ES2838679T3 - Anticuerpos que neutralizan de forma potente el virus de la rabia y otros lisavirus y su utilización - Google Patents

Anticuerpos que neutralizan de forma potente el virus de la rabia y otros lisavirus y su utilización Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que neutraliza la infección por lisavirus, caracterizado porque el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establecen en las SEQ ID NO: 165-169 y 171, respectivamente, o en las SEQ ID NO: 165-168 y 170-171, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos que neutralizan de forma potente el virus de la rabia y otros lisavirus y su utilización
La presente invención se refiere a anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que neutralizan de forma potente la infección tanto con el virus de la rabia (RABV) como de lisavirus no RABV. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican y a células B inmortalizadas y células plasmáticas cultivadas que producen tales anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Además, la invención se refiere al uso de los anticuerpos y de los fragmentos de anticuerpos de la invención en la profilaxis y el tratamiento de la infección por RABV y de la infección con lisavirus distintos de RABV.
La rabia es una infección viral que causa una inflamación aguda del cerebro. La rabia se distribuye en casi todo el mundo y afecta principalmente a animales salvajes y domésticos, pero también se ven implicados los seres humanos, resultando en una enfermedad devastadora, que es casi el 100% invariablemente mortal en personas que no reciben una profilaxis post-exposición (PEP). Los primeros síntomas de la rabia pueden incluir fiebre y hormigueo en la zona de exposición. Estos síntomas van seguidos de uno o más de los siguientes síntomas: movimientos violentos, excitación incontrolada, miedo al agua, incapacidad de mover partes del cuerpo, confusión y pérdida de conocimiento. Una vez que aparecen los síntomas, la rabia casi siempre resulta en la muerte. El período de tiempo entre el momento de contraer la enfermedad y el inicio de los síntomas suele ser de uno a tres meses. Sin embargo, este tiempo puede variar desde menos de una semana hasta más de un año. El tiempo depende de la distancia que el virus debe viajar para llegar al sistema nervioso central.
La rabia es causada por diversos lisavirus, incluido el virus de la rabia y otros lisavirus, por ejemplo el lisavirus del murciélago europeo.
Los lisavirus tienen simetría helicoidal, con una longitud de aproximadamente 180 nm y una sección transversal de aproximadamente 75 nm. Estos virus están envueltos y tienen un genoma de ARN monocatenario con sentido negativo. La información genética está empaquetada como un complejo de ribonucleoproteína donde el ARN está fuertemente unido por la nucleoproteína viral. El ARN genómico del virus codifica cinco genes cuyo orden está altamente conservado: nucleoproteína (N), fosfoproteína (P), proteína de matriz (M), glicoproteína (G) y la ARN polimerasa viral (L).
El género Lisavirus se subdivide en tres filogrupos. El filogrupo I incluye las especies virus de la rabia (RABV), lisavirus de murciélago europeo tipo 1 (EBLV-1) y tipo 2 (EBLV-2), virus Duvenhage (DUVV), lisavirus de murciélago australiano (ABLV), virus de Aravan (ARAV), virus Khujand (KHUV), lisavirus Bokeloh de murciélago (BBLV) y virus Irkut (IRKV). El filogrupo II incluye el virus del murciélago de Lagos (LBV), el virus Mokola (MOKV) y el virus del murciélago Shimoni (SHIV o SHIBV). Los virus restantes, el virus del murciélago del Cáucaso Occidental (WCBV) y el lisavirus Ikoma (IKOV) no pueden incluirse en ninguno de estos filogrupos, pero están relacionados filogenéticamente entre sí; sin embargo, sus distancias genéticas son mayores que las distancias entre los filogrupos I y II (Bourhy, H., et al. Journal of Clinical Microbiology 30, 2419-2426, 1992; Bourhy, H., et al. Virology 194, 70-81, 1993; Amengual, B., et al. J Gen. Virol 78, 2319-2328, 1997; Hooper, P. T. et al. Bulletin de I'lnstitut Pasteur 95, 209-218, 1997; Kuzmin, I.V. et al. Virus Res 149, 197-210, 2010; Badrane, H. et al. J Virol 75, 3268 - 3276, 2001; Marston, D. A. et al. Emerg Infect Dis 18, 664-667, 2012). Es importante destacar que todos los genotipos de estos lisavirus han causado muertes humanas y/o animales en la naturaleza (Badrane, H., et al. J Virol 75, 3268-3276, 2001).
El virus de la rabia (RABV) fue el primero de los catorce genotipos de lisavirus en identificarse. El virus de la rabia es un virus de clasificado como de ARN monocatenario, envuelto y con forma de bulbo grande y el genoma del virus de la rabia codifica para cinco proteínas virales: ARN polimerasa dependiente de ARN (L); una nucleoproteína (N); una proteína fosforilada (P); una proteína de matriz (M) ubicada en el lado interno de la envoltura viral y una glicoproteína de superficie externa (G). La proteína G (62-67 kDa) es una glicoproteína de tipo 1 compuesta por 505 aminoácidos con dos a cuatro sitios de N-glicosilación potenciales. La proteína G cubre la superficie exterior de la envoltura del virión y es el único antígeno diana capaz de inducir anticuerpos neutralizantes del virus.
La rabia está muy extendida en todo el mundo y aproximadamente 10 millones de personas al año reciben tratamiento después de una exposición a la rabia, generalmente después de la mordedura de animales infectados (perros, murciélagos, zorros, gatos, monos, mapaches, mofetas, ganado, lobos, coyotes y otros animales domésticos y salvajes). Se estima que entre 40.000 y 70.000 personas mueren cada año a causa de la enfermedad, principalmente en África, China e India, y el 50% de los casos de rabia en todo el mundo se producen en niños. Estos datos destacan la importante necesidad médica no satisfecha de un tratamiento de la rabia seguro, eficaz y asequible.
La prevención de la rabia se logra mediante la vacunación previa o posterior a la exposición, principalmente utilizando vacunas modernas basadas en cultivos de tejidos. Se recomienda la inmunización antes de la exposición (profilaxis previa a la exposición (PrEP)) para quienes tienen un alto riesgo y se logra mediante la administración de una vacuna contra la rabia (inmunización activa). El grupo de alto riesgo incluye personas que trabajan con murciélagos o que pasan períodos prolongados en zonas del mundo donde la rabia es común. Además, la vacuna antirrábica se recomienda para las personas que viajan a países de África y Asia, donde la rabia es endémica.
En la actualidad, las vacunas de la rabia disponibles incluyen aquellas basadas en tejido nervioso que son mayoritariamente empleadas pero de alto riesgo o vacunas de cultivo celular y huevos embrionados (CCEEV), más seguras pero más costosas. Por ejemplo, en Alemania sólo hay dos vacunas antirrábicas en el mercado, Rabipur® y "Tollwut-lmpfstoff (célula diploide humana [HDC]) inaktiviert". Estas vacunas contienen virus de la rabia inactivados. Ambas vacunas son recomendadas para el uso previo y posterior a la exposición.
Después de la exposición al virus, una profilaxis post-exposición (PEP) con la vacuna de la rabia y una inmunoglobulina de la rabia (RIG) constituyen el tratamiento estándar para prevenir la enfermedad si la persona recibe el tratamiento lo antes posible después de la infección, es decir, durante los primeros días tras la infección. Si no se trata hasta el inicio de los síntomas, la rabia es fatal casi en un 100%. Por tanto, actualmente no existe ningún tratamiento para la rabia.
El "tratamiento" utilizado actualmente cuando se supone que alguien está infectado por el virus es la profilaxis post-exposición (PEP), que combina inmunoglobulina de la rabia (RIG), en particular inmunoglobulinas de la rabia humanas o equinas (HRIG y ERIG, respectivamente), con una vacuna antirrábica. En particular, los pacientes reciben una dosis de RIG (inmunización pasiva) y varias dosis de la vacuna antirrábica (inmunización activa) de acuerdo con la información del fabricante de la vacuna antirrábica. En una terapia estándar ampliamente utilizada, por ejemplo, se administran cinco dosis de la vacuna durante un período de veintiocho días, es decir, la primera dosis de la vacuna contra la rabia se administra tan pronto como sea posible después de la exposición, preferiblemente el día 0, con dosis adicionales los días 3, 7, 14 y 28 después de la primera (véase http: //www.rki.de/DE/Content/lnfekt/EpidBull/Merkblaetter/Ratgeber_Tollwut.html, consultado el 12 de noviembre de 2014). Por el contrario, la inmunoglobulina de la rabia (RIG) para la inmunización pasiva se administra sólo una vez, preferiblemente al principio de la vacunación tras la exposición o tan pronto como sea posible después. La dosis de inmunoglobulina de la rabia humana (HRIG) propuesta por la OMS es de 20 lU/kg de peso corporal; para los productos de inmunoglobulina equina (ERIG) y F (ab')2 es de 40 lU/kg de peso corporal (véase http://www.who.int/rabies/human/WHO_strategy_prepost_exposure/en/index1.html#, recuperado el 12 de noviembre de 2014). En particular, dosis más altas pueden reducir la eficacia de la vacuna. Debería administrarse toda la inmunoglobulina de la rabia o tanto como sea posible desde el punto de vista anatómico para evitar un posible síndrome compartimental en o alrededor del sitio o sitios de la herida. La inmunoglobulina restante, si la hubiera, debe inyectarse vía intramuscular en un sitio distante del sitio de administración de la vacuna. La inmunoglobulina de la rabia se puede diluir a un volumen suficiente para que todas las heridas se infiltren de forma eficaz y segura (véase http://www.who.int/rabies/human/WHO_strategy_prepost_exposure/en/index1.html#, recuperado al 12 de noviembre de 2014). Esto suele tener éxito si se administra hasta 24-48 horas después de la exposición. El HRIG es ampliamente utilizado, especialmente en los países desarrollados, y se considera más seguro que el ERIG. El alto coste de HRIG y su limitada disponibilidad impiden su uso extendido en los países en desarrollo. Además, la vacuna y HRIG o ERIG no protegen eficazmente contra la infección por diferentes especies de lisavirus (la protección está inversamente relacionada con la distancia genética con la cepa de la vacuna). Así, se considera que la necesidad de reemplazar la HRIG con un producto basado en anticuerpos de la rabia al menos igual de potente y más seguro es importante para mejorar el acceso a productos biológicos frente a la rabia, en particular en los países en desarrollo.
Con este fin, en la última década se han desarrollado anticuerpos monoclonales de ratón y anticuerpos monoclonales humanos con dos productos en ensayos clínicos avanzados. Por ejemplo, se han descrito diversos anticuerpos monoclonales murinos contra RABV, incluyendo los anticuerpos murinos 62-7-13, M777-16-3 y M727-5-1, que también neutralizan otros lisavirus (Müller T. et al., Development of a Mouse Monoclonal Antibody Cocktail for Post-exposure Rabies Prophylaxis in Humans. PLOS NEGLECTED TROPICAL DISEASES, 2009, páginas e542). Para mejorar la vida media y disminuir la inmunogenicidad en humanos de los anticuerpos murinos 62-7-13, se ha desarrollado una versión quimérica ratón-humano de este anticuerpo con las regiones variables murinas (del anticuerpo 62-7-13) insertadas en las regiones constantes humanas y expresado en un sistema de producción vegetal (Both L. et al., Production, characterization, and antigen specificity of recombinant 62-71-3, a candidate monoclonal antibody for rabies prophylaxis in humans, THE FASEB JOURNAL, vol. 27, no. 5, 2013, páginas 2055 - 2065). Además, se ha desarrollado CL184 (producido por Crucell), que es una combinación de dos anticuerpos humanos denominados CR57 y CR4098, para reemplazar la HRIG en ensayos clínicos hasta la fase III (Bakker, A.B.H. et al. J Virol 79, 9062-9068, 2005; Goudsmit J, Marissen WE, Weldon WC, Niezgoda M, Hanlon CA, Rice AB, Kruif J, Dietzschold B, Bakker AB, Rupprecht CE (2006), Comparison of an anti-rabies human monoclonal antibody combination with human polyclonal anti-rabies immune globulin. J Infect Dis 193: 796-801). Sin embargo, recientemente el ensayo se ha detenido debido a la falta de actividad neutralizante del cóctel, o de unbo de los dos anticuerpos del cóctel, contra algunos aislados de RABV circulantes. Otro cóctel de anticuerpos que incluye los anticuerpos humanos CR57 y AR16 ha sido descrito por Cai K. et al., Fine mapping and interaction analysis of a linear rabies virus neutralizing epitope, MICROBES AND INFECTION, ELSEVIER, PARIS, FR, vol. 12, n° 12-13, 2010, páginas 948 - 955. Otro anticuerpo monoclonal humano que actualmente está en la fase clínica III en la India es RAB1, producido por el Mass Biologies and Serum Institute de la India, y que se basa en un único anticuerpo monoclonal (Sloan SE, Hanlon C, Weldon W, Niezgoda M, Blanton J, Self J, Rowley KJ, Mandell RB, Babcock GJ, Thomas WD,Jr, et al (2007), Identification and characterization of a human monoclonal antibody that potently neutralizes a broad panel of rabies virus isolates. Vaccine 25: 2800-2810; Nagarajan T, Marissen WE, Rupprecht CE (2014), Monoclonal antibodies for the prevention of rabies: theory and clinical practice. Antibody Technology Journal 4: 1-12). Sin embargo, se han identificado aislados de RABV que no son neutralizados por estos anticuerpos monoclonales (CR57, CR4098 y RAB1) (Kuzimina NA, Kuzmin IV, Ellison JA, Rupprecht CE (2013), Conservation of binding epitopes for monoclonal antibodies on the rabies virus glycoprotein. Journal of Antiviral and Antiretrovirals 5: 37-43, Marissen WE, Kramer RA, Rice A, Weldon WC, Niezgoda M, Faber M, Slootstra JW, Meloen RH, Clijsters-van der Horst M, Visser TJ, et al (2005), Novel rabies virus-neutralizing epitope recognized by human monoclonal antibody: fine mapping and escape mutant analysis. J Virol 79: 4672­ 4678). En el caso del anticuerpo RAB1, dos de los 25 aislados ensayados no fueron neutralizados y tres apenas se neutralizaron (Sloan SE, Hanlon C, Weldon W, Niezgoda M, Blanton J, Self J, Rowley KJ, Mandell RB, Babcock GJ, Thomas WD,Jr, et al (2007), Identification and characterization of a human monoclonal antibody that potently neutralizes a broad panel of rabies virus isolates. Vaccine 25: 2800-2810). En este caso, el riesgo de fallo de la PEP es mayor, al menos en principio, que en el caso del cóctel de anticuerpos CR57 y CR4098. Estos estudios indican que CR4098 y RAB1 tienen un rango de reactividad limitado frente a aislados que no son de RABV y que una fracción significativa de los aislados de RABV ensayados no están neutralizados o solo son poco neutralizados por estos anticuerpos antigénicos del sitio III. De hecho, debido a la falta de una amplia cobertura de RABV, recientemente se ha detenido el desarrollo de CL184, mientras que RAB1 aún está en desarrollo en fase 2/3 en la India. Además, en la WO 2011/080765 A2 se describen anticuerpos monoclonales humanos que neutralizan RABV y otros lisavirus, sin embargo, ninguno de estos anticuerpos fue capaz de to neutralizar EBLV-1 y MOKV.
Por consiguiente, todavía existe la necesidad de reemplazar HRIG con un producto basado en anticuerpos al menos igualmente potente y más seguro. Además, existe la necesidad de un producto capaz de prevenir y de tratar o atenuar la infección por diferentes lisavirus con una alta potencia y eficacia, es decir, un producto que no se limite a neutralizar únicamente el RABV, en particular debido a en algunos países, por ejemplo en Europa y Australia, la rabia es transmitida principalmente por murciélagos. Además, es importante tener anticuerpos que se dirijan a diferentes epítopos y diferentes sitios antigénicos en las diversas cepas para evitar la aparición de cepas virales resistentes y para evitar el escape de variantes resistentes del virus.
Además, dado que actualmente no existe un tratamiento para la rabia, existe la necesidad de un producto que sea eficaz para tratar o atenuar la infección, incluso si la exposición al virus se produjo más de 24 a 48 horas antes del primer tratamiento con el producto. El desarrollo de tal tratamiento sería particularmente beneficioso para al menos dos clases de pacientes: aquellos con exposición conocida al RABv pero que no han podido recibir profilaxis posterior a la exposición debido a las circunstancias y que tienen un mayor riesgo de desarrollar la infección por RABV y aquellos que no reconocieron el contacto con el virus y presentan signos (de diferente gravedad) de la enfermedad (por ejemplo individuos infectados por contactos inadvertidos con murciélagos infectados; RABV de origen murciélago donde la rabia canina está controlada se ha convertido en la principal causa de rabia). Así, el desarrollo de un producto de anticuerpos potentes y ampliamente neutralizantes puede ayudar a ampliar la ventana de tratamiento post-exposición para la infección por RABV en humanos, que actualmente se limita a los primeros días post-infección. En estos individuos, es posible que el RABV ya haya alcanzado los tejidos del s Nc y que también hayan aparecido signos tempranos o tardíos de la enfermedad. Estos pacientes podrían beneficiarse de un tratamiento con anticuerpos neutralizantes muy potentes capaces de filtrarse a través de la barrera hematoencefálica (o ser administrados directamente en el SNC), suministrando una cantidad suficiente de anticuerpos capaces de neutralizar eficazmente la replicación del virus en el tejido del SNC.
En vista de lo anterior, el objeto de la presente invención es proporcionar un producto basado en anticuerpos que sea al menos igual de potente, pero más seguro y más rentable, en comparación con la HRIG. Además, es objeto de la presente invención proporcionar un producto capaz de prevenir y tratar o atenuar la infección con diferentes lisavirus con una alta potencia y eficacia, es decir, un producto que no se limite a neutralizar únicamente RABV. Además, es objeto de la presente invención proporcionar un producto eficaz para tratar o atenuar la infección, incluso si la exposición al virus se ha producido más de 24 a 48 horas antes del primer tratamiento con el producto. En resumen, el objeto de la presente invención es proporcionar anticuerpos mejorados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, así como moléculas de ácido nucleico, vectores y células y composiciones farmacéuticas que superen las desventajas de la técnica anterior discutidas anteriormente con una buena relación coste-eficacia y de forma sencilla.
El objeto que subyace a la presente invención se resuelve mediante el contenido reivindicado.
En esta descripción y las reivindicaciones que le siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que el término "comprende" y variaciones tales como "comprender" y "comprendiendo" implican la inclusión de un miembro, número entero o paso indicado, pero no la exclusión de cualquier otro miembro, número entero o paso no especificado. El término "consiste en" es una realización particular del término "comprende" donde se excluye cualquier otro miembro, número entero o paso no indicado. En el contexto de la presente invención, el término "comprende" abarca el término "consiste en". Por tanto, el término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste", por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X Y.
Los términos "un" y "una" y "el" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para abarcar tanto el singular como el plural, a menos que se indique aquí lo contrario o claramente sea contradicho por el contexto. El término “esencialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo una composición que está "esencialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "esencialmente" puede omitirse de la definición de la invención.
El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x significa x ± 10%.
El término "enfermedad" tal como se usa aquí en general pretende ser sinónimo y se usa indistintamente con los términos "trastorno" y "condición" (como en una condición médica), ya que todos reflejan una condición anormal del cuerpo humano o animal o de una de sus partes que perjudica el funcionamiento normal, se manifiesta típicamente por signos y síntomas distintivos y hace que el ser humano o animal tenga una duración o calidad de vida reducida.
Tal como se usa aquí, la referencia a "tratamiento" de un sujeto o paciente pretende incluir la prevención, profilaxis, atenuación, mejora y terapia. Los términos "sujeto" o "paciente" se usan aquí indistintamente para referirse todos los mamíferos, incluidos los humanos. Ejemplos de sujetos incluyen humanos, vacas, perros, gatos, caballos, cabras, ovejas, cerdos y conejos. En una forma de realización, el paciente es un ser humano.
Tal como se usa aquí, los términos "fragmento de unión a antígeno", "fragmento" y "fragmento de anticuerpo" se usan indistintamente para referirse a cualquier fragmento de un anticuerpo de la invención que retiene la actividad de unión a antígeno del anticuerpo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen un anticuerpo monocatenario, Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv. Además, el término "anticuerpo" tal como se usa aquí incluye tanto anticuerpos como fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo neutralizante" es aquel que puede neutralizar, es decir, prevenir, inhibir, reducir, impedir o interferir con la capacidad de un patógeno para iniciar y/o perpetuar una infección en un huésped. Los términos "anticuerpo neutralizante" y "un anticuerpo que neutraliza" o "anticuerpos que neutralizan" se usan aquí indistintamente. Estos anticuerpos pueden usarse solos o en combinación como agentes profilácticos o terapéuticos con una formulación apropiada, en asociación con la vacunación activa, como herramienta diagnóstica o como una herramienta de producción tal como se describe aquí.
A menudo, las dosis se expresan en relación al peso corporal. Así, una dosis expresada como [g, mg u otra unidad]/kg (o g, mg, etc.) normalmente se refiere a [g, mg u otra unidad] "por kg (o g, mg, etc.) de peso corporal", incluso aunque el término "peso corporal" no se mencione explícitamente.
El término "unión específica" y referencias similares no incluyen la unión no específica.
El término "vacuna" tal como se usa aquí se entiende típicamente como un material profiláctico o terapéutico que proporciona al menos un antígeno, preferiblemente un inmunógeno. El antígeno o inmunógeno puede derivarse de cualquier material adecuado para la vacunación. Por ejemplo, el antígeno o inmunógeno puede derivarse de un patógeno, tal como de bacterias o partículas virales, etc., o de un tumor o tejido canceroso. El antígeno o inmunógeno estimula el sistema inmunológico adaptativo del cuerpo para proporcionar una respuesta inmunitaria adaptativa. En particular, un "antígeno" o un "inmunógeno" se refiere típicamente a una sustancia que puede ser reconocida por el sistema inmune, preferiblemente por el sistema inmune adaptativo, y que es capaz de desencadenar una respuesta inmune específica de antígeno, por ejemplo por formación de anticuerpos y/o células T específicas de antígeno, como parte de una respuesta inmune adaptativa.
Normalmente, un antígeno puede ser o puede comprender un péptido o proteína que puede ser presentada por MHC a las células T.
Tal como se usa aquí, "variante de secuencia" se refiere a cualquier alteración en una secuencia de referencia, siendo una secuencia de referencia cualquiera de las secuencias citadas en la "Tabla de secuencias y números ID de secuencia" (lista de secuencias), es decir SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 218. Así, el término "variante de secuencia" incluye variantes de la secuencia de nucleótidos y variantes de la secuencia de aminoácidos. Es de destacar que las variantes de secuencia a las que se hace referencia en este documento son en particular variantes de la secuencia funcional, es decir, variantes de secuencia que mantienen la función biológica de, por ejemplo, el anticuerpo. En el contexto de la presente invención, tal función biológica mantenida es preferiblemente la unión del anticuerpo a la proteína G de RABV (y no a RABV).
La identidad de secuencia normalmente se calcula con respecto a la longitud completa de la secuencia de referencia (es decir, la secuencia mencionada en la solicitud). El porcentaje de identidad, tal como se refiere aquí, se puede determinar, por ejemplo, usando BLAST con los parámetros predeterminados especificados por el NCBI (el Centro Nacional de Información Biotecnológica; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matriz; penalización por apertura de hueco = 11 y penalización por extensión de hueco = 1].
Tal como se usa aquí, una "variante de secuencia de nucleótidos" tiene una secuencia alterada donde uno o más de los nucleótidos de la secuencia de referencia se han eliminado o sustituido o se han insertado uno o más nucleótidos en la secuencia de la secuencia de nucleótidos de referencia. Los nucleótidos se denominan aquí mediante la designación estándar de una letra (A, C, G o T). Debido a la degeneración del código genético, una "variante de secuencia de nucleótidos" puede resultar en un cambio de la secuencia de aminoácidos de referencia respectiva, es decir, en una "variante de secuencia de aminoácidos", o no. Las variantes de secuencia preferidas son tales variantes de la secuencia de nucleótidos que no dan como resultado variantes de secuencia de aminoácidos (mutaciones silenciosas), pero también están dentro del alcance otras mutaciones no silenciosas, en particular secuencias de nucleótidos mutantes que resultan en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95% idéntica a la secuencia de referencia.
Una "variante de secuencia de aminoácidos" tiene una secuencia alterada donde uno o más de los aminoácidos de la secuencia de referencia se han eliminado o sustituido o se han insertado uno o más aminoácidos en la secuencia de la secuencia de aminoácidos de referencia. Como resultado de las alteraciones, la variante de la secuencia de aminoácidos tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia de referencia, preferiblemente al menos un 90% idéntica, más preferiblemente al menos un 95% idéntica, con mayor preferencia al menos un 99% idéntica a la secuencia de referencia. Las secuencias variantes que son idénticas en al menos un 90% no tienen más de 10 alteraciones, es decir, cualquier combinación de deleciones, inserciones o sustituciones por 100 aminoácidos de la secuencia de referencia.
Si bien es posible tener sustituciones de aminoácidos no conservativas, es preferente que las sustituciones sean sustituciones de aminoácidos conservativas, en las que el aminoácido sustituido tiene propiedades químicas o estructurales similares a las del aminoácido correspondiente en la secuencia de referencia. A modo de ejemplo, las sustituciones de aminoácidos conservativas implican la sustitución de un aminoácido alifático o hidrófobo, por ejemplo alanina, valina, leucina e isoleucina, por otro; la sustitución de un aminoácido que contiene hidroxilo, por ejemplo serina y treonina, por otro; la sustitución de un residuo ácido, por ejemplo ácido glutámico o ácido aspártico, por otro; el reemplazo de un residuo que contiene amida, por ejemplo asparagina y glutamina, por otro; la sustitución de un residuo aromático, por ejemplo fenilalanina y tirosina, por otro; la sustitución de un residuo básico, por ejemplo lisina, arginina e histidina, por otro; y la sustitución de un aminoácido pequeño, por ejemplo alanina, serina, treonina, metionina y glicina, por otro.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos con cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen la fusión al extremo N o C de una secuencia de aminoácidos a una molécula reporter o una enzima.
Es de destacar que las alteraciones en las variantes de secuencia no anulan la funcionalidad de la secuencia de referencia respectiva, en el presente caso, por ejemplo, la funcionalidad de una secuencia de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo de unirse al mismo epítopo y/o de neutralizar suficientemente la infección por lisavirus RABV y no RABV. La guía para determinar qué nucleótidos y residuos de aminoácidos, respectivamente, pueden sustituirse, insertarse o suprimirse sin abolir dicha funcionalidad se encuentra utilizando programas informáticos bien conocidos en la técnica.
La invención se basa, entre otros hallazgos, en el descubrimiento y aislamiento de anticuerpos que son altamente potentes para neutralizar lisavirus RABV y no RABV, así como de sitios antigénicos y epítopos a los que se unen los anticuerpos aquí descritos. Tales anticuerpos son deseables, ya que sólo se requieren pequeñas cantidades de anticuerpos para neutralizar la infección por lisavirus RABV y no RABV mediante un único anticuerpo. El anticuerpo de acuerdo con la presente invención es muy eficaz en la prevención y en el tratamiento o la atenuación de la infección por lisavirus RABV y no RABV. Por tanto, se reducen los costes de producción de los medicamentos que comprenden los anticuerpos para el tratamiento de la infección por lisavirus RABV y no RABV. Además, los anticuerpos según la presente invención neutralizan no sólo los lisavirus de RABV, sino también los lisavirus no RABv , que también causan la rabia, de una manera potente y eficaz. Con respecto al RABV, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención reconocen las amplias variaciones que se producen naturalmente en los epítopos, evitando así cepas resistentes de RABV. Además, los sitios antigénicos peptídicos o polipéptidos inmunogénicos que comprenden epítopos reconocidos por los anticuerpos de la invención pueden ser un componente de una vacuna o una terapia de combinación capaz de inducir protección contra lisavirus RABV y no RABV (reflejando una inmunización activa).
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que neutraliza la infección por lisavirus, caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establecen en las SEQ ID NO: 165-169 y 171, respectivamente, o en las SEQ ID NO: 165-168 y 170­ 171, respectivamente.
La siguiente descripción comprendida en la presente invención se refiere a un anticuerpo aislado, a variantes del anticuerpo o a fragmentos de unión a antígeno del mismo que neutralizan la infección por lisavirus mediante (i) RABV y (ii) al menos un 50% de lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV y WCBV, con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml.
Aquí, "con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml" significa que cada especie neutralizada por el anticuerpo es inhibida al valor IC50 anterior.
"Al menos el 50% de los lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV y WCBV" se refiere a al menos el 50% de las especies del virus Duvenhage (DUVV), lisavirus de murciélago europeo tipo 1 (EBLV-1) y tipo 2 (EBLV-2), lisavirus de murciélago australiano (ABLV), virus Irkut (IRKV), virus Khujand (KHUV), virus Aravan (ARAV), virus del murciélago de Lagos (LBV), virus de Mokola (MOKV), virus del murciélago Shimoni (SHIV o SHIBV), lisavirus del murciélago Bokeloh (BBLV) y virus del murciélago del Cáucaso Occidental (WCBV), es decir, al menos 6 especies de entre las 12 especies mencionadas anteriormente.
Preferentemente, el anticuerpo aislado, las variantes de anticuerpo y los fragmentos de unión a antígeno del mismo neutralizan la infección por lisavirus mediante (i) RABV y (ii) al menos 50% de lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV, WCBV e IKOV con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml.
"Al menos el 50% de los lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV, WCBV e IKOV" se refiere al menos al 50% de las especies del virus Duvenhage (DUVV), lisavirus de murciélago europeo tipo 1 (EBLV-1) y tipo 2 (EBLV-2), lisavirus de murciélago australiano (ABLV), virus Irkut (IRKV), virus Khujand (KHUV), virus Aravan (ARAV), virus del murciélago de Lagos (LBV), virus Mokola (MOKV), virus del murciélago Shimoni (SHIBV), lisavirus del murciélago Bokeloh (BBLV), virus del murciélago del Cáucaso Occidental (WCBV) e lisavirus Ikoma (IKOV), es decir, al menos 7 especies de entre las 13 especies mencionadas anteriormente.
Se considera que cada especie individual de lisavirus está neutralizada con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml siempre que al menos un aislado de cualquiera de dichas especies de lisavirus se neutralice con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml. Preferentemente, al menos dos aislados de cualquiera de tales especies de lisavirus se neutralizan con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml.
Preferentemente, se consigue una IC50 inferior a 10.000 ng/ml con virus infecciosos, es decir, en particular, no con virus pseudotipados.
Así, los anticuerpos, las variantes de anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos tal como se describen aquí pueden neutralizar un amplio espectro de lisavirus.
Preferentemente, el anticuerpo aislado, las variantes de anticuerpo y los fragmentos de unión a antígeno del mismo neutralizan la infección por lisavirus de al menos un 55%, más preferiblemente al menos un 60%, incluso más preferiblemente al menos un 65%, con mayor preferencia al menos un 68% y con particular preferencia al menos un 70% de lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV y WCBV con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml .
Con mayor preferencia, el anticuerpo aislado, las variantes de anticuerpo y los fragmentos de unión de antígeno del mismo neutralizan la infección por lisavirus de al menos un 55%, más preferiblemente al menos un 60%, incluso con mayor preferencia al menos un 65%, con especial preferencia al menos un 68% y con particular preferencia al menos un 70% de lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV, WCBV e IKOV con una IC inferior a 10.000 ng/ml.
Además, la presente descripción comprendida en la invención también proporciona un anticuerpo aislado, variantes de anticuerpo y fragmentos de unión a antígeno del mismo que neutralizan la infección por lisavirus por (i) RABV y (ii) al menos el 50% de todos los aislados de lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV y WCBV, con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml. Preferentemente, el anticuerpo aislado, las variantes de anticuerpo y los fragmentos de unión a antígeno del mismo neutralizan la infección por lisavirus por (i) RABV y (ii) al menos el 50% de todos los aislados de lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV, WCBV e IKOV, con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml.
Por lo tanto, "al menos el 50% de los aislados de lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV y WCBV" se refiere a todos los aislados de las 12 especies anteriores consideradas y "al menos el 50% de todos los aislados de lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV, WCBV e IKOV" se refiere a todos los aislados de las 13 especies consideradas anteriormente (es decir, todos los aislados considerados representan el 100% y el número de aislados neutralizados con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml representa el porcentaje respectivo). Preferentemente, se considera que los siguientes primeros 31 aislados reflejan el 100% de los aislados (véase la Tabla 1, todos los aislados excepto IKOV), preferiblemente todos los 32 aislados que se muestran en la Tabla 1 (incluyendo IKOV) se considera que reflejan 100% de los aislados:
Tabla 1: aislados de lisavirus no RABV
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En la Figura 1 se muestra una descripción más detallada de los aislados de lisavirus no RABV que se muestran en la Tabla 1 (así como de varios aislados de RABV). Esto incluye, además del nombre del aislado, la especie viral y el filogrupo (como se muestra en la Tabla 1), la especie hospedera, el país y el año de origen, el linaje y el número de acceso al GenBank de la secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de la glicoproteína G de ese aislado, si están disponibles (véase la Figura 1).
Así, si al menos 16 de los primeros 31 aislados especificados en la Tabla 1 (es decir, todos los aislados excepto IKOV) son neutralizados por el anticuerpo, variante de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml, el anticuerpo, la variante de anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo neutraliza la infección de al menos el 50% de los aislados de lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV y WCBV, con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml. Además, si al menos 16 de los 32 aislados especificados en la Tabla 1 son neutralizados por el anticuerpo, variante de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml, el anticuerpo, la variante de anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo neutraliza la infección de al menos el 50% de los aislados de lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV, WCBV e IKOV, con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml.
Preferentemente, el anticuerpo aislado, las variantes de anticuerpo y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos neutralizan la infección por lisavirus de al menos el 55%, más preferiblemente de al menos el 60%, incluso más preferiblemente de al menos el 65%, con mayor preferencia de al menos el 68% y con particular preferencia de al menos el 70% de aislados de lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV y WCBV con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml. Más preferiblemente, el anticuerpo aislado, las variantes de anticuerpo y los fragmentos de unión a antígeno del mismo neutralizan la infección por lisavirus de al menos el 55%, más preferiblemente de al menos el 60%, incluso más preferiblemente de al menos el 65%, con mayor preferencia de al menos el 68% y con particular preferencia de al menos el 70% de todos los aislados de lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV, WCBV e IKOV, con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml.
Preferentemente, los primeros 12 aislados mencionados en la Tabla 1 (es decir, de ABLV/Australia/murciélago/ 9810AUS-1998/V1039-2011 a MOK / MOK) se ensayan como virus infecciosos, mientras que el resto de los aislados mencionados en la Tabla 1 (es decir, de Virus de murciélago Shimoni/SHIV a lisavirus Ikoma/IKOV) se ensayan preferiblemente como virus pseudotipados. Por tanto, es preferente considerar un aislado como neutralizante de cierto virus para virus infecciosos si la IC50 es inferior a 10.000 ng/ml y para virus pseudotipados si la IC90 es inferior a 10.000 ng/ml.
Así, en una realización preferente, la presente descripción que comprende la invención proporciona un anticuerpo aislado, variantes de anticuerpo y fragmentos de unión a antígeno del mismo que neutralizan la infección por lisavirus por (i) RABV y (ii) al menos el 50% de todos los aislados de lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en ABLV/Australia/murciélago/9810AUS-1998/V1039-2011/ABLV, 98010/ ABLV, 1301 lisavirus de murciélago Bokeloh/BBLV, 86132SA/DUVV, DUVV/Sudáfrica/humano/96132SA-1971/ RS639-2012/DUVV, EBLV1a/Francia/murciélago/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1, EBLV1b/Francia/murciélago/ 8918-1989 / EBLV-1, EBLV2/UK/murciélago/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2, 94112/EBLV-2, 02053/EBLV-2, 8619/LBV, MOK/MOK, virus del murciélago Shimoni/SHIV, virus del murciélago del Cáucaso occidental/WCBV, lisavirus del murciélago de Australia/RV634/ABLV, virus Aravan/ARAV, virus Duvenhage RSA2006/DUVV, virus Duvenhage ZIM86-RV131/DUVV, lisaviorus del murciélago europeo 1.RV20 /EBLV-1, lisavirus del murciélago europeo 1.RV9/EBLV-1, EBLV1a/Francia/murciélago/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1, EBLV2/UK/murciélago/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2, lisavirus de murciélago europeo 2.RV1787/EBLV-2, lisavirus del murciélago europeo 2.RV628/EBLV-2, virus Irkut/IRKV, virus Khujand/KHUV, 8619/LBV, virus del murciélago de Lagos NIG56-RV1/LBV, virus del murciélago de Lagos SA2004/LBV, virus Mokola NIG68.RV4/MOK, virus Mokola 98/071 RA36/MOK y lisavirus Ikoma/IKOV con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml para ABLV/Australia/murciélago/9810AUS-1998/V1039-2011/ABLV, 98010/ ABLV, 1301 lisavirus de murciélago Bokeloh/BBLV, 86132SA/DUVV, DUVV/Sudáfrica/humano/96132SA-1971/ RS639-2012/DUVV, EBLV1a/Francia/murciélago/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1, EBLV1b/Francia/murciélago/ 8918-1989 / EBLV-1, EBLV2/UK/murciélago/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2, 94112/EBLV-2, 02053/EBLV-2, 8619/LBV, MOK/MOK, virus del murciélago Shimoni/SHIV, virus del murciélago del Cáucaso occidental/WCBV, lisavirus del murciélago de Australia/RV634/ABLV, virus Aravan/ARAV, virus Duvenhage RSA2006/DUVV, virus Duvenhage ZIM86-RV131/DUVV, lisaviorus del murciélago europeo 1.RV20 /EBLV-1, lisavirus del murciélago europeo 1.RV9/EBLV-1, EBLV1a/Francia/murciélago/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1, EBLV2/UK/murciélago/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2, lisavirus de murciélago europeo 2.RV1787/EBLV-2, lisavirus del murciélago europeo 2.RV628/EBLV-2, virus Irkut/IRKV, virus Khujand/KHUV, 8619/LBV, virus del murciélago de Lagos NIG56-RV1/LBV, virus del murciélago de Lagos SA2004/LBV, virus Mokola NIG68.RV4/MOK, virus Mokola 98/071 RA36/MOK y lisavirus Ikoma/IKOV ensayados como virus pseudotipados.
La siguiente descripción que comprende la presente invención, en particular todas las realizaciones preferentes y aspectos adicionales, se refiere tanto al anticuerpo aislado o aun fragmento de unión al antígeno del mismo, que neutraliza la infección por lisavirus de (i) RABV y (ii) al menos el 50% de lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KH UV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV y WCBV, con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml como se describió anteriormente (incluyendo las realizaciones preferentes anteriormente), así como el anticuerpo aislado o un fragmento de unión de antígeno del mismo que neutraliza la infección por lisavirus de (i) RABV y (ii) al menos el 50% de (todas) las cepas de lisavirus no RABV seleccionadas del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KH UV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV y WCBV, con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml como se describió anteriormente (incluyendo las realizaciones preferentes descritas anteriormente).
Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a la proteína G (glicoproteína G) de RABV. Más preferiblemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, se une también a la proteína G (glicoproteína G) de lisavirus no RABV.
El anticuerpo, variante de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se describe aquí, tiene valores de IC50 muy bajos. En particular, es poco probable que los anticuerpos con valores IC50 de 10.000 ng/ml o más sean eficaces in vivo. Así, los anticuerpos tal como se describen aquí tienen una afinidad particularmente alta o fuerte por lisavirus RABV y no RABV y, por tanto, son particularmente adecuados para contrarrestar y/o al menos en parte prevenir una infección por lisavirus RABv y/o no RABV y/o los efectos adversos de una infección por lisavirus RABV y/o no RABV.
Para determinar el valor de IC50 en un ensayo de neutralización, se pueden emplear pseudovirus y/o virus infecciosos. Los expertos en la técnica conocen los respectivos ensayos de neutralización. Sin embargo, preferiblemente se emplea el ensayo de neutralización según Wright, E. et al., Vaccine 27, 71 78-71 86, 2009, para evaluar pseudovirus (PV). Para virus infecciosos, preferiblemente se emplea el ensayo de neutralización de virus de anticuerpos fluorescentes (FAVN) de acuerdo con Cliquet, F., et al., J. Immunol Methods 212, 79­ 87, 1998, o el ensayo rápido de inhibición del foco fluorescente (RFFIT) según Smith, JS, et al., Bull. World Health Organ. 48, 535-541, 1973.
En general, un ensayo de neutralización típicamente mide la pérdida de infectividad del virus a través de la reacción del virus con anticuerpos específicos. Normalmente, la pérdida de infectividad es causada por la interferencia del anticuerpo unido a cualquiera de las etapas de replicación del virus, incluida la unión a las células diana, la entrada y/o la liberación viral. A continuación, se indica un ejemplo de un ensayo de neutralización para ilustrar el principio: se mezcla una cantidad dada de un virus, por ejemplo 50-100 TCDID50 (dosis infecciosa de cultivo tisular al 50%) y diferentes concentraciones de los anticuerpos bajo condiciones apropiadas, por ejemplo durante 1 hora a temperatura ambiente, y luego se inocula en un cultivo de células diana apropiado, por ejemplo células Hep-2 o BHK-21 (riñón 21 de cría de hámster). Los valores se pueden proporcionar típicamente por ml de cultivo celular. La presencia de virus no neutralizados se detecta, por ejemplo, después de un período de tiempo predeterminado, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, midiendo el efecto citopático del virus (no neutralizado) en las células diana, por ejemplo utilizando un ensayo colorimétrico para la cuantificación de la viabilidad celular, por ejemplo el reactivo WST-1. Cuantas más células diana se rescaten de la muerte celular o se mida su viabilidad, más virus fueron neutralizados por los anticuerpos. Los efectos medidos suelen depender de la dosis: cuanto mayor es el título de anticuerpos, más células se rescatan. Dependiendo del carácter neutralizante del anticuerpo, los valores de TCID50 varían, por ejemplo un anticuerpo de carácter neutralizante significativo requerirá que se agreguen cantidades más bajas (del anticuerpo) (para, por ejemplo, lograr la misma cantidad de células diana "rescatadas" en el ensayo, es decir, células que se midieron para ser viables) que otro anticuerpo de un carácter neutralizante menos pronunciado.
Preferentemente, para el anticuerpo, el valor de IC50 (es decir, 50% de neutralización) en un ensayo de neutralización de virus infeccioso como se describe anteriormente es inferior a 10.000 ng/ml, es decir, con respecto a virus infecciosos, mientras que, para el mismo anticuerpo, el valor IC90 (es decir, 90% de neutralización) en un ensayo de neutralización de pseudovirus como se describió anteriormente es inferior a 10.000 ng/ml, es decir, con respecto a pseudovirus.
Además, es preferente que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, neutralice la infección por lisavirus de al menos el 70% de los lisavirus del filogrupo I no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV y ARAV, con una IC50 inferiora 10.000 ng/ml. Por tanto, "al menos el 70%" de las especies mencionadas anteriormente significa al menos 5 de las 7 especies. La infección de una especie de lisavirus se considera neutralizada con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml si la infección de al menos un aislado de esta especie de lisavirus se neutraliza con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml. Preferentemente, el anticuerpo aislado, las variantes de anticuerpo y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos neutralizan la infección por lisavirus de al menos el 70% de los lisavirus del filogrupo I no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV y BBLV con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml. Por tanto, "al menos el 70%" de las especies mencionadas anteriormente significa al menos 6 de las 8 especies. La infección por una especie de lisavirus se considera neutralizada con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml si la infección de al menos un aislado de esta especie de lisavirus se neutraliza con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml.
Preferentemente, el anticuerpo aislado, las variantes de anticuerpo y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos neutralizan la infección por lisavirus de al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, incluso más preferiblemente al menos el 82% de los lisavirus del filogrupo I no RABV seleccionados del grupo consistente de DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV y ARAV, con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml. Más preferiblemente, el anticuerpo aislado, las variantes de anticuerpo y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos neutralizan la infección por lisavirus de al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, incluso más preferiblemente al menos el 82% de los lisavirus del filogrupo I no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV y BBLV con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml.
Según otra realización preferente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, neutraliza la infección por lisavirus de al menos el 70% de los aislados de lisavirus del filogrupo I no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV y ARAV con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml. Por tanto, "al menos el 70% de los aislados de lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV y ARAV" se refiere a todos los aislados de las 7 especies anteriores consideradas (es decir, todos los aislados considerados representan el 100% y el número de aislados neutralizados con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml representa el porcentaje respectivo). Más preferiblemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, neutraliza la infección por lisavirus de al menos el 70% de los aislados de lisavirus del filogrupo I no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV y BBLV con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml. Por tanto, "al menos el 70% de los aislados de lisavirus no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV y BBLV" se refiere a todos los aislados de las 8 especies anteriores consideradas (es decir, todos los aislados considerados representan el 100% y el número de aislados neutralizados con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml representa el porcentaje respectivo). Preferentemente, los 22 aislados citados en la Tabla 1 respecto a las especies de filogrupo I se consideran para calcular el porcentaje. En consecuencia, si al menos 16 de estos 22 aislados citados en la Tabla 1 con respecto a las especies de filogrupo I son neutralizados por el anticuerpo, variante de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml, el anticuerpo, variante de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo neutraliza la infección de al menos el 70% de los aislados de lisavirus del filogrupo I no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV y, preferiblemente BBLV, con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml. Preferentemente, el anticuerpo aislado, las variantes de anticuerpo y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos neutralizan la infección por lisavirus de al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, incluso más preferiblemente al menos el 82%, de los aislados de los lisavirus del filogrupo I no RABV seleccionados del grupo consistente en DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV y, preferiblemente BBLV, con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml.
Es particularmente preferente que el anticuerpo aislado, las variantes de anticuerpo y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos neutralicen la infección por lisavirus de al menos el 70% de los aislados de lisavirus del filogrupo I no RABV seleccionados del grupo consistente en ABLV/Australia/murciélago/ 9810AUS-1998/V1039-2011/ABLV, 98010/ABLV, liosavirus de murciélago Bokeloh 1301/BBLV, 86132SA/DUVV, DUVV/ Sudáfrica/humano/96132SA-1971/RS639-2012/DUVV, EBLV1a/Francia/murciélago/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1, EBLV1 b/Francia/murciélago/8918-1989 / EBLV-1, EBLV2/UK/murciélago/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2, 94112/EBLV-2, 02053/EBLV-2, lisavirus de murciélago australiano/RV634/ABLV, virus Aravan/ARAV, virus Duvenhage RSA2006/DUVV, virus Duvenhage ZIM86-RV131/DUVV, lisavirus del murciélago europeo 1.RV20/EBLV-1, lisavirus del murciélago europeo1.RV9/EBLV-1, EBLV1a/Francia/murciélago/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1, EBLV2/UK/murciélago/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2, lisavirus del murciélago europeo 2.RV1787/EBLV-2 y lisavirus del murciélago europeo 2. RV628/EBLV-2, virus Irkut/IRKV, virus Khujand/KHUV, con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml para ABLV/Australia/murciélago/9810AUS-1998/V1039-2011/ABLV, 98010/ABLV, lisavirus del murciélago Bokeloh 1301/BBLV, 86132SA/DUVV, DUVV/Sudáfrica/humano/96132SA-1971/RS639-2012/DUVV, EBLV1a/Francia/ murciélago/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1, EBLV1 b/Francia/murciélago/8918-1989/EBLV-1, EBLV2/UK/ murciélago/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2, 94112/EBLV-2 y 02053/EBLV-2, ensayados como virus infecciosos y con una IC90 inferior a 10.000 ng/ml para el lisavirus del murciélago australiano/RV634/ABLV, virus Aravan/ARAV, virus Duvenhage RSA2006/DUVV, virus Duvenhage ZIM86-RV131/DUVV, lisavirus del murciélago europeo 1.RV20/EBLV-1, lisavirus del murciélago europeo 1.RV9/EBLV-1, EBLV1a/Francia/murciélago/122938-2002/V3951-2009/EBLV-1, EBLV2/UK/murciélago/RV1332-2002/V3951-2009/EBLV-2, lisavirus del murciélago europeo 2.RV1787/EBLV-2, lisavirus del murciélago europeo 2.RV628/EBLV-2, viruis Irkut/IRKV y virus Khujand/KHUV ensayados como virus pseudotipados.
Entre los lisavirus, y en particular los lisavirus del filogrupo I, es particularmente preferente que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo neutralice la infección de EBLV-1. En particular, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, neutraliza la infección de al menos un aislado de EBLV-1, más preferiblemente de al menos dos, incluso más preferiblemente de al menos tres aislados de EBLV-1, por ejemplo los aislados de EBLV-1 mencionados en la Tabla 1, con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml. Por tanto, es particularmente preferente si uno o más aislados de EBLV-1 se neutralizan en ambos ensayos, un ensayo de neutralización de pseudovirus como se describió anteriormente y un ensayo de neutralización de virus infeccioso como se describió anteriormente. Incluso más preferiblemente, el valor de IC50 en el ensayo de neutralización de virus infecciosos está por debajo de 10.000 ng/ml y el valor de IC90 en el ensayo de neutralización de pseudovirus está por debajo de 10.000 ng/ml.
Es de destacar que ninguno de los anticuerpos monoclonales humanos CR57, CR4098 y RAB1 de la técnica anterior neutraliza EBLV-1 (véase las figuras 5 y 6). Sin embargo, la rabia debida al lisavirus de murciélago europeo tipo 1 está presente en muchos países europeos y los murciélagos están incluidos como especies protegidas en toda Europa. La enfermedad es mortal en humanos y se ha descrito en Europa tras la mordedura de un murciélago. Se recomienda la vacunación contra la rabia antes de la exposición y el tratamiento post­ exposición para las personas expuestas ocupacionalmente y también se recomienda el tratamiento de los viajeros internacionales después de una mordedura de murciélago (Stantic-Pavlinic M. (2005) Eurosurveillance, Volumen 10, Número 11), sin embargo, como se muestra en las figuras 5 y 6, HRIG apenas neutraliza EBLV-1. Por tanto, existe la necesidad de anticuerpos (humanos) que neutralicen EBLV-1.
También es preferente que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, neutralice la infección por RABV CVS-11 con una IC90 de 400 ng/ml o menos, en especial con una IC90 de 100 ng/ml o menos, incluso más preferiblemente con una IC90 de 50 ng/ml o menos y con particular preferencia con una IC90 de 1 ng/ml o menos. En otras palabras, la concentración del anticuerpo, o del fragmento de unión al antígeno del mismo, requerida para la neutralización del 90% (IC90) del aislado de RABV CVS-11 (cepa de virus de desafío 11) es 400 ng/ml o inferior, preferiblemente 100 ng/ml o inferior, en especial 50 ng/ml o inferior, incluso más preferiblemente 1 ng/ml o inferior, en particular en un ensayo de neutralización de pseudovirus como se describe anteriormente y preferiblemente también en un ensayo de neutralización de virus infeccioso RFFIT como se describe anteriormente.
En general, es preferente que el anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, sea un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo. A diferencia de los anticuerpos policlonales, los anticuerpos monoclonales son anticuerpos monoespecíficos, es decir, se unen a un epítopo específico. Por tanto, se evita en gran medida la unión inesperada y los anticuerpos monoclonales se consideran más seguros en comparación con los anticuerpos policlonales.
Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo humano, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal humano, un anticuerpo purificado, un anticuerpo monocatenario, Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv.
Así, los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos recombinantes o anticuerpos purificados. La presente descripción que comprende la invención también proporciona fragmentos de los anticuerpos, esto es fragmentos que retienen la actividad de unión a antígeno de los anticuerpos. Dichos fragmentos incluyen anticuerpos monocatenarios, Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv. Aunque la especificación, incluidas las reivindicaciones, puede en algunos lugares referirse explícitamente a fragmentos de unión a antígenos, fragmentos de anticuerpos, variantes y/o derivados de anticuerpos, se entiende que el término "anticuerpo" incluye todas las categorías de anticuerpos, a saber, fragmentos de unión a antígeno, fragmentos de anticuerpo, variantes y derivados de anticuerpos.
Los fragmentos de los anticuerpos pueden obtenerse a partir de los anticuerpos mediante métodos que incluyen digestión con enzimas, tales como pepsina o papaína, y/o escisión de enlaces disulfuro por reducción química. Alternativamente, los fragmentos de los anticuerpos se pueden obtener por clonación y expresión de parte de las secuencias de las cadenas pesadas o ligeras. Los "fragmentos" de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. La presente descripción que comprende la invención también abarca fragmentos Fv monocatenarios (scFv) derivados de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de la presente descripción que comprende la invención. Por ejemplo, la presente descripción que comprende la invención incluye un scFv que comprende las CDR de un anticuerpo de la presente descripción que comprende la invención. También se incluyen monómeros y dímeros de cadena pesada o ligera, anticuerpos de cadena pesada de dominio único, anticuerpos de cadena ligera de dominio único, así como anticuerpos de cadena única, por ejemplo Fv monocatenario donde los dominios variables de cadena pesada y ligera están unidos por un enlazador peptídico.
Los fragmentos de anticuerpos pueden impartir interacciones monovalentes o multivalentes y estar contenidos en diversas estructuras como se describe anteriormente. Por ejemplo, las moléculas scFv se pueden sintetizar para crear un "triacuerpo" trivalente o un “tetracuerpo” tetravalente. Las moléculas scFv pueden incluir un dominio de la región Fc que da como resultado minicuerpos bivalentes. Además, las secuencias aquí descritas pueden ser un componente de moléculas multiespecíficas donde las secuencias aquí descritas se dirigen a los epítopos tal como se describen aquí y otras regiones de la molécula se unen a otras dianas. Moléculas ilustrativas incluyen Fab2 biespecífico, Fab3 triespecífico, scFv biespecífico y diacuerpos (Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136).
En general, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende preferiblemente (al menos) tres CDR en la cadena pesada y (al menos) tres CDR en la cadena ligera. En general, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) son las regiones hipervariables presentes en los dominios variables de la cadena pesada y los dominios variables de la cadena ligera. Normalmente, las CDR de una cadena pesada y la cadena ligera conectada de un anticuerpo forman juntas el receptor de antígeno. Usualmente, las tres CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) se organizan de forma no consecutiva en el dominio variable. Dado que los receptores de antígeno se componen típicamente de dos dominios variables (en dos cadenas polipeptídicas diferentes, es decir, cadena pesada y ligera), hay seis CDR para cada receptor de antígeno (cadena pesada: CDRH1, CDRH2 y CDRH3; cadena ligera: CDRL1, CDRL2 y CDRL3). Una única molécula de anticuerpo suele tener dos receptores de antígeno y, por tanto, contiene doce CDR. Las CDR en la cadena pesada y/o ligera pueden estar separadas por regiones marco, por lo que una región marco (FR) es una región en el dominio variable que es menos "variable" que la CDR. Por ejemplo, una cadena (o cada cadena, respectivamente) puede estar compuesta por cuatro regiones marco separadas por tres CDR.
Preferentemente, las CDR, en particular CDRH3, del anticuerpo se derivan de un anticuerpo desarrollado en un ser humano. En particular, las CDR, en particular la CDRH3, del anticuerpo son de origen humano o variantes de secuencia funcionales del mismo.
Se han determinado las secuencias de las cadenas pesadas y cadenas ligeras de varios anticuerpos, comprendiendo cada uno tres CDR en la cadena pesada y tres CDR en la cadena ligera. La posición de los aminoácidos CDR se define de acuerdo con el sistema de numeración IMGT (IMGT: http://www.imgt.org/; véase Lefranc, M.-P. et al. (2009), Nucleic Acids Res. 37, D1006-D1012). Las secuencias de las CDR, cadenas pesadas, cadenas ligeras, así como las secuencias de las moléculas de ácido nucleico que codifican las CDR, cadenas pesadas, cadenas ligeras de diversos anticuerpos se describen en el listado de secuencias. Las CDR de las cadenas pesadas de anticuerpos también se denominan CDRH1, CDRH2 y CDRH3, respectivamente. De manera similar, las CDR de las cadenas ligeras del anticuerpo también se denominan CDRL1, CDRL2 y CDRL3, respectivamente.
Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una cadena pesada que comprende CDRH1, c Dr H2 y CDRH3 y una cadena ligera que comprende CDRL1, CDRL2 y CDRL3, donde la cadena pesada CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a las SEQ ID NO: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185 o 203, siendo especialmente preferentes las secuencias de aminoácidos que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las SEQ ID NO: 95 o 167. Con especial preferencia, la cadena pesada CDRH3 del anticuerpo, o de su fragmento de unión al antígeno, comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185 o 203, más preferiblemente de las SEQ ID NO: 95 o 167. En términos más generales, la presente descripción también comprende un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que incluye una cadena pesada que comprende CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y una cadena ligera que comprende CDRL1, CDRL2 y CDRL3, donde la cadena pesada CDRH3 comprende una variante de secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185 o 203, siendo las variantes de secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 o 167 particularmente preferentes. Más preferiblemente, la cadena pesada comprende al menos dos CDRH3 con una cadena pesada CDRH3 comprendiendo una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a la SEQ ID NO: 95 y una cadena pesada CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a la SEQ ID NO: 167. En particular, las variantes de secuencia mencionadas anteriormente son variantes de secuencia funcionales, por ejemplo en las que se mantiene la unión del anticuerpo a la proteína G (glicoproteína G) de RABV (y de no RABV).
También es preferente que el anticuerpo aislado, o el fragmento de unión al antígeno del mismo, comprenda una cadena pesada incluyendo CDR1, CDR2 y CDR3 y una cadena ligera incluyendo CDR1, CDR2 y CDR3 donde la cadena pesada CDR3 comprenda una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, por ejemplo un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, idéntica a las SEQ ID NO: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185 o 203, preferiblemente a las SEQ ID NO: 95 o 167. Con especial preferencia, la cadena pesada comprende al menos dos CDRH3 donde una cadena pesada CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y una cadena pesada CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 167. Las variantes de secuencia mencionadas anteriormente son en particular variantes de secuencia funcionales, por ejemplo donde se mantiene la unión del anticuerpo a la proteína G (glicoproteína G) de RABV (y de no RABV).
La Tabla 2 proporciona los números de SEQ ID para las secuencias de aminoácidos de las seis CDR de las cadenas pesada y ligera, respectivamente, de anticuerpos ilustrativos.
Tabla 2. Números de SEQ ID para polipéptidos CDR de anticuerpos ilustrativos
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También se describen aquí variantes de anticuerpos. Las variantes a las que se hace referencia aquí son, en particular, funcionales, por ejemplo manteniéndose la unión del anticuerpo a la proteína G (glicoproteína G) de RABV (y de no RABV). Tales variantes incluyen variantes naturales generadas por mutación somática in vivo durante la respuesta inmune o in vitro tras el cultivo de clones de células B inmortalizadas. Alternativamente, pueden surgir variantes debido a la degeneración del código genético o pueden producirse debido a errores en la transcripción o la traducción.
Pueden obtenerse otras variantes adicionales de las secuencias de anticuerpos con una afinidad y/o potencia mejoradas usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar sustituciones de aminoácidos para obtener anticuerpos con una afinidad adicionalmente mejorada. Alternativamente, se puede usar la optimización de codones de la secuencia de nucleótidos para mejorar la eficiencia de traducción en sistemas de expresión para la producción del anticuerpo. Además, los polinucleótidos pueden comprender una secuencia optimizada para la especificidad del anticuerpo o para la actividad neutralizante mediante la aplicación de un método de evolución dirigida a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aquí descritas.
Preferentemente, las secuencias de las variantes de anticuerpos pueden compartir un 70% o más (es decir, un 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más) de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias citadas en la solicitud. Tales variantes normalmente tienen una mayor homología con las secuencias aquí citadas en las CDR de la región variable de la cadena pesada (VH) y la región variable de la cadena ligera (VL) que en la región marco. Como es conocido por el experto en la técnica, las mutaciones son más toleradas, es decir, una pérdida de función limitada o nula (por ejemplo la especificidad o la capacidad de neutralización) en las regiones marco que en las CDR.
Preferentemente, la variación de las secuencias aquí proporcionadas está en la región o regiones marco del anticuerpo o en los residuos de ácido nucleico que codifican la región o regiones marco del anticuerpo.
Son preferentes tales anticuerpos (variantes) donde el número de mutaciones somáticas (es decir, anticuerpos "de línea germinal": revierten a la configuración de "línea germinal") es reducido. Las secuencias de la línea germinal de los anticuerpos se pueden determinar, por ejemplo, con referencia a la base de datos IMGT (por ejemplo según las asignaciones IMGT VDJ y VJ e interpretación de reordenamiento: http://www.imgt.org/; véase . Lefranc, M.-P. et al. (2009) Nucleic Acids Res. 37, D1006-D1012) y las variantes de anticuerpos "de línea germinal" pueden producirse, por ejemplo, mediante síntesis genética o mediante mutagénesis dirigida al sitio. Un nivel bajo de mutaciones somáticas reduce el riesgo potencial de inmunogenicidad de los anticuerpos. Preferiblemente, el número de mutaciones somáticas es reducido en las regiones marco (FR) (es decir, "regiones marco de la línea germinal" de los anticuerpos, también denominadas aquí variantes FR-GL). Son especialmente preferentes los anticuerpos (variantes), o un fragmento de unión de antígeno de los mismos, y las variantes FR-GL, respectivamente, sin mutaciones somáticas en las regiones marco (FR). Son particularmente preferentes tales anticuerpos (variantes), o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, y variantes FR-GL, respectivamente, con la menor cantidad posible de mutaciones somáticas donde, por otro lado, la actividad neutralizante no se ve afectada (en comparación con el anticuerpo/fragmento de referencia que contiene (más) mutaciones somáticas). Por una parte, dichos anticuerpos no están alterados en cuanto a su actividad neutralizante, mostrando así una potencia y amplitud muy altas. Por otra parte, se reduce significativamente el riesgo potencial de inmunogenicidad de los anticuerpos.
