CN113226372A

CN113226372A - 抗狂犬病单克隆抗体及其混合物

Info

Publication number: CN113226372A
Application number: CN201980086084.6A
Authority: CN
Inventors: 桑吉夫·库马尔·门迪拉塔; 桑贾伊·班迪奥帕迪亚伊; 潘卡伊·卡利塔; 凯文库马尔·坎萨格拉
Original assignee: Cadila Healthcare Ltd
Current assignee: Zydus Lifesciences Ltd
Priority date: 2018-11-02
Filing date: 2019-10-24
Publication date: 2021-08-06
Also published as: PE20211056A1; WO2020089742A1; EP3873526A1; BR112021008240A2; MX2021005029A; PH12021550987A1; ECSP21039816A; MA54075A

Abstract

本公开内容提供了能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的鼠单克隆抗体。本公开内容还提供了具有所述特性的至少两种单克隆抗体的混合物。所述混合物可以中和来源于物种例如蝙蝠、狗、牛、獴、臭鼬、和狼的病毒，并因此可用于治疗可能已被感染的患者。此外，本公开内容提供了鼠单克隆抗体或至少两种单克隆抗体的混合物与抗狂犬病疫苗的组合，其用于狂犬病或狂犬病相关病毒的暴露后预防(PEP)。

Description

抗狂犬病单克隆抗体及其混合物

技术领域

本发明涉及能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体。更特别地，本发明涉及能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的至少两种单克隆抗体的混合物(cocktail)。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus，RABV)(狂犬病病毒属(Lyssavirusgenus)的类型成员)引起的动物源性疾病，并且是每年＞55 000例死亡(大部分在发展中国家，在那里传播通常在被感染的狗咬伤之后发生)的原因。如果不进行治疗，病毒会逐渐感染周围的神经元并在中枢神经系统中传播，这几乎总是导致死亡。该疾病可通过暴露后预防(post-exposure prophylaxis，PEP)来预防，所述暴露后预防由施用灭活的RABV疫苗以及被动抗体治疗组成。在标准的被动抗体治疗中，将来源于经免疫接种的人(HRIG)或马(ERIG)来源的多克隆狂犬病免疫球蛋白(rabies immunoglobulin，RIG)输注到伤口部位中(The Journal of Infectious Diseases 2014；210：200-8)。

考虑到狂犬病或狂犬病相关病毒在其进入咬伤部位的周围神经之后不能被中和，通过中和病毒而发挥作用的所有咬伤后预防活动都必须仅在咬伤部位进行。RIG已用于在病毒进入神经之前中和伤口中的病毒。明显的是，在咬伤部位有更多量的可用药物会为患者提供更好的保护机会。

如上所述，患狂犬病动物咬伤之后的标准咬伤后预防方案涉及给予RIG和疫苗二者。RIG以被动方式提供针对病毒的早期免疫，而疫苗以主动方式提供针对病毒的后期免疫。任何成功的方案必须维持对以下的正确平衡：i)RIG，其在早期(即在动物咬伤之后立即(72小时))提供高抗狂犬病病毒保护，而ii)其不应中和抗狂犬病疫苗(其也在动物咬伤之后立即给予)，并因此在后期(即长至第42天或更长)在患者中通过主动免疫产生抗狂犬病病毒保护。

作为从经反复免疫接种的动物获得的马来源的多克隆抗狂犬病血清的ERIG的临床试验数据显示这些药物在人中可以以多至40IU/kg给予。在另一方面，作为从经免疫接种的人供体获得的人供体来源的多克隆抗狂犬病血清的HRIG，不能超过20IU/kg给予，因为更高的剂量最终会中和疫苗，从而使咬伤后预防方案自身失败(Bull.Wid Hlth Org.，197145，303-315)。

理想的方案应在咬伤部位提供更高量的RIG以提供早期保护，同时仍允许疫苗提供后期保护。人与马的RIG之间的剂量的差异在于，人患者可容易地将马来源RIG识别为外来实体，并因此提高针对RIG自身的免疫应答。因此，高量的ERIG药物在咬伤部位成为可使用的，并且不能在身体内停留足够长的时间并允许疫苗提供后期保护。在另一方面，人来源RIG不被识别为外来实体，并因此患者的免疫系统不会对其作出反应，从而允许HRIG在患者中循环更长的一段时间，并且如果其超过20IU/kg给予则会中和疫苗。HRIG的更高剂量40IU/kg使方案自身失败。

另外，最可能由于类似原因，用于狂犬病咬伤后预防方案的最近批准的人单克隆抗体已被批准以3.33IU/kg使用。(

产品插页)。

因此，需要具有低循环半衰期的抗体，例如能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的非人或非人源化抗体，作为狂犬病的咬伤后预防方案的一部分。

此外，这些血清来源的抗体经常具有多种缺点，包括有限利用度、批次间变化、高成本、具有血源性外来剂(adventitious agent)的污染和/或不良反应的风险。由于这些原因，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)鼓励开发和评价RIG替代的替代生物制剂。一种这样的替代策略由能够中和广泛多种的RABV分离株的单克隆抗体(mAb)提供。RIG和单克隆抗体二者均直接针对病毒G蛋白，因为数个研究已表明抗G蛋白抗体提供针对狂犬病或狂犬病相关病毒的保护。G蛋白由三个独特的抗原位点组成。狂犬病病毒糖蛋白上存在抗原位点I、II和III，这已经基于使用12种中和单克隆抗体对CVS-11病毒的糖蛋白变体进行抗原分析被确定。(J，gen.Virol.(1983)，64，843-851)。狂犬病病毒糖蛋白(G)通过病毒脂质包膜形成表面突起(projection)，并且是能够诱导病毒中和抗体(virus-neutralizing antibody，VNA)并与其反应的唯一蛋白质。研究已经证实分离的G能够保护动物免于狂犬病(J.gen.Virol.(1983)，64，1649-1656；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.81，7194-7198，1984年11月)。糖蛋白上的抗原位点已通过使用对单克隆抗体进行的中和具有抗性的突变体进行了研究。该文献中已描述了三个主要位点——位点I、II和III。

设计的RIG包含针对G蛋白上多个表位的抗G抗体。单克隆抗体可仅与G蛋白上的一个单表位结合。如果所讨论的表位由于突变而丧失，则提供被动免疫的包含仅一种单克隆抗体的产物将遭受逃脱药物的突变体狂犬病病毒的风险。因此，针对G蛋白上两个独特非重叠表位的两种单克隆抗体的混合物将提供针对突变体的更好的保护。

WO2013048130公开了结合狂犬病病毒的抗狂犬病抗体。所述专利申请公开并教导了嵌合的、人源化的或人单克隆抗体。由于本文中上文讨论的与人来源RIG有关的原因，这样的抗体可无法在早期以高剂量给予以提供高抗狂犬病病毒保护。

因此，迫切需要开发可通过培养合成来大量生产和供应并且可具有均匀品质的用于治疗狂犬病的单克隆抗体制剂。这样的产品将从良好表征的细胞库中产生，并因此免于病毒感染和来自其他外来剂的感染的风险。作为基于单克隆抗体的产品，作为药物给予患者的蛋白质的绝对量将比基于多克隆RIG的药物低得多，并因此发生过敏反应的风险更小。

因此，本发明如本文所述提供了能够在两个分开的位点结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体的制剂，并且还提供了用于中和狂犬病或狂犬病相关病毒、包含以等效量混合的所述两种单克隆抗体的这样的制剂的混合物。

发明概述

本发明提供了能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的鼠单克隆抗体。还提供了能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的至少两种单克隆抗体的混合物。

根据本发明，所述混合物可中和来源于物种(例如蝙蝠、狗、牛、獴(mongoose)、臭鼬(skunk)和狼)的狂犬病和狂犬病相关病毒，并因此可用于治疗可能已被来源于广泛多种物种的狂犬病或狂犬病相关病毒感染的患者。此外，本发明提供了鼠单克隆抗体或至少两种单克隆抗体的混合物与抗狂犬病疫苗的组合，其用于狂犬病或狂犬病相关病毒暴露的暴露后预防(PEP)。

