BR122020023406B1

BR122020023406B1 - Anticorpos que neutralizam de modo potente vírus da raiva e outros lissavírus, moléculas de ácido nucleico, vetor, célula isolada, composição farmacêutica, usos dos mesmos, e kit de partes

Info

Publication number: BR122020023406B1
Application number: BR122020023406-7A
Authority: BR
Inventors: Davide Corti; Hervé BOURHY
Original assignee: Institut Pasteur; Humabs Biomed Sa
Priority date: 2014-11-18
Filing date: 2015-11-18
Publication date: 2023-10-31
Also published as: BR112017010298A2; EP3220947B1; HRP20201811T1; US11730813B2; US20200354435A1; PH12021550521A1; WO2016078761A1; US11723977B2; CN107428819A; CN114805558B; SI3220947T1; US10703801B2; PL3220947T3; US20180105579A1; CN114805558A; EP3831404A1; DK3220947T3; CN107428819B; HUE052595T2; LT3220947T

Abstract

a presente invenção refere-se a anticorpos, e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, que neutralizam potentemente a infecção de ambos lissavírus rabv e não rabv. a invenção também se refere a sítios antigênicos aos quais os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno se ligam, bem como a ácidos nucleicos que codificam e células b imortalizadas e células plasmáticas cultivadas que produzem tais anticorpos e fragmentos de anticorpos. além disso, a invenção refere-se ao uso dos anticorpos e fragmentos de anticorpos da invenção em métodos de triagem bem como no diagnóstico, na profilaxia e no tratamento da infecção pelo rabv e da infecção com lissavírus não rabv.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos, e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, que neutralizam de modo potente a infecção pelo vírus da raiva (RABV) e pelos lissavírus não RABV. A invenção também se refere a sítios antigênicos aos quais os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno se ligam, bem como a ácidos nucleicos que codificam os referidos anticorpos e fragmentos de anticorpos e células B imortalizadas e células plasmáticas cultivadas que produzem os referidos anticorpos e fragmentos de anticorpos. Além disso, a invenção se refere à utilização dos anticorpos e fragmentos de anticorpos da invenção em métodos de triagem bem como no diagnóstico, na profilaxia e no tratamento da infecção pelo lissavírus RABV e com não RABV.

[0002] A raiva é uma infecção viral, que causa inflamação aguda do cérebro. A raiva é distribuída quase em todo o mundo e afeta principalmente animais selvagens e domésticos, mas também envolve seres humanos, resultando em uma doença devastadora, a qual é quase 100 % invariavelmente fatal em indivíduos que não tenham recebido profilaxia pós-exposição (em inglês, PEP). Os sintomas iniciais da raiva podem incluir febre e formigamento no sítio de exposição. Estes sintomas são seguidos por um ou mais dos seguintes sintomas: movimentos violentos, excitação descontrolada, medo da água, uma incapacidade de mover partes do corpo, confusão, e perda da consciência. Depois dos sintomas aparecerem, quase sempre a raiva resulta em óbito. O período de tempo entre contrair a doença e o início dos sinto- mas geralmente é de um a três meses. No entanto, este período de tempo pode variar de menos de uma semana até mais de um ano. O período de tempo depende da distância que o vírus deve percorrer até atingir o sistema nervoso central .

[0003] A raiva é causada por uma série de lissavírus incluindo o vírus da raiva e lissavírus, por exemplo, o lissavírus do morcego europeu.

[0004] Os Lissavírus têm simetria helicoidal, com um comprimento de cerca de 180 nm e uma seção transversal de cerca de 75 nm. Estes vírus são envelopados e têm um genoma de RNA de filamento único com sentido negativo. A informação genética é acumulada como um complexo de ribonucleoproteínas no qual RNA é firmemente ligado pela nucleoproteína viral. O genoma de RNA do vírus codifica cinco genes cuja ordem é altamente conservada: nucleoproteína (N), fosfo- proteína (P), proteína da matriz (M), glicoproteína (G), e a RNA polime- rase viral (L).

[0005] O gênero dos Lissavírus é subdividido em três filogrupos. O filogrupo I inclui a espécies vírus da raiva (RABV), os lissavírus do morcego europeu do tipo 1 (EBLV-1) e tipo 2 (EBLV-2), o vírus Duve- nhage (DUVV), o lissavírus do morcego australiano (ABLV), o vírus Aravan (ARAV), o vírus Khujand (KHUV), o lissavírus do morcego de Bokeloh (BBLV) e o vírus Irkut (IRKV). O filogrupo II inclui o vírus do morcego de Lagos (LBV), o vírus Mokola (MOKV), e o lissavírus do morcego de Shimoni (SHIV ou SHIBV). Os vírus remanescentes, o vírus do morcego Caucasiano do Oeste (WCBV) e o lissavírus Ikoma (IKOV) não podem ser incluídos em qualquer um destes filogrupos mas são relacionados filogeneticamente uns com os outros, no entanto, suas distâncias genéticas são maiores do que as distâncias entre os filogrupos I e II (Bourhy, H., et al. Journal of Clinical Microbiology 30, 2419-2426 ,1992; Bourhy, H., et al. Virology 194, 70-81, 1993; Amengual, B., et al. J Gen. Virol 78, 2319-2328, 1997; Hooper, P. T. et al. Bulletin de l'Institut Pasteur 95, 209-218,1997; Kuzmin, I. V. et al. Virus Res 149, 197-210, 2010; Badrane, H., et al. J Virol 75, 32683276, 2001; Marston, D. A. et al. Emerg Infect Dis 18, 664-667, 2012). De modo importante, todos os genótipos destes lissavírus têm provocado a morte de seres humanos e/ou animais na natureza (Badrane, H., et al. J Virol 75, 3268-3276, 2001).

[0006] O vírus da raiva (RABV) foi o primeiro dos quatorze genóti- pos de lissavírus a serem identificados. O vírus da raiva é um vírus de RNA de filamento único, grande e em forma de bala, envelopado, classificado e o genoma do vírus da raiva codifica para cinco proteínas virais: RNA polimerase RNA-dependente (L); uma nucleoproteína (N); uma proteína fosforilada (P); uma proteína da matriz (M) localizada sobre o lado interno do envelope viral; e uma glicoproteína da superfície externa (G). A proteína G (62 a 67 kDa) é uma glicoproteína tipo I composta de 505 aminoácidos que tem dois a quatro sítios de N- glicosilação potenciais. A proteína G cobre a superfície externa do envelope do vírion e é o único antígeno alvo, o qual é capaz de induzir anticorpos de neutralização de vírus.

[0007] A raiva é disseminada através do globo e aproximadamente 10 milhões de pessoas ao ano são tratadas depois da exposição à raiva, geralmente depois de uma mordida por animais infectados (cães, morcegos, raposas, gatos, macacos guaxinins, gambás, gado bovino, lobos, coiotes e outros animais domésticos e selvagens). Estima-se que algo entre 40.000 a 70.000 pessoas morram devido à doença a cada ano, principalmente na África, na China e na Índia, e 50% dos casos de raiva no mundo inteiro ocorrem em crianças. Estes dados salientam a importante necessidade médica ainda não atendida de um tratamento contra a raiva seguro, eficaz e acessível.

[0008] A prevenção da raiva é realizada por ou vacinação pré- ou pós-exposição, essencialmente usando vacinas modernas, à base de cultura de tecido. A imunização antes da exposição (Profilaxia pré- exposição (em inglês, PrEP)) é recomendada para as pessoas que apresentem um alto risco e é realizada por administração de uma vacina contra a raiva (imunização ativa). O grupo de alto risco inclui pessoas que trabalham com morcegos ou que passam períodos prolongados em áreas do mundo onde a raiva é comum. Além disso, a vacinaantirrábica é recomendada para as pessoas que viajam para países na África e na Ásia, onde a raiva é endêmica.

[0009] As vacinas contra a raiva disponíveis atualmente incluem as vacinas de tecido nervoso mais amplamente usadas porém altamente propensas a risco, ou as vacinas mais seguras porém mais caras de cultura celular e de ovos embrionados (em inglês, CCEEVs). Na Alemanha, por exemplo, somente são comercializadas duas vacinas antirrábicas, Rabipur® e “Tollwut-Impfstoff (célula diploide humana [HDC]) inaktiviert”. Estas vacinas contêm o vírus da raiva inativado. Ambas as vacinas são recomendadas para utilização pré- e pós- exposição.

[0010] Depois de exposição ao vírus, uma profilaxia pós-exposição (em inglês, PEP) com a vacina da raiva e uma imunoglobulina da raiva (RIG) são o tratamento de rotina de prevenção da doença, se a pessoa receber o tratamento o mais cedo possível depois da infecção, isto é, durante os primeiros dias depois da infecção. No caso de não ser tratada até o início dos sintomas, a raiva é quase 100 % fatal. Portanto, atualmente, não existe nenhum tratamento para a raiva.

[0011] O “tratamento” atualmente usado quando se presume que alguém tenha sido infectado pelo vírus é a profilaxia pós-exposição (em inglês, PEP), a qual combina a imunoglobulina da raiva (RIG), em particular imunoglobulinas da raiva humana ou equina (HRIG e ERIG, respectivamente), com uma vacina contra a raiva. Em particular, os pacientes recebem uma dose de RIG (imunização passiva) e várias doses de vacina da raiva (imunização ativa) de acordo com a informação do fabricante da vacina da raiva. Em uma terapia de rotina amplamente usada, por exemplo, cinco doses da vacina são administradas durante um período de vinte e oito dias, isto é, a primeira dose de vacina da raiva é administrada tão logo possível depois da exposição, de modo preferencial no dia 0, com doses adicionais nos dias 3, 7, 14, e 28 depois da primeira dose (cf. http://www.rki.de/DE/Content/Infekt/EpidBull/Merkblaetter/Ratgeber_To llwut.html, recuperado em 12 de novembro de 2014). Em contraste, a imunoglobulina da raiva (RIG) para imunização passiva é administrada somente uma vez, de modo preferencial no início da vacinação pós- exposição, ou tão logo possível depois do início desta. A dose de imu- noglobulina da raiva humana (HRIG) proposta pela OMS é de 20 UI/kg de peso corporal; para produtos de imunoglobulina equina (ERIG) e F(ab’)2 é de 40 UI/kg de peso corporal (cf. http://www.who.int/rabies/human/WHO_strategy_prepost_exposure/en/ index1.html#, recuperado em 12 de novembro de 2014). Em particular, doses maiores podem reduzir a eficácia da vacina. Todas as imuno- globulinas da raiva, ou tanto quanto anatomicamente possível de modo a evitar possível síndrome de compartimento, devem ser administradas dentro do sítio ou sítios do ferimento ou em torno dos mesmos. A imunoglobulina remanescente, se houver, deve ser injetada por via intramuscular em um sítio distante do sítio de administração da vacina. A imunoglobulina da raiva pode ser diluída até um volume suficiente para todos os ferimentos serem infiltrados de modo seguro e eficaz (cf. http://www.who.int/rabies/human/WHO_strategy_prepost_exposure/en/ index1.html#, recuperado em 12 de novembro de 2014). Esta geralmenteé administrada com sucesso até 24 a 48 horas depois da exposição. A HRIG é amplamente usada, especialmente nos países desen- volvidos, e é considerada mais segura do que a ERIG. O alto custo da HRIG e sua disponibilidade limitada proíbem sua ampla utilização nos países em desenvolvimento. Além do mais, a vacina e HRIG ou ERIG não protegem de modo eficaz contra infecção com diferentes espécies de lissavírus (a proteção é inversamente relacionada com a distância genética com a cepa da vacina). Deste modo, a necessidade de substituir a HRIG com pelo menos um produto à base de anticorpos contra a raiva igualmente potente e um mais seguro é considerada como sendo importante para melhorar o acesso aos produtos biológicos da raiva, em particular nos países em desenvolvimento.

[0012] Para este fim, na última década foram desenvolvidos anti corpos monoclonais de camundongo bem como anticorpos monoclo- nais humanos com dois produtos em estudos clínicos avançados. A saber, CL184 (produzido pela Crucell), o qual é um coquetel de dois anticorpos humanos denominados CR57 e CR4098, foi desenvolvido para substituir as HRIGs em estudos clínicos até a fase III (Bakker, A. B. H. et al. , J Virol 79, 9062-9068, 2005; Goudsmit J, Marissen WE, Weldon WC, Niezgoda M, Hanlon CA, Rice AB, Kruif J, Dietzschold B, Bakker AB, Rupprecht CE (2006) Comparison of an anti-rabies human monoclonal antibody combination with human polyclonal anti-rabies immune globulin. J Infect Dis 193: 796-801). No entanto, recentemente o estudo foi interrompido devido à falta de atividade neutralizante do coquetel, ou de um dos dois anticorpos do coquetel, contra alguns isolados de RABV circulantes. Outro anticorpo monoclonal humano, o qual está sendo presentemente testado em fase clínica III na Índia é RAB1, o qual é produzido pela Mass Biologics and Serum Institute of India e o qual se baseia em um único anticorpo monoclonal (Sloan SE, Hanlon C, Weldon W, Niezgoda M, Blanton J, Self J, Rowley KJ, Mandell RB, Babcock GJ, Thomas WD,Jr, et al (2007) Identification and characterization of a human monoclonal antibody that potently neutrali zes a broad painel de rabies virus isolates. Vaccine 25: 2800-2810; Nagarajan T, Marissen WE, Rupprecht CE (2014) Monoclonal antibodies for the prevention of rabies: theory and clinical practice. Antibody Technology Journal 4: 1-12). No entanto, foram identificados isolados de RABV que não são neutralizados por cada um destes anticorpos monoclonais (CR57, CR4098 e RAB1) (Kuzimina NA, Kuzmin IV, Ellison JA, Rupprecht CE (2013) Conservation of binding epitopes for monoclonal antibodies on the rabies virus glycoprotein. Journal of Antiviral and Antiretrovirals 5: 37-43, Marissen WE, Kramer RA, Rice A, Weldon WC, Niezgoda M, Faber M, Slootstra JW, Meloen RH, Clijsters-van der Horst M, Visser TJ, et al (2005) Novel rabies virus-neutralizing epitope recognized by human monoclonal antibody: fine mapping and escape mutant analysis. J Virol 79: 4672-4678). No caso do anticorpo RAB1, dois entre os 25 isolados testados não foram neutralizados e três foram neutralizados fracamente (Sloan SE, Hanlon C, Weldon W, Niezgoda M, Blanton J, Self J, Rowley KJ, Mandell RB, Babcock GJ, Thomas WD,Jr, et al (2007) Identification and characterization of a human monoclonal antibody that potently neutralizes a broad panel of rabies virus isolates. Vaccine 25: 2800-2810). Neste caso o risco de fracasso da profilaxia pós-exposição (em inglês, PEP) é, pelo menos em princípio, maior do que no caso do coquetel dos anticorpos CR57 e CR4098. Estes estudos indicam que CR4098 e RAB1 têm uma amplitude de reatividade limitada com relação aos isolados não RABV e têm uma fração significativa dos isolados de RABV testados que não são neutralizados ou são somente fracamente neutralizados por estes anticorpos do sítio antigênico III. Na verdade, devido à falta de grande cobertura de RABV, recentemente o desenvolvimento de CL184 foi interrompido, ao passo que o RAB1 ainda está em desenvolvimento em uma Fase 2/3 na Índia.

[0013] Por conseguinte, ainda existe uma necessidade de substitu- ir a HRIG com um produto à base de anticorpos pelo menos igualmente potentes e mais seguros. Além do mais, existe uma necessidade de um produto capaz de prevenir bem como tratar ou atenuar infecção com diferentes lissavírus com alta potência e eficácia, isto é, um produto o qual não seja limitado a neutralizar RABV somente, em particular uma vez que em alguns países, por exemplo, na Europa e na Austrália, a raiva é transmitida principalmente por morcegos. Além disso, é importante ter anticorpos que tenham por alvo diferentes epitopos e diferentes sítios antigênicos sobre as várias cepas de modo a evitar o aparecimento de cepas de vírus resistentes e a prevenir a fuga de va-riantes resistentes do vírus.

[0014] Além do mais, como atualmente não existe nenhum trata mento para a raiva, existe uma necessidade de um produto o qual é eficaz no tratamento ou na atenuação de infecção, mesmo se a exposição ao vírus for de mais de 24 a 48 horas antes do primeiro tratamento com o produto. O desenvolvimento de um tratamento semelhante vai ser de benefício em particular para pelo menos duas classes de pacientes: aqueles com exposição conhecida ao RABV mas que não tenham tido êxito em receber pronta profilaxia pós-exposição devido a circunstâncias e que estejam em alto risco de desenvolvimento de infecção pelo RABV, e aqueles que não tenham reconhecido contato com o vírus e apresentem sinais (de diferente gravidade) da doença (por exemplo, indivíduos infectados por contatos não notados com morcegos infectados; o RABV de origem dos morcegos onde a raiva do cão é controlada se tornou a principal causa de raiva humana). O desenvolvimento de um produto de anticorpos potentes e amplamente neutralizantes pode portanto ajudar a expandir a janela de tratamento pós-exposição para infecção pelo RABV humano, que é atualmente limitado aos primeiros dias depois da infecção. Nestes indivíduos o RABV pode já ter atingido os tecidos do sistema nervoso central e também já podem ter aparecido sinais iniciais ou tardios da doença. Estes pacientes podem se beneficiar de um tratamento com anticorpos neutralizantes altamente potentes que podem vazar através da barreirahematoencefálica (ou ser administrado diretamente no sistema nervoso central) liberando uma quantidade suficiente de anticorpos capaz de neutralizar de modo eficaz a replicação de vírus no tecido do SNC.

[0015] Em vista do acima exposto, é o objetivo da presente inven ção proporcionar um produto à base de anticorpos, o qual seja pelo menos igualmente potente, porém mais seguro e com melhor relação custo benefício comparado com a HRIG. Além do mais, é o objeto da presente invenção proporcionar um produto o qual é capaz de prevenção bem como de tratamento ou atenuação de infecção com diferentes lissavírus com alta potência e eficácia, isto é, um produto o qual não é limitado a neutralizar o RABV somente. Além disso, é o objeto da presente invenção proporcionar um produto o qual é eficaz no tratamento ou na atenuação de infecção, mesmo se a exposição ao vírus for mais de 24 a 48 horas antes do primeiro tratamento com o produto. Em resumo, é o objeto da presente invenção proporcionar anticorpos aprimorados, ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, bem como moléculas de ácido nucleico, vetores e células e composições farmacêuticas relacionados, os quais superem as desvantagens da técnica anterior discutidas acima por uma abordagem direta e economicamenteviável.

[0016] O objetivo fundamental da presente invenção é resolvido pelo assunto reivindicado.

[0017] Embora a presente invenção seja descrita em detalhes abaixo, deve ser entendido que esta invenção não é limitada às metodologias, aos protocolos e aos reagentes em particular descritos aqui, neste requerimento de patente, uma vez que estes podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui, neste re- querimento de patente, não se destina a limitar o âmbito da presente invenção a qual será limitada somente pelas reivindicações anexadas. A menos que definido de modo diverso, todos os termos técnicos e científicos usados aqui, neste requerimento de patente, têm os mesmos significados conforme comumente entendido por alguém com conhecimento regular da técnica.

[0018] A seguir, vão ser descritos os elementos da presente in venção. Estes elementos são listados com modalidades específicas, no entanto, deve ser entendido que podem ser combinados em qualquer maneira e em qualquer número para criar modalidades adicionais. Os exemplos e modalidades preferenciais descritos de maneira variada não devem ser considerados para limitar a presente invenção a somente as modalidades explicitamente descritas. Esta descrição deve ser entendida como suportando e englobando modalidades as quais combinam as modalidades explicitamente descritas com qual-quernúmero dos elementos revelados e/ou preferenciais. Além do mais, quaisquer permutações e combinações de todos os elementos descritos neste requerimento vão ser consideradas reveladas pela descrição do presente requerimento, a menos que o contexto indique de modo diverso.

[0019] Do início ao fim desta especificação e das reivindicações as quais se seguem, a menos que oi contexto requeira de modo diverso, o termo "compreendem", e variações tais como "compreende" e "compreendendo",vão ser entendidos como implicando a inclusão de um membro, inteiro ou etapa determinado mas não a exclusão de qualquer outro membro, inteiro ou etapa não determinado. O termo "consistem de"é uma modalidade particular do termo "compreendem", em que qualquer outro membro, inteiro ou etapa não determinado é excluído. No contexto da presente invenção, o termo "compreendem"engloba o termo "consistem de". O termo “compreendendo” portanto en- globa “incluindo” bem como “consistindo” por exemplo, uma composição “compreendendo” X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir algo adicional por exemplo, X + Y.

[0020] Os termos "um" e "uma" e "o" e "a" e referência similar usa dos no contexto de descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações) devem ser considerados como cobrindo tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de modo diverso aqui, neste requerimento de patente, ou claramente contradito pelo contexto. A menção de faixas de valores aqui, neste requerimento de patente, se destina meramente a servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que seja abrangido pela faixa. A menos que indicado de modo diverso aqui, neste requerimento de patente, cada valor individual é incorporado na especificação como se tivesse sido mencionado individualmente aqui, neste requerimento de patente. Nenhum termo na especificação deve ser considerado como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática da invenção.

[0021] A palavra “substancialmente” não exclui “completamente” por exemplo, uma composição a qual é “substancialmente livre” de Y pode ser completamente livre de Y. Onde necessário, a palavra “substancialmente” pode ser omitida da definição da invenção.

[0022] O termo “cerca de” em relação a um valor numérico x signi fica x ± 10%.

[0023] O termo “doença” conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se destina a ser sinônimo de modo geral e é usado de modointercambiável com os termos “distúrbio” e “condição” (como em condição médica), em que todos refletem uma condição anormal do corpo humano ou animal ou de uma de suas partes que prejudica o funcionamento normal, é tipicamente manifestado por sinais e sintomas diferenciados, e faz com que o animal ou ser humano tenha uma reduzida qualidade de vida ou duração da vida.

[0024] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, a referência a “tratamento” de um sujeito ou paciente se destina a incluir prevenção, profilaxia, atenuação, melhora e terapia. Os termos “sujeito” ou “paciente” são usados de modo intercambiável aqui, neste requerimento de patente, para indicar todos os mamíferos incluindo humanos. Exemplos de sujeitos incluem humanos, vacas, cães, gatos, cavalos, cabras, carneiro, porcos, e coelhos. Em uma modalidade, o paciente é um ser humano.

[0025] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, os termos “fragmento de ligação de antígeno,” “fragmento,” e “fragmento de anticorpo” são usados de modo intercambiável para se referir a qualquer fragmento de um anticorpo da invenção que mantenha a atividade de ligação de antígeno do anticorpo. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a, um anticorpo de cadeiaúnica, Fab, Fab’, F(ab')2, Fv ou scFv. Além disso, o termo “anticorpo” conforme usado aqui, neste requerimento de patente, inclui tanto anticorpos quanto fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos.

[0026] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, um “anticorpo neutralizante” é um anticorpo que pode neutralizar, isto é, prevenir, inibir, reduzir, impedir ou interferir com, a capacidade de um patógeno para iniciar e/ou perpetuar uma infecção em um hospedeiro. Os termos “anticorpo neutralizante” e “um anticorpo que neutraliza” ou “anticorpos que neutralizam” são usados de modo intercambiável aqui, neste requerimento de patente. Estes anticorpos podem ser usados isolados, ou em combinação, como agentes profiláticos ou terapêuticos depois de formulação apropriada, em associação com vacinação ativa, como uma ferramenta de diagnóstico, ou como uma ferramenta de produção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.

[0027] Frequentemente as doses são expressas em relação ao peso corporal. Deste modo, uma dose a qual é expressa como [g, mg, ou outra unidade]/kg (ou g, mg etc.) geralmente se refere a [g, mg, ou outra unidade] “por kg (ou g, mg etc.) de peso corporal”, mesmo se o termo “peso corporal” não for explicitamente mencionado.

[0028] O termo “ligar especificamente” e referência similar não en globaaderência inespecífica.

[0029] O termo “vacina” conforme usado aqui, neste requerimento de patente, é tipicamente entendido como sendo um material profilático ou terapêutico proporcionando pelo menos um antígeno, de modo preferencial um imunogênio. O antígeno ou imunogênio pode ser derivado a partir de qualquer material que é adequado para vacinação. Por exemplo, o antígeno ou imunogênio pode ser derivado a partir de um patógeno, tal como de partículas de vírus ou bactérias, etc., ou de um tecido canceroso ou tumor. O antígeno ou imunogênio estimula o sistema imune adaptativo do corpo a proporcionar uma resposta imune adaptativa. Em particular, um “antígeno” ou um “imunogênio” se refere tipicamente a uma substância a qual pode ser reconhecida pelo sistema imune, de modo preferencial pelo sistema imune adaptativo, e a qual é capaz de disparar uma resposta imune antígeno-específica, por exemplo, por formação de anticorpos e/ou células T antígeno- específicas como parte de uma resposta imune adaptativa. Tipicamente, um antígeno pode ser ou pode compreender um peptídeo ou uma proteína o/a qual pode ser apresentado/a pelo MHC a células T.

[0030] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, “va riante de sequência“ se refere a qualquer alteração em uma sequência de referência, por meio do quê uma sequência de referência é qualquer uma das sequências listadas na “Tabela de Sequências e nos Números de SEQ ID” (listagem de sequências), isto é, SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 218. Portanto, o termo “variante de sequência” inclui variantes das sequências de nucleotídeos e variantes das sequências de aminoácidos. Digno de nota, as variantes de sequências referidas aqui, neste requerimento de patente, são em particular variantes de sequências funcionais, isto é, variantes de sequências mantendo a função biológica, por exemplo, do anticorpo. No contexto da presente invenção uma função biológica mantida semelhante é de modo preferencial a ligação do anticorpo à proteína G do RABV (e não RABV).

[0031] A identidade de sequência é geralmente calculada com respeito ao comprimento total da sequência de referência (isto é, a sequência mencionada no requerimento). A percentagem de identitdade, conforme referido aqui, neste requerimento de patente, pode ser determinada, por exemplo, usando BLAST usando os parâmetros default especificados pelo NCBI (o National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [matriz Blosum 62; penalidade de intervalo aberto = 11 e penalidade de extensão de intervalo = 1].

[0032] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma “variante da sequência de nucleotídeos” tem uma sequência alterada na qual um ou mais dos nucleotídeos na sequência de referência é eliminado, ou substituído, ou um ou mais nucleotídeos são inseridos dentro da sequência da sequência de nucleotídeos de referência. Os nucleotídeos são referidos aqui, neste requerimento de patente, pela designação padrão de uma letra (A, C, G, ou T). Devido à degeneraçãodo código genético, uma “variante da sequência de nucleotídeos” pode ou resultar em uma modificação na sequência de aminoácidos de referência respectiva, isto é, em uma “variante da sequência de aminoácidos” ou não. Variantes de sequências preferenciais são as variantes das sequências de nucleotídeos referidas, as quais não resultam em variantes das sequências de aminoácidos (mutações silenciosas), mas outras mutações não silenciosas também estão dentro do âmbito, em particular sequências de nucleotídeos mutantes, as quais resultam em uma sequência de aminoácidos, a qual é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90 %, de modo mais preferencial pelo menos 95% sequência idêntica à sequência de referência.

[0033] Uma “variante da sequência de aminoácidos” tem uma se quência alterada na qual um ou mais dos aminoácidos na sequência de referência é eliminado ou substituído, ou um ou mais aminoácidos são inseridos dentro da sequência da sequência de aminoácidos de referência. Como um resultado das alterações, a variante da sequência de aminoácidos tem uma sequência de aminoácidos a qual é pelo menos 80% idêntica à sequência de referência, de modo preferencial, pelo menos 90% idêntica, de modo mais preferencial pelo menos 95% idêntica, de modo o mais preferencial pelo menos 99% idêntica à sequência de referência. Sequências variantes as quais são pelo menos 90% idênticas têm não mais de 10 alterações, isto é, qualquer combinação de eliminações, inserções ou substituições, por 100 aminoáci- dos da sequência de referência.

[0034] Apesar de ser possível ter substituições de aminoácidos não conservadoras, é preferencial que as substituições sejam substituições de aminoácidos conservadoras, nas quais o aminoácido substituído tenha propriedades estruturais ou químicas similares com o ami- noácido correspondente na sequência de referência. A título de exemplo,substituições de aminoácidos conservadoras envolvem a substituição de um aminoácido alifático ou hidrofóbico, por exemplo, alanina, valina, leucina e isoleucina, com outro; substituição de um aminoácido contendo hidroxila, por exemplo, serina e treonina, com outro; substituição de um resíduo acidífero, por exemplo, ácido glutâmico ou ácido aspártico, com outro; substituição de um resíduo contendo amida, por exemplo, asparagina e glutamina, com outro; substituição de um resíduoaromático, por exemplo, fenilalanina e tirosina, com outro; substituição de um resíduo básico, por exemplo, lisina, arginina e histidina, com outro; e substituição de um aminoácido pequeno, por exemplo, alanina, serina, treonina, metionina, e glicina, com outro.

[0035] Inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões de terminal de amino e/ou de carboxila variando de comprimento a partir de um resíduo até polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequência de resíduos aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem a fusão ao término de N ou de C de uma sequência de aminoácidos a uma molécula repórter ou uma enzima.

[0036] De modo importante, as alterações nas variantes de se quências não abolem a funcionalidade da sequência de referência respectiva, no presente caso, por exemplo, a funcionalidade de uma sequência de um anticorpo, ou de um fragmento de ligação de antíge- no do mesmo, para se ligar ao mesmo epitopo e/ou para neutralizar de modo suficiente a infecção de lissavírus RABV e não RABV. Orientação na determinação de quais nucleotídeos e resíduos aminoácidos, respectivamente, podem ser substituídos, inseridos ou eliminados sem abolir a funcionalidade referida está disponível usando programas de computação de conhecimento geral na técnica.

[0037] Vários documentos são citados do início ao fim do texto desta especificação. Cada um dos documentos citados aqui, neste requerimento de patente, (incluindo todas as patentes, os requerimentos de patente, as publicações científicas, as especificações do fabricante, as instruções, etc.), quer acima ou abaixo, são por este incorporados por meio de referência em sua totalidade. Nada aqui, neste requerimento de patente, deve ser considerado como uma admissão de que a invenção não é intitulada a antedatar a descoberta referida em virtude de invenção anterior.

[0038] Deve ser entendido que esta invenção não é limitada à me todologia, aos protocolos e aos reagentes em particular descritos aqui, neste requerimento de patente, uma vez que estes podem variar. tam- bém deve ser entendido que a terminologia usada aqui, neste requerimento de patente, é para o fim de descrever modalidades particulares somente, e não se destina a limitar o âmbito da presente invenção a qual vai ser limitada somente pelas reivindicações anexadas. A menos que definido de modo diverso, todos os termos técnicos e científicos usados aqui, neste requerimento de patente, têm os mesmos significados conforme comumente entendido por uma pessoa com co-nhecimentoordinário da técnica.

[0039] A invenção se baseia, entre outros achados, na descoberta e no isolamento de anticorpos que são altamente potentes nas neutralização de lissavírus RABV e não RABV, bem como de sítios antigêni- cos e epitopos aos quais os anticorpos da invenção se ligam. Os anticorpos referidos são desejáveis, uma vez que são requeridas somente pequenas quantidades dos anticorpos | de modo a neutralizar a infecção pelos lissavírus por um único anticorpo. Cada único anticorpo de acordo com a presente invenção é altamente eficaz na prevenção bem como no tratamento ou na atenuação de infecção pelos lissavírus RABV e não RABV. Deste modo, são reduzidos os custos de produção de medicamentos compreendendo os anticorpos para o tratamento de infecção pelos lissavírus RABV e não RABV. Além do mais, os anticorpos de acordo com a presente invenção neutralizam não somente lissavírus RABV, mas também não RABV, os quais também causam raiva, em um modo potente e eficaz. A respeito do RABV os anticorpos de acordo com a presente invenção reconhecem amplas variações, as quais ocorrem naturalmente nos epitopos, deste modo evitando cepas de RABV resistentes. Além disso, os sítios antigênicos peptídicos ou polipeptídeos imunogênicos compreendendo epitopos reconhecidos pelos anticorpos da invenção podem ser um componente de uma vacina ou uma terapia de combinação capaz de induzir proteção contra os lissavírus RABV e não RABV (refletindo imunização ativa).

[0040] Em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo isolado, variantes de anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, que neutralizam a infecção pelos lissavírus por (i) lissavírus RABV e (ii) pelo menos 50 % dos não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV e WCBV, com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml.

[0041] Deste modo, “com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml” sig nifica que cada espécie neutralizada por um anticorpo da invenção é inibida pelo valor de IC50 acima.

[0042] “Pelo menos 50 % dos lissavírus não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV e WCBV” se refere a pelo menos 50 % das espécies do vírus Duvenhage (DUVV), do lissavírus do morcego europeu do tipo 1 (EBLV-1) e tipo 2 (EBLV-2), do lissavírus do morcego australiano (ABLV), do vírus Irkut (IRKV), do vírus Khujand (KHUV), do vírus Aravan (ARAV), do vírus do morcego de Lagos (LBV), do vírus Mokola (MOKV), do vírus do morcego de Shimoni (SHIV ou SHIBV), do lissavírus do morcego Bokeloh (BBLV), e do vírus do morcego Caucasiano do Oeste (WCBV), isto é, pelo menos 6 espécies entre as 12 espécies acima mencionadas.

[0043] De modo preferencial, o anticorpo isolado, as variantes de anticorpos e os fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, neutralizam a infecção pelo lissavírus por (i) lissavírus RABV e (ii) pelo menos 50 % dos não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV, WCBV e IKOV, com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml.

[0044] “Pelo menos 50 % dos lissavírus não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV, WCBV e IKOV” se refere a pelo menos 50 % das espécies do vírus Duvenhage (DUVV), do lissa- vírus do morcego europeu do tipo 1 (EBLV-1) e tipo 2 (EBLV-2), do lissavírus do morcego australiano (ABLV), do vírus Irkut (IRKV), do vírus Khujand (KHUV), do vírus Aravan (ARAV), do vírus do morcego de Lagos (LBV), do vírus Mokola (MOKV), do vírus do morcego de Shi- moni (SHIBV), do lissavírus do morcego Bokeloh (BBLV), do vírus do morcego Caucasiano do Oeste (WCBV) e do lissavírus Ikoma (IKOV) isto é, pelo menos 7 espécies entre as 13 espécies acima mencionadas.