En una realización preferente, el anticuerpo aislado o el fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7, 19-25, 37-43, 55-61, 75-81, 93-99, 111-117, 129-135, 147-153, 165-171, 183-189 o 201-207. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos, así como las secuencias de ácido nucleico que las codifican, se proporcionan en la Tabla de secuencias y números SEQ ID más abajo. Los residuos de aminoácidos correspondientes a las seis CDR y los residuos de ácido nucleico que las codifican están resaltados en negrita.
Preferentemente, un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende más de una CDR con una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7, 19-25, 37-43, 55-61, 75-81, 93-99, 111-117, 129-135, 147-153, 165-171, 183-189 y 201-207.
Preferentemente, el anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, comprende dos CDR con una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7, 19-25, 37-43, 55-61, 75-81, 93-99, 111-117, 129-135, 147-153, 165-171, 183-189 o 201-207. Así, es preferente que el anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, comprenda (i) una CDRH1 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 19, 37, 55, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183 o 201 y una CDRL1 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 22, 40, 58, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186 o 204; (ii) una CDRH2 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 20, 38, 56, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184 o 202, y una CDRL2 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 5, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 79, 80, 97, 98, 115, 116, 133, 134, 151, 152, 169, 170, 187, 188, 205 o 206; o (iii) una CDRH3 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185 o 203, y una CDRL3 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 25, 43, 61, 81, 99, 117, 135, 153, 171, 189 o 201.
Preferentemente, el anticuerpo, o su fragmento de unión al antígeno, comprende tres CDR con una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7, 19-25, 37-43, 55-61, 75-81, 93-99, 111-117, 129-135, 147-153, 165-171, 183-189 y 201-207. Así, es preferente que el anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, comprenda (i) una CDRH1 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 19, 37, 55, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183 o 201, una CDRH2 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 20, 38, 56, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184 o 202, y una CDRH3 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185 o 203; o (ii) una CDRL1 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 22, 40, 58, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186 o 204, una CDRL2 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 5, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 79, 80, 97, 98, 115, 116, 133, 134, 151, 152, 169, 170, 187, 188, 205 o 206, y una CDRL3 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 25, 43, 61, 81, 99, 117, 135, 153, 171, 189 o 201.
Preferentemente, el anticuerpo, o su fragmento de unión al antígeno, comprende cuatro CDR con una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7, 19­ 25, 37-43, 55-61, 75-81, 93-99, 111-117, 129-135, 147-153, 165-171, 183-189 y 201-207. Así, es preferente que el anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, comprenda (i) una CDRH1 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 19, 37, 55, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183 o 201, una CDRH2 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 20, 38, 56, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184 o 202, una CDRH3 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185 o 203 y una CDRL con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 4-6, 20-22, 36-38 o 52-54; (ii) una CDRL1 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 22, 40, 58, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186 o 204, una CDRL2 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEC ID NO: 5, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 79, 80, 97, 98, 115, 116, 133, 134, 151, 152, 169, 170, 187, 188, 205 o 206, una CDRL3 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 25, 43, 61, 81, 99, 117, 135, 153, 171, 189 o 201 y una CDRH con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-3, 19-21, 37-39, 55-57, 75-77, 93-95, 111-113, 129-131, 147-149, 165­ 167, 183-185 o 201-203, siendo particularmente preferente una CDRH3 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185 o 203; (iii) una CDRH1 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 19, 37, 55, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183 o 201, una CDRL1 con en al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 22, 40, 58, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186 o 204, una CDRH2 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 20, 38, 56, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184 o 202 y una CDRL2 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 5, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 79, 80, 97, 98, 115, 116, 133, 134, 151, 152, 169, 170, 187, 188, 205 o 206; (iv) una CDRH1 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 19, 37, 55, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183 o 201, una CDRL1 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 22, 40, 58, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186 o 204, una CDRH3 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185 o 203 y una CDRL3 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 25, 43, 61, 81, 99, 117, 135, 153, 171, 189 o 201; o (v) una CDRH2 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las S e Q ID NO: 2, 20, 38, 56, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184 o 202, una CDRL2 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 5, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 79, 80, 97, 98, 115, 116, 133, 134, 151, 152, 169, 170, 187, 188, 205 o 206, una CDRH3 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185 o 203 y una CDRL3 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 25, 43, 61, 81, 99, 117, 135, 153, 171, 189 o 201.
Preferentemente, el anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, comprende cinco CDR con una secuencia con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7, 19-25, 37-43, 55-61, 75-81, 93-99, 111-117, 129-135, 147-153, 165-171, 183-189 y 201-207. Así, es preferente que el anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, comprenda cinco CDR seleccionadas del grupo de una CDRH1 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 19, 37, 55, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183 o 201, una CDRH2 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 20, 38, 56, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184 o 202, una CDRH3 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185 o 203, una CDRL1 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 22, 40, 58, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186 o 204, una CDRL2 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 5, 6, 23, 24, 41,42, 59, 60, 79, 80, 97, 98, 115, 116, 133, 134, 151, 152, 169, 170, 187, 188, 205 o 206 y una CDRL3 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 25, 43, 61, 81, 99, 117, 135, 153, 171, 189 o 201.
Preferentemente, el anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, comprende seis CDR con una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7, 19-25, 37-43, 55-61, 75-81, 93-99, 111-117, 129-135, 147-153, 165-171, 183-189 y 201-207. Así, es preferente que el anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, comprenda seis CDR seleccionadas del grupo de una CDRH1 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 19, 37, 55, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183 o 201, una CDRH2 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 20, 38, 56, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184 o 202, una CDRH3 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185 o 203, una CDRL1 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 22, 40, 58, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186 o 204, una CDRL2 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 5, 6, 23, 24, 41,42, 59, 60, 79, 80, 97, 98, 115, 116, 133, 134, 151, 152, 169, 170, 187, 188, 205 o 206 y una CDRL3 con al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 25, 43, 61, 81, 99, 117, 135, 153, 171, 189 o 201. Con especial preferencia, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende: (i) secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1-5 y 7 o a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-4 y 6-7, respectivamente; (ii) secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas CDRH 1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19-23 y 25 o a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19­ 22 y 24-25, respectivamente; (iii) secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 37-41 y 43 o a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 37-40 y 42-43, respectivamente; (iv) secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 55-59 y 61 o las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 55­ 58 y 60-61, respectivamente; (v) secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 75-79 y 81 o a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 75-78 y 80-81, respectivamente; (vi) secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas CDRH 1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 93-97 y 99 o a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 93­ 96 y 98-99, respectivamente; (vii) secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas CDRH 1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO.: 111-115 y 117 o a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 111-114 y 116-117, respectivamente; (viii) secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas CDRH 1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 129-133 y 135 o a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 129-132 y 134-135, respectivamente; (ix) secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas CDRH 1, CDRH2 y CDr H3 y secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de s Eq ID NO: 147-151 y 153 o a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147-150 y 152-153, respectivamente; (x) secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 165-169 y 171 o a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 165-168 y 170-171, respectivamente; (xi) secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 183-187 y 189 o a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 183-186 y 188­ 189, respectivamente; o (xi) secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 201-205 y 207 o a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 201-204 y 206-207, respectivamente.
Se describe aquí el anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferentemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 93-97 y 99 o a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 93-96 y 98-99, respectivamente.
También se describe aquí el anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 165-169 y 171 o a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 165-168 y 170-171, respectivamente.
Incluso con mayor preferencia, el anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: (i) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH 1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establecen en las SEQ ID NO: 1-5 y 7 o en las SEQ ID NO: 1-4 y 6-7, respectivamente; (ii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establece en las SEQ ID NO: 19-23 y 25 o en las SEQ ID NO: 19-22 y 24-25, respectivamente; (iii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establecen en las SEQ ID NO: 37-41 y 43 o en las SEQ ID NO: 37-40 y 42-43, respectivamente; (iv) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establecen en las SEQ ID NO: 55-59 y 61 o en las SEQ ID NO: 55-58 y 60-61, respectivamente; (v) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establecen en las SEQ ID NO: 75-79 y 81 o en las SEQ ID NO: 75-78 y 80-81, respectivamente; (vi) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRl3 tal como se establecen en las SEQ ID NO: 93-97 y 99 o en las SEQ ID NO: 93-96 y 98-99, respectivamente; (vii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establecen en las SEQ ID NO: 111-115 y 117 o en las SEQ ID NO: 111-114 y 116-117, respectivamente; (viii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establecen en las SEQ ID NO: 129-133 y 135 o en las SEQ ID NO: 129-132 y 134-135, respectivamente; (ix) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establecen en las SEQ ID NO: 147­ 151 y 153 o en las SEQ ID NO: 147-150 y 152-153, respectivamente; (x) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establecen en las SEQ ID NO: 165-169 y 171 o en las SEQ ID NO: 165-168 y 170-171, respectivamente; (xi) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establecen en las SEQ ID NO: 183­ 187 y 189 o en las SEQ ID NO: 183-186 y 188-189, respectivamente; o (xi) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establecen en las SEQ ID NO: 201-205 y 207 o en las SEQ ID NO: 201-204 y 206-207, respectivamente.
También se describe aquí el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, con al menos una CDR, es decir, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis CDR como se describió anteriormente, como una realización del anticuerpo o un fragmento de unión de antígeno del mismo preferente que comprende una CDRH3 que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185 o 203.
También es preferente que el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno comprenda una cadena pesada CDR1 con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1, 19, 37, 55, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183 o 201 o variantes de secuencia de éstas; una cadena pesada CDR2 con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 20, 38, 56, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184 o 202 o variantes de secuencia de éstas; y una cadena pesada CDR3 con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 3, 21, 39, 57, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185 o 203 o variantes de secuencia de éstas. En ciertas realizaciones, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo como se proporciona aquí comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (i) SEC ID NO: 1 para CDRH1, SEC ID NO: 2 para CDRH2 y SEC ID NO: 3 para CDRH3, (ii) SEQ ID NO: 19 para CDRH1, SEQ ID NO: 20 para CDRH2 y SEQ ID NO: 21 para CDRH3, (iii) SEQ ID NO: 37 para CDRH1, SEQ ID NO: 38 para CDRH2 y SEQ ID NO: 39 para CDRH3, (iv) SEQ ID NO: 55 para CDRH1, SEQ ID NO: 56 para CDRH2 y SEQ ID NO: 57 para CDRH3; (v) SEQ ID NO: 75 para CDRH1, SEQ ID NO: 76 para CDRH2 y SEQ ID NO: 77 para CDRH3; (vi) SEQ ID NO: 93 para CDRH1, SEQ ID NO: 94 para CDRH2 y SEQ ID NO: 95 para CDRH3; (vii) SEQ ID NO: 111 para CDRH1, SEQ ID NO: 112 para CDRH2 y SEQ ID NO: 113 para CDRH3; (viii) SEQ ID NO: 129 para CDRH1, SEQ ID NO: 130 para CDRH2 y SEQ ID NO: 131 para CDRH3; (ix) SEQ ID NO: 147 para CDRH1, SEQ ID NO: 148 para CDRH2 y SEQ ID NO: 149 para CDRH3; (x) SEQ ID NO: 165 para CDRH1, SEQ ID NO: 166 para CDRH2 y SEQ ID NO: 167 para CDRH3; (xi) SEQ ID NO: 183 para CDRH1, SEQ ID NO: 184 para CDRH2 y SEQ ID NO: 185 para CDRH3; o (xii) SEQ ID NO: 201 para CDRH1, SEQ ID NO: 202 para CDRH2 y SEQ ID NO: 203 para CDRH3.
Preferentemente, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno comprende una cadena ligera CDR1 con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4, 22, 40, 58, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186 o 204 o variantes de secuencia de éstas; una cadena ligera CDR2 con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID NO: 5, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 79, 80, 97, 98, 115, 116, 133, 134 , 151, 152, 169, 170, 187, 188, 205 o 206 o variantes de secuencia de éstas; y una cadena ligera CDR3 con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7, 25, 43, 61, 81, 99, 117, 135, 153, 171, 189 o 201 o variantes de secuencia de éstas. En ciertas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se proporciona aquí comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 4 para CDRL1, SEQ ID NO: 5 o 6 para CDRL2 y SEQ ID NO: 7 para CDRL3; (ii) SEQ ID NO: 22 para CDRL1, SEQ ID NO: 23 o 24 para CDRL2 y SEQ ID NO: 25 para CDRL3; (iii) SEQ ID NO: 40 para CDRL1, SEQ ID NO: 41 o 42 para CDRL2 y SEQ ID NO: 43 para CDRL3; (iv) SEQ ID NO: 58 para CDRL1, SEQ ID NO: 59 o 60 para CDRL2 y SEQ ID NO: 61 para CDRL3; (v) SEQ ID NO: 78 para CDRL1, SEQ ID NO: 79 u 80 para CDRL2 y SEQ ID NO: 81 para CDRL3; (vi) SEQ ID NO: 96 para CDRL1, SEQ ID NO: 97 o 98 para CDRL2 y SEQ ID NO: 99 para CDRL3; (vii) SEQ ID NO: 114 para CDRL1, SEQ ID NO: 115 o 116 para CDRL2 y SEQ ID NO: 117 para CDRL3; (viii) SEQ ID NO: 132 para CDRL1, SEQ ID NO: 133 o 134 para CDRL2 y SEQ ID NO: 135 para CDRL3; (ix) SEQ ID NO: 150 para CDRL1, SEQ ID NO: 151 o 152 para CDRL2 y SEQ ID NO: 152 para CDRL3; (x) SEQ ID NO: 168 para CDRL1, SEQ ID NO: 169 o 170 para CDRL2 y SEQ ID NO: 171 para CDRL3; (xi) SEQ ID NO: 186 para CDRL1, SEQ ID NO: 187 o 188 para CDRL2 y SEQ ID NO: 189 para CDRL3; o (xii) SEQ ID NO: 204 para CDRL1, SEQ ID NO: 205 o 206 para CDRL2 y SEQ ID NO: 207 para CDRL3.
También se describe el anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y CDR1, CDR2 y de cadena ligera CDR3 que son al menos un 80%, por ejemplo un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1-7, 19-25, 37-43, 55-61, 75-81, 93-99, 111-117, 129-135, 147-153, 165-171, 183-189 y 201-207, respectivamente.
Preferiblemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión al antígeno del mismo, es de acuerdo con gRVA122, gRVA144, gRVB185, gRVB492, gRVC3, gRVC20, gRVC21, gRVC38, gRVC44, gRVC58, gRVC68 o gRVC111, preferentemente de acuerdo con gRVC20 o gRVC58. Más preferiblemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión al antígeno del mismo, es RVA122, RVA144, RVB185, RVB492, RVC3, RVC20, RVC21, RVC38, RVC44, RVC58, RVC68 o RVC111, preferentemente RVC20 o RVC58.
Los presentes inventores han aislado doce anticuerpos monoclonales (mAb), que aquí se denominan RVA122, RVA144, RVB185, RVB492, RVC3, RVC20, RVC21, RVC38, RVC44, RVC58, RVC68 y RVC111 (ver los ejemplos 1 a 4). Basado en los anticuerpos RVA122, RVA144, RVB185, RVB492, RVC3, RVC20, RVC21, RVC38, RVC44, RVC58, RVC68 y RVC111, en particular en los genes VH y VL de RVA122, RVA144, RVB185, RVB492, RVC3, RVC20, RVC21, RVC38, RVC44, RVC58, RVC68 y RVC111, los términos gRVA122, gRVA144, gRVB185, gRVB492, gRVC3, gRVC20, gRVC21, gRVC38, gRVC44, gRVC68 o gRVC111 tal como se usan aquí se refieren a los respectivos anticuerpos "genéricos", o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que tienen las secuencias de aminoácidos específicas, codificadas por las secuencias de nucleótidos específicas, como se subraya a continuación.
Tal como se usa aquí, "gRVA122" se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una secuencia de aminoácidos para CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, que está codificado por una secuencia de nucleótidos de CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 8, una secuencia de aminoácidos de CDRH2 según la SEQ ID NO: 2, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 9, una secuencia de aminoácidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 3, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 10, una secuencia de aminoácidos para CDRL1 según la SEQ ID NO: 4, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL1 según la SEQ ID NO: 11, una secuencia de aminoácidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 5 o 6, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 12 o 13, y una secuencia de aminoácidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 7, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 14. La región variable de la cadena pesada (VH) de "gRVA122" tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 15, que está codificada por una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 17, y la región variable de la cadena ligera (VL) de "gRVA122" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 16, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 18.
Tal como se usa aquí, "gRVA144" se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una secuencia de aminoácidos para CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 19, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 26, una secuencia de aminoácidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 20, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 27, una secuencia de aminoácidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 21, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 28, una secuencia de aminoácidos para CDRL1 según la SEQ ID NO: 22, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL1 según la SEQ ID NO: 29, una secuencia de aminoácidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 23 o 24, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 30 o 31, y una secuencia de aminoácidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 25, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 32. La región variable de la cadena pesada (VH) de "gRVA144" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 33, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 35, y la región variable de la cadena ligera (VL) de "gRVA144" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 34, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 36.
Tal como se usa aquí, "gRVB185" se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una secuencia de aminoácidos para CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 37, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 44, una secuencia de aminoácidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 38, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 39, que está codificada por una secuencia de nucleótidos de CDRH3 según la SEQ ID NO: 46, una secuencia de aminoácidos para CDRL1 según la SEQ ID NO: 40, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL1 según la SEQ ID NO: 47, una secuencia de aminoácidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 41 o 42, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 48 o 49, y una secuencia de aminoácidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 43, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 50. La región variable de la cadena pesada (VH) de "gRVB185" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 51, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 53, y la región variable de la cadena ligera (VL) de "gRVB185" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 52, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 54.
Tal como se usa aquí, "gRVB492" se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una secuencia de aminoácidos para CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 55, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH 1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 62, una secuencia de aminoácidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 56, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 63, una secuencia de aminoácidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 57, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 64, una secuencia de aminoácidos CDRL1 según la SEQ ID NO: 58, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL1 según la SEQ ID NO: 65, una secuencia de aminoácidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 59 o 60, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 66 o 67, y una secuencia de aminoácidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 61, que está codificada por una secuencia de nucleótidos de CDRL3 según la SEQ ID NO: 68. La región variable de la cadena pesada (VH) de "gRVES492" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 69 o 70, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 72 o 73, y la región variable de la cadena ligera (VL) de "gRVB492" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 71, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 74.
Tal como se usa aquí, "gRVC3" se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una secuencia de aminoácidos para CDRH 1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 75, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 82, una secuencia de aminoácidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 76, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 83, una secuencia de aminoácidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 77, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 84, una secuencia de aminoácidos para CDRL1 según la SEQ ID NO: 78, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL1 según la SEQ ID NO: 85, una secuencia de aminoácidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 79 u 80, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 86 u 87, y una secuencia de aminoácidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 81, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 88. La región variable de la cadena pesada (VH) de "gRVC3" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 89, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 91, y la región variable de la cadena ligera (VL) de "gRVC3" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 90, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 92.
Tal como se usa aquí, "gRVC20" se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una secuencia de aminoácidos para CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 93, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 100, una secuencia de aminoácidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 94, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 101, una secuencia de aminoácidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 95, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 102, una secuencia de aminoácidos para CDRL1 según la SEQ ID NO: 96, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL1 según la SEQ ID NO: 103, una secuencia de aminoácidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 97 o 98, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 104 o 105, y una secuencia de aminoácidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 99, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 106. La región variable de la cadena pesada (VH) de “gRVC20" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 107, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 109, y la región variable de la cadena ligera (VL) de" gRVC20" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 108, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 110.
Tal como se usa aquí, "gRVC21" se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una secuencia de aminoácidos para CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 111, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 118, una secuencia de aminoácidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 112, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 119, una secuencia de aminoácidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 113, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 120, una secuencia de aminoácidos para CDRL1 según la SEQ ID NO: 114, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL1 según la SEQ ID NO: 121, una secuencia de aminoácidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 115 o 116, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 122 o 123, y una secuencia de aminoácidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 117, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 124. La región variable de la cadena pesada (VH) de "gRVC21" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 125, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 127, y la región variable de la cadena ligera (VL) de "gRVC21" tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 126, que está codificada por una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 128.
Tal como se usa aquí, "gRVC38" se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una secuencia de aminoácidos para CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 129, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 136, una secuencia de aminoácidos CDRH2 la según SEQ ID NO: 130, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 137, una secuencia de aminoácidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 131, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 138, una secuencia de aminoácidos CDRL1 según la SEQ ID NO: 132, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL1 según la SEQ ID NO: 139, una secuencia de aminoácidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 133 o 134, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 140 o 141, y una secuencia de aminoácidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 135, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 142. La región variable de la cadena pesada (VH) de "gRVC38" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 143, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 145, y la región variable de la cadena ligera (VL) de "gRVC38" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 144, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 146.
Tal como se usa aquí, "gRVC44" se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una secuencia de aminoácidos para CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 147, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 154, una secuencia de aminoácidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 148, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 155, una secuencia de aminoácidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 149, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 156, una secuencia de aminoácidos CDRL1 según la SEQ ID NO: 150, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL1 según la SEQ ID NO: 157, una secuencia de aminoácidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 151 o 152, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 158 o 159, y una secuencia de aminoácidos CDRL3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 153, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 160. La región variable de la cadena pesada (VH) de "gRVC44" tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 161, que está codificada por una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 163, y la región variable de la cadena ligera (VL) de "gRVC44" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 162, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 164.
Tal como se usa aquí, "gRVC58" se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una secuencia de aminoácidos para CDRH 1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 165, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 172, una secuencia de aminoácidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 166, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 173, una secuencia de aminoácidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 167, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 174, una secuencia de aminoácidos para CDRL1 según la SEQ ID NO: 168, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL1 según la SEQ ID NO: 175, una secuencia de aminoácidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 169 o 170, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 176 o 177, y una secuencia de aminoácidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 171, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 178. La región variable de la cadena pesada (VH) de "gRVC58" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 179, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO: 181, y la región variable de la cadena ligera (VL) de "gRVC58" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 180, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 182.
Tal como se usa aquí, "gRVC68" se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una secuencia de aminoácidos para CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 183, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 190, una secuencia de aminoácidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 184, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 191, una secuencia de aminoácidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 185, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 192, una secuencia de aminoácidos para CDRL1 según la SEQ ID NO: 186, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL1 según la SEQ ID NO: 193, una secuencia de aminoácidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 187 o 188, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 194 o 195, y una secuencia de aminoácidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 189, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 196. La región variable de la cadena pesada (VH) de "gRVC68" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 197, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 199, y la región variable de la cadena ligera (VL) de "gRVC68" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 198, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 200.
Tal como se usa aquí, "gRVC111" se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una secuencia de aminoácidos para CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 201, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 208, una secuencia de aminoácidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 202, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH2 según la SEQ ID NO: 209, una secuencia de aminoácidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 203, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRH3 según la SEQ ID NO: 210, una secuencia de aminoácidos para CDRL1 según la SEQ ID NO: 204, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL1 según la SEQ ID NO: 211, una secuencia de aminoácidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 205 o 206, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL2 según la SEQ ID NO: 212 o 213, y una secuencia de aminoácidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 207, que está codificada por una secuencia de nucleótidos CDRL3 según la SEQ ID NO: 214. La región variable de la cadena pesada (VH) de "gRVC111" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 215, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 217, y la región variable de la cadena ligera (VL) de "gRVC111" tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 216, que está codificada por una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 218.
Preferentemente, los anticuerpos según gRVA122, gRVA144, gRVB185, gRVB492, gRVC3, gRVC20, gRVC21, gRVC38, gRVC44, gRVC58, gRVC68 o gRVC111, preferiblemente según gRVC20 y gRVC58, son del tipo IgG1.
Preferentemente, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno comprende una cadena pesada que comprende una o más (es decir, una, dos o las tres) cadenas pesadas CDR de gRVA122, gRVA144, gRVB185, gRVB492, gRVC3, gRVC20, gRVC21, gRVC38, gRVC44, gRVC58, gRVC68 o gRVC111, preferiblemente de acuerdo con gRVC20 y gRVC58.
También es preferente que el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno comprenda las cadenas ligeras CDR de gRVA122, gRVA144, gRVB185, gRVB492, gRVC3, gRVC20, gRVC21, gRVC38, gRVC44, gRVC58, gRVC68 o gRVC111, preferiblemente de acuerdo con gRVC20 y gRVC58.
Preferentemente, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno comprende todas las CDR del anticuerpo RVC20 citadas en la Tabla 2 o todas las CDR del anticuerpo RVC58 citadas en la Tabla 2. Alternativamente, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno preferiblemente también pueden comprender todas las CDR del anticuerpo RVA122 como se citan en la Tabla 2. Alternativamente, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno también pueden comprender preferiblemente todas las CDR del anticuerpo RVA144 citadas en la Tabla 2. Alternativamente, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno también pueden comprender preferiblemente todas las CDR del anticuerpo RVB185 que se citan en la Tabla 2. Alternativamente, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno también pueden comprender preferiblemente todas las CDR del anticuerpo RVB492 como se citan en la Tabla 2. Alternativamente, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno también pueden comprender preferiblemente todas las CDR del anticuerpo RVC3 citadas en la Tabla 2. Alternativamente, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno también pueden comprender preferiblemente todas las CDR del anticuerpo RVC21 citadas en la Tabla 2. Alternativamente, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno también pueden comprender preferiblemente todas las CDR del anticuerpo RVC38 citadas en la Tabla 2. Alternativamente, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno también pueden comprender preferiblemente todas las CDR del anticuerpo RVC44 citadas en la Tabla 2. Alternativamente, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno también pueden comprender preferiblemente todas las CDR del anticuerpo RVC68 citadas en la Tabla 2. Alternativamente, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno también pueden comprender preferiblemente todas las CDR del anticuerpo RVC111 citadas en la Tabla 2.
Los números de SEQ ID para la secuencia de aminoácidos para la región variable de la cadena pesada (VH) y la región variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpos ilustrativos, así como los números de SEQ ID para las secuencias de ácido nucleico que los codifican, se muestran en Tabla 3.
Tabla 3. Números de SEQ ID para los residuos de aminoácidos y ácidos nucleicos VH y VL de anticuerpos ilustrativos
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Preferentemente, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente un 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia indicada en cualquiera de las SEQ ID NO: 15, 33, 51, 69, 70, 89, 107, 125, 143, 161, 179, 197 o 215. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia indicada en las SEQ ID NO: 16, 34, 52, 71, 90, 108, 126, 144, 162, 180, 198 o 216. En otra realización preferente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada o cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente un 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a las secuencias proporcionadas en las figuras 22 a 33.
Las figuras 22 a 33 muestran las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos RVA122, RVA144, RVB185, RVB492, RVC3, RVC20, RVC21, RVC38, RVC44, RVC58, RVC68 y RVC111, respectivamente, así como las secuencias de ácido nucleico que las codifican. Las secuencias de aminoácidos de las CDR y las secuencias de ácido nucleico que codifican las CDR están en negrita, mientras que las secuencias de aminoácidos de la región marco y las secuencias de ácido nucleico que codifican la región marco están en letras sin formato.
Preferentemente, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno comprende (i) una región variable de cadena pesada con al menos el 80%, por ejemplo el 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16; o (ii) una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 33 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 34; (iii) o una región variable de cadena pesada con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 51 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 52; o (iv) una región variable de cadena pesada con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 69 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 71; o (v) una región variable de cadena pesada con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 70 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 71; o (vi) una región variable de cadena pesada con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 89 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 90; o (vii) una región variable de cadena pesada con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 107 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 108; o (viii) una región variable de cadena pesada con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 125 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 126; o (ix) una región variable de cadena pesada con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 143 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 144; o (x) una región variable de cadena pesada con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 161 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 162; o (xi) una región variable de cadena pesada con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 179 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 180; o (xii) una región variable de cadena pesada con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 197 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 198; o (xiii) una región variable de cadena pesada con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 215 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80%, por ejemplo un 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 216.
Con mayor preferencia, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno comprende: (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; o (ii) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; o (iii) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; o (iv) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; o (v) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; o (vi) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 89 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; o (vii) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; o (viii) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; o (ix) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 143 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 144; o (x) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 162; o (xi) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 180; o (xii) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 197 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 198; o (xiii) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 215 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 216.
Ejemplos de anticuerpos incluyen RVA122, RVA144, RVB185, RVB492, RVC3, RVC20, RVC21, RVC38, R V c 4 4 , RVC58, RVC68 o R v C ll l , preferiblemente RVC20 o RVC58. Preferiblemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, es de acuerdo con gRVA122, gRVA144, gRVB185, gRVB492, gRVC3, gRVC20, gRVC21, gRVC38, gRVC44, gRVC58, gRVC68 o gRVC111, preferentemente es de acuerdo con gRVC20 o gRVC58.
El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, puede emplearse en la profilaxis, el tratamiento 0 la atenuación de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV, preferiblemente lisavirus RABV y/o no RABV del filogrupo 1, en especial RABV y/o EBLV-1. A continuación se describen más detalles para este uso, por ejemplo directamente debajo y en el contexto de una composición farmacéutica y de uso médico.
Preferentemente, el uso del anticuerpo, o del fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe anteriormente comprende administrar dicho anticuerpo en combinación con otro anticuerpo monoclonal aislado que neutraliza la infección por lisavirus y que comprende una cadena pesada CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a la SEQ ID NO: 95 o a la SEQ ID NO: 167 y donde ambos anticuerpos se unen específicamente a diferentes epítopos de la glicoproteína G de RABV. El otro anticuerpo, es decir, el anticuerpo que neutraliza la infección por lisavirus y que comprende una cadena pesada CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a la SEQ ID NO: 95 o SEQ ID NO: 167 preferiblemente es también un anticuerpo tal como se describe aquí.
Preferentemente, el otro anticuerpo, es decir, el anticuerpo que neutraliza la infección por lisavirus y que comprende una cadena pesada CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a la SEQ ID NO: 95 o SEQ ID n O : 167 comprende preferiblemente (i) secuencias de aminoácidos de la cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de la cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93-97 y 99 o a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93-96 y 98-99, respectivamente, o (ii) secuencias de aminoácidos de la cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de la cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 165-169 y 171 o a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 165-168 y 170-171, respectivamente. Con mayor preferencia, el otro anticuerpo, es decir, el anticuerpo que neutraliza la infección por lisavirus y que comprende una cadena pesada CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a las SEQ ID NO: 95 o SEQ ID NO: 167, comprende una región variable de cadena pesada con al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 o de SEQ ID NO: 179. Incluso con mayor preferencia, el otro anticuerpo, es decir, el anticuerpo que neutraliza la infección por lisavirus y que comprende una cadena pesada CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a las SEQ ID NO: 95 o SEQ ID NO: 167, comprende (i) una región variable de cadena pesada con al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; o (ii) una región variable de cadena pesada con al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 180.
Así, se proporciona una combinación de anticuerpos para la profilaxis, el tratamiento o la atenuación de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV, preferiblemente por lisavirus RABV y/o no RABV del filogrupo 1, más preferiblemente RABV y/o EBLV-1, con al menos un anticuerpo en sentido amplio, incluyendo la neutralización de EBLV-1.
Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, para uso como se describe aquí se une al sitio antigénico I o III en la glicoproteína G de RABV y el otro anticuerpo, que se administra en combinación, se une al otro de los sitios antigénicos I o III de la glicoproteína G de RABV.
Es de señalar que los anticuerpos antirrábicos humanos reconocen con mayor frecuencia los sitios antigénicos 1 o III en la glucoproteína G de RABV, mientras que, por ejemplo, los anticuerpos antirrábicos de ratón reconocen con mayor frecuencia el sitio antigénico II en la glucoproteína G de RABV. Se supone que la dominancia inmunogénica del sitio antigénico II es menor en humanos que en ratones (Kramer RA, Marissen WE, Goudsmit J, Visser TJ, Clijsters-Van der Horst M, Bakker AQ, de Jong M, Jongeneelen M, Thijsse S , Backus HH, Rice AB, Weldon W c , Rupprecht CE, Dietzschold B, Bakker AB, de Kruif J (2005), The human antibody repertoire specific for rabies virus glycoprotein as selected from immune libraries. Eur J Immunol.
35(7):2131-45). Por consiguiente, se cree que una combinación de anticuerpos que reconocen los sitios antigénicos I y III en la glicoproteína G de RABV es más eficaz que, por ejemplo, una combinación que implica un anticuerpo que reconoce el sitio antigénico II en la glicoproteína G de RABv .
Preferiblemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso como se describe aquí comprende una cadena pesada CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a la SEQ ID NO: 95 y donde el otro anticuerpo administrado en combinación comprende una cadena pesada CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a la SEQ ID NO: 167 .
Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso como se describe aquí comprende secuencias de aminoácidos para las cadenas pesadas c Dr H 1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos para las cadenas ligeras CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93-97 y 99 o a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93-96 y 98-99, respectivamente, y el otro anticuerpo administrado en combinación comprende secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 165­ 169 y 171 o a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 165-168 y 170-171, respectivamente. Con mayor preferencia, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso como se describe aquí comprende una región variable de cadena pesada con al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 y el otro anticuerpo administrado en combinación comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 180. Incluso con mayor preferencia, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso como se describe aquí es de acuerdo con gRVC20 y donde el otro anticuerpo administrado en combinación es de acuerdo con gRVC58.
Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso de acuerdo con la presente invención como se describe aquí y el otro anticuerpo, que se administra en combinación, se administran simultánea o consecutivamente.
Es de destacar que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso de acuerdo con la presente invención como se describe aquí y el otro anticuerpo, que se administra en combinación, se pueden administrar por separado, por ejemplo en composiciones farmacéuticas separadas, o juntos, es decir, como un "cóctel" de anticuerpos, por ejemplo en la misma composición farmacéutica.
Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso según la presente invención como se describe aquí y el otro anticuerpo, que se administra en combinación, se administran por separado. Así, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso de acuerdo con la presente invención como se describe aquí y el otro anticuerpo, que se administra en combinación, pueden administrarse simultánea o consecutivamente. Para la administración consecutiva de ambos anticuerpos, el tiempo entre (el final de) la administración del primer anticuerpo y (el comienzo de) la administración del segundo anticuerpo, por ejemplo para la profilaxis post-exposición o para el tratamiento de la infección por lisavirus, preferiblemente es no superior a una semana, más preferiblemente no superior a 5 días, incluso más preferiblemente no superior a 3 días, con especial preferencia no superior a 2 días y con particular preferencia no superior a un día (24h). En una realización preferente del mismo, el tiempo entre (el final de) la administración del primer anticuerpo y (el comienzo de) la administración del segundo anticuerpo no es más de 12 h, preferiblemente no más de 6 h, más preferiblemente no más de 3 h, incluso más preferiblemente no más de 1 h, con especial preferencia no más de 30 min y con particular preferencia no más de 10 min. Es particularmente preferente una administración consecutiva donde un anticuerpo se administra inmediatamente después de la administración del otro anticuerpo (esto significa en particular que la administración de uno de los anticuerpos comienza menos de 10 minutos después del final de la administración del otro anticuerpo). En la administración consecutiva como se describe arriba, es preferente que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso según la presente invención como se describe aquí se administre primero y el otro anticuerpo, el que se administra en combinación, se administre después. En la administración consecutiva como se describe anteriormente, también es preferente que el otro anticuerpo, el que se administra en combinación, se administre primero y el anticuerpo, o el fragmento de unión al antígeno del mismo, para su uso de acuerdo con la presente invención como se describe aquí se administre posteriormente. En una realización preferente, se administra primero un anticuerpo que es según gRVC20 y después se administra un anticuerpo que es según gRVC58, como se describen anteriormente. En otra realización preferente, se administra primero un anticuerpo que es según gRVC58 y a continuación se administra un anticuerpo que es según gRVC20, como se describen anteriormente.
También es preferente que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso según la presente invención como se describe aquí y el otro anticuerpo, que se administra en combinación, se administren como un cóctel de anticuerpos, por ejemplo en la misma composición farmacéutica tal como se describe aquí.
Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso de acuerdo con la presente invención como se describe aquí y el otro anticuerpo, que se administra en combinación, se administran en cantidades equimolares.
La invención describe además un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que se une al mismo epítopo que un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno tal como se han descrito anteriormente, o un anticuerpo que compite con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tal como se han descrito anteriormente.
Preferentemente, este epítopo es el sitio antigénico III.2, B o C de la proteína G de RABV (glicoproteína G). Ninguno de los anticuerpos CR57 y CR4098 se une a estos epítopos, pero se unen al sitio antigénico I y III, respectivamente. Sin embargo, varios anticuerpos aquí descritos, a saber, RVB181, RVC56, RVB185, RVC21, RVB161 y RVC111, se unen al sitio antigénico III.2 de la proteína G de RABV. El nuevo sitio antigénico III.2 probablemente está próximo al sitio antigénico III en la proteína G de RABV (véase el ejemplo 3). Siguiendo los mismos criterios, se definieron tres nuevos sitios antigénicos adicionales denominados A, B y C. El sitio B está definido por el anticuerpo RVC44, cuya unión no está bloqueada por ningún otro anticuerpo del panel. De manera similar, el sitio C está definido por los anticuerpos RVB143 y RVC68, que también reconocen un epítopo único y distinto en comparación con todos los demás anticuerpos. Es de destacar que RVC44, RVB143 y RVC68 son los únicos anticuerpos de este panel capaces de unirse mediante transferencia Western a la proteína G en condiciones reductoras, lo que sugiere que reconocen un epítopo lineal en la proteína G de RABV (véase el ejemplo 3).
Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une al mismo epítopo que el anticuerpo tal como se describe anteriormente, también neutraliza la infección de RABV y la infección de al menos el 50% de los lisavirus no RABV DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV y WCBV con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml, por lo que las realizaciones preferentes antes descritas para el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, que neutralizan la infección de RABV y la infección de al menos un 50% de los lisavirus no RABV DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV y WCBV con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml también se aplican al anticuerpo, o al fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une al mismo epítopo que el anticuerpo antes descrito.
Los anticuerpos también incluyen moléculas de anticuerpos híbridas que neutralizan la infección de RABV y la infección de al menos el 50% de los lisavirus no RABV DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIV, BBLV y WCBV con una IC50 inferior a 10.000 ng/ml como se describió anteriormente y que comprenden una o más CDR de un anticuerpo como se describe aquí y una o más CDR de otro anticuerpo al mismo epítopo. En una realización, tales anticuerpos híbridos comprenden tres CDR de un anticuerpo como se describe aquí y tres CDR de otro anticuerpo para el mismo epítopo. Anticuerpos híbridos ilustrativos comprenden (i) las tres cadenas pesadas CDR de un anticuerpo como se describe aquí y las tres cadenas ligeras CDR de otro anticuerpo para el mismo epítopo, o (ii) las tres cadenas ligeras CDR de un anticuerpo tal como se describe aquí y las tres cadenas pesadas CDR de otro anticuerpo del mismo epítopo.
En otro aspecto, la presente descripción que comprende la invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se ha descrito anteriormente. Son preferentes las secuencias de ácidos nucleicos que codifican parte o la totalidad de las cadenas ligeras y pesadas y las CDR de los anticuerpos aquí descritos. Preferiblemente, se proporcionan aquí secuencias de ácido nucleico que codifican parte o todas las cadenas ligeras y pesadas y las CDR de los anticuerpos ilustrativos aquí descritos. La tabla 3 anterior proporciona los números de SEQ ID para las secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera de algunos ejemplos de anticuerpos. La Tabla 4 siguiente proporciona los números de SEQ ID para las secuencias de ácido nucleico que codifican las CDR de algunos ejemplos de anticuerpos. Debido a la redundancia del código genético, existirán variantes de estas secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen las mismas secuencias de aminoácidos.
Así, la presente descripción también comprende una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe aquí.
Una molécula de ácido nucleico es una molécula que comprende, preferiblemente que consiste en, componentes de ácido nucleico. El término molécula de ácido nucleico se refiere preferiblemente a moléculas de ADN o ARN. Preferiblemente se usa como sinónimo del término "polinucleótido". Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico es un polímero que comprende o consiste en monómeros nucleótidos que están unidos covalentemente entre sí mediante enlaces fosfodiéster de un esqueleto de azúcar/fosfato. El término "molécula de ácido nucleico" también incluye moléculas de ácido nucleico modificadas, tales como bases modificadas, modificadas con azúcar o modificadas en su esqueleto, etc., moléculas de ADN o ARN.
Tabla 4. Números de SEQ ID ara olinucleótidos CDR de anticuer os ilustrativos
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Preferentemente, la secuencia de polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico es al menos un 75% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de las SEQ ID NO: 8-14, 17, 18, 26-32, 35, 36, 44-50, 53, 54, 62-68, 72-74, 82-88, 91, 92, 100-106, 109, 110, 118-124, 127, 128, 136-142, 145, 146, 154-160, 163, 164, 172­ 178, 181, 182, 190-196, 199, 200, 208-214, 217 o 218. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico es de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 8-14, 17, 18, 26-32, 35, 36, 44­ 50, 53, 54, 62-68, 72-74, 82-88, 91, 92, 100-106, 109, 110, 118-124, 127, 128, 136-142, 145, 146, 154-160, 163, 164, 172-178, 181, 182, 190-196, 199, 200, 208-214, 217 o 218, o variantes de secuencia de las mismos.
También es preferente que las secuencias de ácidos nucleicos incluyan secuencias de ácidos nucleicos que tengan al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad con el ácido nucleico que codifica la región variable de una cadena pesada o ligera de un anticuerpo tal como se describe aquí. En otra realización, una secuencia de ácido nucleico de la invención tiene la secuencia de un ácido nucleico que codifica una CDR de cadena pesada o ligera de un anticuerpo tal como se describe aquí. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% idénticas a las secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 8-14, 17, 18, 26-32, 35, 36, 44-50, 53, 54, 62-68, 72-74, 82­ 88, 91, 92, 100-106, 109, 110, 118-124, 127, 128, 136-142, 145, 146, 154-160, 163, 164, 172-178, 181, 182, 190-196, 199, 200, 208-214, 217 o 218.
Las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad con el ácido nucleico que codifica una cadena pesada o ligera de un anticuerpo como se proporciona en las figuras 22 a 33.
En general, la molécula de ácido nucleico puede manipularse para insertar, eliminar o alterar determinadas secuencias de ácido nucleico. Los cambios de dicha manipulación incluyen cambios para introducir sitios de restricción, para modificar el uso de codones, para añadir u optimizar la transcripción y/o secuencias reguladoras de traducción, etc. También es posible cambiar el ácido nucleico para alterar los aminoácidos codificados. Por ejemplo, puede ser útil introducir una o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. Tales mutaciones puntuales pueden modificar funciones efectoras, la afinidad de unión a antígeno, modificaciones postraduccionales, inmunogenicidad, etc., pueden introducir aminoácidos para la unión de grupos covalentes (por ejemplo etiquetas) o pueden introducir etiquetas (por ejemplo con fines de purificación). Las mutaciones se pueden introducir en sitios específicos o de forma aleatoria, seguidas de selección (por ejemplo evolución molecular). Por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las regiones CDR, las regiones variables de la cadena pesada o las regiones variables de la cadena ligera de los anticuerpos como se describen aquí se pueden mutar aleatoria o direccionalmente para introducir diferentes propiedades en los aminoácidos codificados. Dichos cambios pueden ser resultado de un proceso iterativo donde se mantienen los cambios iniciales y se introducen nuevos cambios en otras posiciones de nucleótidos. Además, los cambios logrados en pasos independientes pueden combinarse. Las diferentes propiedades introducidas en los aminoácidos codificados pueden incluir mejorar la afinidad.
También se incluyen dentro del alcance de la presente descripción que comprende la invención los vectores, por ejemplo vectores de expresión, que comprenden una secuencia de ácido nucleico tal como se describe aquí. Preferiblemente, un vector comprende una molécula de ácido nucleico tal como se describe anteriormente.
El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico, preferiblemente a una molécula de ácido nucleico artificial, es decir, a una molécula de ácido nucleico que no se encuentra en la naturaleza. Un vector es adecuado para incorporar o albergar una secuencia de ácido nucleico deseada. Dichos vectores pueden ser vectores de almacenamiento, vectores de expresión, vectores de clonación, vectores de transferencia, etc. Un vector de almacenamiento es un vector que permite el almacenamiento conveniente de una molécula de ácido nucleico. Así, el vector puede comprender una secuencia correspondiente, por ejemplo, a un anticuerpo deseado o a un fragmento de anticuerpo del mismo tal como se describe aquí. Se puede usar un vector de expresión para la obtención de productos de expresión tales como ARN, por ejemplo ARNm, o péptidos, polipéptidos o proteínas. Por ejemplo, un vector de expresión puede comprender las secuencias necesarias para la transcripción de un tramo de secuencia del vector, como una secuencia promotora. Un vector de clonación es típicamente un vector que contiene un sitio de clonación, el cual puede usarse para incorporar secuencias de ácido nucleico al vector. Un vector de clonación puede ser, por ejemplo, un vector plásmido o bacteriófago. Un vector de transferencia puede ser un vector adecuado para transferir moléculas de ácido nucleico a células u organismos, por ejemplo, vectores virales. Un vector puede ser, por ejemplo, un vector de ARN o un vector de ADN. Preferiblemente, un vector es una molécula de ADN. Por ejemplo, un vector en el sentido de la presente solicitud comprende un sitio de clonación, un marcador de selección, tal como un factor de resistencia a antibióticos, y una secuencia adecuada para la multiplicación del vector, tal como un origen de replicación. Preferiblemente, un vector en el contexto de la presente solicitud es un vector plásmido.
También se describen aquí células transformadas con dichos vectores. Ejemplos de tales células incluyen células eucariotas, por ejemplo células de levadura, células animales o células vegetales. En una realización, las células son células de mamífero, por ejemplo humanas, CHO, HEK293T, PER.C6, NSO, células de mieloma o de hibridoma. Por consiguiente, la presente descripción que comprende la invención también se refiere a una célula que expresa el anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, tal como se describe aquí; o que comprende el vector tal como se describe aquí.
En particular, la célula puede ser transfectada con un vector tal como se describe aquí, preferentemente con un vector de expresión. El término "transfección" se refiere a la introducción de moléculas de ácido nucleico, tales como moléculas de ADN o ARN (por ejemplo ARNm), en células, preferiblemente en células eucariotas. Tal como se usa aquí, el término "transfección" abarca cualquier método conocido por el experto en la materia para introducir moléculas de ácido nucleico en células, preferiblemente en células eucariotas, tal como en células de mamífero. Dichos métodos abarcan, por ejemplo, electroporación, lipofección, por ejemplo basada en lípidos catiónicos y/o liposomas, precipitación con fosfato de calcio, transfección basada en nanopartículas, transfección basada en virus o transfección basada en polímeros catiónicos, tales como DEAE-dextrano o polietilenimina, etc. Preferiblemente, la introducción no es viral.
También se describen aquí anticuerpos monoclonales que se unen a un epítopo capaz de unirse a los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos aquí descritos. Por consiguiente, también se describe aquí un polipéptido inmunogénico aislado o purificado que comprende un epítopo que se une específicamente al anticuerpo o al fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe anteriormente. Dicho péptido inmunogénico también puede emplearse para una vacuna, por ejemplo para una vacuna empleada en combinación con los anticuerpos aquí descritos.
También se describen aquí nuevos epítopos a los que se unen los anticuerpos neutralizantes aquí descritos. Estos epítopos, en el sitio antigénico particular III.2, B y C, se encuentran en la proteína G de RABV (glicoproteína G) como se describió anteriormente.
Los epítopos a los que se unen los anticuerpos aquí descritos pueden ser lineales (continuos) o conformacionales (discontinuos). Preferiblemente, los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos como se describen aquí tienen se unen a un epítopo conformacional, en especial el epítopo conformacional está presente solo bajo condiciones no reductoras. Sin embargo, en particular con respecto a los sitios antigénicos B y C como se describió anteriormente, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos aquí descritos también pueden unirse a un epítopo lineal, en especial el epítopo lineal está presente tanto bajo condiciones no reductoras como bajo condiciones reductoras.
Los anticuerpos monoclonales y recombinantes son particularmente útiles en la identificación y purificación de los polipéptidos individuales u otros antígenos contra los cuales están dirigidos. Los anticuerpos aquí descritos tienen una utilidad adicional en el sentido de que pueden emplearse como reactivos en inmunoensayos, radioinmunoensayos (RIA) o ensayos inmunoabsorbentes con tinción enzimática (ELISA). En estas aplicaciones, los anticuerpos pueden marcarse con un reactivo detectable analíticamente, tal como un radioisótopo, una molécula fluorescente o una enzima. Los anticuerpos también se pueden emplear para la identificación y caracterización molecular (mapeo de epítopos) de antígenos.
Los anticuerpos aquí descritos también pueden acoplarse a un fármaco para su administración a un sitio de tratamiento o acoplarse a un marcador detectable para facilitar la obtención de imágenes de un sitio que comprenda células de interés, tales como células infectadas con lisavirus RABV y/o no RABV. Los métodos para unir anticuerpos a fármacos y marcadores detectables son bien conocidos en la técnica, al igual que los métodos para la visualización usando marcadores detectables. Los anticuerpos marcados se pueden emplear en una amplia variedad de ensayos, empleando una amplia variedad de marcadores. La detección de la formación de un complejo anticuerpo-antígeno entre un anticuerpo tal como el aquí descrito y un epítopo de interés (un epítopo de RABV y/o no RABV) se puede facilitar uniendo una sustancia detectable al anticuerpo. Medios de detección adecuados incluyen el uso de marcadores, tales como radionúclidos, enzimas, coenzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes, cromógenos, sustratos o cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, complejos de grupos prostéticos, radicales libres, partículas y colorantes. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluorescencia, rodamina, diclorotriazinilamina-difluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente es luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen 125I, 1311, 35S o 3H. Dichos reactivos marcados pueden usarse diversos ensayos bien conocidos, tales como radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimáticos, por ejemplo ELISA, e inmunoensayos fluorescentes (véase US 3,766,162; US3,791,932; US3,817,837 y US 4,233,402, por ejemplo).
Un anticuerpo de acuerdo como el aquí descrito se puede conjugar con un residuo terapéutico, tal como una citotoxina, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo o radioisótopo. Ejemplos de radioisótopos incluyen I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-1 86, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99 e ln-111. Tales conjugados de anticuerpos pueden emplearse para modificar una respuesta biológica dada; el residuo de fármaco no debe interpretarse como limitado a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el residuo de fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina diftérica.
Las técnicas para conjugar tales residuos terapéuticos con anticuerpos son bien conocidas. Véase, por ejemplo, Arnon et al. (1985) “Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2a ed; Marcel Dekker, Inc.), pp.
623-653; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italia, 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316; y Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158
Alternativamente, un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, puede conjugarse con un segundo anticuerpo, o fragmento de anticuerpo del mismo, para formar un heteroconjugado de anticuerpo tal como se describe en la US 4.676.980. Además, se pueden usar enlazadores entre los marcadores y los anticuerpos aquí descritos (por ejemplo US 4.831.175). Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden marcarse directamente con yodo, indio, itrio radiactivos u otra partícula radiactiva conocida en la técnica (por ejemplo US 5.595.721). El tratamiento puede consistir en una combinación de tratamiento con anticuerpos conjugados y no conjugados administrados simultánea o subsecuentemente (por ejemplo WO00/52031; WO00/52473).
Los anticuerpos aquí descritos también se pueden unir a un soporte sólido. Además, los anticuerpos aquí descritos, o fragmentos de anticuerpos funcionales de los mismos, pueden modificarse químicamente mediante conjugación covalente a un polímero para, por ejemplo, aumentar su vida media circulante. Ejemplos de polímeros y métodos para su unión a péptidos se muestran en la US 4.766.106, US 4.179.337, u S 4.495.285 y US 4.609.546. En algunas realizaciones, los polímeros se pueden seleccionar de polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua a temperatura ambiente y tiene la fórmula general: R(O-CH2-CH2 )nO-R, donde R puede ser hidrógeno o un grupo protector, tal como un grupo alquilo o alcanol. Preferiblemente, el grupo protector puede tener entre 1 y 8 carbonos. Por ejemplo, el grupo protector es metilo. El símbolo n es un número entero positivo. En una realización, n está entre 1 y 1.000. En otra realización, n está entre 2 y 500. Preferiblemente, el PEG tiene un peso molecular promedio entre 1.000 y 40.000, más preferiblemente el PEG tiene un peso molecular entre 2.000 y 20.000, incluso más preferiblemente el PEG tiene un peso molecular entre 3.000 y 12.000. Además, el PEG puede tener al menos un grupo hidroxilo, por ejemplo el PEG puede tener un grupo hidroxilo terminal. Por ejemplo, es el grupo hidroxilo terminal el que se activa para reaccionar con un grupo amino libre en el inhibidor. Sin embargo, se entenderá que el tipo y la cantidad de grupos reactivos pueden variar para lograr un conjugado PEG/anticuerpo covalente.
Los polioles polioxietilados solubles en agua también son útiles. Incluyen sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada y glicerol polioxietilado (POG). En una realización, se usa POG. Sin estar ligado a ninguna teoría, debido a que el esqueleto glicerol del glicerol polioxietilado es el mismo esqueleto que se encuentra naturalmente en, por ejemplo, mono-, di-, tri-glicéridos de animales y humanos, esta ramificación no necesariamente se vería como un agente extraño en el cuerpo. El POG puede tener un peso molecular en el mismo rango que el PEG. Otro sistema de administración de fármacos que se puede utilizar para aumentar la vida media circulatoria es el liposoma. Los expertos en la técnica conocen métodos para preparar sistemas de liberación de liposomas. En la técnica se conocen otros sistemas de administración de fármacos y se describen, por ejemplo, en el documento Poznansky et al. (1980) y Poznansky (1984).
Los anticuerpos aquí descritos se pueden proporcionar en forma purificada. Típicamente, el anticuerpo estará presente en una composición esencialmente libre de otros polipéptidos, por ejemplo donde menos del 90% (en peso), normalmente menos del 60% y más habitualmente menos del 50% de la composición está formada por otros polipéptidos.
Los anticuerpos aquí descritos pueden ser inmunogénicos en huéspedes no humanos (o heterólogos), por ejemplo, en ratones. En particular, los anticuerpos pueden tener un idiotopo inmunogénico en huéspedes no humanos, pero no en un huésped humano. Los anticuerpos tal como se describen aquí para uso humano incluyen aquellos que no pueden aislarse fácilmente de huéspedes tales como ratones, cabras, conejos, ratas, mamíferos no primates, etc. y generalmente no pueden obtenerse por humanización o a partir de xeno-ratones.
Los anticuerpos pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo IgA, IgG, IgM, es decir, una cadena pesada a y o |j), pero preferentemente serán IgG. Dentro del isotipo IgG, los anticuerpos pueden ser de la subclase IgG1, lgG2, lgG3 o lgG4, siendo preferente lgG1. Los anticuerpos pueden tener una cadena ligera A o k .
Producción de anticuerpos
Los anticuerpos aquí descritos se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la metodología general para obtener anticuerpos monoclonales usando tecnologías de hibridomas es bien conocida (Kohler, G. y Milstein, C., 1975; Kozbar y col. 1983). En una realización, se usa el método alternativo de inmortalización de EBV descrito en la WO2004/076677.
Usando el método descrito en la WO 2004/076677, las células B que producen el anticuerpo tal como se describe aquí se pueden transformar con EBV y un activador de células B policlonal. Pueden añadirse opcionalmente estimulantes adicionales de crecimiento y de diferenciación celular durante la etapa de transformación para mejorar aún más la eficacia. Estos estimulantes pueden ser citocinas, como IL-2 e IL-15. En un aspecto, se añade IL-2 durante la etapa de inmortalización para mejorar aún más la eficiencia de la inmortalización, pero su uso no es esencial. Las células B inmortalizadas producidas usando estos métodos pueden cultivarse mediante métodos conocidos en la técnica y los anticuerpos ser aislados de los mismos.
Con el método descrito en la WO 2010/046775, pueden cultivarse células plasmáticas en cantidades limitadas o como células plasmáticas individuales en placas de micropocillos de cultivo. Los anticuerpos pueden aislarse de los cultivos de las células plasmáticas. Además, a partir de los cultivos de células plasmáticas, se puede extraer ARN y se puede realizar una PCR por métodos conocidos en la técnica. Las regiones VH y VL de los anticuerpos pueden amplificarse mediante RT-PCR (PCR de transcriptasa inversa), secuenciarse y clonarse en un vector de expresión, que luego se transfecta en células HEK293T o en otras células huésped. La clonación de ácido nucleico en vectores de expresión, la transfección de células huésped, el cultivo de las células huésped transfectadas y el aislamiento del anticuerpo producido pueden realizarse usando cualquier método conocido por el experto en la materia.
Los anticuerpos se pueden purificar adicionalmente, si se desea, por filtración, centrifugación y varios métodos cromatográficos, tales como HPLC o cromatografía de afinidad. Las técnicas para la purificación de anticuerpos, por ejemplo anticuerpos monoclonales, incluyendo las técnicas para producir anticuerpos de calidad farmacéutica, son bien conocidas en la técnica.
Pueden obtenerse fragmentos de anticuerpos a partir de anticuerpos mediante métodos que incluyen la digestión con enzimas, tales como pepsina o papaína, y/o la escisión de enlaces disulfuro por reducción química. Alternativamente, se pueden obtener fragmentos de anticuerpos mediante clonación y expresión de parte de las secuencias de las cadenas pesadas o ligeras. Los "fragmentos" de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. Los fragmentos Fv de cadena simple (scFv) derivados de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo tal cmo se describe aquí también pueden ser útiles, por ejemplo un scFv que comprende las CDR de un anticuerpo tal como el aquí descrito. También se incluyen monómeros y dímeros de cadena pesada o ligera, anticuerpos de cadena pesada de dominio único, anticuerpos de cadena ligera de dominio único, así como anticuerpos de cadena única, por ejemplo Fv de cadena única donde se unen los dominios variables de las cadenas pesada y ligera mediante un enlazador peptídico.
Los fragmentos de anticuerpos pueden impartir interacciones monovalentes o multivalentes y pueden estar contenidos en diversas estructuras como se describe anteriormente. Por ejemplo, las moléculas scFv se pueden sintetizar para crear un "triacuerpo" trivalente o un “tetracuerpo” tetravalente. Las moléculas scFv pueden incluir un dominio de la región Fc que resulta en minicuerpos bivalentes. Además, las secuencias aquí descritas pueden ser un componente de moléculas multiespecíficas donde las secuencias como se describen aquí se dirigen a los epítopos aquí descritos y otras regiones de la molécula se unen a otras dianas. Moléculas ilustrativas incluyen Fab2 biespecífico, Fab3 triespecífico, scFv biespecífico y diacuerpos (Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136).
Pueden usarse técnicas estándar de biología molecular para preparar secuencias de ADN que codifican los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos tal como se describen aquí. Las secuencias de ADN deseadas pueden sintetizarse completa o parcialmente usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos. Las técnicas de mutagénesis dirigida a sitio y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) pueden usarse según sea apropiado.
Puede emplearse cualquier sistema célula huésped/vector adecuado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican las moléculas de anticuerpo aquí descritas o fragmentos de las mismas. Se pueden emplear bacterias, por ejemplo E. coli, y otros sistemas microbianos, en parte, para la expresión de fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab y F(ab')2, y especialmente fragmentos Fv y fragmentos de anticuerpos monocatenarios, por ejemplo Fv monocatenario. Se pueden emplear sistemas de expresión en células huésped eucarióticas, por ejemplo de mamífero, para producir moléculas de anticuerpos más grandes, incluyendo moléculas de anticuerpos completas. Células huésped de mamífero adecuadas incluyen células CHO, HEK293T, PER.C6, NSO, células de mieloma o de hibridoma.
También se describe aquí un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo tal como se describe aquí, que comprende cultivar una célula huésped que comprende un vector que codifica un ácido nucleico tal como se describe aquí bajo condiciones adecuadas para la expresión de proteínas a partir de un ADN que codifica la molécula de anticuerpo aquí descrita y aislar la molécula de anticuerpo.
La molécula de anticuerpo puede comprender sólo un polipéptido de cadena pesada o ligera, en cuyo caso sólo se necesita usar una secuencia polipeptídica codificante de cadena pesada o ligera para transfectar las células huésped. Para obtener productos que comprenden tanto cadenas pesadas como ligeras, la línea celular puede transfectarse con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Alternativamente, puede emplearse un solo vector, incluyendo el vector secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada. Alternativamente, los anticuerpos aquí descritos pueden producirse (i) expresando una secuencia de ácido nucleico tal como se describe aquí en una célula huésped y (ii) aislando el producto de anticuerpo expresado. Además, el método puede incluir (iii) purificar el anticuerpo aislado. Las células B transformadas y las células plasmáticas cultivadas pueden cribarse para determinar aquellas que producen anticuerpos con la especificidad o función deseada.
La etapa de cribado puede realizarse mediante cualquier inmunoensayo, por ejemplo, ELISA, por tinción de tejidos o células (incluyendo células transfectadas), con un ensayo de neutralización o mediante uno de varios otros métodos conocidos en la técnica para identificar una especificidad o función deseada. El ensayo puede seleccionarse según el simple reconocimiento de uno o más antígenos o adicionalmente según una función deseada, por ejemplo para seleccionar anticuerpos neutralizantes en lugar de solo anticuerpos de unión a antígenos, para seleccionar anticuerpos que pueden cambiar características de las células diana, tal como su cascada de señalización, su forma, su tasa de crecimiento, su capacidad de influir en otras células, su respuesta a la influencia de otras células o de otros reactivos o por un cambio en las condiciones, su estado de diferenciación, etc.
Entonces pueden producirse clones de células B transformadas individuales a partir del cultivo de células B transformadas positivas. La etapa de clonación para separar clones individuales de la mezcla de células positivas puede llevarse a cabo usando dilución limitante, micromanipulación, deposición de una sola célula por clasificación celular u otro método conocido en la técnica.
El ácido nucleico de las células plasmáticas cultivadas puede aislarse, clonarse y expresarse en células HEK293T u otras células huésped conocidas usando métodos conocidos en la técnica.