附图说明

图1示出了在向具有疑似的患狂犬病动物咬伤的患者施用mAb A和mAb B的混合物+疫苗以及

+疫苗之后，平均RVNA浓度与时间曲线的线性图。混合物以40IU/kg的剂量递送，而

(HRIG)以其20IU/kg的批准剂量给予。在第14天之后，与HRIG相比，本发明的混合物维持更高的平均RVNA效价。

本文说明书中使用的缩写列表：

本申请中使用的氨基酸的缩写提供于下表中：

本申请中使用的另一些缩写：

ABV：澳大利亚蝙蝠病毒(Australian bat virus)

BHK：幼仓鼠肾成纤维细胞(Baby Hamster Kidney fibroblast)

CDRH1：重链互补决定区1

CDRH2：重链互补决定区2

CDRH3：重链互补决定区3

CDRL1：轻链互补决定区1

CDRL2：轻链互补决定区2

CDRL3：轻链互补决定区3

CHO：中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary)

CSO：半滑舌鳎卵巢(Cynoglossus Semilaevis Ovary)

CVS：攻击病毒毒株(Challenge Virus Strain)

DP：药物产品(Drug product)

DS：药物物质(Drug substance)

EBLV：欧洲蝙蝠狂犬病病毒属(European bat lyssavirus)

ERIG：马狂犬病免疫球蛋白(Equine rabies immunoglobulin)

FAVN：荧光抗体病毒中和(Fluorescent antibody virus neutralisation)

FFU：荧光形成单位(Fluorescence-Forming Unit)

FITC：异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate)

HC：重链

HCVR：重链可变区(Heavy chain variable region)

HEK：人胚肾(Human embryonic kidney)

HeLa：海拉细胞(Henrietta Lacks)

HRIG：人狂犬病免疫球蛋白(Human rabies immunoglobulin)

LC：轻链

LCVR：轻链可变区(Light chain variable region)

mAb A：单克隆抗体A

mAb B：单克隆抗体B

MCB：主细胞库(Master cell bank)

NA cell：神经母细胞瘤细胞(Neuroblastoma cell)

PBS：磷酸盐缓冲盐水

PEP：暴露后预防

RABV：狂犬病病毒

RFFIT：快速荧光灶抑制测试(Rapid fluorescent focus inhibition test)

RIG：狂犬病免疫球蛋白(Rabies immunoglobulin)

RVNA：狂犬病病毒中和抗体(Rabies virus neutralizing antibody)

SRIG：标准狂犬病免疫球蛋白(Standard rabies immunoglobulin)

SV：街毒(Street Virus)

WCB：工作细胞库(Working cell bank)

本文说明书中使用的序列表列表：

SEQ ID NO.1：

(mAb A的CDRH1)

SEQ ID NO.2：

(mAb A的CDRH2)

SEQ ID NO.3：

(mAb A的CDRH3)

SEQ ID NO.4：

(mAb A的CDRL1)

SEQ ID NO.5：

(mAb A的CDRL2)

SEQ ID NO.6：

(mAb A的CDRL3)

SEQ ID NO.7：

(mAb A的HCVR)

SEQ ID NO.8：

(mAb A的LCVR)

SEQ ID NO.9：

(mAb A的HC)

SEQ ID NO.10：

(mAb A的LC)

SEQ ID NO.11：

(mAb B的HC)

SEQ ID NO.12：

(mAb B的LC)

定义

本文中使用的术语“混合物”是至少两种作为两种独立的活性药物物质的单克隆抗体的混合物。根据本发明的混合物优选包含mAb A和mAb B的混合物。优选地，所述混合物在制剂缓冲剂中制备。混合物通过在制剂缓冲剂中混合治疗量，优选等效量的单克隆抗体的两种活性药物物质材料来制备。最后，将其与另一些合适的药用赋形剂一起配制以制备可用于治疗性或治疗目的的抗狂犬病单克隆抗体的稳定药物组合物。

本文中使用的术语“PEP”或“暴露后预防”包括以下步骤：

1.在暴露之后应尽快处理所有咬伤伤口、抓挠和RABV暴露部位；需要用皂或清洁剂和大量的水彻底清洗和冲洗伤口约15分钟。如有可能，应向伤口施加含碘或类似杀病毒的表面制剂。

2.在暴露之后应立即施用一系列狂犬病疫苗注射剂，作为PEP主动免疫接种组分的一部分。

3.针对严重的III类暴露，应施用RIG，作为PEP被动免疫接种组分的一部分。

根据本发明的狂犬病疫苗可包括本领域已知的任何抗狂犬病疫苗。根据本发明的RIG可包括鼠单克隆抗体或至少两种单克隆抗体的混合物。

本文中使用的术语“mAb A”是可结合狂犬病或狂犬病相关病毒并将其中和的单克隆抗体。根据本发明的单克隆抗体mAb A包含：含有SEQ ID NO：1中所示多肽的CDRH1、含有SEQ ID NO：2中所示多肽的CDRH2区、含有SEQ ID NO：3中所示多肽的CDRH3区、含有SEQ IDNO：4中所示多肽的CDRL1、含有SEQ ID NO：5中所示多肽的CDRL2区以及含有SEQ ID NO：6中所示多肽的CDRL3区。根据本发明的mAb A的HCVR和LCVR区分别是SEQ ID NO：7中所示多肽和SEQ ID NO：8中所示多肽。此外，根据本发明的mAb A的重链和轻链分别是SEQ ID NO：9中所示多肽和SEQ ID NO：10中所示多肽。优选地，根据本发明的mAb A是鼠单克隆抗体。在一个方面中，本发明提供了包含IgG1恒定区，优选鼠IgGl的mAb A。其与狂犬病病毒包膜G蛋白上的位点II结合。

本文中使用的术语“mAb B”是司结合狂犬病或狂犬病相关病毒并将其中和的单克隆抗体。包含根据本发明的mAb B的重链和轻链的根据本发明的单克隆抗体mAb B分别是SEQ ID NO：11中所示多肽和SEQ ID NO：12中所示多肽。优选地，根据本发明的mAb B是鼠单克隆抗体。在一个方面中，本发明提供了包含IgG2b恒定区，优选鼠IgG2b的mAb B。其与狂犬病病毒包膜G蛋白上的位点III结合。

本文中提及的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域：CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，其从氨基端至羧基端以以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。在一个优选方面中，根据本发明的抗体是鼠抗体。

本文中使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示出针对特定表位的单一结合特异性和亲和力。

术语“药物组合物”是指为使活性成分的生物活性明确有效的这样的形式的制剂。术语“药物制剂”或“药物组合物”或“组合物”在此可互换使用。“可药用”载体或赋形剂是可合理地施用于对象哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的那些。

术语“赋形剂”是指可添加至制剂以使制剂形式中的活性药物物质稳定、调节和维持药物制剂的渗量(osmolality)和pH的试剂。常用赋形剂的一些实例包括但不限于糖、多元醇、氨基酸、表面活性剂和聚合物。“可药用”赋形剂是可合理地施用于对象哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的那些。

在药理学意义上，在本发明的上下文中，抗体的“治疗量”或“有效量”是指有效预防或治疗病症的量：对于该病症的治疗，所述抗体是有效的。

根据本发明，术语“等效量”是指相对于混合物制剂中存在的另一种或更多种抗体提供相同效力的每种抗体的量。根据本发明的抗体的效力可以以国际单位测量。狂犬病或狂犬病相关病毒中和抗体的效力通过RFFIT方法与“抗狂犬病免疫球蛋白，人WHO国际标准(Anti-rabies Immunoglobulin，Human WHO International Standard)”(RAI)或针对所述国际标准的经验证的内部参考标准进行比较来确定。

术语“患者”和“对象”可互换使用并且按其常规含义使用以指患有或有倾向患有可通过施用本发明的组合物来预防或治疗之病症的活生物体，并且包括动物。术语“动物”是指人或非人动物，包括但不限于：农场动物，例如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括家养的、野生的和猎鸟类(game birds)，例如鸡、火鸡和另一些鹑鸡类鸟类、鸭、鹅；以及非人灵长类，包括但不限于猴、黑猩猩和其他猿和猴的物种。该术语不表示特定年龄。因此，成年、少年和新生个体均是目标。