[0045] Cada única espécie de lissavírus é considerada como sen do neutralizada com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml, sempre que pelo menos um isolado de qualquer espécie de lissavírus semelhante for neutralizado com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml. De modo preferencial, pelo menos dois isolados de qualquer uma das espécie de lissavírus semelhantes são neutralizados com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml.

[0046] De modo preferencial, a IC50 de menos de 10000 ng/ml é obtida com vírus infecciosos, isto é, em particular não com vírus de pseudotipos (pseudotyped viruses).

[0047] Portanto, os anticorpos, as variantes de anticorpos e os fra gmentos de ligação de antígeno dos mesmos, de acordo com a presente invenção são capazes de neutralizar um amplo espectro de lis- savírus.

[0048] De modo preferencial, o anticorpo isolado, as variantes de anticorpos e os fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos neutralizaminfecção pelo lissavírus de pelo menos 55 %, de modo mais preferencial pelo menos 60 %, de modo ainda mais preferencial pelo menos 65 %, de modo o mais preferencial pelo menos 68 % e de modo particularmente preferencial pelo menos 70 % dos lissavírus não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV e WCBV com uma IC50 abaixo de 10000 ng/ml.

[0049] De modo mais preferencial, o anticorpo isolado, as varian tes de anticorpos e os fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos neutralizam infecção pelo lissavírus de pelo menos 55 %, de modo mais preferencial pelo menos 60 %, de modo ainda mais preferencial pelo menos 65 %, de modo o mais preferencial pelo menos 68 % e de modo particularmente preferencial pelo menos 70 % dos lissavírus não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV, WCBV e IKOV com uma IC50 abaixo de 10000 ng/ml.

[0050] Além do mais, a presente invenção também proporciona um anticorpo isolado, variantes de anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, que neutralizam a infecção pelos lissavírus por (i) lissavírus RABV e (ii) pelo menos 50 % de todos os isolados de não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV- 1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV e WCBV, com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml. De modo preferencial, o anticorpo isolado, as variantes de anticorpos e os fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, neutralizam a infecção pelo lissaví- rus por (i) lissavírus RABV e (ii) pelo menos 50 % de todos os isolados de não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV, WCBV e IKOV, com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml.

[0051] Deste modo, “pelo menos 50 % dos isolados de lissavírus não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV- 1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV e WCBV” se refere a todos os isolados das 12 espécies acima considerados e “pelo menos 50 % de todos os isolados de lissavírus não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV, WCBV e IKOV” se refere a todos os isolados das 13 espécies acima considerados (isto é, todos os isolados considerados representam 100% e o número de isolados neutralizados com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml representa a percentagem respectiva). De modo preferencial, os primeiro 31 isolados que se seguem são considerados para refletir 100% dos isolados (cf. a Tabela 1, todos os isolados com exceção de IKOV), de modo mais preferencial todos os 32 isolados mostrados na Tabela 1 (incluindo IKOV) são considerados para refletir 100% dos iso-lados: Tabela 1: Isolados de lissavírus não RABV *mesmo isolado testado como pseudovírus e vírus infeccioso.

[0052] Uma descrição mais detalhada dos isolados de lissavírus não RABV mostrados na Tabela 1 (bem como de vários isolados de RABV) é mostrada na Figura 1. Isto inclui - além do nome do isolado, a espécie viral e o filogrupo (conforme mostrado na Tabela 1) - a espécie hospedeira, o país e o ano de origem, a linhagem e o número de acesso no GenBank da sequência de aminoácidos e/ou nucleotídeos da glicoproteína G daquele isolado, caso disponível (cf. a Figura 1).

[0053] Por conseguinte, se pelo menos 16 dos primeiros 31 isola dos specificados na Tabela 1 (isto é, todos os isolados com a exceção de IKOV) forem neutralizados pelo anticorpo, pela variante de anticorpo ou pelo fragmento de ligação de antígeno do mesmo, com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml, o anticorpo, a variante de anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo neutraliza infecção de pelo menos 50 % dos isolados de lissavírus não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV e WCBV, com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml. Além do mais, se pelo menos 16 dos 32 isolados specificados na Tabela 1 forem neutralizados pelo anticorpo, pela variante de anticorpo ou pelo fragmento de ligação de antígeno do mesmo, com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml, o anticorpo, a variante de anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo neutraliza infecção de pelo menos 50 % dos isolados de lissavírus não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV, WCBV e IKOV com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml.

[0054] De modo preferencial, o anticorpo isolado, as variantes de anticorpos e os fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos neu- tralizam infecção pelo lissavírus de pelo menos 55 %, de modo mais preferencial pelo menos 60 %, de modo ainda mais preferencial pelo menos 65 %, de modo o mais preferencial pelo menos 68 % e de modo particularmente preferencial pelo menos 70 % dos isolados dos lis- savírus não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV e WCBV com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml. De modo mais pre-ferencial, o anticorpo isolado, as variantes de anticorpos e os fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos neutralizam infecção pelo lis- savírus de pelo menos 55 %, de modo mais preferencial pelo menos 60 %, de modo ainda mais preferencial pelo menos 65 %, de modo o mais preferencial pelo menos 68 % e de modo particularmente preferencial pelo menos 70 % de todos os isolados dos lissavírus não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV, WCBV e IKOV com uma IC50 abaixo de 10000 ng/ml.

[0055] De modo preferencial, os primeiros 12 isolados menciona dos na Tabela 1 (isto é, de ABLV/Australia/bat/9810AUS- 1998/V1039-2011 a MOK/MOK) são testados como vírus infecciosos, ao passo que os outros isolados mencionados na Tabela 1 (istoé, de Vírus do morcego de Shimoni/SHIV até lissavírus Ikoma/IKOV) de modo preferencial são testados como vírus de pseudotipos. Deste modo, é preferencial considerar um isolado como neutralizando um determinado vírus para vírus infecciosos, se a IC50 for de menos de 10000 ng/ml e para vírus de pseudotipos, se a IC90 for de menos de 10000 ng/ml.

[0056] Portanto, em uma modalidade preferencial a presente in venção proporciona um anticorpo isolado, variantes de anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, que neutralizam a infecção pelos lissavírus por (i) lissavírus RABV e (ii) pelo menos 50 % de todos os isolados de não RABV selecionados entre o grupo que consiste em: vírus do morcego australiano ABLV/Australia/bat//9810AUS-1998/V1039-2011/ABLV, 98010/ABLV, Lissavírus do morcego Bokeloh 1301 /BBLV, vírus humano da África do Sul 86132SA /DUVV, DUVV/ SouthAfri- ca/human/96132SA-1971/ RS639-2012/DUVV, lissavírus do morcegofrancês EBLV1a/France/ bat/ 122938-2002/V3951 - 2009/EBLV-1, lissavírus do morcego francês EBLV1b/France/ bat/8918-1989/EBLV-1, lissavírus do morcego do Reino Unido EBLV2/UK/bat/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2, 94112/EBLV-2, 02053/EBLV-2, 8619/LBV, MOK/MOK, Vírus do morcego de Shimoni/SHIV, Vírus do morcego Caucasiano do Oeste/WCBV, lissavírus do morcego australiano/RV634/ABLV, Vírus Ara- van/ARAV, Vírus de Duvenhage RSA2006/DUVV, Vírus de Duve- nhage ZIM86-RV 131/DUVV, lissavírus do morcego europeu 1.RV20/EBLV-1, lissavírus do morcego europeu 1.RV9/EBLV-1, lissavírus do morcego francês EBLV 1a/France/bat/ 122938- 2002/V3951-2009/EBLV-1, lissavírus do morcego do Reino Unido EBLV2/ UK/bat/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2, lissavírus do morcego europeu 2.RV1787/EBLV-2, lissavírus do morcego europeu 2.RV628/EBLV-2, Vírus Irkut/IRKV, Vírus Khujand/KHUV, 8619/LBV, Vírus do morcego de Lagos NIG56-RV1/LBV, Vírus do morcego de Lagos SA2004/LBV, Vírus Mokola NIG68.RV4/MOK, Vírus Mokola 98/071 RA36/MOK e lissavírus Ikoma /IKOV com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml para o vírus do morcego australiano ABLV/Australia/bat//9810AUS-1998/V1039-2011/ABLV, 98010/ABLV, Lissavírus do morcego Bokeloh 1301 /BBLV, vírus humano da África do Sul 86132SA /DUVV, DUVV/ SouthAfri- ca/human/96132SA-1971/ RS639-2012/DUVV, lissavírus do morcegofrancês EBLV1a/France/ bat/ 122938-2002/V3951 - 2009/EBLV-1, lissavírus do morcego francês EBLV1b/France/ bat/8918-1989/EBLV-1, lissavírus do morcego do Reino Unido EBLV2/UK/bat/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2, 94112/EBLV-2, 02053/EBLV-2, 8619/LBV, MOK/MOK testados como vírus infecciosos e com uma IC90 de menos de 10000 ng/ml para o Vírus do morcego de Shimoni/SHIV, Vírus do morcego Caucasiano do Oes- te/WCBV, lissavírus do morcego australiano/RV634/ABLV, Vírus Aravan/ARAV, Vírus de Duvenhage RSA2006/DUVV, Vírus de Duvenhage ZIM86-RV 131/DUVV, lissavírus do morcego europeu 1.RV20/EBLV-1, lissavírus do morcego europeu 1.RV9/EBLV-1, lissavírus do morcego francês EBLV 1a/France/bat/ 122938-2002/V3951-2009/EBLV-1, lissavírus do morcego do Reino Unido EBLV2/ UK/bat/RV1332-2002/V3951- 2009/EBLV-2, lissavírus do morcego europeu 2.RV1787/EBLV-2, lissavírus do morcego europeu 2.RV628/EBLV-2, Vírus Irkut/IRKV, Vírus Khujand/KHUV, 8619/LBV, Vírus do morcego de Lagos NIG56-RV1/LBV, Vírus do morcego de Lagos SA2004/LBV, Vírus Mokola NIG68.RV4/MOK, Vírus Mokola 98/071 RA36/MOK e lissavírus Ikoma /IKOV testados como vírus de pseudotipos.

[0057] A descrição que segue da presente invenção, em particular todas as modalidades preferenciais e aspectos adicionais, se refere tanto ao anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que neutraliza a infecção pelos lissavírus por (i) lissavírus RABV e (ii) pelo menos 50 % dos não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV e WCBV, com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml conforme descrito acima (incluindo as modalidades preferenciais dos mesmos acima descritas) bem como ao anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que neutraliza a infecção pelos lissavírus por (i) lissavírus RABV e (ii) pelo menos 50 % de (todos os) isolados de não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV e WCBV, com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml conforme descrito acima (incluindo as modalidades preferenciais dos mesmos acima descritas).

[0058] De modo preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção se liga à proteína G (glicoproteína G) de RABV. De modo mais preferencial o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção se liga também à proteína G (glico- proteína G) de lissavírus não RABV.

[0059] O anticorpo, variante de anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção têm valores de IC50 muito baixos. Em particular, é muito improvável que os anticorpos com valores de IC50 de 10000 ng/ml ou mais sejam eficazes in vivo. Deste modo, os anticorpos de acordo com a presente invenção têm uma afinidade particular elevada ou forte por lissavírus RABV e não RABV e são portanto particularmente adequados para neutralizar e/ou pelo menos prevenir em parte uma infecção pelo lissavírus RABV e/ou não RABV e/ou efeitos adversos de uma infecção pelo lissavírus RABV e/ou não RABV.

[0060] De modo a determinar o valor de IC50 em um teste de neu tralização, podem ser usados pseudovírus e/ou vírus infecciosos. Os testes de neutralização respectivos são de conhecimento da pessoa versada na técnica. No entanto, de modo preferencial o teste de neu-tralização de acordo com Wright, E. et al., Vaccine 27, 7178-7186, 2009, o qual é incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente, é usado para avaliar pseudovírus (PV). Para vírus infecciosos de modo preferencial é usado o “teste de neutralização de vírus de anticorpos fluorescentes” (FAVN) de acordo com Cliquet, F., et al., J. Immunol Methods 212, 79-87, 1998., o qual é incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente, ou “o teste de inibição de foco fluorescente rápido” (RFFIT) de acordo com Smith, J. S., et al., Bull. World Health Organ. 48, 535-541, 1973, o qual também é incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente.

[0061] Em geral, um teste de neutralização tipicamente mede a perda de infectividade do vírus através da reação do vírus com anti-corpos específicos. Tipicamente, uma perda de infectividade é causada por interferência pelo anticorpo ligado com qualquer uma das etapas de replicação de vírus incluindo ligação a células alvo, entrada, e/ou liberação viral. A seguir é proporcionado um exemplo não limitan- te de um teste de neutralização para ilustrar o princípio: uma determinada quantidade de um vírus, por exemplo, 50 a 100 TCDID50 (50% da dose infecciosa de cultura de tecido), e diferentes concentrações dos anticorpos são misturadas sob condições apropriadas, por exemplo, por 1 hora em temperatura ambiente, e em seguida inoculados em uma cultura de células alvo apropriada, por exemplo, células Hep-2 ou células BHK-21 (células de rim de hamster bebê 21). Tipicamente os valores podem ser proporcionados por ml de cultura celular. A presença de vírus não neutralizado é detectada, por exemplo, depois de uma quantidade de tempo predeterminada, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 dias, medindo o efeito citopático do vírus (não neutralizado) sobre as células alvo, por exemplo, usando um teste colorimétrico para a quantificação da viabilidade celular, como, por exemplo, o reagente WST-1. Quanto mais células alvo são recuperadas de morte celular ou são medidas como sendo viáveis, mais vírus foi neutralizado pelos anticorpos. Os efeitos medidos são geralmente dependentes da dose: Quanto maior o título de anticorpos, mais células são recuperadas. Depen- dendo do caráter neutralizante do anticorpo, os valores de TCID50 variam, por exemplo, um anticorpo de significativo caráter neutralizante vai precisar que menores quantidades (do anticorpo) sejam adicionadas (de modo a, por exemplo, obter a mesma quantidade de células alvo “recuperadas” no teste, isto é, células medidas como sendo viáveis) do que outro anticorpo de caráter neutralizante menos acentuado.

[0062] De modo preferencial, para o anticorpo de acordo com a presente invenção o valor da IC50 (isto é, 50% de neutralização) em um teste de neutralização de vírus infeccioso conforme descrito acima é de menos de 10000 ng/ml, isto é, com relação a vírus infecciosos, ao passo que para o mesmo anticorpo o valor da IC90 (isto é, 90% de neu-tralização) em um teste de neutralização de pseudovírus conforme descrito acima é de menos de 10000 ng/ml, isto é, em relação a pseu- dovírus.

[0063] Além do mais, é preferencial que o anticorpo, ou o fragmen to de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção neutralize a infecção pelos lissavírus por pelo menos 70 % dos lissavírus do filogrupo I não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, e ARAV, com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml. Deste modo, “pelo menos 70%” das espécies acima mencionadas significa pelo menos 5 das 7 espécies. A infecção de uma espécie de lissavírus é considerada como neutralizada com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml, se a infecção de pelo menos um isolado desta espécie de lissavírus for neutralizada com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml. De modo preferencial, o anticorpo isolado, as variantes de anticorpos e os fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos neutralizam infecção pelo lissavírus por pelo menos 70% dos lissavírus do filogrupo I não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV e BBLV com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml. Deste modo, “pelo menos 70 %” das espécies acima mencionadas significa pelo menos 6 das 8 espécies. A infecção de uma espécie de lissavírus é considerada como neutralizada com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml, se a infecção de pelo menos um isolado desta espécie de lissavírus for neutralizada com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml.

[0064] De modo preferencial, o anticorpo isolado, as variantes de anticorpos e os fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos neu-tralizaminfecção pelo lissavírus de pelo menos 75%, de modo mais preferencial pelo menos 80%, de modo ainda mais preferencial pelo menos 82%, dos lissavírus não RABV do filogrupo I selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, e ARAV, com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml. De modo mais preferencial, o anticorpo isolado, as variantes de anticorpos e os fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos neutralizam infecção pelo lissavírus de pelo menos 75%, de modo mais preferencial pelo menos 80 %, de modo ainda mais preferencial pelo menos 82%, dos lissavírus não RABV do filogrupo I selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV e BBLV com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml.

[0065] De acordo com outra modalidade preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção neutraliza a infecção pelos lissavírus por pelo menos 70% dos isolados de lissavírus não RABV do filogrupo I selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, e ARAV, com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml. Deste modo, “pelo menos 70% dos isolados de lissavírus não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, e ARAV” se refere a todos os isolados das 7 espécies acima consideradas (isto é, todos os isolados considerados representam 100% e o número de isolados neutralizados com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml representa a percentagem respectiva). De modo mais preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção neutraliza a infecção pelos lissavírus por pelo menos 70% dos isolados de lissavírus não RABV do filogrupo I selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV e BBLV com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml. Deste modo, “pelo menos 70 % dos isolados de lissavírus não RABV selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV ARAV e BBLV” se refere a todos os isolados das 8 espécies acima consideradas (isto é, todos os isolados considerados representam 100% e o número de isolados neutralizados com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml representa a percentagem respectiva). De modo preferencial, os 22 isolados mencionados na Tabela 1 referentes às espécies do filogrupo I são considerados para calcular a percentagem. Por conseguinte, se pelo menos 16 destes 22 isolados mencionados na Tabela 1 referentesàs espécies do filogrupo I forem neutralizados pelo anticorpo, pela variante de anticorpo ou pelo fragmento de ligação de antígeno do mesmo, com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml, o anticorpo, a variante de anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo neutraliza infecção de pelo menos 70% dos isolados de lissavírus não RABV do filogrupo I selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV e, de modo preferencial BBLV, com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml. De modo preferencial, o anticorpo isolado, as variantes de anticorpos e os fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos neutralizam infecção pelo lis- savírus de pelo menos 75%, de modo mais preferencial pelo menos 80 %, de modo ainda mais preferencial pelo menos 82 %, dos isolados dos lissavírus não RABV do filogrupo I selecionados entre o grupo que consiste em DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV e, de modo preferencial, BBLV com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml.

[0066] É particularmente preferencial que o anticorpo isolado, as variantes de anticorpos e os fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, de acordo com a presente invenção neutralizem a infecção pelos lissavírus por pelo menos 70 % dos isolados de lissavírus do fi- logrupo I não RABV selecionados entre o grupo que consiste em: vírus do morcego australiano ABLV/Australia/bat//9810AUS-1998/V1039- 2011/ABLV, 98010/ABLV, Lissavírus do morcego Bokeloh 1301 /BBLV, vírus humano da África do Sul 86132SA /DUVV, DUVV/ SouthAfrica/human/96132SA-1971/ RS639-2012/DUVV, lissavírus do morcego francês EBLV1a/France/ bat/ 122938-2002/V3951 - 2009/EBLV-1, lissavírus do morcego francês EBLV1b/France/ bat/8918-1989/EBLV-1, lissavírus do morcego do Reino Unido EBLV2/UK/bat/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2, 94112/EBLV-2, 02053/EBLV-2, lissavírus do morcego australiano/RV634/ABLV, Vírus Aravan/ARAV, Vírus de Duvenhage RSA2006/DUVV, Vírus de Duvenhage ZIM86-RV 131/DUVV, lissavírus do morcego europeu 1.RV20/EBLV-1, lissavírus do morcego europeu 1.RV9/EBLV-1, lissavírus do morcego francês EBLV 1a/France/bat/ 122938-2002/V3951-2009/EBLV-1, lissavírus do morcego do Reino Unido EBLV2/ UK/bat/RV1332-2002/V3951- 2009/EBLV-2, lissavírus do morcego europeu 2.RV1787/EBLV-2 e lissavírus do morcego europeu 2.RV628/EBLV-2, Vírus Irkut/IRKV, Vírus Khujand/KHUV, com uma IC50 de menos de 10000 ng/ml para o vírus do morcego australiano ABLV/Australia/bat//9810AUS-1998/V1039-2011/ABLV, 98010/ABLV, Lissavírus do morcego Bokeloh 1301 /BBLV, vírus humano da África do Sul 86132SA /DUVV, DUVV/ SouthAfri- ca/human/96132SA-1971/ RS639-2012/DUVV, lissavírus do mor-cegofrancês EBLV1a/France/ bat/ 122938-2002/V3951 - 2009/EBLV-1, lissavírus do morcego francês EBLV1b/France/ bat/8918-1989/EBLV-1, lissavírus do morcego do Reino Unido EBLV2/UK/bat/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2, 94112/EBLV-2 e 02053/EBLV-2, testados como vírus infecciosos e com uma IC90 de menos de 10000 ng/ml para o lissavírus do morcego australia- no/RV634/ABLV, Vírus Aravan/ARAV, Vírus de Duvenhage RSA2006/DUVV, Vírus de Duvenhage ZIM86-RV 131/DUVV, lis- savírus do morcego europeu 1.RV20/EBLV-1, lissavírus do morcego europeu 1.RV9/EBLV-1, lissavírus do morcego francês EBLV 1a/France/bat/ 122938-2002/V3951-2009/EBLV-1, lissavírus do morcego do Reino Unido EBLV2/ UK/bat/RV1332-2002/V3951- 2009/EBLV-2, lissavírus do morcego europeu 2.RV1787/EBLV-2, lissavírus do morcego europeu 2.RV628/EBLV-2, Vírus Irkut/IRKV e Vírus Khujand/KHUV testados como vírus de pseu- dotipos.

[0067] Entre os lissavírus, e em particular os lissavírus do filogrupo I, é particularmente preferencial que o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção neutralize infecção de EBLV-1. Em particular, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção neutraliza infecção de pelo menos um isolado de EBLV-1, de modo mais preferencial de pelo menos dois, de modo ainda mais preferencial de pelo menos três isolados de EBLV-1, por exemplo, os isolados de EBLV-1 mencionados na Tabela 1, com uma IC50 abaixo de 10000 ng/ml. Deste modo, é particularmente preferencial se o um ou mais isolados de EBLV-1 forem neutralizados tanto em um teste de neutralização de pseudovírus conforme descrito acima quanto em um teste de neutralização de vírus infeccioso conforme descrito acima. De modo ainda mais preferencial, o valor da IC50 no teste de neutralização de vírus infeccioso é abaixo de 10000 ng/ml e o valor da IC90 no teste de neutralização de pseudovírus é abaixo de 10000 ng/ml.

[0068] Digno de nota, nenhum dos anticorpos monoclonais huma nos da técnica anterior CR57, CR4098 e RAB1 neutraliza EBLV-1 (cf. as Figuras 5 e 6). No entanto, a raiva devida ao Lissavírus do morcego europeu do tipo 1 está presente em mitos países da Europa e os mor-cegosestão listados como espécies protegidas através da Europa. A doença é fatal em seres humanos e foi descrita na Europa depois de uma mordida de morcego. Recomenda-se vacinação pré-exposição e tratamento pós-exposição à raiva para pessoas com exposição ocupa- cional e também se recomenda o tratamento de viajantes internacionais depois de mordidas de morcego (Stantic-Pavlinic M. (2005) Euro-surveillance, Volume 10, Issue 11), no entanto, conforme mostrado nas Figuras 5 e 6, a HRIG dificilmente neutraliza o EBLV-1. Portanto, existe uma necessidade de anticorpos (humanos) neutralizantes do EBLV-1.

[0069] Além disso é preferencial que o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção neutralize infecção pelo RABV CVS-11 com uma IC90 de 400 ng/ml ou menos, de modo mais preferencial com uma IC90 de 100 ng/ml ou menos, de modo ainda mais preferencial com uma IC90 de 50 ng/ml ou menos e de modo particularmente preferencial com uma IC90 de 1 ng/ml ou menos. Em outras palavras, a concentração do anticorpo, ou do fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção requerida para 90% de neutralização (IC90) do isolado de RABV CVS-11 (cepa do vírus de estímulo 11 (challenge virus strain 11)) é de 400 ng/ml ou menos, de modo preferencial de 100 ng/ml ou menos, de modo mais preferencial de 50 ng/ml ou menos, de modo ainda mais preferencial de 1 ng/ml ou menos, em particular em um tes te de neutralização de pseudovírus conforme descrito acima, e de modo preferencial também em um teste de neutralização de vírus infeccioso RFFIT conforme descrito acima.

[0070] Em geral, é preferencial que o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção seja um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em contraste com os anticorpos policlonais, os anticorpos monoclonais são anticorpos monoespecíficos, isto é, eles se ligam a um epitopo específico. Portanto, a ligação inesperada é largamente evitada e os anticorpos monoclonais são considerados como mais seguros comparados com os anticorpos policlonais.

[0071] De modo preferencial, o anticorpo de acordo com a presen te invenção, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, é um anticorpo humano, um anticorpo monoclonal, um anticorpo monoclonal humano, um anticorpo purificado, um anticorpo de cadeia única, Fab, Fab’, F(ab')2, Fv ou scFv.

[0072] Deste modo, os anticorpos da invenção podem ser anticor pos humanos, anticorpos monoclonais, anticorpos monoclonais humanos, anticorpos recombinantes ou anticorpos purificados. A invenção também proporciona fragmentos dos anticorpos da invenção, particularmente fragmentos que conservam a atividade de ligação de antíge- no dos anticorpos. Os fragmentos referidos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos de cadeia única, Fab, Fab’, F(ab')2, Fv ou scFv. Embora a especificação, incluindo as reivindicações, possa, em alguns locais, se referir explicitamente a um ou mais fragmentos de ligação de antígeno, um ou mais fragmentos de anticorpos, uma ou mais variantes e/ou um ou mais derivados de anticorpos, deve ser entendido que o termo “anticorpo” ou “anticorpo da invenção” inclui todas as categorias de anticorpos, a saber, um ou mais fragmentos de ligação de antí- geno, um ou mais fragmentos de anticorpos, uma ou mais variantes e um ou mais derivados de anticorpos.

[0073] Os fragmentos dos anticorpos da invenção podem ser obti dos a partir dos anticorpos por meio de métodos que incluem digestão com enzimas, tais como pepsina ou papaína, e/ou por clivagem de li-gações de dissulfeto por redução química. Alternativamente, os frag-mentos dos anticorpos podem ser obtidos por clonagem e expressão de parte das sequências das cadeias pesadas ou leves. “Fragmentos” de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab’, F(ab')2 e Fv. A invenção também engloba fragmentos Fv de cadeia única (scFv) derivados a partir das cadeias pesadas e leves de um anticorpo da invenção. Por exemplo, a invenção inclui um scFv compreendendo as CDRs de um anticorpo da invenção. Também são incluídos monômeros e dímeros de cadeia pesada ou leve, anticorpos de cadeia pesada de domínio único, anticorpos de cadeia leve de domínio único, bem como anticorpos de cadeia única, por exemplo, Fv de cadeia única no qual os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves são unidos por um enca- deador de peptídeos.

[0074] Os fragmentos de anticorpos da invenção podem transmitir interações monovalentes ou multivalentes e estar contidos em uma variedade de estruturas conforme descrito acima. Por exemplo, molé-culas de scFv podem ser sintetizadas para criar um “triabody” trivalente ou um “tetrabody” tetravalente. As moléculas de scFv podem incluir um domínio da região de Fc resultando em minibodies bivalentes. Além disso, as sequências da invenção podem ser um componente das moléculas multiespecíficas nas quais as sequências da invenção têm por alvo os epitopos da invenção e outras regiões da molécula se ligam a outros alvos. Moléculas de exemplo incluem, mas não estão limitadas a, Fab2 biespecíficos, Fab3 tri-específicos, scFv biespecífi- cos, e diabodies (Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136).

[0075] Em geral, o anticorpo de acordo com a presente invenção, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de modo preferencial compreende (pelo menos) três CDRs sobre a cadeia pesada e (pelo menos) três CDRs sobre a cadeia leve. Em geral, regiões determinantes de complementaridade (CDRs) são as regiões hipervariáveis presentes em domínios variáveis de cadeia pesada e em domínios variáveis de cadeia leve. Tipicamente, as CDRs de uma cadeia pesada e a cadeia leve conectada de um anticorpo juntas formam o receptor de antígeno. De modo geral, as três CDRs (CDR1, CDR2, e CDR3) são arranjadas não consecutivamente no domínio variável. Como os receptores de antígeno são tipicamente compostos de dois domínios variáveis (sobre duas cadeias de polipeptídeos diferentes, isto é, cadeia pesada e leve), existem seis CDRs para cada receptor de antígeno (cadeia pesada: CDRH1, CDRH2, e CDRH3; cadeia leve: CDRL1, CDRL2, e CDRL3). Uma única molécula de anticorpo geralmente tem dois receptores de antígeno e portanto contém doze CDRs. As CDRs sobre a cadeia pesada e/ou leve podem ser separadas por regiões de framework, por meio do quê uma região de framework (FR) é uma região no domínio variável a qual é menos “variável” do que a CDR. Por exemplo, uma cadeia (ou cada cadeia, respectivamente) pode ser composta de quatro regiões de framework, separadas por três CDR.

[0076] De modo preferencial, as CDRs, em particular CDRH3, do anticorpo de acordo com a presente invenção são derivadas a partir de um anticorpo desenvolvido em um ser humano. Em particular, as CDRs, em particular a CDRH3, do anticorpo de acordo com a presente invenção são de origem humana ou variantes de sequências funcionais da mesma.

[0077] Foram determinadas as sequências das cadeias pesadas e leves de vários anticorpos da invenção, cada uma compreendendo três CDRs sobre a cadeia pesada e três CDRs sobre a cadeia leve. A posição dos aminoácidos das CDRs são definidas de acordo com o sistema de numeração IMGT (IMGT: http://www.imgt.org/; cf. Lefranc, M.-P. et al. (2009) Nucleic Acids Res. 37, D1006-D1012). As sequências das CDRs, cadeias pesadas, cadeias leves bem como as sequências das moléculas de ácido nucleico codificando as CDRs, cadeias pesadas, cadeias leves dos anticorpos da invenção, isto é, de vários anticorpos de acordo com a invenção, são reveladas na listagem de sequências. As CDRs das cadeias pesadas do anticorpo também são referidas como CDRH1, CDRH2 e CDRH3, respectivamente. De modo similar, as CDRs das cadeias leves do anticorpo também são referidas como CDRL1, CDRL2 e CDRL3, respectivamente.

[0078] De modo preferencial, o anticorpo de acordo com a presen te invenção, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, com-preende uma cadeia pesada compreendendo CDRH1, CDRH2 e CDRH3 e uma cadeia leve compreendendo CDRL1, CDRL2 e CDRL3, em que a CDRH3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica às SEQ ID NOs: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, ou 203, por meio do quê sequências de aminoácidos que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às SEQ ID NOs: 95 ou 167 são particularmente preferenciais. De modo mais preferencial, a CDRH3 de cadeia pesada do anticorpo, ou do fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, ou 203, de modo mais preferencial de SEQ ID NOs: 95 ou 167. Em termos mais gerais, a presente invenção também compreende um anticorpo, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma cadeia pesada compreendendo CDRH1, CDRH2 e CDRH3 e uma cadeia leve compreendendo CDRL1, CDRL2 e CDRL3, em que a CDRH3 de cadeia pesada compreende uma vari- ante da sequência de aminoácidos idêntica às SEQ ID NOs: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, ou 203, por meio do quê variantes das sequências de aminoácidos idênticas às SEQ ID NOs: 95 ou 167 são particularmente preferenciais. De modo mais preferencial a cadeia pesada compreende pelo menos duas CDRH3 com uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica à SEQ ID NO: 95 e uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica à SEQ ID NO: 167. As variantes de se-quências referidas acima são em particular variantes de sequências funcionais, por exemplo, em que a ligação do anticorpo à proteína G (glicoproteína G) do RABV (e não RABV) é mantida.

[0079] Além disso é preferencial que, o anticorpo isolado da inven ção, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreenda uma cadeia pesada compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 e uma cadeia leve compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3, em que a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica às SEQ ID NOs: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, ou 203, de modo preferencial às SEQ ID NOs: 95 ou 167. De modo mais preferencial a cadeia pesada compreende pelo menos duas CDRH3 com uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 e uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 167. As variantes de sequências referidas acima são em particular variantes de sequências funcionais, por exemplo, em que a ligação do anticorpo à proteína G (glicoproteína G) do RABV (e não RABV) é mantida.

[0080] A Tabela 2 proporciona os números de SEQ ID para as se- quências de aminoácidos das seis CDRs das cadeias pesadas e leves, respectivamente, de anticorpos de exemplo da invenção. Tabela 2. Números de SEQ ID para Polipeptídeos de CDR de anticorpos de exemplo da invenção.

[0081] Anticorpos variantes também são incluídos dentro do âmbi to da invenção. Deste modo, variantes das sequências mencionadas no requerimento também são incluídas dentro do âmbito da invenção. As variantes referidas aqui, neste requerimento de patente, são em particular funcionais, por exemplo, em que a ligação do anticorpo à proteína G (glicoproteína G) do RABV (e não RABV) é mantida. As va-riantes incluem variantes naturais geradas por mutação somática in vivo durante a resposta imune ou in vitro depois de cultura de clones de células B imortalizadas. Alternativamente, variantes podem surgir devido à degeneração do código genético ou podem ser produzidas devido a erros na transcrição ou na translação.

[0082] Variantes adicionais das sequências de anticorpos as quais têm aprimorada afinidade e/ou potência podem ser obtidas usando métodos conhecidos na técnica e são incluídas dentro do âmbito da invenção. Por exemplo, substituições de aminoácidos podem ser usa- das para obter anticorpos com afinidade ainda mais aprimorada. Alter-nativamente,otimização de códons da sequência de nucleotídeos pode ser usada para aprimorar a eficiência de translação em sistemas de expressão para a produção do anticorpo. Além disso, polinucleotídeos compreendendo uma sequência otimizada para especificidade de anti-corpo ou atividade de neutralização por meio da aplicação de um método de evolução direcionado para qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos da invenção também estão dentro do âmbito da invenção.