Los clones de células B inmortalizados o las células huésped transfectadas pueden emplearse de diversas formas, por ejemplo como fuente de anticuerpos monoclonales, como fuente de ácido nucleico (ADN o ARNm) que codifica un anticuerpo monoclonal de interés, para la investigación, etc.
También se describe aquí una composición que comprende células de memoria B inmortalizadas o células huésped transfectadas que producen los anticuerpos aquí descritos.
El clon de células B inmortalizadas o las células plasmáticas cultivadas aquí descritos también se pueden utilizar como fuente de ácido nucleico para la clonación de genes de anticuerpos para la expresión recombinante posterior. La expresión a partir de fuentes recombinantes es más habitual para fines farmacéuticos que la expresión de células B o hibridomas, por ejemplo por razones de estabilidad, reproducibilidad, facilidad de cultivo, etc.
Así, también se describe un método para preparar una célula recombinante, comprendiendo las etapas de: (i) obtener uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo ARNm de cadena pesada y/o ligera) del clon de la célula B o del plasma de células cultivadas que codifica el anticuerpo de interés; (ii) insertar el ácido nucleico en un vector de expresión y (iii) transfectar el vector en una célula huésped para permitir la expresión del anticuerpo de interés en esa célula huésped.
De manera similar, también se describe un método para preparar una célula recombinante, el cual comprende las etapas de: (i) secuenciar el ácido o los ácidos nucleicos del clon de la célula B o de las células plasmáticas cultivadas que codifican el anticuerpo de interés; y (ii) usar la información de secuencia de la etapa (i) para preparar el o los ácidos nucleicos para la inserción en una célula huésped con el fin de permitir la expresión del anticuerpo de interés en esa célula huésped. El ácido nucleico puede manipularse, pero no es necesario, entre las etapas (i) y (ii) para introducir sitios de restricción, cambiar el uso de codones y/u optimizar las secuencias reguladoras de la transcripción y/o la traducción.
Además, también se describe un método para preparar una célula huésped transfectada, el cual comprende el paso de transfectar una célula huésped con uno o más ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo de interés, donde los ácidos nucleicos son ácidos nucleicos que se derivan de clon de células B inmortalizado o de una célula plasmática cultivada tal como se describe aquí. Así, los procedimientos para preparar primero el o los ácidos nucleicos y luego usarlos para transfectar una célula huésped se pueden realizar en diferentes momentos por diferentes personas en diferentes lugares (por ejemplo, en diferentes países).
Estas células recombinantes como se describen aquí pueden usarse luego con fines de expresión y cultivo. Son particularmente útiles para la expresión de anticuerpos con el fin de una producción farmacéutica a gran escala. También se pueden utilizar como ingrediente activo en una composición farmacéutica. Se puede utilizar cualquier técnica de cultivo adecuada, incluyendo cultivo estático, cultivo en botella giratoria, fluido ascites, cartucho de biorreactor de fibra hueca, minifermentador modular, tanque agitado, cultivo de microportadores, perfusión de núcleo cerámico, etc.
Los métodos para obtener y secuenciar genes de inmunoglobulina a partir de células B o células plasmáticas son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, véase el Capítulo 4 de Kuby Immunology, 4a edición, 2000).
La célula huésped transfectada puede ser una célula eucariota, incluyendo células de levadura y animales, en particular células de mamífero (por ejemplo células CHO, células NS0, células humanas como PER.C6 o células HKB-11, células de mieloma), así como células vegetales. Los huéspedes de expresión preferentes pueden glicosilar el anticuerpo aquí descrito, en particular con estructuras carbohidrato que no son en sí mismas inmunogénicas en humanos. En una realización, la célula huésped transfectada puede crecer en un medio sin suero. En otra realización, la célula huésped transfectada puede crecer en cultivo sin la presencia de productos derivados animales. La célula huésped transfectada también se puede cultivar para dar una línea celular.
También se describe aquí un método para preparar una o más moléculas de ácido nucleico (por ejemplo genes de cadena pesada y ligera) que codifican un anticuerpo de interés, comprendiendo el método las etapas de: (i) preparar un clon de células B inmortalizadas o cultivar células plasmáticas tal como se describe aquí; (ii) obtener del clon de células B o de las células plasmáticas cultivadas el ácido nucleico que codifica el anticuerpo de interés. Además, también se describe un método para obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de interés que comprende las etapas de: (i) preparar un clon de células B inmortalizadas o cultivar células plasmáticas tal como se describe aquí; (ii) secuenciar el ácido nucleico del clon de células B o las células plasmáticas cultivadas que codifican el anticuerpo de interés.
También se describe un método para preparar molécula(s) de ácido nucleico que codifica(n) un anticuerpo de interés, comprendiendo el método la etapa de obtener el ácido nucleico que fue obtenido a partir de un clon de células B transformadas o de células plasmáticas cultivadas tal como las aquí descritas. Así, los procedimientos para obtener primero el clon de células B o la célula plasmática cultivada y luego obtener el o los ácidos nucleicos del clon de células B o de las células plasmáticas cultivadas se pueden realizar en diferentes momentos por diferentes personas en diferentes lugares (por ejemplo en diferentes países).
También se describe aquí un método para preparar un anticuerpo (por ejemplo para uso farmacéutico) como el aquí descrito que comprende las etapas de: (i) obtener y/o secuenciar uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo genes de cadena pesada y ligera) del clon de células B seleccionado o de las células plasmáticas cultivadas que expresan el anticuerpo de interés; (ii) insertar el o los ácidos nucleicos en o usar las secuencias de ácido nucleico para preparar un vector de expresión; (iii) transfectar una célula huésped que pueda expresar el anticuerpo de interés; (iv) cultivar o subcultivar las células huésped transfectadas en condiciones en las que se expresa el anticuerpo de interés; y, opcionalmente, (v) purificar el anticuerpo de interés.
Además, también se describe aquí un método para preparar un anticuerpo, el cual comprende las etapas de: cultivar o subcultivar una población de células huésped transfectadas en condiciones en las que se expresa el anticuerpo de interés y, opcionalmente, purificar el anticuerpo de interés, donde dicha población de células huésped transfectadas se ha preparado (i) proporcionando un ácido nucleico que codifica un anticuerpo seleccionado de interés que es producido por un clon de células B o células plasmáticas cultivadas preparadas como se describe anteriormente, (ii) insertando el ácido nucleico en un vector de expresión, (iii) transfectando el vector en una célula huésped que puede expresar el anticuerpo de interés, y (iv) cultivando o subcultivando la célula huésped transfectada que comprende los ácidos nucleicos insertados para producir el anticuerpo de interés. Así, los procedimientos para preparar primero la célula huésped recombinante y luego cultivarla para expresar el anticuerpo pueden realizarse en momentos muy diferentes por diferentes personas en diferentes lugares (por ejemplo en diferentes países).
Epítopos
Como se mencionó anteriormente, los anticuerpos aquí descritos se pueden usar para mapear los epítopos a los que se unen. Los anticuerpos tal como se describen aquí, que se unen a epítopos y anticuerpos conocidos, se unen a nuevos epítopos de la proteína G de RABV (glicoproteína G). Estos epítopos de la proteína G de RABV y ejemplos de anticuerpos que se unen a cada uno de los epítopos se describen en detalle en los ejemplos 3 y 5 y, más específicamente, con respecto a la conservación de los sitios antigénicos I y III en la proteína G de RABV en el ejemplo 6.
En general, los epítopos a los que se unen los anticuerpos aquí descritos pueden ser lineales (continuos) o conformacionales (discontinuos). En una realización preferente, los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos se unen a un epítopo conformacional. También es preferente que el epítopo conformacional esté presente solo bajo condiciones no reductoras.
Esto es, se ha demostrado previamente que los dos anticuerpos de referencia CR57 y CR4098 reconocen los sitios antigénicos I y III de la proteína G de RABV (Bakker, A. B. H. et al., J Virol 79, 9062-9068, 2005), respectivamente. Los anticuerpos ilustrativos aquí descritos pueden agruparse en 6 grupos. RVA125, RVC3, RVC20 y RVD74 se unen al grupo del sitio antigénico I. Es de destacar que la unión de los anticuerpos antigénicos al sitio I de la proteína G se ve reforzada por un subgrupo de anticuerpos no antigénicos del sitio 1. RVA122, RVA144, RVB492, RVC4, RVC69, RVC38 y RVC58 se unen al sitio antigénico III, por lo que el epítopo RVC58 podría solapar sólo parcialmente con el sitio antigénico III. Un tercer grupo compuesto por los anticuerpos RVB181, RVC56, RVB185, RVC21, RVB161 y RVC111 se une al sitio antigénico III.2, que es probablemente proximal al sitio antigénico III de la proteína G. Se definieron tres sitios adicionales denominados A, B y C. El sitio A está definido por el anticuerpo único RVB686, por lo que la unión de RVB686 podría inducir un efecto alostérico sobre la proteína G que compromete la unión de la mayoría de los otros anticuerpos. El sitio B está definido por el anticuerpo RVC44. De manera similar, el sitio C está definido por los anticuerpos RVB143 y RVC68, que también reconocen un epítopo único y distinto en comparación con todos los otros anticuerpos. Cabe señalar que RVC44, RVB143 y RVC68 son los únicos anticuerpos de este panel capaces de unirse a la proteína G en condiciones reductoras, lo que sugiere que reconocen un epítopo lineal en la proteína G de Ra BV.
Los polipéptidos que se unen a los anticuerpos aquí descritos pueden tener varios usos. Los polipéptidos y variantes de polipéptidos de los mismos en forma purificada o sintética pueden emplearse para generar respuestas inmunes (es decir, como una vacuna, o para la producción de anticuerpos para otros usos) o para cribar sueros en busca de anticuerpos que inmunorreaccionan con el epítopo o mimotopos del mismo. En una realización, tales polipéptidos o variantes de polipéptidos o antígenos que comprenden tales polipéptidos o variantes de polipéptidos pueden usarse como vacuna para generar una respuesta inmune que comprenda anticuerpos de la misma calidad que los aquí descritos.
Además, se describe aquí el uso del anticuerpo, o del fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se describe aquí para monitorear la calidad de las vacunas contra lisavirus anti-RABV y/o no RABV comprobando que el antígeno de dicha vacuna contiene el epítopo específico en la conformación correcta.
Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos aquí descritos también se pueden usar en un método para controlar la calidad de las vacunas. En particular, los anticuerpos pueden emplearse para comprobar que el antígeno de una vacuna contiene el epítopo inmunogénico correcto en la conformación correcta. El uso de un anticuerpo tal como se describe aquí, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, para monitorizar la calidad de una vacuna contra lisavirus RABV y/o no RABV, por ejemplo comprobando que el antígeno de dicha vacuna contiene el epítopo específico en la conformación correcta también se describe aquí.
Los polipéptidos que se unen a los anticuerpos aquí descritos también pueden ser útiles en el cribado de ligandos que se unen a dichos polipéptidos. Tales ligandos incluyen anticuerpos; incluyendo aquellos de camello, tiburón y otras especies, fragmentos de anticuerpos, péptidos, productos de tecnología de visualización de fagos, aptámeros, adnectinas o fragmentos de otras proteínas virales o celulares, que pueden bloquear el epítopo y así prevenir la infección.
Composiciones farmacéuticas
La descripción que comprende la presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más de: los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos aquí descritos; el ácido nucleico que codifica dichos anticuerpos o fragmentos; el vector que codifica los ácidos nucleicos; la célula que expresa el anticuerpo o que comprende el vector; o el polipéptido inmunogénico reconocido por los anticuerpos o el fragmento de unión al antígeno tal como se describe aquí. La composición farmacéutica también puede contener un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se describen aquí, el ácido nucleico tal como se describe aquí, el vector tal como se describe aquí, la célula tal como se describe aquí o el polipéptido inmunogénico tal como se describe aquí y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Aunque el vehículo o excipiente puede facilitar la administración, no debe inducir por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Tampoco debería ser tóxico. Vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes, de metabolización lenta, tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas.
Pueden emplearse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales inorgánicas tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables en las composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos como agua, solución salina, glicerol y etanol. Además, en tales composiciones pueden estar presentes sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes, o sustancias tampón del pH. Dichos vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas y suspensiones para su ingestión por parte del sujeto.
Las composiciones se pueden preparar de diversas formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección (por ejemplo una composición liofilizada, como Synagis™ y Herceptin™, para su reconstitución con agua estéril que contiene un conservante). La composición se puede preparar para la administración tópica, por ejemplo como una pomada, crema o polvo. La composición se puede preparar para la administración oral, por ejemplo como una pastilla o cápsula, como un aerosol o como un jarabe (opcionalmente aromatizado). La composición se puede preparar para la administración pulmonar, por ejemplo como un inhalador, usando un polvo fino o un aerosol. La composición se puede preparar como un supositorio o pesario. La composición puede prepararse para la administración nasal, auditiva u ocular, por ejemplo en forma de gotas. La composición puede estar en forma de kit diseñado de manera que una composición combinada se reconstituya justo antes de la administración a un sujeto. Por ejemplo, se puede proporcionar un anticuerpo liofilizado en forma de kit con agua estéril o un tampón estéril.
Se apreciará que el ingrediente activo de la composición será una molécula de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o variantes y derivados del mismo. Como tal, será susceptible de degradación en el tracto gastrointestinal. Así, si la composición se va a administrar por una vía que usa el tracto gastrointestinal, la composición deberá contener agentes que protejan al anticuerpo de la degradación, pero que liberen el anticuerpo una vez que se haya absorbido a partir del tracto gastrointestinal.
En Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, ISBN: 0683306472, se encuentra una discusión exhaustiva de vehículos farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas generalmente tienen un pH entre 5,5 y 8,5, en algunas realizaciones éste puede estar entre 6 y 8, y en otras realizaciones ser de aproximadamente 7. El pH puede mantenerse mediante el uso de un tampón. La composición puede ser estéril y/o libre de pirógenos. La composición puede ser isotónica con respecto a los humanos. En una realización, las composiciones farmacéuticas se suministran en recipientes cerrados herméticamente.
Las composiciones pueden estar presentes en varias formas de administración; las formas incluyen aquellas adecuadas para la administración parenteral, por ejemplo mediante inyección o infusión, por ejemplo por inyección en bolo o infusión continua. Cuando el producto es para la inyección o infusión, puede estar en forma de suspensión, solución o emulsión en un vehículo oleoso o acuoso y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca para su reconstitución antes de su uso con un líquido estéril apropiado. Típicamente se entiende que un vehículo es un material adecuado para almacenar, transportar y/o administrar un compuesto, tal como un compuesto farmacéuticamente activo, en particular los anticuerpos aquí descritos. Por ejemplo, el vehículo puede ser un líquido fisiológicamente aceptable adecuado para almacenar, transportar y/o administrar un compuesto farmacéuticamente activo, en particular los anticuerpos aquí descritos. Una vez formuladas, las composiciones se pueden administrar directamente al sujeto. En una realización, las composiciones están adaptadas para su administración a mamíferos, por ejemplo sujetos humanos.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por cualquier vía, incluyendo la vía oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea, tópica, subcutánea, intranasal, enteral, sublingual, intravaginal o rectal. También se pueden usar hipoespráis para administrar las composiciones farmacéuticas. Normalmente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección.
La administración directa de las composiciones generalmente se realizará mediante inyección de forma subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o administrada al espacio intersticial de un tejido, siendo preferente la inyección intravenosa o intramuscular, en especial la inyección intramuscular. Las composiciones también se pueden administrar en una lesión. De manera particularmente preferente, la composición se administra de manera similar a las inmunoglobulinas antirrábicas (RIG) conocidas en la profilaxis post-exposición. Por ejemplo, la OMS recomienda administrar todo el RIG, o tanto como sea anatómicamente posible para evitar un posible síndrome compartimental, en o alrededor del sitio o sitios de la herida (por ejemplo el sitio de la mordedura). La inmunoglobulina restante, si la hay, debe inyectarse vía intramuscular en un sitio distante del sitio de administración de la vacuna (véase http://www.who.int/rabies/human/WHO_strategy_prepost_exposure/en/index1.html#, recuperado el 12 de noviembre de 2014). Por consiguiente, este método de administración también es particularmente preferente para el anticuerpo y la composición farmacéutica, al menos en la profilaxis post-exposición y posiblemente también en el tratamiento u otras aplicaciones.
El tratamiento de dosis puede ser un programa de dosis única o un programa multidosis. Los productos farmacéuticos conocidos basados en anticuerpos proporcionan orientación relacionada con la frecuencia de administración, por ejemplo si un producto farmacéutico debe administrarse diaria, semanal, mensualmente, etc. La frecuencia y la dosis también pueden depender de la gravedad de los síntomas. En particular, el programa de tratamiento de inmunoglobulinas antirrábicas proporciona una guía relacionada con la frecuencia de administración. En el caso de RIG, en la profilaxis post-exposición se recomienda administrar RIG para la inmunización pasiva solo una vez, preferiblemente al inicio de la vacunación post-exposición o tan pronto como sea posible después. Por consiguiente, este programa de tratamiento también es particularmente preferente para el anticuerpo y la composición farmacéutica, al menos en la profilaxis post-exposición. DE forma más general, es decir, para todas las aplicaciones, es preferente que el anticuerpo o la composición farmacéutica se administren en un programa de dosis única, es decir, solo una dosis. Por consiguiente, la composición farmacéutica preferentemente se proporciona como un producto de dosis única, es decir, como un producto que comprende una dosis única. Sin embargo, dado que la dosis puede depender del peso corporal, en tales casos una dosis correspondiente a un peso corporal máximo se considera "dosis única".
En particular, se prefiere que la cantidad del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno del mismo de la composición farmacéutica no exceda de 100 mg, preferiblemente no exceda de 50 mg, más preferiblemente no exceda de 20 mg, incluso más preferiblemente no exceda de 10 mg, y en particular no exceda de 5 mg. Preferentemente, esta cantidad de anticuerpo se refiere a una dosis única como se describe anteriormente. La dosis del anticuerpo que es eficaz, por ejemplo en la profilaxis post-exposición, es así baja, mientras que la cantidad recomendada de HRIG es de 20 lU/kg de peso corporal, para ERIG y F(ab')2 es incluso de 40 lU/kg de peso corporal. Una cantidad tan baja de anticuerpo podría producirse y formularse en una forma estable (es decir, como una formulación liofilizada, donde, por ejemplo, estudios previos han demostrado que los anticuerpos monoclonales conservados por liofilización son estables durante 33 meses a 40 °C y 5 meses a 50 °C) y a un coste asequible también para los países en desarrollo.
Sin embargo, el anticuerpo o la composición farmacéutica también se pueden administrar en más de una dosis, por ejemplo en casos graves, por ejemplo en protocolos de tratamiento.
Preferentemente, la composición se administra a un sujeto después de que haya tenido lugar una infección con un lissavirus RABV y/o no RABV.
Las composiciones farmacéuticas incluirán una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos como se describen aquí y/o de un polipéptido que comprende un epítopo que se une a un anticuerpo tal como se describe aquí, es decir, una cantidad suficiente para tratar, mejorar, atenuar o prevenir una enfermedad o afección deseada 0 para exhibir un efecto terapéutico detectable. Los efectos terapéuticos también incluyen la reducción o atenuación de la potencia patógena o los síntomas físicos. La cantidad eficaz precisa para cualquier sujeto particular dependerá de su tamaño, peso y salud, la naturaleza y la extensión de la afección y la terapéutica o combinación de terapias seleccionadas para la administración. La cantidad eficaz para una situación dada se determina mediante experimentación de rutina y está dentro del juicio médico. Una dosis eficaz estará generalmente entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 100 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 0,0075 a aproximadamente 75 mg/kg, más preferiblemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 60 mg/kg, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 50 mg/kg del anticuerpo aquí descrito en el individuo al que se administra.
Preferentemente, la composición farmacéutica comprende al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se describen aquí, donde los dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen específicamente a diferentes epítopos en la glicoproteína G de RABV. Por ejemplo, la composición farmacéutica comprende un primer anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se describen aquí, y un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se describen aquí, donde el primer anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a otro epítopo en la glicoproteína G de RABV que el segundo anticuerpo o el segundo fragmento de unión a antígeno del mismo.
Es decir, los dos anticuerpos aquí descritos se unen específicamente a la proteína G de RABV, pero a diferentes epítopos de la proteína G de RABV. Por ejemplo, un anticuerpo puede unirse específicamente al sitio antigénico 1 de la proteína G de RABV y un anticuerpo adicional puede unirse específicamente a un epítopo de la glicoproteína G de RABV que se solapa al menos parcialmente con el sitio antigénico III de la glicoproteína G de RABV. Los sitios antigénicos de los anticuerpos ilustrativos se describen en el Ejemplo 3. Además, el experto en la técnica puede determinar fácilmente si dos anticuerpos se unen al mismo o a diferentes epítopos de la proteína G de RABV, por ejemplo empleando cualquier estudio competitivo, en el Ejemplo 3 se muestra un ejemplo de un estudio competitivo.
Preferentemente, un anticuerpo de los al menos dos anticuerpos comprendidos en dicha composición farmacéutica se une (específicamente) al sitio antigénico I en la glicoproteína G de RABV y otro anticuerpo de los al menos dos anticuerpos comprendidos en dicha composición farmacéutica se une (específicamente) al sitio antigénico III de la glicoproteína G de RABV.
Con mayor preferencia, al menos uno de los al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno del mismo comprendidos en dicha composición farmacéutica comprende una cadena pesada CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a la SEQ ID NO: 95 o a la SEQ ID NO: 167.
En una composición farmacéutica preferente, uno de los al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno del mismo comprende (i) secuencias de aminoácidos de la cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de la cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93-97 y 99 o a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93-96 y 98-99, respectivamente o (ii) secuencias de aminoácidos de la cadena pesada CDRH 1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de la cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 165-1 69 y 17 o a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 165-168 y 170-171, respectivamente. En especial, uno de los al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que tiene al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 o de SEQ ID NO: 179.
En una composición farmacéutica particularmente preferente que comprende al menos dos anticuerpos como se describen aquí, uno de los al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprende una cadena pesada CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a la SEQ ID NO: 95 y donde otro de los al menos dos anticuerpos comprende una cadena pesada CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a la SEQ ID NO: 167. Preferentemente, uno de los al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno del mismo comprende secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93-97 y 99 o a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93-96 y 98­ 99, respectivamente, y otro de los al menos dos anticuerpos comprende secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, Cd Rh 2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 165-169 y 171 o a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 165-168 y 170-171, respectivamente. Con mayor preferencia, uno de los al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión de antígeno de los mismos es según la gRVC20 y el otro de los al menos dos anticuerpos es según gRVC58.
Un ejemplo particularmente preferente de dos anticuerpos que se unen específicamente a diferentes epítopos de la glicoproteína G de Ra Bv es RVC20 y RVC58.
Además, la composición farmacéutica también puede contener más de dos, por ejemplo 3, 4, 5, 6, etc., anticuerpos como los aquí descritos, por lo que al menos dos, preferiblemente más de dos, más preferiblemente todos los anticuerpos contenidos se unen a diferentes epítopos de la proteína G de RABV.
Preferentemente, los (al menos) dos anticuerpos aquí descritos están presentes en la composición farmacéutica en cantidades equimolares, preferiblemente como una mezcla equimolar.
La combinación de dos de tales anticuerpos que se unen a diferentes epítopos de la proteína G de RABV representa un tratamiento con una amplitud de reactividad sin precedentes y con un riesgo reducido de escapar a la selección de mutantes. En particular, una combinación de dos o más anticuerpos monoclonales como los aquí descritos donde los anticuerpos se unen a diferentes epítopos o sitios en la proteína G de RABV aumenta el efecto protector y evita el escape de variantes resistentes del virus.
Preferentemente, las composiciones pueden incluir dos o más (por ejemplo 2, 3, 4, 5, etc.) anticuerpos tal como se describen aquí para proporcionar un efecto terapéutico aditivo o sinérgico. El término "sinergia" se usa para describir un efecto combinado de dos o más agentes activos que es mayor que la suma de los efectos individuales de cada agente activo respectivo. Así, cuando el efecto combinado de dos o más agentes da como resultado una "inhibición sinérgica" de una actividad o proceso, se pretende que la inhibición de la actividad o proceso sea mayor que la suma de los efectos inhibidores de cada agente activo respectivo. El término "efecto terapéutico sinérgico" se refiere a un efecto terapéutico observado con una combinación de dos o más terapias en el que el efecto terapéutico (medido por cualquiera de varios parámetros) es mayor que la suma de los efectos terapéuticos individuales observados con el respectivo terapias individuales.
En otra realización, la composición puede comprender uno o más (por ejemplo 2, 3, etc.) anticuerpos tales como los aquí descritos y uno o más (por ejemplo 2, 3, etc.) anticuerpos adicionales contra un lisavirus RABV y/o no RABV. Los anticuerpos aquí descritos pueden administrarse junto con anticuerpos específicos para otros patógenos. Los anticuerpos tal como se describen aquí pueden administrarse combinados/simultáneamente o en momentos separados de los anticuerpos específicos de patógenos distintos de lisavirus RABV y/o no RABV.
En otra realización, se describe una composición farmacéutica que comprende dos o más anticuerpos donde el primer anticuerpo es un anticuerpo como se describe aquí y el segundo anticuerpo es específico para un patógeno diferente que puede haber co-infectado al sujeto al que se le administra una composición farmacéutica.
En una realización particularmente preferente, la composición farmacéutica aquí descrita se administra en combinación con una vacuna antirrábica (inmunización activa), en particular en la profilaxis post-exposición. Las vacunas contra la rabia disponibles en la actualidad incluyen las vacunas de tejido nervioso, más utilizadas pero con mayor riesgo de riesgo, o las vacunas de cultivo celular y huevos embrionados (CCEEV), más seguras pero más costosas. En Alemania, por ejemplo, sólo hay dos vacunas antirrábicas en el mercado, Rabipur® y "Tollwut-lmpfstoff (célula diploide humana [HDC]) inactivada". Estas vacunas contienen virus de la rabia inactivados. Ambas vacunas se recomiendan para la pre- y post-exposición. Otro ejemplo de vacuna contra la rabia es Imovax (Sanofi Pasteur), que es una vacuna comercial de células diploides humanas inactivadas. Las vacunas antirrábicas se administran en general de acuerdo con la información del fabricante, por lo que un protocolo típico de profilaxis post-exposición incluye la administración de la vacuna los días 0, 3, 7, 14 y 28 después de la infección. La composición farmacéutica (inmunización pasiva) se administra preferiblemente solo una vez, preferiblemente simultáneamente o tan pronto como sea posible después del inicio de la vacunación. Preferiblemente, la composición farmacéutica se administra en un sitio distante de la vacuna.
Ejemplos de anticuerpos como se describen aquí específicos para, y que neutralizan lisavirus RABV y/o no RABV incluyen RVA122, RVA144, RVB185, RVB492, RVC3, RVC20, RVC21, RVC38, RVC44, RVC58, RVC68 y RVC111.
Es particularmente preferente la combinación, en particular una combinación equimolar, de anticuerpos según gRVC20 y gRVC58, más preferiblemente anticuerpos RVC20 y RVC58. RVC20 se une al sitio antigénico I de la proteína G de RABV y RVC 58 se une a un epítopo de la glicoproteína G de RABV que se solapa al menos parcialmente con el sitio antigénico III de la glicoproteína G de RABV. Así, es preferente una composición farmacéutica que comprende los anticuerpos RVC58 y RVC20 o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, preferiblemente en cantidades equimolares, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Además, también es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con gRVA122 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con gRVA144 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con gRVB185 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según gRVB492 o un fragmento de unión al antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con gRVC3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con gRVC20 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con gRVC21 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con gRVC38 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con gRVC44 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con gRVC58 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con gRVC68 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según gRVC111 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Además, también es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo RVA122 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo RVA144 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo RVB185 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo RVB492 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo RVC3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo RVC20 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo RVC21 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo RVC38 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo RVC44 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo RVC58 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo RVC68 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo RVC111 variante 3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se pueden administrar anticuerpos a aquellos sujetos que previamente no han mostrado respuesta, es decir, se ha demostrado que son refractivos al tratamiento de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV. Dicho tratamiento puede incluir un pre-tratamiento con un agente antiviral. Esto puede deberse, por ejemplo, a una infección con una cepa de lisavirus RABV y/o no RABV resistente a los antivirales.
En una realización, una composición puede incluir los anticuerpos aquí descritos donde los anticuerpos pueden constituir al menos el 50% en peso (por ejemplo el 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más) de la proteína total en la composición. En tal composición, los anticuerpos están en forma purificada.
También se describe aquí un método para preparar una composición farmacéutica, el cual comprende las etapas de: (i) preparar un anticuerpo tal el aquí descrito; y (ii) mezclar el anticuerpo purificado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.
En otra realización, un método para preparar una composición farmacéutica comprende el paso de: mezclar un anticuerpo con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, siendo el anticuerpo un anticuerpo monoclonal que se obtuvo a partir de una célula B transformada o de una célula plasmática cultivada tal como se describe aquí. Así, los procedimientos para obtener primero el anticuerpo monoclonal y luego preparar el fármaco se pueden realizar en momentos muy diferentes por diferentes personas en diferentes lugares (por ejemplo en diferentes países).
Como alternativa a la administración de anticuerpos o células B con fines terapéuticos, es posible administrar un ácido nucleico (típicamente ADN) que codifica el anticuerpo monoclonal de interés (o un fragmento activo del mismo) derivado de la célula B o de las células plasmáticas cultivadas a un sujeto, de manera que el ácido nucleico se pueda expresar en el sujeto in situ para proporcionar un efecto terapéutico deseado. Se conocen en la técnica vectores de administración de ácidos nucleicos y terapias génicas adecuados.
Las composiciones pueden ser composiciones inmunogénicas y, en algunas realizaciones, pueden ser composiciones de vacuna que comprenden un antígeno que comprende un epítopo reconocido por un anticuerpo tal como se describe aquí o un fragmento de unión de antígeno del mismo, en particular composiciones farmacéuticas tal como se describen aquí que comprenden un polipéptido inmunogénico de como se describe aquí. Tales “vacunas” pueden ser tanto profilácticas (es decir, para prevenir la infección) como terapéuticas (es decir, para tratar o mejorar la infección). Estas composiciones de vacuna pueden provocar tanto una respuesta inmune mediada por células como una respuesta inmune humoral con el fin de abordar eficazmente la infección por lisavirus RABV y no RABV. Esta respuesta inmune puede inducir anticuerpos de larga duración (por ejemplo neutralizantes) y una inmunidad mediada por células que pueden responder rápidamente a la exposición a lisavirus RABV y/o no RABV.
Las composiciones pueden incluir un antimicrobiano, en particular si se envasan en un formato multidosis. Pueden comprender un tensioactivo, por ejemplo un Tween (polisorbato), tal como Tween 80. Generalmente los tensioactivos están presentes en niveles bajos, por ejemplo menos del 0,01%. Las composiciones también pueden incluir sales de sodio (por ejemplo cloruro de sodio) para dar tonicidad. Es típica una concentración de 10 ± 2 mg/ml de NaCl.