本文中使用的术语“狂犬病病毒”包括狂犬病和狂犬病相关病毒。根据本发明，可与任何病毒G蛋白的位点II或位点III结合的鼠抗体可用于其中所述病毒活性有害的治疗。

本文中使用的术语“暴露”包括被患狂犬病的动物咬伤、抓挠和舔舐。

本文中使用的术语

是在市场上可获得的经批准的HRIG。其是本领域技术人员已知的。

具体实施方式

在一个实施方案中，本发明提供了用于狂犬病和狂犬病相关病毒暴露的PEP的鼠单克隆抗体。

在一个优选实施方案中，本发明提供了用于狂犬病和狂犬病相关病毒暴露的PEP的至少两种鼠单克隆抗体的混合物。

在一个实施方案中，本发明提供了可以以比HRIG或人单克隆抗体或人源化单克隆抗体的批准剂量更高的剂量使用的鼠单克隆抗体或至少两种鼠单克隆抗体的混合物。在一个优选实施方案中，本发明提供了可以以大于20IU/kg的剂量使用的鼠单克隆抗体或至少两种鼠单克隆抗体的混合物。在一个更优选实施方案中，本发明提供了可以以20IU/kg至100IU/kg的剂量使用的鼠单克隆抗体或至少两种鼠单克隆抗体的混合物。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于狂犬病和狂犬病相关病毒暴露的PEP的鼠单克隆抗体或至少两种鼠单克隆抗体的混合物，其中所述抗体或混合物允许主动免疫接种以产生并维持有效的免疫应答。

在一个实施方案中，本发明提供了鼠单克隆抗体与抗狂犬病疫苗的组合，其用于狂犬病和狂犬病相关病毒暴露的PEP。

在一个优选实施方案中，本发明提供了至少两种鼠单克隆抗体的混合物与抗狂犬病疫苗的组合，其用于狂犬病和狂犬病相关病毒暴露的PEP。

在一个实施方案中，本发明提供了鼠单克隆抗体用于狂犬病和狂犬病相关病毒暴露的PEP的用途。

在一个优选实施方案中，本发明提供了至少两种单克隆抗体的混合物用于狂犬病和狂犬病相关病毒暴露的PEP的用途。

在一个实施方案中，本发明提供了能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体。

在一个实施方案中，本发明提供了编码单克隆抗体序列的多核苷酸。

在一个实施方案中，本发明提供了包含以下的单克隆抗体：含有SEQ ID NO：1中所示多肽的CDRH1、含有SEQ ID NO：2中所示多肽的CDRH2区以及含有SEQ ID NO：3中所示多肽的CDRH3区。

在一个实施方案中，本发明提供了包含以下的单克隆抗体：含有SEQ ID NO：4中所示多肽的CDRL1、含有SEQ ID NO：5中所示多肽的CDRL2区以及含有SEQ ID NO：6中所示多肽的CDRL3区。

在一个优选实施方案中，本发明提供了包含以下的单克隆抗体：

(a)含有SEQ ID NO：1中所示多肽的CDRH1；

(b)含有SEQ ID NO：2中所示多肽的CDRH2；

(c)含有SEQ ID NO：3中所示多肽的CDRH3；

(d)含有SEQ ID NO：4中所示多肽的CDRL1；

(e)含有SEQ ID NO：5中所示多肽的CDRL2；以及

(f)含有SEQ ID NO：6中所示多肽的CDRL3。

在一个实施方案中，本发明提供了包含含有SEQ ID NO：7中所示多肽的HCVR的单克隆抗体。

在一个实施方案中，本发明提供了包含含有SEQ ID NO：8中所示多肽的LCVR的单克隆抗体。

在一个优选实施方案中，本发明提供了包含以下的单克隆抗体：(a)含有SEQ IDNO：7中所示多肽的重链可变区，和(b)含有SEQ ID NO：8中所示多肽的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明提供了包含含有SEQ ID NO：9中所示多肽的重链的单克隆抗体。

在一个实施方案中，本发明提供了包含含有SEQ ID NO：10中所示多肽的轻链的单克隆抗体。

在一个优选实施方案中，本发明提供了包含以下的单克隆抗体：(a)含有SEQ IDNO：9中所示多肽的重链，和(b)含有SEQ ID NO：10中所示多肽的轻链。

在一个实施方案中，本发明提供了包含含有SEQ ID NO：11中所示多肽的重链的单克隆抗体。

在一个实施方案中，本发明提供了包含含有SEQ ID NO：12中所示多肽的轻链的单克隆抗体。

在一个优选实施方案中，本发明提供了包含以下的单克隆抗体：(a)含有SEQ IDNO：11中所示多肽的重链，和(b)含有SEQ ID NO：12中所示多肽的轻链。

在一个优选实施方案中，本发明提供了能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的至少两种单克隆抗体的混合物。

在一个更优选实施方案中，本发明提供了两种单克隆抗体mAb A和mAb B的混合物。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码单克隆抗体序列的多核苷酸的表达载体。

在一个实施方案中，本发明提供了用编码单克隆抗体序列的多核苷酸转化的宿主细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供了通过培养细胞系来产生本发明单克隆抗体的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体的组合物。

在一个优选实施方案中，本发明提供了包含能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的至少两种单克隆抗体的混合物的组合物。

在一个更优选实施方案中，本发明提供了包含以下的组合物：能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的至少两种单克隆抗体的混合物，其中单克隆抗体之一包含含有SEQ ID NO：1中所示多肽的CDRH1、含有SEQ ID NO：2中所示多肽的CDRH2区以及含有SEQ IDNO：3中所示多肽的CDRH3区，和/或包含含有SEQ ID NO：4中所示多肽的CDRL1、含有SEQ IDNO：5中所示多肽的CDRL2区以及含有SEQ ID NO：6中所示多肽的CDRL3区。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含以下的组合物：能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的至少两种单克隆抗体的混合物，其中单克隆抗体之一包含含有SEQ IDNO：7中所示多肽的HCVR，和/或包含含有SEQ ID NO：8中所示多肽的LCVR。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含以下的组合物：能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的至少两种单克隆抗体的混合物，其中单克隆抗体之一包含含有SEQ IDNO：9中所示多肽的重链，和/或包含含有SEQ ID NO：10中所示多肽的轻链。

在一个优选实施方案中，本发明提供了包含以下的组合物：能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的至少两种单克隆抗体的混合物，其中单克隆抗体之一包含含有SEQID NO：11中所示多肽的重链，和/或包含含有SEQ ID NO：12中所示多肽的轻链。

在一个优选实施方案中，本发明提供了包含以下的组合物：能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的至少两种单克隆抗体的混合物，其中一种抗体包含含有SEQ ID NO：9中所示多肽的重链，并且第二抗体包含含有SEQ ID NO：11中所示多肽的重链，和/或一种抗体包含含有SEQ ID NO：10中所示多肽的轻链，并且第二抗体包含含有SEQ ID NO：12中所示多肽的轻链。

在另一个实施方案中，根据本发明的组合物包含至少两种单克隆抗体的混合物以及药用赋形剂。根据本发明的混合物如以上实施方案中所述。

在一个实施方案中，本发明提供了通过细胞培养方法制备如任一前述权利要求中所要求保护的抗体的方法，其包括：

i)培养表达能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体的宿主细胞；以及

ii)分离并回收在所述宿主细胞中表达的能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体。

在另一个实施方案中，本发明提供了通过合适的色谱法或纯化技术来纯化如任一前述权利要求中所要求保护的抗体的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体的药盒(kit)。

在一个优选实施方案中，本发明提供了包含能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的至少两种单克隆抗体的混合物的药盒。

在一个实施方案中，本发明提供了用于使用能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体，优选使用能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的至少两种单克隆抗体的混合物来诊断狂犬病的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供了使用能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体，优选使用能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的至少两种单克隆抗体的混合物来治疗和预防狂犬病的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了使用能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体，优选使用能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的至少两种单克隆抗体的混合物来检测狂犬病或狂犬病相关病毒的方法。