[0083] De modo preferencial, sequências de anticorpos variantes podem compartilhar 70% ou mais (isto é, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) identidade de sequência de aminoácidos com as sequências mencionadas no requerimento. As variantes referidas geralmente têm uma maior homologia com as se-quências listadas aqui, neste requerimento de patente, nas CDRs da região variável de cadeia pesada (VH) e da região variável de cadeia leve (VL) do que na região de framework. Conforme é de conhecimento de uma pessoa versada na técnica, mutações são mais toleradas, isto é, função limitada ou sem perda de função (por exemplo, especificidade ou capacidade de neutralização) nas regiões de framework do que nas CDRs.

[0084] A invenção portanto compreende um anticorpo, ou um fra gmento de ligação de antígeno do mesmo, em que a variação das se-quências proporcionadas aqui, neste requerimento de patente, de modo preferencial é na uma ou mais regiões de framework do anticorpo ou nos resíduos de ácidos nucleicos que codificam a uma ou mais regiões framework do anticorpo.

[0085] Na presente invenção, os anticorpos (variantes) referidos são preferenciais, nos quais o número de mutações somáticas é reduzido (isto é, anticorpos “germlined”: revertidos de volta para configura- ção da “linhagem germinativa”). As sequências da linhagem germinati- va de anticorpos podem ser determinadas, por exemplo, com referência ao banco de dados da IMGT (por exemplo, de acordo com as atribuições da IMGT VDJ e VJ e a interpretação de reorganização: http://www.imgt.org/; cf. Lefranc, M.-P. et al. (2009) Nucleic Acids Res. 37, D1006-D1012) e variantes de anticorpos “germlined” podem ser produzidas, por exemplo, por síntese genética ou por mutagênese di-recionada a sítio (site-directed mutagenesis). Um baixo nível de muta-ções somáticas reduz o risco potencial de imunogenicidade do anticorpo. De modo preferencial, o número de mutações somáticas é reduzido nas regiões de framework (FR) (isto é, anticorpos “germlined de regiões de framework”, também referidas aqui, neste requerimento de patente, como variantes FR-GL). Anticorpos (variantes), ou um fragmento de ligação de antígeno dos mesmos, e variantes FR-GL, respectivamente, sem quaisquer mutações somáticas nas regiões de framework (FR) são mais preferenciais. São particularmente preferenciais os anticorpos (variantes) referidos, ou um fragmento de ligação de an- tígeno dos mesmos, e variantes FR-GL, respectivamente, com tão poucas mutações somáticas quanto possível, por meio do quê por ou- to lado a atividade de neutralização não é prejudicada (em comparação com o anticorpo de referência / fragmento contendo (mais) mutações somáticas). Os anticorpos referidos por um lado não são prejudicados em suas atividades de neutralização, deste modo apresentando uma potência e uma amplitude muito elevadas. Por outro lado, um potencial risco de imunogenicidade do anticorpo é significativamente reduzido.

[0086] Em uma modalidade preferencial, o anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo da invenção compreende pelo menos uma CDR com uma sequência que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 7, 19 a 25, 37 a 43, 55 a 61, 75 a 81, 93 a 99, 111 a 117, 129 a 135, 147 a 153, 165 a 171, 183 a 189, ou 201 a 207. As sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos da invenção bem como as sequências de ácidos nucleicos que codificam os mesmossão proporcionadas na Tabela de Sequências e nos Números de SEQ ID abaixo. Os resíduos aminoácidos correspondentes às seis CDRs e os resíduos de ácidos nucleicos que codificam os mesmos são salientados em texto em negrito.

[0087] De modo preferencial, um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção compreende mais de uma CDR com uma sequência que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 7, 19 a 25, 37 a 43, 55 a 61, 75 a 81, 93 a 99, 111 a 117, 129 a 135, 147 a 153, 165 a 171, 183 a 189, e 201 a 207.

[0088] De modo preferencial, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreende duas CDRs com uma sequência que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 7, 19 a 25, 37 a 43, 55 a 61, 75 a 81, 93 a 99, 111 a 117, 129 a 135, 147 a 153, 165 a 171, 183 a 189, ou 201 a 207. Deste modo é preferencial que o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreenda (i) uma CDRH1 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 19, 37, 55, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183 ou 201 e uma CDRL1 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 22, 40, 58, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186, ou 204; (ii) uma CDRH2 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 20, 38, 56, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184, ou 202, e uma CDRL2 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 79, 80, 97, 98, 115, 116, 133, 134, 151, 152, 169, 170, 187, 188, 205, ou 206; ou (iii) uma CDRH3 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, ou 203, e uma CDRL3 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 25, 43, 61, 81, 99, 117, 135, 153, 171, 189, ou 201.

[0089] De modo preferencial, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreende três CDRs com uma sequência que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 7, 19 a 25, 37 a 43, 55 a 61, 75 a 81, 93 a 99, 111 a 117, 129 a 135, 147 a 153, 165 a 171, 183 a 189, e 201 a 207. Deste modo é preferencial que o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreenda (i) uma CDRH1 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 19, 37, 55, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183 ou 201, uma CDRH2 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 20, 38, 56, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184, ou 202, e uma CDRH3 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, ou 203; ou (ii) uma CDRL1 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 22, 40, 58, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186, ou 204, uma CDRL2 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 79, 80, 97, 98, 115, 116, 133, 134, 151, 152, 169, 170, 187, 188, 205, ou 206, e uma CDRL3 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 25, 43, 61, 81, 99, 117, 135, 153, 171, 189, ou 201.

[0090] De modo preferencial, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreende quatro CDRs com uma sequên- cia que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 7, 19 a 25, 37 a 43, 55 a 61, 75 a 81, 93 a 99, 111 a 117, 129 a 135, 147 a 153, 165 a 171, 183 a 189, e 201 a 207. Deste modo é preferencial que o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreenda (i) uma CDRH1 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 19, 37, 55, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183 ou 201, uma CDRH2 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 20, 38, 56, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184, ou 202, uma CDRH3 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, ou 203, e uma CDRL que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 6, 20 a 22, 36 a 38, ou 52 a 54; (ii) uma CDRL1 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 22, 40, 58, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186, ou 204, uma CDRL2 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 79, 80, 97, 98, 115, 116, 133, 134, 151, 152, 169, 170, 187, 188, 205, ou 206, uma CDRL3 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 25, 43, 61, 81, 99, 117, 135, 153, 171, 189, ou 201, e uma CDRH que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3, 19 a 21, 37 a 39, 55 a 57, 75 a 77, 93 a 95, 111 a 113, 129 a 131, 147 a 149, 165 a 167, 183 a 185 ou 201 a 203, por meio do quê uma CDRH3 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, ou 203 é particularmente preferencial; (iii) uma CDRH1 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 19, 37, 55, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183 ou 201, uma CDRL1 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 22, 40, 58, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186, ou 204, uma CDRH2 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 20, 38, 56, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184, ou 202, e uma CDRL2 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 79, 80, 97, 98, 115, 116, 133, 134, 151, 152, 169, 170, 187, 188, 205, ou 206; (iv) uma CDRH1 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 19, 37, 55, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183 ou 201, uma CDRL1 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 22, 40, 58, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186, ou 204, uma CDRH3 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, ou 203, e uma CDRL3 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 25, 43, 61, 81, 99, 117, 135, 153, 171, 189, ou 201; ou (v) uma CDRH2 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 20, 38, 56, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184, ou 202, uma CDRL2 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 79, 80, 97, 98, 115, 116, 133, 134, 151, 152, 169, 170, 187, 188, 205, ou 206, uma CDRH3 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, ou 203, e uma CDRL3 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 25, 43, 61, 81, 99, 117, 135, 153, 171, 189, ou 201.

[0091] De modo preferencial, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreende cinco CDRs com uma sequência que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 7, 19 a 25, 37 a 43, 55 a 61, 75 a 81, 93 a 99, 111 a 117, 129 a 135, 147 a 153, 165 a 171, 183 a 189, e 201 a 207. Deste modo é preferencial que o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreenda cinco CDRs selecionadas entre o grupo de uma CDRH1 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 19, 37, 55, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183 ou 201, uma CDRH2 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 20, 38, 56, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184, ou 202, uma CDRH3 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, ou 203, uma CDRL1 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 22, 40, 58, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186, ou 204, uma CDRL2 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 79, 80, 97, 98, 115, 116, 133, 134, 151, 152, 169, 170, 187, 188, 205, ou 206, e uma CDRL3 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 25, 43, 61, 81, 99, 117, 135, 153, 171, 189, ou 201.

[0092] De modo preferencial, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreende seis CDRs com uma sequência que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 7, 19 a 25, 37 a 43, 55 a 61, 75 a 81, 93 a 99, 111 a 117, 129 a 135, 147 a 153, 165 a 171, 183 a 189, e 201 a 207. Deste modo é preferencial que o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreenda seis CDRs selecionadas entre o grupo de uma CDRH1 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 19, 37, 55, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183 ou 201, uma CDRH2 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 20, 38, 56, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184, ou 202, uma CDRH3 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, ou 203, uma CDRL1 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 22, 40, 58, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186, ou 204, uma CDRL2 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 79, 80, 97, 98, 115, 116, 133, 134, 151, 152, 169, 170, 187, 188, 205, ou 206, e uma CDRL3 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 25, 43, 61, 81, 99, 117, 135, 153, 171, 189, ou 201. De modo mais preferencial, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreende: (i) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 a 5 e 7 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 a 4 e 6 a 7, respectivamente; (ii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de amino- ácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19 a 23 e 25 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19 a 22 e 24 a 25, respectivamente; (iii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 37 a 41 e 43 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 37 a 40 e 42 a 43, respectivamente; (iv) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 55 a 59 e 61 ou às sequências de ami- noácidos de SEQ ID NOs: 55 a 58 e 60 a 61, respectivamente; (v) se-quências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 75 a 79 e 81 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 75 a 78 e 80 a 81, respectivamente; (vi) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 97 e 99 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 96 e 98 a 99, respectivamente; (vii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 111 a 115 e 117 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 111 a 114 e 116 a 117, respectivamente; (viii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 129 a 133 e 135 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 129 a 132 e 134 a 135, respectivamente; (ix) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 147 a 151 e 153 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 147 a 150 e 152 a 153, respectivamente; (x) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 169 e 171 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 168 e 170 a 171, respectivamente; (xi) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 183 a 187 e 189 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 183 a 186 e 188 a 189, respectivamente; ou (xii) sequências de ami- noácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 201 a 205 e 207 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 201 a 204 e 206 a 207, respectivamente.

[0093] Em uma modalidade particularmente preferencial o anticor po isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a invenção compreende sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 97 e 99 ou às sequências de ami- noácidos de SEQ ID NOs: 93 a 96 e 98 a 99, respectivamente.

[0094] Em outra modalidade particularmente preferencial o anti corpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a invenção compreende sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de amino- ácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 169 e 171 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 168 e 170 a 171, respectivamente.

[0095] De modo ainda mais preferencial, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a invenção compreende: (i) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve conforme estipulado nas SEQ ID NOs: 1 a 5 e 7 ou nas SEQ ID NOs: 1 a 4 e 6 a 7, respectivamente; (ii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve conforme estipulado nas SEQ ID NOs: 19 a 23 e 25 ou nas SEQ ID NOs: 19 a 22 e 24 a 25, respectivamente; (iii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve conforme estipulado nas SEQ ID NOs: 37 a 41 e 43 ou nas SEQ ID NOs: 37 a 40 e 42 a 43, respectivamente; (iv) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de amino- ácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve conforme estipulado nas SEQ ID NOs: 55 a 59 e 61 ou nas SEQ ID NOs: 55 a 58 e 60 a 61, respectivamente; (v) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve conforme estipulado nas SEQ ID NOs: 75 a 79 e 81 ou nas SEQ ID NOs: 75 a 78 e 80 a 81, respectivamente; (vi) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve conforme estipulado nas SEQ ID NOs: 93 a 97 e 99 ou nas SEQ ID NOs: 93 a 96 e 98 a 99, respectivamente; (vii) se-quências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve conforme estipulado nas SEQ ID NOs: 111 a 115 e 117 ou nas SEQ ID NOs: 111 a 114 e 116 a 117, respectivamente; (viii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve conforme estipulado nas SEQ ID NOs: 129 a 133 e 135 ou nas SEQ ID NOs: 129 a 132 e 134 a 135, respectivamente; (ix) sequências de ami- noácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve conforme estipulado nas SEQ ID NOs: 147 a 151 e 153 ou nas SEQ ID NOs: 147 a 150 e 152 a 153, respectivamente; (x) sequências de aminoáci- dos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve conforme esti-pulado nas SEQ ID NOs: 165 a 169 e 171 ou nas SEQ ID NOs: 165 a 168 e 170 a 171, respectivamente; (xi) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de amino- ácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve conforme estipulado nas SEQ ID NOs: 183 a 187 e 189 ou nas SEQ ID NOs: 183 a 186 e 188 a 189, respectivamente; ou (xii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de amino- ácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve conforme estipulado nas SEQ ID NOs: 201 a 205 e 207 ou nas SEQ ID NOs: 201 a 204 e 206 a 207, respectivamente.

[0096] Entre as modalidades descritas acima do anticorpo, ou do fragmento de ligação de antígeno do mesmo, da invenção tendo pelo menos uma CDR, isto é, uma, duas, três, quatro, cinco, seis CDRs conforme descrito acima, é preferencial uma modalidade referida do anticorpo, ou do fragmento de ligação de antígeno do mesmo, a qual compreende uma CDRH3 que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, ou 203.

[0097] Além disso é preferencial que, o anticorpo isolado ou frag mento de ligação de antígeno da invenção compreenda uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1, 19, 37, 55, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183 ou 201 ou variantes de sequência das mesmas; uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 20, 38, 56, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184, ou 202 ou variantes de sequência das mesmas; e uma CDR3 de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, ou 203 ou variantes de sequência das mesmas. Em determinadas modalidades, um anticorpo ou fragmento de anticorpo conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente, compreende uma cadeia pesada com-preendendo a sequência de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 1 para CDRH1, SEQ ID NO: 2 para CDRH2 e SEQ ID NO: 3 para CDRH3, (ii) SEQ ID NO: 19 para CDRH1, SEQ ID NO: 20 para CDRH2, e SEQ ID NO: 21 para CDRH3, (iii) SEQ ID NO: 37 para CDRH1, SEQ ID NO: 38 para CDRH2, e SEQ ID NO: 39 para CDRH3, (iv) SEQ ID NO: 55 para CDRH1, SEQ ID NO: 56 para CDRH2, e SEQ ID NO: 57 para CDRH3; (v) SEQ ID NO: 75 para CDRH1, SEQ ID NO: 76 para CDRH2, e SEQ ID NO: 77 para CDRH3; (vi) SEQ ID NO: 93 para CDRH1, SEQ ID NO: 94 para CDRH2, e SEQ ID NO: 95 para CDRH3; (vii) SEQ ID NO: 111 para CDRH1, SEQ ID NO: 112 para CDRH2, e SEQ ID NO: 113 para CDRH3; (viii) SEQ ID NO: 129 para CDRH1, SEQ ID NO: 130 para CDRH2, e SEQ ID NO: 131 para CDRH3; (ix) SEQ ID NO: 147 para CDRH1, SEQ ID NO: 148 para CDRH2, e SEQ ID NO: 149 para CDRH3; (x) SEQ ID NO: 165 para CDRH1, SEQ ID NO: 166 para CDRH2, e SEQ ID NO: 167 para CDRH3; (xi) SEQ ID NO: 183 para CDRH1, SEQ ID NO: 184 para CDRH2, e SEQ ID NO: 185 para CDRH3; ou (xii) SEQ ID NO: 201 para CDRH1, SEQ ID NO: 202 para CDRH2, e SEQ ID NO: 203 para CDRH3.

[0098] De modo preferencial, o anticorpo ou o fragmento de liga ção de antígeno da invenção compreende uma CDR1 de cadeia leve com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 4, 22, 40, 58, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186, ou 204 ou variantes de sequência das mesmas; uma CDR2 de cadeia leve com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 5, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 79, 80, 97, 98, 115, 116, 133, 134, 151, 152, 169, 170, 187, 188, 205, ou 206 ou variantes de sequência das mesmas; e uma CDR3 de cadeia leve com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 25, 43, 61, 81, 99, 117, 135, 153, 171, 189, ou 201 ou variantes de sequência das mesmas. Em determinadas modalidades, um anticorpo ou fragmento de anticorpo conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente, compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 4 para CDRL1, SEQ ID NO: 5 ou 6 para CDRL2, e SEQ ID NO: 7 para CDRL3; (ii) SEQ ID NO: 22 para CDRL1, SEQ ID NO: 23 ou 24 para CDRL2, e SEQ ID NO: 25 para CDRL3; (iii) SEQ ID NO: 40 para CDRL1, SEQ ID NO: 41 ou 42 para CDRL2, e SEQ ID NO: 43 para CDRL3; (iv) SEQ ID NO: 58 para CDRL1, SEQ ID NO: 59 ou 60 para CDRL2, e SEQ ID NO: 61 para CDRL3; (v) SEQ ID NO: 78 para CDRL1, SEQ ID NO: 79 ou 80 para CDRL2, e SEQ ID NO: 81 para CDRL3; (vi) SEQ ID NO: 96 para CDRL1, SEQ ID NO: 97 ou 98 para CDRL2, e SEQ ID NO: 99 para CDRL3; (vii) SEQ ID NO: 114 para CDRL1, SEQ ID NO: 115 ou 116 para CDRL2, e SEQ ID NO: 117 para CDRL3; (viii) SEQ ID NO: 132 para CDRL1, SEQ ID NO: 133 ou 134 para CDRL2, e SEQ ID NO: 135 para CDRL3; (ix) SEQ ID NO: 150 para CDRL1, SEQ ID NO: 151 ou 152 para CDRL2, e SEQ ID NO: 152 para CDRL3; (x) SEQ ID NO: 168 para CDRL1, SEQ ID NO: 169 ou 170 para CDRL2, e SEQ ID NO: 171 para CDRL3; (xi) SEQ ID NO: 186 para CDRL1, SEQ ID NO: 187 ou 188 para CDRL2, e SEQ ID NO: 189 para CDRL3; ou (xii) SEQ ID NO: 204 para CDRL1, SEQ ID NO: 205 ou 206 para CDRL2, e SEQ ID NO: 207 para CDRL3.

[0099] Em outra modalidade da invenção, a invenção compreende um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 a 7, 19 a 25, 37 a 43, 55 a 61, 75 a 81, 93 a 99, 111 a 117, 129 a 135, 147 a 153, 165 a 171, 183 a 189, e 201 a 207, respectivamente.

[00100] De modo preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, é de acordo com gRVA122, gRVA144, gRVB185, gRVB492, gRVC3, gRVC20, gRVC21, gRVC38, gRVC44, gRVC58, gRVC68, ou gRVC111, de modo preferencial é de acordo com gRVC20 ou gRVC58. De modo mais preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, é RVA122, RVA144, RVB185, RVB492, RVC3, RVC20, RVC21, RVC38, RVC44, RVC58, RVC68, ou RVC111, de modo preferencial RVC20 ou RVC58.

[00101] Os presentes inventores isolaram doze anticorpos mono- clonais (mAbs), os quais são referidos aqui, neste requerimento de patente, como RVA122, RVA144, RVB185, RVB492, RVC3, RVC20, RVC21, RVC38, RVC44, RVC58, RVC68, e RVC111 (cf. os Exemplos 1 a 4). Com base nos anticorpos RVA122, RVA144, RVB185, RVB492, RVC3, RVC20, RVC21, RVC38, RVC44, RVC58, RVC68, e RVC111, em particular nos genes VH e VL de RVA122, RVA144, RVB185, RVB492, RVC3, RVC20, RVC21, RVC38, RVC44, RVC58, RVC68, e RVC111, os termos gRVA122, gRVA144, gRVB185, gRVB492, gRVC3, gRVC20, gRVC21, gRVC38, gRVC44, gRVC58, gRVC68, ou gRVC111, conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se referem a anticorpos “genéricos” respectivos, ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, tendo as sequências de aminoácidos específicas, codificadas pelas sequências de nucleotídeos específicas, con-formeesboçado abaixo.

[00102] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, “gRVA122” se refere a um anticorpo, ou fragmento de ligação de antí- geno do mesmo, tendo uma sequência de aminoácidos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 1, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 8, uma sequência de aminoácidos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 2, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 9, uma sequência de aminoácidos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 3, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 10, uma sequência de aminoácidos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 4, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 11, uma sequência de aminoá- cidos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 5 ou 6, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 12 ou 13, e uma sequência de aminoácidos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 7, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 14. A região variável de cadeia pesada (VH) de “gRVA122” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 15, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 17, e a região variável de cadeia leve (VL) de “gRVA122” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 16, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 18.

[00103] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, “gRVA144” se refere a um anticorpo, ou fragmento de ligação de antí- geno do mesmo, tendo uma sequência de aminoácidos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 19, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 26, uma sequência de aminoácidos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 20, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 27, uma sequência de aminoácidos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 21, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 28, uma sequência de aminoácidos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 22, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 29, uma sequência de aminoá- cidos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 23 ou 24, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 30 ou 31, e uma sequência de aminoácidos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 25, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 32. A região variável de cadeia pesada (VH) de “gRVA144” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 33, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 35, e a região variável de cadeia leve (VL) de “gRVA144” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 34, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 36.

[00104] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, “gRVB185” se refere a um anticorpo, ou fragmento de ligação de antí- geno do mesmo, tendo uma sequência de aminoácidos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 37, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 44, uma se-quência de aminoácidos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 38, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 45, uma sequência de aminoácidos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 39, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 46, uma sequência de aminoácidos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 40, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 47, uma sequência de aminoá- cidos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 41 ou 42, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 48 ou 49, e uma sequência de aminoácidos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 43, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 50. A região variável de cadeia pesada (VH) de “gRVB185” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 51, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 53, e a região variável de cadeia leve (VL) de “gRVB185” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 52, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 54.

[00105] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, “gRVB492” se refere a um anticorpo, ou fragmento de ligação de antí- geno do mesmo, tendo uma sequência de aminoácidos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 55, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 62, uma sequência de aminoácidos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 56, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 63, uma sequência de aminoácidos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 57, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 64, uma sequência de aminoácidos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 58, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 65, uma sequência de aminoá- cidos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 59 ou 60, a qual é codi-ficada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 66 ou 67, e uma sequência de aminoácidos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 61, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 68. A região variável de cadeia pesada (VH) de “gRVB492” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 69 ou 70, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 72 ou 73, e a região variável de cadeia leve (VL) de “gRVB492” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 71, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 74.

[00106] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, “gRVC3” se refere a um anticorpo, ou fragmento de ligação de antíge- no do mesmo, tendo uma sequência de aminoácidos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 75, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 82, uma sequência de aminoácidos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 76, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 83, uma sequência de aminoácidos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 77, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 84, uma sequência de aminoácidos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 78, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 85, uma sequência de aminoá- cidos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 79 ou 80, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 86 ou 87, e uma sequência de aminoácidos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 81, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 88. A região variável de cadeia pesada (VH) de “gRVC3” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 89, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 91, e a região variável de cadeia leve (VL) de “gRVC3” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 90, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 92.

[00107] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, “gRVC20” se refere a um anticorpo, ou fragmento de ligação de antí- geno do mesmo, tendo uma sequência de aminoácidos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 93, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 100, uma sequência de aminoácidos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 94, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 101, uma sequência de aminoácidos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 95, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 102, uma sequência de aminoácidos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 96, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 103, uma sequência de aminoá- cidos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 97 ou 98, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 104 ou 105, e uma sequência de aminoácidos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 99, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 106. A região variável de cadeia pesada (VH) de “gRVC20” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 107, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 109, e a região variável de cadeia leve (VL) de “gRVC20” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 108, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 110.

[00108] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, “gRVC21” se refere a um anticorpo, ou fragmento de ligação de antí- geno do mesmo, tendo uma sequência de aminoácidos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 111, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 118, uma sequência de aminoácidos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 112, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 119, uma sequência de amino- ácidos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 113, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 120, uma sequência de aminoácidos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 114, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 121, uma se-quência de aminoácidos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 115 ou 116, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 122 ou 123, e uma sequência de aminoácidos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 117, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 124. A região variável de cadeia pesada (VH) de “gRVC21” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 125, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 127, e a região variável de cadeia leve (VL) de “gRVC21” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 126, a qual é codificada por uma sequência de nucleotí- deos de acordo com a SEQ ID NO: 128.

[00109] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, “gRVC38” se refere a um anticorpo, ou fragmento de ligação de antí- geno do mesmo, tendo uma sequência de aminoácidos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 129, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 136, uma sequência de aminoácidos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 130, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 137, uma sequência de amino- ácidos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 131, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 138, uma sequência de aminoácidos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 132, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 139, uma sequência de aminoácidos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 133 ou 134, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 140 ou 141, e uma sequência de aminoácidos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 135, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 142. A região variável de cadeia pesada (VH) de “gRVC38” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 143, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 145, e a região variável de cadeia leve (VL) de “gRVC38” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 144, a qual é codificada por uma sequência de nucleotí- deos de acordo com a SEQ ID NO: 146.

[00110] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, “gRVC44” se refere a um anticorpo, ou fragmento de ligação de antí- geno do mesmo, tendo uma sequência de aminoácidos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 147, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 154, uma sequência de aminoácidos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 148, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 155, uma sequência de amino- ácidos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 149, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 156, uma sequência de aminoácidos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 150, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 157, uma sequência de aminoácidos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 151 ou 152, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 158 ou 159, e uma sequência de aminoácidos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 153, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 160. A região variável de cadeia pesada (VH) de “gRVC44” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 161, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 163, e a região variável de cadeia leve (VL) de “gRVC44” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 162, a qual é codificada por uma sequência de nucleotí- deos de acordo com a SEQ ID NO: 164.

[00111] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, “gRVC58” se refere a um anticorpo, ou fragmento de ligação de antí- geno do mesmo, tendo uma sequência de aminoácidos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 165, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 172, uma sequência de aminoácidos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 166, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 173, uma sequência de amino- ácidos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 167, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 174, uma sequência de aminoácidos de CDRL1 de acor- do com a SEQ ID NO: 168, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 175, uma se-quência de aminoácidos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 169 ou 170, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 176 ou 177, e uma sequência de aminoácidos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 171, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 178. A região variável de cadeia pesada (VH) de “gRVC58” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 179, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 181, e a região variável de cadeia leve (VL) de “gRVC58” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 180, a qual é codificada por uma sequência de nucleotí- deos de acordo com a SEQ ID NO: 182.

[00112] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, “gRVC68” se refere a um anticorpo, ou fragmento de ligação de antí- geno do mesmo, tendo uma sequência de aminoácidos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 183, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 190, uma sequência de aminoácidos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 184, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 191, uma sequência de amino- ácidos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 185, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 192, uma sequência de aminoácidos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 186, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 193, uma sequência de aminoácidos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 187 ou 188, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 194 ou 195, e uma sequência de aminoácidos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 189, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 196. A região variável de cadeia pesada (VH) de “gRVC68” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 197, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 199, e a região variável de cadeia leve (VL) de “gRVC68” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 198, a qual é codificada por uma sequência de nucleotí- deos de acordo com a SEQ ID NO: 200.

[00113] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, “gRVC111” se refere a um anticorpo, ou fragmento de ligação de antí- geno do mesmo, tendo uma sequência de aminoácidos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 201, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 208, uma sequência de aminoácidos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 202, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 209, uma sequência de amino- ácidos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 203, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 210, uma sequência de aminoácidos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 204, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 211, uma sequência de aminoácidos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 205 ou 206, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 212 ou 213, e uma sequência de aminoácidos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 207, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 214. A região variável de cadeia pesada (VH) de “gRVC111” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 215, a qual é codificada por uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 217, e a região variável de cadeia leve (VL) de “gRVC111” tem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 216, a qual é codificada por uma sequência de nucleotí- deos de acordo com a SEQ ID NO: 218.

[00114] De modo preferencial, os anticorpos de acordo com gRVA122, gRVA144, gRVB185, gRVB492, gRVC3, gRVC20, gRVC21, gRVC38, gRVC44, gRVC58, gRVC68, ou gRVC111, de modo preferencialé de acordo com gRVC20 e gRVC58 são do tipo de IgG1.

[00115] De modo preferencial, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção compreende uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais (isto é, uma, duas ou todas as três) CDRs de cadeia pesada de gRVA122, gRVA144, gRVB185, gRVB492, gRVC3, gRVC20, gRVC21, gRVC38, gRVC44, gRVC58, gRVC68, ou gRVC111, de modo preferencial é de acordo com gRVC20 e gRVC58.

[00116] Além disso é preferencial que o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção compreenda CDRs de cadeia leve de gRVA122, gRVA144, gRVB185, gRVB492, gRVC3, gRVC20, gRVC21, gRVC38, gRVC44, gRVC58, gRVC68, ou gRVC111, de modo preferencial é de acordo com gRVC20 e gRVC58.

[00117] De modo preferencial, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção compreende todas as CDRs do anticorpo RVC20 conforme listado na Tabela 2 ou todas as CDRs do anticorpo RVC58 conforme listado na Tabela 2. Al-ternativamente, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antíge- no de acordo com a presente invenção também pode compreender de modo preferencial todas as CDRs do anticorpo RVA122 conforme listado na Tabela 2. Alternativamente, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção também pode compreender de modo preferencial todas as CDRs do anticorpo RVA144 conforme listado na Tabela 2. Alternativamente, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção também pode compreender de modo preferencial todas as CDRs do anticorpo RVB185 conforme listado na Tabela 2. Alternati-vamente, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção também pode compreender de modo preferencial todas as CDRs do anticorpo RVB492 conforme listado na Tabela 2. Alternativamente, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção também pode compreender de modo preferencial todas as CDRs do anticorpo RVC3 conforme listado na Tabela 2. Alternativamente, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção também pode compreender de modo preferencial todas as CDRs do anticorpo RVC21 conforme listado na Tabela 2. Alternativamente, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção também pode compreender de modo preferencial todas as CDRs do anticorpo RVC38 conforme listado na Tabela 2. Al-ternativamente, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antíge- no de acordo com a presente invenção também pode compreender de modo preferencial todas as CDRs do anticorpo RVC44 conforme listado na Tabela 2. Alternativamente, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção também pode compreender de modo preferencial todas as CDRs do anticorpo RVC68 conforme listado na Tabela 2. Alternativamente, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção também pode compreender de modo preferencial todas as CDRs do anticorpo RVC111 conforme listado na Tabela 2.

[00118] Os números de SEQ ID para a sequência de aminoácidos para a região variável de cadeia pesada (VH) e para a região variável de cadeia leve (VL) de anticorpos de exemplo da invenção bem como os números de SEQ ID para as sequências de ácidos nucleicos codificando as mesmas são listados na Tabela 3. Tabela 3. Números de SEQ ID para resíduos de aminoácidos e de ácidos nucleicos VH e VL para anticorpos de exemplo de acordo com a presente invenção.

[00119] De modo preferencial, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de ami- noácidos que é cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência mencionada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 15, 33, 51, 69, 70, 89, 107, 125, 143, 161, 179, 197, ou 215. Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que é cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência mencionada nas SEQ ID NOs: 16, 34, 52, 71, 90, 108, 126, 144, 162, 180, 198, ou 216. Em ainda outra modalidade pre-ferencial, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que é cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica às sequências proporcionadas nas Figuras 22 a 33.

[00120] As Figuras 22 a 33 mostram as sequências de aminoácidos para as cadeias pesada e leve dos anticorpos RVA122, RVA144, RVB185, RVB492, RVC3, RVC20, RVC21, RVC38, RVC44, RVC58, RVC68, e RVC111, respectivamente, bem como as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas. As sequências de amino- ácidos das CDRs e as sequências de ácidos nucleicos que codificam as CDRs estão em texto em negrito ao passo que as sequências de aminoácidos da região de framework e as sequências de ácidos nu- cleicos que codificam a região de framework estão em texto sem formatação.

[00121] De modo preferencial, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção compreende (i) uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; ou (ii) uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; (iii) ou uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou (iv) uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; ou (v) uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; ou (vi) uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; ou (vii) uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; ou (viii) uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; ou (ix) uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 143 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 144; ou (x) uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 162; ou (xi) uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 180; ou (xii) uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 197 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 198; ou (xiii) uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 216.

[00122] De modo mais preferencial, o anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; ou (ii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (iii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou (iv) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; ou (v) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 71; ou (vi) uma região variável de cadeia pesa- da compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; ou (vii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; ou (viii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; ou (ix) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 143 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 144; ou (x) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 162; ou (xi) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 180; ou (xii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 197 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 198; ou (xiii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 216.

[00123] Exemplos de anticorpos da invenção incluem, mas não estão limitados a, RVA122, RVA144, RVB185, RVB492, RVC3, RVC20, RVC21, RVC38, RVC44, RVC58, RVC68, ou RVC111, de modo preferencial RVC20 ou RVC58. De modo preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, é de acordo com gRVA122, gRVA144, gRVB185, gRVB492, gRVC3, gRVC20, gRVC21, gRVC38, gRVC44, gRVC58, gRVC68, ou gRVC111, de modo preferencial é de acordo com gRVC20 ou gRVC58.

[00124] O anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção pode ser usado na profilaxia, no tratamento ou na atenuação de infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV, de modo preferencial por lissavírus RABV e/ou não RABV do filogrupo I, de modo mais preferencial por RABV e/ou EBLV- 1. Detalhes adicionais para esta utilização são descritas abaixo, por exemplo, diretamente abaixo e no contexto de uma composição farmacêutica e de uma utilização médica.

[00125] De modo preferencial, a utilização do anticorpo, ou do fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção conforme descrito acima, compreende administrar o referido anticorpo em combinação com outro anticorpo monoclonal isolado que neutraliza a infecção pelo lissavírus e que compreende uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticaà SEQ ID NO: 95 ou à SEQ ID NO: 167 e em que ambos os anticorpos ligam especificamente a diferentes epitopos sobre a glicoprote- ína G do RABV. O outro anticorpo, isto é, o anticorpo que neutraliza a infecção pelo lissavírus e que compreende uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica à SEQ ID NO: 95 ou à SEQ ID NO: 167, além disso de modo preferencial é um anticorpo de acordo com a presente invenção.

