叠时，或者当由两种抗体的臂覆盖的区域重叠时，则竞争应当是几乎完全的。弱的抑制性或增强作用可以简单地反映亲和力的降低，这是由于空间或别构效应。出于该原因，在此，我们已经限定了称为III.2的新型位点，其很可能接近G蛋白上的抗原位点III。按照相同的标准，三个另外的位点被限定，命名为A、B和C。位点A由唯一抗体RVB686限定，其结合损害该组的大多数标记抗体的结合，但是相互地，标记的RBV686的结合不被该组的任何抗体阻断。这些结果可能暗示RBV686结合诱导损害大多数其它抗体的结合的对G蛋白的变构效应。位点B由抗体RVC44限定，其结合不被该组的任何其它抗体阻断。类似地，位点C由抗体RVB143和RVC68限定，抗体RVB143和RVC68与所有其它抗体相比也识别唯一的和不同的表位。值得注意的是，RVC44、RVB143和RVC68是该组仅有的能够通过蛋白质印迹在还原条件下结合至G蛋白的抗体，这暗示它们识别RABV G蛋白上的线性表位。
实施例4：
根据本发明的抗体强力地中和RABV和非RABV狂犬病毒属病毒
针对使用假型(22个分离群，如图5中所示)和传染性病毒(16个分离群，如体6中所示)的一大组狂犬病毒属病毒，连同参比抗体CR57、CR4098、RAB1和(HRIG)，选择22种抗体中的十二种测试它们的效力和识别RABV G蛋白上的不同位点，该一大组狂犬病毒属病毒涵盖RABV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOK、SHIBV、BBLV、WCBV和IKOV物种(图5、6和7)。
假型病毒的生产和中和试验。人胚肾293T克隆17细胞(HEK 293T/17；ATCC CRL-11268)被用于生产慢病毒假型。中和试验对BHK-21细胞克隆13(ATCC CCL-10)进行。在384-孔板中，导致50-100×104相对光单位(RLU)输出的假型病毒用二倍稀释的血清或抗体在37％(5％CO2)下培育1h，然后加入3’000个BHK-21细胞。这些被培育进一步的48h，然后移除上清液并加入15μl Steadylite试剂(Perkin Elmer)。5min后通过阅读Synergy微孔板光度计(BioTek)(Wright等2008)上的板来检测萤光素酶活性。传染性的降低通过比较存在和不存在抗体情况下的RLU来确定并且表达为中和百分比。单克隆抗体的中和效力在此被测量为IC90，其被限定为RLU降低90％的抗体浓度——在减去细胞对照孔中的背景RLU之后与病毒对照孔相比(血清为ID50，即RLU降低50％的血清稀释)。血清的ID50值对应于RLU降低50％的稀释。
狂犬病毒属病毒细胞适应和体外中和试验。选择的RABV和非RABV狂犬病毒属病毒在Neuro-2A(ATCC目录号CCL-131)上分离，进一步细胞适应和产生细胞工作原液并在BSR细胞(BHK-21的克隆)上滴定。分别从荧光抗体病毒中和(mFAVN)和从快速荧光灶抑制(mRFFIT)测试(FAVN:Cliquet,F.等.,J.Immunol Methods 212,79–87,1998；RFFIT:Smith,J.S.等.,Bull.World Health Organ.48,535–541,1973,Warrell MJ,Riddell A,Yu LM,Phipps J,Diggle L,Bourhy H,Deeks JJ,Fooks AR,Audry L,Brookes SM等(2008)Asimplified 4-site economical intradermal post-exposure rabies vaccineregimen:a randomised controlled comparison with standard methods.PLoS NeglTrop Dis 2:e224)轻微修改的两种方案被用于在研究下测试抗体的效力。CVS-11工作原液被扩增，并且分别根据适应的中和测试——RFFIT或FAVN——在BSR或BHK-21上滴定。同样地，进行标准FAVN和RFFIT试验以评估测试的抗体对CVS-11的效力。简言之，mFAVN试验基于标准FAVN但是在BSR细胞上进行。
中和的截止是高于10000ng/ml的IC90(假型病毒)或IC50(传染性病毒)。换句话说，如果关于抗体实现高于10000ng/ml的IC90(假型病毒)或IC50(传染性病毒)，则各自抗体被视为“不中和”。
在假型中和试验中测试的抗原位点I抗体之中(Wright,E.等,J Gen.Virol 89,2204–2213,2008；Wright,E.等,Vaccine 27,7178–7186；2009)，RVC20显示了最宽的反应性，其能够中和RABV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV遗传谱系I病毒以及来自遗传谱系II的SHIBV和来自推定的遗传谱系IV的IKOV(图5)。使用的假病毒分离群的完整描述可以从图1中获得。作为比较，抗原位点I抗体CR57明显地差于RVC20，这是因为其不能够中和EBLV-1、SHIBV和IKOV分离群(见图5)。
当使用FAVN(Cliquet,F.等.,J.Immunol Methods 212,79–87,1998)或RFFIT(Smith,J.S.等.,Bull.World Health Organ.48,535–541,1973)试验对传染性病毒进行测试时，RVC20在其宽度方面也是优越的，其能够中和RABV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、BBLV以及遗传谱系II MOKV(见图6；不被中和的仅有的物种是LBV)。使用的传染性病毒分离群的完整描述可以从图1中获得。在相同的分析中，CR57不中和EBLV-1分离群(如关于假病毒观察到的)、LBV分离群和MOKV分离群(见图6)。
在假型中和试验中测试的抗原位点III抗体中，RVC58以IC90<10ng/ml强力地中和所有遗传谱系I病毒(即RABV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV，见图5)。作为比较，抗原位点III抗体CR4098远差于RVC58，这是因为其不能中和DUVV、EBLV-1、EBLV-2、IRKV和KHUV分离群并且不良地中和ARAV(见图5)。
当对传染性病毒进行测试时，在所有测试的抗原位点III抗体中，RVC58在其宽度方面也是优越的，这是因为其能够强力地中和RABV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、BBLV(见图6；不被中和的仅有的物种是MOKV和LBV)。在相同的分析中，CR4098不中和EBLV-1、DUVV、BBLV、测试的四种RABV分离群中的一种、测试的三种EBLV-2分离群分离群中的一种和测试的两种ABLV分离群中的一种(见图6)。
值得注意的是，抗原位点C抗体RVC68中和测试的所有遗传谱系I和II假病毒(仅WCBV未被中和)，虽然与RVC20和RVC58相比，IC90值高10-100倍(图5和7)。但是，当对传染性病毒进行测试时，抗体RVC68不能够中和EBLV、ABLV、MOKV以及测试的四种RABV分离群中的一种(图6和7)。
如果抗体宽度的分析不限于非RABV狂犬病毒属病毒(评分为阳性，所有病毒以IC50<10000ng/ml被中和)，RVC58(抗原位点III)能够中和69％的测试的所有非RABV狂犬病毒属病毒，并且显著地，测试的所有遗传谱系I狂犬病毒属病毒。相比之下，抗体CR4098和RAB1仅分别中和19％和27％的非RABV狂犬病毒属病毒，和分别中和23％和25％的遗传谱系I非RABV狂犬病毒属病毒。并行地，RVC20(抗原位点I)分别能够中和72％和91％的非RABV狂犬病毒属病毒和遗传谱系I非RABV狂犬病毒属病毒。相比之下，抗体CR57分别中和47％和68％的非RABV狂犬病毒属病毒和遗传谱系I非RABV狂犬病毒属病毒。
当组合时，RVC58和RVC20分别覆盖78％和100％的非RABV狂犬病毒属病毒和遗传谱系I非RABV狂犬病毒属病毒，而CR57和CR4098分别仅覆盖50％和68％的非RABV狂犬病毒属病毒和遗传谱系I非RABV狂犬病毒属病毒(图8A-8B)。也针对该组假病毒和病毒测试HRIG，并且即使其是多克隆抗G蛋白抗体的混合物，仅覆盖25％的非RABV狂犬病毒属病毒和36％的遗传谱系I非RABV狂犬病毒属病毒(见图8)。
为了更详细地调查根据本发明的抗体中和不同RABV分离群的能力，根据本发明的抗体RVC20和RVC58以及参比抗体CR57和CR4098的中和活性的分析然后被扩展至非常大组的RABV分离群(n＝26，24种病毒和2种假病毒)，其代表所有流行谱系(即美国、亚洲、世界性的、非洲2、非洲3和北极/北极样谱系)(图9)。所有26种RABV分离群有效地被RVC20和RVC58抗体中和，IC50和IC90几何平均值分别为26和12ng/ml。作为比较，CR57和CR4098也中和测试的所有RABV，但是分别具有61和100ng/ml的更高的IC50和IC90值。值得注意的是，CR4098以IC50>10000ng/ml——该浓度在体内是不可能有效的——中和两种RABV分离群。
在进一步的步骤中，抗体的RABV中和活性的分析被进一步延伸，包括进一步的参比抗体RAB1和甚至更大组的RABV分离群(n＝35，27种病毒和8种假病毒；CVS-11作为传染性病毒和作为假病毒被测试，其中图10包括作为传染性病毒测试的CVS-11，和图11示出了利用CVS-11执行的所有三种中和试验，即假病毒(PV)、FAVN和RFFIT)，其代表所有流行谱系(即美国、亚洲、世界性的、非洲2、非洲3和北极/北极样谱系)(图10B)。分离群的完整描述可以从图1中获得。如图10A中所示，所有35种分离群有效地被RVC20和RVC58抗体中和，IC50值(对于传染性病毒)或IC90值(对于假病毒)在0.1到140ng/ml的范围内。作为比较，参比抗体CR57、CR4098和RAB1中和测试的所有RABV，但是与RVC20和RVC58相比具有显著更低的效力，并且具有更宽范围的IC50或IC90值(即，分别地0.6–969ng/ml、0.7–23600ng/ml、1–4153ng/ml，见图10A)。与RVC20和RVC58类似，HRIG中和绝大多数的RABV株，其被测试具有窄范围的IC50值。重要地，CR4098和RAB1分别中和六种和三种RABV分离群，IC50>1000ng/ml(见图10A)，该浓度在暴露后预防中是不可能有效的。
该分析被延伸至另外的8种RABV分离群，对于它们而言，抗体结合至G蛋白转染子细胞的能力通过流式细胞术测试(图11)。RABV株的全长G基因被密码子优化用于真核细胞表达并被克隆入phCMV1载体(Genlantis)。G蛋白表达质粒被用于转染293F-Expi细胞。转染后三天，细胞被收集、固定并用皂苷透化以便免疫染色所有测试抗体。抗体与转染的细胞的结合使用Becton Dickinson FACSCanto2(BD Biosciences)利用FlowJo软件(TreeStar)进行分析。如图11中所示，所有这些RABV株通过RVC20和RVC58识别，而RAB1不结合至91001USA株和CR57不结合至RV/R.3PHL/2008/TRa-065和09029NEP株。这些发现将通过RVC20和RVC58识别的RABV分离群的数目延伸至43。
图10B显示了从公共数据库检索的2215种RABV G蛋白序列的系统树。用黑点强调的是测试的RABV病毒的序列(两种G蛋白序列，即CV9.13、毛里塔尼亚/狗/2019-2006/V6235-2007是不可获得的并且因此不包含在树中)。这显示了测试的RABV病毒(黑点)代表所有流行谱系(即美国、亚洲、世界性的、非洲2、非洲3和北极/北极样谱系)。
使用RABV假病毒(PV，PV中和试验根据Wright,E.等,J Gen.Virol 89,2204–2213,2008和Wright,E.等,Vaccine 27,7178–7186,2009进行，其通过引用被并入本文)或传染性病毒(如通过如下测量的：荧光抗体病毒中和测试，FAVN，根据Cliquet,F.等.,J.ImmunolMethods 212,79–87,1998，其通过引用被并入本文；或快速荧光灶抑制试验RFFIT，根据Smith,J.S.等.,Bull.World Health Organ.48,535–541,1973，其通过引用被并入本文)的中和结果的选择以及选择的RABV和非RABV分离群的特征分别在图12和13中示出。
实施例5：
使用突变体假病毒的表位作图
为了更好的精炼(refine)12种选择的人单克隆抗体的表位特异性，针对工程化的RABV假型测试它们。具体而言，在Bakker,A.B.H.等,J Virol 79,9062–9068,2005中和在Marissen,W.等,J Virol 79,4672–4678,2005中描述的CR57和CR4098病毒逃逸突变体中发现的氨基酸改变K226E、K226N、G229E、N336D和N336S被引入CVS-11G基因并且产生相应的突变体假病毒。
该组12种选择的抗体以及参比抗体CR57和CR4098在15μg/ml下测试它们中和5种突变体病毒(K226E、K226N、G229E、N336D和N336S)的能力，并且与相应的亲本CVS-11株进行比较。该分析的结果在图14中概括。CR57和RVC20——但不是RVC3——抗体不能够中和CR57CVS-11逃逸突变体K226E、K226N和G229E。这些结果表明RVC3识别抗原位点I中的表位，其不同于由CR57识别的表位，并且表明RVC20识别与由CR57识别的表位类似的表位。但是，RVC20与CR57相比特征在于针对非RABV狂犬病毒属病毒的更广谱的反应性(图8)的发现表明抗原位点I中其关联表位的RVC20抗体识别模式与CR57的有区别，其能够耐受结合位点中和周围残基中的更多数目的氨基酸改变。
所有抗体，包括CR4098，除了RAB1之外(数据未显示)，能够中和CR4098 CVS-11逃逸突变体N336D，因而表明该突变体对于在CSV-11G蛋白的背景下结合至其关联表位不具有显著的影响。另外，所有的发明性抗原位点III抗体，具体而言RVC58，与CR4098相比显示了与非RABV狂犬病毒属病毒的更大反应性宽度(图7)。
实施例6：
RABV分离群内RVC20和RVC58表位的保守的分析
由抗体CR57识别的抗原位点I通过肽扫描分析和通过病毒逃逸突变体K226E、K226N和G229E的分离来限定，并且被发现位于由残基KLCGVL组成的最小结合区(RABV G蛋白的共有序列和位置226-231；Marissen,W.等,J.Virol 79,4672–4678,2005)。图4中显示的竞争结果和图14中显示的突变体假病毒测试的结果表明RVC20结合至抗原位点I。本发明人因此分析了一组2566种序列中抗原位点I氨基酸残基的保守程度，该组2566种序列来自从代表全球RVBA多样性的多个公共数据库检索的独立RABV分离群。
因此，已经发现位置226在99.73％的分析的序列中是K和在0.19％中是R(在99.92％的分离群中是R或K)(图15A)。RVC20——但不是CR57——中和在位置226携带K和R二者的病毒(图16)。抗原位点I中的其它多态位置是残基231，其在67.65％的分析的RABV分离群中是L，在17.30％中是S和在14.73％中是P(L、S或P存在于99.96％的序列中，图15A)。RVC20和CR57被测试并且中和在位置231携带亮氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基的狂犬病毒属病毒(图16)。该分析确认了我们先前的中和结果并且表明RVC20抗体表位在RABV中是高度保守的。重要地，在位置226处的所有三种CR57和RVC20 CVS-11逃逸突变体有效地被RVC58中和。
对抗原位点III抗体RVC58进行类似分析。抗原位点III主要地由残基KSVRTWNEI(RABV G蛋白的共有序列和位置330-338；(Walker,P.J.等,J.Gen.Virol 80,1211–1220,1999；Bakker,A.B.H.等,J Virol 79,9062–9068,2005))形成。图4中显示的竞争结果和图14中显示的突变体病毒测试的结果表明RVC58识别抗原位点III内的残基。本发明人因此分析了——如上面对于抗原位点I描述的——一组2566种序列中抗原位点III氨基酸残基的保守程度，该组2566种序列来自从代表全球RVBA多样性的多个公共数据库检索的独立RABV分离群(如上面对于抗原位点I的)。
因此，已经发现了位置330、331、334、335和337是高度保守的(>99.61％)，而残基332、333、336和338是多态的(图15B)。位置330在99.61％的分析的序列中是K和在0.27％中是N(K或N存在于99.88％的序列中)。RVC58显示为中和在位置330携带K或N的病毒(图16)。位置331是高度保守的，其在99.96％的分离群中由S编码。位置332在77.05％的序列中是V和在22.88％中是I(V或I存在于99.93％的分离群中)。RVC58显示为中和在位置332携带V或I的狂犬病毒属病毒。位置333在96.22％的分离群中是R。几种其它残基——而不是D——在RABV分离群中的位置333处发现。相比之下，遗传谱系II狂犬病毒属病毒在那个位置携带D并且这些病毒不被RVC58中和，因而暗示在位置333中的D可能损害RVC58结合，但是该残基没有在天然RABV分离群中发现。位置334在99.65％的分离群中是T。位置335在100％的分离群中是W。位置336在90.57％的分析的RABV分离群中是N，在3.59％中是D，在5.65％中是S和在0.08％中是K(N、D、S或K存在于99.89％的分离群中)。RVC58显示为中和在位置336携带N、D、S或K的狂犬病毒属病毒。值得注意的是，在位置336携带D的RABV不被CR4098和RAB1中和，因而暗示潜在地4％的流行RABV对CR4098中和和对RAB1中和具有抗性。值得注意的是，在此分析的大多数非洲RABV分离群(59.1％)在位置336携带D。这些分离群对应于谱系非洲2。位置337在99.61％的分离群中是E和在0.35％中是D(E或D存在于99.96％的分离群中)。RVC58显示为中和在位置337携带E或D的狂犬病毒属病毒。最终，位置338在93.73％的分析的分离群中是I和在6.16％中是V(I或V存在于99.9％的分离群中)。RVC58显示为中和在位置338携带I或V的狂犬病毒属病毒。