发明详述

如本文中上文所述，狂犬病是对人最危险的疾病之一，如果不及时进行治疗会导致死亡。暴露后预防(PEP)方案优选涉及两种组分——提供主动免疫的一种组分，以及提供被动免疫的另一种组分。主动免疫由疫苗提供，疫苗通过激活患者/对象的免疫系统而发挥作用，并且以延迟的方式(即仅在接种疫苗的七天或其之后)产生针对所讨论的病毒的免疫。被动免疫由现成的抗体(例如多克隆抗体(HRIG、ERIG等)、单克隆抗体或其混合物)提供，所述抗体在注射到患者/对象中之后立即提供抗病毒保护。由于被动免疫接种携带中和减弱PEP的主动免疫接种以及置患者生命于风险之中的重大风险，因此根据被动免疫接种在患者中的循环半衰期，正确平衡被动免疫接种的剂量和被动免疫接种的类型在通过被动免疫接种提供足够量和类型的中和抗体中非常重要，所述被动免疫接种在早期提供保护/免疫，同时允许疫苗(主动免疫接种)一起不间断地实现其功能并为患者提供完整的免疫保护窗口。迄今为止，被动免疫接种主要由常规产品，即HRIG和ERIG提供，其分别以20IU/kg和40IU/kg使用。如先前所述，HRIG和ERIG因为携带病原体的潜在风险是不安全的。尝试开发为单克隆人源化/人抗体形式的更安全的替代产品已产生了能够仅提供非常低效力的抗体作为早期被动免疫接种(因为在较高剂量下它们最终中和主动免疫接种)的产品。因此，需要比常规产品更安全并且还提供相当的效力的被动免疫接种产品。

本发明提供了鼠单克隆抗体或至少两种鼠单克隆抗体的混合物作为狂犬病或狂犬病相关病毒暴露的PEP的被动免疫接种组分，以及疫苗作为主动免疫接种组分。根据本发明的鼠单克隆抗体或至少两种鼠单克隆抗体的混合物可以以比HRIG或人单克隆抗体或人源化单克隆抗体的批准剂量更高的剂量给予，而不会显著中和作为PEP一部分给予的抗狂犬病疫苗提供的主动免疫接种。根据本发明的鼠单克隆抗体或至少两种鼠单克隆抗体的混合物可以以大于20IU/kg的剂量，优选以20IU/kg至100IU/kg的剂量给予。本发明的抗体或混合物不会显著中和抗狂犬病疫苗提供的主动免疫接种，该抗狂犬病疫苗作为PEP的一部分以大于20IU/kg的剂量，优选以20IU/kg至100IU/kg的剂量给予。因此，用于PEP的根据本发明的鼠单克隆抗体或至少两种鼠单克隆抗体的混合物允许主动免疫接种以产生并维持针对狂犬病和狂犬病相关病毒的有效免疫应答。根据本发明的疫苗是本领域已知的抗狂犬病疫苗。本发明提供了能够结合并中和狂犬病和狂犬病相关病毒的鼠单克隆抗体或至少两种鼠单克隆抗体的混合物，其用于狂犬病和狂犬病相关病毒暴露的PEP。

单克隆抗体mAb A和mAb B：

根据本发明的能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体包含含有以下的HCVR：含有SEQ ID NO：1中所示多肽的CDRH1、含有SEQ ID NO：2中所示多肽的CDRH2区以及含有SEQ ID NO：3中所示多肽的CDRH3区。根据本发明的能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体包含含有以下的LCVR：含有SEQ ID NO：4中所示多肽的CDRL1、含有SEQ ID NO：5中所示多肽的CDRL2区以及含有SEQ ID NO：6中所示多肽的CDRL3区。

根据本发明的能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体包含含有SEQ ID NO：7中所示多肽的HCVR。

根据本发明的能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体包含含有SEQ ID NO：8中所示多肽的LCVR。

根据本发明的能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体包含含有SEQ ID NO：9中所示多肽的重链。根据本发明的能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体包含含有SEQ ID NO：10中所示多肽的轻链。

包含分别在作为重链和轻链的SEQ ID NO：9和10中所示多肽的单克隆抗体在本文中被称为mAb A。mAb A包含如分别在SEQ ID NO.7和8中所示的HCVR和LCVR的氨基酸序列。此外，mAb A包含如分别在SEQ ID NO.1、2和3中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列。此外，mAb A包含如分别在SEQ ID NO.4、5和6中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列。

根据本发明的能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体包含含有SEQ ID NO：11中所示多肽的重链。

根据本发明的能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体包含含有SEQ ID NO：12中所示多肽的轻链。

包含分别在作为重链和轻链的SEQ ID NO：11和12中所示的多肽的单克隆抗体在本文中被称为mAb B。

优选地，mAb A和mAb B是根据本发明的鼠抗体。

此外，本发明提供了两种或更多种单克隆抗体的混合物。优选地，本发明提供了能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的至少两种单克隆抗体(即mAb A和mAb B)的混合物。优选地，混合物包含能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的等效量的抗体。根据本发明的两种抗体之一是包含如分别在SEQ ID NO.7和8中所示HCVR和LCVR的氨基酸序列的单克隆抗体。根据本发明的第二单克隆抗体是包含如分别在SEQ ID NO：11和12中所示重链和轻链的氨基酸序列的单克隆抗体。

优选地，根据本发明的混合物包含：具有分别含有SEQ ID NO.9和10中所示多肽的重链和轻链的一种单克隆抗体，以及具有分别含有SEQ ID NO.11和12中所示多肽的重链和轻链的第二单克隆抗体。

用于混合物制备的单克隆抗体基于例如以下的标准选择：结合特异性、狂犬病病毒属的中和谱、生物活性、中和效力等以及工业可行性。多种狂犬病病毒属毒株从多个地理区域中的特定物种分离。例如，包括来自亚洲(印度、菲律宾和泰国等)、非洲(北非、撒哈拉以南非洲等)和新世界的狗以及来自南非的獴的RABV(基因型1)。

主要地，包括来自亚洲(印度、菲律宾和泰国等)、非洲(北非、撒哈拉以南非洲等)和新世界的狗以及来自南非的獴的RABV(基因型1)。此外，还测试了抗体针对狂犬病相关病毒，即EBLV-1、-2(基因型5、6)、ABLV(基因型7)、杜文海格病毒(Duvenhage virus)(基因型4)、伊尔库特病毒(Irkut virus)、苦盏(Khujand)和阿拉万(Aravan)的中和能力。

病毒中和用狂犬病和狂犬病相关病毒CVS 11、SAD B19、PV、Kelev、EBLV1、EBLV2、ABV、杜文海格、伊尔库特、阿拉万和苦盏进行。病毒中和还用来自以下的狂犬病和狂犬病相关分离株进行：欧洲狐(European Fox)、土耳其狗(Dog Turkey)、埃塞俄比亚狗(DogEthiopia)、印度狗(Dog India)、墨西哥狗(Dog Mexico)、萨拉热窝狼(Wolf Sarajevo)、USA山猫(Bobcat-USA)、东欧狐(East European fox)、极地狐(Polar fox)、阿塞拜疆狗(Dog Azerbaijan)、尼泊尔狗(Dog Nepal)、SE US浣熊(Raccoon，SE US)、TX灰狐(Gray foxTX)、阿拉斯加北极狐(Arctic fox Alaska)、SC US臭鼬(Skunk SC US)、CA臭鼬(SkunkCA)。

如在本文中下文提供的实施例中所提及的，进行快速荧光灶抑制测试(RFFIT)或荧光抗体病毒中和测试(FAVN)测定以研究广谱的狂犬病病毒属毒株的中和。

所述抗体在可包含表达载体和宿主细胞系的表达系统中产生。技术人员已知的任何表达载体可用于本发明，并且表达载体的选择取决于所选择的宿主细胞的性质。在宿主细胞中引入载体可通过但不限于磷酸钙转染、病毒感染、DEAE右旋糖酐介导的转染、脂质体转染或电穿孔来实现，并且技术人员可选择和使用适合于所使用的表达载体和宿主细胞的引入方法。载体包含表达抗体所需的所有基本元件。优选地，载体包含一种或更多种可选择标志物，但不限于此，并且也可使用不包含可选择标志物的载体。

本发明提供了包含转化到宿主细胞中以产生本发明单克隆抗体的表达载体的宿主细胞。在本发明中，宿主细胞可包含哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细菌来源的细胞，但不限于此。哺乳动物细胞可选自以下但不限于此：CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、Bowes黑素瘤细胞(Bowes melanoma cell)、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK 293细胞和HEK293T细胞。技术人员已知的合适的哺乳动物宿主细胞可用于开发本发明的抗体及其混合物。优选地，用于产生本发明抗体的宿主细胞是来源于SP2/O的宿主细胞。