[00126] De modo preferencial, o outro anticorpo, isto é, o anticorpo que neutraliza a infecção pelo lissavírus e que compreende uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de amino- ácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica à SEQ ID NO: 95 ou à SEQ ID NO: 167, compreende de modo preferencial (i) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 97 e 99 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 96 e 98 a 99, respectivamente, ou (ii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de amino- ácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 169 e 171 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 168 e 170 a 171, respectivamente. De modo mais preferencial, o outro anticorpo, isto é, o anticorpo que neutraliza a infecção pelo lissavírus e que compreende uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de amino- ácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica à SEQ ID NO: 95 ou à SEQ ID NO: 167, compreende uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 ou de SEQ ID NO: 179. De modo ainda mais preferencial, o outro anticorpo, isto é, o anticorpo que neutraliza a infecção pelo lissavírus e que compreende uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticaà SEQ ID NO: 95 ou à SEQ ID NO: 167, compreende (i) uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; ou (ii) uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 180.

[00127] Deste modo, é proporcionada uma combinação de anticorpos para a profilaxia, o tratamento ou a atenuação de infecção por lis- savírus RABV e/ou não RABV, de modo preferencial por lissavírus RABV e/ou não RABV do filogrupo I, de modo mais preferencial por RABV e/ou EBLV-1, com pelo menos um anticorpo amplamente neu- tralizante, incluindo neutralizante de EBLV-1.

[00128] De modo preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, para utilização de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, se liga ao sítio antigênico I ou III sobre a glicoproteína G do RABV e o outro anticorpo, o qual é administrado em combinação, se liga ao outro dos sítios antigênicos I ou III sobre a glicoproteína G do RABV.

[00129] De modo interessante, os anticorpos antirrábicos humanos mais frequentemente reconhecem os sítios antigênicos I ou III sobre a glicoproteína G do RABV, ao passo que, por exemplo, os anticorpos antirrábicos de camundongo mais frequentemente reconhecem o sítio antigênico II sobre a glicoproteína G do RABV. Supõe-se que a domi-nância imunogênica do sítio antigênico II seja menor em seres humanos do que em camundongos (Kramer RA, Marissen WE, Goudsmit J, Visser TJ, Clijsters-Van der Horst M, Bakker AQ, de Jong M, Jongene- elen M, Thijsse S, Backus HH, Rice AB, Weldon WC, Rupprecht CE, Dietzschold B, Bakker AB, de Kruif J (2005) The human antibody repertoire specific for rabies virus glycoprotein as selected from immune libraries. Eur J Immunol. 35(7):2131-45). Por conseguinte, acredita-se que uma combinação de anticorpos reconhecendo os sítios antigêni- cos I e III sobre a glicoproteína G do RABV seja mais eficaz do que, por exemplo, uma combinação envolvendo um anticorpo reconhecendo o sítio antigênico II sobre a glicoproteína G do RABV.

[00130] De modo preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, para utilização de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, compreende uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica à SEQ ID NO: 95 e em que o outro anticorpo administrado em combinação compreende uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica à SEQ ID NO: 167.

[00131] De modo preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, para utilização de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, com-preendesequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 97 e 99 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 96 e 98 a 99, respectivamente, e o outro anticorpo administrado em combinação compreende sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 169 e 171 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 168 e 170 a 171, respectivamente. De modo mais preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, para utilização de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, com- preende uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 e o outro anticorpo administrado em combinação compreende uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 180. De modo ainda mais preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, para utilização de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, é de acordo com gRVC20 e em que o outro anticorpo administrado em combinação é de acordo com gRVC58.

[00132] De modo preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, para utilização de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, e o outro anticorpo, o qual é administrado em combinação, são administrados simultaneamente ou consecutivamente.

[00133] Digno de nota, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, para utilização de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, e o outro anticorpo, o qual é administrado em combinação, podem ser adminis-trados separadamente, por exemplo, em composições farmacêuticas separadas, ou juntos, isto é, como um “coquetel” de anticorpos, por exemplo, na mesma composição farmacêutica.

[00134] De modo preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, para utilização de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, e o outro anticorpo, o qual é administrado em combinação, são adminis- trados separadamente. Deste modo, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, para utilização de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, e o outro anticorpo, o qual é administrado em combinação, podem ser administrados ou simultaneamente ou consecutivamente. Para admi-nistração consecutiva de ambos os anticorpos, o tempo entre (o final de) a administração do primeiro anticorpo e (o início de) a administração do segundo anticorpo, por exemplo, em profilaxia pós-exposição ou tratamento de infecção pelo lissavírus, de modo preferencial é de não mais de uma semana, de modo mais preferencial não mais de 5 dias, de modo ainda mais preferencial não mais de 3 dias, de modo o mais preferencial não mais de 2 dias e de modo particularmente prefe-rencialnão mais de um dia (24 horas). Em uma modalidade preferencial da mesma, o tempo entre (o final de) a administração do primeiro anticorpo e (o início de) a administração do segundo anticorpo é de não mais de 12 horas, de modo preferencial não mais de 6 horas, de modo mais preferencial não mais de 3 horas, de modo ainda mais pre-ferencialnão mais de 1 hora, de modo o mais preferencial não mais de 30 min e de modo particularmente preferencial não mais de 10 min. Uma administração consecutiva em que um anticorpo é administrado imediatamente depois da administração do outro anticorpo é particu-larmente preferencial (isto significa em particular que a administração de um dos anticorpos se inicia menos de 10 min depois do final da administração do outro anticorpo). Na administração consecutiva con-forme descrito acima é preferencial que o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, para utilização de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, seja administrado primeiro e o outro anticorpo, o qual é administrado em combinação, seja administrado depois disso. Na administração consecutiva conforme descrito acima também é preferencial que o ou- tro anticorpo, o qual é administrado em combinação, seja administrado primeiro e o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, para utilização de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, seja administrado depois disso. Em uma modalidade preferencial da mesma, um anticorpo, o qual é de acordo com gRVC20, é administrado primeiro e um anticorpo, o qual é de acordo com gRVC58, é administrado administrado depois disso conforme descrito acima. Em outra modalidade preferencial da mesma, um anticorpo, o qual é de acordo com gRVC58, é administrado primeiro e um anticorpo, o qual é de acordo com gRVC20, é administrado administrado depois disso conforme descrito acima.

[00135] Além disso é preferencial que o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, para utilização de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, e o outro anticorpo, o qual é administrado em combinação, sejam administrados como um coquetel de anticorpos, por exemplo, na mesma composição farmacêutica conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.

[00136] De modo preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, para utilização de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, e o outro anticorpo, o qual é administrado em combinação, são administrados em quantidades equimolares.

[00137] A invenção adicionalmente compreende um anticorpo, ou fragmento do mesmo, que se liga ao mesmo epitopo que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da invenção, ou um anticorpo que compete com um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da invenção.

[00138] De modo preferencial, este epitopo é o sítio antigênico III.2, B, ou C da proteína G do RABV (glicoproteína G). Neenhum dos anti- corpos CR57 e CR4098 se liga a estes epitopos, mas se ligam aos sí-tiosantigênicos I e III, respectivamente. No entanto, vários anticorpos de acordo com a presente invenção, a saber RVB181, RVC56, RVB185, RVC21, RVB161 e RVC111 se ligam ao sítio antigênico III.2 da proteína G do RABV. O novo sítio antigênico III.2 é provavelmente proximal ao sítio antigênico III sobre a proteína G do RABV (cf. o Exemplo 3). Seguindo os mesmos critérios, foram definidos três novos sítios antigênicos adicionais de nominados A, B e C. O sítio B é definido pelo anticorpo RVC44, cuja ligação não é bloqueada por qualquer outro anticorpo do painel. De modo similar, o sítio C é definido pelos anticorpos RVB143 e RVC68, os quais também reconhecem um epito- po único e distinto quando comparado com todos os outros anticorpos. Digno de nota, RVC44, RVB143 e RVC68 são os únicos anticorpos deste painel capazes de ligação por Western blotà proteína G sob condições redutoras, sugesrindo que reconhecem um epitopo linear sobre a proteína G do RABV (cf. o Exemplo 3).

[00139] De modo preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo conforme descrito acima, também neutraliza infecção pelo RABV e infecção de pelo menos 50 % dos lissavírus não RABV DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV e WCBV com uma IC50 abaixo de 10000 ng/ml, por meio do quê as modalidades preferenciais descritas acima para o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção que neutraliza infecção pelo RABV e infecção de pelo menos 50 % dos lissavírus não RABV DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV e WCBV com uma IC50 abaixo de 10000 ng/ml também se aplica ao anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo conforme descrito acima.

[00140] Os anticorpos da invenção também incluem moléculas de anticorpos híbridos que neutralizam infecção pelo RABV e infecção de pelo menos 50 % dos lissavírus não RABV DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV e WCBV com uma IC50 abaixo de 10000 ng/ml conforme descrito acima e que compreendem uma ou mais CDRs de um anticorpo da invenção e uma ou mais CDRs de outro anticorpo para o mesmo epitopo. Em uma modalidade, os anticorpos híbridos referidos compreendem três CDRs de um anticorpo da invenção e três CDRs de outro anticorpo para o mesmo epitopo. Os anticorpos híbridos de exemplo referidos compreendem (i) as três CDRs de cadeia pesada de um anticorpo da invenção e as três CDRs de cadeia leve de outro anticorpo para o mesmo epitopo, ou (ii) as três CDRs de cadeia leve de um anticorpo da invenção e as três CDRs de cadeia pesada de outro anticorpo para o mesmo epitopo.

[00141] Em outro aspecto, a invenção também proporciona uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificando o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção conforme descrito acima. São preferenciais as sequências de ácidos nucleicos codificando parte ou todas as cadeias leves e pesadas e CDRs dos anticorpos da presente invenção. De modo preferencial portanto, são proporcionadas aqui, neste requerimento de patente, sequências de ácidos nucleicos codificando parte ou todas as cadeias leves e pesadas e CDRs dos anticorpos de exemplo da invenção. A Tabela 3 acima proporciona os números de SEQ ID para as sequências de ácidos nucleicos codificando as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve de alguns exemplos de anticorpos da invenção. A Tabela 4 abaixo proporciona os números de SEQ ID para as sequências de ácidos nucleicos codificando as CDRs de alguns exemplos dos anticorpos da invenção. Devido à redundância do código genético, vão existir variantes destas sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas sequências de aminoácidos.

[00142] Portanto, a presente invenção também compreende uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codifi-cando o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção.

[00143] Uma molécula de ácido nucleico é uma molécula compre-endendo, de modo preferencial consistindo de componentes de ácido nucleico. O termo molécula de ácido nucleico de modo preferencial se refere a moléculas de DNA ou RNA. De modo preferencial é usado de maneira sinônima com o termo “polinucleotídeo”. De modo preferencial, uma molécula de ácido nucleico é um polímero compreendendo ou consistindo de monômeros de nucleotídeos os quais são ligados de modo covalente uns aos outros por ligações de fosfodiéster de uma espinha dorsal de açúcar / fosfato. O termo “molécula de ácido nuclei- co” também engloba moléculas de ácido nucleico modificadas, tais como moléculas de DNA ou RNA modificadas com bases, modificadas com açúcar ou de espinha dorsal modificada etc. Tabela 4. Números de SEQ ID para Polinucleotídeos de CDR de anti-corpos de exemplo de acordo com a presente invenção.

[00144] De modo preferencial, a sequência de polinucleotídeos da molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção é pelo menos 75% idêntica à sequência de ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 8 a 14, 17, 18, 26 a 32, 35, 36, 44 a 50, 53, 54, 62 a 68, 72 a 74, 82 a 88, 91, 92, 100 a 106, 109, 110, 118 a 124, 127, 128, 136 a 142, 145, 146, 154 a 160, 163, 164, 172 a 178, 181, 182, 190 a 196, 199, 200, 208 a 214, 217 ou 218. De modo preferencial, a sequência de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção é de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 8 a 14, 17, 18, 26 a 32, 35, 36, 44 a 50, 53, 54, 62 a 68, 72 a 74, 82 a 88, 91, 92, 100 a 106, 109, 110, 118 a 124, 127, 128, 136 a 142, 145, 146, 154 a 160, 163, 164, 172 a 178, 181, 182, 190 a 196, 199, 200, 208 a 214, 217 ou 218, ou variantes de sequência das mesmas.

[00145] Além disso é preferencial que as sequências de ácidos nu- cleicos de acordo com a invenção incluam sequências de ácidos nu- cleicos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o ácido nucleico codificando a região variável de uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo da invenção. Em outra modalidade, uma sequência de ácidos nucleicos da invenção tem a sequência de um ácido nucleico codificando uma CDR de cadeia pesada ou leve de um anticorpo da invenção. Por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com a invenção compreende uma sequência que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pe- lo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica às sequências de ácidos nucleicos de SEQ ID NOs: 8 a 14, 17, 18, 26 a 32, 35, 36, 44 a 50, 53, 54, 62 a 68, 72 a 74, 82 a 88, 91, 92, 100 a 106, 109, 110, 118 a 124, 127, 128, 136 a 142, 145, 146, 154 a 160, 163, 164, 172 a 178, 181, 182, 190 a 196, 199, 200, 208 a 214, 217 ou 218.

[00146] Em ainda outra modalidade preferencial, as sequências de ácidos nucleicos de acordo com a invenção incluem sequências de ácidos nucleicos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o ácido nucleico codificando uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo da invenção conforme proporcionado nas Figuras 22 a 33.

[00147] Em geral, a molécula de ácido nucleico pode ser manipulada para inserir, eliminar ou alterar determinadas sequências de ácidos nucleicos. As modificações de semelhante manipulação incluem, mas não estão limitadas a, modificações para introduzir sítios de restrição, para alterar o uso de codons, para adicionar ou otimizar a transcrição e/ou translação de sequências reguladoras, etc. Também é possível modificar o ácido nucleico para alterar os aminoácidos codificados. Por exemplo, pode ser útil introduzir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácidos na sequência de aminoácidos do anticorpo. As mutações de ponto referidas podem modificar as funções efetoras, a afinidade de ligação de antígeno, modificações pós-translacionais, a imunogenici- dade, etc., podem introduzir aminoácidos para a fixação de grupamentos covalentes (por exemplo, marcadores) ou podem introduzir etiquetas (por exemplo, para fins de purificação). Mutações podem ser introduzidas em sítios específicos ou podem ser introduzidas aleatoriamen- te, seguidas por seleção (por exemplo, evolução molecular). Por exemplo, um ou mais ácidos nucleicos codificando qualquer uma das regiões de CDR, regiões variáveis de cadeia pesada ou regiões variáveis de cadeia leve de anticorpos da invenção podem ser mutados aleatoriamente ou direcionalmente de modo a introduzir diferentes propriedades nos aminoácidos codificados. As modificações referidas podem ser o resultado de um processo iterativo em que modificações iniciais são retidas e novas modificações em outras posições de nu- cleotídeos são introduzidas. Além disso, modificações obtidas em etapas independentes podem ser combinadas. Diferentes propriedades introduzidas nos aminoácidos codificados podem incluir, mas não estão limitadas a, reforço da afinidade.

[00148] Adicionalmente incluídos dentro do âmbito da invenção estão vetores, por exemplo, vetores de expressão, compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com a invenção. De modo preferencial, um vetor compreende uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico conforme descrito acima.

[00149] O termo “vetor” se refere a uma molécula de ácido nucleico, de modo preferencial a uma molécula de ácido nucleico artificial, isto é, uma molécula de ácido nucleico a qual não ocorre na natureza. Um vetor no contexto da presente invenção é adequado para incorporar ou abrigar uma sequência de ácidos nucleicos desejada. Os vetores referidos podem ser vetores de armazenamento, vetores de expressão, vetores de clonagem, vetores de transferência, etc. Um vetor de armazenamentoé um vetor o qual permite o armazenamento conveniente de uma molécula de ácido nucleico. Portanto, o vetor pode compreender uma sequência correspondente, por exemplo, a um anticorpo ou fragmento de anticorpo desejável da mesma de acordo com a presente invenção. Um vetor de expressão pode ser usado para a produção de produtos de expressão tais como RNA, por exemplo, mRNA, ou peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Por exemplo, um vetor de ex-pressão pode compreender sequências necessárias para a transcrição de um trecho de sequência do vetor, tal como uma sequência de pro-motor. Um vetor de clonagem é tipicamente um vetor que contém um sítio de clonagem, o qual pode ser usado para incorporar sequências de ácidos nucleicos no vetor. Um vetor de clonagem pode ser, por exemplo, um vetor de plasmídeo ou um vetor de bacteriófago. Um vetor de transferência pode ser um vetor o qual é adequado para transfe-rirmoléculas de ácido nucleico para dentro de células ou organismos, por exemplo, vetores virais. Um vetor no contexto da presente invenção pode ser, por exemplo, um vetor de RNA ou um vetor de DNA. De modo preferencial, um vetor é uma molécula de DNA. Por exemplo, um vetor no sentido do presente requerimento compreende um sítio de clonagem, um marcador de seleção, tal como um fator de resistência a antibiótico, e uma sequência adequada para a multiplicação do vetor, tal como uma origem de replicação. De modo preferencial, um vetor no contexto do presente requerimento é um vetor de plasmídeo.

[00150] Células transformadas com os vetores referidos também são incluídas dentro do âmbito da invenção. Exemplos de semelhantes células incluem, mas não estão limitados a, células eucarióticas, por exemplo, células de leveduras, células de animais ou células de plantas. Em uma modalidade as células são células de mamífero, por exemplo, humanas, CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, de mieloma ou de hibridoma. Por conseguinte, a presente invenção também se refere a uma célula expressando o anticorpo, ou o fragmento de ligação de an- tígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção; ou compreendendo o vetor de acordo com a presente invenção.

[00151] Em particular, a célula pode ser transfectada com um vetor de acordo com a presente invenção, de modo preferencial com um ve- tor de expressão. O termo “transfecção” se refere à introdução de mo-léculas de ácido nucleico, tais como moléculas de DNA ou RNA (por exemplo, mRNA), dentro das células, de modo preferencial dentro de células eucarióticas. No contexto da presente invenção, o termo “trans- fecção” engloba qualquer método de conhecimento de uma pessoa versada para a introdução de moléculas de ácido nucleico dentro das células, de modo preferencial dentro de células eucarióticas, tais como dentro de células de mamífero. Os métodos referidos englobam, por exemplo, eletroporação, lipofecção, por exemplo, à base de lipídeos catiônicos e/ou lipossomas, precipitação de fosfato de cálcio, transfec- ção à base de nanopartículas, transfecção à base de vírus, ou trans- fecção à base de polímeros catiônicos, tais como DEAE-dextrano ou polietilenimina etc. De modo preferencial, a introdução é não viral.

[00152] A invenção também se refere a anticorpos monoclonais que se ligam a um epitopo capaz de ligação dos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno da invenção. Por conseguinte, a presente invenção compreende um polipeptídeo imunogênico isolado ou purificado compreendendo um epitopo que liga especificamente ao anticorpo, ou ao fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção. Um peptídeo imunogênico semelhante de acordo com a presente invenção também pode ser usado para uma vacina, por exemplo, para uma vacina a qual é usada em combinação com os anticorpos de acordo com a presente invenção.

[00153] A invenção proporciona novos epitopos aos quais os anticorpos neutralizantes da invenção se ligam. Estes epitopos, em particular sítio antigênico III.2, B e C, são encontrados sobre a proteína G do RABV (glicoproteína G) conforme descrito acima.

[00154] Os epitopos aos quais os anticorpos da invenção se ligam podem ser lineares (contínuos) ou conformacionais (descontínuos). De modo preferencial, os anticorpos e os fragmentos de anticorpos da in- venção ligam um epitopo conformacional, de modo mais preferencial o epitopo conformacional está presente somente sob condições não re-dutoras. No entanto, em particular com respeito aos sítios antigênicos B e C conforme descrito acima, os anticorpos e os fragmentos de anti-corpos da invenção também podem ligar um epitopo linear, de modo mais preferencial o epitopo linear está presente tanto sob condições não redutoras quanto sob condições redutoras.

[00155] Anticorpos monoclonais e recombinantes são particular-menteúteis na identificação e na purificação dos polipeptídeos individuais ou outros antígenos contra os quais são direcionados. Os anticorpos da invenção têm utilidade adicional pelo fato de que podem ser empregados como reagentes em imunoensaios, radioimunoensaios (RIA) ou ensaios imunossorventes ligados a enzimas (ELISA). Nestas aplicações, os anticorpos podem ser marcados com um reagente de- tectável analiticamente tal como um radioisótopo, uma molécula efluo- rescent ou uma enzima. Os anticorpos também podem ser usados para a identificação molecular e caracterização (mapeamento de epitopos) de antígenos.

[00156] Os anticorpos da invenção também podem ser acoplados a um fármaco para liberação para um sítio de tratamento ou acoplados a um marcador detectável para facilitar o estudo por imagens (imaging) de um sítio compreendendo células de interesse, tais como células infectadas com lissavírus RABV e/ou não RABV. Os métodos para o acoplamento de anticorpos a fármacos e marcadores detectáveis são de conhecimento geral na técnica, assim como os métodos para estudo por imagens usando marcadores detectáveis. Anticorpos marcados podem ser empregados em uma ampla variedade de testes, empregando uma ampla variedade de marcadores. A detecção da formação de um complexo de antígeno e anticorpo entre um anticorpo da invenção e um epitopo de interesse (um epitopo de RABV e/ou não RABV) pode ser facilitada anexando uma substância detectável ao anticorpo. Meios de detecção adequados incluem a utilização de marcadores tais como radionuclídeos, enzimas, coenzimas, fluorescentes, quimilumi- nescentes, cromogênios, substratos enzimáticos ou co-fatores, inibido-resenzimáticos, complexos de grupamentos prostéticos, radicais livres, partículas, corantes, e semelhantes. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, ß- galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupamentosprostéticos adequados incluem estreptavidina / biotina e avidina / biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, roda- mina, diclorotriazinilamina fluoresceína, dansil cloreto ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente é luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aquorina; e exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 35S, ou 3H. Os reagentes marcados referidos podem ser usados em uma variedade de testes de conhecimento geral, tais como radioimunoen- saios, imunoensaios enzimáticos, por exemplo, ELISA, imunoensaios fluorescentes, e semelhantes. (Vide a Patente dos Estados Unidos No. US 3.766.162; a Patente dos Estados Unidos No. US 3.791.932; a Pa-tente dos Estados Unidos No. US 3.817.837; e a Patente dos Estados Unidos No. US 4.233.402, por exemplo).

[00157] Um anticorpo de acordo com a invenção pode ser conjugado a uma porção terapêutica tal como uma citotoxina, um agente tera-pêutico,ou um íon de metal radioativo ou radioisótopo. Exemplos de radioisótopos incluem, mas não estão limitados a, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111, e semelhantes. Os conjugados de anticorpos referidos podem ser usados para modificar uma determinada resposta biológica; a porçãode fármaco não deve ser considerada como limitada aos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção de fármaco pode ser uma proteína ou um polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. As proteínas referidas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina diftérica.

[00158] As técnicas para a conjugação de semelhante porção terapêutica a anticorpos são de conhecimento geral. Vide, por exemplo, Arnon et al. (1985) “Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) “Antibodies for Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2d ed; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-653; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection e Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316; e Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158.

[00159] Alternativamente, um anticorpo, ou fragmento de anticorpo do mesmo, pode ser conjugado a um segundo anticorpo, ou fragmento de anticorpo do mesmo, para formar um heteroconjugado de anticorpos conforme descrito na Patente dos Estados Unidos No. US 4.676.980. Além disso, encadeadores podem ser usados entre os marcadores e os anticorpos da invenção (por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. US 4.831.175). Anticorpos ou, fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos podem ser marcados diretamente com iodo radioativo, índio, ítrio, ou outra partícula radioativa conhecida na técnica (por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. US 5.595.721). O tratamento pode consistir de uma combinação de tratamento com anticorpos conjugados e não conjugados administrados simultaneamente ou subsequentemente (por exemplo, Requerimento de Patente Internacional No. WO00/52031; Requerimento de Patente Internacional No. WO00/52473).

[00160] Os anticorpos da invenção também podem ser anexados a um suporte sólido. Adicionalmente, os anticorpos da invenção, ou fra-gmentos de anticorpos funcionais dos mesmos, podem ser quimicamente modificados por conjugação covalente a um polímero de modo a, por exemplo, aumentar sua meia-vida circulante. Exemplos de polímeros, e métodos para anexar os mesmos a peptídeos, são mostrados na Patente dos Estados Unidos No. US 4.766.106; na Patente dos Estados Unidos No. US 4.179.337; na Patente dos Estados Unidos No. US 4,495,285 e na Patente dos Estados Unidos No. US 4.609.546. Em algumas modalidades os polímeros podem ser selecionados entre polióis polioxietilados e polietileno glicol (PEG). PEG é solúvel em água em temperatura ambiente e tem a fórmula geral: R(O-CH2- CH2)nO-R em que R pode ser hidrogênio, ou um grupamento de proteção tal como um grupamento de alquila ou alcanol. De modo preferencial, o grupamento de proteção pode ter entre 1 e 8 carbonos. Por exemplo, o grupamento de proteção é metila. O símbolo n é um inteiro positivo. Em uma modalidade n é entre 1 e 1.000. Em outra modalidade n é entre 2 e 500. De modo preferencial, o PEG tem um peso molecular médio entre 1.000 e 40.000, de modo mais preferencial o PEG tem um peso molecular entre 2.000 e 20.000, de modo ainda mais preferencial o PEG tem um peso molecular entre 3.000 e 12.000. Além do mais, PEG pode ter pelo menos um grupamento hidróxi, por exemplo, o PEG pode ter um grupamento hidróxi terminal. Por exemplo, é o grupamento hidróxi terminal o qual é ativado para reagir com um grupamento amino livre sobre o inibidor. No entanto, deve ser entendido que o tipo e a quantidade dos grupamentos reativos podem ser variados de modo a obter um PEG / anticorpo conjugados de modo covalente da presente invenção.

[00161] Polióis polioxietilados hidrossolúveis também são úteis na presente invenção. Incluem sorbitol polioxietilado, glicose polioxietila- da, glicerol polioxietilado (POG), e semelhantes. Em uma modalidade, é usado POG. Sem ser limitado por qualquer teoria, como a espinha dorsal de glicerol de glicerol polioxietilado é a mesma espinha dorsal que ocorre naturalmente em, por exemplo, animais e seres humanos em mono-, di-, e triglicerídeos, esta ramificação não seria vista necessariamente como um agente estranho no corpo. POG pode ter um peso molecular na mesma faixa de PEG. Outro sistema de liberação de fármaco que pode ser usado para aumentar a meia-vida circulatória é o lipossoma. Os métodos de preparação de sistemas de liberação de lipossomas são de conhecimento de uma pessoa versada na técnica. Outros sistemas de liberação de fármacos são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, com referência a Poznansky et al. (1980) e Poznansky (1984).

[00162] Os anticorpos da invenção podem ser proporcionados em forma purificada. Tipicamente, o anticorpo vai estar presente em uma composição que é substancialmente livre de outros polipeptídeos por exemplo, onde menos de 90% (em peso), geralmente menos de 60% e mais usualmente menos de 50% da composição é composto de ou-trospolipeptídeos.

[00163] Os anticorpos da invenção podem ser imunogênicos em hospedeiros não humanos (ou heterólogos) por exemplo, em camun-dongos. Em particular, os anticorpos podem ter um idiotopo que é imunogênico em hospedeiros não humanos, mas não em um hospedeiro humano. Os anticorpos da invenção para utilização humana incluem aqueles que não podem ser facilmente isolados a partir de hos- pedeiros tais como camundongos, cabras, coelhos, ratos, mamíferos não primatas, etc. e de modo geral não podem ser obtidos por huma-nizaçãoou a partir de xeno-camundongos (xeno-mice).

[00164] Os anticorpos da invenção podem ser de qualquer isótipo (por exemplo, IgA, IgG, IgM isto é, uma cadeia pesada a, Y ou µ), porém de modo preferencial vão ser IgG. Dentro do isotipo das IgG, os anticorpos podem ser da subclasse IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, por meio do quê IgG1 é preferencial. Os anticorpos da invenção podem ter uma cadeia leve K ou uma À.

Produção de anticorpos

[00165] Os anticorpos de acordo com a invenção podem ser produzidos por meio de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a metodologia geral para produção de anticorpos monoclonais usando tecnologia de hibridoma é de conhecimento geral (Kohler, G. e Milstein, C,. 1975; Kozbar et al. 1983). Em uma modalidade, o método de imortalização do EBV alternativo descrito na Patente Internacional No. WO/2004/076677 is used.

[00166] Usando o método descrito na Patente Internacional WO 2004/076677, células B produtoras do anticorpo da invenção podem ser transformadas com EBV e um ativador de células B policlonais. Estimulantes adicionais de crescimento e diferenciação celulares podem ser opcionalmente adicionados durante a etapa de transformação para reforçar mais a eficiência. Estes estimulantes podem ser citocinas tais como IL-2 e IL-15. Em um aspecto, IL-2 é adicionada durante a etapa de imortalização de modo a aprimorar mais a eficiência de imor- talização, mas sua utilização não é essencial. As células B imortalizadas produzidas usando estes métodos podem ser em seguida cultivadas usando métodos conhecidos na técnica e anticorpos isolados a partir das mesmas.

[00167] Usando o método descrito na Patente Internacional WO 2010/046775, células plasmáticas podem ser cultivadas em números limitados, ou como células plasmáticas únicas em placas de cultura de microcavidades. Os anticorpos podem ser isolados a partir das culturas de células plasmáticas. Além disso, a partir das culturas de células plasmáticas, pode ser extraído o RNA e pode ser realizada reação de PCR usando métodos conhecidos na técnica. As regiões VH e VL dos anticorpos podem ser amplificadas por RT-PCR (transcriptase reversa PCR), sequenciadas e clonadas em um vetor de expressão que é em seguida transfectado em células HEK293T ou em outras células hos-pedeiras. A clonagem de ácido nucleico em vetores de expressão, a transfecção de células hospedeiras, a cultura das células hospedeiras transfectadas e o isolamento do anticorpo produzido podem ser feitos usando quaisquer métodos conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

[00168] Os anticorpos podem ser adicionalmente purificados, caso desejado, usando filtração, centrifugação e vários métodos cromato- gráficos tais como HPLC ou cromatografia por afinidade. Técnicas para purificação de anticorpos, por exemplo, anticorpos monoclonais, in-cluindotécnicas para a produção de anticorpos de grau farmacêutico, são de conhecimento geral na técnica.

[00169] Os fragmentos dos anticorpos da invenção podem ser obtidos a partir dos anticorpos por meio de métodos que incluem digestão com enzimas, tais como pepsina ou papaína, e/ou por clivagem de ligações de dissulfeto por redução química. Alternativamente, os fragmentos dos anticorpos podem ser obtidos por clonagem e expressão de parte das sequências das cadeias pesadas ou leves. “Fragmentos” de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab’, F(ab')2 e Fv. A invenção também engloba fragmentos Fv de cadeia única (scFv) derivados a partir das cadeias pesadas e leves de um anticorpo da invenção. Por exemplo, a invenção inclui um scFv compreendendo as CDRs de um anticorpo da invenção. Também são incluídos monômeros e dímeros de cadeia pesada ou leve, anticorpos de cadeia pesada de domínio único, anticorpos de cadeia leve de domínio único, bem como anticorpos de cadeia única, por exemplo, Fv de cadeia única no qual os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves são unidos por um enca- deador de peptídeos.

[00170] Os fragmentos de anticorpos da invenção podem transmitir interações monovalentes ou multivalentes e estar contidos em uma variedade de estruturas conforme descrito acima. Por exemplo, molé-culas de scFv podem ser sintetizadas para criar um “triabody” trivalente ou um “tetrabody” tetravalente. As moléculas de scFv podem incluir um domínio da região de Fc resultando em minibodies bivalentes. Além disso, as sequências da invenção podem ser um componente das moléculas multi-específicas nas quais as sequências da invenção têmpor alvo os epitopos da invenção e outras regiões da molécula se ligam a outros alvos. Moléculas de exemplo incluem, mas não estão limitadas a, Fab2 biespecíficos, Fab3 tri-específicos, scFv biespecífi- cos, e diabodies (Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136).

[00171] Técnicas de rotina de biologia molecular podem ser usadas para preparar sequências de DNA codificando os anticorpos ou fragmentos de anticorpos da presente invenção. Sequências de DNA desejadas podem ser sintetizadas completamente ou em parte usando técnicas de síntese de oligonucleotídeo. Técnicas de mutagênese direcionada a sítio e de reação de cadeia polimerase (PCR) podem ser usadas conforme apropriado.

[00172] Qualquer sistema de célula hospedeira / vetor adequado pode ser usado para a expressão das sequências de DNA codificando as moléculas de anticorpos da presente invenção ou fragmentos dos mesmos. Sistemas bacterianos, por exemplo, de E. coli, e outros sis- temas microbianos podem ser usados, em parte, para a expressão de fragmentos de anticorpos tais como fragmentos Fab e F(ab’)2, e espe-cialmente fragmentos Fv e fragmentos de anticorpos de cadeia única, por exemplo, Fvs de cadeia única. Sistemas de expressão de células hospedeiras eucarióticas, por exemplo, de mamífero, podem ser usados para a produção de moléculas de anticorpos maiores, incluindo moléculas de anticorpos completas. Células hospedeiras de mamífero adequadas incluem, mas não estão limitadas a, células CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, de mieloma ou de hibridoma.

[00173] A presente invenção também proporciona um processo para a produção de uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção compreendendo cultura de uma célula hospedeira com-preendendo um vetor codificando um ácido nucleico da presente in-venção sob condições adequadas para a expressão de proteína de DNA codificando a molécula de anticorpo da presente invenção, e isolamento da molécula de anticorpo.