Además, las composiciones pueden comprender un alcohol de azúcar (por ejemplo manitol) o un disacárido (por ejemplo sacarosa o trehalosa), por ejemplo alrededor de 15-30 mg/ml (por ejemplo 25 mg/ml), en particular si van a ser liofilizadas o si incluyen un material que ha sido reconstituido a partir de material liofilizado. El pH de una composición para liofilización puede ajustarse entre 5 y 8 o entre 5,5 y 7 o alrededor de 6,1 antes de la liofilización.
Las composiciones también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. En una realización, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen un adyuvante.
Kit de partes
En un aspecto adicional, la presente descripción que comprende la invención proporciona un kit de partes que comprende al menos un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se describe aquí, al menos un ácido nucleico tal como se describe aquí, al menos un vector tal como se describe aquí, al menos una célula tal como se describe aquí, al menos un polipéptido inmunogénico tal como se describe aquí y/o al menos una composición farmacéutica tal como se describe aquí.
Preferentemente, tal kit de partes comprende al menos dos anticuerpos diferentes, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, como se describen aquí donde los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a diferentes epítopos en la glicoproteína G de RABV. Tal kit de partes es particularmente útil para la combinación de dos anticuerpos como los aquí descritos. Los al menos dos anticuerpos pueden estar presentes en el kit de partes como entidades separadas o combinadas, por ejemplo como una mezcla, por ejemplo cuando ambos anticuerpos están contenidos en la misma composición farmacéutica. Preferiblemente, los al menos dos anticuerpos diferentes son entidades separadas del kit de partes, que el usuario puede mezclar si es necesario. También es preferente que se combinen los al menos dos anticuerpos diferentes, por ejemplo como una mezcla, por ejemplo cuando ambos anticuerpos están contenidos en la misma composición farmacéutica.
Preferentemente, en tal kit de partes, un anticuerpo de los al menos dos anticuerpos se une al sitio antigénico I en la glicoproteína G de RABV y otro anticuerpo de los al menos dos anticuerpos se une al sitio antigénico III en la glicoproteína G de RABV.
También es preferente en tal kit de partes que al menos uno de los al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenda una cadena pesada CDRH3 que comprenda una secuencia de aminoácidos al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a la SEQ ID NO: 95 o SEQ ID NO: 167. Más preferiblemente, en tal kit de partes, al menos uno de los al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprende (i) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH 1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93-97 y 99 o a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 93-96 y 98-99, respectivamente o (ii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRLI, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 165-169 y 171 o a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 165-168 y 170-171, respectivamente. Incluso con mayor preferencia, en tal kit de partes, uno de los al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 o de SEQ ID NO: 179.
Preferentemente, uno de los al menos dos anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno comprende una cadena pesada CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a la SEQ ID NO: 95 y otro de los al menos dos anticuerpos comprende una cadena pesada CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a la SEQ ID NO: 167. Más preferiblemente, en tal kit de partes, uno de los al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprende secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93-97 y 99 o a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93-96 y 98-99, respectivamente, y otro de los al menos dos anticuerpos comprenden secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH 1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 165-169 y 171 o a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 165-168 y 170-171, respectivamente. Incluso con mayor preferencia, en tal kit de partes, uno de los al menos dos anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno es de acuerdo con gRVC20 y otro de los al menos dos anticuerpos es de acuerdo con gRVC58.
Usos y tratamientos médicos
En un aspecto adicional, la presente descripción que comprende la invención proporciona el uso de un anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se describe aquí, del ácido nucleico tal como se describe aquí, del vector tal como se describe aquí, de la célula tal como se describe aquí, del polipéptido inmunogénico tal como se describe aquí o de la composición farmacéutica tal como se describe aquí en (i) la profilaxis, en particular la profilaxis post-exposición, el tratamiento o la atenuación de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV; en (ii) la vacunación contra de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV; o (iii) el diagnóstico de RABV y/u de otra infección por lisavirus.
Preferentemente, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos tal como se describen aquí o sus derivados y variantes pueden usarse para la profilaxis post-exposición y para el tratamiento o la atenuación de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV, es decir, en la infección por lisavirus RABV o no RABV o en la coinfección con lisavirus tanto RABV como no RABV; para la prevención de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV; o para el diagnóstico de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV. Preferiblemente, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe aquí se puede usar en la profilaxis, el tratamiento o la atenuación post-exposición de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV.
Una combinación de dos o más anticuerpos como se describen aquí, por ejemplo una combinación de 2, 3, 4, 5, 6, 7, etc. anticuerpos como se describen aquí, es particularmente preferente para el uso en (i) la profilaxis, en particular la profilaxis post-exposición, el tratamiento o la atenuación de una infección por lisavirus RABV y/o no RABV; y en (ii) la vacunación contra la infección por lisavirus RABV y/o no RABV. Tal combinación puede ser, por ejemplo, una terapia de combinación como se describe a continuación. Además, es preferente la administración de los dos o más anticuerpos en cantidades equimolares. En particular, es preferente una combinación de dos anticuerpos que comprenden las seis regiones CDR según RVC20 y RVC58, respectivamente, en especial una combinación de dos anticuerpos según gRVC20 y gRVC58 y en particular una combinación de los anticuerpos RVC20 y RVC58.
Además, en tal combinación de dos o más anticuerpos, es preferente que al menos dos, preferiblemente más de dos, en especial todos los anticuerpos combinados se unan a diferentes epítopos de la proteína G de RABV como se describió anteriormente. Por ejemplo, un primer anticuerpo de la combinación puede unirse específicamente al sitio antigénico I en la proteína G del RABV y un segundo anticuerpo puede unirse específicamente a un epítopo en la glicoproteína G del RABV que al menos se solapa parcialmente con el sitio antigénico III en la glicoproteína G de RABV. Los sitios antigénicos de anticuerpos ilustrativos se describen en el Ejemplo 3. Además, el experto en la técnica puede determinar fácilmente si dos o más anticuerpos se unen al mismo o a diferentes epítopos en la proteína G de RABV, por ejemplo empleando cualquier estudio de competencia, mostrándose un ejemplo de estudio de competencia en el Ejemplo 3. Un ejemplo particularmente preferido de una combinación de dos o más anticuerpos como se describe aquí es una combinación de anticuerpos de acuerdo con gRVC20 y gRVC58, preferentemente RVC20 y RVC58. Además, una combinación de dos o más anticuerpos como se describe aquí puede incluir, por ejemplo, cualquier combinación de dos o más anticuerpos de acuerdo con gRVA122, gRVA144, gRVB185, gRVB492, gRVC3, gRVC20, gRVC21, gRVC38, gRVC44, gRVC58, gRVC68 y gRVC111, preferentemente cualquier combinación de dos o más de RVA122, RVA144, RVB185, RVB492, RVC3, RVC20, RVC21, RVC38, RVC44, RVC58, RVC68 y RVC111.
Preferiblemente, los dos o más anticuerpos aquí descritos se administran en combinación en cantidades equimolares.
Una "combinación de (dos o más) anticuerpos" tal como se usa aquí se refiere a cualquier combinación, por ejemplo los dos o más anticuerpos pueden estar contenidos en una composición farmacéutica o, preferiblemente, los dos o más anticuerpos se administran como una terapia de combinación, en particular pueden administrarse por separado, por ejemplo en preparaciones de anticuerpos independientes, por ejemplo en composiciones farmacéuticas independientes. Esto significa que, en la combinación, preferiblemente al menos uno de los anticuerpos combinados, en especial 2, 3, 4, 5 o 6 de los anticuerpos combinados, en particular cada uno de los anticuerpos combinados se administran por separado. En la terapia de combinación, los anticuerpos aquí descritos se pueden administrar combinados/simultáneamente o consecutivamente, es decir, un anticuerpo tras otro.
En otra realización, la combinación puede comprender uno o más (por ejemplo 2, 3, etc.) anticuerpos como se describen aquí y uno o más (por ejemplo 2, 3, etc.) anticuerpos adicionales contra un lisavirus RABV y/o no RABV. Los anticuerpos aquí descritos pueden administrarse junto con anticuerpos específicos para otros patógenos.
El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, el ácido nucleico, el vector, la célula, el polipéptido inmunogénico o la composición farmacéutica tal como se describen aquí pueden proporcionarse para su uso como un medicamento para (i) la profilaxis, en particular la profilaxis post-exposición, el tratamiento o la atenuación de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV; (ii) la vacunación contra la infección por lisavirus RABV y/o no RABV; o (iii) el diagnóstico de RABV y/o de otra infección por lisavirus.
Dentro del alcance de la descripción hay varias formas y vías de administración del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno del mismo, del ácido nucleico, del vector, de la célula, del polipéptido inmunogénico o de la composición farmacéutica, como se describió anteriormente en relación a la composición farmacéutica. Esto se aplica también en el contexto del uso del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno del mismo, del ácido nucleico, del vector, de la célula, del polipéptido inmunogénico como se describe aquí, en particular en relación a las formas y vías de administración preferentes.
Los métodos de diagnóstico pueden incluir el contacto de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo con una muestra. Tales muestras pueden ser muestras de tejido tomadas, por ejemplo, de conductos nasales, cavidades sinusales, glándulas salivales, pulmón, hígado, páncreas, riñón, oído, ojo, placenta, tracto digestivo, corazón, ovarios, pituitaria, glándulas suprarrenales, tiroides, cerebro o piel. Los métodos de diagnóstico también pueden incluir la detección de un complejo antígeno/anticuerpo.
También se describe aquí (i) un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o variantes y derivados del mismo como se describen anteriormente, (ii) un clon de células B inmortalizadas como se describe aquí, (iii) un epítopo capaz de unir un anticuerpo como se describe aquí o (iv) un ligando, preferiblemente un anticuerpo, capaz de unir un epítopo que une un anticuerpo tal como se describe aquí para su uso en terapia.
Preferentemente, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe aquí, el ácido nucleico como se describe aquí, el vector como se describe aquí, la célula como se describe aquí, el polipéptido inmunogénico como se describe aquí o la composición farmacéutica como se describe aquí se utilizan en la profilaxis, el tratamiento o la atenuación post-exposición de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV, administrándose el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, el ácido nucleico, el vector, la célula o la composición farmacéutica hasta siete días, preferiblemente hasta cinco días, después de la infección.
El término "profilaxis post-exposición" tal como se usa aquí se refiere a un protocolo de tratamiento que comienza después de la exposición al virus y antes de que se detecten los primeros síntomas de la rabia. Sin embargo, dado que actualmente no existe un tratamiento real para la rabia, es decir, después del inicio de los síntomas, la profilaxis post-exposición también se puede aplicar después de que los primeros síntomas de la rabia sean detectables; sin embargo, se sabe que la profilaxis post-exposición convencional apenas es efectiva en un momento tan tardío.
En general, la profilaxis post-exposición se inicia lo antes posible después de la exposición o sospecha de exposición al virus, preferiblemente dentro de unas pocas horas hasta 24 horas o hasta 48 horas después de la exposición. En esta ventana de tiempo limitada, se sabe que la profilaxis post-exposición es más eficaz.
Sin embargo, los anticuerpos aquí descritos también son eficaces cuando se administran en un momento posterior, presumiblemente incluso después del inicio de los primeros síntomas. Por tanto, los anticuerpos aquí descritos invención aumentan considerablemente la ventana de tiempo para iniciar la profilaxis, el tratamiento o la atenuación post-exposición de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV. Preferentemente, el anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, el ácido nucleico, el vector, la célula o la composición farmacéutica tal como se describen aquí se administran al menos hasta siete días, preferiblemente al menos hasta cinco días, después de la infección.
También es preferente que el anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, tal como se describe aquí, el ácido nucleico tal como se describe aquí, el vector tal como se describe aquí, la célula tal como se describe aquí, el polipéptido inmunogénico tal como se describe aquí o la composición farmacéutica tal como se describe aquí se utilice en la profilaxis, el tratamiento o la atenuación post-exposición de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV, administrándose el anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, el ácido nucleico, el vector, la célula o la composición farmacéutica en combinación con una vacuna, preferiblemente una vacuna antirrábica, un antivírico, preferiblemente ribavirina, interferón alfa y/o ketamina.
Como se describió anteriormente, las vacunas contra la rabia actualmente disponibles incluyen las vacunas de tejido nervioso, más ampliamente utilizadas pero con mayor riesgo potencia, o las vacunas de cultivo celular y huevos embrionados (CCEEV), más seguras pero más costosas. En Alemania por ejemplo, sólo hay dos vacunas antirrábicas en el mercado, Rabipur® y "Tol lwut-lmpfstoff (célula diploide humana [HDC]) inactivada". Estas vacunas contienen el virus de la rabia inactivado. Ambas vacunas se recomiendan para su pre- y post­ exposición. Otro ejemplo de vacuna contra la rabia es Imovax (Sanofi-Pasteur), que es una vacuna comercial de células diploides humanas inactivadas. En general, las vacunas antirrábicas se administran de acuerdo con la información del fabricante, por lo que un protocolo típico de profilaxis post-exposición incluye la administración de la vacuna los días 0, 3, 7, 1, 4 y 28 después de la infección.
Un antiviral se refiere a una clase de medicamento que se usa específicamente para tratar infecciones virales. Al igual que los antibióticos para bacterias, se utilizan antivirales específicos para virus específicos. A diferencia de la mayoría de los antibióticos, los medicamentos antivirales no destruyen su patógeno objetivo; en cambio, inhiben su desarrollo. El antivírico ribavirina es particularmente preferente.
En una realización preferente, el anticuerpo o el fragmento de unión de antígeno del mismo como se describe aquí, el ácido nucleico como se describe aquí, el vector como se describe aquí, la célula como se describe aquí, el polipéptido inmunogénico como se describe aquí o la composición farmacéutica como se describe aquí se utilizan en la profilaxis, el tratamiento o la atenuación post-exposición a la infección por lisavirus RABV y/o no RABV, administrándose el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, el ácido nucleico, el vector, la célula o la composición farmacéutica en un esquema estándar PEP, preferiblemente en combinación con una vacuna, preferiblemente en el primer tratamiento del esquema estándar PEP solamente.
Un "esquema estándar PEP" se refiere típicamente al esquema de profilaxis post-exposición recomendado por la OMS (véase http://www.who.int/rabies/human/WHO_strategy_prepost_exposición/en/index1.html#, recuperado el 12 de noviembre de 2014), donde los anticuerpos aquí descritos reemplazan a los RIG, es decir, H RIG o ERIG. Es decir, se inicia una vacunación post-exposición tan pronto como sea posible después de la exposición con una vacuna contra la rabia como se describe aquí que sigue el protocolo del fabricante, típicamente al menos dos inyecciones. Por ejemplo, un protocolo estándar incluye inyecciones de la vacuna en los días 0, 3, 7, 14 y 28 después de la exposición. Concomitantemente con la primera inyección, o tan pronto como sea posible después, se administra la única y simple dosis del anticuerpo.
Cuando se utiliza en la profilaxis post-exposición, en el tratamiento o en la atenuación de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV, preferiblemente el anticuerpo o el fragmento de unión del antígeno del mismo se administra preferiblemente a una dosis de 0,005 a 100 mg / kg, preferentemente a una dosis de 0,0075 a 50 mg/kg, más preferiblemente a una dosis de 0,01 a 10 mg/kg, incluso con mayor preferencia a una dosis de 0,01 a 1 mg/kg y con particular preferencia a una dosis de 0,01 a 0,1 mg/kg. Esta dosis es particularmente preferente en un esquema PEP estándar como se describe anteriormente.
También es preferente que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe aquí, el ácido nucleico como se describe aquí, el vector como se describe aquí, la célula como se describe aquí, el polipéptido inmunogénico como se describe aquí o la composición farmacéutica como se describe aquí invención para su uso en la profilaxis, el tratamiento o la atenuación post-exposición a la infección por lisavirus RABV y/o no RABV se administre 1 a 6 días, preferiblemente 2 a 5 días, después de la infección.
En otra realización preferente, que no se refiere al esquema PEP estándar, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe aquí, para su uso en la profilaxis, el tratamiento o la atenuación post-exposición a la infección por lisavirus RABV y/o no RABV se administra sin la administración concomitante y/o posterior de una vacuna.
Además de la administración en combinación con una vacuna, por ejemplo en un esquema PEP estándar, los anticuerpos aquí descritos también son eficaces cuando se administran sin una vacuna, por ejemplo como tratamiento de la rabia, por ejemplo cuando se administran más de uno o dos días después de la exposición.
Además, es preferente que en el anticuerpo o el fragmento de unión de antígeno del mismo como se describe aquí o en la composición farmacéutica como se describe aquí para su uso en la profilaxis, el tratamiento o la atenuación post-exposición a la infección por lisavirus RABV y/o no RABV, que el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo se administre a una dosis de 0,01 a 100 mg/kg, preferiblemente a una dosis de 0,1 a 75 mg/kg, más preferiblemente a una dosis de 1 a 60 mg/kg e incluso con mayor preferencia a una dosis de 10 a 50 mg/kg. Estas dosis "más altas" son particularmente preferentes si la exposición fue grave y/o si el tratamiento se inicia después de uno o dos días tras la exposición.
También se describe aquí un método para tratar a un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o variantes y derivados de los mismos tal como se describen aquí, o un ligando, preferiblemente un anticuerpo, capaz de unirse a un epítopo que se une a un anticuerpo tal como el aquí descrito. En una realización, el método resultado en una infección reducida por lisavirus por RABV y/o no RABV en el sujeto. En otra realización, el método previene, reduce el riesgo o retrasa la infección por lisavirus RABV y/o no RABV en el sujeto.
En particular, se describe un método para prevenir y/o tratar una infección por lisavirus RABV y/o no RABV en un sujeto, donde el método comprende administrar a un sujeto que lo necesite el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo como se describe aquí, el ácido nucleico como se describe aquí, el vector como se describe aquí, la célula como se describe aquí, el polipéptido inmunogénico como se describe aquí y/o la composición farmacéutica como se describe aquí. Tal método preferentemente comprende la profilaxis post­ exposición como se describe en este documento. También es preferentre que dicho método comprenda la vacunación contra la infección por lisavirus RABV y/o no RABV.
También se describe un método para diagnosticar una infección por lisavirus RABV y/o no RABV en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe aquí, el ácido nucleico como se describe aquí, el vector como se describe aquí, la célula como se describe aquí, el polipéptido inmunogénico como se describe aquí y/o la composición farmacéutica como se describe aquí.
Preferentemente, en los métodos descritos anteriormente, al menos dos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tal como se describen aquí se administran al sujeto, uniéndose los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos específicamente a diferentes epítopos de la glicoproteína G de RABV. Preferiblemente, un anticuerpo de los al menos dos anticuerpos se une al sitio antigénico I en la glicoproteína G de RABV y otro anticuerpo de los al menos dos anticuerpos se une al sitio antigénico III en la glicoproteína G de RABV. Preferiblemente, al menos uno de los al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprende una cadena pesada CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a la SEQ ID NO: 95 o SEQ ID NO: 167. Con mayor preferencia, al menos uno de los al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprende (i) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93-97 y 99 o a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93-96 y 98-99, respectivamente o (ii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 165-1 69 y 171 o a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 165-168 y 170-171, respectivamente. Incluso con mayor preferencia, uno de los al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprende una cadena pesada CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a la SEQ ID NO: 95 y otro de los al menos dos anticuerpos comprenden una cadena pesada CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idéntica a la SEQ ID NO: 167. Con particular preferencia, uno de los al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprende secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93-97 y 99 o a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93-96 y 98-99, respectivamente, y otro de los al menos dos anticuerpos comprende secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, idénticas a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 165-1 69 y 171 o a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 165-168 y 170-171, respectivamente.
También se describe aquí el uso de (i) un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o variantes y derivados de los mismos tal como se describen aquí, (ii) un clon de células B inmortalizadas como el aquí descrito, (iii) un epítopo capaz de unirse a un anticuerpo como se describe aquí, (iv) un ligando, preferiblemente un anticuerpo, que se une a un epítopo capaz de unirse a un anticuerpo como se describe aquí o (v) una composición farmacéutica como se describe aquí en (i) la fabricación de un medicamento para el tratamiento o atenuación de la infección lisavirus RABV y/o no RABV, (ii) una vacuna o (iii) el diagnóstico de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV.
También se describe una composición como la aquí descrita para su uso como medicamento para la prevención o el tratamiento de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV. También se proporciona el uso de un anticuerpo como se describe aquí y/o de una proteína que comprende un epítopo al que se une dicho anticuerpo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto y/o para el diagnóstico en un sujeto. También se proporciona un método para tratar a un sujeto que comprende la etapa de administrar al sujeto una composición como se describe aquí. En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un humano. Una forma de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico implica monitorizar los síntomas de la enfermedad después de la administración de la composición aquí descrita. El tratamiento puede ser un programa de dosis única o un programa multidosis.
En una realización, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, clon de células B inmortalizado, epítopo o composición como se describen aquí se administra a un sujeto que necesita tal tratamiento. Tal sujeto incluye uno que está particularmente en riesgo o es susceptible a una infección por lisavirus RABV y/o no RABV.
Los anticuerpos y fragmentos de los mismos tal como se describen aquí también pueden usarse en un kit para el diagnóstico de una infección por lisavirus RABV y/o no RABV. Además, los epítopos capaces de unirse a un anticuerpo como se describe aquí pueden usarse en un kit para monitorizar la eficacia de los procedimientos de vacunación, detectando la presencia de anticuerpos protectores anti-lisavirus RABV o no RABV. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o variantes y derivados de los mismos como se describen aquí también pueden usarse en un kit para controlar la fabricación de vacunas con la inmunogenicidad deseada.
Los anticuerpos y fragmentos de los mismos como se describen aquí también pueden emplearse para monitorear la calidad de las vacunas anti-lisavirus RABV o no RABV, comprobando que el antígeno de dicha vacuna contiene el epítopo específico en la conformación correcta.
También se describe un epítopo que se une específicamente a un anticuerpo como se describe aquí o a un fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso (i) en terapia, (ii) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o atenuación de la infección por lisavirus RABV y/o no RABV, (iii) como vacuna o (iv) en el cribado de ligandos capaces de neutralizar la infección por lisavirus RABV y/o no RABV.
También se describe un método para preparar un producto farmacéutico, el cual comprende la etapa de mezclar un anticuerpo monoclonal con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, siendo el anticuerpo monoclonal un anticuerpo monoclonal que se obtuvo a partir de una célula huésped transfectada como se describe aquí. Así, los procedimientos para obtener primero el anticuerpo monoclonal (por ejemplo expresarlo y/o purificarlo) y luego mezclarlo con el o los vehículos farmacéuticos se pueden realizar en momentos muy diferentes por diferentes personas en diferentes lugares (por ejemplo en diferentes países ).
Comenzando con una célula B transformada o una célula plasmática cultivada como se describe aquí, se pueden realizar varias etapas de cultivo, subcultivo, clonación, subclonación, secuenciación, preparación de ácido nucleico, etc. para perpetuar el anticuerpo expresado por el transformado de la célula B o de la célula plasmática cultivada, con optimización opcional en cada paso. En una realización, los métodos anteriores comprenden además técnicas de optimización (por ejemplo maduración u optimización por afinidad) aplicadas a los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo. La descripción abarca todas las células, ácidos nucleicos, vectores, secuencias, anticuerpos, etc. usados y preparados durante tales pasos.
En todos estos métodos, el ácido nucleico usado en el huésped de expresión puede manipularse para insertar, eliminar o alterar ciertas secuencias de ácido nucleico. Los cambios debidos a dicha manipulación incluyen cambios para introducir sitios de restricción, para modificar el uso de codones, para agregar u optimizar la transcripción y/o secuencias reguladoras de traducción, etc. También es posible cambiar el ácido nucleico para alterar los aminoácidos codificados. Por ejemplo, puede ser útil introducir una o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. Tales mutaciones puntuales pueden modificar funciones efectoras, la afinidad de unión a antígenos, modificaciones postraduccionales, inmunogenicidad, etc., pueden introducir aminoácidos para la unión de grupos covalentes (por ejemplo etiquetas) o pueden introducir etiquetas (por ejemplo con fines de purificación). Las mutaciones se pueden introducir en sitios específicos o se pueden introducir aleatoriamente, seguido de selección (por ejemplo evolución molecular). Por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las regiones CDR, regiones variables de cadena pesada o regiones variables de cadena ligera de los anticuerpos aquí descritos se pueden mutar aleatoria o direccionalmente para introducir diferentes propiedades en los aminoácidos codificados. Dichos cambios pueden ser resultado de un proceso iterativo en el que se mantienen los cambios iniciales y se introducen nuevos cambios en otras posiciones de nucleótidos. Además, los cambios logrados en pasos independientes pueden combinarse. Las diferentes propiedades introducidas en los aminoácidos codificados pueden incluir una mayor afinidad.
DESCRIPCION DE FIGURAS
Figura 1: muestra un resumen de las características de los aislados de lisavirus RABV y no RABV mencionados aquí. Esto incluye el nombre del aislado, la especie viral y el filogrupo (como se muestra en la Tabla 1 para los aislados de lisavirus no RABV), así como la especie huésped, el país y el año de origen, el linaje y el número de acceso al GenBank de la secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de la glicoproteína G de ese aislado, si está disponible.
Figura 2: muestra los resultados de la unión a la proteína G de RABV (A) y la neutralización (B) en un panel de 90 y 29 muestras de plasma de vacunados de RABV, respectivamente. Los símbolos negros indican HRIG (Berirab®), los símbolos grises indican los 4 donantes seleccionados para el interrogatorio de células de memoria.
Figura 3: muestra un resumen de todas las características genéticas y funcionales del panel de 21 anticuerpos neutralizantes de RABV humanos aislados. Se muestran el uso de VH, VL y VK, el porcentaje de identidad de nucleótidos con el gen de la línea germinal correspondiente, la potencia de neutralización en pseudovirus CVS-1 1 RABV (pp) expresada como concentración de IgG en ng/ml capaz de neutralizar el 90% de la infectividad viral (IC90) y la reactividad de los anticuerpos en western blot (WB) en condiciones no reductoras o reductoras.
Figura 4: muestra los resultados de una matriz de competencia cruzada de anticuerpos monoclonales realizada por ELISA en los 21 anticuerpos aislados y dos anticuerpos de referencia de especificidad de epítopo conocida (CR57 y CR4098). Se muestra el porcentaje de inhibición de la unión de los anticuerpos biotinilados mostrados en la fila superior por los anticuerpos citados en la columna de la izquierda.
Figura 5: muestra los resultados de la neutralización de 13 especies de lisavirus diferentes (22 cepas virales) analizadas como pseudovirus mediante una selección de 12 anticuerpos monoclonales humanos del panel aislado en comparación con los tres anticuerpos de referencia RAB1, CR57 y CR4098 y las inmunoglobulinas humanas policlonales (HRIG, Berirab®). Se muestra el valor IC90 en ng/ml, donde IC90>10.000 ng/ml se puntuó como negativo (los valores de neutralización de Berirab® se puntuaron como negativos si IC90> 50.000 ng/ml).
Figura 6: muestra los resultados de la neutralización de 8 especies de lisavirus diferentes (16 aislados virales) analizados como virus infecciosos mediante una selección de 12 anticuerpos monoclonales humanos del panel aislado en comparación con los tres anticuerpos de referencia RAB1, CR57 y CR4098 y las inmunoglobulinas humanas policlonales (HRIG, Berirab®). Se muestra el valor IC50 en ng/ml, donde IC50> 10.000 ng/ml se puntuó como negativo (los valores para la neutralización de Berirab® se puntuaron como negativos si IC50> 50.000 ng/ml).
Figura 7: muestra los resultados de la neutralización de 13 especies de lisavirus diferentes analizadas como pseudovirus (A, 22 aislados virales) o virus (B, 16 aislados virales) mediante una selección de 12 anticuerpos monoclonales del panel aislado en comparación con los dos anticuerpos de referencia CR57 y CR4098 y las inmunoglobulinas humanas policlonales (HRIG, Berirab®).
Figura 8: muestra un resumen del porcentaje de aislados de lisavirus no RABV (n = 32) (A) y aislados de lisavirus del filogrupo I no RABV (n = 22) (B) neutralizados con una IC50 (para virus) o IC90 (para pseudovirus) por debajo de 10.000 ng/ml por anticuerpos monoclonales RVC20, RVC58, rAB1, CR57, CR4098 o una combinación de RVC20 con RVC58 o CR57 con CR4098. En las Figuras 5 y 6 se muestra la lista de aislados (y su filogrupo) utilizados para este análisis. N, número de aislados utilizados en el cálculo de los aislados neutralizados. *, HRIG se puntuó como negativa cuando IC50 o IC90 era > 50.000 ng/ml; **, RAB1 se probó contra 26 aislados no RABV y 16 aislados del filogrupo I no RABV, respectivamente.
Figura 9: muestra los resultados de la neutralización de aislados de RABV probados como pseudovirus (círculos rellenos, n = 2) o virus (círculos vacíos, n = 24) por los anticuerpos RVC20 y RVC58 seleccionados de nuestro panel y los dos anticuerpos de referencia CR57 y CR4098.
Figura 10: demuestra que RVC20 y RVC58 neutralizan potencialmente los aislados de RABV de varias líneas.
(A) Neutralización de aislados de RABV probados como para virus pseudotipados (círculos llenos, n = 8; se muestran los valores IC90) o virus vivos (círculos vacíos, n = 27; se muestran los valores IC50) por el RVC20 seleccionado y anticuerpos RVC58 de nuestro panel, los anticuerpos de referencia CR57, CR4098 y RAB1 y HRIG. Se muestra la neutralización de la cepa Cv S-11 utilizando virus vivos (ensayo RFFIT, ver Figura 11). La línea de puntos indica un umbral de neutralización superior a 1.000 ng/ml. Se muestra el valor medio geométrico de cada conjunto de datos. Se muestra el valor P de una prueba de rango con signo de pares emparejados Wilcoxon (****P<0,0001; ***P<0,001). (B) Árbol filogenético de 2215 secuencias de proteínas G recuperadas de bases de datos públicas. Se destacan con puntos las secuencias de los aislados de RABV probados en este trabajo (dos secuencias de proteína G, es decir CV9.13 y Mauritania/perro/2019-2006/V6235-2007 no estaban disponibles y, por tanto, no se incluyeron en el árbol), incluyendo los que fueron probados por FACS para la unión (ver Figura 11).
Figura 11: muestra un resumen de los 43 aislados de RABV analizados. La actividad de neutralización (IC50 para virus e IC90 para pseudvovirus en ng/ml) de anticuerpos monoclonales RVC20, RVC58, CR57, CR4098 y rA b 1 y HRIG como se ilustra en la Figura 10. RFFIT, prueba rápida de inhibición del foco de fluorescencia; FAVN, prueba de neutralización de virus con anticuerpos fluorescentes; PV, ensayo de neutralización basado en pseudovirus. * virus probados por FACs para la unión a transfectantes de proteína G.
Figura 12: muestra las características de 26 aislados de RABV seleccionados probados como virus o pseudovirus, así como la actividad de neutralización en ng/ml de los anticuerpos monoclonales RVC20, RVC58, CR57, CR4098 y HRIG como se ilustra en las Figuras 9 y 10. RFFIT, prueba rápida de inhibición del foco de fluorescencia; FAVN, prueba de neutralización de virus con anticuerpos fluorescentes; PV, ensayo de neutralización basado en pseudovirus. Se muestra la IC50 para los resultados de FAVN y Rf FIT e IC90 para los resultados de PV.