技术人员还可使用包含融合细胞的另一种表达系统，其中将包含表达本发明单克隆抗体氨基酸序列的核苷酸序列的一种宿主细胞与另一种宿主细胞融合以开发表达系统。用于产生本发明的能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的抗体的方法，其主要包括：i)培养表达能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体的宿主细胞；以及ii)分离并回收在所述宿主细胞中表达的能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体。

培养表达能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体的宿主细胞优选地包括在本领域已知的合适培养基中通过Sp2/0细胞培养方法产生单克隆抗体。单克隆抗体的表达以组成性方式发生，并且以可溶性形式被细胞分泌。

分离和回收在所述宿主细胞中表达的能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体主要包括细胞澄清、与其他合适的色谱技术和/或过滤技术组合的亲和色谱法以制备目标单克隆抗体的经纯化的原料药物质。测试了经纯化的单克隆抗体或其混合物制剂对多种狂犬病病毒属毒株的中和。

本发明还提供了包含能够结合并中和狂犬病和狂犬病相关病毒的单克隆抗体、优选至少两种单克隆抗体的混合物以及可药用载体或赋形剂的稳定的药物组合物。优选的赋形剂是缓冲剂、盐和表面活性剂。配制和制备最终的原料药产品的合适赋形剂可由技术人员选择。根据本发明的药物组合物包含单克隆抗体或至少两种单克隆抗体的混合物的治疗效力。所述治疗效力在1IU/mL至5000IU/mL，优选100IU/mL至3000IU/mL的范围内。根据本公开内容的治疗效力包括在所提及范围(即1IU/mL至5000IU/mL)之间的各整数和非整数数字。例如，所述范围包括10IU/mL、25IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL、1000IU/mL、1200IU/mL、2000IU/mL、3000IU/mL、4000IU/mL和5000IU/mL。根据本发明的抗体的混合物可包含所述治疗范围内的每种单克隆抗体的治疗效力。优选地，抗体混合物包含在所述治疗范围内的治疗量、优选等效量的每种单克隆抗体。根据本发明的抗体的优选治疗效力为100IU/mL至3000IU/mL。在一个实施方案中，根据本发明的混合物的优选治疗效力为400IU/mL至1500IU/mL。更优选地，根据本发明的抗体的治疗效力为150IU/mL或300IU/mL或600IU/mL。更优选地，根据本发明的混合物的治疗效力为300IU/mL或600IU/mL或1200IU/mL。本发明的预防性和治疗性组合物在制造和储存条件下是无菌且稳定的。其可以是溶液并且可在递送之前或递送时添加和/或混合适当的可药用赋形剂以提供单位剂量的可注射形式。或者，本发明的组合物可以是可在递送之前或递送时在适当的可药用赋形剂中重构的冻干形式。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是冷冻干燥。“冻干或冷冻干燥的组合物”是通过冻干或冷冻干燥过程制备的剂型。冻干用文献中已知的涉及例如冷冻、退火、初次干燥和二次干燥的步骤的常规冻干技术进行。

根据本发明的能够结合并中和狂犬病或狂犬病相关病毒的单克隆抗体、优选至少两种单克隆抗体的混合物的组合物可用于治疗和预防狂犬病，优选用于咬伤后预防。研究了根据本发明的单克隆抗体或其混合物，以检查狂犬病病毒中和活性。抗体中和狂犬病或狂犬病相关病毒的效力通过RFFIT、与“抗狂犬病免疫球蛋白，人WHO国际标准”(RAI)或针对所述国际标准的经验证的内部参考标准进行比较来确定。RFFIT测定可用于在早期(被动免疫接种)和后期(主动免疫接种)两种情况下确定针对狂犬病或狂犬病相关病毒的抗体。

本发明的预防性和治疗性组合物的施用途径可分为经口途径和肠胃外途径。优选的施用途径是渗透到暴露部位中及其周围。任选地，在远离伤口部位的部位处肌内注射剩余体积，但不限于此。

发现单克隆抗体和至少两种单克隆抗体的混合物具有中和多种狂犬病或狂犬病相关病毒的能力，并因此可用于在感染有狂犬病或狂犬病相关病毒的患者和动物中治疗和预防狂犬病。优选地，单克隆抗体和两种单克隆抗体的混合物可在被患狂犬病的动物咬伤之后在暴露区域周围直接施用。任选地，剩余体积在身体的不同部位肌内施用。优选地，抗体混合物包含本发明的mAb A和mAb B。

本发明的预防性和治疗性抗体的剂量选自1IU/Kg至100IU/Kg。本发明的预防性和治疗性抗体的剂量的优选范围为10IU/Kg至80IU/Kg。更优选地，本发明的预防性和治疗性抗体的剂量为40IU/Kg。在一个实施方案中，根据本发明的预防性和治疗性混合物的剂量选自1IU/Kg至100IU/Kg。优选地，根据本发明的预防性和治疗性混合物的剂量选自10IU/Kg至80IU/Kg。更优选地，根据本发明的预防性和治疗性混合物的剂量为40IU/Kg。

本发明的预防性和治疗性抗体的剂量方案包括施用与抗狂犬病疫苗组合的本发明的抗体。根据本发明的抗狂犬病疫苗可以是在市场上可获得的或在临床开发中的抗狂犬病疫苗。例如，根据本发明的抗狂犬病疫苗可选自Imovax、Rabavert、Rabipur、Rabivax、Vaxirab N、Abhayrab、Indirab、Verorab、SPEEDA等。这些是在市场上可获得的抗狂犬病疫苗的品牌名称。在一个优选实施方案中，本发明的抗体作为紧急程序无延迟地施用。其也可在施用第一疫苗剂量之后多至7天注射。在一个优选实施方案中，本发明的抗体或混合物可用于狂犬病和狂犬病相关病毒暴露的PEP。更优选地，本发明的抗体或混合物与抗狂犬病疫苗组合使用，以用于狂犬病和狂犬病相关病毒暴露的PEP。

本发明中使用的分析方法：

用于效力和RVNA效价确定的快速荧光灶抑制测试(RFFIT)。

RFFIT测定在96孔组织培养板中进行。将固定剂量的CVS-11与受试物质和参考物质的1∶2系列稀释物的每一种一起孵育。在这样孵育90分钟之后，将受试物质和参考物质以及CVS-11病毒添加至BHK-21细胞上，并将其在5％CO₂培养箱中于37℃下孵育另外的22±2小时。在孵育期结束时，将细胞单层洗涤并用80％丙酮固定。在每个系列稀释下存在的未被中和的病毒通过以下来检测：通过使用FITC缀合的针对狂犬病病毒核蛋白的抗体鉴定被剩余病毒感染的细胞，并在荧光显微镜下计数发荧光的被感染细胞。RVNA效价如下所示计算：

RVNA效价的计算

在此，通过以下非限制性实施例举例说明本发明，所述实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：单克隆抗体mAbA活性药物物质的制造

mAbA单克隆抗体的药物物质制造过程涉及——

-上游Sp2/0细胞培养过程，以及

-下游纯化过程。

产生mAb A单克隆抗体的上游培养过程

在存在无动物源的培养基和饲养组分的情况下，在Sp2/0细胞培养过程中通过表达系统的宿主细胞产生mAb A单克隆抗体。包含血清组分的培养基也可用于产生所述抗体。上游的每个批次产生均是以带有mAb A多核苷酸序列的Sp2/0细胞的主细胞库(MCB)或工作细胞库(WCB)小瓶内容物的复苏开始。在细胞库小瓶复苏之后，进行了一系列接种发育步骤以产生具有足够数目的细胞的最终接种物，并将其接种到生产生物反应器中。生物反应器中的细胞培养过程以具有多种在线和离线控制参数的良好控制的方式进行，来以组成性方式表达mAb A单克隆抗体。蛋白质以可溶性形式被细胞分泌。

产生了包含单克隆抗体的组合物的多个批次。在含有液体细胞培养基的200L生物反应器中培养mAb A的接种物。由这些核酸编码的成熟抗体是mAb A，并且包含SEQ ID NO：9中所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：10中所示的轻链氨基酸序列。当需要时，通过使用CO2气体和/或碳酸氢钠将pH维持在7.0±0.3来在受控的环境中进行细胞培养。通过鼓入空气和/或氧气并通过控制生物反应器中的搅拌速度，将溶解氧浓度维持在15±5％的饱和度。生物反应器在约36.0℃至约37.0℃的温度下运转。

生长培养基包含以下组分：

组分浓度/升

BD CELLTM MAB ACF 12.860gm

将细胞在上述条件下培养两天，自第2天起，开始饲养并继续直至批次结束。以下培养基组分作为普通饲料进料至细胞培养基——

培养持续时间为约7至9天。体外细胞龄(从主细胞库初始解冻至收获的培养天数)为26天或更短。在这之后，通过离心和深层过滤细胞培养基来收获澄清的细胞培养物上清液。然后重新调节(recondition)该澄清的上清液以与下一纯化柱平衡条件基本上相匹配。然后使上清液进行蛋白a色谱法，并允许杂质从该色谱柱中流出。

获得mAb A单克隆抗体药物物质的下游纯化过程

mAb A单克隆抗体的纯化过程用包括细胞澄清、重新调节、色谱法、病毒灭活、病毒清除和膜超滤-渗滤的数个单元操作进行。通过色谱法的纯化涉及多种相互作用色谱技术，例如亲和色谱法以及其他合适的色谱法和过滤技术。病毒灭活在低pH条件下进行一段时间，并且病毒清除通过纳滤进行。重新调节和/或缓冲液更换通过常规的膜超滤-渗滤进行。

在纯化过程结束时，将经纯化的mAb A单克隆抗体通过0.2μm滤器无菌过滤，并将其在合适的容器密闭系统中于冷冻条件下储存。整个纯化过程用与mAb A单克隆抗体及其纯化过程有关的合适的物理和理化参数来监测和控制。当通过分析型高效尺寸排阻色谱法进行评估时，发现mAb A药物物质显示出大于99％的纯度。

实施例2：mAb B单克隆抗体活性药物物质的制造

mAb B单克隆抗体的药物物质制造过程涉及——

-上游Sp2/0细胞培养过程，以及

-下游纯化过程。

产生mAb B单克隆抗体的上游培养过程

在存在无动物源的培养基和饲养组分的情况下，在细胞培养过程中通过表达系统Sp2/0的宿主细胞产生mAb B单克隆抗体。包含血清组分的培养基也可用于产生所述抗体。上游的每个批次产生均是以带有mAb B多核苷酸序列的Sp2/0细胞的主细胞库(MCB)或工作细胞库(WCB)小瓶内容物的复苏开始。在细胞库小瓶复苏之后，进行了一系列接种发育步骤以产生具有足够数目的细胞的最终接种物，并将其接种到生产生物反应器中。生物反应器中的细胞培养过程以具有多种在线和离线控制参数的良好控制的方式进行，来以组成性方式表达mAb B单克隆抗体。蛋白质以可溶性形式被细胞分泌。

产生了包含单克隆抗体的组合物的多个批次。在含有液体细胞培养基的200L生物反应器中培养mAb B的接种物。由这些核酸编码的成熟抗体是mAb B，并且包含SEQ ID NO：11中所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：12中所示的轻链氨基酸序列。当需要时，通过使用CO2气体和/或碳酸氢钠将pH维持在7.0±0.3来在受控的环境中进行细胞培养。通过鼓入空气和/或氧气并通过控制生物反应器中的搅拌速度，将溶解氧浓度维持在30±10％的饱和度。生物反应器在约36.0℃至约37.0℃的温度下运转。

生长培养基包含以下组分：

组分浓度/升

BD CellTM MAb ACF 12.860gm

将细胞在上述条件下培养两天。自第2天起，开始饲养并继续直至批次结束。以下培养基组分作为普通饲料进料至细胞培养基——

生长培养基包含以下组分：

培养持续时间为约5至7天。体外细胞龄(从主细胞库初始解冻至收获的培养天数)为33天或更短。在这之后，通过离心和深层过滤细胞培养基来收获澄清的细胞培养物上清液。然后重新调节该澄清的上清液以与下一纯化柱平衡条件基本上相匹配。然后使上清液进行蛋白A色谱法，并允许杂质从该色谱柱中流出。

获得mAb B单克隆抗体药物物质的下游纯化过程

mAb B单克隆抗体的纯化过程用包括细胞澄清、重新调节、色谱法、病毒灭活、病毒清除和膜超滤-渗滤的数个单元操作进行。通过色谱法的纯化涉及多种相互作用色谱技术，例如亲和色谱法以及其他合适的色谱法和过滤技术。病毒灭活在低pH条件下进行一段时间，并且病毒清除通过纳滤进行。重新调节和/或缓冲液更换通过常规的膜超滤-渗滤进行。

在纯化过程结束时，将经纯化的mAb B单克隆抗体通过0.2μm滤器无菌过滤，并将其在合适的容器密闭系统中于冷冻条件下储存。整个纯化过程用与mAb B单克隆抗体及其纯化过程有关的合适的物理和理化参数来监测和控制。当通过分析型高效尺寸排阻色谱法进行评估时，发现mAb B药物物质显示出大于99％的纯度。

实施例3：包含等效抗体的抗体混合物的制备

为了制备包含等效量的两种抗体的抗体混合物，通过进行RFFIT测试，为mAb A和mAb B的经纯化的药物物质指定以IU/mg计的效力值。通过含有氯化钠和聚山梨酯的pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液，基于浓度(mg/mL)稀释单独的药物物质mAb A和mAb B，以达到以IU/mL计的相似效力值。为了制备包含等效抗体的抗体混合物，将经稀释的mAb A和mAb B的药物物质二者适当混合。

实施例4：单克隆抗体混合物的制造

通过在存在含有氯化钠和聚山梨酯的pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液的情况下混合等效量的mAb A和mAb B单克隆抗体药物物质来制备抗体混合物。在合适的容器中以逐步的方式进行复合(compounding)。控制在复合的不同阶段时溶液的pH，并彻底进行溶液的混合。在复合完成之后，取出配制的原料的等分试样，并对pH和渗量进行分析。对于最终配制的原料的生物负荷降低和无菌过滤，使用0.2μm灭菌级滤器，然后填充到玻璃小瓶或注射器中。在原料过滤之前(pre)和之后(post)测试滤器完整性。通过使用泵进行填充，并在整个填充过程中按重量计检查填充体积。在无菌条件下同时进行填充的初级容器的在线加塞(on-line stoppering)。在加塞之后，进行翻转密封(flip-off sealing)。由此制备的最终产品提供了稳定的药物组合物，发现其在规定的容器密闭系统中在实时温度储存条件下保持稳定至少36个月。

实施例5：mAb A和mAb B的体外研究

在多种实验设置中，基于对从特定宿主物种和地理区域分离的RABV和狂犬病相关病毒的选择，测量所选mAb候选物的体外交叉反应性。主要地，包括来自亚洲(印度、菲律宾和泰国等)、非洲(北非、撒哈拉以南非洲等)和新世界的狗的RABV(基因型1)。另外，包括来自南非的獴的RABV(基因型1)。此外，测试了mAb(mAb A和mAb B)针对狂犬病相关病毒(例如，EBLV-1、EBLV-2(基因型5、6)、ABLV(基因型7)、杜文海格病毒(基因型4)分离物种，包括伊尔库特病毒、苦盏和阿拉万)的中和能力。

将NA细胞的单层用所选的RABV和狂犬病相关病毒毒株在5％CO₂中于37℃下以0.1的感染复数感染1小时。然后去除病毒接种物，向细胞添加新鲜培养基，并随后将细胞在0.5％CO₂中于37℃下孵育72小时。随后，收集培养物上清液并对BHK 21细胞进行滴定。进行多至三次传代以获得足够的病毒效价。将病毒在-80℃下储存，直至进一步使用。

使用恒定病毒和不同的mAb方法方式对BHK 21细胞进行快速荧光灶抑制测试(RFFIT)或荧光抗体病毒中和测试(FAVN)测定。将每种mAb(经纯化的或上清液)进行系列稀释(10.0至0.03IU/ml)，并将其与10⁴FFU/ml的待测试的RABV和狂犬病相关病毒一起孵育。为了确定每种mAb的中和效力，将通过mAb A和mAb B对受试病毒的100％降低与通过国际标准狂犬病免疫球蛋白(SRIG，2^nd人狂犬病免疫球蛋白制剂，国家生物标准与防治研究所(National Institute for Biological Standards and Control)，Potters Bar，UK)对相同受试病毒的100％降低进行比较。本文中使用的SRIG是也可称为HRIG的人来源狂犬病免疫球蛋白。在孵育24小时之后读出测试。

5.1通过所选mAb进行的病毒中和的体外研究

表1：使用17种RABV和狂犬病相关病毒进行的Mab A和SRIG的中和模式。封闭(灰色)框表示存在活病毒

#封闭框表示存在活病毒

表2：使用17种RABV和狂犬病相关病毒进行的Mab B和SRIG的中和模式。封闭(灰色)框表示存在活病毒

#封闭框表示存在活病毒

这两种mAb均作为从10IU/mL的效力开始直至0.03IU/mL稀释度的重悬的经纯化抗体进行测试。另外，发现所述抗体在其中和潜能上是互补的。该测试表明，对于病毒中和的广度，所选抗体与SRIG是可比较的。

5.2通过所选mAb进行的病毒中和的体外研究

在体外测试测定中，使用七种不同的RABV(2种实验室毒株和5种RABV野毒株)来确定每种mAb的中和效力。此外，病毒组中包括代表基因型4、5和6的4种不同的狂犬病相关病毒以及来自中亚和东西伯利亚的蝙蝠狂犬病病毒属的4种分离株[澳大利亚蝙蝠病毒(ABV)、阿拉万病毒(ARAV)、苦盏病毒(KHUV)和伊尔库特病毒(IRKV)]。

表3：使用RABV和狂犬病相关病毒进行的SRIG、mAb A和B的中和模式

#封闭框表示存在活病毒

候选mAb针对狂犬病和一些其他狂犬病病毒属存在广谱的体外交叉反应性。所有狂犬病和狂犬病相关病毒均被单克隆抗体的任一者中和。另外，发现所述抗体在其中和潜能上是互补的。该测试表明，对于病毒中和的广度，所选抗体与SRIG是可比较的。数据表明，所述抗体与SRIG在其中和不同的狂犬病和RABV(如狂犬病病毒属)的能力之间具有相似性。

5.3通过mAb A和mAb B的混合物、HRIG和ERIG进行的病毒中和的体外研究

进行了针对街狂犬病病毒分离株和CVS毒株的实验。

表4：mAb混合物、HRIG和ERIG的中和模式

发现mAb A和B的混合物中和所有分离株，类似于通过HRIG(人狂犬病免疫球蛋白制剂)和ERIG(马狂犬病免疫球蛋白制剂)的中和。

实施例6：mAb混合物的体内效力研究

6.1 mAb混合物、ERIG和HRIG的体内效力研究

在该研究中，使用小鼠作为动物模型。将经病毒攻击的动物分为5个研究组：1)注射生理盐水的对照组；2)注射0.2IU/小鼠的mAb混合物；3)注射0.4IU/小鼠的mAb混合物；4)注射0.2IU/小鼠的HRIG；5)注射0.4IU/小鼠的ERIG。

在该研究中，使用CVS病毒和街毒的10种毒株来攻击动物。以0.2IU/小鼠和0.4IU/小鼠的两种剂量施用mAb混合物以与相似剂量的HRIG和ERIG进行比较。基于HRIG(20IU/Kg)和ERIG(40IU/Kg)的推荐剂量计算待测试mAb的稀释度。在第4组中将每只小鼠注射0.2IU/小鼠的HRIG，并且在第5组中注射0.4IU/小鼠的ERIG。以分别在第2组和第3组中的剂量0.2IU/小鼠和0.4IU/小鼠二者测试mAb混合物。

用每种所述病毒的100LD₅₀攻击具有8只小鼠的每个组。在病毒攻击1小时之后，对照组接受与病毒接种的相同部位上接种的100μL生理盐水。四个组中的其余组接受在接种了病毒的相同区域中渗入的mAb稀释物之一。使小鼠保持处于观察下1个月。

表7：mAb混合物、ERIG和HRIG在经病毒攻击的小鼠中的动物研究

表7中提供的结果表明，在用抗狂犬病单克隆抗体(HRIG、ERIG和mAb混合物)处理的研究组中观察到100％的存活率。而在用CVS攻击的对照组中，观察到100％死亡率。

还证明了本发明的mAb混合物与当前批准的抗体(HRIG和ERIG)一样强效。

6.2 mAb混合物和HRIG的体内效力研究

为了建立针对人中的合适临床研究设计的PK/PD相关性，进行了经狂犬病病毒(CVS-11)攻击的仓鼠中的体内效力研究。

效力确定基于在用等剂量的受试样品mAb混合物和标准HRIG(Kamrab，KamadaLtd.，Beit-Kama，Israel)处理之后，狂犬病病毒致死剂量下存活的仓鼠数目。

将研究动物基于其体重随机化并分为不同的处理组。将经病毒攻击的动物分为以下三组(每组10只动物)：1)注射单独的CVS-11病毒的组；2)独立注射CVS-11病毒和抗狂犬病mAb混合物的组；3)注射CVS-11病毒和标准HRIG(Kamrab，Kamada Ltd.，Beit-Kama，Israel)的组。

将具有已知LD₅₀效价的狂犬病病毒制剂适当稀释，并将200μL施用到每只仓鼠的右腓肠肌中。在饲养条件下，将抗狂犬病mAb混合物和标准Kamrab的配制溶液在6小时时于病毒注射的相同部位处施用到限定的组中。所选择的剂量水平为15IU/仓鼠，以使注射部位的剂量体积最小化(约100μL)。每天观察仓鼠的狂犬病的任何临床体征，例如麻痹或死亡。在观察到狂犬病病毒感染的任何体征之后，通过二氧化碳窒息使动物安乐死。从病毒攻击起30天之后检查存活％。研究结果示于表8中。

表8：在CVS-11病毒攻击6小时之后在无疫苗的情况下mAb混合物和HRIG给药的动物研究

进行了与HRIG(Kamrab，Kamada Ltd.，Beit-Kama，Israel)进行比较的mAb混合物的体内效力研究，以表明mAb混合物在经狂犬病病毒攻击的仓鼠中的病毒中和潜能。在该研究中，在病毒攻击之后6小时处理动物的情况下，本发明的mAb混合物显示出90％存活。其优于通过HRIG(Kamrab，Kamada Ltd.，Beit-Kama)的50％存活。

实施例7：mAb混合物的III期临床研究

包含mAb A和mAb B的混合物的效力在随机、多中心、开放标签、比较器受控的III期人临床研究中进行研究，以在PEP背景中评价混合物与HRIG的效力和安全性并对其进行比较，其中二者均与抗狂犬病疫苗组合施用。

该研究包括具有来自疑似的患狂犬病动物的WHO III类暴露的308名对象，所述对象被平分为两个分支(arm)。在一个分支中，向对象给予与抗狂犬病疫苗(VaxiRab N；Cadila Healthcare Ltd.Ahmedabad，India)组合的mAb混合物(40IU/kg)；并且在另一分支中，给予与抗狂犬病疫苗一起的HRIG(

(20IU/kg，Sanofi Pasteur SAFrance))。

在这两个分支中，将所比较的药物直接施用于被患狂犬病的动物咬伤的伤口周围区域(单个部位/多个部位)，并且剩余体积在身体的不同部位肌内施用。按照针对狂犬病疫苗接种的埃森方案(Essen regimen)(在第0、3、7、14和28天的五个肌内剂量)，将这两种药物均在第0天与抗狂犬病疫苗组合施用。对于每个对象，随访该研究84天。

结果：

就在早期时间点(第3和7天)和后期时间点(第14、28、42和84天)两种情况下评估的RVNA效价而言，发现两种药物Mab混合物和HRIG至少是可比较的。该研究表明，mAb混合物像HRIG一样，提供了完整的保护窗口，即在整个研究持续时间中未显著中和抗狂犬病疫苗。此外，与HRIG相比，在mAb混合物分支中在第28、42和84天观察到的后期时间点效价更高，从而确定了与人来源的多克隆抗体(HRIG)相比，鼠mAb混合物对疫苗(主动免疫接种)的中和更少，表明在PEP背景中鼠单克隆抗体的优点超过人抗体。

通过引用并入

本文中提及的专利文件和科学文章中的每一个的全部公开内容均出于所有目的通过引用并入。

等同方案

本发明可在不脱离其精神或基本特征的情况下以其他特定形式体现。因此，前述实施方案在所有方面应被认为是举例说明性的，而不是限制本文中所述的发明。因此，本发明的范围通过所附权利要求书而不是通过前述说明书指示，并且在权利要求书的等同含义和范围内的所有变化均旨在包括在其中。

序列表

<110> Cadila Healthcare Limited

<120> 抗狂犬病单克隆抗体及其混合物

<130> CHL-PCT0794

<150> 201821041598

<151> 2018-11-02

<160> 12

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 鼠单克隆抗体(mAb A的CDRH1)

<400> 1

Ser Ser Trp Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 鼠单克隆抗体(mAb A的CDRH2)

<400> 2

Gln Thr His Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 鼠单克隆抗体(mAb A的CDRH3)

<400> 3

Glu Ser Gly Asp Gly Pro His Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 鼠单克隆抗体(mAb A的CDRL1)

<400> 4

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 鼠单克隆抗体 (mAb A的CDRL2)

<400> 5

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 鼠单克隆抗体(mAb A的CDRL3)

<400> 6

Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro His Thr

1 5

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 鼠单克隆抗体(mAb A的HCVR)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Trp Met His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Thr His Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ser Gly Asp Gly Pro His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 鼠单克隆抗体(mAb A的HCVR) (mAb A的LCVR)

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro His

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Thr Lys

100 105

<210> 9

<211> 445

<212> PRT

<213> 鼠单克隆抗体(mAb A的HC)

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Trp Met His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Thr His Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ser Gly Asp Gly Pro His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

115 120 125

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

130 135 140

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

195 200 205

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

210 215 220

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

290 295 300

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

305 310 315 320

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

340 345 350

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

355 360 365

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

385 390 395 400

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

405 410 415

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

420 425 430

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 10

<211> 214

<212> PRT

<213> 鼠单克隆抗体(mAb A的LC)

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro His

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Thr Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 11

<211> 455

<212> PRT

<213> 鼠单克隆抗体(mAb B的HC)

<400> 11

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly His

20 25 30

Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Ile Ile Trp Ala Asp Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ser Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Gly Asp Ile Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu

165 170 175

Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser

195 200 205

Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr

210 215 220

Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys

245 250 255

Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn

275 280 285

Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr

290 295 300

Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu

325 330 335

Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg

340 345 350

Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg

355 360 365

Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp

370 375 380

Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser

405 410 415

Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser

420 425 430

Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr

435 440 445

Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 12

<211> 214

<212> PRT

<213> 鼠单克隆抗体(mAb B的LC)

<400> 12

Asp Val Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Pro Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

Claims

1.单克隆抗体，其包含：

(a)含有SEQ ID NO：1中所示多肽的CDRH1；

(b)含有SEQ ID NO：2中所示多肽的CDRH2；

(c)含有SEQ ID NO：3中所示多肽的CDRH3；

(d)含有SEQ ID NO：4中所示多肽的CDRL1；

(e)含有SEQ ID NO：5中所示多肽的CDRL2；以及

(f)含有SEQ ID NO：6中所示多肽的CDRL3。

2.如权利要求1中所要求保护的单克隆抗体，其包含：

(a)含有SEQ ID NO：7中所示多肽的重链可变区，以及

(b)含有SEQ ID NO：8中所示多肽的轻链可变区。

3.如权利要求2中所要求保护的单克隆抗体，其包含：

(a)含有SEQ ID NO：9中所示多肽的重链，以及

(b)含有SEQ ID NO：10中所示多肽的轻链。

4.单克隆抗体，其包含：

(a)含有SEQ ID NO：11中所示多肽的重链，以及

(b)含有SEQ ID NO：12中所示多肽的轻链。

5.至少两种单克隆抗体的混合物，其中所述抗体之一是如权利要求1中所要求保护的单克隆抗体。

6.至少两种单克隆抗体的混合物，其中所述抗体之一是如权利要求4中所要求保护的单克隆抗体。

7.至少两种单克隆抗体的混合物，其中两种抗体是如权利要求1和权利要求4中所要求保护的单克隆抗体。

8.如任一前述权利要求中所要求保护的抗体，其是IgG同种型，优选IgG1或IgG2。

9.如任一前述权利要求中所要求保护的单克隆抗体，其是鼠单克隆抗体。

10.鼠单克隆抗体或至少两种鼠单克隆抗体的混合物，其用于狂犬病和狂犬病相关病毒暴露的PEP，其中所述抗体允许主动免疫接种以产生并维持有效的免疫应答。

11.如权利要求10中所要求保护的鼠单克隆抗体或至少两种鼠单克隆抗体的混合物，其选自权利要求1至9。

12.如任一前述权利要求中所要求保护的鼠单克隆抗体与抗狂犬病疫苗的组合，其用于狂犬病和狂犬病相关病毒暴露的PEP。

13.如任一前述权利要求中所要求保护的鼠单克隆抗体用于狂犬病和狂犬病相关病毒暴露的PEP的用途。

14.如任一前述权利要求中所要求保护的至少两种鼠单克隆抗体的混合物与抗狂犬病疫苗的组合，其用于狂犬病和狂犬病相关病毒暴露的PEP。

15.如任一前述权利要求中所要求保护的至少两种单克隆抗体的混合物用于狂犬病和狂犬病相关病毒暴露的PEP的用途。

16.组合物，其包含权利要求1至14中任一项所述的单克隆抗体或至少两种单克隆抗体的混合物，以及可药用载体。

17.如权利要求15中所要求保护的组合物，其包含选自缓冲剂、糖、多元醇、氨基酸、表面活性剂和聚合物的赋形剂。

18.如权利要求16中所要求保护的组合物，其包含选自柠檬酸盐缓冲剂、聚山梨酯80、氯化钠的赋形剂。

19.如权利要求15至17中所要求保护的组合物，其是冻干制剂。

20.如权利要求15中所要求保护的组合物，其中单克隆抗体或混合物的所述抗体之一以1IU/mL至5000IU/mL，优选100IU/mL至3000IU/mL，更优选150IU/mL或300IU/mL或600IU/mL存在。

21.如权利要求15中所要求保护的组合物，其中混合物以100IU/mL至150IU/mL，优选400IU/mL至1500IU/mL，更优选300IU/mL或600IU/mL或1200IU/mL存在。

22.如任一前述权利要求中所要求保护的单克隆抗体或至少两种单克隆抗体的混合物，其通过渗透到暴露部位中及其周围施用和/或在远离伤口部位的部位处肌内施用。

23.如任一前述权利要求中所要求保护的单克隆抗体或至少两种单克隆抗体的混合物，其以1IU/Kg至100IU/Kg，优选10IU/Kg至80IU/Kg，更优选40IU/Kg的剂量施用。

24.如任一前述权利要求中所要求保护的单克隆抗体或至少两种单克隆抗体的混合物，其在所述暴露之后立即开始施用直至所述暴露之后7天。

25.药盒，其包含如任一前述权利要求中所要求保护的单克隆抗体或至少两种单克隆抗体的混合物。

26.用于使用如任一前述权利要求中所要求保护的单克隆抗体或至少两种单克隆抗体的混合物诊断狂犬病的方法。

27.使用如任一前述权利要求中所要求保护的单克隆抗体或至少两种单克隆抗体的混合物检测狂犬病病毒的方法。

28.通过细胞培养方法制备如任一前述权利要求中所要求保护的抗体的方法，其包括：

i)培养表达能够结合并中和狂犬病病毒的单克隆抗体的表达系统的宿主细胞，优选Sp2/0细胞；以及

ii)分离并回收在所述宿主细胞中表达的能够结合并中和狂犬病病毒的单克隆抗体。

29.纯化如任一前述权利要求中所要求保护的抗体的方法，其通过合适的色谱法或纯化技术进行。