[00174] A molécula do anticorpo pode compreender somente um polipeptídeo de cadeia pesada ou leve, em cujo caso somente uma sequência codificante de polipeptídeo de cadeia pesada ou de cadeia leve precisa ser usada para transfectar as células hospedeiras. Para a produção de produtos compreendendo tanto cadeias pesadas quanto leves, a linhagem celular pode ser transfectada com dois vetores, um primeiro vetor codificando um polipeptídeo de cadeia leve e um segundo vetor codificando um polipeptídeo de cadeia pesada. Alternativamente, pode ser usado um único vetor, o vetor incluindo sequências codificando polipeptídeos de cadeia leve e de cadeia pesada. Alternativamente, os anticorpos de acordo com a invenção podem ser produzidos por (i) expressão de uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com a invenção em uma célula hospedeira, e (ii) isolamento do produto de anticorpo expressado. Adicionalmente, o método pode in- cluir (iii) purificação do anticorpo isolado. Células B transformadas e células plasmáticas cultivadas podem ser triadas para as células pro-dutoras de anticorpos da especificidade ou função desejada.

[00175] A etapa de triagem pode ser realizada por qualquer imuno- ensaio, por exemplo, ELISA, por tingimento de tecidos ou células (in-cluindocélulas transfectadas), por teste de neutralização ou por um de uma série dos outros métodos conhecidos na técnica para identificar a especificidade ou função desejada. O teste pode selecionar com base em simples reconhecimento de um ou mais antígenos, ou pode selecionar com base adicional em uma função desejada, por exemplo, para selecionar anticorpos neutralizantes ao invés de somente anticorpos de ligação de antígeno, para selecionar anticorpos que podem modifi-carcaracterísticas das células visadas, tais como suas cascatas de sinalização, seu formato, sua taxa de crescimento, sua capacidade de influenciar outras células, sua respost à influência por outras células ou por outros reagentes ou por uma modificação em condições, seu estado de diferenciação, etc.

[00176] Clones de células B transformadas individuais podem ser então produzidos a partir da cultura de células B transformadas positivas. A etapa de clonagem para a separação de clones individuais da mistura de células positivas pode ser realizada usando diluição limitan- te, micromanipulação, deposição de célula única por classificação celular ou outro método conhecido na técnica.

[00177] Ácido nucleico das células plasmáticas cultivadas pode ser isolado, clonado e expressado em células HEK293T ou outras células hospedeiras conhecidas usando métodos conhecidos na técnica.

[00178] Os clones de células B imortalizadas ou as células hospedeiras transfectadas da invenção podem ser usados em vários modos, por exemplo, como uma fonte de anticorpos monoclonais, como uma fonte de ácido nucleico (DNA ou mRNA) codificando um anticorpo mo noclonal de interesse, para pesquisa, etc.

[00179] A invenção também proporciona uma composição compre-endendocélulas de memória B imortalizadas ou células hospedeiras transfectadas que produzem anticorpos de acordo com a presente in-venção.

[00180] O clone de célula B imortalizada ou as células plasmáticas cultivadas da invenção também podem ser usados como uma fonte de ácido nucleico para a clonagem de genes de anticorpos para subse-quenteexpressão recombinante. A expressão de fontes recombinan- tes é mais comum para fins farmacêuticos do que a expressão de células B ou hibridomas, por exemplo, por razões de estabilidade, repro- dutibilidade, facilidade de cultura, etc.

[00181] Portanto a invenção também proporciona um método para preparação de uma célula recombinante, compreendendo as etapas de: (i) obtenção de um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, mRNAs de cadeia pesada e/ou leve) a partir do clone de células B ou das célu-lasplasmáticas cultivadas que codificam o anticorpo de interesse; (ii) inserção do ácido nucleico em um vetor de expressão e (iii) transfec- ção do vetor em uma célula hospedeira de modo a permitir a expressão do anticorpo de interesse naquela célula hospedeira.

[00182] De modo similar, a invenção proporciona um método para a preparação de uma célula recombinante, compreendendo as etapas de: (i) sequenciamento de um ou mais ácidos nucleicos a partir do clone de células B ou das células plasmáticas cultivadas que codificam o anticorpo de interesse; e (ii) utilização da informação de sequência da etapa (i) para preparar um ou mais ácidos nucleicos para inserção em uma célula hospedeira de modo a permitir a expressão do anticorpo de interesse naquela célula hospedeira. O ácido nucleico pode, mas não precisa, ser manipulado entre as etapas (i) e (ii) para introduzir sítios de restrição, para modificar o uso de codons, e/ou para otimizar se- quências reguladoras de transcrição e/ou translação.

[00183] Além do mais, a invenção também proporciona um método de preparação de uma célula hospedeira transfectada, compreendendo a etapa de transfecção de uma célula hospedeira com um ou mais ácidos nucleicos que codificam os referidos anticorpos e fragmentos de anticorpos um anticorpo de interesse, em que os ácidos nucleicos são ácidos nucleicos que foram derivados a partir de um clone de célula B imortalizada ou de uma célula plasmática cultivada da invenção. Portanto os procedimentos para primeiro preparar o um ou mais ácidos nucleicos e em seguida usar este para transfectar uma célula hospedeira podem ser realizazdos em diferentes momentos por diferentes pessoas em diferentes locais (por exemplo, em diferentes países).

[00184] Estas células recombinantes da invenção podem ser então usadas para fins de expressão e cultura. São particularmente úteis para a expressão de anticorpos para produção farmacêutica em larga escala. Também podem ser usados como o ingrediente ativo de uma composição farmacêutica. Pode ser usada qualquer técnica de cultura adequada, incluindo mas não limitada a cultura estática, cultura de frasco rolante, fluido de ascite, cartucho de biorreator do tipo de fibra oca, minifermentador modular, tanque agitado, cultura de microporta- dor, perfusão de núcleo cerâmico, etc.

[00185] Métodos para obter e sequenciar genes de imunoglobulina a partir de células B ou de células plasmáticas são de conhecimento geral na técnica (por exemplo, vide o Capítulo 4 de Kuby Immunology, 4th edition, 2000).

[00186] A célula hospedeira transfectada pode ser uma célula euca- riótica, incluindo células de leveduras e de animais, particularmente células de mamífero (por exemplo, células CHO, células NS0, células humanas tais como células PER.C6 ou HKB-11, células de mieloma), bem como células de plantas. Hospedeiros de expressão preferenciais podem glicosilar o anticorpo da invenção, particularmente com estruturas de carboidrato que não são as próprias imunogênicas em seres humanos. Em uma modalidade, a célula hospedeira transfectada pode ser capaz de crescer em meio livre de soro. Em uma modalidade adi-cional, a célula hospedeira transfectada pode ser capaz de crescer em cultura sem a presença de produtos derivados de animais. A célula hospedeira transfectada também pode ser cultivada para proporcionar uma linhagem celular.

[00187] A invenção também proporciona um método para a preparação de uma ou mais moléculas de ácido nucleico (por exemplo, genes de cadeias pesadas e leves) que codificam um anticorpo de interesse, compreendendo as etapas de: (i) preparação de um clone de célula B imortalizada ou cultura de células plasmáticas de acordo com a invenção; (ii) obtenção, a partir do clone de células B ou das células plasmáticas cultivadas, de ácido nucleico que codifica o anticorpo de interesse. Além disso, a invenção proporciona um método para a obtenção de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um anticorpo de interesse, compreendendo as etapas de: (i) preparação de um clone de célula B imortalizada ou cultura de células plasmáticas de acordo com a invenção; (ii) sequenciamento de ácido nucleico a partir do clone de células B ou das células plasmáticas cultivadas que codificam o anticorpo de interesse.

[00188] A invenção adicionalmente proporciona um método de pre-paração de uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam um anticorpo de interesse, compreendendo a etapa de obtenção do ácido nucleico que foi obtido a partir de um clone de células B transformadas ou das células plasmáticas cultivadas da invenção. Portanto os procedimentos para primeiro obter o clone de células B ou a célula plasmática cultivada, e em seguida obter um ou mais ácidos nucleicos a partir do clone de células B ou das células plasmáticas cultivadas pode ser realizado em diferentes momentos por diferentes pessoas em diferentes locais (por exemplo, em diferentes países).

[00189] A invenção também compreende um método para a preparação de um anticorpo (por exemplo, para utilização farmacêutica) de acordo com a presente invenção, compreendendo as etapas de: (i) obtenção e/ou sequenciamento de um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, genes de cadeias pesadas e leves) a partir do clone de células B selecionado ou das células plasmáticas cultivadas expressando o anticorpo de interesse; (ii) inserção do um ou mais ácidos nucleicos em ou utilização da uma ou mais sequências de um ou mais ácidos nucleicos para prepara\r um vetor de expressão; (iii) transfecção de uma célula hospedeira que pode expressar o anticorpo de interesse; (iv) cultura ou subcultura das células hospedeiras transfectadas sob condições em que o anticorpo de interesse é expressado; e, opcional-mente, (v) purificação do anticorpo de interesse.

[00190] A invenção também proporciona um método de preparação de um anticorpo compreendendo as etapas de: cultura ou subcultura de uma população de células hospedeiras transfectadas sob condições em que o anticorpo de interesse é expressado e, opcionalmente, purificação do anticorpo de interesse, em que a referida população de células hospedeiras transfectadas foi preparada por (i) provimento de um ou mais ácidos nucleicos codificando um anticorpo de interesse selecionado que é produzido por um clone de células B ou por células plasmáticas cultivadas preparadas conforme descrito acima, (ii) inserção do um ou mais ácidos nucleicos em um vetor de expressão, (iii) transfecção do vetor em uma célula hospedeira que pode expressar o anticorpo de interesse, e (iv) cultura ou subcultura da célula hospedeira transfectada compreendendo os ácidos nucleicos inseridos para produzir o anticorpo de interesse. Portanto os procedimentos para primeiro preparar a célula hospedeira recombinante e em seguigad culti var a mesma para expressar anticorpo podem ser realizados em mo-mentos muito diferentes por diferentes pessoas em diferentes locais (por exemplo, em diferentes países).

Epitopos

[00191] Conforme mencionado acima, os anticorpos da invenção podem ser usados para mapear os epitopos aos quais eles se ligam. A invenção proporciona anticorpos, os quais se ligam a epitopos conhecidos e anticorpos, os quais se ligam a novos epitopos sobre a proteína G do RABV (glicoproteína G). Estes epitopos da proteína G do RABV e exemplos de anticorpos, os quais se ligam a cada um dos epitopos, são descritos em detalhes nos Exemplos 3 e 5, e mais especificamente dizendo respeito à conservação dos sítios antigênicos I e III sobre a proteína G do RABV no Exemplo 6.

[00192] Em geral, os epitopos aos quais os anticorpos da invenção se ligam podem ser lineares (contínuos) ou conformacionais (descontínuos). Em uma modalidade preferencial, os anticorpos e fragmentos de anticorpos da invenção se ligam a um epitopo conformacional. Também é preferencial que o epitopo conformacional esteja presente somente sob condições não redutoras.

[00193] A saber, foi demonstrado previamente que os dois anticorpos de referência CR57 e CR4098 reconhecem os sítios antigênicos I e III da proteína G do RABV (Bakker, A. B. H. et al., J Virol 79, 90629068, 2005), respectivamente. Os anticorpos de exemplo de acordo com a presente invenção podem ser agrupados em 6 grupos. RVA125, RVC3, RVC20 e RVD74 se ligam ao grupo do sítio antigênico I. Digno de nota, a ligação de anticorpos do sítio antigênico I à proteína G é reforçada por um subgrupo de anticorpos não do sítio antigênico I. RVA122, RVA144, RVB492, RVC4, RVC69, RVC38 e RVC58 se ligam ao sítio antigênico III, por meio do quê o epitopo RVC58 pode se sobrepor somente parcialmente com sítio antigênico III. Um terceiro gru- po composto pelos anticorpos RVB181, RVC56, RVB185, RVC21, RVB161 e RVC111 liga ao sítio antigênico III.2, o qual provavelmente é proximal ao sítio antigênico III sobre a proteína G. Três sítios adicionais foram definidos, denominados A, B e C. O sítio A é definido pelo único anticorpo RVB686, por meio do quê a ligação de RVB686 pode induzir um efeito alostérico sobre a proteína G que compromete a ligação da maior parte dos outros anticorpos. O sítio B é definido pelo anticorpo RVC44. De modo similar, o sítio C é definido pelos anticorpos RVB143 e RVC68, os quais também reconhecem um epitopo único e distinto comparado com todos os outros anticorpos. Digno de nota, RVC44, RVB143 e RVC68 são os únicos anticorpos deste painel capazes de ligação à proteína G sob condições redutoras, sugerindo que reconhecem um epitopo linear sobre a proteína G do RABV.

[00194] Os polipeptídeos que se ligam aos anticorpos da presente invenção podem ter uma série de usos. Os polipeptídeos e variantes de polipeptídeos dos mesmos em forma purificada ou sintética podem ser usados para dar origem a respostas imunes (isto é, como uma vacina, ou para a produção de anticorpos para outras usos) ou para triagem de soros para anticorpos que imunorreagem com o epitopo ou mimótopes dos mesmos. Em uma modalidade os referidos polipeptí- deos ou variantes de polipeptídeos, ou antígeno compreendendo os referidos polipeptídeos ou variantes de polipeptídeos podem ser usados como uma vacina para dar origem a uma resposta imune que compreende anticorpos da mesma qualidade que os descritos na presente invenção.

[00195] Além do mais, a presente invenção também se refere à utilização do anticorpo, ou do fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, para o monitoramento da qualidade de vacinas de lissavírus anti-RABV e/ou anti-não RABV verificando se o antígeno da vacina referida contém o epitopo específico na conformação correta.

[00196] Os anticorpos e fragmentos de anticorpos da invenção também podem ser usados em um método de monitoramento da qualidade de vacinas. Em particular os anticorpos podem ser usados para verificar que o antígeno em uma vacina contém o epitopo imunogênico correto na conformação correta. A utilização de um anticorpo da invenção, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, para o monitoramento da qualidade de uma vacina contra lissavírus RABV e/ou não RABV, por exemplo, verificando que o antígeno da vacina referida contém o epitopo específico na conformação correta também é contemplada como estando dentro do âmbito da invenção.

[00197] Os polipeptídeos que se ligam aos anticorpos da presente invenção também pode ser útil em triagem para ligantes que ligam aos polipeptídeos referidos. Os ligantes referidos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos; incluindo os de camelos, tubarões e outras es-pécies, fragmentos de anticorpos, peptídeos, produtos de tecnologia de display de fago, aptâmeros, adnectinas ou fragmentos de outras proteínas virais ou celulares, podem bloquear o epitopo e portanto prevenir infecção. Os ligantes referidos são englobados dentro do âmbito da invenção.

Composições farmacêuticas

[00198] A invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos da invenção; o ácido nucleico codificando os anticorpos ou fragmentos referidos; o vetor codificando os ácidos nucleicos; a célula expressando o anticorpo ou compreendendo o vetor; ou o polipeptídeo imunogênico reconhecido pelos anticorpos ou pelo fragmento de ligação de antígeno da invenção. A composição farmacêutica também pode conter um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. De modo preferencial, a composição farmacêutica compreende o anticor- po, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção, o vetor de acordo com a presente invenção, a célula de acordo com a presente invenção, ou o polipeptídeo imunogênico de acordo com a presente invenção, e um excipiente, diluente ou veículo farma- ceuticamente aceitável.

[00199] Embora o veículo ou excipiente possa facilitar a administração, não deve o próprio induzir a produção de anticorpos prejudicial para o indivíduo recebendo a composição. Nem deve ser tóxico. Veículos adequados podem ser macromoléculas grandes, lentamente me- tabolizadas tais como proteínas, polipeptídeos, lipossomas, polissaca- rídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméri- cos, copolímeros de aminoácidos e partículas de vírus inativos.

[00200] Podem ser usados sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, sais de ácidos minerais, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos.

[00201] Veículos farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem adicionalmente conter líquidos tais como água, salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes ou substâncias de tam- ponamento de pH, podem estar presentes em semelhantes composições. Os veículos referidos permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas semifluidas e suspensões, para ingestão pelo sujeito.

[00202] As composições da invenção podem ser preparadas em várias formas. Por exemplo, as composições podem ser preparadas como injetáveis, ou como soluções ou suspensões líquidas. Formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, veículos líqui- dos antes da injeção também podem ser preparadas (por exemplo, uma composição liofilizada, como Synagis™ e Herceptin™, para re-constituição com água estéril contendo um conservante). A composição pode ser preparada para administração tópica, por exemplo, como uma pomada, um creme ou um pó. A composição pode ser preparada para administração oral, por exemplo, como um comprimido ou uma cápsula, como um spray, ou como um xarope (opcionalmente aromatizado). A composição pode ser preparada para administração pulmonar, por exemplo, como um inalante, usando um pó fino ou um spray. A composição pode ser preparada como um supositório ou pessário. A composição pode ser preparada para administração nasal, aural ou ocular, por exemplo, como gotas. A composição pode estar em forma de kit, projetada de tal modo que uma composição combinada é re-constituída logo antes da administração a um sujeito. Por exemplo, um anticorpo liofilizado pode ser proporcionado em forma de kit com água estéril ou um tampão estéril.

[00203] Deve ser reconhecido que o ingrediente ativo na composição vai ser uma molécula de anticorpo, um fragmento de anticorpo ou variantes e derivados dos mesmos. Como tal, vai ser suscetível a degradação no trato gastrointestinal. Portanto, se a composição for para ser administrada por uma via usando o trato gastrointestinal, a composição vai precisar conter agentes os quais protejam o anticorpo contra degradação mas os quais liberem o anticorpo assim que tenha sido absorvido a partir do trato gastrointestinal.

[00204] Uma completa discussão de veículos farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 0683306472.

[00205] As composições farmacêuticas da invenção de modo geral têm um pH entre 5,5 e 8,5, em algumas modalidades este pode ser entre 6 e 8, e em outras modalidades de cerca de 7. O pH pode ser mantido pela utilização de um tampão. A composição pode ser estéril e/ou livre de pirogênio. A composição pode ser isotônica com respeito aos seres humanos. Em uma modalidade, as composições farmacêuticas da invenção são supridas em recipientes selados hermeticamente.

[00206] Dentro do escopo da invenção estão composições presentes em várias formas de administração; as formas incluem, mas não estão limitadas a, as formas adequadas para administração parenteral, por exemplo, por injeção ou infusão, por exemplo, por injeção de pílula grande ou infusão contínua. Onde o produto é para injeção ou infusão, pode tomar a forma de uma suspensão, de uma solução ou de uma emulsão em um veículo oleoso ou aquoso e pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, conservantes, estabili- zantes e/ou dispersantes. Alternativamente, a molécula de anticorpo pode estar em forma a seco, para reconstituição antes da utilização com um líquido estéril apropriado. Um veículo é tipicamente entendido como sendo um material que é adequado para armazenar, transportar, e/ou administrar um composto, tal como um composto farmaceutica- mente ativo, em particular os anticorpos de acordo com a presente invenção. Por exemplo, o veículo pode ser um líquido fisiologicamente aceitável, o qual é adequado para armazenar, transportar, e/ou administrar um composto farmaceuticamente ativo, em particular os anticorpos de acordo com a presente invenção. Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao sujeito. Em uma modalidade as composições são adaptadas para administração a sujeitos mamíferos, por exemplo, humanos.

[00207] As composições farmacêuticas desta invenção podem ser administradas por qualquer número de vias incluindo, mas não limitadas a, vias oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutânea, tópica, subcutânea, intranasal, enteral, sublingual, intravaginal ou retal. Hiposprays também podem ser usados para administrar as composições farmacêuticas da invenção. Tipicamente, as composições terapêuticas podem ser preparadas como injetáveis, ou como soluções ou suspensões líquidas. Além disso, podem ser preparadas formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão, em veículos líquidos antes da injeção.

[00208] A liberação direta das composições de modo geral vai ser realizada por injeção, por via subcutânea, por via intraperitoneal, por via intravenosa ou por via intramuscular, ou liberada para o espaço intersticial de um tecido, por meio do quê injeção por via intravenosa ou por via intramuscular são preferenciais e injeção por via intramuscular é mais preferencial. As composições também podem ser administradas dentro de uma lesão. De modo particularmente preferencial, a composição de acordo com a presente invenção é administrado de modo similar para imunoglobulinas da raiva conhecidas (RIGs) em pro-filaxiapós-exposição. Por exemplo, a OMS recomenda administrar toda a RIG, ou tanto quanto anatomicamente possível de modo a evitar possível síndrome compartimental, dentro ou em torno do sítio ou sítios do ferimento (por exemplo, o sítio da mordida). A imunoglobulina remanescente, se houver, deve ser injetada por via intramuscular em um sítio distante do sítio da administração da vacina (cf. http://www.who.int/rabies/human/WHO_strategy_prepost_exposure/en/ index1.html#, recuperado em 12 de novembro de 2014). Por conseguinte, este método de administração também é particularmente preferencial para o anticorpo e a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, pelo menos em profilaxia pós-exposição e possi-velmentetambém em tratamento ou outras aplicações.

[00209] A dosagem do tratamento pode ser um esquema de dose única ou um esquema de múltiplas doses. Os produtos farmacêuticos à base de anticorpos conhecidos proporcionam orientação quanto à frequência de administração, por exemplo, se um produto farmacêutico deve ser administrado diariamente, semanalmente, mensalmente, etc. A frequência e a dosagem também podem depender da gravidade dos sintomas. Em particular, o esquema de tratamento para as imunoglo- bulinas da raiva proporciona orientação quanto à frequência de admi-nistração. Para as RIGs, recomenda-se em profilaxia pós-exposição administrar a RIG para imunização passiva somente uma vez, de modo preferencial no início da vacinação pós-exposição, ou tão logo possível depois do início da vacinação pós-exposição. Por conseguinte, este esquema de tratamento também é particularmente preferencial para o anticorpo e a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, pelo menos em profilaxia pós-exposição. Em aplicações mais gerais, isto é, para todas as aplicações, é preferencial que o anticorpo ou a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção seja administrado em um esquema de dose única, isto é, somente uma única dose. Por conseguinte, a composição farmacêutica de modo preferencial é proporcionada como um produto de dose única, isto é, como um produto o qual compreende somente uma única dose. No entanto, como a dose pode depender do peso corporal, em semelhantes casos uma dose correspondente a um peso corporal máximoé considerada como “dose única”.

[00210] Em particular, é preferencial que a quantidade do anticorpo, ou do fragmento de ligação de antígeno do mesmo, na composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, não exceda 100 mg, de modo preferencial não exceda 50 mg, de modo mais preferencial não exceda 20 mg, de modo ainda mais preferencial não exceda 10 mg, e de modo particularmente preferencial não exceda 5 mg. Esta quantidade de anticorpo de modo preferencial se refere a uma única dose conforme descrito acima. A dose do anticorpo de acordo com a presente invenção, a qual é eficaz, por exemplo, em profilaxia pós- exposição, é portanto muito baixa, ao passo que a quantidade reco-mendada de HRIG é de 20 UI/kg de peso corporal, para ERIG e F(ab’)2 é ainda de 40 UI/kg de peso corporal. Uma quantidade baixa similar do anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser produzida e formulada em uma forma estável (isto é, formulação liofiliza- da, onde, por exemplo, estudos anteriores mostraram que anticorpos monoclonais preservados por liofilização são estáveis por 33 meses a 40°C e 5 meses a 50°C) e em um custo acessível também para os países em desenvolvimento.

[00211] No entanto, o anticorpo ou a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção também pode ser administrado em mais de uma dose, por exemplo, em casos graves, por exemplo, em protocolos de tratamento.

[00212] De modo preferencial, a composição de acordo com a invenção é administrada a um sujeito depois de ter ocorrido uma infecção com um lissavírus RABV e/ou um lissavírus não RABV.

[00213] As composições farmacêuticas vão incluir uma quantidade eficaz de um ou mais anticorpos da invenção e/ou um polipeptídeo compreendendo um epitopo que liga um anticorpo da invenção, isto é, uma quantidade que é suficiente para tratar, melhorar, atenuar ou pre-venir uma doença ou condição desejada, ou para apresentar um efeito terapêutico detectável. Efeitos terapêuticos também incluem redução ou atenuação na potência patogênica ou nos sintomas físicos. A quantidade eficaz precisa para qualquer sujeito em particular vai depender de seu tamanho, do peso, e da saúde, da natureza e da extensão da condição, e dos terapêuticos ou da combinação de terapêuticos selecionados para administração. A quantidade eficaz para uma dada situação é determinada por experimentação de rotina e está dentro do critério de um clínico. Para os fins da presente invenção, uma dose efi- caz de modo geral vai ser de a partir de cerca de 0,005 a cerca de 100 mg/kg, de modo preferencial a partir de cerca de 0,0075 a cerca de 75 mg/kg, de modo mais preferencial a partir de cerca de 0,01 a cerca de 60 mg/kg, de modo ainda mais preferencial a partir de cerca de 0,03 a cerca de 50 mg/kg do anticorpo da presente invenção no indivíduo ao qual é administrado.

[00214] De modo preferencial, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção compreende pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, de acordo com a presente invenção, em que os dois anticorpos, ou os fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, ligam especificamente a diferentes epitopos sobre a glicoproteína G do RABV. Por exemplo, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção compreende um primeiro anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, e um segundo anticorpo, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, em que o primeiro anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, se liga especificamente a outro epitopo sobre a glicoproteína G do RABV do que o segundo anticorpo ou o segundo fragmento de ligação de antígeno do mesmo.

[00215] Isto é, os dois anticorpos de acordo com a presente invenção se ligam especificamente à proteína G do RABV, mas a diferentes epitopos sobre a proteína G do RABV. Por exemplo, um anticorpo pode se ligar especificamente ao sítio antigênico I sobre a proteína G do RABV e um anticorpo adicional pode ser ligar especificamente a um epitopo sobre a glicoproteína G do RABV, o qual pelo menos se sobrepõe parcialmente com o sítio antigênico III sobre a glicoproteína G do RABV. Os sítios antigênicos dos anticorpos de exemplo de acordo com a presente invenção são esboçados no Exemplo 3. Além do mais, se dois anticorpos sel igam ao mesmo epitopo ou a diferentes epitopos sobre a proteína G do RABV pode ser facilmente determinado por uma pessoa versada na técnica, por exemplo, por meio do uso de qualquer estudo de competição, por meio do quê um exemplo de um estudo de competição é mostrado no Exemplo 3.

[00216] De modo preferencial, um anticorpo entre os pelo menos dois anticorpos compreendidos por uma composição farmacêutica semelhante de acordo com a presente invenção se liga (especificamente) ao sítio antigênico I sobre a glicoproteína G do RABV e outro anticorpo entre os pelo menos dois anticorpos compreendidos por uma composição farmacêutica semelhante de acordo com a presente invenção se liga (especificamente) ao sítio antigênico III sobre a glico- proteína G do RABV.

[00217] De modo mais preferencial, pelo menos um entre os pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos compreendidos por uma composição farmacêutica semelhante de acordo com a presente invenção compreende uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica à SEQ ID NO: 95 ou à SEQ ID NO: 167.

[00218] Em uma composição farmacêutica preferencial de acordo com a presente invenção, um entre os pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos compreende (i) se-quências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 97 e 99 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 96 e 98 a 99, respectivamente ou (ii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 169 e 171 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 168 e 170 a 171, respectivamente. De modo mais preferencial, um entre os pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos compreende uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, de identidade de sequência com a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 107 ou de SEQ ID NO: 179.

[00219] Em uma composição farmacêutica particularmente preferencial de acordo com a presente invenção compreendendo pelo menos dois anticorpos de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, um entre os pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos compreende uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica à SEQ ID NO: 95 e em que outro entre os pelo menos dois anticorpos compreende uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica à SEQ ID NO: 167. De modo preferencial, um entre os pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos compreende sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 97 e 99 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 96 e 98 a 99, respectivamente, e outro entre os pelo menos dois anticorpos compre-endesequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 169 e 171 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 168 e 170 a 171, respectivamente. De modo mais preferencial, um entre os pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos é de acordo com gRVC20 e em que outro entre os pelo menos dois anticorpos é de acordo com gRVC58.

[00220] Um exemplo particularmente preferencial de dois anticorpos de acordo com a presente invenção, os quais ligam especificamente a diferentes epitopos sobre a glicoproteína G do RABV, é RVC20 e RVC58.

[00221] Além do mais, a composição farmacêutica também pode conter mais de dois, por exemplo, 3, 4, 5, 6, etc., anticorpos de acordo com a presente invenção, por meio do quê pelo menos dois, de modo preferencial mais de dois, de modo mais preferencial todos os anticorpos contidos, se ligam a diferentes epitopos sobre a proteína G do RABV.

[00222] De modo preferencial, os (pelo menos) dois anticorpos de acordo com a presente invenção estão presentes na composição farmacêutica em quantidades equimolares, de modo preferencial como uma mistura equimolar.

[00223] A combinação de dois dos anticorpos referidos de acordo com a presente invenção, os quais se ligam a diferentes epitopos da proteína G do RABV representa um tratamento com uma amplitude de reatividade imprecedente e com risco reduzido de fuga de seleção de mutante. Em particular, uma combinação de dois ou mais anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção, por meio do quê os anticorpos se ligam a alguns diferentes epitopos ou sítios sobre a proteína G do RABV, aumento o efeito de proteção e previne a fuga de variantes resistentes do vírus.

[00224] De modo preferencial, as composições podem incluir dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, etc.) anticorpos da invenção proporci-onando um efeito terapêutico aditivo ou sinérgico. O termo “sinergia” é usado para descrever um efeito combinado de dois ou mais agentes ativos que é maior do que a soma dos efeitos individuais de cada agente ativo respectivo. Deste modo, onde o efeito combinado de dois ou mais agentes resulta em “inibição sinérgica” de uma atividade ou de um processo, entende-se que a inibição da atividade ou do processo é maior do que a soma dos efeitos inibitórios de cada agente ativo respectivo. O termo “efeito terapêutico sinérgico” se refere a um efeito terapêutico observado com uma combinação de duas ou mais terapias em que o efeito terapêutico (conforme medido por qualquer um de uma série de parâmetros) é maior do que a soma dos efeitos terapêuticos individuais observados com as terapias individuais respectivas.

[00225] Em outra modalidade, a composição pode compreender um ou mais (por exemplo, 2, 3, etc.) anticorpos da invenção e um ou mais (por exemplo, 2, 3, etc.) anticorpos adicionais contra um lissavírus RABV e/ou um lissavírus não RABV. Além disso, a administração dos anticorpos da invenção junto com anticorpos específicos para outros patógenos está dentro do âmbito da invenção. Os anticorpos da invenção podem ser administrados ou combinados / simultaneamente ou em momentos separados dos anticorpos específicos para patógenos diferentes de um lissavírus RABV e/ou de um lissavírus não RABV.

[00226] Em outra modalidade, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais anticorpos, em que o primeiro anticorpo é um anticorpo da invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, e o segundo anticorpo é específico para um patógeno diferente que pode ter coinfectado o sujeito ao qual a composição farmacêutica está sendo administrada.

[00227] Em uma modalidade particularmente preferencial, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é adminis- trado em combinação com uma vacina contra a raiva (imunização ativa), em particular em profilaxia pós-exposição. As vacinas da raiva atualmente disponíveis incluem as vacinas de tecido nervoso mais amplamente usadas porém altamente propensas a risco, ou as vacinas mais seguras porém mais caras de cultura celular e ovo embrio- nado (CCEEVs). Na Alemanha, por exemplo, somente estão no mercado duas vacinas antirrábicas, Rabipur® e “Tollwut-Impfstoff (célula diploide humana [HDC]) inaktiviert”. Estas vacinas contêm o vírus da raiva inativado. Ambas as vacinas são recomendadas para utilização pré- e pós-exposição. Outor exemplo de uma vacina contra a raiva é Imovax (Sanofi-Pasteur), a qual é uma vacina comercial inativada de célula diploide humana. Em geral as vacinas da raiva são administradas de acordo com as informações do fabricante, por meio do quê um protocolo de profilaxia pós-exposição típico inclui a administração da vacina nos dias 0, 3, 7, 14 e 28 depois da infecção. A composição farmacêutica de acordo com a invenção (imunização passiva) de modo preferencial é administrada somente uma vez, de modo preferencial simultaneamente ou tão logo possível depois do início da vacinação. De modo preferencial, a composição farmacêutica de acordo com a invenção é administrada em um sítio distante da vacina.

[00228] Exemplos de anticorpos da invenção específicos para, e que neutralizam os lissavírus RABV e/ou não RABV incluem, mas não estão limitados a, RVA122, RVA144, RVB185, RVB492, RVC3, RVC20, RVC21, RVC38, RVC44, RVC58, RVC68, e RVC111.

[00229] A combinação, em particular uma combinação equimolar, de anticorpos de acordo com gRVC20 e gRVC58, de modo mais preferencial os anticorpos RVC20 e RVC58, é particularmente preferencial. RVC20 se liga ao sítio antigênico I da proteína G do RABV e RVC 58 se liga a um epitopo sobre a glicoproteína G do RABV, o qual pelo menos se sobrepõe parcialmente com o sítio antigênico III sobre a gli- coproteína G do RABV. Deste modo, é preferencial uma composição farmacêutica compreendendo os anticorpos RVC58 e RVC20 ou um fragmento de ligação de antígeno dos mesmos, de modo preferencial em quantidades equimolares, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00230] Além do mais, também é preferencial uma composição far-macêutica compreendendo o anticorpo de acordo com gRVA122 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farma- ceuticamente aceitável. Também é preferencial uma composição far-macêutica compreendendo o anticorpo de acordo com gRVA144 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farma- ceuticamente aceitável. Também é preferencial uma composição far-macêutica compreendendo o anticorpo de acordo com gRVB185 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farma- ceuticamente aceitável. Também é preferencial uma composição far-macêutica compreendendo o anticorpo de acordo com gRVB492 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farma- ceuticamente aceitável. Também é preferencial uma composição far-macêutica compreendendo o anticorpo de acordo com gRVC3 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceuti- camente aceitável. Também é preferencial uma composição farmacêu-tica compreendendo o anticorpo de acordo com gRVC20 ou um frag-mento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceutica- mente aceitável. Também é preferencial uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de acordo com gRVC21 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceutica- mente aceitável. Também é preferencial uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de acordo com gRVC38 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceutica- mente aceitável. Também é preferencial uma composição farmacêuti- ca compreendendo o anticorpo de acordo com gRVC44 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceutica- mente aceitável. Também é preferencial uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de acordo com gRVC58 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceutica- mente aceitável. Também é preferencial uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de acordo com gRVC68 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceutica- mente aceitável. Também é preferencial uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de acordo com gRVC111 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceutica- mente aceitável.