Figura 13: muestra las características de 28 aislados seleccionados de lisavirus no RABV ensayados como virus o pseudovirus, así como la actividad de neutralización en ng/ml de los anticuerpos monoclonales RVC20, RVC58, CR57, CR4098 y HRIG como se ilustra en las Figuras 5, 6 y 7. RFFIT, prueba rápida de inhibición del foco de fluorescencia; FAVN, prueba de neutralización de virus con anticuerpos fluorescentes; PV, ensayo de neutralización basado en pseudovirus. Se muestra la IC50 para los resultados de FAVN y RFFIT y la IC90 para los resultados de PV.
Figura 14: muestra los resultados de la neutralización de CVS-11 y diferentes mutantes de CVS-11 por el panel de 12 anticuerpos monoclonales seleccionados aquí descritos y los anticuerpos de referencia RAB1, CR57 y CR4098. Las células negras indican neutralización completa, las células grises neutralización parcial y las células blancas no neutralización. Nd, no ensayado.
Figura 15: muestra que RVC20 y RVC58 se dirigen a epítopos altamente conservados en los sitios antigénicos I y III. Nivel de conservación de residuos de aminoácidos en los sitios antigénicos I y III calculado mediante análisis de las secuencias de la proteína G de 2566 RABV. Los gráficos circulares muestran la distribución detallada del uso de aminoácidos en cada posición. Los residuos subrayados indican que los virus que llevan el residuo correspondiente en esa posición son neutralizados por RVC20 o RVC58. (A) Frecuencia de residuos de aminoácidos en el sitio antigénico I; (B) Frecuencia de residuos de aminoácidos en el sitio antigénico III.
Figura 16: muestra una alineación de secuencias de sitios antigénicos de la proteína G de todos los lisavirus probados y secuenciados. Se muestran los lisavirus del filogrupo I no-RABV y del filogrupo ll-IV no-RABV, respectivamente. Nd, no ensayado. (A) Sitio antigénico I con flechas en la primera columna que indican una falta de neutralización por CR57 y flechas en la segunda columna (la columna más a la derecha del panel A) que indican una falta de neutralización por RVC20. (B) Sitio antigénico III con flechas en la primera columna que indican una falta de neutralización por CR4098, flechas en la segunda columna que indican una falta de neutralización por RAB1 y flechas en la tercera columna (la columna más a la derecha del panel B) que indican una falta de neutralización por RVC58. Las flechas en puntos indican una neutralización débil o parcial.
Figura 17: muestra el porcentaje de supervivencia en hámsteres sirios infectados con el aislado de RABV CVS-11 y luego no tratados o tratados con PEP estándar (HRIG y vacunación) o con dos dosis diferentes de un cóctel de anticuerpos monoclonales RVC20+RVC58 (y vacunación). El virus RABV se administró vía intramuscular (50 |jl de 1057TCID50/ml) en el músculo gastrocnemio de la pata izquierda. La vacuna utilizada es una vacuna de células diploides humanas inactivadas comercial (Imovax; Sanofi-Pasteur) y se administró vía intramuscular (0,05 ml) en el músculo gastrocnemio de la pata trasera derecha.
Figura 18: muestra el nivel de anticuerpos IgG de hámster unidos a la proteína G medido por ELISA (A), el nivel de anticuerpos neutralizantes en suero de hámster (B) y los niveles de anticuerpos IgG humanos residuales (C) medidos en sueros recolectados 42 días después de la inmunización con la vacuna RABV en hámsteres sirios no retados.
Figura 19: muestra el porcentaje de supervivencia de hámsteres sirios infectados con un virus de campo RABV aislado de las glándulas salivales de un zorro infectado (Italia/zorro rojo/673/2011) y luego sin tratar, tratado el día 1 con el estándar PEP (es decir, HRIG y vacunación) o tratados el día 1, 5 o 9 después de la infección con una dosis única de RVC58+RVC20 a 40 mg/kg.
Figura 20: muestra las cantidades de ARNm de NP de RABV medidas por RT-PCR post-mortem en muestras del SNC (A) y los niveles de anticuerpos IgG de hámster que se unen a la proteína G medidos por ELISA (B) del experimento mostrado en la Figura 18. Los asteriscos indican los animales que sucumben a la infección, los diamantes animales que muestran una parálisis permanente de la pata trasera que fue el sitio del desafío viral y los círculos abiertos los animales asintomáticos.
Figura 21: muestra el análisis histológico del cerebro, el bulbo raquídeo y tejidos de la médula espinal de dos animales representativos tratados con RVC58 y RVC20 el día 5 después de la infección (A) o que se dejaron tratados (B). En particular, el análisis de inmunohistoquímica tuvo como objetivo revelar la presencia del antígeno N de RABV para identificar los cuerpos de inclusión patognomónicos (cuerpos de Negri).
Figura 22: muestra las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo RVA122, así como las secuencias de ácido nucleico que los codifican. Las secuencias resaltadas en negrita son regiones CDR (nucleótidos o aa) y los residuos subrayados son residuos mutados en comparación con la secuencia de la "línea germinal".
Figura 23: muestra las secuencias de aminoácidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo RVA144, así como las secuencias de ácidos nucleicos que los codifican. Las secuencias resaltadas en negrita son regiones CDR (nucleótidos o aa) y los residuos subrayados son residuos mutados en comparación con la secuencia de la "línea germinal".
Figura 24: muestra las secuencias de aminoácidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo RVB185, así como las secuencias de ácidos nucleicos que los codifican. Las secuencias resaltadas en negrita son regiones CDR (nucleótidos o aa) y los residuos subrayados son residuos mutados en comparación con la secuencia de la "línea germinal".
Figura 25: muestra las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo RVB492, así como las secuencias de ácido nucleico que las codifican. Las secuencias resaltadas en negrita son regiones CDR (nucleótidos o aa) y los residuos subrayados son residuos mutados en comparación con la secuencia de la "línea germinal".
Figura 26: muestra las secuencias de aminoácidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo RVC3, así como las secuencias de ácidos nucleicos que los codifican. Las secuencias resaltadas en negrita son regiones CDR (nucleótidos o aa) y los residuos subrayados son residuos mutados en comparación con la secuencia de la "línea germinal".
Figura 27: muestra las secuencias de aminoácidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo RVC20, así como las secuencias de ácidos nucleicos que los codifican. Las secuencias resaltadas en negrita son regiones CDR (nucleótidos o aa) y los residuos subrayados son residuos mutados en comparación con la secuencia de la "línea germinal".
Figura 28: muestra las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo RVC21, así como las secuencias de ácidos nucleicos que los codifican. Las secuencias resaltadas en negrita son regiones CDR (nucleótidos o aa) y los residuos subrayados son residuos mutados en comparación con la secuencia de la "línea germinal".
Figura 29: muestra las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo RVC38, así como las secuencias de ácidos nucleicos que los codifican. Las secuencias resaltadas en negrita son regiones CDR (nucleótidos o aa) y los residuos subrayados son residuos mutados en comparación con la secuencia de la "línea germinal".
Figura 30: muestra las secuencias de aminoácidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo RVC44, así como las secuencias de ácidos nucleicos que los codifican. Las secuencias resaltadas en negrita son regiones CDR (nucleótidos o aa) y los residuos subrayados son residuos mutados en comparación con la secuencia de la "línea germinal".
Figura 31: muestra las secuencias de aminoácidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo RVC58, así como las secuencias de ácido nucleico que las codifican. Las secuencias resaltadas en negrita son regiones CDR (nucleótidos o aa) y los residuos subrayados son residuos mutados en comparación con la secuencia de la "línea germinal".
Figura 32: muestra las secuencias de aminoácidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo RVC68, así como las secuencias de ácido nucleico que las codifican. Las secuencias resaltadas en negrita son regiones CDR (nucleótidos o aa) y los residuos subrayados son residuos mutados en comparación con la secuencia de la "línea germinal".
Figura 33: muestra las secuencias de aminoácidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo RVC111, así como las secuencias de ácido nucleico que las codifican. Las secuencias resaltadas en negrita son regiones CDR (nucleótidos o aa) y los residuos subrayados son residuos mutados en comparación con la secuencia de la "línea germinal".
Ejemplos
Ejemplo 1: Selección de vacunados contra la rabia para el aislamiento de anticuerpos ampliamente neutralizantes
Con el fin de aislar anticuerpos ampliamente neutralizantes capaces de neutralizar aislados de RABV, pero también lisavirus no RABV, se examinaron 90 muestras de plasma de vacunados para detectar la presencia de títulos altos de anticuerpos que se unen a la proteína G de RABV (cepa CVS-1 1) mediante ELISA (Figura 2A) y se seleccionaron 29 muestras con los títulos de unión más altos (EC50>50) para análisis adicionales. En particular, las 29 muestras de plasma seleccionadas se analizaron para determinar su capacidad para neutralizar un panel de 12 lisavirus pseudotipados que incluyen virus del filogrupo I RABV, DUVV, k Hu V, EBLV1, ARAV, EBLV2, IRKV, ABLV, virus del filogrupo II LABV, SHIBV, MOKV y del filogrupo III WCBV (Figura 2B). Se incluyó como referencia la inmunoglobulina antirrábica humana (HRIG) Berirab® (Zydus Cadila). Como era de esperar, todas las muestras neutralizaron, aunque con títulos variables, el aislado homólogo RABV CVS-11. El perfil de neutralización de las otras especies de lisavirus varió considerablemente en todos los donantes analizados, donde en unos pocos casos se neutralizaron todas las especies. Es de destacar que HRIG (Berirab®) mostró solo una actividad modesta contra las especies del filogrupo I no RABV y no mostró reactividad cruzada con los virus del filogrupo II y III. Este análisis permitió seleccionar cuatro vacunados como donantes de sangre para el posterior aislamiento y caracterización de potentes anticuerpos ampliamente neutralizantes.
Ejemplo 2: Aislamiento y caracterización de anticuerpos antirrábicos ampliamente neutralizantes
Se aislaron células B de memoria IgG+ a partir de PBMC criopreservadas de las cuatro vacunas seleccionadas utilizando microperlas CD22 (Miltenyi Biotec), seguido de agotamiento de las células portadoras de IgM, IgD e IgA mediante clasificación celular. Las células B de memoria de los cuatro vacunados seleccionados se inmortalizaron luego con EBV (virus de Epstein Barr) y CpG (oligodesoxinucleótido CpG 2006) en múltiples pocillos replicados como se describió anteriormente (Traggiai, E. et al., Nat. Med. 10, 871 - 875, 2004) y los sobrenadantes del cultivo se analizaron luego en una selección primaria usando un ensayo de neutralización pseudotipado CSV-11 RABV basado en 384 pocillos (aislado de referencia CVS-11, cepa de vacuna) Se utilizaron células 293T de riñón embrionario humano para la producción de los pseudotipos lentivirales (sustitutos de lisavirus). Los ensayos de neutralización se llevaron a cabo en 21 células fetales de riñón de hámster 13 (BHK). En una placa de 384 pocillos, se incubó el pseudovirus CVS-11, que resultó en una producción de 50-100 x 104 unidades de luz relativa (RLU) con diluciones duplicadas en sueros durante 1 h a 37% (5% de CO2 ) antes de la adición de 3.000 células BHK-21. Se incubaron durante 48 h más, después de lo cual se eliminó el sobrenadante y se añadieron 15 |jl de reactivo Steadylite (Perkin Elmer). La actividad de luciferasa se detectó 5 minutos más tarde leyendo las placas en un luminómetro de microplacas Synergy (BioTek) (Wright, E. et al., J Gen. Virol 89, 2204-2213, 2008). Se recogieron y expandieron los cultivos positivos. De los cultivos positivos, las secuencias VH y VL se recuperaron por RT-PCR. Los anticuerpos RVC20 y RVC58 se clonaron en vectores de expresión IgG1 e Ig kappa o Ig lambda humanos (amablemente proporcionados por Michel Nussenzweig, Rockefeller University, Nueva York, EE. UU.) esencialmente como se describe (Tiller T, Meffre E, Yurasov S, Tsuiji M, Nussenzweig MC, Wardemann H (2008), Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods 329: 112-124). Los anticuerpos monoclonales se produjeron a partir de células B inmortalizadas con EBV o mediante transfección transitoria de células 293 Freestyle (Invitrogen). Se recogieron los sobrenadantes de las células B o las células transfectadas y se purificó por afinidad la IgG mediante cromatografía de proteína A o proteína G (GE Healthcare) y se desalaron frente a PBS.
Se aislaron quinientos anticuerpos monoclonales humanos por su capacidad para neutralizar RABV. Se seleccionaron veintiún anticuerpos monoclonales humanos por su alta potencia neutralizante contra CVS-11 RABV, con una IC90 (concentración de anticuerpo que neutraliza el 90% de la infectividad viral) en un rango de 0,01 a 317 ng/ml (Figura 3), producido por EBV-células B inmortalizadas y purificadas por afinidad mediante cromatografía de proteína A o proteína G (en el caso de IgG3). Como referencia, también se probaron HRIG y otros dos anticuerpos monoclonales humanos (CR57 y CR4098) que se desarrollaron hasta la Fase III para reemplazar los RIG (pero recientemente fallaron debido a la falta de actividad neutralizante contra algunos aislados de RABV de campo circulante). Además, se demostró que todos los anticuerpos se unían a la proteína G de RABV por ELISA (CVS-11). Para ello, se utilizó un ELISA estándar. Brevemente, las placas ELISA se recubrieron con proteína G de RABV a 5 jg/ml, se bloquearon con FCS al 10% en PBS, se incubaron con suero o anticuerpos humanos y se lavaron. Los anticuerpos unidos se detectaron por incubación con IgG antihumana de cabra conjugada con AP (Southern Biotech). A continuación, se lavaron las placas, se añadió sustrato (p-NPP, Sigma) y se leyeron las placas a 405 nm. Las afinidades relativas de unión a suero o unión de anticuerpo monoclonal se determinaron midiendo la dilución en sueros (DE50) o la concentración de anticuerpo (CE50) requerida para lograr un 50% de la unión máxima en saturación.
Para comprender si el epítopo afín es conformacional o no, la proteína G de RABV se procesó en un gel SDS-PAGE en condiciones reductoras (RED) o no reductoras (NR) y se sondaron mediante transferencia Western con todos los anticuerpos monoclonales humanos aislados. Con unas pocas excepciones (RVB143, RVC44 y RVC68), todos los anticuerpos no se unieron a la proteína G de RABV en condiciones reductoras, lo que sugiere que el epítopo reconocido es conformacional (Figura 3).
Ejemplo 3: Estudios de competencia de anticuerpos: determinación de sitios antigénicos en la proteína G de RABV
A continuación, se realizaron estudios de competencia para determinar la proximidad espacial de cada uno de los epítopos conformacionales reconocidos por todos los anticuerpos del panel. Se demostró previamente que los dos anticuerpos de referencia CR57 y CR4098 reconocen los sitios antigénicos I y III de la proteína G (Bakker, ABH et al., J Virol 79, 9062-9068, 2005; de Kruif, J. et al., Annu Rev Med 58, 359-368, 2007), respectivamente y, por tanto, se usaron en este ensayo como sondas para mapear la especificidad de cada anticuerpo de nuestro panel. En particular, CR57, CR4098 y los 21 anticuerpos seleccionados se purificaron y marcaron con biotina y luego se analizaron por ELISA en un ensayo de competición de matriz completa en el que los anticuerpos no marcados se incubaron primero a una concentración de 10 pg/ml en placas recubiertas con proteína G RABV, seguido de la adición de anticuerpos biotinilados a una concentración de 100 ng/ml (es decir, 100 veces menos que el anticuerpo no marcado), cuya unión se reveló con estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina. Los resultados se muestran en la Figura 4 e indican el porcentaje de bloqueo de la unión de los anticuerpos marcados en todas las combinaciones posibles (es decir, 21 x 21) y se utilizaron para agrupar los anticuerpos en 6 grupos. Al interpretar los resultados de la competencia debe tenerse en cuenta que si dos epítopos se superponen o las áreas cubiertas por los brazos de los dos anticuerpos se superponen, la competencia debe ser casi completa. Los efectos inhibidores o potenciadores débiles pueden reflejar una disminución de la afinidad debido a efectos estéricos o alostéricos.
RVA125, RVC3, RVC20 y RVD74 se asignaron al grupo del sitio antigénico I de acuerdo con la competencia con CR57 y sus competencias recíprocas. Es de destacar que la unión de los anticuerpos antigénicos del sitio I a la proteína G se potencia mediante un subgrupo de anticuerpos antigénicos del sitio 1. RVA122, RVA144, RVB492, RVC4, RVC69, RVC38 y RVC58 se asignaron al sitio antigénico III de acuerdo con la competencia con CR4098 y sus competencias recíprocas. RVC58 mostró solo una competencia parcial con CR4098 (esto es del 64%), así como competencia con anticuerpos no antigénicos del sitio I y III, lo que sugiere que el epítopo RVC58 podría solapar solo parcialmente con el sitio antigénico III. Un tercer grupo compuesto por los anticuerpos RVB181, RVC56, RVB185, RVC21, RVB161 y RVC111 se denominó III.2, ya que la unión de todos estos anticuerpos biotinilados fue bloqueada por todos los anticuerpos antigénicos del sitio III, pero recíprocamente todos estos anticuerpos no fueron capaces de bloquear la unión de varios anticuerpos antigénicos del sitio III como CR4098, RVC4 y RVC69. Al interpretar los resultados de la competencia debe tenerse en cuenta que cuando dos epítopos se superponen, o cuando las áreas cubiertas por los brazos de los dos anticuerpos se superponen, la competencia debe ser casi completa. Los efectos inhibidores o potenciadores débiles pueden simplemente reflejar una disminución en la afinidad debido a los efectos estéricos o alostéricos. Por esta razón, aquí hemos definido un nuevo sitio llamado III.2, que probablemente sea próximo al sitio antigénico III en la proteína G. Siguiendo el mismo criterio, se definieron tres sitios adicionales denominados A, B y C. El sitio A está definido por el anticuerpo único RVB686, cuya unión compromete la unión de la mayoría de los anticuerpos marcados del panel, pero recíprocamente la unión de los marcados RBV686 no está bloqueado por ningún anticuerpo del panel. Estos resultados podrían sugerir que la unión de RVB686 induce un efecto alostérico sobre la proteína G que compromete la unión de la mayoría de los otros anticuerpos. El sitio B está definido por el anticuerpo RVC44, cuya unión no está bloqueada por ningún otro anticuerpo del panel. De manera similar, el sitio C está definido por los anticuerpos RVB143 y RVC68, que también reconocen un epítopo único y distinto en comparación con todos los demás anticuerpos. Es de destacar que RVC44, RVB143 y RVC68 son los únicos anticuerpos de este panel capaces de unirse mediante transferencia Western a la proteína G en condiciones reductoras, lo que sugiere que reconocen un epítopo lineal en la proteína G de RABv .
Ejemplo 4: Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención neutralizan potentemente lisavirus RABV y no RABV
Doce de los 22 anticuerpos fueron seleccionados por su potencia y por el reconocimiento de distintos sitios en la proteína G de RABV para ser probados, junto con los anticuerpos de referencia CR57, CR4098, RAB1 y Berirab® (HRIG), contra un gran panel de lisavirus usando virus pseudotipados (22 aislados, como se muestra en la Fig.5) e infecciosos (16 aislados, como se muestra en la Fig.6) que cubren las especies RABV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV, LBV, MOK, SHIBV, BBLV, WCBV e IKOV (Figuras 5, 6 y 7).
Producción de virus pseudotipados y ensayo de neutralización. Se usaron células de riñón embrionario humano 293T clon 17 (He K 293T/17; At Cc c Rl-11268) para la producción de los pseudotipos lentivirales. Se realizaron ensayos de neutralización en células BHK-21 clon 13 (ATCC CCL-10). En una placa de 384 pocillos, el virus pseudotipado que dio como resultado una producción de 50-100 x 104 unidades de luz relativa (RLU) se incubó con diluciones duplicadas en sueros o anticuerpos durante 1 h a 37% (5% de CO2 ) antes de la adición de 3.000 células BHK-21. Se incubaron durante 48 horas más, después de lo cual se eliminó el sobrenadante y se añadieron 15 pl de reactivo Steadylite (Perkin Elmer). La actividad de la luciferasa se detectó 5 minutos después mediante la lectura de las placas en un luminómetro de microplacas Synergy (BioTek) (Wright et al.
2008) . La reducción de la infectividad se determinó comparando las RLU en presencia y ausencia de anticuerpos y se expresó como porcentaje de neutralización. La potencia de neutralización para los anticuerpos monoclonales se mide aquí como IC90, que se definió como la concentración de anticuerpo a la que las RLU se redujeron en un 90% en comparación con los pocillos de control del virus después de restar las RLU de fondo en los pocillos de control celular (ID50 para los sueros, es decir, la dilución de sueros a los que las RLU se redujeron en un 50%). Los valores ID50 para los sueros corresponden a la dilución a la que las RLU se redujeron en un 50%.
Ensayos de neutralización in vitro y adaptación de células de lisavirus. Se aislaron lisavirus seleccionados de RABV y no RABV en Neuro-2A (ATCC cat n. CCL-131), más reservas de trabajo y adaptadas a células producidas y valoradas en células BSR (un clon de BHK-21). Se adaptaron y aplicaron dos protocolos ligeramente modificados de la prueba de neutralización de virus de anticuerpos fluorescentes (mFAVN) y de la prueba de inhibición rápida de focos fluorescentes (mRFFIT) (FAVN: Cliquet, F., et al., J. Immunol Methods 212, 79-87, 1998; RFFIT: Smith , JS y col., Bull. World Health Organ. 48, 535-541, 1973, Warrell MJ, Riddell A, Yu LM, Phipps J, Diggle L, Bourhy H, Deeks JJ, Fooks AR, Audry L, Brookes SM, et al (2008), A simplified 4-site economical intradermal post-exposure rabies vaccine regimen: a randomised controlled comparison with standard methods. PLoS Negl Trop Dis 2: e224), respectivamente, para probar la potencia de los anticuerpos en estudio. El stock de trabajo CVS-11 se amplificó y tituló en BSR o BHK-21, de acuerdo con la prueba de neutralización adoptada, RFFIT o FAVN, respectivamente. Además, se llevaron a cabo ensayos estándar FAVN y RFFIT para evaluar la potencia de los anticuerpos probados contra CVS-11. Brevemente, los ensayos de mFAVN se basaron en FAVN estándar pero se realizaron en células BSR.
El punto de corte para la neutralización fue IC90 (virus pseudotipados) o IC50 (virus infecciosos) por encima de 10.000 ng/ml. En otras palabras, si se alcanzaba una IC90 (virus pseudotipados) o una IC50 (virus infecciosos) superior a 10.000 ng/ml con un anticuerpo, el anticuerpo respectivo se consideraba "no neutralizante". Entre los anticuerpos antigénicos del sitio I ensayados en el ensayo de neutralización pseudotipado (Wright, E. et al., J Gen. Virol 89, 2204-221 3, 2008; Wright, E. y col., Vaccine 27, 71 78-71 86; 2009) , RVC20 mostró la mejor amplitud de reactividad al ser capaz de neutralizar los virus del filogrupo I RABV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, IRKV, KHUV, ARAV. así como SHIBV del filogrupo II e IKOV del supuesto filogrupo IV ( Fig. 5). En la Figura 1 se puede obtener una descripción completa de los aislados de pseudovirus utilizados. Como comparación, el anticuerpo CR57 del sitio antigénico I fue claramente inferior a RVC20, ya que no pudo neutralizar los aislados de EBLV-1, SHIBV e IKOV (ver Figura 5).
Cuando se probó en virus infecciosos usando FAVN (Cliquet, F., et al., J. Immunol Methods 212, 79-87, 1998) o RFFIT (Smith, J. S., et al., Bull. World Health Organ, 48, 535-541, 1973), RVC20 también fue superior en su amplitud, pudiendo neutralizar RABV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, BBLV, así como el filogrupo II MOKV (ver Fig. 6; la única especie que no fue neutralizada es LBV). En la Figura 1 se puede obtener una descripción completa de los aislados de virus infecciosos utilizados. En el mismo análisis, CR57 no neutralizó los aislados de EBLV-1 (como se observó con los pseudovirus), los aislados de LBV y los aislados de MOKV (ver Figura 6).
Entre los anticuerpos antigénicos del sitio III probados en el ensayo de neutralización pseudotipado, RVC58 neutralizó de forma potente, con una IC90 <10 ng/ml, todos los virus del filogrupo I (esto es RABV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, a BlV, IRKV, KHUV, ARAV, ver Figura 5). Como comparación, el sitio antigénico III del anticuerpo CR4098 fue muy inferior al RVC58, ya que no pudo neutralizar los aislados DUVV, EBLV-1, EBLV-2, IRKV y KHUV y ARAV pobremente neutralizado (ver Figura 5).
Cuando se probó en virus infecciosos, de todos los anticuerpos antigénicos del sitio III probados, RVC58 también fue superior en su amplitud, ya que fue capaz de neutralizar potentemente RABV, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, BBLV (ver Fig. 6; las únicas especies que no fueron neutralizadas son MOKV y LBV). En el mismo análisis, CR4098 no neutralizó EBLV-1, DUVV, BBLV, uno de los cuatro aislados de RABV analizados, uno de los tres aislados de EBLV-2 analizados y uno de los dos aislados de ABLV analizados (ver Fig. 6).
Es de destacar que el anticuerpo antigénico del sitio CRVC68 neutralizó todos los pseudovirus del filogrupo I y II probados (solo WCBV no fue neutralizado), aunque con valores IC9010-100 veces más altos en comparación con RVC20 y RVC58 (Figura 5 y 7). Sin embargo, cuando se probó en virus infecciosos, el anticuerpo RVC68 no pudo neutralizar EBLV, ABLV, MOKV ni tampoco uno de los cuatro aislados de RABV probados (Figuras 6 y 7).
Si el análisis de la amplitud de anticuerpos se limita a lisavirus no RABV (puntuando como positivos todos los virus neutralizados con una IC50 < 10.000 ng/ml), RVC58 (sitio antigénico III) es capaz de neutralizar el 69% de todos los lisavirus no RABV analizados y, notablemente, todos los lisavirus del filogrupo I analizados. En comparación, el anticuerpo CR4098 y RAB1 neutralizaron solo el 19% y el 27%, respectivamente, de los lisavirus no RABV y el 23% y el 25%, respectivamente, del filogrupo I de lisavirus no Ra Bv . Paralelamente, el RVC20 (sitio antigénico I) es capaz de neutralizar el 72% y el 91% de los lisavirus no RABV y de los lisavirus del filogrupo I no RABV, respectivamente. En comparación, el anticuerpo CR57 neutralizó el 47% y el 68% de los lisavirus no RABV y de los lisavirus no RABV del filogrupo I, respectivamente.
Cuando se combinaron, RVC58 y RVC20 cubrieron el 78% y el 100% de los lisavirus no RABV y de los lisavirus del filogrupo I no RABV, respectivamente, mientras que c R57 y CR4098 cubrieron solo el 50% y 68% de los lisavirus no RABV y de los lisavirus del filogrupo I de RABV, respectivamente (Figura 8A-B). Las HRIG también se probaron contra el panel de pseudovirus y virus e incluso si se trataba de una mezcla de anticuerpos policlonales anti-proteína G cubría solo el 25% de los lisavirus no RABV y el 36% de los lisavirus del filogrupo I no RABV (ver Figura 8).
Para investigar con más detalle la capacidad de los anticuerpos descritos para neutralizar diferentes aislados de RABV, se amplió luego el análisis de la actividad neutralizante de los anticuerpos RVC20 y RVC58 y de los anticuerpos de referencia CR57 y CR4098 a un panel muy grande de aislados de RABV (n = 26, 24 virus y 2 pseudovirus), que son representativos de todos los linajes circulantes (esto es, americano, asiático, cosmopolita, África 2, África 3 y linajes árticos/tipo ártico) (Figura 9). Los 26 aislados de RABV fueron neutralizados eficazmente por los anticuerpos RVC20 y RVC58 con medias geométricas IC50 e IC90 de 26 y 12 ng/ml, respectivamente. Como comparación, CR57 y CR4098 también neutralizaron todos los RABV probados, pero con valores de IC50 e IC90 superiores a 61 y 100 ng/ml, respectivamente. Es de destacar que CR4098 neutralizó dos cepas de RABV con una IC50 > 10.000 ng/ml, una concentración que probablemente no sea eficaz in vivo.
En un paso adicional, el análisis de la actividad neutralizante de RABV de los anticuerpos se amplió aún más, incluido el anticuerpo de referencia adicional RAB1 y un panel aún mayor de aislados de RABV (n = 35, 27 virus y 8 pseudovirus; se probó CVS-11 como virus infeccioso y como pseudovirus, incluyendo la fig. 10 CVS-I I como virus infeccioso y mostrando la Fig. 11 los resultados de los tres ensayos de neutralización realizados con CVS-11, a saber, pseudovirus (PV), FAVN y RFFIT), que son representativos de todos los linajes circulantes (esto es, americano, asiático, cosmopolita, África 2, África 3 y linajes Ártico/tipo Ártico) (Figura 10B). La descripción completa de los aislados se puede obtener de la Figura 1. Como se muestra en la Figura 10A, los 35 aislados de RABV fueron efectivamente neutralizados por anticuerpos RVC20 y RVC58 con valores IC50 (para virus infecciosos) o valores IC90 (para pseudovirus) que van desde 0,1 a 140 ng/ml. Como comparación, los anticuerpos de referencia CR57, CR4098 y RAB1 neutralizaron todos los RABV probados, pero con una potencia significativamente menor que RVC20 y RVC58 y con un rango más amplio de valores IC50 o IC90 (por ejemplo 0,6 - 969 ng/ml, 0,7 - 23.600 ng/ml, 1 - 4153 ng/ml, respectivamente, ver Figura 10A). De manera similar a RVC20 y RVC58, HRIG neutralizó la gran mayoría de las cepas de RABV probadas con un rango estrecho de valores de IC50. Es importante destacar que CR4098 y RAB1 neutralizaron seis y tres aislados de RABV, respectivamente, con una IC50 > 1.000 ng/ml (ver fig. 10A), una concentración que probablemente no sea eficaz en la profilaxis post-exposición.
Este análisis se amplió a 8 aislados adicionales de RABV para los que se evaluó la capacidad de los anticuerpos para unirse a células transfectantes de proteína G mediante citometría de flujo (Figura 11). Los genes G de longitud completa de las cepas de RABV se optimizaron por codones para la expresión de células eucariotas y clonado en el vector phCMV1 (Genlantis). Se utilizaron plásmidos que expresaban proteína G para transfectar células 293F-Expi. Tres días después de la transfección, las células se recolectaron, fijaron y permeabilizaron con saponina para inmunoteñir todos los anticuerpos de prueba. La unión de los anticuerpos a las células transfectadas se analizó usando un Becton Dickinson FACSCanto2 (BD Biosciences) con el software Flowjo (TreeStar). Como se muestra en la Figura 11, todas estas cepas de RABV fueron reconocidas por RVC20 y RVC58, mientras que RAB1 no se unió a la cepa 91001 USA y CR57 no se unió a las cepas RV/R.3PHL/2008/TRa-065 y 09029NEP. Estos hallazgos amplían el número de aislados de RABV reconocidos por RVC20 y RVC58 a 43.
La Figura 10B muestra el árbol filogenético de 2215 secuencias de proteína G de RABV recuperadas de bases de datos públicas. Destacadas con puntos negros están las secuencias de los virus RABV probados (dos secuencias de proteína G, es decir, CV9.13, Mauritania/perro/2019-2006/V6235-2007 no estaban disponibles y, por tanto, no se incluyeron en el árbol). Esto muestra que los virus RABV probados (puntos negros) son representativos de todos los linajes circulantes (es decir, americano, asiático, cosmopolita, África 2, África 3 y linajes Árticos/tipo Ártico).
Se realizó una selección de resultados de neutralización utilizando pseudovirus de RABV (PV, el ensayo de neutralización de PV se realizó de acuerdo con Wright, E. et al., J Gen. Virol 89, 2204-221 3, 2008 y Wright, E. et al., Vaccine 27, 71 78-71 86, 2009) o virus infecciosos (medidos por el ensayo de neutralización del virus anticuerpo fluorescente, FAVN, según Cliquet, F., et al., J. Immunol Methods 212, 79-87, 1998, o por el ensayo rápida de inhibición del foco de fluorescencia, RFFIT, según Smith, JS y col., Bull. World Health Organ, 48, 535-541, 1973) y las características de los aislados seleccionados de RABV y no RABV se muestran en las Figuras 12 y 13, respectivamente.
Ejemplo 5: Mapeo de epítopos utilizando pseudovirus mutantes
Con el fin de refinar mejor la especificidad del epítopo de los 12 anticuerpos monoclonales humanos seleccionados, se probaron contra pseudotipos de RABV modificados genéticamente. En particular, el aminoácido cambia K226E, K226N, G229E, N336D y N336S que se encuentran en los mutantes de escape viral CR57 y CR4098 descritos en Bakker, ABH et al., J Virol 79, 9062-9068, 2005 y en Marissen, W. et al., J Virol 79, 4672-4678, 2005, se introdujeron en el gen CVS-11 G y se produjeron los correspondientes pseudovirus mutantes.
El panel de 12 anticuerpos seleccionados, así como los anticuerpos de referencia CR57 y CR4098, se analizaron a 15 pg/ml para determinar su capacidad de neutralizar los 5 pseudovirus mutantes (K226E, K226N, G229E, N336D y N336S) y se compararon con el CVS - cepa 11 parental correspondiente. Los resultados de este análisis se resumen en la Figura 14. Los anticuerpos CR57 y RVC20, pero no RVC3, no pudieron neutralizar los mutantes de escape CR57 CVS-1 1 K226E, K226N y G229E. Estos resultados indican que RVC3 reconoce un epítopo en el sitio antigénico I que es distinto del reconocido por CR57, y que RVC20 reconoce un epítopo similar al reconocido por CR57. Sin embargo, el hallazgo de que RVC20 se caracteriza por una reactividad más amplia contra lisavirus no RABV (Figura 8) en comparación con CR57, indica que el modo de reconocimiento del anticuerpo RVC20 de su epítopo análogo en el sitio antigénico I es distinto al de CR57, pudiendo tolerar un mayor número de cambios de aminoácidos en el sitio de unión y en los residuos circundantes.
Todos los anticuerpos, incluido CR4098, con la excepción de RAB1 (datos no mostrados), fueron capaces de neutralizar los mutantes de escape CR4098 CVS-11 N336D, lo que indica que esta mutación no tiene un impacto significativo en la unión a sus epítopos afines en el contexto de la proteína G CSV-11. Además, todos los anticuerpos antigénicos del sitio III de la invención, RVC58 en particular, mostraron una mayor amplitud de reactividad con lisavirus no RABV en comparación con CR4098 (Figura 7).
Ejemplo 6: Análisis de la conservación de los epítopos RVC20 y RVC58 dentro de los aislados de RABV
El sitio antigénico I reconocido por el anticuerpo CR57 se definió mediante análisis de barrido de péptidos y mediante el aislamiento de los mutantes de escape viral K226E, K226N y G229E y se encontró que se localizaba en la región de unión mínima compuesta por los residuos KLCGVL (secuencia consenso y posiciones 226-231 de la proteína G RABV; Marissen, W. et al., J. Vi rol 79, 4672-4678, 2005). Los resultados de la competencia mostrados en la Figura 4 y los resultados de la prueba de pseudovirus mutante mostrados en la Figura 14 indican que RVC20 se une al sitio antigénico I. Por tanto, los presentes inventores analizaron el grado de conservación de los residuos aminoácidos del sitio antigénico I en un panel de 2566 secuencias a partir de aislados independientes de RABV recuperados de múltiples bases de datos públicas representativas de la diversidad global de RABV.
Así, se encontró que la posición 226 es K en el 99,73% y R en el 0,19% de las secuencias analizadas (R o K en el 99,92% de los aislados) (Figura 15A). RVC20, pero no CR57, neutraliza los virus que llevan tanto K como R en la posición 226 (Figura 16). La otra posición polimórfica en el sitio antigénico I es el residuo 231, que es L en 67,65%, S en 17,30% y P en 14,73% de los aislados de RABV analizados (L, S o P están presentes en el 99,69% de las secuencias, Figura 15A). Se probaron RVC20 y CR57 y se neutralizaron los lisavirus que llevaban residuos leucina, serina o prolina en la posición 231 (Figura 16). Este análisis confirmó nuestros resultados de neutralización anteriores e indicó que el epítopo del anticuerpo RVC20 está altamente conservado en RABV. Es importante destacar que todos los tres mutantes de escape CR57 y RVC20 CVS-11 en la posición 226 son neutralizados eficazmente por RVC58.
Se realizó un análisis similar para el anticuerpo RVC58 del sitio antigénico III. El sitio antigénico III está formado principalmente por los residuos KSVRTWNEI (secuencia consenso y posiciones 330-338 de la proteína G RABV; (Walker, P. J. et al., J. Gen. Virol 80, 121 1 -1220, 1999; Bakker, A. B. H. y col. , J Virol 79, 9062 - 9068, 2005). Los resultados de la competencia mostrados en la Figura 4 y los resultados de la prueba de pseudovirus mutante mostrada en la Figura 14 indican que RVC58 reconoce residuos dentro del sitio antigénico III. Por tanto, los presentes inventores analizaron como se describió anteriormente para el sitio antigénico I el grado de conservación de los residuos aminoácidos del sitio antigénico III en un panel de 2566 secuencias de aislados de RABV independientes recuperados de múltiples bases de datos públicas representativas de la diversidad global de RABV (como para el sitio antigénico I anterior).
Así, se encontró que las posiciones 330, 331, 334, 335 y 337 están muy conservadas (> 99,61%), mientras que los residuos 332, 333, 336 y 338 son polimórficos (Figura 15B). La posición 330 es K en el 99,61% y N en el 0,27% de las secuencias analizadas (K o N están presentes en el 99,88% de las secuencias). Se demostró que RVC58 neutraliza los virus que llevan K o N en la posición 330 (Figura 16). La posición 331 está altamente conservada y está codificada por S en el 99,96% de los aislados. La posición 332 es V en el 77,05% e I en el 22,88% de las secuencias (V o I están presentes en el 99,93% de los aislados). Se demostró que RVC58 neutraliza los lisavirus que llevan V o I en la posición 332. La posición 333 es R en el 96,22% de los aislados. Varios otros residuos, pero no D, se encuentran en la posición 333 en los aislados de RABV. Por el contrario, los lisavirus del filogrupo II tienen D en esa posición y estos virus no son neutralizados por RVC58, lo que sugiere que D en la posición 333 podría comprometer la unión de RVC58, pero este residuo no se encuentra en los aislados naturales de RABV. La posición 334 es T en el 99,65% de los aislados. La posición 335 es W en el 100% de los aislados. La posición 336 es N en 90,57%, D en 3,59%, S en 5,65% y K en 0,08% de los aislados de RABV analizados (N, D, S o K están presentes en el 99,89% de los aislados). Se demostró que RVC58 neutraliza los lisavirus que portan N, D, S o K en la posición 336. Es de destacar que los RABV que llevan D en la posición 336 no son neutralizados por CR4098 y RAB1, lo que sugiere que potencialmente el 4% de los RABV circulantes son resistentes a la neutralización de CR4098 y a la neutralización de RAB1. Es de destacar que la mayoría de los aislados africanos de RABV analizados aquí (59,1%) tienen una D en la posición 336. Estos aislados corresponden al linaje Africa2. La posición 337 es una E en el 99,61% y D en el 0,35% de los aislados (E o D están presentes en el 99,96% de los aislados). Se demostró que RVC58 neutraliza los lisavirus que portan E o D en la posición 337. Finalmente, la posición 338 es I en 93,73% y V en 6,16% de los aislados analizados (I o V están presentes en 99,9% de los aislados). Se demostró que RVC58 neutraliza los lisavirus que portan I o V en la posición 338.
Así, RVC58 reconoce aislados de RABV y no RABV que llevan múltiples residuos en las posiciones polimórficas que son representativas de al menos el 99,80% de los RABV analizados (Figura 15B, Figura 16). Este análisis confirmó nuestros resultados de neutralización previos, en los que RVC58 neutralizó todos los lisavirus del filogrupo I probados e indicó que el epítopo del anticuerpo RVC58 está altamente conservado en los lisavirus RABV y no RABV. En resumen, los dos anticuerpos RVC58 y RVC20 neutralizaron de forma potente los aislados de RABV humanos y animales, así como la mayoría de los lisavirus no RABV (incluidos los nuevos virus de murciélago euroasiático) al unirse a dos sitios antigénicos distintos (sitio I y III) en la proteína G del virus. La combinación de estos dos anticuerpos representa un tratamiento con una amplitud de reactividad sin precedentes y con un riesgo reducido de escapar a la selección de mutantes.
Ejemplo 7: Los anticuerpos RVC58 y RVC20 protegen a los hámsteres sirios de una infección letal por RABV
Para investigar si los anticuerpos RVC58 y RVC20 muestran actividad neutralizante contra una infección letal por RABV in vivo, se realizó un estudio en hámster sirio (Mesocricetus auratus). A las 6 h de la administración de una dosis letal de RABV CVS-11 (50 |jl de 10577TCID50/ml en el músculo gastrocnemio de la pata trasera izquierda, los hámsteres (n = 12 por grupo) se dejaron sin tratar o se inició la profilaxis con cualquiera de las vacunas (Imovax; Sanofi-Pasteur: una vacuna comercial de células diploides humanas inactivadas, que se administró vía intramuscular en un volumen de 0,05 ml en el músculo gastrocnemio de la pata trasera derecha, una dosis que corresponde a 0,125 unidades internacionales de antígeno de la rabia) más HRIG (Berirab®, 20 mg/kg, equivalente a 20 lU/kg y administrado vía intramuscular en un volumen de 0,05 ml), o la vacuna más 0,045 mg/kg de una mezcla equimolar de anticuerpos RVC20 y RVC58 o la vacuna más 0,0045 mg/kg de una mezcla equimolar de anticuerpos RVC20 y RVC58. Los animales tratados también recibieron la vacuna contra la rabia los días 3, 7, 14 y 28. Los animales se controlaron durante el experimento y se sacrificaron cuando aparecieron signos de rabia clínica. Once de los 12 animales que no fueron tratados después de la infección sucumbieron el día 8 (Figura 17). La profilaxis post-exposición estándar (PEP) basada en 20 mg/kg de HRIG y vacuna fue eficaz para reducir la mortalidad general al 33% (sobrevivieron 8/12 animales; Figura 17). Sorprendentemente, la combinación de RVC58 RVC20 a 0,045 mg/kg (que corresponde a 1/440 de la HRIG administrada) protegió al 75% de los animales (9/12), mientras que una dosis 10 veces menor de RVC58 y RVC20 (0,0045 mg/kg) protegieron solo al 33% de los animales. Esto sugiere que 0,045 mg/kg de RVC58 RVC20 es superior a la dosis de 20 mg/kg de HRIG. La dosis protectora de 0,045 mg/kg de RVC58 RVC20 corresponde en humanos a una dosis total media a administrar durante la PEP de solo 3 mg de la mezcla RVC58 RVC20. Esta cantidad podría producirse y formularse en una forma estable (es decir, formulación liofilizada, donde, por ejemplo, estudios previos han demostrado que los anticuerpos monoclonales conservados por liofilización son estables durante 33 meses a 40 °C y 5 meses a 50 °C) y a un coste asequible para los países en desarrollo.
Ejemplo 8: Los anticuerpos RVC58 y RVC20 no interfieren con la vacunación
Durante la PEP, existe la posibilidad de que la administración simultánea de anticuerpos y vacuna disminuya la capacidad de la vacuna para inducir los niveles umbral de anticuerpos neutralizantes necesarios para la protección. Por tanto, es fundamental evaluar el grado en que un tratamiento con anticuerpos interfiere con la vacunación. Para determinar el efecto de la mezcla de anticuerpos sobre la potencia de la vacuna, se realizó un experimento animal in vivo en ausencia de exposición a RABV. En particular, todos los animales (n = 12 por grupo) fueron vacunados con vacuna antirrábica los días 0, 3, 7, 14 y 28 (Imovax, Sanofi-Pasteur, administrada vía intramuscular a un volumen de 0,05 ml en el músculo gastrocnemio de la pata trasera derecha, una dosis que corresponde a 0,125 unidades internacionales de antígeno de la rabia) y administrada concomitantemente el día 0 con HRIG (Berirab®, 20 mg/kg) o con una mezcla equimolar de RVC58 RVC20 a 0,045 mg/kg o 40 mg/kg (dosis 888 veces mayor), que se inyectaron vía intramuscular en el músculo gastrocnemio de la pata trasera izquierda. Se determinaron los títulos de unión al suero (medidos en ELISA en placas recubiertas con proteína G de RABV mediante la detección de anticuerpos de hámster unidos a proteína G con anticuerpos policlonales anti-hámster conjugados con fosfatasa alcalina), los títulos de neutralización del suero (ensayo de neutralización FAVN en CVS-11; de acuerdo con Cliquet, F., et al., J. Immunol Methods 21 2, 79-87, 1998) y los niveles de anticuerpos IgG humanos residuales el día 42. HRIG y 0,045 mg/kg de RVC58 RVC20 no redujeron la respuesta del anticuerpo de unión a IgG de hámster endógeno a la proteína G de RABV (Figura 1 8A) en comparación con los animales que recibieron la vacuna sola. Es de destacar que el nivel de anticuerpos neutralizantes en animales tratados con las dosis de 0,045 y 40 mg/kg es comparable al obtenido por la vacuna sola o por la vacuna y los animales tratados con HRIG y en la mayoría de los animales el título neutralizante es superior a 10 UI/ml (Figura 18B). Finalmente, mientras que todavía se encuentran niveles altos de anticuerpos humanos (por encima de 10 |jg/ml) el día 42 en animales tratados con 20 mg/kg de HRIG o 40 mg/kg de RVC58 RVC20, no se detectaron niveles bajos de IgG humana en los sueros de animales tratados con 0,045 mg/kg de RVC58 RVC20 (Figura 18C). Estos resultados sugieren que una dosis de 0,045 mg/kg de RVC58 RVC20, que demostró ser protectora, no compromete la producción de anticuerpos neutralizantes de virus provocados en animales tras la vacunación con RABV.
Ejemplo 9: Los anticuerpos RVC58 y RVC20 actúan terapéuticamente en hámsteres sirios infectados letalmente con RABV
Actualmente, no existe ningún tratamiento para la rabia. El desarrollo de un tratamiento sería beneficioso para al menos dos clases de pacientes: aquellos con exposición conocida al RABV pero que no han podido recibir profilaxis post-exposición inmediata debido a las circunstancias y que tienen un mayor riesgo de desarrollar infección por RABV, y aquellos que no reconocieron el contacto con el virus y presentan signos (de diferente gravedad) de la enfermedad (por ejemplo individuos infectados por contactos inadvertidos con murciélagos infectados; el RABV de origen murciélago donde se controla la rabia canina se ha convertido en la principal causa de rabia humana). Inyecciones i.v. de dosis simple o múltiple con el cóctel RVC58 y RVC20 (es decir, una mezcla equimolar de anticuerpos RVC58 y RVC20) proporcionarían títulos altos de anticuerpos neutralizantes sistémicos (incluso en el SNC) y bloquearían la replicación viral y la progresión de la enfermedad. El desarrollo de un cóctel de anticuerpos potentes y ampliamente neutralizantes puede ayudar a ampliar la ventana de tratamiento post-exposición para la infección humana por RABV, que actualmente se limita a los primeros días tras la infección. En estos individuos, es posible que el RV ya haya alcanzado los tejidos del SNC y que también hayan aparecido signos tempranos o tardíos de la enfermedad. Estos pacientes podrían beneficiarse de un tratamiento con anticuerpos neutralizantes muy potentes que pueden filtrarse a través de la barrera hematoencefálica (o administrarse directamente en el CSN) suministrando una cantidad suficiente de anticuerpos capaces de neutralizar eficazmente la replicación del virus en el tejido del SNC.
Se evaluó el potencial terapéutico de los anticuerpos RVC58 RVC20 en hámsteres sirios desafiados letalmente con un aislado de campo de RABV. En particular, RVC58 RVC20 se probaron en hámsteres sirios desafiados en el músculo gastrocnemio de una pata trasera con una dosis letal de un virus de campo aislado de las glándulas salivales de un zorro infectado (Italia/zorro rojo/673/2011). En los animales infectados, el RABV fue detectable en el SNC (sistema nervioso central) el día 5 después del desafío. Los animales se trataron con una única inyección de 40 mg/kg de RVC58 RVC20 administrada el día 1 (n = 12), el día 5 (n = 12) o el día 9 (n = 7) después de la infección sin una administración concomitante de la vacuna. Los grupos de control recibieron una solución salina tamponada con fosfato (n = 17) o la PEP estándar (20 mg/kg de HRIG y vacuna; n = 12). Los animales se controlaron dos veces al día y se sacrificaron cuando aparecieron signos clínicos de rabia. Sorprendentemente, RVC58 RVC20 protegió a los animales de la infección letal cuando se administró hasta 5 días después de la infección (Figura 19). Es de destacar que 3 de los 12 animales tratados mostraron signos clínicos de la enfermedad (parálisis del sitio de desafío de la pata trasera), que sin embargo no se desarrolló más. En este modelo, la PEP clásica confería solo una protección modesta en comparación con los animales no tratados (Figura 19). No se detectaron signos de enfermedad en los animales supervivientes hasta 60 días después de la infección.
En todos los animales que sucumbieron y en todos los supervivientes (que fueron sacrificados el día 60) se reveló la presencia de RABV cuantificando el ARN genómico y el ARNm viral que codifica la proteína N en la médula espinal, la médula oblonga/cerebelo y el cerebro cuantificado mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Es de destacar que se midieron niveles detectables de ARN viral en el SNC de animales asintomáticos tratados con RVC58 RVC20 el día 1 o 5 después de la infección (aunque a niveles 100-1000 inferiores a los medidos en los animales que sucumbieron) (Figura 20A), indicando así que la infección inicial por RABV no fue abortiva, sino que se mantuvo bajo control dentro del SNC por los anticuerpos neutralizantes altamente potentes administrados y muy probablemente por una respuesta inmune endógena concomitante al virus.
El desarrollo de una respuesta inmune endógena robusta también se confirmó midiendo los títulos de anticuerpos IgG de hámster específicos de la proteína G de RABV en el suero de todos los animales (Figura 20B). Es de destacar que los animales que recibieron RVC58 RVC20 el día 5 (todos sobrevivieron a la infección letal) desarrollaron niveles altos de anticuerpos IgG específicos de la proteína G a niveles comparables, o superiores, que los obtenidos en los animales supervivientes por la vacuna del grupo PEP. El nivel de estos anticuerpos también fue comparable o superior al obtenido en animales no diagnosticados que recibieron la PEP estándar (ver Figura 18). Finalmente, la dosis alta de RVC58 RVC20 también podría ser compatible con la vacunación concomitante, como lo demuestra el hallazgo de que el uso de una dosis alta de estos anticuerpos no compromete la respuesta inmune a la vacuna (Figura 18A-B).
Las muestras de tejido del cerebro, el bulbo raquídeo y la médula espinal de animales de control sintomáticos o animales que recibieron RVC58 RVC20 el día 5 (y sacrificados el día 60) se analizaron para detectar la presencia del antígeno N de RABV mediante inmunohistoquímica (IHC). En particular, el análisis IHC se centró en la identificación de cuerpos de Negri, que son cuerpos de inclusión patognomónicos eosinófilos, claramente delineados (2-10 pm de diámetro), formados por agregados de nucleocápsidas y que se encuentran en el citoplasma de neuronas que contienen el virus de la rabia. Si bien se encontraron numerosos cuerpos de Negri en tejidos del SNC de animales de control positivo, solo se identificaron muy pocos cuerpos en animales tratados con anticuerpos el día 5 (Figura 21). Estos resultados confirman que el RABV ha llegado al SNC e incluso al cerebro en los animales tratados con la dosis alta de RVC58 RVC20 sin provocar síntomas. La presencia de anticuerpos neutralizantes de RABV en las primeras etapas de la evolución clínica del paciente se considera un factor importante que contribuye a un resultado favorable. Esto probablemente ocurre en menos del 20% de todos los pacientes con rabia. La presencia de anticuerpos neutralizantes del RABV es un marcador de una respuesta inmune adaptativa activa que es esencial para la eliminación viral (Lafon, M., en "Rabies", A. C. Jackson y W. H. Wunner, 3a ed., pp. 489-504, Elsevier Academic Press, Londres, 2013). Hubo seis sobrevivientes de rabia que recibieron la vacuna contra la rabia antes del inicio de su enfermedad (y solo uno que no recibió la vacuna). Esto apoya la idea de que una respuesta inmune temprana está asociada con un resultado positivo. Por último, la mayoría de los supervivientes de la rabia han mostrado anticuerpos neutralizantes de RABV en suero y líquido cefalorraquídeo. Los potentes y amplios anticuerpos neutralizantes del RABV humano aquí descritos, por ejemplo RVC20 y RVC58, ofrecen la oportunidad de conferir una inmunidad pasiva inmediata y robusta, que podría representar (i) un potente agente para la terapia post­ exposición, que es eficaz en concentraciones mucho más bajas en comparación con HRIG y (ii) un agente terapéutico válido para el tratamiento de pacientes con un diagnóstico clínico temprano de la rabia. En este sentido, es concebible que un inicio rápido de la terapia pueda ofrecer la mejor oportunidad para un resultado favorable. Por tanto, los anticuerpos aquí descritos, por ejemplo los anticuerpos monoclonales humanos RVC58 y RVC20, pueden representar una terapia eficaz solos o en combinación con otras terapias que incluyen la vacunación antirrábica, ribavirina (u otros antivirales), interferón alfa y ketamina.
TABLA DE SECUENCIAS Y NÚMEROS DE SEQ ID
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Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que neutraliza la infección por lisavirus, caracterizado porque el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establecen en las SEQ ID NO: 165-169 y 171, respectivamente, o en las SEQ iD NO: 165-168 y 170-171, respectivamente.
2. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada con al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 180.
3. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada tal como se establece en la SEQ ID NO: 179 y una región variable de cadena ligera tal como se establece en la SEQ ID NO: 180.
4. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo humano, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal humano, un anticuerpo purificado, un anticuerpo monocatenario, Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv.
5. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en la profilaxis, en el tratamiento o en la atenuación de una infección por lisavirus RABV y/o no RABV, preferentemente lisavirus del filogrupo I RABV y/o no RABV, con mayor preferencia RABV y/o EBLV-1.
6. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso según la reivindicación 5, donde el uso comprende administrar dicho anticuerpo en combinación con otro anticuerpo monoclonal aislado que neutraliza una infección por lisavirus y que comprende (i) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 93-97 y 99 o en las SEQ ID NO: 93-96 y 98­ 99, respectivamente; (ii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 1-5 y 7 o en las SEQ ID NO: 1-4 y 6-7, respectivamente; (iii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 19-23 y 25 o en las SEQ ID NO: 19-22 y 24­ 25, respectivamente; (iv) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 37-41 y 43 o en las SEQ ID NO: 37-40 y 42 -43, respectivamente; (v) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 55-59 y 61 o en las SEQ ID NO: 55-58 y 60­ 61, respectivamente; (vi) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 75-79 y 81 o en las SEQ ID NO: 75-78 y 80-81, respectivamente; (vii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 111-115 y 117 o en las SEQ ID NO: 111-114 y 116-117, respectivamente; (viii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 129-133 y 135 o en las SEQ ID NO: 129-132 y 134-135, respectivamente; (ix) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las Se Q ID NO: 147-151 y 153 o en las SEQ ID NO: 147-150 y 152-153, respectivamente; (x) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDr H3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 183-187 y 189 o en las SEQ ID NO: 183-186 y 188-189, respectivamente; o (xi) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 201-205 y 207 o en las SEQ ID NO: 201-204 y 206-207, respectivamente; y donde ambos anticuerpos se unen específicamente a diferentes epítopos en la glicoproteína G de RABV, preferentemente donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a un sitio antigénico I o III en la proteína G de RABV y el otro anticuerpo, que se administra en combinación, se une al otro de los sitios antigénicos I o III en la glicoproteína G de RABV.
7. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso según la reivindicación 6, donde el otro anticuerpo administrado en combinación comprende secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establece en las SEQ ID NO: 93-97 y 99, respectivamente, o en las SEQ ID NO: 93-96 y 98-99, respectivamente.
8. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, donde el anticuerpo y el otro anticuerpo, que se administra en combinación, se administran en cantidades equimolares.
9. Molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo, o el fragmento de unión al antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
10. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9.
11. Célula aislada que expresa el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o que comprende el vector según la reivindicación 10.
12. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el ácido nucleico según la reivindicación 9, el vector según la reivindicación 10, la célula aislada según la reivindicación 11 y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, que comprende al menos dos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, donde uno de los al menos dos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, es el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y el otro o los otros anticuerpos, o el o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, comprende(n) (i) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 93-97 y 99 o en las SEQ ID NO: 93-96 y 98-99, respectivamente; (ii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 1-5 y 7 o en las SEQ ID NO: 1-4 y 6-7, respectivamente; (iii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 19-23 y 25 o en las SEQ ID NO: 19-22 y 24­ 25, respectivamente; (iv) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 37-41 y 43 o en las SEQ ID NO: 37-40 y 42 -43, respectivamente; (v) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 55-59 y 61 o en las SEQ ID NO: 55-58 y 60­ 61, respectivamente; (vi) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 75-79 y 81 o en las SEQ ID NO: 75-78 y 80-81, respectivamente; (vii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 111-115 y 117 o en las SEQ ID NO: 111-114 y 116-117, respectivamente; (viii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 129-133 y 135 o en las SEQ ID NO: 129-132 y 134-135, respectivamente; (ix) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las Se Q ID NO: 147-151 y 153 o en las SEQ ID NO: 147-150 y 152-153, respectivamente; (x) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDr H3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 183-187 y 189 o en las SEQ ID NO: 183-186 y 188-189, respectivamente; y/o (xi) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 201-205 y 207 o en las SEQ ID NO: 201-204 y 206-207, respectivamente;
donde los al menos dos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a diferentes epítopos en la glicoproteína G de RABV, preferentemente donde un anticuerpo de los al menos dos anticuerpos se une al sitio antigénico I en la proteína G de RABV y otro anticuerpo de los al menos dos anticuerpos se une al sitio antigénico III en la glicoproteína G de RABV.
14. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, donde uno de los al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprende secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establece en las SEQ ID NO: 93-97 y 99 o en las SEQ ID NO: 93-96 y 98-99, respectivamente, y otro de los al menos dos anticuerpos comprende secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establece en las SEQ ID NO: 165-169 y 171 o en las SEQ ID NO: 165­ 168 y 170-171, respectivamente.
15. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el ácido nucleico según la reivindicación 9, el vector según la reivindicación 10, la célula aislada según la reivindicación 11o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 para su uso en (i) la profilaxis, en particular en la profilaxis post-exposición, en el tratamiento o la atenuación de una infección por lisavirus RABV y/o no RABV; (ii) la vacunación contra una infección por lisavirus RABV y/o no RABV; o (iii) el diagnóstico de una infección por RABV y/o por otros lisavirus
16. Uso del anticuerpo, o del fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para monitorizar la calidad de vacunas anti lisavirus RABV o no RABV mediante la comprobación de que el antígeno de dicha vacuna contiene el epítopo específico en la conformación correcta.
17. Kit de partes que comprende al menos dos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que neutralizan la infección por lisavirus, donde uno de los al menos dos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, es el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y el otro o los otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen específicamente a un epítopo diferente en la glicoproteína G de RABV.
18. Kit de partes según la reivindicación 17, donde el kit comprende al menos dos anticuerpos diferentes, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, donde uno de los al menos dos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, es el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y el otro o los otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismo comprende(n) (i) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las Se Q ID NO: 93-97 y 99 o en las SEQ ID NO: 93-96 y 98-99, respectivamente; (ii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 1-5 y 7 o en las SEQ ID NO: 1­ 4 y 6-7, respectivamente; (iii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 19-23 y 25 o en las SEQ ID NO: 19-22 y 24-25, respectivamente; (iv) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 37-41 y 43 o en las SEQ ID NO: 37-40 y 42 -43, respectivamente; (v) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 55-59 y 61 o en las SEQ ID NO: 55-58 y 60-61, respectivamente; (vi) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 75-79 y 81 o en las SEQ ID NO: 75-78 y 80­ 81, respectivamente; (vii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 111-115 y 117 o en las SEQ ID NO: 111-114 y 116-117, respectivamente; (viii) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 129-133 y 135 o en las SEQ ID NO: 129-132 y 134-135, respectivamente; (ix) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las s Eq ID NO: 147-151 y 153 o en las SEQ ID NO: 147-150 y 152-153, respectivamente; (x) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRl2 y CDRL3 como se establece en las SeQ ID NO: 183­ 187 y 189 o en las SEQ ID NO: 183-186 y 188-189, respectivamente; y/o (xi) secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 como se establece en las SEQ ID NO: 201-205 y 207 o en las SEQ ID NO: 201-204 y 206-207, respectivamente;
donde los anticuerpos, o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a diferentes epítopos en la glicoproteína G de RABV, preferentemente donde un anticuerpo de los al menos dos anticuerpos se une al sitio antigénico I en la proteína G de RABV y otro anticuerpo de los al menos dos anticuerpos se une al sitio antigénico III en la glicoproteína G de RABV.
19. Kit de partes según la reivindicación 17 o 18, donde al menos uno de los al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprende secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establece en las SEQ ID NO: 93-97 y 99 o en las SEQ ID NO: 93-96 y 98-99, respectivamente, y otro de los al menos dos anticuerpos comprende secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se establece en las SEQ ID NO: 165-169 y 171 o en las SEQ ID NO: 165­ 168 y 170-171, respectivamente.
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