因而，RVC58识别在多态位置中携带多种残基的RABV和非RABV分离群，其代表至少99.80％的分析的RABV(图15B、图16)。该分析确认了我们先前的中和结果——其中RVC58中和所有测试的遗传谱系I狂犬病毒属病毒，并表明RVC58抗体表位在RABV和非RABV狂犬病毒属病毒中是高度保守的。
总之，两种抗体RVC58和RVC20通过结合病毒G蛋白上的两种有区别的抗原位点(位点I和III)强力地中和人和动物RABV分离群以及大多数非RABV狂犬病毒属病毒(包括新的欧亚蝙蝠病毒)。这两种抗体的组合代表具有史无前例的反应宽度和具有降低风险的逃逸突变体选择的治疗。
实施例7：
RVC58和RVC20抗体保护叙利亚仓鼠免受致死的RABV感染
为了调查抗体RVC58和RVC20在体内是否展示针对致死的RABV感染的中和活性，我们进行了叙利亚仓鼠(金仓鼠)研究。在施用致死剂量的RABV CVS-11(50μl，105.7TCID50/ml，在左后腿的腓肠肌中)后6h，仓鼠(n＝12/组)不被处理，或者利用疫苗(Imovax；Sanofi-Pasteur：一种商业的灭活的人二倍体细胞疫苗，其以0.05ml的体积肌肉内施用在右后腿的腓肠肌中，与狂犬病抗原的0.125国际单位对应的剂量)加HRIG(20mg/kg，相当于20IU/kg，并且以0.05ml的体积肌肉内施用)，或者疫苗加0.045mg/kg的RVC20和RVC58抗体的等摩尔混合物或者疫苗加0.0045mg/kg的RVC20和RVC58抗体的等摩尔混合物发起预防。处理的动物在第3、7、14和28天时也接受狂犬病疫苗。在实验的过程期间监测动物并且当狂犬病的临床征兆出现时处死动物。在感染后没有被处理的12只动物中的7只在第8天时死亡(图17)。基于20mg/kg HRIG和疫苗的标准暴露后预防(PEP)在降低总体死亡率至33％方面是有效的(8/12动物存活；图17)。引人注目地，0.045mg/kg的RVC58+RVC20的组合(其对应于施用的HRIG的1/440)保护75％的动物(9/12)，而RVC58和RVC20的10倍低的剂量(0.0045mg/kg)保护仅33％的动物。这暗示0.045mg/kg RVC58+RVC20优于20mg/kg HRIG剂量。0.045mg/kg RVC58+RVC20的保护剂量在人中对应于在仅3mg的RVC58+RVC20混合物的PEP期间施用的平均总剂量。该量可以以稳定形式(即，冻干制剂，其中例如先前的研究已经显示了通过冻干保存的单克隆抗体在40℃下稳定33个月和在50℃下稳定5个月)和以对发展中国家负担得起的成本生产和配制。
实施例8：
RVC58和RVC20抗体不干扰接种疫苗
在PEP期间，存在如下可能性：抗体和疫苗的同时施用降低了疫苗诱导对于保护需要的中和抗体的阈值水平的能力。因此，评估抗体治疗干扰接种疫苗的程度是至关重要的。为了确定抗体混合物对疫苗效力的作用，在不存在RABV攻击的情况下进行体内动物实验。具体而言，所有动物(n＝12/组)在第0、3、7、14和28天时用狂犬病疫苗接种疫苗(Imovax，Sanofi-Pasteur，其以0.05ml的体积肌肉内施用在右后腿的腓肠肌中，与狂犬病抗原的0.125国际单位对应的剂量)，并且在第0天时用HRIG(20mg/kg)或0.045mg/kg或40mg/kg(888倍更高剂量)的RVC58+RVC20的等摩尔混合物伴随施用，其被肌肉内注射在左后腿的腓肠肌中。血清结合效价(通过检测G蛋白结合的仓鼠抗体与碱性磷酸酶缀合的抗仓鼠多克隆抗体在RABV G蛋白涂覆的板上在ELISA中测量的)、血清中和效价(对CVS-11的中和FAVN试验；根据Cliquet,F.等.,J.Immunol Methods 212,79–87,1998)和残留的人IgG抗体的水平在第42天时测定。与单独接受疫苗的动物相比，HRIG和0.045mg/kg的RVC58+RVC20不降低对RABV G蛋白的内源仓鼠IgG结合抗体应答(图18A)。值得注意的是，在用0.045和40mg/kg剂量二者处理的动物中的中和抗体的水平比得上通过单独的疫苗或通过疫苗和HRIG处理的动物得出的中和抗体的水平，并且在大多数动物中，中和效价高于10IU/ml(图18B)。最终，虽然在第42天时在用20mg/kg的HRIG或40mg/kg的RVC58+RVC20处理的动物中发现仍然高水平的人抗体(高于10μg/ml)，但是在用0.045mg/kg的RVC58+RVC20处理的动物的血清中发现了检测不到的低水平的人IgG(图18C)。这些结果暗示，0.045mg/kg的RVC58+RVC20的剂量，其显示为保护性的，在RABV接种疫苗之后不损害在动物中引起的病毒中和抗体的产生。
实施例9：
RVC58和RVC20抗体在致命地感染有RABV的叙利亚仓鼠中治疗上起作用
目前，不存在对于狂犬病的治疗。治疗的发展将对至少两类患者具有益处：已知暴露于RABV但是由于某些情况未能接受迅速的暴露后预防并且处于发展RABV感染的增加风险下的患者；和没有意识到与病毒接触并且存在疾病的(不同严重性的)征兆的患者(例如，通过与被感染的蝙蝠未被注意的接触感染的个体；在狗狂犬病被控制的地方，蝙蝠起源的RABV已经成为人狂犬病的主要原因)。具有RVC58和RVC20混合物(即RVC58和RVC20抗体的等摩尔混合物)的单次或多次静脉注射将提供高效价的全身性中和抗体(包括在CNS中)并阻断病毒复制和疾病进展。强力和广谱中和抗体的混合物的发展可以有助于扩展人RABV感染的暴露后治疗窗口，其目前被限制到感染后的头几天。在这些个体中，RV可能已经到达CNS组织并且疾病的早期或晚期征兆可能也已经出现。这些患者可以受益于利用可以穿过血脑屏障渗漏的(或者直接在CSN中施用的)高度强力的中和抗体的治疗，递送能够有效地中和CNS组织中的病毒复制的足够量的抗体。
RVC58+RVC20抗体的治疗潜能在用野生RABV分离群致死攻击的叙利亚仓鼠中评估。具体而言，RVC58+RVC20在后腿的腓肠肌中被攻击的叙利亚仓鼠中测试，利用从感染的狐狸(意大利/红狐狸/673/2011)的唾液腺分离的致死剂量的野生病毒。在感染的动物中，RABV在攻击后第5天时在CNS(中枢神经系统)中是可检测的。用在感染后的第1天(n＝12)时、第5天(n＝12)时或第9天(n＝7)时给予的40mg/kg的RVC58+RVC20的单次注射处理动物，不伴随施用疫苗。对照组接受磷酸盐缓冲盐水(n＝17)或标准PEP(20mg/kg HRIG和疫苗；n＝12)。每天监测动物两次，并且当狂犬病的临床征兆出现时处死动物。引人注目地，当在感染后多达5天施用时，RVC58+RVC20保护动物免受致死感染(图19)。值得注意的是，12只处理的动物中的3只显示了疾病的临床征兆(攻击的后腿部位的麻痹)，但是其不进一步发展。在该模型中，与未处理的动物相比，传统的PEP给予仅适度保护(图19)。在感染后多达60天，在存活的动物中没有检测到疾病的征兆。
在所有死亡的动物中和在所有存活动物中(它们在第60天时被处死)，通过使用定量实时PCR量化脊髓、延髓/小脑和大脑中编码N蛋白的基因组RNA和病毒mRNA来揭示RABV的存在。值得注意的是，病毒RNA的可检测水平在感染后的第1或5天时用RVC58+RVC20处理的无症状动物的CNS中测量(虽然以与在死亡动物中测量的那些相比低100-1000倍的水平)(图20A)，因而表明初始的RABV感染不是无效的(abortive)而是通过使用的高度强力的中和抗体和最可能通过对病毒的伴随的内源免疫应答在CNS内保持在控制下。
有力的内源免疫应答的发展也通过测量所有动物的血清中RABV G蛋白特异性仓鼠IgG抗体效价来确认(图20B)。值得注意的是，在第5天时接受RVC58+RVC20的动物(所有动物从致死感染中存活)发展高水平的G蛋白特异性IgG抗体，该水平比得上或高于PEP组中通过疫苗存活的动物中得出的那些抗体水平。这些抗体的水平也比得上或高于接受标准PEP的未受攻击动物中得出的那些抗体水平(参见图18)。最后，高剂量的RVC58+RVC20也可能与伴随的接种疫苗兼容，如通过如下发现所示出的：高剂量的这些抗体的使用不损害对疫苗的免疫应答(图18A-B)。
来自无症状对照动物或在第5天时接受RVC58+RVC20的动物(并且在第60天时处死)的脑、延髓和脊髓的组织样本被分析，通过免疫组织化学(IHC)分析RABV N抗原的存在。具体而言，IHC分析集中于狂犬病包涵体的鉴定，该狂犬病包涵体是嗜酸性的、尖轮廓的示病性包涵体(直径为2–10μm)，通过核衣壳的聚集形成并且在包含狂犬病毒的神经元的细胞质中发现。虽然许多狂犬病包涵体在来自阳性对照动物的CNS组织中发现，但是仅非常少的包涵体在第5天时用抗体处理的动物中被鉴定(图21)。这些结果确认了RABV在用高剂量的RVC58+RVC20处理的动物中已经到达CNS，并且甚至脑，而不引起症状。
在患者临床过程的早期存在RABV中和抗体被认为是促进有利结果的重要因素。这可能在少于20％的所有患有狂犬病的患者中出现。RABV中和抗体的存在是对于清除病毒必不可少的主动适应性免疫应答的标志(Lafon,M.,in“Rabies”,A.C.Jackson和W.H.Wunner,3rd eds.,pp.489–504,Elsevier Academic Press,London,2013)。存在狂犬病的六名存活者，这些患者在其疾病发病之前接受狂犬病疫苗(并且仅一名不接受疫苗)。这支持了早期免疫应答与阳性结果相关联的概念。最终，大多数狂犬病的存活者在血清和脑脊液中已经显示了RABV中和抗体。根据本发明的强力和广谱人RABV中和抗体，例如RVC20和RVC58，提供了给予立即的和强力的被动免疫的机会，其可能代表(i)用于暴露后疗法的强效剂，其与HRIG相比在低得多的浓度下有效；和(ii)用于治疗具有狂犬病的早期临床诊断的患者的有力的治疗剂。就此而言，可以想象的是疗法的迅速开始可以提供有利结果的最好机会。根据本发明的抗体，例如人单克隆抗体RVC58和RVC20，因此可以代表单独地或与其它疗法——其包括狂犬病疫苗、利巴韦林(或其它抗病毒药)、干扰素-α和氯胺酮——组合的有效疗法。
序列和SEQ ID编号的表格
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*黑体强调的序列是CDR区(核苷酸或aa)，并且加下划线的残基是与“种系”序列相比突变的残基。
序列表
<110>胡默波斯生物医学公司巴斯德研究院
<120> 强力地中和狂犬病毒和其它狂犬病毒属病毒的抗体和其用途
<130> HB01P014WO1
<160> 218
<170> PatentIn version 3.5
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Val
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Met Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
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Arg Asp Ser Gly Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
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Trp Gly Pro Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Lys Ser Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Thr Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asn Arg Leu
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Ser Gly Trp Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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acctgcactg tctctggtga ctccatgaat aatttctact ggggctggat ccggcagccc 120
gcagggaagg gactggagtg gattggatat atctattaca gtgggaccac caactacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca atagacacgt ccaagaacca attctccctg 240
aaggtgaact ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt attgtgcgag agactccggt 300
gactacgtca gctactacta ttatggtatg gacgtctggg gcccagggac cacggtcacc 360
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ccaggaacgg cccccaaact ccttatttac aagagtgata agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccac gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaagatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggata acaggctgag tggttggctc 300
ttcggcggag ggacgaagct gaccgtccta g 331
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Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Thr
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Ile Phe Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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Trp Ile Gly Ser Val Tyr Tyr Asn Gly His Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Ala Ile Ser Ile Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe
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Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
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65 70 75 80
Leu Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Ser Ser
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cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggagtgtct attataatgg acacacctac 180
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g 361
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tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtccactg gtaccagcaa 120
cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca ccaagcggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240
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<213> 人工序列
<220>
<223> RVB185 CDRH1 nuc
<400> 44
ggtgcccccg tcagtggtgt taactcctac 30
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB185 CDRH2 nuc
<400> 45
atcaagtaca gtgggagcac c 21
<210> 46
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB185 CDRH3 nuc
<400> 46
gccagacaaa gtactatgac gggccgggac tac 33
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB185 CDRL1 nuc
<400> 47
agatccaaca tcggaagcca tcct 24
<210> 48
<400> 48
000
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB185 CDRL2 long nuc
<400> 49
ctcatctatg gtgatagtca gcgaccc 27
<210> 50
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB185 CDRL3 nuc
<400> 50
gcagcatggg atgacagcct gagtggcctt tgggtg 36
<210> 51
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB185 重链 aa
<400> 51
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Ala Pro Val Ser Gly Val
20 25 30
Asn Ser Tyr Trp Val Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala Thr Ile Lys Tyr Ser Gly Ser Thr His Arg Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Glu Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gln Ser Thr Met Thr Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 52
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB185 轻链 aa
<400> 52
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser His
20 25 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Pro Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 53
<211> 358
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB185 重链 nuc
<400> 53
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcagtg tctccggtgc ccccgtcagt ggtgttaact cctactgggt gtggatccgc 120
cagccccccg ggaaggggct ggagtggatt gcgactatca agtacagtgg gagcacccac 180
cgtagcccgt cgctcaggag tcgagtcacc atatccgtag acacgtccaa gaatcagttc 240
tccctggagc tgagctctgt gaccgccgct gacacggctg tatattactg tgccagacaa 300
agtactatga cgggccggga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag 358
<210> 54
<211> 334
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB185 轻链 nuc
<400> 54
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagatc caacatcgga agccatcctg taaactggta ccagcagctc 120
ccgggagcgg cccccaagct cctcatctat ggtgatagtc agcgaccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcccc tcagcctccc tggccatcag tggactccag 240
tctgaagatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgag tggcctttgg 300
gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaa 334
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 CDRH1 aa
<400> 55
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 CDRH2 aa
<400> 56
Leu Asn Ser Ile Asp His Arg Thr
1 5
<210> 57
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 CDRH3 aa
<400> 57
Ala Arg Gly Val Gly Leu Trp Phe Gly Glu Leu Ser Trp Asn Tyr Phe
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 CDRL1 aa
<400> 58
Ser Asn Asp Ile Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5
<210> 59
<400> 59
000
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 CDRL2 长 aa
<400> 60
Met Ile Phe Tyr Val Asn Lys Arg Pro
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 CDRL3 aa
<400> 61
Cys Ser Phe Ala Gly Ser Tyr Ser Leu
1 5
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 CDRH1 nuc
<400> 62
ggattcagct ttagcagcta tgcc 24
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 CDRH2 nuc
<400> 63
cttaattcta ttgatcatag aaca 24
<210> 64
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 CDRH3 nuc
<400> 64
gctcgggggg tgggactatg gttcggtgaa ttatcctgga attactttga ctac 54
<210> 65
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 CDRL1 nuc
<400> 65
agcaatgata ttggtggtta taactat 27
<210> 66
<400> 66
000
<210> 67
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 CDRL2 长 nuc
<400> 67
atgatttttt atgtcaataa gcggccc 27
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 CDRL3 nuc
<400> 68
tgctcatttg caggcagtta ctcctta 27
<210> 69
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 重链变体 1 aa
<400> 69
Glu Val Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Arg Leu Tyr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Leu Asn Ser Ile Asp His Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Val Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Gly Leu Trp Phe Gly Glu Leu Ser Trp Asn Tyr Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 70
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 重链变体 2 aa
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Arg Leu Tyr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Leu Asn Ser Ile Asp His Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Val Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Gly Leu Trp Phe Gly Glu Leu Ser Trp Asn Tyr Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 71
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 轻链 aa
<400> 71
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Phe Tyr Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Phe Ala Gly Ser
85 90 95
Tyr Ser Leu Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 72
<211> 376
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 重链变体 1 nuc
<400> 72
gaggtgcagc tgatggagtc tgggggaggc ctggtacagc cgggggggtc catgagactc 60
tactgtgcag cctctggatt cagctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctcgagtg ggtctcaagt cttaattcta ttgatcatag aacagactat 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa caccctgtat 240
ttacaaatgg acagcctgag agtcgaggac tcggccatgt attactgtgc tcggggggtg 300
ggactatggt tcggtgaatt atcctggaat tactttgact actggggcca gggaaccctg 360
gtcaccgtct cctcag 376
<210> 73
<211> 376
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 重链变体 2 nuc
<400> 73
gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ctggtacagc cgggggggtc catgagactc 60
tactgtgcag cctctggatt cagctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctcgagtg ggtctcaagt cttaattcta ttgatcatag aacagactat 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa caccctgtat 240
ttacaaatgg acagcctgag agtcgaggac tcggccatgt attactgtgc tcggggggtg 300
ggactatggt tcggtgaatt atcctggaat tactttgact actggggcca gggaaccctg 360
gtcaccgtct cctcag 376
<210> 74
<211> 328
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVB492 轻链 nuc
<400> 74
cagtctgccc tgactcagcc tcgctcagtg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcaa tgatattggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacaa 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt ttttatgtca ataagcggcc ctcaggggtc 180
cctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg atgaagctga ttattactgc tgctcatttg caggcagtta ctccttattc 300
ggcagaggga ccaagctgac cgtcctag 328
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC3 CDRH1 aa
<400> 75
Thr Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
1 5
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC3 CDRH2 aa
<400> 76
Ile Ser Ala Ser Gly Ser Ser Thr
1 5
<210> 77
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC3 CDRH3 aa
<400> 77
Ala Lys Phe Ala His Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Ser Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
<210> 78
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC3 CDRL1 aa
<400> 78
Gln Ser Val Asn Ser Asn
1 5
<210> 79
<400> 79
000
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC3 CDRL2 长 aa
<400> 80
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala
1 5
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC3 CDRL3 aa
<400> 81
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Val Ser Ile Thr
1 5 10
<210> 82
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC3 CDRH1 nuc
<400> 82
acattcacgt ttagaaacta tgcc 24
<210> 83
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC3 CDRH2 nuc
<400> 83
attagtgcta gtggtagtag cacg 24
<210> 84
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC3 CDRH3 nuc
<400> 84
gcgaaatttg ctcacgattt ttggagtggt tattcttact ttgactcc 48
<210> 85
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC3 CDRL1 nuc
<400> 85
cagagtgtta acagcaac 18
<210> 86
<400> 86
000
<210> 87
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC3 CDRL2 长 nuc
<400> 87
ctcatctatg gtgcatccac cagggcc 27
<210> 88
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC3 CDRL3 nuc
<400> 88
cagcagtata ataattgggt ttcgatcacc 30
<210> 89
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC3 重链 aa
<400> 89
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ala Ser Gly Ser Ser Thr Asn Tyr Ala Ala Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Phe Ala His Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Ser Tyr Phe Asp Ser
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 90
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC3 轻链 aa
<400> 90
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Gln Ser Val Asn Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Val Ser
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 91
<211> 370
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC3 重链 nuc
<400> 91
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ctggtgcagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctacatt cacgtttaga aactatgcca tgtcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggactg ggtctcaggg attagtgcta gtggtagtag cacgaattat 180
gcagcctccc tgaagggccg atttaccatc tccagagaca attccaagaa cacattgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtct attactgtgc gaaatttgct 300
cacgattttt ggagtggtta ttcttacttt gactcctggg gccagggaac cctggtcacc 360
gtctcctcag 370
<210> 92
<211> 325
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC3 轻链 nuc
<400> 92
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccggtca gagtgttaac agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
gggcaggctc ccagactcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataatt gggtttcgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaac 325
<210> 93
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC20 CDRH1 aa
<400> 93
Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly Ser Tyr Ser
1 5 10
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC20 CDRH2 aa
<400> 94
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 95
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC20 CDRH3 aa
<400> 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Ser Asp Phe Trp Ser Gly Ser Pro Leu Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 96
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC20 CDRL1 aa
<400> 96
Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 97
<400> 97
000
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC20 CDRL2 长 aa
<400> 98
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln
1 5
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC20 CDRL3 aa
<400> 99
Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 100
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC20 CDRH1 nuc
<400> 100
ggtggctcct tcagcagtgg aagttactcc 30
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC20 CDRH2 nuc
<400> 101
atctattaca gtgggagcac t 21
<210> 102
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC20 CDRH3 nuc
<400> 102
gcgagaggca cgtattccga tttttggagt ggttcccctt tagactac 48
<210> 103
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC20 CDRL1 nuc
<400> 103
cagggcatta gcaattat 18
<210> 104
<400> 104
000
<210> 105
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC20 CDRL2 长 nuc
<400> 105
ctgatctatg ctgcatccag tttgcaa 27
<210> 106
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC20 CDRL3 nuc
<400> 106
caacagtatg atacttaccc tctcact 27
<210> 107
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC20 重链 aa
<400> 107
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val His Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Asn Ser Ile Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Ser Asp Phe Trp Ser Gly Ser Pro Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 108
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC20 轻链 aa
<400> 108
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 109
<211> 373
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC20 重链 nuc
<400> 109
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctccggtgg ctccttcagc agtggaagtt actcctggaa ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacttat 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atgtcagtac acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgaactctat aactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaggc 300
acgtattccg atttttggag tggttcccct ttagactact ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctcct cag 373
<210> 110
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC20 轻链 nuc
<400> 110
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggcattagc aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaacag cctgcagcct 240
gaagattttg taacttattt ctgccaacag tatgatactt accctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa ac 322
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC21 CDRH1 aa
<400> 111
Gly Gly Ser Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Tyr
1 5 10
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC21 CDRH2 aa
<400> 112
Ile Tyr Tyr Asn Gly Tyr Thr
1 5
<210> 113
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC21 CDRH3 aa
<400> 113
Ala Thr Gln Ser Thr Met Thr Thr Ile Ala Gly His Tyr
1 5 10
<210> 114
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC21 CDRL1 aa
<400> 114
Thr Ser Asn Ile Gly Asn Ser Tyr
1 5
<210> 115
<400> 115
000
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC21 CDRL2 长 aa
<400> 116
Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro
1 5
<210> 117
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC21 CDRL3 aa
<400> 117
Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Asn Ala Tyr Val
1 5 10
<210> 118
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC21 CDRH1 nuc
<400> 118
ggtggctcca tcagcaaccc taactactac 30
<210> 119
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC21 CDRH2 nuc
<400> 119
atctattata atgggtacac c 21
<210> 120
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC21 CDRH3 nuc
<400> 120
gcgacgcaat ctacgatgac taccatagcg ggccactac 39
<210> 121
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC21 CDRL1 nuc
<400> 121
acatccaaca ttgggaattc ttat 24
<210> 122
<400> 122
000
<210> 123
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC21 CDRL2 长 nuc
<400> 123
ctcatttatg acaataataa gcgaccc 27
<210> 124
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC21 CDRL3 nuc
<400> 124
ggaacatggg acagcagcct gaatgcttat gtc 33
<210> 125
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC21 重链 aa
<400> 125
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Pro
20 25 30
Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asp Gln Phe
65 70 75 80
Phe Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Thr Gln Ser Thr Met Thr Thr Ile Ala Gly His Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 126
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC21 轻链 aa
<400> 126
Gln Ser Val Leu Thr Gln Ala Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Leu
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn Ser
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Asn Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 127
<211> 364
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC21 重链 nuc
<400> 127
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acgtgcactg tctctggtgg ctccatcagc aaccctaact actactgggg ctggatccgc 120
cagcccccag ggaagggtct ggaatggatt gggagtatct attataatgg gtacacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatccgtgg acaagtccaa ggaccagttc 240
tttctgaaga tgacctctct gaccgccgca gacacggctg tgtattactg tgcgacgcaa 300
tctacgatga ctaccatagc gggccactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tcag 364
<210> 128
<211> 331
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC21 轻链 nuc
<400> 128
cagtctgtat tgacgcaggc gccctcagtg tctgcggccc caggactaaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcacatc caacattggg aattcttatg tatcctggta ccagcagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctgacacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240
actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggaca gcagcctgaa tgcttatgtc 300
ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta g 331
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC38 CDRH1 aa
<400> 129
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 130
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC38 CDRH2 aa
<400> 130
Ile Met Pro Met Phe Val Ala Ala
1 5
<210> 131
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC38 CDRH3 aa
<400> 131
Ala Arg Gly Asp Gly Tyr Asn Tyr Lys Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 132
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC38 CDRL1 aa
<400> 132
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 133
<400> 133
000
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC38 CDRL2 长 aa
<400> 134
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln
1 5
<210> 135
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC38 CDRL3 aa
<400> 135
Gln Gln Leu Asp Thr Tyr Val Ala Leu Thr
1 5 10
<210> 136
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC38 CDRH1 nuc
<400> 136
ggaggcacct tcagcagcta tgcc 24
<210> 137
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC38 CDRH2 nuc
<400> 137
atcatgccta tgtttgtggc ggca 24
<210> 138
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC38 CDRH3 nuc
<400> 138
gcgagagggg atggctacaa ttacaagtgg tattttgacc tt 42
<210> 139
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC38 CDRL1 nuc
<400> 139
caggacatta gtaattat 18
<210> 140
<400> 140
000
<210> 141
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC38 CDRL2 长 nuc
<400> 141
ctgatctatg ctgcatccac tttgcaa 27
<210> 142
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC38 CDRL3 nuc
<400> 142
caacagcttg atacttacgt cgcgctcact 30
<210> 143
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC38 重链 aa
<400> 143
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Leu Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Met Pro Met Phe Val Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Val Ser Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Met His Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Gly Tyr Asn Tyr Lys Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 144
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC38 轻链 aa
<400> 144
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Thr Tyr Val Ala
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 145
<211> 364
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC38 重链 nuc
<400> 145
gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcca tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctgggctag ggcttgagtg gatgggaggg atcatgccta tgtttgtggc ggcaaactac 180
gcacagaact tccagggcag agtcacggtt tctgtggaca aatccacgaa caccgcctat 240
atggagatgc acaacctgag atctgacgac acggccatgt attactgtgc gagaggggat 300
ggctacaatt acaagtggta ttttgacctt tggggccagg gaaccctagt caccgtctcc 360
tcag 364
<210> 146
<211> 325
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC38 轻链 nuc
<400> 146
gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca ggacattagt aattatttag cctggtatca gcaaaaacca 120
gggaagcccc ctaaactcct gatctatgct gcatccactt tgcaaagggg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggtcagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag cttgatactt acgtcgcgct cactttcggc 300
ggagggacca aggtggagat caaac 325
<210> 147
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC44 CDRH1 aa
<400> 147
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser
1 5
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC44 CDRH2 aa
<400> 148
Ile Ser Thr Thr Gly Thr Tyr Ile
1 5
<210> 149
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC44 CDRH3 aa
<400> 149
Ala Arg Arg Ser Ala Ile Ala Leu Ala Gly Thr Gln Arg Ala Phe Asp
1 5 10 15
Ile
<210> 150
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC44 CDRL1 aa
<400> 150
Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
1 5
<210> 151
<400> 151
000
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC44 CDRL2 长 aa
<400> 152
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His
1 5
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC44 CDRL3 aa
<400> 153
Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Pro Trp Thr
1 5
<210> 154
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC44 CDRH1 nuc
<400> 154
ggcttcacct ttagtagtta tagt 24
<210> 155
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC44 CDRH2 nuc
<400> 155
atcagtacta ctggtactta cata 24
<210> 156
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC44 CDRH3 nuc
<400> 156
gcgagacggt cggccatagc actggctggt acgcagcgtg cttttgatat c 51
<210> 157
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC44 CDRL1 nuc
<400> 157
cagaacatta acaactat 18
<210> 158
<400> 158
000
<210> 159
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC44 CDRL2 长 nuc
<400> 159
ctgatctatg ctgcatccag tttacat 27
<210> 160
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC44 CDRL3 nuc
<400> 160
caacagagtt acagtaaccc ttggacg 27
<210> 161
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC44 重链 aa
<400> 161
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Thr Thr Gly Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Ser Ala Arg Ser Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Ala Ile Ala Leu Ala Gly Thr Gln Arg Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Pro Gly Thr Asn Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 162
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC44 轻链 aa
<400> 162
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Cys Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 163
<211> 373
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC44 重链 nuc
<400> 163
gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggctt cacctttagt agttatagta tgagttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcatcc atcagtacta ctggtactta catatactac 180
gcagactcag tggagggccg attctccatt tccagagaca gcgccaggag ctctctgttt 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtct attactgtgc gagacggtcg 300
gccatagcac tggctggtac gcagcgtgct tttgatatct ggggcccagg gacaaacgtc 360
atcgtctctt cag 373
<210> 164
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC44 轻链 nuc
<400> 164
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gaacattaac aactatttaa attggtatca gcagaaacta 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tacatagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg ccagtggatc tgggacagat ttcattctga ccatcagtaa tctgcaacct 240
gaagattgtg caacttacta ctgtcaacag agttacagta acccttggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa ac 322
<210> 165
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC58 CDRH1 aa
<400> 165
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala
1 5
<210> 166
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC58 CDRH2 aa
<400> 166
Ile Ser Asp Arg Gly Gly Ser Arg
1 5
<210> 167
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC58 CDRH3 aa
<400> 167
Ala Arg Asp Ile Ala Pro Pro Tyr Asn Tyr Tyr Phe Tyr Gly Met Asp
1 5 10 15
Val
<210> 168
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC58 CDRL1 aa
<400> 168
Ser Ser Asp Ile Gly Ala Phe Asn Tyr
1 5
<210> 169
<400> 169
000
<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC58 CDRL2 长 aa
<400> 170
Ile Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro
1 5
<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC58 CDRL3 aa
<400> 171
Asn Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Gln Leu
1 5 10
<210> 172
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC58 CDRH1 nuc
<400> 172
ggattcacct ttagcaccta tgcc 24
<210> 173
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC58 CDRH2 nuc
<400> 173
attagtgata gaggtggtag taga 24
<210> 174
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC58 CDRH3 nuc
<400> 174
gcgagagata ttgccccccc atataactac tacttctacg gtatggacgt c 51
<210> 175
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC58 CDRL1 nuc
<400> 175
agcagtgaca ttggtgcttt taactat 27
<210> 176
<400> 176
000
<210> 177
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC58 CDRL2 长 nuc
<400> 177
ataatttatg aggtcagtaa tcggccc 27
<210> 178
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC58 CDRL3 nuc
<400> 178
aactcatata caagcagcag cactcagtta 30
<210> 179
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC58 重链 aa
<400> 179
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Asp Arg Gly Gly Ser Arg Tyr Tyr Ala Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ile Ala Pro Pro Tyr Asn Tyr Tyr Phe Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 180
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC58 轻链 aa
<400> 180
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ala Phe
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Gln Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 181
<211> 373
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC58 重链 nuc
<400> 181
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcgg cctctggatt cacctttagc acctatgcca tgaattgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtgata gaggtggtag tagatactac 180
gcaggctccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gagagatatt 300
gcccccccat ataactacta cttctacggt atggacgtct ggggccgagg gaccacggtc 360
accgtctcct cag 373
<210> 182
<211> 331
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC58 轻链 nuc
<400> 182
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gtaccagcag tgacattggt gcttttaact atgtctcttg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcataatt tatgaggtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc aactcatata caagcagcag cactcagtta 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta g 331
<210> 183
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC68 CDRH1 aa
<400> 183
Gly Gly Ser Ile Ser Glu His His
1 5
<210> 184
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC68 CDRH2 aa
<400> 184
Ile Phe His Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 185
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC68 CDRH3 aa
<400> 185
Ala Arg Ala Val Ser Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Ile Asp Val
1 5 10
<210> 186
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC68 CDRL1 aa
<400> 186
Gln Asp Ile Ser Asn Trp
1 5
<210> 187
<400> 187
000
<210> 188
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC68 CDRL2 长 aa
<400> 188
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln
1 5
<210> 189
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC68 CDRL3 aa
<400> 189
Gln Gln Ala Lys Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 190
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC68 CDRH1 nuc
<400> 190
ggtggctcca ttagtgagca ccac 24
<210> 191
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC68 CDRH2 nuc
<400> 191
atctttcaca gtgggagtac c 21
<210> 192
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC68 CDRH3 nuc
<400> 192
gcgagagcgg tgtctactta ctactactat tacatagacg tc 42
<210> 193
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC68 CDRL1 nuc
<400> 193
caggatatta gcaactgg 18
<210> 194
<400> 194
000
<210> 195
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC68 CDRL2 长 nuc
<400> 195
ctgatctatg ctgcgtccag tttgcaa 27
<210> 196
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC68 CDRL3 nuc
<400> 196
caacaggcta agagtttccc tcttact 27
<210> 197
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC68 重链 aa
<400> 197
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Gly Ser Ile Ser Glu His
20 25 30
His Trp Ser Trp Leu Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Phe His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Asn Ile Ser Leu Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Val Ser Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Ile Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 198
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC68 轻链 aa
<400> 198
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Ile Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Lys Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 199
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC68 重链 nuc
<400> 199
caggtgcagc tacaggagtc gggcccaaga ctggtgaagc cctcggagac cctgtccctc 60
acctgcactt tctctggtgg ctccattagt gagcaccact ggagctggct ccggcagtcc 120
ccagggaagg gactggagtg gattggatat atctttcaca gtgggagtac caactacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caacatatca ttagacaagt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt tctgtgcgag agcggtgtct 300
acttactact actattacat agacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
g 361
<210> 200
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC68 轻链 nuc
<400> 200
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca ggatattagc aactggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct gcgtccagtt tgcaaagtgg gatctcatct 180
aggttcagcg gcggtggctc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caagttacta ctgtcaacag gctaagagtt tccctcttac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa ac 322
<210> 201
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC111 CDRH1 aa
<400> 201
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr Val
1 5
<210> 202
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC111 CDRH2 aa
<400> 202
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 203
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC111 CDRH3 aa
<400> 203
Ala Arg Gly Ser Gly Thr Gln Thr Pro Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 204
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC111 CDRL1 aa
<400> 204
Gln Ser Ile Thr Ser Trp
1 5
<210> 205
<400> 205
000
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC111 CDRL2 长 aa
<400> 206
Leu Ile Tyr Asp Asp Ser Thr Leu Glu
1 5
<210> 207
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC111 CDRL3 aa
<400> 207
Gln Gln Tyr Glu Ser Tyr Ser Gly Thr
1 5
<210> 208
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC111 CDRH1 nuc
<400> 208
ggattctcct tcagtagcta tgtt 24
<210> 209
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC111 CDRH2 nuc
<400> 209
atatcatatg atggaagtaa taaa 24
<210> 210
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC111 CDRH3 nuc
<400> 210
gcgagagggt ccggaaccca aactcccctc tttgactac 39
<210> 211
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC111 CDRL1 nuc
<400> 211
cagagtatta ctagctgg 18
<210> 212
<400> 212
000
<210> 213
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC111 CDRL2 长 nuc
<400> 213
ctgatctatg atgactccac tttggaa 27
<210> 214
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC111 CDRL3 nuc
<400> 214
caacagtatg agagttattc agggacg 27
<210> 215
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC111 重链 aa
<400> 215
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Ile Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Gly Thr Gln Thr Pro Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 216
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC111 轻链 aa
<400> 216
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Gln Ser Ile Thr Ser Trp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Met Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Asp Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Ser Tyr Ser Gly
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 217
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC111 重链 nuc
<400> 217
caggtgcaac tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt ctccttcagt agctatgtta tgtactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtgacaatt atatcatatg atggaagtaa taaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtct attactgtgc gagagggtcc 300
ggaacccaaa ctcccctctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
g 361
<210> 218
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RVC111 轻链 nuc
<400> 218
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccaatca gagtattact agctgggtgg cctggtatca gcagatgcca 120
gggagagccc ctaaactcct gatctatgat gactccactt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tatgagagtt attcagggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa ac 322

Claims (54)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合狂犬病毒属病毒糖蛋白G并且中和狂犬病毒属病毒感染，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段包括重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别如SEQ ID NO:93-97和99或者分别如SEQ ID NO:93-96、98和99中所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或抗原结合片段中和(i)RABV和(ii)至少50％的非RABV狂犬病毒属病毒的所有分离群的狂犬病毒属病毒感染，所述非RABV狂犬病毒属病毒选自ABLV/澳大利亚/蝙蝠/9810AUS-1998/V1039-2011/ABLV、98010/ABLV、1301博克洛蝙蝠狂犬病毒属病毒/BBLV、86132SA/DUVV、DUVV/南非/人/96132SA-1971/RS639-2012/DUVV、EBLV1a/法国/蝙蝠/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1、EBLV1b/法国/蝙蝠/8918-1989/EBLV-1、EBLV2/UK/蝙蝠/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2、94112/EBLV-2、02053/EBLV-2、8619/LBV、MOK/MOK、希莫尼蝙蝠病毒/SHIV、西高加索蝙蝠病毒/WCBV、澳大利亚蝙蝠狂犬病毒属病毒/RV634/ABLV、阿拉万病毒/ARAV、杜文黑基病毒RSA2006/DUVV、杜文黑基病毒ZIM86-RV131/DUVV、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒1.RV20/EBLV-1、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒1.RV9/EBLV-1、EBLV1a/法国/蝙蝠/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1、EBLV2/UK/蝙蝠/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒2.RV1787/EBLV-2、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒2.RV628/EBLV-2、伊尔库特病毒/IRKV、库詹德病毒/KHUV、8619/LBV、拉哥斯蝙蝠病毒NIG56-RV1/LBV、拉哥斯蝙蝠病毒SA2004/LBV、莫科拉病毒NIG68.RV4/MOK、莫科拉病毒98/071RA36/MOK和伊科马狂犬病毒属病毒/IKOV，对于作为传染性病毒测试的ABLV/澳大利亚/蝙蝠/9810AUS-1998/V1039-2011/ABLV、98010/ABLV、1301博克洛蝙蝠狂犬病毒属病毒/BBLV、86132SA/DUVV、DUVV/南非/人/96132SA-1971/RS639-2012/DUVV、EBLV1a/法国/蝙蝠/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1、EBLV1b/法国/蝙蝠/8918-1989/EBLV-1、EBLV2/UK/蝙蝠/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2、94112/EBLV-2、02053/EBLV-2、8619/LBV、MOK/MOK，具有低于10000ng/ml的IC50，并且对于作为假型病毒测试的希莫尼蝙蝠病毒/SHIV、西高加索蝙蝠病毒/WCBV、澳大利亚蝙蝠狂犬病毒属病毒/RV634/ABLV、阿拉万病毒/ARAV、杜文黑基病毒RSA2006/DUVV、杜文黑基病毒ZIM86-RV131/DUVV、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒1.RV20/EBLV-1、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒1.RV9/EBLV-1、EBLV1a/法国/蝙蝠/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1、EBLV2/UK/蝙蝠/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒2.RV1787/EBLV-2、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒2.RV628/EBLV-2、伊尔库特病毒/IRKV、库詹德病毒/KHUV、8619/LBV、拉哥斯蝙蝠病毒NIG56-RV1/LBV、拉哥斯蝙蝠病毒SA2004/LBV、莫科拉病毒NIG68.RV4/MOK、莫科拉病毒98/071RA36/MOK和伊科马狂犬病毒属病毒/IKOV，具有低于10000ng/ml的IC90。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或抗原结合片段以低于10000ng/ml的IC50值中和至少70％的非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒的狂犬病毒属病毒感染，所述非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒选自DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV和ARAV。
4.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或抗原结合片段中和至少70％的非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒的分离群的狂犬病毒属病毒感染，所述非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒选自ABLV/澳大利亚/蝙蝠/9810AUS-1998/V1039-2011/ABLV、98010/ABLV、1301博克洛蝙蝠狂犬病毒属病毒/BBLV、86132SA/DUVV、DUVV/南非/人/96132SA-1971/RS639-2012/DUVV、EBLV1a/法国/蝙蝠/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1、EBLV1b/法国/蝙蝠/8918-1989/EBLV-1、EBLV2/UK/蝙蝠/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2、94112/EBLV-2、02053/EBLV-2、澳大利亚蝙蝠狂犬病毒属病毒/RV634/ABLV、阿拉万病毒/ARAV、杜文黑基病毒RSA2006/DUVV、杜文黑基病毒ZIM86-RV131/DUVV、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒1.RV20/EBLV-1、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒1.RV9/EBLV-1、EBLV1a/法国/蝙蝠/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1、EBLV2/UK/蝙蝠/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒2.RV1787/EBLV-2和欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒2.RV628/EBLV-2、伊尔库特病毒/IRKV、库詹德病毒/KHUV，对于作为传染性病毒测试的ABLV/澳大利亚/蝙蝠/9810AUS-1998/V1039-2011/ABLV、98010/ABLV、1301博克洛蝙蝠狂犬病毒属病毒/BBLV、86132SA/DUVV、DUVV/南非/人/96132SA-1971/RS639-2012/DUVV、EBLV1a/法国/蝙蝠/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1、EBLV1b/法国/蝙蝠/8918-1989/EBLV-1、EBLV2/UK/蝙蝠/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2、94112/EBLV-2和02053/EBLV-2，具有低于10000ng/ml的IC50，并且对于作为假型病毒测试的澳大利亚蝙蝠狂犬病毒属病毒/RV634/ABLV、阿拉万病毒/ARAV、杜文黑基病毒RSA2006/DUVV、杜文黑基病毒ZIM86-RV131/DUVV、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒1.RV20/EBLV-1、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒1.RV9/EBLV-1、EBLV1a/法国/蝙蝠/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1、EBLV2/UK/蝙蝠/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒2.RV1787/EBLV-2、欧洲蝙蝠狂犬病毒属病毒2.RV628/EBLV-2、伊尔库特病毒/IRKV和库詹德病毒/KHUV，具有低于10000ng/ml的IC90。
5.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或抗原结合片段中和EBLV-1的感染。
6.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
7.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段以400ng/ml或更低的IC90中和RABV CVS-11的感染。
8.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或抗原结合片段包括与SEQ ID NO:107的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重链可变区和与SEQID NO:108的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的轻链可变区。
9.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或抗原结合片段包括与SEQ ID NO:107的氨基酸序列具有至少90％的序列统一性的重链可变区和与SEQID NO:108的氨基酸序列具有至少90％的序列统一性的轻链可变区。
10.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段是人抗体、单克隆抗体、纯化抗体、单链抗体、Fab、Fab’、F(ab')2或Fv。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒感染的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述RABV和/或非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒是RABV和/或EBLV-1。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述用途包括将所述抗体与另一种分离的单克隆抗体组合施用，所述另一种分离的单克隆抗体中和狂犬病毒属病毒感染并且包括(i)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQID NO:165-169和171的氨基酸序列或者SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列；(ii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:1-5和7的氨基酸序列或者SEQ ID NO:1-4和6-7的氨基酸序列；(iii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ IDNO:19-23和25的氨基酸序列或者SEQ ID NO:19-22和24-25的氨基酸序列；(iv)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:37-41和43的氨基酸序列或者SEQ ID NO:37-40和42-43的氨基酸序列；(v)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:55-59和61的氨基酸序列或者SEQ ID NO:55-58和60-61的氨基酸序列；(vi)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:75-79和81的氨基酸序列或者SEQ ID NO:75-78和80-81的氨基酸序列；(vii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:111-115和117的氨基酸序列或者SEQ ID NO:111-114和116-117的氨基酸序列；(viii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ IDNO:129-133和135的氨基酸序列或者SEQ ID NO:129-132和134-135的氨基酸序列；(ix)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQID NO:147-151和153的氨基酸序列或者SEQ ID NO:147-150和152-153的氨基酸序列；(x)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:183-187和189的氨基酸序列或者SEQ ID NO:183-186和188-189的氨基酸序列；或(xi)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:201-205和207的氨基酸序列或者SEQ ID NO:201-204和206-207的氨基酸序列，并且其中两种抗体特异性地结合至RABV的糖蛋白G上的不同表位。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至RABV的糖蛋白G上的抗原位点I或III，和组合施用的另一种抗体结合至RABV的糖蛋白G上的抗原位点I或III的另一种。
15.根据权利要求13所述的用途，其中所述另一种分离的单克隆抗体包括的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列分别为SEQ IDNO:165-169和171的氨基酸序列或SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列。
16.根据权利要求13所述的用途，其中组合施用的所述另一种分离的单克隆抗体包括重链可变区，其具有SEQ ID NO:179的氨基酸序列。
17.根据权利要求13所述的用途，其中所述抗体和组合施用的所述另一种抗体被同时或连续施用。
18.根据权利要求13所述的用途，其中所述抗体和组合施用的所述另一种抗体以等摩尔量施用。
19.一种核酸分子，其包括编码根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链或轻链或两条链的多核苷酸。
20.一种载体，其包括根据权利要求19所述的核酸分子。
21.一种细胞，其表达根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；或者包括根据权利要求20所述的载体。
22.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求19所述的核酸、根据权利要求20所述的载体、根据权利要求21所述的细胞，和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或运载体。
23.一种药物组合物，其包括至少两种抗体或其抗原结合片段，其中所述至少两种抗体或其抗原结合片段的一种是根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，并且另一种抗体或其抗原结合片段包括(i)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:165-169和171的氨基酸序列或者SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列；(ii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:1-5和7的氨基酸序列或者SEQID NO:1-4和6-7的氨基酸序列；(iii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:19-23和25的氨基酸序列或者SEQ ID NO:19-22和24-25的氨基酸序列；(iv)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:37-41和43的氨基酸序列或者SEQ ID NO:37-40和42-43的氨基酸序列；(v)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:55-59和61的氨基酸序列或者SEQ ID NO:55-58和60-61的氨基酸序列；(vi)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:75-79和81的氨基酸序列或者SEQ ID NO:75-78和80-81的氨基酸序列；(vii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:111-115和117的氨基酸序列或者SEQ ID NO:111-114和116-117的氨基酸序列；(viii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:129-133和135的氨基酸序列或者SEQ IDNO:129-132和134-135的氨基酸序列；(ix)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:147-151和153的氨基酸序列或者SEQ ID NO:147-150和152-153的氨基酸序列；(x)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:183-187和189的氨基酸序列或者SEQ ID NO:183-186和188-189的氨基酸序列；和/或(xi)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:201-205和207的氨基酸序列或者SEQ ID NO:201-204和206-207的氨基酸序列；其中所述至少两种抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RABV的糖蛋白G上的不同表位。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述至少两种抗体中的一种抗体结合至RABV的糖蛋白G上的抗原位点I，并且所述至少两种抗体中的另一种抗体结合至RABV的糖蛋白G上的抗原位点III。
25.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述另一种抗体或其抗原结合片段包括分别根据SEQ ID NO:165-169和171的氨基酸序列或SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
26.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述另一种抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，其与SEQ ID NO:179的氨基酸序列具有至少80％序列同一性。
27.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述另一种抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，其与SEQ ID NO:179的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
28.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述药物组合物包括等摩尔量的所述抗体或其抗原结合片段和所述另一种抗体或其抗原结合片段。
29.根据权利要求22所述的药物组合物，其作为单剂量产品被提供。
30.根据权利要求23所述的药物组合物，其作为单剂量产品被提供。
31.根据权利要求22所述的药物组合物，其中根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的量不超过100mg。
32.根据权利要求23所述的药物组合物，其中根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的量不超过100mg。
33.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求19所述的核酸、根据权利要求20所述的载体、根据权利要求21所述的细胞或根据权利要求22-32中任一项所述的药物组合物，制备用于(i)预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒感染；或(ii)诊断RABV和/或其它遗传谱系I狂犬病毒属病毒感染的药物中的用途。
34.根据权利要求33所述的用途，其中所述用途是暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒感染，其中所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述载体、所述细胞或所述药物组合物在感染后多达七天被施用。
35.根据权利要求33所述的用途，其中所述用途是暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒感染，其中所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述载体、所述细胞或所述药物组合物在感染后多达五天被施用。
36.根据权利要求33所述的用途，其中所述用途是暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒感染，其中所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述载体、所述细胞或所述药物组合物与疫苗、抗病毒药、干扰素-α和/或氯胺酮组合施用。
37.根据权利要求33所述的用途，其中所述用途是暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒感染，其中所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述载体、所述细胞或所述药物组合物与狂犬病疫苗、利巴韦林、干扰素-α和/或氯胺酮组合施用。
38.根据权利要求33所述的用途，其中所述用途是暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒感染，其中所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述载体、所述细胞或所述药物组合物以标准PEP方案施用。
39.根据权利要求38所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段以0.005到100mg/kg的剂量施用。
40.根据权利要求33所述的用途，其中所述用途是暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒感染，其中所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述载体、所述细胞或所述药物组合物在感染后的1到6天施用。
41.根据权利要求33所述的用途，其中所述用途是暴露后预防、治疗或减轻RABV和/或非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒感染，其中所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述载体、所述细胞或所述药物组合物在感染后的2到5天施用。
42.根据权利要求40或41所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段在不伴随和/或随后施用疫苗的情况下施用。
43.根据权利要求42所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段以0.01到100mg/kg的剂量施用。
44.根据权利要求33所述的用途，其中所述用途包括暴露后预防。
45.根据权利要求33所述的用途，其中根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，和另一种抗体或其抗原结合片段被施用至对象，所述另一种抗体或其抗原结合片段包括(i)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:165-169和171的氨基酸序列或者SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列；(ii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:1-5和7的氨基酸序列或者SEQ ID NO:1-4和6-7的氨基酸序列；(iii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQID NO:19-23和25的氨基酸序列或者SEQ ID NO:19-22和24-25的氨基酸序列；(iv)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ IDNO:37-41和43的氨基酸序列或者SEQ ID NO:37-40和42-43的氨基酸序列；(v)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:55-59和61的氨基酸序列或者SEQ ID NO:55-58和60-61的氨基酸序列；(vi)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:75-79和81的氨基酸序列或者SEQ ID NO:75-78和80-81的氨基酸序列；(vii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:111-115和117的氨基酸序列或者SEQ ID NO:111-114和116-117的氨基酸序列；(viii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ IDNO:129-133和135的氨基酸序列或者SEQ ID NO:129-132和134-135的氨基酸序列；(ix)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQID NO:147-151和153的氨基酸序列或者SEQ ID NO:147-150和152-153的氨基酸序列；(x)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:183-187和189的氨基酸序列或者SEQ ID NO:183-186和188-189的氨基酸序列；和/或(xi)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:201-205和207的氨基酸序列或者SEQ ID NO:201-204和206-207的氨基酸序列；所述抗体或其抗原结合片段和另一种抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RABV的糖蛋白G上的不同表位。
46.根据权利要求45所述的用途，其中至少两种抗体中的一种抗体结合至RABV的糖蛋白G上的抗原位点I，并且至少两种抗体中的另一种抗体结合至RABV的糖蛋白G上的抗原位点III。
47.根据权利要求45所述的用途，其中所述另一种抗体或其抗原结合片段包括重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为根据SEQ ID NO:165-169和171的氨基酸序列或根据SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列。
48.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在通过检查抗RABV或抗非RABV遗传谱系I狂犬病毒属病毒疫苗的抗原包含正确构象的特异性表位来监测所述疫苗的质量中的用途。
49.组分试剂盒，其包括根据权利要求1-10中任一项所述的至少一种抗体或其抗原结合片段、根据权利要求19所述的至少一种核酸、根据权利要求20所述的至少一种载体、根据权利要求21所述的至少一种细胞和/或根据权利要求22至32中任一项所述的至少一种药物组合物。
50.组分试剂盒，其包括根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，和另一种抗体或其抗原结合片段，所述另一种抗体或其抗原结合片段包括(i)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:165-169和171的氨基酸序列或者SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列；(ii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ IDNO:1-5和7的氨基酸序列或者SEQ ID NO:1-4和6-7的氨基酸序列；(iii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:19-23和25的氨基酸序列或者SEQ ID NO:19-22和24-25的氨基酸序列；(iv)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:37-41和43的氨基酸序列或者SEQ ID NO:37-40和42-43的氨基酸序列；(v)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:55-59和61的氨基酸序列或者SEQ ID NO:55-58和60-61的氨基酸序列；(vi)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:75-79和81的氨基酸序列或者SEQ ID NO:75-78和80-81的氨基酸序列；(vii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:111-115和117的氨基酸序列或者SEQ ID NO:111-114和116-117的氨基酸序列；(viii)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:129-133和135的氨基酸序列或者SEQ ID NO:129-132和134-135的氨基酸序列；(ix)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:147-151和153的氨基酸序列或者SEQ ID NO:147-150和152-153的氨基酸序列；(x)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:183-187和189的氨基酸序列或者SEQ ID NO:183-186和188-189的氨基酸序列；和/或(xi)重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别为SEQ ID NO:201-205和207的氨基酸序列或者SEQ ID NO:201-204和206-207的氨基酸序列；其中所述抗体或其抗原结合片段和另一种抗体或其抗原结合片段特异性地结合至RABV的糖蛋白G上的不同表位。
51.根据权利要求50所述的组分试剂盒，其中至少两种抗体中的一种抗体结合至RABV的糖蛋白G上的抗原位点I，并且至少两种抗体中的另一种抗体结合至RABV的糖蛋白G上的抗原位点III。
52.根据权利要求50所述的组分试剂盒，其中所述另一种抗体或其抗原结合片段包括重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列和轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其分别地为根据SEQ ID NO:165-169和171的氨基酸序列或根据SEQ ID NO:165-168和170-171的氨基酸序列。
53.根据权利要求50所述的组分试剂盒，其中所述抗体或其抗原结合片段和另一种抗体或其抗原结合片段中的一种包括重链可变区，其与SEQ ID NO:107或SEQ ID NO:179的氨基酸序列具有至少80％序列同一性。
54.根据权利要求50所述的组分试剂盒，其中所述抗体或其抗原结合片段和另一种抗体或其抗原结合片段中的一种包括重链可变区，其与SEQ ID NO:107或SEQ ID NO:179的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
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