[00231] Além disso, também é preferencial uma composição farma-cêutica compreendendo o anticorpo RVA122 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitá-vel.Também é preferencial uma composição farmacêutica compreen-dendo o anticorpo RVA144 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Também é pre-ferencial uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo RVB185 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um ve-ículo farmaceuticamente aceitável. Também é preferencial uma com-posição farmacêutica compreendendo o anticorpo RVB492 ou um fra-gmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceuti- camente aceitável. Também é preferencial uma composição farmacêu-tica compreendendo o anticorpo RVC3 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Também é preferencial uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo RVC20 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Também é preferencial uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo RVC21 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farma- ceuticamente aceitável. Também é preferencial uma composição far-macêutica compreendendo o anticorpo RVC38 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceuticamente acei-tável. Também é preferencial uma composição farmacêutica compre-endendo o anticorpo RVC44 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Também é pre-ferencial uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo RVC58 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Também é preferencial uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo RVC68 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceutica- mente aceitável. Também é preferencial uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo RVC111 variante 3 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável também é preferencial.

[00232] Os anticorpos podem ser administrados aos sujeitos os quais não tenham apresentado previamente nenhuma resposta, isto é, tenha sido demonstrado que são refratários ao tratamento para a infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV. O tratamento referido pode incluir tratamento prévio com um agente antiviral. Isto pode ser devido, por exemplo, a infecção com uma cepa de lissavírus RABV e/ou não RABV resistente a antiviral.

[00233] Em uma modalidade, uma composição da invenção pode incluir os anticorpos da invenção, em que os anticorpos podem compor pelo menos 50% em peso (por exemplo, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais) da proteína total na composição. Em uma composição semelhante, os anticorpos estão em forma purificada.

[00234] A invenção proporciona um método de preparação de uma composição farmacêutica compreendendo as etapas de: (i) preparação de um anticorpo da invenção; e (ii) mistura do anticorpo purificado com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[00235] Em outra modalidade, um método de preparação de uma composição farmacêutica compreende a etapa de: mistura de um anti-corpo com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal que foi obtido a partir de uma célula B transformada ou de uma célula plasmática cultivada da invenção. Deste modo os procedimentos para primeiro obtenção do anticorpo monoclonal e em seguida preparação do produto farmacêutico podem ser realizados em momentos muito diferentes por pessoas diferentes em locais diferentes (por exemplo, em países diferentes).

[00236] Como uma alternativa à liberação de anticorpos ou células B para fins terapêuticos, é possível liberar ácido nucleico (tipicamente DNA) que codifica o anticorpo monoclonal (ou fragmento ativo do mesmo) de interesse derivado a partir da célula B ou das células plasmáticas cultivadas a um sujeito, de tal modo que o ácido nucleico possa ser expressado no sujeito in situ para proporcionar um efeito terapêutico desejado. Vetores de liberação de ácido nucleico e terapia genética adequados são conhecidos na técnica.

[00237] As composições da invenção podem ser composições imu- nogênicas, e em algumas modalidades podem ser composições de vacina compreendendo um antígeno compreendendo um epitopo re-conhecido por um anticorpo da invenção ou por um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, em particular composições farmacêuticas da invenção, as quais compreendem um polipeptídeo imunogênico de acordo com a invenção. As “vacinas” referidas de acordo com a invenção podem ser ou profiláticas (isto é, prevenir a infecção) ou terapêuticas (isto é, tratar ou melhorar a infecção). As composições de vacina da invenção podem provocar tanto uma resposta imune celular bem como uma resposta imune humoral de modo a tratar de modo eficaz infecção pelo lissavírus RABV e não RABV. Esta resposta imune pode induzir anticorpos de longa ação (por exemplo, neutralizantes) e uma imunidade celular que pode responder rapidamente depois da exposição ao lissavírus RABV e/ou não RABV.

[00238] As composições podem incluir um antimicrobiano, particu-larmente se acondicionadas em um formato de múltiplas doses. Podem compreender detergente por exemplo, um Tween (polissorbato), tal como Tween 80. Os detergentes geralmente estão presentes em baixos níveis, por exemplo, menos de 0,01%. As composições também podem incluir sais de sódio (por exemplo, cloreto de sódio) para proporcionar tonicidade. Uma concentração de 10±2 mg/ml de NaCl é típica.

[00239] Além disso, as composições podem compreender um álcool de açúcar (por exemplo, manitol) ou um dissacarídeo (por exemplo, sacarose ou trealose) por exemplo, em torno de 15 a 30 mg/ml (por exemplo, 25 mg/ml), particularmente se tiverem de ser liofilizadas ou se incluírem material o qual tenha sido reconstituído a partir de material liofilizado. O pH de uma composição para liofilização pode ser ajustado para entre 5 e 8, ou entre 5,5 e 7, ou em torno de 6,1 antes da liofilização.

[00240] As composições da invenção também podem compreender um ou mais agentes imunorreguladores. Em uma modalidade, um ou mais dos agentes imunorreguladores incluem um adjuvante. Kit de partes

[00241] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um kit de partes compreendendo pelo menos um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, pelo menos um ácido nucleico de acordo com a presente invenção confor- me descrito aqui, neste requerimento de patente, pelo menos um vetor de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste re-querimento de patente, pelo menos uma célula de de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de pa-tente, pelo menos um polipeptídeo imunogênico de acordo com a pre-sente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, e/ou pelo menos uma composição farmacêutica de acordo com a pre-sente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.

[00242] De modo preferencial, um kit de partes semelhante compreende pelo menos dois diferentes anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, em que os anticorpos, ou os fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, ligam especificamente a diferentes epitopos sobre a glicoproteína G do RABV. Um kit de partes semelhante é particularmente útil para a combinação de dois anticorpos de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Os pelo menos dois anticorpos podem estar presentes no kit de partes como entidades separadas ou combinadas, por exemplo, como uma mistura, por exemplo, se ambos os anticorpos estiverem contidos na mesma composição farmacêutica. De modo preferencial, os pelo menos dois diferentes anticorpos são entidades separadas no kit de partes, as quais podem ser misturadas pelo usuário cado necessário. Além disso é preferencial que os pelo menos dois diferentes anticorpos sejam combinados, por exemplo, como uma mistura, por exemplo, se ambos os anticorpos estiverem contidos na mesma composição farmacêutica.

[00243] De modo preferencial, em um kit de partes semelhante um anticorpo entre os pelo menos dois anticorpos se liga ao sítio antigêni- co I sobre a glicoproteína G do RABV e outro anticorpo entre os pelo menos dois anticorpos se liga ao sítio antigênico III sobre a glicoprote- ína G do RABV.

[00244] Também é preferencial em um kit de partes semelhante que pelo menos um entre os pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos compreenda uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que seja pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica à SEQ ID NO: 95 ou à SEQ ID NO: 167. De modo mais preferencial, em um kit de partes semelhante pelo menos um entre os pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos compreende (i) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 97 e 99 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 96 e 98 a 99, respectivamente ou (ii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 169 e 171 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 168 e 170 a 171, respectivamente. De modo ainda mais preferencial, em um kit de partes semelhante um entre os pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos compreende uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, de identidade de sequência com a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 107 ou de SEQ ID NO: 179.

[00245] De modo preferencial, um entre os pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos compreende uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica à SEQ ID NO: 95 e outro entre os pelo menos dois anti-corpos compreende uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica à SEQ ID NO: 167. De modo mais preferencial, em um kit de partes semelhante um entre os pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos compreende sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 97 e 99 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 96 e 98 a 99, respectivamente, e outro entre os pelo menos dois anticorpos compreende sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 169 e 171 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 168 e 170 a 171, respectivamente. De modo ainda mais preferencial, em um kit de partes semelhante um entre os pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos é de acordo com gRVC20 e em que outro entre os pelo menos dois anticorpos é de acordo com gRVC58. Tratamentos e Usos Medicinais

[00246] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona a utilização de um anticorpo, ou de um fragmento de ligação de antí- geno do mesmo, de acordo com a presente invenção, do ácido nuclei- co de acordo com a presente invenção, do vetor de acordo com a presente invenção, da célula de acordo com a presente invenção, do poli- peptídeo imunogênico de acordo com a presente invenção, ou da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção em (i) profilaxia, em particular profilaxia pós-exposição, tratamento ou atenu-ação de infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV; em (ii) vacinação contra infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV; ou em (iii) diagnóstico de infecção pelo lissavírus RABV e/ou por outro lissavírus.

[00247] De modo preferencial, os anticorpos e fragmentos de anticorpos da invenção ou derivados e variantes dos mesmos podem ser usados para a profilaxia pós-exposição e para o tratamento ou atenuação de infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV, isto é, infecção pelo lissavírus RABV ou infecção pelo lissavírus não RABV ou co- infecção com ambos os lissavírus RABV e não RABV; para a prevenção de infecção pelo lissavírus RABV e/ou não RABV; ou para o diagnóstico de infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV. De modo preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção pode ser usado na profilaxia pós-exposição, no tratamento ou na atenuação de infecção pelo lissa- vírus RABV e/ou não RABV.

[00248] Uma combinação de dois ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção, por exemplo, uma combinação de 2, 3, 4, 5, 6, 7 etc. anticorpos de acordo com a presente invenção, é particularmente preferencial para a utilização em (i) profilaxia, em particular profilaxiapós-exposição, tratamento ou atenuação de infecção por lissaví- rus RABV e/ou não RABV; e em (ii) vacinação contra infecção por lis- savírus RABV e/ou não RABV. Uma combinação semelhante pode ser, por exemplo, uma terapia de combinação conforme descrito abaixo.Além do mais, é preferencial a administração dos dois ou mais anticorpos em quantidades equimolares. Em particular, é preferencial uma combinação de dois anticorpos compreendendo as seis regiões de CDRs de acordo com RVC20 e RVC58, respectivamente, é mais preferencial uma combinação de dois anticorpos de acordo com gRVC20 e gRVC58, e é particularmente preferencial uma combinação dos anticorpos RVC20 e RVC58.

[00249] Além do mais, em uma combinação semelhante de dois ou mais anticorpos é preferencial que pelo menos dois, de modo preferencial mais de dois, de modo mais preferencial todos os anticorpos combinados, se liguem a diferentes epitopos sobre a proteína G do RABV conforme descrito acima. Por exemplo, um primeiro anticorpo na combinação pode se ligar especificamente a sítio antigênico I sobre a proteína G do RABV e um segundo anticorpo pode se ligar especifi-camente a um epitopo sobre a glicoproteína G do RABV, o qual pelo menos se sobrepõe parcialmente com o sítio antigênico III sobre a gli- coproteína G do RABV. Os sítios antigênicos dos anticorpos de exemplo de acordo com a presente invenção são esboçados no Exemplo 3. Além do mais, se dois ou mais anticorpos se ligam ao mesmo epitopo ou a diferentes epitopos sobre a proteína G do RABV pode ser facilmente determinado por uma pessoa versada na técnica, por exemplo, por utilização de qualquer estudo de competição, por meio do quê um exemplo de um estudo de competição é mostrado no Exemplo 3. Um exemplo particularmente preferencial de uma combinação de dois ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção é uma combinação de anticorpos de acordo com gRVC20 e gRVC58, de modo preferencial RVC20 e RVC58. Além do mais, uma combinação de dois ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção pode incluir, por exemplo, qualquer combinação de dois ou mais anticorpos de acordo com gRVA122, gRVA144, gRVB185, gRVB492, gRVC3, gRVC20, gRVC21, gRVC38, gRVC44, gRVC58, gRVC68, e gRVC111, de modo preferencial qualquer combinação de dois ou mais de RVA122, RVA144, RVB185, RVB492, RVC3, RVC20, RVC21, RVC38, RVC44, RVC58, RVC68, e RVC111.

[00250] De modo preferencial, os dois ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção são administrados em combinação em quan- tidades equimolares.

[00251] Uma “combinação de (dois ou mais) anticorpos” conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a qualquer combinação, por exemplo, os dois ou mais anticorpos podem estar contidos em uma composição farmacêutica, ou, de modo preferencial, os dois ou mais anticorpos são administrados como terapia de combinação, em particular podem ser administrados separadamente uns dos outros, por exemplo, em preparações de anticorpos separadas, por exemplo, em composições farmacêuticas separadas. Isto significa que na combinação de modo preferencial pelo menos um dos anticorpos combinados, de modo mais preferencial 2, 3, 4, 5, ou 6 dos anticorpos combinados, de modo mais preferencial cada um dos anticorpos combinadosé / são administrados separadamente. Na terapia de combinação, os anticorpos da invenção podem ser administrados ou combinados / simultaneamente ou consecutivamente, isto é, um anticorpo depois do outro.

[00252] Em outra modalidade, a combinação pode compreender um ou mais (por exemplo, 2, 3, etc.) anticorpos da invenção e um ou mais (por exemplo, 2, 3, etc.) anticorpos adicionais contra um lissavírus RABV e/ou um lissavírus não RABV. Além disso, a administração de anticorpos da invenção junto com anticorpos específicos para outros patógenos está dentro do âmbito da invenção.

[00253] O anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, o ácido nucleico, o vetor, a célula, o polipeptídeo imunogêni- co, ou a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser proporcionado para utilização como um medicamento para (i) profilaxia, em particular profilaxia pós-exposição, tratamento ou atenuação de infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV; (ii) vacinação contra infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV; ou (iii) diagnóstico de infecção pelo lissavírus RABV e/ou por outro lissavírus.

[00254] Estão dentro do âmbito da invenção várias formas e vias de administração do anticorpo, ou do fragmento de ligação de antígeno do mesmo, do ácido nucleico, do vetor, da célula, do polipeptídeo imu- nogênico, ou da composição farmacêutica, conforme descrito acima, com respeito à composição farmacêutica. Isto também se aplica no contexto da utilização do anticorpo, ou do fragmento de ligação de an- tígeno do mesmo, do ácido nucleico, do vetor, da célula, do polipeptí- deo imunogênico conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, em particular com relação a formas e vias de administração preferenciais.

[00255] Os métodos de diagnóstico podem incluir por em contato um anticorpo ou um fragmento de anticorpo com uma amostra. As amostras referidas podem ser amostras de tecido colhidas a partir de, por exemplo, passagens nasais, cavidades sinusais, glândulas saliva-res,pulmão, fígado, pâncreas, rim, ouvido, olho, placenta, trato alimen-tar,coração, ovários, pituitária, adrenais, tiroide, cérebro ou pele. Os métodos de diagnóstico também podem incluir a detecção de um complexo de antígeno / anticorpo.

[00256] A invenção portanto proporciona (i) um anticorpo, um fragmento de anticorpo, ou variantes e derivados dos mesmos de acordo com a invenção, (ii) um clone de célula B imortalizada de acordo com a invenção, (iii) um epitopo capaz de ligação de um anticorpo da invenção ou (iv) um ligante, de modo preferencial um anticorpo, capaz de ligação de um epitopo que liga um anticorpo da invenção para utilização em terapia.

[00257] De modo preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção, o vetor de acordo com a presente invenção, a célula de acordo com a presente invenção, o polipeptídeo imunogênico de acordo com a presente invenção, ou a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção são usados na profilaxia pós-exposição, no tratamento ou na atenuação de infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV, em que o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, o ácido nu- cleico, o vetor, a célula, ou a composição farmacêutica é administrado até sete dias, de modo preferencial até cinco dias, depois da infecção.

[00258] O termo “profilaxia pós-exposição” conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a um protocolo de tratamento, o qual se inicia depois da exposição ao vírus e antes dos primeiros sintomas de raiva serem detectáveis. No entanto, como atualmente não existe nenhum tratamento real, isto é, depois do início dos sintomas, para a raiva, a profilaxia pós-exposição também pode ser aplicada depois dos primeiros sintomas de raiva serem detectáveis, no entanto,é de conhecimento geral que a profilaxia pós-exposição convencionalé quase ineficaz em um ponto do tempo tardio semelhante.

[00259] Em geral, a profilaxia pós-exposição é iniciada tão logo possível depois da exposição ou exposição suspeita ao vírus, de modo preferencial dentro de umas poucas horas até 24 horas ou até 48 horas depois da exposição. Nesta limitada janela de tempo, sabe-se que a profilaxia pós-exposição é a mais eficaz.

[00260] No entanto, os anticorpos de acordo com a presente invenção também são eficazes quando administrados em um ponto do tempo posterior, presumivelmente mesmo depois do início dos primeiros sintomas. Portanto, os anticorpos de acordo com a presente invenção aumentam consideravelmente a janela de tempo para o início da profi-laxiapós-exposição, do tratamento ou da atenuação da infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV. De modo preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, o ácido nucleico, o vetor, a célula, ou a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é administrado pelo menos até sete dias, de modo pre- ferencial pelo menos até cinco dias, depois da infecção.

[00261] Além disso é preferencial que o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção, o vetor de acordo com a presente invenção, a célula de acordo com a presente invenção, o polipeptídeo imunogênico de acordo com a presente invenção, ou a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção sejam usados na profilaxia pós-exposição, no tratamento ou na atenuação de infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV, em que o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, o ácido nucleico, o vetor, a célula, ou a composição farmacêutica é administrado em combinação com uma vacina, de modo preferencial uma vacina contra a raiva, um antiviral, de modo preferencial ribavirina, alfa interferon e/ou cetamina.

[00262] Conforme descrito acima, as vacinas da raiva atualmente disponíveis incluem as vacinas de tecido nervoso mais amplamente usadas porém altamente propensas a risco, ou as vacinas mais seguras porém mais caras de cultura celular e ovos embrionados (CCE- EVs). Na Alemanha, por exemplo, são comercializadas somente duas vacinas antirrábicas, Rabipur® e “Tollwut-Impfstoff (célula diploide humana [HDC]) inaktiviert”. Estas vacinas contêm o vírus da raiva inati- vado. Ambas as vacinas são recomendadas para utilização pré- e pós- exposição. Outro exemplo de uma vacina contra a raiva é Imovax (Sa-nofi-Pasteur), a qual é uma vacina de célula diploide humana inativada comercial. Em geral as vacinas da raiva são administradas de acordo com as informações do fabricante, por meio do quê um protocolo de profilaxia pós-exposição típico inclui a administração da vacina nos dias 0, 3, 7, 14 e 28 depois da infecção.

[00263] Um antiviral refere-se a uma classe de medicação utilizada especificamente para o tratamento de infecções viralis. Como os anti- bióticos para as bactérias, antivirais específicos são usados para vírus específicos. Diferentemente da maioria dos antibióticos, os fármacos antivirais não destroem seu patógeno alvo; ao invés, eles inibem o seu desenvolvimento. Particularmente preferencial é ribavirina antiviral.

[00264] Em uma modalidade preferencial, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção, o vetor de acordo com a presente invenção, a célula de acordo com a presente invenção, o polipeptídeo imunogênico de acordo com a presente invenção, ou a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção são usados na profilaxia pós-exposição, no tratamento ou na atenuação de infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV, em que o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, o ácido nucleico, o vetor, a célula, ou a composição farmacêutica é administrado em um esquema de profilaxia pós-exposição de rotina (em inglês, PEP), de modo preferencial em combinação com uma vacina, de modo preferencial no primeiro tratamento do esquema de profilaxia pós-exposição de rotina somente.

[00265] Um “esquema de profilaxia pós-exposição de rotina (em inglês, PEP)” tipicamente se refere ao esquema de profilaxia pós- exposição conforme recomendado pela OMS (cf. http://www.who.int/rabies/human/WHO_strategy_prepost_exposure/en/ index1.html#, recuperado em 12 de novembro de 2014), por meio do quê os anticorpos de acordo com a invenção substituem as RIGs, isto é, HRIG ou ERIG. A saber, uma vacinação pós-exposição é iniciada tão logo possível depois da exposição com uma vacina contra a raiva conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, a qual segue o protocolo do fabricante, tipicamente pelo menos duas injeções. Por exemplo, um protocolo padrão inclui injeções na vacina nos dias 0, 3, 7, 14, e 28 depois da exposição. De modo concomitante com a primei- ra injeção, ou tão logo possível depois disso, é administrada a dose única e simples do anticorpo.

[00266] Quando usado na profilaxia pós-exposição, no tratamento ou na atenuação de infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV, de modo preferencial o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção de modo preferencial é administrado em uma dose de 0,005 a 100 mg/kg, de modo preferencial em uma dose de 0,0075 a 50 mg/kg, de modo mais preferencial em uma dose de 0,01 a 10 mg/kg, de modo ainda mais preferencial em uma dose de 0,01 a 1 mg/kg, e de modo particularmente preferencial em uma dose de 0,01 a 0,1 mg/kg. Uma dose semelhante é particularmente preferencial em um esquema de profilaxia pós-exposição de rotina (em inglês, PEP) conforme descrito acima.

[00267] Além disso é preferencial que o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção, o vetor de acordo com a presente invenção, a célula de acordo com a presente invenção, o polipeptídeo imunogênico de acordo com a presente invenção, ou a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção para utilização na profilaxia pós-exposição, no tratamento ou na atenuação de infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV, seja administrado de 1 a 6 dias, de modo preferencial de 2 a 5 dias, depois da infecção.

[00268] Em outra modalidade preferencial, a qual não se refere ao esquema de profilaxia pós-exposição de rotina, o anticorpo, ou o frag-mento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, para utilização na profilaxia pós-exposição, no tratamento ou na atenuação de infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV, é ad-ministrado sem administração concomitante e/ou subsequente de uma vacina.

[00269] Além de administração em combinação com uma vacina, por exemplo, em um esquema de profilaxia pós-exposição de rotina, os anticorpos de acordo com a presente invenção também são eficazes quando administrados sem uma vacina, por exemplo, como tratamento da raiva, por exemplo, caso administrados mais de um ou dois dias depois da exposição.

[00270] Além do mais, é preferencial que no anticorpo, ou no fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção ou na composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24 para utilização na profilaxia pós- exposição, no tratamento ou na atenuação de infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV, que o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, seja administrado em uma dose de 0,01 a 100 mg/kg, de modo preferencial em uma dose de 0,1 a 75 mg/kg, de modo mais preferencial em uma dose de 1 a 60 mg/kg, e de modo ainda mais preferencial em uma dose de 10 a 50 mg/kg. As “maiores” doses referidas em particular são preferenciais se a exposição foi severa e/ou se o tratamento for iniciado mais tarde do que um ou dois dias depois da exposição.

[00271] A invenção também proporciona um método de tratamento de um sujeito compreendendo administrar ao sujeito um anticorpo, um fragmento de anticorpo, ou variantes e derivados dos mesmos de acordo com a invenção, ou, um ligante, de modo preferencial um anticorpo, capaz de ligação de um epitopo que liga um anticorpo da invenção. Em uma modalidade, o método resulta em redução da infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV no sujeito. Em outra modalidade, o método previne, reduz o risco ou retarda a infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV no sujeito.

[00272] Em particular, a presente invenção proporciona um método de prevenção e/ou tratamento de uma infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV em um sujeito, em que o método compreende administrar a um sujeito que necessite do mesmo o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, o ácido nucleico de acordo com de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, o vetor de acordo com de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, a célula de acordo com de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, o polipeptídeo imunogênico de acordo com de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, e/ou a composição farmacêutica de acordo com de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Um método semelhante de modo preferencial compreende profilaxia pós-exposição conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Além disso é preferencial que um método semelhante compreenda vacinação contra infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV.

[00273] A presente invenção também proporciona um método de diagnosticar uma infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV em um sujeito, em que o método compreende administrar a um sujeito que necessite do mesmo o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antíge- no do mesmo, de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de pa-tente, o vetor de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, a célula de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, o polipeptídeo imunogênico de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, e/ou a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.

[00274] De modo preferencial, nos métodos acima descritos de acordo com a presente invenção pelo menos dois anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, são administrados ao sujeito, cujos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, ligam especificamente a diferentes epitopos sobre a glicoproteína G do RABV. De modo preferencial um anticorpo entre os pelo menos dois anticorpos se liga ao sítio antigênico I sobre a glicoproteína G do RABV e outro anticorpo entre os pelo menos dois anticorpos se liga ao sítio antigênico III sobre a glicoproteína G do RABV. De modo preferencial pelo menos um entre os pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos compreende uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica à SEQ ID NO: 95 ou à SEQ ID NO: 167. De modo mais preferencial, pelo menos um entre os pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos com-preende (i) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 97 e 99 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 96 e 98 a 99, respectivamente ou (ii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de amino- ácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 169 e 171 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 168 e 170 a 171, respectivamen- te. De modo ainda mais preferencial, um entre os pelo menos dois an-ticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos compreende uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica à SEQ ID NO: 95 e outro entre os pelo menos dois anticorpos compreende uma CDRH3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idêntica à SEQ ID NO: 167. De modo particularmente preferencial, um entre os pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos compreendesequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 97 e 99 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93 a 96 e 98 a 99, respectivamente, e outro entre os pelo menos dois anticorpos compreende sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2, e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2, e CDRL3 de cadeia leve que são pelo menos 80%, de modo preferencial pelo menos 90%, idênticas às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 169 e 171 ou às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 165 a 168 e 170 a 171, respectivamente.

[00275] A invenção também proporciona a utilização de (i) um anticorpo, um fragmento de anticorpo, ou variantes e derivados dos mesmos de acordo com a invenção, (ii) um clone de célula B imortalizada de acordo com a invenção, (iii) um epitopo capaz de ligação de um anticorpo da invenção, (iv) um ligante, de modo preferencial um anticorpo, que se liga a um epitopo capaz de ligação de um anticorpo da invenção, ou (v) uma composição farmacêutica da invenção em (i) a fabricação de um medicamento para o tratamento ou a atenuação de infecção pelo lissavírus RABV e/ou não RABV (ii) uma vacina, ou (iii) diagnóstico de infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV.

[00276] A invenção proporciona uma composição da invenção para utilização como um medicamento para a prevenção ou o tratamento de infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV. Também proporciona a utilização de um anticorpo da invenção e/ou de uma proteína compre-endendo um epitopo ao qual um anticorpo semelhante se liga na fabri-cação de um medicamento para o tratamento de um sujeito e/ou diag-nóstico em um sujeito. Também proporciona um método para o trata-mento de um sujeito, compreendendo a etapa de administrar ao sujeito uma composição da invenção. Em algumas modalidades o sujeito pode ser um ser humano. Um modo de verificar a eficácia do tratamento terapêutico envolve o monitoramento dos sintomas de doença depois da administração da composição da invenção. O tratamento pode ser um esquema de dose única ou um esquema de múltiplas doses.

[00277] Em uma modalidade, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um clone de célula B imortalizada, um epitopo ou uma composição de acordo com a invenção é administrado a um sujeito que necessite de semelhante tratamento. Um sujeito semelhante inclui, mas não está limitado a, um sujeito o qual está particularmente em risco de ou suscetível a infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV.

[00278] Os anticorpos e os fragmentos dos mesmos conforme descrito na presente invenção também podem ser usados em um kit para o diagnóstico de infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV. Além disso, epitopos capazes de ligação de um anticorpo da invenção podem ser usados em um kit para o monitoramento da eficácia dos procedimentos de vacinação por detecção da presença de anticorpos protetores anti- lissavírus RABV ou anti- lissavírus não RABV. Os anticorpos, os fragmento de anticorpos, ou as variantes e os derivados dos mesmos, conforme descrito na presente invenção também podem ser usados em um kit para o monitoramento da fabricação de vacinas com a imunogenicidade desejada.

[00279] Os anticorpos e os fragmentos dos mesmos conforme descrito na presente invenção também podem ser usados para o monitoramento da qualidade de vacinas contra lissavírus anti-RABV ou anti- não RABV verificando se o antígeno da vacina referida contém o epi- topo específico na conformação correta.

[00280] A invenção também proporciona um epitopo que liga espe-cificamente a um anticorpo da invenção ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, para utilização (i) em terapia, (ii) na fabricação de um medicamento para o tratamento ou a atenuação de infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV, (iii) como uma vacina, ou (iv) em tria-gem para ligantes capazes de neutralizar a infecção por lissavírus RABV e/ou não RABV.

[00281] A invenção também proporciona um método de preparação de um fármaco, compreendendo a etapa de misturar um anticorpo monoclonal com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, em que o anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal que foi obtido a partir de uma célula hospedeira transfectada da invenção. Deste modo os procedimentos para primeiro obter o anticorpo monoclonal (por exemplo, expressando o mesmo e/ou purificando o mesmo) e em seguida misturando o mesmo com o um ou mais veículos farmacêuticos podem ser realizados em momentos muito diferentes por diferentes pessoas em diferentes locais (por exemplo, em diferentes países).

[00282] Iniciando com uma célula B transformada ou com uma célu-laplasmática cultivada da invenção, podem ser realizadas várias etapas de cultura, subcultura, clonagem, subclonagem, sequenciamento, preparação de ácido nucleico, etc. de modo a perpetuar o anticorpo expressado pela célula B transformada ou pela célula plasmática culti-vada, com otimização opcional em cada etapa. Em uma modalidade, os métodos acima adicionalmente compreendem técnicas de otimização (por exemplo, otimização ou maturação por afinidade) aplicadas aos ácidos nucleicos que codificam o anticorpo. A invenção engloba todas as células, os ácidos nucleicos, os vetores, as sequências, os anticorpos etc. usados e preparados durante as referidas etapas.

[00283] Em todos estes métodos, o ácido nucleico usado no hospedeiro de expressão pode ser manipulado para inserir, eliminar ou alterar determinadas sequências de ácidos nucleicos. As modificações de semelhante manipulação incluem, mas não estão limitadas a, modifi-cações para introduzir sítios de restrição, para alterar o uso de codons, para adicionar ou otimizar a transcrição e/ou translação de sequências reguladoras, etc. Também é possível modificar o ácido nucleico para alterar os aminoácidos codificados. Por exemplo, pode ser útil introduzir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácidos na sequência de aminoácidos do anticorpo. As mutações de ponto referidas podem modificar as funções efetoras, a afinidade de ligação de antígeno, mo-dificações pós-translacionais, a imunogenicidade, etc., podem introdu-ziraminoácidos para a fixação de grupamentos covalentes (por exemplo, marcadores) ou podem introduzir etiquetas (por exemplo, para fins de purificação). Mutações podem ser introduzidas em sítios específicos ou podem ser introduzidas aleatoriamente, seguidas por seleção (por exemplo, evolução molecular). Por exemplo, um ou mais ácidos nucleicos codificando qualquer uma das regiões de CDR, regiões vari-áveis de cadeia pesada ou regiões variáveis de cadeia leve de anticorpos da invenção podem ser mutados aleatoriamente ou direcionalmente de modo a introduzir diferentes propriedades nos aminoácidos codificados. As modificações referidas podem ser o resultado de um processo iterativo em que modificações iniciais são retidas e novas modificações em outras posições de nucleotídeos são introduzidas. Além disso, modificações obtidas em etapas independentes podem ser combinadas. Diferentes propriedades introduzidas nos aminoácidos codificados podem incluir, mas não estão limitadas a, reforço da afini-dade.

[00284] As Figuras, Sequências e Exemplos que se seguem se destinam a ilustrar adicionalmente a invenção. Não se destinam a limitar o assunto da invenção aos mesmos.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00285] A Figura 1 mostra um sumário das características dos isolados de lissavírus RABV e não RABV referidos aqui, neste requerimento de patente. Isto inclui nome do isolado, espécie viral e filogru- po (conforme mostrado na Tabela 1 para os isolados de lissavírus não RABV) bem como espécies hospedeiras, país e anos de origem, linhagem e o número de acesso no GenBank da sequência de aminoá- cidos e/ou nucleotídeos da glicoproteína G daquele isolado, caso disponível.

[00286] A Figura 2 mostra os resultados da ligação da proteína G do RABV (A) e da neutralização (B) por um painel de 90 e 29 amostras de plasma de vacinados contra RABV, respectivamente. Os símbolos em preto indicam HRIG (Berirab®), os símbolos em cinza indicam os 4 doadores selecionados para a interrogação de células B de memória.

[00287] A Figura 3 mostra um sumário de todas as característi-casgenéticas e funcionais do painel de 21 anticorpos neutralizantes anti-RABV humana isolados. São mostrados o uso de VH, VL e VK, a percentagem de identidade de nucleotídeos com o gene da linhagem germinativa correspondente, a potência de neutralização sobre pseu- dovírus RABV CVS-11 (pp) expressada como a concentração de IgG em ng/ml capaz de neutralizar 90% da infectividade viral (IC90) e a rea- tividade dos anticorpos em western blot (WB) sob condições não redu- toras ou redutoras.

[00288] A Figura 4 mostra os resultados de uma matriz de competição cruzada de anticorpo monoclonal realizada por ELISA sobre os 21 anticorpos isolados e dois anticorpos de referência de especificidade de epitopo conhecida (CR57 e CR4098). É mostrada a percentagem de inibição de ligação dos anticorpos biotinilados mostrada na linha superior pelos anticorpos listados na coluna da esquerda.

[00289] A Figura 5 mostra os resultados da neutralização de 13 diferentes espécies de lissavírus (22 isolados virais) testados como pseudovírus por uma seleção de 12 anticorpos monoclonais humanos do painel de isolados em comparação com os três anticorpos de referência RAB1, CR57 e CR4098 e as imunoglobulinas humanas policlo- nais (HRIG, Berirab®). É mostrado o valor da IC90 em ng/ml, por meio do quê IC90 >10’000 ng/ml foram classificados como negativos (valores para neutralização por Berirab®são classificados como negativos se a IC90 >50’000 ng/ml).

[00290] A Figura 6 mostra os resultados da neutralização de 8 diferentes espécies de lissavírus (16 isolados virais) testados como vírus infecciosos por uma seleção de 12 anticorpos monoclonais humanos do painel de isolados em comparação com os três anticorpos de referência RAB1, CR57 e CR4098 e as imunoglobulinas humanas policlonais (HRIG, Berirab®). É mostrado o valor da IC50 em ng/ml, por meio do quê IC50 >10’000 ng/ml foram classificados como negativos (valores para neutralização por Berirab®são classificados como negativos se IC50 >50’000 ng/ml).

[00291] A Figura 7 mostra os resultados da neutralização de 13 diferentes espécies de lissavírus testadas como pseudovírus (A, 22 isolados virais) ou vírus (B, 16 isolados virais) por uma seleção de 12 anticorpos monoclonais do painel de isolados em comparação com os dois anticorpos de referência CR57 e CR4098 e as imunoglobulinas humanas policlonais (HRIG, Berirab®).

[00292] A Figura 8 mostra um sumário da percentagem de isolados de lissavírus não RABV (n=32) (A) e isolados de lissavírus não RABV do filogrupo I (n=22) (B) neutralizados com IC50 (para vírus) ou IC90 (para pseudovírus) abaixo de 10000 ng/ml por anticorpos mono- clonais RVC20, RVC58, RAB1, CR57, CR4098, ou uma combinação de RVC20 com RVC58 ou CR57 com CR4098. A lista dos isolados (e seu filogrupo) usados para esta análise é mostrada nas Figuras 5 e 6. N, número de isolados usados no cálculo dos isolados neutralizados. *, HRIG foi classificada como negativa quando a IC50 ou a IC90 foi >50’000 ng/ml; **, RAB1 foi testado contra 26 isolados de não RABV e 16 isolados de não RABV do filogrupo I, respectivamente.

[00293] A Figura 9 mostra os resultados da neutralização de isolados do RABV testados como pseudovírus (círculos preenchidos, n=2) ou vírus (círculos vazios, n=24) pelos anticorpos selecionados RVC20 e RVC58 de nosso painel e os dois anticorpos de referência CR57 e CR4098.

[00294] A Figura 10 mostra que RVC20 e RVC58 neutralizam de maneira potente isolados do RABV de múltiplas linhagens. (A) A neutralização dos isolados do RABV testados como para vírus de pseudo- tipos (círculos preenchidos, n=8; mostrados como valores da IC90 values) ou vírus vivos (círculos vazios, n=27; mostrados como valores da IC50) pelos anticorpos selecionados RVC20 e RVC58 de nosso painel, pelos anticorpos de referência CR57, CR4098 e RAB1 e HRIG. A neutralização da cepa CVS-11 é mostrada usando vírus vivos (teste RFFIT, vide a Figura 11). A linha pontilhada indica um limiar para neutralização acima de 1’000 ng/ml. É mostrado o valor médio geométrico para cada conjunto de dados. É mostrado o P valor de um Wilcoxon teste de classificação assinado de pares combinados (****P<0,0001; ***P<0,001). (B) Árvore filogenética de 2215 sequências de proteína G recuperadas a partir de bancos de dados públicos. Salientadas com pontos estão as sequências dos isolados de RABV testadas neste estudo (duas sequências de proteína G, isto é, CV9.13 e Maurita- nia/dog/2019-2006/V6235-2007, não estavam disponíveis e portanto não foram incluídas na árvore) incluindo as que foram testadsa por FACS para ligação (cf. a Figura 11).

[00295] A Figura 11 mostra um sumário dos 43 isolados de RABV testados. Atividade de neutralização (IC50 para vírus e IC90 para pseu- dvovírus em ng/ml) dos anticorpos monoclonais RVC20, RVC58, CR57, CR4098 e RAB1, e HRIG conforme ilustrado na Figura 10. RFFIT, teste de inibição de foco fluorescente rápido; FAVN, teste de neutralização de vírus de anticorpos fluorescentes; PV, teste de neutralização à base de pseudovírus. *, vírus testados por FACS para ligação a transfectantes de proteína G.

[00296] A Figura 12 mostra as características de 26 isolados de RABV selecionados testados como vírus ou pseudovírus bem como a atividade de neutralização em ng/ml dos anticorpos monoclonais RVC20, RVC58, CR57 e CR4098, e HRIG conforme ilustrado nas Figuras 9 e 10. RFFIT, teste de inibição de foco fluorescente rápido; FAVN, teste de neutralização de vírus de anticorpos fluorescentes; PV, teste de neutralização à base de pseudovírus. São mostrados a IC50 para os resultados do FAVN e do RFFIT e a IC90 para os resultados do PV.

[00297] A Figura 13 mostra as características de 28 isolados de lissavírus não RABV selecionados testados como vírus ou pseudovírus bem como a atividade de neutralização em ng/ml dos anticorpos mo- noclonais RVC20, RVC58, CR57 e CR4098, e HRIG conforme ilustrado nas Figuras 5, 6 e 7. RFFIT, teste de inibição de foco fluorescente rápido; FAVN, teste de neutralização de vírus de anticorpos fluores-centes; PV, teste de neutralização à base de pseudovírus. São mos- trados a IC50 para os resultados do FAVN e do RFFIT e a IC90 para os resultados do PV.

[00298] A Figura 14 mostra os resultados de neutralização de CVS-11 e diferentes mutantes de CVS-11 pelo painel de 12 anticorpos monoclonais selecionados de acordo com a invenção e os anticorpos de referência RAB1, CR57 e CR4098. Células em preto indicam neutralização completa, células em cinza indicam neutralização parcial e células em branco indicam nenhuma neutralização. Nd, não testadas.

[00299] A Figura 15 mostra que RVC20 e RVC58 tem por alvo epitopos altamente conservados nos sítios antigênicos I e III. O nível de conservação dos resíduos aminoácidos nos sítios antigênicos I e III conforme calculado pela análise das sequências de proteína G de 2566 RABVs. Gráficos de torta mostram a distribuição detalhada do uso de aminoácidos em cada posição. Os resíduos sublinhados indicam que vírus carregando o resíduo correspondente naquela posição são neutralizados ou por RVC20 ou por RVC58. (A) Frequência de resíduos aminoácidos no sítio antigênico I; (B) Frequência de resíduos aminoácidos no sítio antigênico III.

[00300] A Figura 16 mostra um alinhamento das sequências de sítio antigênico da proteína G de todos os lissavírus testados e se- quenciados. São mostrados os lissavírus não RABV do filogrupo I e não RABV dos filogrupos II a IV, respectivamente. Nd, não testados. (A) Sitio antigênico I com setas na primeira coluna indicando uma falta de neutralização por CR57 e setas na segunda coluna (coluna mais à direita do painel A) indicando uma falta de neutralização por RVC20. (B) Sitio antigênico III com setas na primeira coluna indicando uma falta de neutralização por CR4098, setas na segunda coluna indicando uma falta de neutralização por RAB1 e setas na terceira coluna (coluna mais à direita do painel B) indicando uma falta de neutralização por RVC58. Setas pontilhadas indicam neutralização fraca ou parcial.

[00301] A Figura 17 mostra a percentagem de sobrevida em hamsters sírios infectados com isolado de RABV CVS-11 e e em seguida deixados não tratados ou tratados com a PEP padrão (HRIG e vacinação) ou com duas doses diferentes de um coquetel de anticorpos monoclonais RVC20+RVC58 (e vacinação). O vírus RABV foi administrado por via intramuscular (50 µl de 105.7TCID50/ml) no músculo gastrocnêmio da pata traseira esquerda. A vacina usada é uma vacina de célula diploide humana inativada comercial (Imovax; Sanofi- Pasteur) e foi administrada por via intramuscular (0,05 ml) no músculo gastrocnêmio da pata traseira direita.

[00302] A Figura 18 mostra o nível de anticorpos IgG de hamster ligando à proteína G conforme medido por ELISA (A), o nível de anticorpos neutralizantes dos soros dos hamsters (B) e os níveis de anticorpos IgG humanos residuais (C) conforme medido sobre soros coletados 42 dias depois de imunização com vacina de RABV em hamsters sírios não estimulados.

[00303] A Figura 19 mostra a percentagem de sobrevida em hamsters sírios infectados com um vírus RABV de campo isolado a partir das glândulas salivares de uma raposa infectada (Italy/red fox/673/2011) e em seguida deixados não tratados, tratados no dia 1 com a PEP padrão (isto é, HRIG e vacinação) ou tratados ou no dia 1, 5 ou 9 depois da infecção com uma única dose de RVC58+RVC20 a 40 mg/kg.

[00304] A Figura 20 mostra as quantidades de mRNA de RABV NP conforme medido por RT-PCR sobre amostras do sistema nervoso central post-mortem (A) e os níveis de anticorpos IgG de hamster li-gando à proteína G conforme medido por ELISA (B) do experimento mostrado na Figura 18. Asteriscos indicam animais sucumbindo à in-fecção, losangos indicam animais apresentando uma paralisia perma-nente da pata traseira que foi sítio do estímulo viral e círculos abertos indicam animais assintomáticos.

[00305] A Figura 21 mostra a análise histológica de tecidos do cérebro, da medula oblongata e da medula espinhal de dois animais re-presentativos tratados com RVC58 e RVC20 no dia depois da infecção (A) ou deixados tratados (B). Em particular, a análise imuno- histoquímica teve por objetivo revelar a presença do antígeno RABV N para identificar os corpos de inclusão patognomônicos (corpúsculos de Negri).

[00306] A Figura 22 mostra as sequências de aminoácidos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo RVA122 bem como as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas. As sequências sa-lientadas em negrito são regiões de CDR (nucleotídeo ou aa) e os re-síduos sublinhados são resíduos mutados em comparação com a se-quência da “linhagem germinativa”.

[00307] A Figura 23 mostra as sequências de aminoácidos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo RVA144 bem como as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas. As sequências sa-lientadas em negrito são regiões de CDR (nucleotídeo ou aa) e os re-síduos sublinhados são resíduos mutados em comparação com a se-quência da “linhagem germinativa”.

[00308] A Figura 24 mostra as sequências de aminoácidos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo RVB185 bem como as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas. As sequências sa-lientadas em negrito são regiões de CDR (nucleotídeo ou aa) e os re-síduos sublinhados são resíduos mutados em comparação com a se-quência da “linhagem germinativa”.

[00309] A Figura 25 mostra as sequências de aminoácidos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo RVB492 bem como as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas. As sequências sa-lientadas em negrito são regiões de CDR (nucleotídeo ou aa) e os re- síduos sublinhados são resíduos mutados em comparação com a se-quência da “linhagem germinativa”.

[00310] A Figura 26 mostra as sequências de aminoácidos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo RVC3 bem como as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas. As sequências salientadas em negrito são regiões de CDR (nucleotídeo ou aa) e os resíduos sublinhados são resíduos mutados em comparação com a sequência da “linhagem germinativa”.

[00311] A Figura 27 mostra as sequências de aminoácidos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo RVC20 bem como as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas. As sequências sa-lientadas em negrito são regiões de CDR (nucleotídeo ou aa) e os re-síduos sublinhados são resíduos mutados em comparação com a se-quência da “linhagem germinativa”.

[00312] A Figura 28 mostra as sequências de aminoácidos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo RVC21 bem como as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas. As sequências sa-lientadas em negrito são regiões de CDR (nucleotídeo ou aa) e os re-síduos sublinhados são resíduos mutados em comparação com a se-quência da “linhagem germinativa”.

[00313] A Figura 29 mostra as sequências de aminoácidos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo RVC38 bem como as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas. As sequências sa-lientadas em negrito são regiões de CDR (nucleotídeo ou aa) e os re-síduos sublinhados são resíduos mutados em comparação com a se-quência da “linhagem germinativa”.

[00314] A Figura 30 mostra as sequências de aminoácidos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo RVC44 bem como as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas. As sequências sa-lientadas em negrito são regiões de CDR (nucleotídeo ou aa) e os re- síduos sublinhados são resíduos mutados em comparação com a se-quência da “linhagem germinativa”.

[00315] A Figura 31 mostra as sequências de aminoácidos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo RVC58 bem como as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas. As sequências sa-lientadas em negrito são regiões de CDR (nucleotídeo ou aa) e os re-síduos sublinhados são resíduos mutados em comparação com a se-quência da “linhagem germinativa”.

[00316] A Figura 32 mostra as sequências de aminoácidos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo RVC68 bem como as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas. As sequências sa-lientadas em negrito são regiões de CDR (nucleotídeo ou aa) e os re-síduos sublinhados são resíduos mutados em comparação com a se-quência da “linhagem germinativa”.

[00317] A Figura 33 mostra as sequências de aminoácidos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo RVC111 bem como as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas. As sequências sa-lientadas em negrito são regiões de CDR (nucleotídeo ou aa) e os re-síduos sublinhados são resíduos mutados em comparação com a se-quência da “linhagem germinativa”.

EXEMPLOS

[00318] Modalidades exemplares da presente invenção são propor-cionadas nos exemplos que se seguem. Os exemplos que se seguem são apresentados somente a título de ilustração e para ajudar uma pessoa com conhecimento regular na utilização da invenção. Os exemplos não se destinam de qualquer maneira a limitar de modo di-verso o âmbito da invenção.

Exemplo 1: Seleção de vacinados contra a raiva para o isolamento de anticorpos amplamente neutralizantes.

[00319] De modo a isolar anticorpos amplamente neutralizantes capazes de neutralizar isolados de RABV mas não lissavírus não RABV, 90 amostras de plasma de vacinados foram triadas para a presença de altos títulos de anticorpos ligando à proteína G do RABV (cepa CVS- 11) por ELISA (Figura 2A) e foram selecionadas 29 amostras com os maiores títulos de ligação (EC50>50) para análise posterior. Em particular as 29 amostras de plasma selecionadas foram testadas para sua capacidade para neutralizar sobre um painel de 12 lissavírus de pseu- dotipos incluindo os vírus do filogrupo I RABV, DUVV, KHUV, EBLV1, ARAV, EBLV2, IRKV, ABLV, os vírus do filogrupo II LABV, SHIBV e MOKV, e WCBV do filogrupo III (Figura 2B). A imunoglobulina da raiva humana (HRIG) Berirab® (Zydus Cadila) foi incluída como uma referência. Conforme esperado todas as amostras neutralizaram, embora com títulos variáveis, o isolado do RABV CVS-11 homólogo. O perfil de neutralização das outras espécies de lissavírus variou considera- valmente em todos os doadores testados onde em uns poucos casos todas as espécies foram neutralizadas. Digno de nota, HRIG (Berirab®) apresentou somente modesta atividade contra espécies não RABV do filogrupo I, e não apresentou reatividade cruzada com os vírus dos fi- logrupos II e III. Esta análise permitiu selecionar quatro vacinados como doadores de sangue para o isolamento e a caracterização subsequentes de potentes anticorpos amplamente neutralizantes.

Exemplo 2: Isolamento e caracterização de anticorpos amplamente neutrali- zantes contra a raiva.

[00320] Células B de memória IgG+ foram isoladas a partir de PBMCs criopreservadas dos quatro vacinados selecionados usando microcontas CD22 (Miltenyi Biotec), seguidas por depleção de células carregando IgM, IgD e IgA por classificação celular. As células B de memória dos quatro vacinados selecionados foram em seguida imorta- lizadas com EBV (Vírus Epstein Barr) e CpG (oligodesoxinucleotídeo CpG 2006) em cavidades de múltiplas replicatas conforme previamente descrito (Traggiai, E. et al., Nat. Med. 10, 871-875, 2004) e os so- brenadantes da cultura foram em seguida testados em uma triagem primária usando um teste à base de 384 cavidades de neutralização de pseudotipos de RABV CSV-11 (isolado de referência CVS-11, cepa de vacina). Células renais embrionárias humanas 293T foram usadas para a produção dos pseudotipos lentivirais (lissavírus substitutos). Testes de neutralização foram empreendidos sobre o clone 13 de 21 células renais de hamster bebê (BHK). Em uma placa de 384 cavidades, pseudovírus CVS-11 que resultou em uma produção de 50 a 100 x 104 unidades luminosas relativas (RLU) foi incubado com diluições duplicadas de soros por 1 h a 37% (5% de CO2) antes da adição de 3’000 células BHK-21. Estas foram incubadas por um adicional de 48 h, depois do qual o sobrenadante foi removido e 15 µl de reagente Steadylite (Perkin Elmer) foi adicionado. A atividade de luciferase foi detectada 5 min depois por leitura das placas sobre um luminômetro de microplaca Synergy (BioTek) (Wright, E. et al., J Gen. Virol 89, 2204-2213, 2008). As culturas positivas foram coletadas e expandidas. A partir das culturas positivas, as sequências de VH e VL foram recuperadas por RT-PCR. Os anticorpos RVC20 e RVC58 foram clo- nados em vetores de expressão de Ig kappa ou Ig lâmbda e IgG1 humana (gentilmente proporcionados pela Michel Nussenzweig, Rockefeller University, New York, US) essencialmente conforme descrito (Tiller T, Meffre E, Yurasov S, Tsuiji M, Nussenzweig MC, War- demann H (2008) Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods 329: 112-124). Anticorpos monoclonais foram produzidos a partir de células B imortalizadas com EBV ou por transfecção transitória de células 293 Freestyle (Invitrogen). Os sobre- nadantes de células B ou células transfectadas foram coletados e as IgG foram purificadas por afinidade por cromatografia de Proteína A ou Proteína G (GE Healthcare) e dessalgadas contra PBS.

[00321] Quinhentos anticorpos monoclonais humanos foram isolados por sua capacidade para neutralizar o RABV. Vinte e um anticorpos monoclonais humanos foram selecionados por sua alta potência de neutralização contra o RABV CVS-11, com uma IC90 (concentração de anticorpo neutralizando 90% da infectividade viral) variando a partir de 0,01 a 317 ng/ml (Figura 3), produzida por células B imortalizadas com EBV e purificadas por afinidade por cromatografia de Proteína A ou Proteína G (no caso de IgG3). Como uma referência HRIG e dois outros anticorpos monoclonais humanos (CR57 e CR4098) que foram desenvolvidos até a Fase III para substituir as RIGs (mas recentemente fracassaram devido à falta de atividade de neutralização contra alguns isolados de RABV de campo circulantes) também foram testados.Além disso, em seguida foi demonstrado que todos os anticorpos se ligam à proteína G do RABV por ELISA (CVS-11). Para este fim, foi usado um ELISA padrão. Em resumo, placas de ELISA foram revestidas com proteína G do RABV a 5 µg/ml, bloqueadas com 10% de FCS em PBS, incubadas com soro ou anticorpos humanos e lavadas. Os anticorpos ligados foram detectados por incubação com IgG de cabra anti-humana conjugada a AP (Southern Biotech). As placas foram em seguida lavadas, substrato (p-NPP, Sigma) foi adicionado e as placas foram lidas a 405 nm. As afinidades relativas da ligação do soro ou da ligação do anticorpo monoclonal foram determinadas medindo a diluição do soro (ED50) ou a concentração de anticorpo (EC50) requerida para obter 50% de ligação máxima em saturação.

[00322] De modo a entender se o epitopo cognato é conformacional ou não, a proteína G do RABV foi passada sobre um gel SDS-PAGE sob condições redutoras (RED) ou não redutoras (NR) e sondada por Western blot com todos os anticorpos monoclonais humanos isolados. Com umas poucas exceções (RVB143, RVC44 e RVC68) todos os an-ticorposnão se ligaram à proteína G do RABV sob condições redutoras, portanto sugerindo que o epitopo reconhecido é conformacional (Figura 3).

Exemplo 3: Estudos de competição de anticorpos: determinação de sítios an- tigênicos sobre a proteína G do RABV.

[00323] Em seguida foram realizados estudos de competição para determinar a proximidade espacial de cada um dos epitopos confor- macionais reconhecidos por todos os anticorpos do painel. Foi previa-mente demonstrado que os dois anticorpos de referência CR57 e CR4098 reconhecem os sítios antigênicos I e III da proteína G (Bakker, A. B. H. et al., J Virol 79, 9062-9068, 2005; de Kruif, J. et al., Annu Rev Med 58, 359-368, 2007), respectivamente, e portanto foram usados neste teste como sondas para mapear a especificidade de cada anticorpo de nosso painel. Em particular, CR57, CR4098 e todos os 21 anticorpos selecionados foram purificados e marcados com biotina e em seguida testados por ELISA em um teste de competição de matriz completa, no qual os anticorpos não marcados foram incubados primeiroem uma concentração de 10 µg/ml sobre placas revestidas com proteína G do RABV, seguida pela adição de anticorpos biotinilados em uma concentração de 100 ng/ml (isto é, 100 vezes menos do anticorponão marcado), cuja ligação foi revelada com estreptavidina conjugada a fosfatase alcalina. Os resultados mostrados na Figura 4 e indicam a percentagem de bloqueio da ligação dos anticorpos marcados em todas as combinações possíveis (isto é, 21 x 21) e foram usados para agrupar os anticorpos em 6 grupos. Ao interpretar os resultados da competição, deve-se levar em conta que se dois epitopos se sobrepõem, ou se as áreas cobertas pelos braços dos dois anticorpos se sobrepõem, a competição vai ser quase completa. Efeitos inibitórios ou de reforço fracos podem refletir uma diminuição na afinidade devido a efeitos estéricos ou alostéricos.

[00324] RVA125, RVC3, RVC20 e RVD74 foram atribuídos ao gru po do sítio antigênico I de acordo com a competição com CR57 e a suas competições recíprocas. Digno de nota, a ligação dos anticorpos do sítio antigênico I à proteína G é reforçada por um subgrupo de anticorposnão do sítio antigênico I. RVA122, RVA144, RVB492, RVC4, RVC69, RVC38 e RVC58 foram atribuídos ao sítio antigênico III de acordo com a competição com CR4098 e a suas competições recíprocas. RVC58 apresentou somente uma competição parcial com CR4098 (isto é, 64%) bem como competição com anticorpos não dos sítios antigênicos I e III, portanto sugerindo que o epitopo RVC58 pode somente se sobrepor parcialmente com o sítio antigênico III. Um terceiro grupo composto pelos anticorpos RVB181, RVC56, RVB185, RVC21, RVB161 e RVC111 foi denominado III.2 uma vez que a ligação de todos estes anticorpos biotinilados foi bloqueada por todos os anticorpos do sítio antigênico III mas reciprocamente todos estes anticorposnão foram capazes de bloquear a ligação de vários anticorpos do sítio antigênico III como CR4098, RVC4 e RVC69. Ao interpretar os resultados da competição, deve-se levar em conta que quando dois epitopos se sobrepõem, ou quando as áreas cobertas pelos braços dos dois anticorpos se sobrepõem, a competição vai ser quase completa. Efeitos inibitórios ou de reforço fracos podem simplesmente refletir uma diminuição na afinidade devido a efeitos estéricos ou alosté- ricos. Por esta razão aqui nós definimos um novo sítio denominado III.2, o qual provavelmente é proximal ao sítio antigênico III sobre a proteína G. Seguindo os mesmos critérios, três sítios adicionais foram definidos denominados A, B e C. O sítio A é definido pelo único anticorpo RVB686, cuja ligação compromete a ligação da maioria dos an- ticorpos marcados do painel, mas reciprocamente a ligação do RBV686 marcado não é bloqueada por qualquer anticorpo do painel. Estes resultados podem sugerir que a ligação de RVB686 induz um efeito alostérico sobre a proteína G que compromete a ligação da maioria dos outros anticorpos. O sítio B é definido pelo anticorpo RVC44, cuja ligação não é bloqueada por qualquer outro anticorpo do painel. De modo similar, o sítio C é definido pelos anticorpos RVB143 e RVC68, os quais também reconhecem um epitopo único e distinto em comparação com todos os outros anticorpos. Digno de nota, RVC44, RVB143 e RVC68 são os únicos anticorpos destes painel capazes de ligação por western blot à proteína G sob condições redutoras, sugerindo que eles reconhecem um epitopo linear sobre a proteína G do RABV.

Exemplo 4: Os anticorpos de acordo com a presente invenção neutralizam de modo potente os lissavírus RABV e não RABV.

[00325] Doze dos 22 anticorpos foram selecionados por sua potência e pelo reconhecimento de sítios distintos sobre a proteína G do RABV para serem testados, junto com os anticorpos de referência CR57, CR4098, RAB1 e Berirab® (HRIG), contra um grande painel de lissavírus usando vírus de pseudotipos (22 isolados, conforme mostrado na Fig. 5) e infecciosos (16 isolados, conforme mostrado na Fig. 6) cobrindo as espécies RABV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIBV, BBLV, WCBV e IKOV (Figuras 5, 6 e 7).

[00326] Produção de vírus de pseudotipos e teste de neutralização. Células renais embrionárias humanas 293T clone 17 (HEK 293T/17; ATCC CRL-11268) foram usadas para a produção dos pseudotipos lentivirais. Testes de neutralização foram empreendidos sobre o clone 13 de células BHK-21 (ATCC CCL-10). Em uma placa de 384 cavida- des, vírus de pseudotipos que resultaram em uma produção de 50 a 100 x 104 unidades luminosas relativas (RLU) foi incubado com diluições em duplicata de soros ou anticorpos por 1 h a 37% (5% de CO2) antes da adição de 3’000 células BHK-21. Estas foram incubadas por um adicional de 48 horas, depois do qual o sobrenadante foi removido e 15 µl de reagente Steadylite (Perkin Elmer) foi adicionado. A atividade de luciferase foi detectada 5 min depois por leitura das placas sobre um luminômetro de microplaca Synergy (BioTek) (Wright et al. 2008). A redução da infectividade foi determinada comparando a RLU na pre-sençae na ausência de anticorpos e expressada como percentagem de neutralização. A potência de neutralização para os anticorpos mo- noclonais é aqui medida como a IC90, a qual foi definida como a con-centraçãode anticorpos na qual as RLU foram reduzidas 90% compa-rados com cavidades de controle de vírus depois de subtração da RLU de fundo em cavidades de controle celular (ID50 para os soros, isto é, a diluição de soros na qual as RLU foram reduzidas 50%). Os valores da ID50 para os soros correspondem à diluição na qual as RLU foram reduzidas 50%.

[00327] Adaptação celular dos lissavírus e testes de neutralização in vitro.Lissavírus RABVs e não RABV selecionados foram isolados sobre Neuro-2A (ATCC cat n. CCL-131), adicionalmente adaptados celularmente e estoques de trabalho foram produzidos e titulados so-brecélulas BSR (um clone de BHK-21). Dois protocolos ligeiramente modificados de Neutralização de Vírus de Anticorpo Fluorescente (mFAVN) e de teste de Rápida Inibição de Focos Fluorescentes (mRFFIT) (FAVN: Cliquet, F., et al., J. Immunol Methods 212, 79-87, 1998; RFFIT: Smith, J. S., et al., Bull. World Health Organ. 48, 535541, 1973, Warrell MJ, Riddell A, Yu LM, Phipps J, Diggle L, Bourhy H, Deeks JJ, Fooks AR, Audry L, Brookes SM, et al (2008) A simplified 4- site economical intradermal post-exposure rabies vaccine regimen: a randomised controlled comparison with standard methods. PLoS Negl Trop Dis 2: e224), respectivamente, foram aplicados para testar a po-tência dos anticorpos em estudo. O estoque de trabalho de CVS-11 foi amplificado e titulado sobre ou BSR ou BHK-21, de acordo com o teste de neutralização adotado, RFFIT ou FAVN, respectivamente. Do mesmo modo, testes FAVN e RFFIT de rotina foram empreendidos para avaliar a potência dos anticorpos testados contra CVS-11. Em suma, os testes de mFAVN foram baseados em FAVN padrão, mas foram empreendidos sobre células BSR.

[00328] O corte para a neutralização foi uma IC90 (vírus de pseudo- tipos) ou uma IC50 (vírus infecciosos) acima 10000 ng/ml. Em outras palavras, se uma IC90 (vírus de pseudotipos) ou uma IC50 (vírus infec-ciosos) acima 10000 ng/ml foi obtida com um anticorpo, o anticorpo respectivo foi considerado como “não neutralizante”.

[00329] Entre os anticorpos do sítio antigênico I testados no teste de neutralização de pseudotipos (Wright, E. et al., J Gen. Virol 89, 2204-2213, 2008; Wright, E. et al., Vaccine 27, 7178-7186; 2009), RVC20 apresentou a melhor amplitude de reatividade sendo capaz de neutralizar vírus do filogrupo I RABV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV bem como SHIBV do filogrupo II e IKOV do filo- grupo putativo IV (Fig. 5). Uma completa descrição dos isolados de pseudovírus usados pode ser recuperada da Figura 1. Como uma comparação, o anticorpo do sítio antigênico I CR57 foi claramente inferior a RVC20, uma vez que não foi capaz de neutralizar isolados de EBLV-1, SHIBV e IKOV (cf. Fig. 5).

[00330] Quando testado sobre vírus infecciosos usando ou o teste FAVN (Cliquet, F., et al., J. Immunol Methods 212, 79-87, 1998) ou o teste RFFIT (Smith, J. S., et al., Bull. World Health Organ. 48, 535541, 1973), RVC20 também foi superior em sua amplitude sendo capaz de neutralizar RABV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, BBLV bem como o filogrupo II MOKV (cf. Fig. 6; a única espécie a qual não foi neutralizada é LBV). Uma completa descrição dos isolados de vírus infecciosos usados pode ser recuperada da Figura 1. Na mesma análise, CR57 não neutralizou os isolados de EBLV-1 (conforme observado com pseudovírus), os isolados de LBV e os isolados de MOKV (cf. Fig. 6).

[00331] Entre os anticorpos do sítio antigênico III testados no teste de neutralização de pseudotipos, RVC58 neutralizou de modo potente com IC90 < 10 ng/ml todos os vírus do filogrupo I (isto é, RABV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, cf. Fig. 5). Como uma comparação o anticorpo CR4098 do sítio antigênico III foi bem inferior a RVC58, uma vez que não foi capaz de neutralizar isolados de DUVV, EBLV-1, EBLV-2, IRKV e KHUV e neutralizou fracamente ARAV (cf. Fig. 5).

[00332] Quando testado sobre vírus infecciosos, de todos os anticorpos do sítio antigênico III testados, RVC58 também foi superior em sua amplitude, uma vez que foi capaz de neutralizar de modo potente RABV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, BBLV (cf. Fig. 6; as únicas espécies as quais não foram neutralizadas são MOKV e LBV). Na mesmaanálise CR4098 não neutralizou EBLV-1, DUVV, BBLV, um dos quatro isolados de RABV testados, um dos três isolados de EBLV-2 testados e um dos dois isolados de ABLV testados (cf. Fig. 6).

[00333] Digno de nota, o anticorpo RVC68 do sítio antigênico C neutralizou todos os pseudovírus dos filogrupos I e II testados (somente WCBV não foi neutralizado), embora com valores de IC90 10 a 100 vezes maiores comparado com RVC20 e RVC58 (Figura 5 e 7). Quando testado sobre vírus infecciosos, o anticorpo RVC68, no entanto, não foi capaz de neutralizar EBLV, ABLV, MOKV bem como um dos quatro isolados de RABV testados (Figuras 6 e 7).

[00334] Se a análise da amplitude do anticorpo for limitada a lissaví- rus não RABV (classificando como positivos todos os vírus neutralizado com IC50 <10000 ng/ml), RVC58 (sítio antigênico III) é capaz de neutralizar 69% de todos os lissavírus não RABV testados e, notavel-mente, todos os lissavírus do filogrupo I testados. Em comparação, o anticorpo CR4098 e RAB1 neutralizou somente 19% e 27%, respecti-vamente, dos lissavírus não RABV e 23% e 25%, respectivamente, dos lissavírus não RABV do filogrupo I. Em paralelo, RVC20 (sítio an- tigênico I) é capaz de neutralizar 72% e 91% dos lissavírus não RABV e dos lissavírus não RABV do filogrupo I, respectivamente. Em compa-ração, o anticorpo CR57 neutralizou 47% e 68% dos lissavírus não RABV e dos lissavírus não RABV do filogrupo I, respectivamente.

[00335] Quando combinados, RVC58 e RVC20 cobriram 78% e 100% dos lissavírus não RABV e dos lissavírus não RABV do filogrupo I, respectivamente, ao passo que CR57 e CR4098 cobriram somente 50% e 68% dos lissavírus não RABV e dos lissavírus não RABV do filogrupo I, respectivamente (Figura 8A-B). As HRIGs também foram testadas contra o painel de pseudovírus e vírus e mesmo se é uma mistura de anticorpos policlonais anti-proteína G cobriu somente 25% dos lissavírus não RABV e 36% dos lissavírus não RABV do filogrupo I (cf. a Figura 8).

[00336] De modo a investigar a capacidade dos anticorpos de acordo com a presente invenção para neutralizar diferentes isolados de RABV em mais detalhes, a análise da atividade de neutralização dos anticorpos de acordo com a presente invenção RVC20 e RVC58, e dos anticorpos de referência CR57 e CR4098 foi em seguida estendida a um painel muito grande de isolados de RABV (n=26, 24 vírus e 2 pseudovírus), os quais são representativos de todas as linhagens circulantes (isto é, linhagens Americana, Asiática, Cosmopolita, África 2, África 3 e Ártico/ Ártico-like) (Figura 9). Todos os 26 isolados de RABV foram neutralizados de modo eficaz pelos anticorpos RVC20 e RVC58 com IC50 e IC90 médias geométricas de 26 e 12 ng/ml, respectivamente. Como uma comparação CR57 e CR4098 também neutralizaram todos os RABV testados mas com maiores valores de IC50 e IC90 de 61 e 100 ng/ml, respectivamente. Digno de nota, CR4098 neutralizou dois isolados de RABV com IC50 >10000 ng/ml, uma concentração a qual provavelmente não é eficaz in vivo.

[00337] Em uma etapa adicional, a análise da atividade de neutralização do RABV dos anticorpos foi adicionalmente estendida, incluindo o anticorpo de referência adicional RAB1 e um painel de isolados de RABV ainda maior (n=35, 27 vírus e 8 pseudovírus; CVS-11 foi testado como vírus infeccioso e como pseudovírus com a Fig. 10 incluindo CVS-11 testado como vírus infeccioso e a Fig. 11 mostrando os resultados para todos os três testes de neutralização realizados com CVS- 11, a saber pseudovírus (PV), FAVN e RFFIT), os quais são representativos de todas as linhagens circulantes lineages (isto é, linhagens Americana, Asiática, Cosmopolita, África 2, África 3 e Ártico/ Ártico- like) (Figura 10B). A completa descrição dos isolados pode ser recuperada da Figura 1. Conforme mostrado na Figura 10A, todos os 35 isolados de RABV foram neutralizados de modo eficaz pelos anticorpos RVC20 e RVC58 com valores da IC50 (para vírus infecciosos) ou valores da IC90 (para pseudovírus) variando de 0,1 a 140 ng/ml. Como uma comparação, os anticorpos de referência CR57, CR4098 e RAB1 neutralizaram todos os RABV testados, mas com uma potência significativamente menor do que RVC20 e RVC58 e com uma gama maior de valores de IC50 ou IC90 (isto é, 0,6 a 969 ng/ml, 0,7 a 23600 ng/ml, 1 a 4153 ng/ml, respectivamente, cf. Fig. 10A). De maneira similar a RVC20 e RVC58, HRIG neutralizou a grande maioria das cepas do RABV testadas com uma faixa estreita de valores de IC50. De modo importante, CR4098 e RAB1 neutralizaram seis e três isolados de RABV, respectivamente, com uma IC50 >1000 ng/ml (cf. Fig. 10A), uma concentração a qual provavelmente não é eficaz em profilaxia pós- exposição.

[00338] Esta análise foi estendida a 8 isolados de RABV adicionais para os quais a capacidade dos anticorpos para ligar a céluas trans- fectantes de proteína G foi testada por citometria de fluxo (Figura 11). Os genes G de comprimento total das cepas de RABV foram otimizados por códons para expressão celular eucariótica e clonados no vetor phCMV1 (Genlantis). Plasmídeos de expressão de proteína G foram usados para transfectar células 293F-Expi. Três dias depois da trans- fecção, as células foram coletadas, fixadas e permeabilizadas com sa- ponina para coloração imune (immunostaining) de todos os anticorpos de teste. A ligação dos anticorpos às células transfectadas foi analisada usando um Becton Dickinson FACSCanto2 (BD Biosciences) com o software FlowJo (TreeStar). Conforme mostrado na Figura 11, todas estas cepas de RABV foram reconhecidas por RVC20 e RVC58, ao passo que RAB1 não se ligou à cepa 91001USA e CR57 não se ligou às cepas RV/R.3PHL/2008/TRa-065 e 09029NEP. Estes achados estendem o número de isolados de RABV reconehcidos por RVC20 e RVC58 para 43.

[00339] A Figura 10B mostra a árvore filogenética de 2215 sequências de proteína G do RABV recuperadas de bancos de dados públicos. Salientadas com pontos pretos estão as sequências dos vírus RABV testados (duas sequências de proteína G, isto é, CV9.13, Mauri- tania/dog/2019-2006/V6235-2007 não estavam disponíveis e portanto não foram incluídas na árvore). Isto mostra que os vírus RABV testados (pontos pretos) são representativos de todas as linhagens circulantes (isto é, linhagens Americanas, Asiáticas, Cosmopolitas, África 2, África 3 e Ártico/ Ártico-like).

[00340] Uma seleção dos resultados de neutralização usando pseudovírus RABV (PV, o teste de neutralização PV foi realizado de acordo com Wright, E. et al., J Gen. Virol 89, 2204-2213, 2008 e Wright, E. et al., Vaccine 27, 7178-7186, 2009, o qual é incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente) ou vírus infecciosos (conforme medido ou pelo teste de neutralização de vírus de anticorpos fluorescentes, FAVN, de acordo com Cliquet, F., et al., J. Immunol Methods 212, 79-87, 1998, o qual é incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente, ou pelo teste de inibição de foco fluorescente rápido, RFFIT, de acordo com Smith, J. S., et al., Bull. World Health Organ. 48, 535-541, 1973, o qual é incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente) e as características dos isolados de RABV e não RABV selecionados são mostradas nas Figuras 12 e 13, respectivamente. Exemplo 5: Mapeamento de epitopos usando pseudovírus mutantes.

[00341] De modo a melhor refinar a especificidade de epitopos dos 12 anticorpos monoclonais humanos selecionados, estes foram testados contra pseudotipos de RABV manipulados. Em particular, as alterações de aminoácidos K226E, K226N, G229E, N336D e N336S encontradas nos mutantes de fuga viral CR57 e CR4098 descritos em Bakker, A. B. H. et al., J Virol 79, 9062-9068, 2005 e em Marissen, W. et al., J Virol 79, 4672-4678, 2005, foram introduzidas no gene CVS- 11 G e foram produzidos os pseudovírus mutantes correspondentes.

[00342] O painel de 12 anticorpos selecionados bem como os anti-corposde referência CR57 e CR4098 foram testados a 15 µg/ml para sua capacidade para neutralizar os 5 pseudovírus mutantes (K226E, K226N, G229E,N336D e N336S) e comparados com a cepa de origem correspondente CVS-11. Os resultados desta análise estão resumidos na Figura 14. Os anticorpos CR57 e RVC20, mas não RVC3, não foram capazes de neutralizar os mutantes de fuga de CR57 CVS-11: K226E, K226N e G229E. Estes resultados indicam que RVC3 reco- nhece um epitopo no sítio antigênico I o qual é distinto daquele reco-nhecido por CR57, e que RVC20 reconhece um epitopo similar ao que é reconhecido por CR57. No entanto, a descoberta de que RVC20 é caracterizado por uma reatividade mais ampla contra lissavírus não RABV (Figura 8) em comparação com CR57 indica que o modo do an-ticorpo RVC20 de reconhecimento de seu epitopo cognato no sítio an- tigênico I é distinto daquele de CR57, sendo capaz de tolerar um maior número de modificações de aminoácidos no sítio de ligação e nos re-síduos em torno.

[00343] Todos os anticorpos, incluindo CR4098, com a exceção de RAB1 (dados não mostrados), foram capazes de neutralizar os mutan- tes de fuga de CR4098 CVS-11: N336D, portanto indicando que esta mutação não tem um impacto significativo sobre a ligação a seus epitopos cognatos no contexto da proteína G do CSV-11. Além disso, todos os anticorpos do sítio antigênico III da invenção, RVC58 em particular, apresentaram uma maior amplitude de reatividade com lissaví- rus não RABV em comparação com CR4098 (Figura 7).

Exemplo 6: Análise da conservação dos epitopos RVC20 e RVC58 dentro dos isolados de RABV.

[00344] O sítio antigênico I reconhecido pelo anticorpo CR57 foi definido por análise de varredura de peptídeos e pelo isolamento dos mu- tantes de fuga viral: K226E, K226N, e G229E e foi visto que se localiza na região de ligação mínima composta pelos resíduos KLCGVL (sequência de consenso e posições 226 a 231 da proteína G do RABV; Marissen, W. et al., J. Virol 79, 4672-4678, 2005). Os resultados da competição mostrados na Figura 4 e os resultados do teste de pseu- dovírus mutante mostrado na Figura 14 indicam que RVC20 se liga ao sítio antigênico I. Os presentes inventores portanto analisaram o grau de conservação dos resíduos aminoácidos do sítio antigênico I em um painel de 2566 sequências de isolados de RABV independentes recu-perados a partir de múltiplos bancos de dados públicos representativos da diversidade global de RABV.

[00345] Deste modo, foi visto que a posição 226 é uma K em 99,73% e R em 0,19% das sequências analisadas (R ou K em 99,92% dos isolados) (Figura 15A). RVC20, mas não CR57, neutraliza vírus carregando tanto K quanto R na posição 226 (Figura 16). A outra posição polimórfica no sítio antigênico I é o resíduo 231, o qual é L em 67,65%, S em 17,30% e P em 14,73% dos isolados de RABV analisados (L, S ou P estão presentes em 99,69% das sequências, Figura 15A). RVC20 e CR57 foram testados e neutralizaram lissavírus carregandoresíduos leucina, serina ou prolina na posição 231 (Figura 16). Esta análise confirmou nossos resultados de neutralização anteriores e indicaram que o epitopo de anticorpo RVC20 é altamente conservado no RABV. De modo importante, todos os três mutantes de fuga de CR57 e RVC20 CVS-11 na posição 226 são neutralizados de modo eficaz por RVC58.

[00346] Uma análise similar foi realizada para o anticorpo RVC58 do sítio antigênico III. O sítio antigênico III é essencialmente formado pelos resíduos KSVRTWNEI (sequência de consenso e posições 330 a 338 da proteína G do RABV; (Walker, P. J. et al., J. Gen. Virol 80, 1211-1220, 1999; Bakker, A. B. H. et al. , J Virol 79, 9062-9068, 2005). Os resultados da competição mostrados na Figura 4 e os resul-tados do teste de pseudovírus mutante mostrados na Figura 14 indicam que RVC58 reconhece resíduos dentro do sítio antigênico III. Os presentes inventores portanto analisaram, conforme descrito acima para o sítio antigênico I, o grau de conservação dos resíduos aminoá- cidos do sítio antigênico III em um painel de 2566 sequências de isolados de RABV independentes recuperados a partir de múltiplos bancos de dados públicos representativos da diversidade global de RABV (como para o sítio antigênico I acima).

[00347] Deste modo, foi visto que as posições 330, 331, 334, 335 e 337 são altamente conservadas (>99,61%), ao passo que os resíduos 332, 333, 336 e 338 são polimórficos (Figura 15B). A posição 330 é uma K em 99,61% e N em 0,27% das sequências analisadas (K ou N estão presentes em 99,88% das sequências). RVC58 foi demonstrado para neutralizar vírus carregando ou K ou N na posição 330 (Figura 16). A posição 331 é altamente conservada sendo codificada por S em 99,96% dos isolados. A posição 332 é uma V em 77,05% e I em 22,88% das sequências (V ou I estão presentes em 99,93% dos isolados). RVC58 foi demonstrado para neutralizar lissavírus carregando ou V ou I na posição 332. A posição 333 é R em 96,22% dos isolados. Vários outros resíduos, mas não D, são encontrados na posição 333 em isolados de RABV. Em contraste, os lissavírus do filogrupo II carregam uma D naquela posição e estes vírus não são neutralizados por RVC58, portanto sugerindo que uma D na posição 333 pode comprometer a ligação de RVC58, mas este resíduo não é encontrado em isolados de RABV naturais. A posição 334 é uma T em 99,65% dos isolados. A posição 335 é W em 100% dos isolados. A posição 336 é N em 90,57%, D em 3,59%, S em 5,65% e K em 0,08% dos isolados de RABV analisados (N, D, S ou K estão presentes em 99,89% dos isolados). RVC58 foi demonstrado para neutralizar lissavírus carregando ou N, D, S ou K na posição 336. Digno de nota, RABV carregando D na posição 336 não foi neutralizado por CR4098 e RAB1, portanto sugerindo que potencialmente 4% dos RABVs circulantes são resistentes a neutralização por CR4098 e a neutralização por RAB1. Digno de nota, a maioria dos isolados de RABV africanos analisados aqui (59,1%) carregam uma D na posição 336 representada. Estes isolados correspondemà linhagem África2. A posição 337 é uma E em 99,61% e D em 0,35% dos isolados (E ou D estão presentes em 99,96% dos isola- dos). RVC58 foi demonstrado para neutralizar lissavírus carregando ou E ou D na posição 337. Finalmente, a posição 338 é I em 93,73% e V em 6,16% dos isolados analisados (I ou V estão presentes em 99,9% dos isolados). RVC58 foi demonstrado para neutralizar lissavírus carregando ou I ou V na posição 338.

[00348] Portanto, RVC58 reconhece isolados de RABV e não RABV carregando múltiplos resíduos nas posições polimórficas que são re-presentativas de pelo menos 99,80% dos RABVs analisados (Figura 15B, Figura 16). Esta análise confirmou nossos resultados de neutralização anteriores em que RVC58 neutralizou todos os lissavírus do fi- logrupo I testados e indicou que o epitopo de anticorpo RVC58 é altamente conservado em lissavírus RABV e não RABV.

[00349] Em suma, os dois anticorpos RVC58 e RVC20 neutralizaram de modo potente isolados de RABV humano e animal bem como a maioria dos lissavírus não RABV (incluindo o novo vírus do morcego eurasiano) por ligação de dois sítios antigênicos distintos (sítio I e sítio III) sobre a proteína G do vírus. A combinação destes dois anticorpos representa um tratamento com uma amplitude de reatividade imprece- dente e com reduzido risco de seleção de mutante de fuga.

Exemplo 7: Anticorpos RVC58 e RVC20 protegem hamsters sírios contra uma infecção letal pelo RABV.

[00350] De modo a investigar se os anticorpos RVC58 e RVC20 apresentam atividade de neutralização contra uma infecção letal pelo RABV in vivo, nós realizamos um estudo com hamster sítio (Mesocri- cetus auratus). Em 6 h depois da administração de uma dose letal de RABV CVS-11 (50 µl de 105.7 TCID50/ml no músculo gastrocnêmio da pata traseira esquerda, os hamsters (n=12 por grupo) foram deixados não tratados ou foi iniciada profilaxia com uma ou outra vacina (Imo- vax; Sanofi-Pasteur: uma vacina comercial de células diploides huma- nas inativadas, a qual foi administrada por via intramuscular em um volume de 0,05 ml no músculo gastrocnêmio da pata traseira direita, uma dose que corresponde a 0,125 unidades internacionais de antíge- no da raiva) mais HRIG (Berirab®, 20 mg/kg, equivalente a 20 UI/kg e administrada por via intramuscular em um volume de 0,05 ml), ou vacina mais 0,045 mg/kg de uma mistura equimolar dos anticorpos RVC20 e RVC58 ou vacina mais 0,0045 mg/kg de uma mistura equimolar dos anticorpos RVC20 e RVC58. Os animais tratados também receberam a vacina da raiva nos dias 3, 7, 14 e 28. Os animais foram monitorados durante o curso do experimento e foram eutanizados quando ocorreram sinais de raiva clínica. Onze de 12 animais que não foram tratados depois da infecção sucumbiram por volta do dia 8 (Figura 17). A profilaxia pós-exposição padrão se baseou em 20 mg/kg de HRIG e a vacina foi eficaz na redução da mortalidade global até 33% (8/12 animais sobreviveram; Figura 17). De modo importante, a combinação de RVC58+RVC20 a 0,045 mg/kg (os quais correspondem a 1/440 da HRIG administrada) protegeu 75% dos animais (9/12), ao passo que uma dose 10 vezes menor de RVC58 e RVC20 (0,0045 mg/kg) protegeu somente 33% dos animais. Isto sugere que 0,045 mg/kg de RVC58+RVC20 é superior à dose de 20 mg/kg de HRIG. A dose protetora de 0,045 mg/kg de RVC58+RVC20 corresponde em seres humanos a uma dose total média a ser administrada durante a PEP de somente 3 mg da mistura RVC58+RVC20. Esta quantidade pode ser produzida e formulada em uma forma estável (isto é, formulação liofilizada, onde, por exemplo, estudos prévios demonstraram que anticorpos monoclonais preservados por liofilização são estáveis por 33 meses a 40°C e 5 meses a 50°C) e em um custo acessível para os países em desenvolvimento.

Exemplo 8: Anticorpos RVC58 e RVC20 não interferem com a vacinação.

[00351] Durante a PEP, existe a possibilidade de que a administração simultânea de anticorpos e vacina diminua a capacidade da vacina para induzir o limiar de níveis de anticorpos neutralizantes requerido para proteção. Portanto, é crucial avaliar o grau no qual um tratamento com anticorpos interfere com a vacinação. De modo a determinar o efeito da mistura de anticorpos sobre a potência da vacina, um experimento animal in vivo foi realizado na ausência de estímulo com RABV. Em particular, todos os animais (n=12 por grupo) foram vacinados com vacina da raiva no dia 0, 3, 7, 14 e 28 (Imovax ,Sanofi- Pasteur, administrada por via intramuscular em um volume de 0,05 ml no músculo gastrocnêmio da pata traseira direita, uma dose que corresponde a 0,125 unidades internacionais de antígeno da raiva) e foram administrados de modo concomitante no dia 0 com HRIG (Beri- rab®, 20 mg/kg) ou uma mistura equimolar de RVC58+RVC20 a 0,045 mg/kg ou 40 mg/kg (dose 888 vezes maior) que foram injetadas por via intramuscular no músculo gastrocnêmio da pata traseira esquerda. Os títulos de ligação do soro (medidos em ELISA sobre placas revestidas com proteína G do RABV por detecção dos anticorpos de hamster ligadosà proteína G com anticorpos policlonais anti-hamster conjugados a fosfatase alcalina), títulos neutralizantes do soro (teste de neutralização FAVN sobre CVS-11; de acordo com Cliquet, F., et al., J. Immunol Methods 212, 79-87, 1998) e os níveis de anticorpos de IgG humana residuais foram determinados no dia 42. HRIG e 0,045 mg/kg de RVC58+RVC20 não reduziram a resposta de anticorpos de ligação de IgG de hamster endógena à proteína G do RABV (Figura 18A) em comparação com animais recebendo vacina somente. Digno de nota, o nível de anticorpos neutralizantes em animais tratados com tanto a dose de 0,045 quanto a de 40 mg/kg é comparável ao provocado em animais tratados pela vacina somente ou pela vacina e HRIG e na maioria dos animais o título de neutralização é acima de 10 UI/ml (Fi- gura 18B). Finalmente, apesara de ainda altos níveis de anticorpos humanos (acima 10 µg/ml) serem encontrados no dia 42 em animais tratados com 20 mg/kg de HRIG ou 40 mg/kg de RVC58+RVC20, níveis indetectáveis a baixos níveis de IgG humana foram encontrados nos soros de animais tratados com 0,045 mg/kg de RVC58+RVC20 (Figura 18C). Estes resultados sugerem que uma dose de 0,045 mg/kg de RVC58+RVC20, a qual foi demonstrado que é protetora, não compromete a produção de anticorpos neutralizantes de vírus provocados em animais depois de vacinação contra RABV.

Exemplo 9: Anticorpos RVC58 e RVC20 agem terapeuticamente em hamsters sírios infectados de modo letal com RABV.

[00352] Atualmente, não existe nenhum tratamento para a raiva. O desenvolvimento de um tratamento vai ser de benefício para pelo menos duas classes de pacientes: aqueles com exposição conhecida ao RABV mas que não chegaram a receber pronta profilaxia pós- exposição devido a circunstâncias e que estão em risco aumentado de desenvolver a infecção pelo RABV, e aqueles que não reconheceram contato com o vírus e apresentam sinais (de gravidade diferente) da doença (por exemplo, indivíduos infectados por contatos não notados com morcegos infectados; RABV de origem de morcego onde a raiva canina está controlada se tornou a principal causa de raiva humana). Injeção única ou múltiplas injeções i.v. com o coquetel de RVC58 e RVC20 (isto é, uma mistura equimolar dos anticorpos RVC58 e RVC20) vai proporcionar altos títulos de anticorpos neutralizantes sistêmicos (inclusive no sistema nervoso central) e bloquear a replicação viral e a progressão da doença. O desenvolvimento de um coquetel de anticorpos potentes e amplamente neutralizantes pode ajudar a expandir a janela de tratamento pós-exposição para a infecção humana pelo RABV, que é atualmente limitada aos primeiros dias depois da infecção. Nerstes indivíduos o RV pode já ter atingido os tecidos do sistema nervoso central (SNC) e também podem ter aparecido sinais iniciais ou tardios da doença. Estes pacientes podem se beneficiar de um tratamento com anticorpos neutralizantes altamente potentes que podem passar através da barreira hematoencefálica (ou podem ser administrados diretamente no SNC) liberando uma quantidade suficiente de anticorpos capazes de neutralizar de modo eficaz a replicação do vírus no tecido do SNC.

[00353] O potencial terapêutico dos anticorpos RVC58+RVC20 foi avaliado em hamsters sírios estimulados letalmente com um isolado de campo de RABV. Em particular, RVC58+RVC20 foram testados em hamsters sírios estimulados no músculo gastrocnêmio de uma pata traseira com uma dose letal de um vírus de campo isolado a partir das glândulas salivares de uma raposa infectada (Italy/red fox/ 673/2011). Em animais infectados, o RABV foi detectável no SNC (sistema nervoso central) no dia 5 depois do estímulo. Os animais foram tratados com uma única injeção de 40 mg/kg de RVC58+RVC20 administrada ou no dia 1 (n=12), no dia 5 (n=12) ou no dia 9 (n=7) depois da infecção sem uma administração concomitante da vacina. Os grupos de controle receberam ou salina tamponada com fosfato (n=17) ou a PEP padrão (20 mg/kg de HRIG e vacina; n=12). Os animais foram monitorados duas vezes ao dia e eutanizados quando apareceram sinais clínicos da raiva. De modo importante, RVC58+RVC20 protegeu os animais contra infecção letal quando administrado até 5 dias depois da infecção (Figura 19). Digno de nota, 3 dos 12 animais tratados apresentaram sinais clínicos da doença (paralisia do sítio de estímulo da pata traseira), os quais, no entanto, não se desenvolveram adicionalmente. Neste modelo, a PEP clássica conferiu somente uma modesta proteção em comparação com os animais não tratados (Figura 19). Não foram detectados sinais de doença nos animais sobreviventes até 60 dias depois da infecção.

[00354] Em todos os animais sucumbidos e em todos os sobreviventes (os quais foram sacrificados no dia 60) a presença de RABV foi revelada quantificando o RNA genômico e o mRNA viral codificando para a proteína N na medula espinhal, na medula oblongata / no cere- belo e no cérebro quantificada usando PCR em tempo real quantitativo. Digno de nota, níveis detectáveis de RNA viral foram medidos no SNC de animais assintomáticos tratados com RVC58+RVC20 no dia 1 ou 5 depois da infecção (embora em níveis 100 a 1000 menores do que os medidos em animais sucumbindo) (Figura 20A), portanto indicando que a infecção pelo RABV inicial não foi abortada mas mantida sobre controle dentro do SNC pelos anticorpos neutralizantes altamente potentes administrados e mais provavelmente por uma resposta imune endógena concomitante ao vírus.

[00355] O desenvolvimento de uma robusta resposta imune endó-genatambém foi confirmado pela medição dos títulos de anticorpos IgG de hamster específicos contra a proteína G do RABV nos soros de todos os animais (Figura 20B). Digno de nota, animais recebendo RVC58+RVC20 no dia 5 (todos sobreviveram à infecção let) desenvol-veram altos níveis de anticorpos IgG específicos contra a proteína G em níveis comparáveis, ou maiores, do que os provocados nos animais sobreviventes pela vacina no grupo PEP. O nível destes anticor-postambém foi comparável ou maior do que os provocados em ani-maisnão estimulados recebendo a PEP padrão (vide a Figura 18). Fi-nalmente, a alta dose de RVC58+RVC20 também pode ser compatível com a vacinação concomitante conforme mostrado pela descoberta de que a utilização de uma alta dose destes anticorpos não compromete a resposta imune à vacina (Figuras 18A a B).

[00356] Amostras de tecido do cérebro, da medula oblongata e da espinha dorsal de animais de controle sintomáticos ou de animais re- cebendo RVC58+RVC20 no dia 5 (e sacrificados no dia 60) foram ana-lisadas para a presença de antígeno de RABV N por imuno- histoquímica (IHC). Em particular, a análise por IHC foi focalizada sobre a identificação de corpúsculos de Negri, os quais são corpúsculos de inclusão patognomônicos, eosinofílicos, nitidamente esboçados (de 2 a 10 µm de diâmetro) compostos de agregados de nucleocapsídeos e encontrados no citoplasma de neurônios contendo o vírus da raiva. Apesar de numerosos corpúsculos de Negri terem sido encontrados em tecidos do sistema nervoso central de animais de controle positivo, somente muito poucos corpúsculos foram identificados em animais tratados com anticorpos no dia 5 (Figura 21). Estes resultados confir-mam que o RABV atingiu o SNC, e mesmo o cérebro, em animais tra-tados com a alta dose de RVC58+RVC20 sem causar sintomas.

[00357] A presença de anticorpos neutralizantes anti-RABV precoce nos pacientes em curso clínico é considerada um importante fator que con-tribui para um desfecho favorável. Isto provavelmente ocorre em menos de 20% de todos os pacientes com raiva. A presença de anticorpos neutrali- zantes anti- RABV é um marcador de uma resposta imune adaptativa ativa que é essencial para o clearance viral (Lafon, M., in ‘‘Rabies’’, A. C. Jackson and W. H. Wunner, 3rd eds., pp. 489-504, Elsevier Academic Press, Londres, 2013). Houve seis sobrevivewntes da raiva que receberam vacina da raiva antes do início de sua doença (e somente um que não recebeu vacina). Isto corrobora a noção de que uma resposta imune precoce está associada com um desfecho positivo. Finalmente, a maioria dos sobreviventes da raiva apresentaram anticorpos neutralizantes anti-RABV no soro e no líquido cefalorraquidiano. Os anticorpos potentes e amplamente neu- tralizantes do RABV humanos de acordo com a presente invenção, por exemplo, RVC20 e RVC58, oferecem a oportunidade de conferir uma imunidade passiva imediata e robusta, a qual pode representar (i) um agente potente para terapia pós-exposição, a qual é eficaz em concentrações mui- to menores comparada com a HRIG e (ii) um agente terapêutico válido para o tratamento de pacientes com um diagnóstico clínico de raiva precoce. A este respeito é concebível que um pronto início da terapia possa oferecer a melhor oportunidade para um desfecho favorável. Os anticorpos de acordo com a presente invenção, por exemplo, os anticorpos monoclonais humanos RVC58 e RVC20, podem portanto representar uma terapia eficaz isolada ou em combinação com outras terapias incluindo vacinação contra a raiva, ribavirina (ou outros antivirais), alfa interferon e cetamina. Tabela de Sequências e Números de SEQ ID * as sequências salientadas em negrito são regiões de CDRs (nucleo- tídeo ou aa) e os resíduos sublinhados são resíduos mutados em comparação com a sequência da “linhagem germinativa”.

Claims

1. Anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, que neutraliza a infecção por lissavírus, caracterizado pelo fato de que o anticorpo, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 93-97 e 99, respectivamente, ou nas SEQ ID NOs: 93-96 e 9899, respectivamente.

2. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada conforme estabelecida na SEQ ID NO: 107 e uma região variável da cadeia leve como estabelecida na SEQ ID NO: 108.

3. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é um anticorpo humano, um anticorpo monoclonal, um anticorpo monoclonal humano, um anticorpo purificado, um anticorpo de cadeia simples, Fab, Fab', F(ab')2, Fv ou scFv.

4. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que compreende uma sequência nucleotídica selecionada dentre as SEQ ID NOs: 100-106 ou as se-quências nucleotídicas degeneradas das mesmas que codificam o an-ticorpo, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a mo-lécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 4.

6. Célula isolada, caracterizada pelo fato de que expressa o anticorpo, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou que compreende o vetor, como definido na reivindicação 5, em que a célula é uma célula bacteriana.

7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, o ácido nucleico, como definido na reivindicação 4, o vetor, como definido na reivindicação 5, ou a célula isolada, como definida na reivindicação 6, e um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos dois anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, em que um dos pelo menos dois anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, é o anticorpo ou o fragmento de ligação ao an- tígeno como definido em qualquer um das reivindicações 1 a 4, e os outros anticorpos/anticorpo, ou fragmento(s) de ligação ao antígeno dos mesmos, compreende(m) (i) sequências de aminoácidos de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de amino- ácidos de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 165-169 e 171 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 165-168 e 170-171, respectivamente; (ii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 da cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1-5 e 7 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1- 4 e 6-7, respectivamente; (iii) sequências de ami- noácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 19-23 e 25 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 19- 22 e 24-25, respectivamente; (iv) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 da cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 37-41 e 43 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 37- 40 e 42-43, respectivamente; (v) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 da cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 55-59 e 61 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 55- 58 e 60-61, respectivamente; (vi) sequências de aminoácidos de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 75-79 e 81 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 75- 78 e 80-81, respectivamente; (vii) sequências de aminoácidos de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 111115 e 117 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 111- 114 e 116-117, respectivamente; (viii) sequências de aminoácidos de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de amino- ácidos de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 129-133 e 135 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 129-132 e 134-135, respectivamente; (ix) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 da cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 147-151 e 153 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 147- 150 e 152-153, respectivamente; (x) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 da cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 183-187 e 189 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 183-186 e 188-189, respectiva- mente; e/ou (xi) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 da cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 201-205 e 207 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs : 201204 e 206-207, respectivamente, em que os pelo menos dois anticorpos, ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, se ligam especificamente a dife-rentesepítopos na glicoproteína G de RABV, de preferência em que um anticorpo de pelo menos dois anticorpos se liga ao sítio antigênico I na glicoproteína G de RABV e outro anticorpo de pelo menos dois anticorpos se liga ao sítio antigênico III na glicoproteína G de RABV.

9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que um dos pelo menos dois anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreende sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 93-97 e 99 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 93-96 e 98-99, respectivamente, e outro dos pelo menos dois anticorpos compreende sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e aminoá- cido CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 165-169 e 171 ou nas SEQ ID NOs: 165-168 e 170171, respectivamente.

10. Uso do anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para monitorar a qualidade das vacinas de lissavírus anti-RABV ou anti-não-RABV, verificando se o antí- geno da referida vacina contém o epítopo específico na conformação correta.

11. Uso do anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica ou kit para profilaxia, tratamento ou atenuação de infecção por Lissavírus RABV e/ou não-RABV, preferencialmente lissavírus filogrupo I RABV e/ou não-RABV, mais preferencialmente RABV e/ou EBLV-1.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica ou kit compreende outro anticorpo monoclonal isolado que neutraliza a infecção por lissavírus e que compreende (i) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve sequências de aminoácidos conforme apresentadas nas SEQ ID NOs: 165-169 e 171 ou conforme apresentadas nas SEQ ID NOs: 165-168 e 170-171, respectivamente; (ii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1-5 e 7 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1- 4 e 6-7, respectivamente; (iii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 19-23 e 25 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 19- 22 e 24-25, respectivamente; (iv) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de amino- ácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 37-41 e 43 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 37- 40 e 42-43, respectivamente; (v) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de amino- ácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 55-59 e 61 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 55- 58 e 60-61, respectivamente; (vi) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de amino- ácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 75-79 e 81 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 75- 78 e 80-81, respectivamente; (vii) sequências de aminoáci- dos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve, conforme esta-belecido nas SEQ ID NOs: 111-115 e 117 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 111- 114 e 116-117, respectivamente; (viii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 129-133 e 135 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 129- 132 e 134-135, respectivamente; (ix) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 147-151 e 153 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 147- 150 e 152-153, respectivamente; (x) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 183-187 e 189 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 183186 e 188-189, respectivamente; ou (xi) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de amino- ácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 201-205 e 207 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 201 -204 e 206-207, respectivamente; e em que ambos os anticorpos se ligam especificamente a diferentes epítopos na glicoproteína G de RABV, preferencialmente em que o anticorpo, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga ao sítio antigênico I ou III na glicoproteína G de RABV e o outro anticorpo se liga ao outro antigênico sítios I ou III na glicoproteína G de RABV.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o outro anticorpo compreende sequências de aminoá- cidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve, conforme esta-belecidas nas SEQ ID NOs: 165-169 e 171, respectivamente, ou nas SEQ ID NOs: 165-168 e 170-171, respectivamente.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracteri-zado pelo fato de que o anticorpo e o outro anticorpo estão presentes na composição farmacêutica ou kit em quantidades equimolares.

15. Uso do anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, do ácido nucleico, como definido na reivindicação 4, do vetor, como definido na reivindicação 5, da célula isolada, como definida na reivindicação 6, ou da composição farmacêutico, como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de uma composição farmacêutica, kit ou vacina para (i) profilaxia, em particular profilaxia pós-exposição, tratamento ou atenuação de infecção por lissavirus RABV e/ou não-RABV; (ii) vacinação contra infecção por lossavirus RABV e/ou não-RABV; ou (iii) diagnóstico de infecção por lyssavírus RABV e/ou outro.

16. Kit de partes, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos dois anticorpos diferentes, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, neutralizando a infecção por lissavírus, em que um dos pelo menos dois anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antí- geno dos mesmos, é o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antíge- no como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e o outro anticorpo/anticorpos, ou fragmento(s) de ligação ao antígeno dos mesmos, se liga especificamente a um epítopo diferente na glicoprote- ína G de RABV.

17. Kit de peças, de acordo com a reivindicação 16, carac-terizado pelo fato de que o kit compreende pelo menos dois anticorpos diferentes, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, em que um dos pelo menos dois anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antí- geno dos mesmos, é o anticorpo, ou o fragmento de ligação ao antí- geno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e o outro anticorpo/anticorpos, ou fragmento(s) de ligação ao antígeno dos mesmos, compreende(m) (i) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 165-169 e 171 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 165-168 e 170-171, respectivamente; (ii) sequências de aminoá- cidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 da cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve conforme esta-belecido nas SEQ ID NOs: 1-5 e 7 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1-4 e 6-7, respectivamente; (iii) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de amino- ácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 19-23 e 25 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 19- 2 e 24-25, respectivamente; (iv) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 da cadeia pesada e sequências de amino- ácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 37-41 e 43 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 37- 40 e 42-43, respectivamente; (v) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 da cadeia pesada e sequências de amino- ácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 55-59 e 61 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 55- 58 e 60-61, respectivamente; (vi) sequências de aminoácidos de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de ami- noácidos de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve conforme esta- belecido nas SEQ ID NOs: 75-79 e 81 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 75- 78 e 80-81, respectivamente; (vii) sequências de aminoácidos de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e se-quências de aminoácidos de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve conforme estabelecido em SEQ ID NOs: 111-115 e 117 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 111- 114 e 116-117, respectivamente; (viii) sequências de aminoácidos de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 129133 e 135 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 129- 132 e 134-135, respectivamente; (ix) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 da cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 147-151 e 153 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 147- 150 e 152-153, respectivamente; (x) sequências de amino- ácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 da cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 183-187 e 189 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 183- 186 e 188-189, respectivamente; e/ou (xi) sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 da cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 201-205 e 207 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs : 201-204 e 206-207, respectivamente, em que os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antíge- no dos mesmos, se ligam especificamente a diferentes epítopos na glicoproteína G de RABV, de preferência em que um anticorpo de pelo menos dois anticorpos se liga ao sítio antigênico I na glicoproteína G de RABV e outro anticorpo do em pelo menos dois anticorpos ligam-se ao sítio antigênico III da glicoproteína G de RABV.

18. Kit de peças, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos, pelo menos, dois anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos com-preendesequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 93-97 e 99 ou conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 93-96 e 98-99, res-pectivamente, e outro dos pelo menos dois anticorpos compreende sequências de aminoácidos CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada e sequências de aminoácidos de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 165-169 e 171 ou nas SEQ ID NOs: 165-168 e 170-171, respectivamente.

19. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada das SEQ ID NOs: 109 e 110 ou suas se-quências de ácidos nucleicos degeneradas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos.