BR112021008240A2 - Anticorpo monoclonal, coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais, combinação de um anticorpo monoclonal ou de um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino e uma vacina antirrábica, uso de um anticorpo monoclonal ou de um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino, composição, conjunto, método, métodos para diagnosticar e detectar raiva e processos para a produção e purificação de um anticorpo - Google Patents
Anticorpo monoclonal, coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais, combinação de um anticorpo monoclonal ou de um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino e uma vacina antirrábica, uso de um anticorpo monoclonal ou de um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino, composição, conjunto, método, métodos para diagnosticar e detectar raiva e processos para a produção e purificação de um anticorpo Download PDFInfo
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Abstract
proteínas inseticidas. a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal de murino capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva. a mesma também proporciona um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais capazes de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva. de acordo com a presente invenção, o referido coquetel pode neutralizar a raiva e os vírus relacionados à raiva que é derivado a partir de espécies tais como morcegos, cães, vacas, mangustos, gambás, e lobos, e assim pode ser útil no tratamento de um paciente que foi potencialmente infectado por raiva ou pelos vírus relacionados à raiva derivados de uma ampla variedade de espécies. além disso, a presente invenção proporciona uma combinação de anticorpo monoclonal de murino ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais e vacina antirrábica para uso em pep de exposição com raiva ou os vírus relacionados à raiva.
Description
RAIVA E PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE UM ANTICORPO Campo da Invenção
[001] A presente invenção se refere a um anticorpo monoclonal capaz de se ligar e neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva. Mais especificamente, a mesma se refere a um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais capazes de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva.
Antecedentes da Invenção
[002] A raiva é uma doença zoonótica causada pelo vírus da raiva (RABV), o membro do tipo do gênero Lissavírus, e é responsável por > 55.000 mortes por ano em grande parte do mundo em desenvolvimento, onde a transmissão geralmente ocorre após a mordida de um cão infectado. Se não for tratado, o vírus infecta progressivamente os neurônios circundantes e se propaga no sistema nervoso central, levando, quase invariavelmente, à morte. A doença pode ser prevenida pela profilaxia pós- exposição (PEP), que consiste na administração da vacina RABV inativada associada à terapia com anticorpos passivos. Em uma terapia de anticorpo passivo padrão, imunoglobulinas policlonais da raiva (RIG), derivadas de fontes humanas imunizadas (HRIG) ou equinas (ERIG), são infundidas no local da ferida. (The Journal of Infectious Diseases 2014; 210: 200–8).
[003] Considerando que a raiva ou os vírus relacionados à raiva não podem ser neutralizados após terem entrado nos nervos periféricos no local da mordida, todas as atividades de profilaxia pós-mordida que atuam neutralizando o vírus devem ser realizadas apenas no local da mordida. As RIGs têm sido usadas para neutralizar o vírus na lesão antes que o vírus entre no nervo. É óbvio que ter mais quantidade de medicamento disponível no local da mordida proporcionará uma melhor chance de proteção do paciente.
[004] Como descrito acima, um regime de profilaxia pós-mordida padrão após uma mordida de animal com raiva envolve a administração de RIGs e vacina. As RIGs fornecem imunidade precoce contra o vírus de forma passiva, enquanto a vacina fornece imunidade posterior contra o vírus de forma ativa. Qualquer regime bem-sucedido deve manter o equilíbrio correto de i) RIGs que fornecem alta proteção anti-vírus da raiva na fase inicial, ou seja, imediatamente (72 horas) após a mordida do animal, enquanto ii) não deve neutralizar a vacina antirrábica (que também é administrada imediatamente após a mordida do animal) e, assim, desenvolvendo proteção antivírus da raiva por meio de imunidade ativa no paciente na fase tardia, ou seja, até o dia 42 ou mais.
[005] Dados de ensaios clínicos de ERIGs, que são soros antirrábicos policlonais derivados de cavalos obtidos de animais imunizados repetidamente, mostram que esses fármacos podem ser administradas até 40 IU/kg em humanos. Por outro lado, HRIGs que são soros antirrábicos policlonais derivados de doadores humanos obtidos de doadores humanos imunizados não podem ser administrados além de 20 IU/kg, pois uma dose mais elevada acaba neutralizando a vacina, falhando assim o próprio regime de profilaxia pós-mordida. (Bull. Wid Hlth Org., 1971 45, 303-315).
[006] Um regime ideal deve fornecer maiores quantidades de RIG no local da mordida para fornecer proteção de fase inicial, enquanto ainda permite que a vacina forneça proteção de fase tardia. A diferença nas doses entre as RIGs humanas e de equinos é que o paciente humano pode reconhecer facilmente as RIGs derivadas de cavalos como uma entidade estranha e, assim, aumentar uma resposta imunológica contra a própria RIG. Assim, uma grande quantidade de medicamento ERIG se torna disponível no local da mordida e não permanece no corpo por tempo suficiente, permitindo que a vacina forneça proteção de fase tardia. Por outro lado, as RIGs derivadas de humanos não são reconhecidas como entidade estranha e, portanto, o sistema imunológico do paciente não reage a ele, permitindo que a HRIG circule no paciente por um período mais longo de tempo e neutralizando a vacina se for administrada além de 20 IU/kg. Uma dose mais alta de 40 IU/kg de um HRIG falhou o regime em si.
[007] Além disso, provavelmente devido a uma razão semelhante, um anticorpo monoclonal humano recentemente aprovado para o regime de profilaxia pós- mordida da raiva foi aprovado para ser usado em 3,33 IU/kg. (Folheto do produto Rabishield®).
[008] Portanto, há uma necessidade de um anticorpo com uma meia-vida de circulação baixa, como um anticorpo não humano ou não humanizado, capaz de se ligar e neutralizar a raiva ou vírus relacionados à raiva como parte de um regime de profilaxia pós-mordida para raiva.
[009] Além disso, esses anticorpos derivados do soro muitas vezes sofrem de várias desvantagens, incluindo disponibilidade limitada, variação de lote a lote, alto custo, contaminação com agentes adventícios transmitidos pelo sangue e/ou risco de reações adversas. Por essas razões, a Organização Mundial da Saúde (OMS) incentiva o desenvolvimento e avaliação de produtos biológicos alternativos para substituição de RIG.
Uma dessas estratégias alternativas é oferecida por anticorpos monoclonais (mAbs) que são capazes de neutralizar uma ampla gama de isolados de RABV. Tanto as RIGs quanto os monoclonais são direcionados contra a proteína G viral, pois vários estudos demonstraram que os anticorpos antiproteína G fornecem proteção contra a raiva ou os vírus relacionados à raiva. A proteína G consiste em três campos antigênicos distintos. Os locais antigênicos I, II e III existem na glicoproteína do vírus da raiva que foram determinados com base na análise antigênica de variantes de glicoproteínas do vírus CVS- 11 usando 12 anticorpos monoclonais neutralizantes. (J, gen. Virol. (1983), 64, 843 - 851).
A glicoproteína (G) do vírus da raiva forma projeções superficiais através do envelope lipídico viral e é a única proteína capaz de induzir e reagir com o anticorpo neutralizante do vírus (VNA). Estudos estabeleceram que o G isolado é capaz de proteger os animais contra a raiva (J. gen. Virol. (1983), 64, 1649 - 1656; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 81,
7194 - 7198, novembro 1984). Os campos antigênicos na glicoproteína foram estudados usando mutantes resistentes à neutralização por anticorpos monoclonais. Três locais principais - Local I, II e III foram descritos nesta litroatura.
[010] Por concepção, as RIGs compreendem anticorpos anti-G dirigidos contra múltiplos epítopos na proteína G. Um anticorpo monoclonal pode se ligar a apenas um único epítopo na proteína G. Um produto que fornece imunidade passiva que compreende apenas um anticorpo monoclonal sofre do risco de um vírus da raiva mutante escapar do fármaco se o epítopo em questão foi perdido devido à mutação. Portanto, um coquetel de dois anticorpos monoclonais direcionados a dois epítopos distintos não sobrepostos na proteína G forneceria melhor proteção contra mutantes.
[011] O documento WO 2013048130 divulga um anticorpo antirrábica que se liga ao vírus da raiva. O referido pedido de patente divulga e ensina anticorpos monoclonais quiméricos, humanizados ou humanos. Tais anticorpos podem não ser administrados em altas doses para fornecer alta proteção antivírus da raiva na fase inicial devido a razões discutidas aqui acima relacionadas a RIGs de origem humana.
[012] Consequentemente, há uma necessidade urgente para o desenvolvimento de uma preparação de anticorpo monoclonal para o tratamento da raiva que possa ser produzida e fornecida em grandes quantidades por síntese cultural e que possa ter qualidade uniforme. Tal produto seria produzido a partir de bancos de células bem caracterizados e, portanto, livre do risco de infecções virais e infecções de outros agentes adventícios. Por ser um produto à base de anticorpo monoclonal, a quantidade absoluta de proteína administrada ao paciente como medicamento seria muito menor do que um medicamento à base de RIG policlonal e, portanto, apresenta menor risco de reações anafiláticas.
[013] Portanto, a presente invenção fornece, conforme descrito neste documento, uma preparação de anticorpos monoclonais capazes de se ligar em dois locais separados e neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva e ainda um coquetel de tal preparação compreendendo os referidos dois anticorpos monoclonais misturados com quantidades equipotentes para neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva.
Sumário da Invenção
[014] A presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal de murino capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva. A mesma também proporciona um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais capazes de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva.
[015] De acordo com a presente invenção, o referido coquetel pode neutralizar a raiva e os vírus relacionados à raiva que é derivado a partir de espécies tais como morcegos, cães, vacas, mangustos, gambás, e lobos, e assim pode ser útil no tratamento de um paciente que foi potencialmente infectado pela raiva ou os vírus relacionados à raiva derivados a partir de uma ampla variedade de espécies. Além disso, a presente invenção proporciona uma combinação de anticorpo monoclonal de murino ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos mono clonais e vacina antirrábica para uso em Profilaxia pós-exposição (PEP) de exposição a raiva ou vírus relacionados à raiva.
Breve Descrição da Figura
[016] A Figura 1 mostra o gráfico linear da concentração média de RVNA versus curvas de tempo após a administração do coquetel de vacina de mAb A e mAb B + vacina e Imogam® + vacina para pacientes com suspeita de mordedura de animal raivoso. O coquetel foi administrado na dose de 40 IU/kg, enquanto o Imogam® (HRIG) foi administrado na dose aprovada de 20 IU/kg. Após o dia 14, o coquetel da presente invenção mantém títulos médios de RVNA mais elevados em comparação com HRIG.
Lista de abreviações usadas na especificação desse documento:
[017] Abreviações de amino ácidos como usados no presente pedido são proporcionadas na Tabela abaixo: Abreviação Abreviação Full Name (3 Letra) (1 Letra) Alanina Ala A
Arginina Arg R
Asparagina Asn N
Aspartato Asp D
Cisteína Cys C
Glutamato Glu E
Glutamina Gln Q
Glicina Gly G
Histidina His H
Isoleucina Ile I
Leucina Leu L
Lisina Lys K
Metionina Met M
Fenilalanina Phe F
Prolina Pro P
Serina Ser S
Treonina Thr T
Triptofano Trp W
Tirosina Tyr Y
Valina Val V
Outras abreviações usadas no presente pedido:
ABV: Vírus do morcego australiano
BHK: Fibroblastos de rim de Hamster Bebê
CDRH1: Região de determinação complementar 1 de cadeia pesada
CDRH2: Região de determinação complementar 2 de cadeia pesada
CDRH3: Região de determinação complementar 3 de cadeia pesada
CDRL1: Região de determinação complementar 1 de cadeia leve
CDRL2: Região de determinação complementar 2 de cadeia leve
CDRL3: Região de determinação complementar 3 de cadeia leve
CHO: Ovário de Hamster chinês
CSO: Ovário de Cynoglossus Semilaevis
CVS: Desafio de Cepa de Vírus
DP: Produto de Fármaco
DS: Substância de Fármaco
EBLV: Lissavírus de morcego europeu
ERIGs: Imunoglobulinas da raiva de equino
FAVN: Neutralização do vírus do anticorpo fluorescente
FFU: Unidade de formação de fluorescência
FITC: Isotiocianato de fluoresceína
HC: Cadeia pesada
HCVR: Região variável de cadeia pesada
HEK: Rim de embrião humano
HeLa: Henrietta Lacks
HRIGs: Imunoglobulinas da raiva humana
LC: Cadeia leve
LCVR: Região variável de cadeia leve mAb A: Anticorpo monoclonal A mAb B: Anticorpo monoclonal B
MCB: Banco de células mestre
NA células: Células de neuroblastoma
PBS: Salina tamponada a fosfato
PEP: Profilaxia pós-exposição
RABV: Vírus da raiva
RFFIT: Teste rápido de inibição de foco fluorescente
RIGs: Imunoglobulinas da raiva
RVNA: Anticorpo de neutralização do vírus da raiva SRIG: Imunoglobulina da raiva padrão SV: Street Vírus WCB: Banco de células de trabalho Lista de Listagens de Sequências usadas no Relatório Descritivo: SEQ ID NO. 1: SSWMH (CDRH1 de mAb A) SEQ ID NO. 2: QTHPNSGYTNYNEKFKG (CDRH2 de mAb A) SEQ ID NO. 3: ESGDGPHWYFDV (CDRH3 de mAb A) SEQ ID NO. 4: KASQDVSTAVA (CDRL1 de mAb A) SEQ ID NO. 5: SASYRYT (CDRL2 de mAb A) SEQ ID NO. 6: QQHYSSPHT (CDRL3 de mAb A) SEQ ID NO. 7:
EWIGQTHPNSGYTNYNEKFKGKATLTVDTSSSTAYVDLSSLTSEDSAVYYCARESGDGP HWYFDVWGAGTAVTVSS (HCVR de mAb A) SEQ ID NO. 8:
IYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSSPHTFGGGTKLET K (LCVR de mAb A) SEQ ID NO. 9:
APQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGS YFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (HC de mAb A)
SEQ ID NO. 10:
KRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTD QDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (LC de mAb A) SEQ ID NO. 11:
KIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPV LDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYILKKTISRSPGK (HC de mAb B) SEQ ID NO. 12:
RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQ DSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (LC de mAb B) Definições
[018] O termo “coquetel” como usado nesse documento é uma mistura de pelo menos dois anticorpos monoclonais como duas substâncias fármaco ativas independentes. O coquetel de acordo com a presente invenção compreende preferivelmente uma mistura de mAb A e de mAb B. Preferivelmente, o referido coquetel é preparado no tampão de formulação. O coquetel é preparado por misturar quantidades terapêuticas, preferivelmente quantidades equipotentes dos dois materiais de substância de fármaco ativo de anticorpos monoclonais no tampão de formulação. Finalmente, o mesmo é formulado com outro(s) excipiente(s) farmacêutico(s) adequado(s) para preparar uma composição farmacêutica estável de anticorpos monoclonais antirrábica que pode ser usada para fins terapêuticos ou de tratamento.
[019] O termo “PEP” ou “profilaxia pós-exposição” como usado nesse documento inclui as etapas a seguir:
[020] 1. Todas as mordeduras, arranhões e campos de exposição RABV devem ser atendidos o mais rápido possível após a exposição; é necessária uma lavagem profunda e enxágue da lesão por aproximadamente 15 minutos, com sabão ou detergente e grandes quantidades de água. Quando disponível, uma preparação tópica contendo iodo, ou similarmente viricida, deve ser aplicada na lesão.
[021] 2. Uma série de injeções de vacina antirrábica deve ser administrada imediatamente após uma exposição como parte do componente ativo de imunização da PEP.
[022] 3. A RIG deve ser administrada para exposições graves de categoria III como parte do componente de imunização passiva da PEP.
[023] Vacina de raiva de acordo com a presente invenção pode incluir qualquer vacina antirrábica conhecida na técnica. A RIG de acordo com a presente invenção pode incluir anticorpo monoclonal de murino ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais.
[024] O termo “mAb A” como usado nesse documento é um anticorpo monoclonal que pode se ligar ao vírus da raiva ou aos vírus relacionados à raiva e neutralizar o mesmo. Um anticorpo monoclonal mAb A de acordo com a presente invenção que compreende um CDRH1 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 1, uma região CDRH2 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 2, uma região CDRH3 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 3, um CDRL1 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 4, uma região CDRL2 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 5 e uma região CDRL3 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 6. HCVR e região LCVR de mAb A de acordo com a presente invenção é um polipeptídeo determinado em
SEQ ID NO: 7 e um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 8, respectivamente. Além disso, cadeia pesada e cadeia leve de mAb A de acordo com a presente invenção é um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 9 e um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 10, respectivamente. Preferivelmente, mAb A de acordo com a presente invenção é um anticorpo monoclonal de murino. Em um dos aspectos, a presente invenção proporciona mAb A que compreende região constante de IgG1, preferivelmente IgG1 de murino. O mesmo se liga ao campo II na proteína G do envelope do vírus da raiva.
[025] O termo “mAb B” como usado nesse documento é um anticorpo monoclonal que pode se ligar ao vírus da raiva ou os vírus relacionados à raiva e neutralizar o mesmo. Um anticorpo monoclonal mAb B de acordo com a presente invenção que compreende uma cadeia pesada e cadeia leve de mAb B de acordo com a presente invenção é um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 11 e um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 12, respectivamente. Preferivelmente, mAb B de acordo com a presente invenção é um anticorpo monoclonal de murino. Em um dos aspectos, a presente invenção proporciona mAb B que compreende Região constante de IgG2b, preferivelmente IgG2b de murino. O mesmo se liga ao campo III na proteína G de envelope do vírus da raiva.
[026] O termo “anticorpo” como referido nesse documento inclui anticorpos totais e qualquer fragmento de ligação a antígeno (isto é, “porção de ligação a antígeno”) ou cadeias únicas dos mesmos. Um “anticorpo” se refere a uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cade4ias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto, ou uma porção de ligação a antígeno dos mesmos.
Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada nesse documento como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada nesse documento como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida de um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominada regiões de determinação complementar (CDR), intercalada com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, arranjadas a partir de amino-terminal ao carboxi-terminal na ordem a seguir: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, que incluem várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (C1q) do sistema complementar clássico. Em um aspecto preferido, o anticorpo de acordo com a presente invenção é um anticorpo de murino.
[027] Os termos “anticorpo monoclonal” ou “composição de anticorpo monoclonal” como usado nesse documento se refere a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma única especificidade de ligação e afinidade para um determinado epítopo.
[028] O termo "composição farmacêutica" se refere a preparações que estão em uma forma que permite que a atividade biológica dos ingredientes ativos seja inequivocamente eficaz. O termo "formulação farmacêutica" ou "composição farmacêutica" ou "composição" pode ser usado aqui de forma intercambiável. Veículos ou excipientes "farmaceuticamente aceitáveis" são aqueles que podem ser razoavelmente administrados a um indivíduo mamífero para fornecer uma dose eficaz do ingrediente ativo empregado.
[029] O termo "excipiente" se refere a um agente que pode ser adicionado a uma formulação para estabilizar a substância ativa do medicamento na forma formulada para ajustar e manter a osmolaridade e o pH das preparações farmacêuticas. Exemplos de excipientes comumente usados incluem, mas não estão limitados a, açúcares, polióis, aminoácidos, tensoativos e polímeros. Excipientes "farmaceuticamente aceitáveis" são aqueles que podem ser razoavelmente administrados a um mamífero para fornecer uma dose eficaz do ingrediente ativo empregado.
[030] Em um sentido farmacológico, no contexto da presente invenção,
uma "quantidade terapêutica" ou "quantidade eficaz" de um anticorpo se refere a uma quantidade eficaz na prevenção ou tratamento de um distúrbio para o tratamento do qual o anticorpo é eficaz.
[031] O termo "quantidade equipotente", de acordo com a presente invenção, se refere a uma quantidade de cada anticorpo que fornece a mesma potência em relação a outro anticorpo ou anticorpos presentes na preparação do coquetel. A potência de um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser medida em unidades internacionais. A potência dos anticorpos neutralizantes de vírus da raiva ou relacionados à raiva é determinada pelo método RFFIT em comparação com uma "Imunoglobulina Antirrábica, Padrão Internacional Humano da OMS" (RAI) ou um padrão de referência interno validado contra o referido padrão internacional.
[032] Os termos "paciente" e "indivíduo" são usados indistintamente e em seu sentido convencional para se referir a um organismo vivo que sofre ou está sujeito a uma condição que pode ser prevenida ou tratada pela administração de uma composição da presente invenção, e inclui animais. O termo "Animal" se refere a um animal humano ou não humano, incluindo, mas não se limitando a animais de fazenda, como gado, ovelhas, porcos, cabras e cavalos; mamíferos domésticos, como cães e gatos; animais de laboratório, incluindo roedores, como camundongos, ratos e porquinhos-da-índia; aves, incluindo aves domésticas, selvagens e de caça, como galinhas, perus e outras aves galináceas, patos, gansos e primatas não humanos, incluindo, mas não se limitando a macacos, chimpanzés e outras espécies de símios e macacos. O termo não denota uma determinada idade. Assim, indivíduos adultos, juvenis e recém-nascidos são de interesse.
[033] O termo “vírus da raiva” como usado nesse documento inclui raiva e os vírus relacionados à raiva. De acordo com a presente invenção, anticorpos de murino que podem se ligar ao campo II ou campo III da proteína G de qualquer vírus podem ser usados para o tratamento no qual a atividade do referido vírus é prejudicial.
[034] O termo “exposição” como usado nesse documento inclui mordidas, arranhões e lambidas por um animal raivoso.
[035] O termo “Imogam®” conforme usado aqui, é uma HRIG aprovada disponível no mercado. É conhecida de uma pessoa versada na técnica.
Realizações da Invenção
[036] Em uma realização, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal de murino para a PEP de exposição à raiva e vírus relacionados à raiva.
[037] Em uma realização preferida, a presente invenção proporciona coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino para a PEP de exposição à raiva e vírus relacionados à raiva.
[038] Em uma das realizações, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal de murino ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino que podem ser usados em uma dose mais elevada do que a dose aprovada de HRIG ou anticorpos monoclonais humanos ou anticorpos monoclonais humanizados. Em uma realização preferida, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal de murino ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino que podem ser usados em uma dose mais do que 20 IU/kg. Em uma realização mais preferida, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal de murino ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino que podem ser usados em uma dose entre 20 IU/kg a 100 IU/kg.
[039] Em uma outra realização, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal de murino ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino para a PEP de exposição à raiva e vírus relacionados à raiva em que o anticorpo ou um coquetel permite a imunização ativa para gerar e manter uma resposta imune efetiva.
[040] Em uma das realizações, a presente invenção proporciona uma combinação de um anticorpo monoclonal de murino e uma vacina antirrábica para a PEP de exposição à raiva e vírus relacionados à raiva.
[041] Em uma realização preferida, a presente invenção proporciona uma combinação de coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino e vacina antirrábica para a PEP de exposição à raiva e vírus relacionados à raiva.
[042] Em uma das realizações, a presente invenção proporciona o uso de anticorpo monoclonal de murino para a PEP de exposição à raiva e vírus relacionados à raiva.
[043] Em uma realização preferida, a presente invenção proporciona o uso de coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais para a PEP de exposição à raiva e vírus relacionados à raiva.
[044] Em uma realização, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva.
[045] Em uma das realizações, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo que codifica a sequência do anticorpo monoclonal.
[046] Em uma das realizações, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal que compreende um CDRH1 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO:1, uma região CDRH2 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 2, e uma região CDRH3 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 3.
[047] Em uma das realizações, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal que compreende uma região CDRL1 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO:4, uma região CDRL2 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 5, e uma região CDRL3 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 6.
[048] Em uma realização preferida, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal que compreende:
[049] CDRH1 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 1;
[050] CDRH2 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 2;
[051] CDRH3 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID
NO: 3;
[052] CDRL1 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 4;
[053] CDRL2 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 5; e
[054] CDRL3 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 6.
[055] Em uma realização, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal compreendendo HCVR que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 7.
[056] Em uma realização, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal compreendendo LCVR que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 8.
[057] Em uma realização preferida, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 7 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 8.
[058] Em uma realização, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia pesada que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 9.
[059] Em uma realização, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia leve que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 10.
[060] Em uma realização preferida, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal que compreende: (a) uma cadeia pesada que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 9 e (b) uma cadeia leve que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 10.
[061] Em uma realização, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia pesada que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 11.
[062] Em uma realização, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia leve que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 12.
[063] Em uma realização preferida, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal que compreende: (a) uma cadeia pesada que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 11 e (b) uma cadeia leve que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 12.
[064] Em uma realização preferida, a presente invenção proporciona um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais capazes de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva.
[065] Em mais realização preferida, a presente invenção proporciona um coquetel de dois anticorpos monoclonais mAb A e mAb B.
[066] Em uma outra realização, a presente invenção proporciona um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo que codifica a sequência do anticorpo monoclonal.
[067] Em uma realização, a presente invenção proporciona uma célula hospedeira transformada com o polinucleotídeo que codifica a sequência do anticorpo monoclonal.
[068] Em uma outra realização, a presente invenção proporciona um método de produzir o anticorpo monoclonal da presente invenção por cultivar a linhagem celular.
[069] Em uma realização adicional, a presente invenção proporciona uma composição que compreende um anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva.
[070] Em uma realização preferida, a presente invenção proporciona uma composição que compreende um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais capazes de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva.
[071] Em uma realização mais preferida, a presente invenção proporciona uma composição que compreende um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais capazes de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva em que um dos anticorpos monoclonais que compreende um CDRH1 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO:1, uma região CDRH2 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 2, e uma região CDRH3 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 3 e/ou que compreende uma região CDRL1 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO:4, uma região CDRL2 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 5, e uma região CDRL3 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 6.
[072] Em uma realização adicional, a presente invenção proporciona uma composição que compreende um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais capazes de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva em que um dos anticorpos monoclonais compreendendo HCVR que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 7 e/ou compreendendo LCVR que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 8.
[073] Em uma realização adicional, a presente invenção proporciona uma composição que compreende um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais capazes de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva em que um dos anticorpos monoclonais que compreende uma cadeia pesada que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 9 e/ou que compreende uma cadeia leve que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 10.
[074] Em uma das realizações preferidas, a presente invenção proporciona uma composição que compreende um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais capazes de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva em que um dos anticorpos monoclonais que compreende uma cadeia pesada que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 11 e/ou que compreende uma cadeia leve que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 12.
[075] Em uma realização preferida, a presente invenção proporciona uma composição que compreende um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais capazes de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva em que um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 9 e um segundo anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 11 e/ou um anticorpo que compreende uma cadeia leve que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 10 e segundo anticorpo que compreende uma cadeia leve que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 12.
[076] Em uma outra realização, a composição de acordo com a presente invenção compreende um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais e excipientes farmacêuticos. O coquetel de acordo com a presente invenção é como descrito nas realizações acima.
[077] Em uma das realizações, a presente invenção proporciona um processo de produzir anticorpo de acordo com o reivindicado em qualquer reivindicação precedente por método de cultura celular que compreende:
[078] cultivar a célula hospedeira que expressa anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva; e
[079] isolar e recuperar anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva expresso na referida célula hospedeira.
[080] Em uma outra realização, a presente invenção proporciona um processo de purificar anticorpo de acordo com o reivindicado em qualquer reivindicação precedente por técnica adequada de cromatografia ou de purificação.
[081] Em uma outra realização, a presente invenção proporciona um kit que compreende um anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva.
[082] Em uma realização preferida, a presente invenção proporciona um kit que compreende um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais capazes de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva.
[083] Em uma das realizações, a presente invenção proporciona um método para diagnosticar raiva usando o anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva, preferivelmente usando um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais capazes de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva.
[084] Em uma outra realização, a presente invenção proporciona um método de tratar e evitar raiva usando o anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva, preferivelmente usando um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais capazes de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva.
[085] Em uma das realizações, a presente invenção é para proporcionar um método de detectar raiva ou os vírus relacionados à raiva usando o anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva, preferivelmente usando um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais capazes de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva.
Descrição Detalhada Da Invenção
[086] Conforme descrito aqui acima, a raiva é uma das doenças mais perigosas para os humanos, que causa a morte se não for tratada a tempo. Um regime de profilaxia pós-exposição (PEP) envolve preferivelmente dois componentes - um que fornece imunidade ativa e o outro que fornece imunidade passiva. A imunidade ativa é fornecida por uma vacina que atua ativando o sistema imunológico do paciente / indivíduo e gera imunidade contra o vírus em questão de forma retardada, isto é, apenas no ou após sete dias da vacinação. A imunidade passiva é fornecida por anticorpos prontos, como anticorpos policlonais (HRIG, ERIG etc.), anticorpos monoclonais ou seu coquetel, que fornece proteção antivírus imediatamente após a injeção no paciente / indivíduo. Uma vez que a imunização passiva acarreta um risco significativo de neutralizar a imunização ativa de debilitar a PEP e colocar a vida do paciente em risco, é importante um equilíbrio correto entre a dose de imunização passiva e o tipo de imunização passiva em termos de sua meia-vida circulante no paciente no fornecimento de quantidade suficiente e tipo de anticorpos neutralizantes por meio de imunização passiva que fornece proteção / imunidade na fase inicial, enquanto permite que a vacina (imunização ativa) execute sua função ininterruptamente, fornecendo uma janela ininterrupta de proteção imunológica ao paciente. Até agora, a imunização passiva tem sido amplamente fornecida por produtos convencionais, a saber, HRIG e ERIG, que são usados a 20 IU/kg e 40 IU/kg, respectivamente. HRIG e ERIG, conforme descrito anteriormente, não são seguros devido ao risco potencial de carregar patógenos. As tentativas de desenvolver produtos de substituição mais seguros na forma de anticorpos monoclonais humanizados / humanos levaram a produtos que são capazes de fornecer apenas uma potência muito baixa de anticorpos como imunização passiva precoce, porque em doses mais altas eles acabam neutralizando a imunização ativa. Assim, há a necessidade de um produto de imunização passiva que seja mais seguro do que os produtos convencionais e também forneça potência comparável.
[087] A presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal de murino ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino como o componente de imunização passiva da PEP de exposição com raiva ou os vírus relacionados à raiva junto com a vacina como o componente de imunização ativa. Um anticorpo monoclonal de murino ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino de acordo com a presente invenção pode ser administrado a uma dose mais elevada do que a dose aprovada de HRIG ou anticorpos monoclonais humanos ou anticorpos monoclonais humanizados sem significantemente neutralizar a imunização ativa proporcionada por uma vacina antirrábica administrada como uma parte da PEP. O anticorpo monoclonal de murino ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino de acordo com a presente invenção pode ser administrado em uma dose mais do que 20 IU/kg, preferivelmente em uma dose entre 20 IU/kg a 100 IU/kg.
Anticorpos ou um coquetel da presente invenção não significantemente neutraliza a imunização ativa proporcionada por uma vacina antirrábica administrada como uma parte da PEP em uma dose mais do que 20 IU/kg, preferivelmente em uma dose entre 20 IU/kg a 100 IU/kg. Assim, um anticorpo monoclonal de murino ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino de acordo com a presente invenção, para PEP permite que a imunização ativa gere e mantenha uma resposta imune efetiva contra raiva e vírus relacionados à raiva. A vacina de acordo com a presente invenção é uma vacina antirrábica conhecida na técnica. A presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal de murino ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino capazes de se ligar e de neutralizar a raiva e vírus relacionados a raiva para a PEP de exposição à raiva e vírus relacionados à raiva.
Anticorpos monoclonais mAb A e mAb B:
[088] Um anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva de acordo com a presente invenção compreende HCVR que compreende um CDRH1 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO:1, uma região CDRH2 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 2, e uma região CDRH3 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO:
3.
[089] Um anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva de acordo com a presente invenção compreende LCVR que compreende uma região CDRL1 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO:4, uma região CDRL2 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 5, e uma região CDRL3 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 6.
[090] Um anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva de acordo com a presente invenção compreende HCVR que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 7.
[091] Um anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva de acordo com a presente invenção compreende LCVR que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 8.
[092] Um anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva de acordo com a presente invenção compreende uma cadeia pesada que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 9. Um anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva de acordo com a presente invenção compreende uma cadeia leve que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 10.
[093] Um anticorpo monoclonal que compreende polipeptídeos determinados em SEQ ID NOs: 9 e 10 de cadeia pesada e cadeia leve, respectivamente é referido nesse documento como mAb A. mAb A que compreende sequências de amino ácido de HCVR e LCVR como determinado em SEQ ID NOs 7 e 8, respectivamente. Além disso, mAb A que compreende sequências de amino ácido de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 como determinado em SEQ ID NOs 1, 2 e 3, respectivamente. Além disso, mAb A que compreende sequências de amino ácido de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 como determinado em SEQ ID NOs 4, 5 e 6, respectivamente.
[094] Um anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva de acordo com a presente invenção compreende uma cadeia pesada que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 11.
[095] Um anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva de acordo com a presente invenção compreende uma cadeia leve que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 12.
[096] Um anticorpo monoclonal que compreende polipeptídeos determinados em SEQ ID NOs: 11 e 12 de cadeia pesada e cadeia leve, respectivamente é referido nesse documento como mAb B.
[097] Preferivelmente, mAb A e mAb B são anticorpos de murino de acordo com a presente invenção.
[098] Além disso, a presente invenção proporciona um coquetel de dois ou mais anticorpos monoclonais. Preferivelmente, a presente invenção proporciona um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais isto é mAb A e mAb B capazes de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva. Preferivelmente, o coquetel compreende quantidades equipotentes de anticorpos capazes de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva. Um dos dois anticorpos de acordo com a presente invenção é um anticorpo monoclonal que compreende sequências de amino ácido de HCVR e LCVR como determinado em SEQ ID NOs 7 e 8, respectivamente. O segundo anticorpo monoclonal de acordo com a presente invenção é um anticorpo monoclonal que compreende as sequências de amino ácido de cadeia pesada e de cadeia leve como determinado em SEQ ID NOs 11 e 12, respectivamente.
[099] Preferivelmente, um coquetel de acordo com a presente invenção que compreende um anticorpo monoclonal tendo cadeia pesada e cadeia leve que compreende polipeptídeos determinados em SEQ ID NOs 9 e 10, respectivamente e segundo anticorpo monoclonal tendo cadeia pesada e cadeia leve que compreende os polipeptídeos determinados em SEQ ID NOs 11 e 12, respectivamente.
[0100] Os anticorpos monoclonais para uma preparação de coquetel são selecionados com base em critérios, tais como especificidade de ligação, espectro de neutralização de lissavírus, atividade biológica, potência neutralizante, etc. e viabilidade industrial. Várias cepas de lissavírus são isoladas de espécies específicas em várias áreas geográficas. Por exemplo, RABV (genótipo 1) de cães da Ásia (Índia, Filipinas e Tailândia etc.), África (Norte da África, África Subsaariana, etc.) e do Novo Mundo e de mangusto(s) da África do Sul foram incluídos.
[0101] Primeiramente, RABV (genótipo 1) de cães da Asia (Índia, Filipinas e Tailândia etc.), África (Norte da África, África Subsaariana, etc.) e do Novo Mundo e de mangusto(s) da África do Sul foram incluídos. Além disso, a capacidade de neutralização dos anticorpos foi também testada contra vírus relacionados a raiva, ou seja, EBLV-1, -2, (genótipo 5, 6) ABLV (genótipo 7), vírus Duvenhage (genótipo 4), vírus Irkut, Khujand e Aravan.
[0102] A neutralização do vírus foi realizada com vírus da raiva e relacionados com a raiva CVS 11, SAD B19, PV, Kelev, EBLV1, EBLV2, ABV, Duvenhage, Irkut, Aravan e Khujand. Neutralização do vírus também foi realizada com raiva e raiva isolados relacionados de Raposa Europeia, Cão da Turquia, Cão da Etiópia, Cão da Índia, Cão do México, Lobo de Sarajevo, Lince-EUA, Raposa do Leste Europeu, raposa polar, Cão do Azerbaijão, Cão do Nepal, Guaxinim, SE US, Raposa cinza do TX, Raposa Ártica do Alasca, Gambá de SC US, Gambá de CA.
[0103] Ensaios de inibição de foco fluorescente rápido (RFFIT) ou teste de neutralização de vírus de anticorpo fluorescente (FAVN) foram realizados para estudar a neutralização de amplo espectro de cepas de lissavírus, conforme mencionado nos exemplos fornecidos nesse documento abaixo.
[0104] Os anticorpos são produzidos em um sistema de expressão que pode compreender um vetor de expressão e uma linha de células hospedeiras. Qualquer vetor de expressão conhecido por aquele versado na técnica pode ser usado na presente invenção, e a escolha do vetor de expressão depende da natureza da célula hospedeira de escolha. A introdução do vetor em células hospedeiras pode ser efetuada por, mas não se limitando a, transfecção de fosfato de cálcio, infecção de vírus, transfecção mediada por dextrano DEAE, transfecção de lipofectamina ou eletroporação, e o especialista na técnica pode selecionar e usar um método de introdução adequado para o vetor de expressão e célula hospedeira usada. O vetor contém todos os elementos essenciais necessários para expressar o(s) anticorpo(s). De preferência, o vetor contém um ou mais marcadores selecionáveis, mas não está limitado aos mesmos, e um vetor que não contém nenhum marcador selecionável também pode ser usado.
[0105] A presente invenção proporciona uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão transformado em uma célula hospedeira para produzir o anticorpo monoclonal da presente invenção. Na presente invenção, a célula hospedeira pode compreender células de origem de mamífero, vegetal, inseto, fúngica ou bacteriana, mas não é limitada aos mesmos. Uma célula de mamífero pode ser selecionada, mas não está limitada às mesmas, células CHO, células F2N, células CSO, células BHK, células de melanoma Bowes, células HeLa, células 911, células AT1080, células A549, células HEK 293 e células HEK293T. Células hospedeiras de mamífero adequadas conhecidas pelos versados na técnica podem ser usadas para o desenvolvimento de anticorpos e seu coquetel da presente invenção. De preferência, a célula hospedeira usada para produzir anticorpos da presente invenção é uma célula hospedeira derivada de SP2/O.
[0106] Um especialista também pode usar outro sistema de expressão que compreende células de fusão em que uma célula hospedeira que contém sequências de nucleotídeos que expressam sequências de amino ácidos de anticorpos monoclonais da presente invenção é fundida com outra célula hospedeira para desenvolver o sistema de expressão. O método para produzir anticorpos capazes de se ligar e neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva da presente invenção compreendendo principalmente i) a cultura da célula hospedeira que expressa o anticorpo monoclonal capaz de se ligar e neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva; e ii) isolar e recuperar o anticorpo monoclonal capaz de se ligar e neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva expressos na referida célula hospedeira.
[0107] Cultivar a célula hospedeira que expressa o anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva inclui preferivelmente a produção de anticorpo monoclonal por processo de cultura de célula Sp2/0 em meio adequado que é conhecido na técnica. A expressão do anticorpo monoclonal ocorre em uma maneira constitutiva e secretada pelas células em forma solúvel.
[0108] Isolar e recuperar o anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva expresso na referida célula hospedeira inclui principalmente clarificação de células, cromatografia de afinidade em combinação com outras técnicas de cromatografia adequadas e/ou técnicas de filtração para preparar uma substância medicamentosa purificada de anticorpo monoclonal de interesse. O anticorpo monoclonal purificado ou a preparação do coquetel do mesmo é testado para a neutralização de várias cepas de lissavírus.
[0109] A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica estável que compreende um anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva e os vírus relacionados à raiva, preferivelmente um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Excipientes preferidos são tampão, sal e tensoativo. Excipientes adequados para formular e para preparar produto de fármaco no volume final podem ser selecionados por uma pessoa versada na técnica. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção inclui potência terapêutica do anticorpo monoclonal ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais. A referida potência terapêutica é na faixa a partir de 1 IU/mL a 5000 IU/mL, preferivelmente 100 IU/mL a 3000 IU/mL. A potência terapêutica de acordo com presente descrição inclui cada número inteiro e número não inteiro entre as faixas mencionadas, isto é, 1 IU/mL a 5000 IU/mL. Por exemplo, a referida faixa inclui 10 IU/mL, 25 IU/mL, 50 IU/mL, 100 IU/mL, 150 IU/mL, 200 IU/mL, 300 IU/mL, 400 IU/mL, 500 IU/mL, 600 IU/mL, 700 IU/mL, 800 IU/mL, 900 IU/mL, 1000 IU/mL, 1200 IU/mL, 2000 IU/mL, 3000 IU/mL, 4000 IU/mL e 5000 IU/mL. O coquetel de anticorpos de acordo com a presente invenção pode incluir a potência terapêutica de cada anticorpo monoclonal na faixa terapêutica descrita. Preferivelmente, o coquetel de anticorpos inclui uma quantidade terapêutica, preferivelmente uma quantidade equipotente de cada anticorpo monoclonal na faixa terapêutica descrita. A potência terapêutica preferida do anticorpo de acordo com a presente invenção é entre 100 IU/mL – 3000 IU/mL. Em uma das realizações, a potência terapêutica preferida de coquetel de acordo com a presente invenção é entre 400 IU/mL – 1500 IU/mL. Mais preferivelmente, a potência terapêutica do anticorpo de acordo com a presente invenção é 150 IU/mL ou 300 IU/mL ou 600 IU/mL. Mais preferivelmente, a potência terapêutica de coquetel de acordo com a presente invenção é 300 IU/mL ou 600 IU/mL ou 1200 IU/mL. A composição preventiva e terapêutica da presente invenção é estéril e estável nas condições de fabricação e armazenamento. Pode estar em solução e um excipiente farmaceuticamente aceitável apropriado pode ser adicionado e/ou misturado antes ou no momento do envio para fornecer uma forma injetável de dosagem unitária. Alternativamente, a composição da presente invenção pode estar na forma liofilizada que pode ser reconstituída em um excipiente farmaceuticamente aceitável apropriado antes ou no momento do envio. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, o método de preparação preferido é a liofilização. A "composição liofilizada ou de secagem por congelamento" é uma forma de dosagem que é preparada por liofilização ou processo de secagem por congelamento. A liofilização foi realizada com técnica de liofilização convencional conhecida na literatura envolvendo etapas como congelamento, recozimento, secagem primária e secagem secundária.
[0110] A composição de anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva ou os vírus relacionados à raiva, preferivelmente um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção pode ser usada para o tratamento e prevenção da raiva, preferivelmente para profilaxia pós-mordida. Os anticorpos monoclonais ou o coquetel dos mesmos de acordo com a presente invenção são estudados para verificar a atividade de neutralização do vírus da raiva. A potência dos anticorpos neutralizantes do vírus da raiva ou relacionados à raiva é determinada por RFFIT em comparação com uma "Imunoglobulina Antirrábica, Padrão Internacional Humano da OMS" (RAI) ou um padrão de referência interno validado contra o padrão internacional. O ensaio RFFIT é útil para a determinação de anticorpos contra a raiva ou os vírus relacionados à raiva, tanto na fase inicial (imunização passiva) quanto na fase tardia (imunização ativa).
[0111] As vias de administração da composição preventiva e terapêutica da presente invenção podem ser divididas em vias oral e parenteral. A via de administração preferida é a infiltração no local de exposição e em torno dele. Opcionalmente, o volume restante é injetado por via intramuscular no(s) local(is) distante(s) do local da lesão, mas não está limitado aos mesmos.
[0112] O anticorpo monoclonal e o coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais foi observado ter a capacidade de neutralizar a raiva ou os vários vírus relacionados à raiva e assim é útil para o tratamento e prevenção de raiva nos pacientes e animais infectados com raiva ou os vírus relacionados à raiva. Preferivelmente, o anticorpo monoclonal e o coquetel de dois anticorpos monoclonais podem ser administrados diretamente na área circunvizinha da exposição da mordida por um animal com raiva. Como opção, o volume restante foi administrado nas diferentes partes do corpo por via intramuscular. Preferivelmente, o coquetel de anticorpos compreende mAb A e mAb B da presente invenção.
[0113] A dose dos anticorpos preventivos e terapêuticos da presente invenção é selecionada a partir de 1 IU/Kg a 100 IU/Kg. A faixa preferida de uma dose dos anticorpos preventivos e terapêuticos da presente invenção é 10 IU/Kg a 80 IU/Kg. Mais preferivelmente, a dose do anticorpo preventivo e terapêutico da presente invenção é 40 IU/Kg. Em uma das realizações, a dose do coquetel preventivo e terapêutico de acordo com a presente invenção é selecionada a partir de 1 IU/Kg a 100 IU/Kg. Preferivelmente, a dose do coquetel preventivo e terapêutico de acordo com a presente invenção é selecionada a partir de 10 IU/Kg a 80 IU/Kg. Mais preferivelmente, a dose do coquetel preventivo e terapêutico de acordo com a presente invenção é 40 IU/Kg.
[0114] Um regime de dosagem dos anticorpos preventivos e terapêuticos da presente invenção inclui uma administração de anticorpo da presente invenção em conjunto com vacina antirrábica. A vacina antirrábica de acordo com a presente invenção pode ser as vacinas antirrábica oferecidas no mercado ou sob desenvolvimento clínico.
Por exemplo, vacina antirrábica de acordo com a presente invenção pode ser selecionada a partir de Imovax, Rabavert, Rabipur, Rabivax, Vaxirab N, Abhayrab, Indirab, Verorab, SPEEDA, etc. Estas são as marcas das vacinas antirrábicas disponíveis no mercado. Em uma realização preferida, o anticorpo da presente invenção é administrado sem demora como um procedimento de emergência. Também pode ser injetado até 7 dias após a administração da primeira dose da vacina. Em uma realização preferida, o anticorpo ou coquetel da presente invenção pode ser usado para a PEP de exposição com raiva e os vírus relacionados à raiva. Mais preferencialmente, o anticorpo ou o coquetel da presente invenção é usado em conjunto com a vacina antirrábica para a PEP de exposição à raiva e os vírus relacionados à raiva.
Métodos analíticos usados na presente invenção:
[0115] Teste rápido de inibição do foco fluorescente (RFFIT) para a determinação da potência e do titulação de RVNA.
[0116] O teste de RFFIT foi realizado em placas de cultura de tecido com 96 cavidades. Uma dose fixa de CVS-11 foi incubada com cada uma das diluições em série 1:2 do teste e os materiais de referência. Após 90 minutos da referida incubação, o teste e os materiais de referência junto com o vírus CVS-11 foram adicionados sobre Células BHK-21 e incubados por mais 22 ± 2 horas adicionais em uma incubadora com 5% de CO2 a 37°C. No final do período de incubação, a monocamada de células foi lavada e fixada com 80% de acetona. A presença de vírus não neutralizados em cada diluição em série é detectada pela identificação de células infectadas por vírus residual usando um anticorpo conjugado FITC contra a nucleoproteína do vírus da raiva e contando as células infectadas por fluorescência sob um microscópio fluorescente. A titulação de RVNA foi calculada conforme mostrado abaixo:
[0117] Cálculo da titulação de RVNA Diferença do logaritmo 50% 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑓𝑒𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑞𝑢𝑎𝑠𝑒 𝑎𝑏𝑎𝑖𝑥𝑜 𝑑𝑒 50% = 𝑖𝑛𝑓𝑒𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑞𝑢𝑎𝑠𝑒 𝑎𝑐𝑖𝑚𝑎 𝑑𝑒 50% − 𝑖𝑛𝑓𝑒𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑞𝑢𝑎𝑠𝑒 𝑎𝑏𝑎𝑖𝑥𝑜 𝑑𝑒 50% Log (recíproco de diluição de ponto final de 50% = Log (recíproco de diluição de ponto de partida) + diferença do logaritmo Titulação de ponto final = Antilog do Log (recíproco de diluição de ponto final de 50%) Titulação de RVNA (IU/mL) = titulação do ponto final da amostra titulação do ponto final de Ref. Std. X 2 IU/mL (Referência Padrão)
[0118] Aqui, a presente invenção é ilustrada com os exemplos não limitantes a seguir que não devem ser interpretados como limitação do âmbito da presente invenção de forma alguma.
Exemplos
[0119] Exemplo 1: Fabricação de substância ativa do fármaco do anticorpo monoclonal mAb A
[0120] Processo de fabricação de substância de fármaco de um anticorpo monoclonal mAb envolve –
[0121] - Processo de cultura a montante de célula Sp2/0 e
[0122] - Processo de purificação a jusante.
[0123] Processo de cultura a montante para produzir um anticorpo monoclonal mAb
[0124] Um anticorpo monoclonal mAb foi produzido pela célula hospedeira do sistema de expressão no processo de cultura de célula Sp2/0 na presença de meio livre de origem animal e componentes de alimentação. Meio contendo os componentes do soro pode também ser usado para produzir o referido anticorpo. Cada produção de lote a montante foi iniciada com a revitalização de um conteúdo de frasco de banco de células mestre (MCB) ou Banco de Células de Trabalho (WCB) de células Sp2/0 contendo a sequência de polinucleotídeo mAb A. Após a revitalização do frasco do banco de células, uma série de etapas de desenvolvimento de sementes foi realizada para gerar o inóculo final com um número adequado de células e inoculado no biorreator de produção. O processo de cultura de células em biorreator foi conduzido de forma bem controlada com vários parâmetros de controle on-line e off-line para expressar o anticorpo monoclonal mAb A, de maneira constitutiva. A proteína foi secretada pelas células na forma solúvel.
[0125] Foram produzidos vários lotes de uma composição compreendendo o anticorpo monoclonal. Um inóculo do mAb A foi cultivado em biorreatores de 200 L contendo um meio de cultura de células líquido. O anticorpo maduro codificado por estes ácidos nucleicos é mAb A e compreende a sequência de amino ácidos da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 9 e a sequência de amino ácidos da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 10. A cultura celular foi realizada em ambiente controlado, mantendo pH 7,0 ± 0,3 com gás CO2 e/ou bicarbonato de sódio, conforme e quando necessário. A concentração de oxigênio dissolvido foi mantida em 15 ± 5% de saturação com aspersão de ar e/ou gás oxigênio e pelo controle da velocidade de agitação no biorreator. Os biorreatores foram operados a uma temperatura de cerca de 36,0 °C a cerca de 37,0 °C.
[0126] Meio de crescimento contém os componentes a seguir:
[0127] Componentes Concentração por litro
[0128] BD CELLTM MAB ACF 12.860 gm
[0129] Células foram desenvolvidas sob as condições acima mencionadas por dois dias a partir do dia 2, a alimentação foi iniciada e continuada até o final do lote.
Os componentes do meio a seguir foram alimentados ao meio de cultura celular como a alimentação comum – Componentes Concentração por litro L-Glutamina 2 mM diariamente a partir do dia 2 para frente até o dia antes da coleta Meio de crescimento concentrado 2% de alimentação (v / v) com relação ao volume de trabalho inicial no biorreator a partir do dia 3 para frente até o dia antes da coleta
[0130] A duração da cultura foi de cerca de 7 a 9 dias. A idade celular in vitro (dias de cultura desde o degelo inicial do banco de células mestre até a coleta) foi de 26 dias ou menos. Depois disso, o sobrenadante clarificado da cultura de células foi colhido por centrifugação e filtração profunda do meio de cultura de células. Este sobrenadante clarificado foi então recondicionado para corresponder substancialmente às condições de equilíbrio da coluna de purificação seguinte. O sobrenadante foi então submetido a cromatografia de proteína A e as impurezas foram deixadas fluir para fora desta coluna de cromatografia.
[0131] Processo de purificação a jusante para obter um anticorpo monoclonal mAb fármaco substância
[0132] Processo de purificação de um anticorpo monoclonal mAb foi realizado com diversas operações unitárias que compreendem clarificação celular, recondicionamento, cromatografia, inativação viral, depuração do vírus e ultrafiltração- diafiltração da membrana. A purificação por cromatografia envolveu várias técnicas de cromatografia de interação, como cromatografia de afinidade e outras técnicas adequadas de cromatografia e filtração. A inativação viral foi conduzida em condição de pH baixo por um certo período de tempo e a eliminação do vírus foi realizada por nanofiltração. O recondicionamento e/ou troca de tampão foi realizado por ultrafiltração-diafiltração de membrana convencional.
[0133] No final do processo de purificação, o anticorpo monoclonal mAb A purificado foi filtrado através de um filtro de 0,2 µm, assepticamente, e armazenado sob condição de congelamento em sistema de fechamento de recipiente adequado. Todo o processo de purificação foi monitorado e controlado com parâmetros físicos e físico- químicos apropriados relacionados ao anticorpo monoclonal mAb A e seu processo de purificação. Quando avaliado por cromatografia analítica de exclusão de tamanho de alto desempenho, a substância medicamentosa mAb A mostrou apresentar pureza superior a 99%.
[0134] Exemplo 2: Fabricação de substância fármaco ativa de anticorpo monoclonal mAb B
[0135] Processo de fabricação de substância de fármaco de anticorpo monoclonal mAb B envolve –
[0136] - Processo de cultura a montante de célula Sp2/0 e
[0137] - Processo de purificação a jusante.
[0138] Processo de cultura a montante para produzir anticorpo monoclonal mAb B
[0139] Anticorpo monoclonal mAb B foi produzido por célula hospedeira do sistema de expressão Sp2/0 em processo de cultura celular na presença de meio livre de origem animal e componentes de alimentação. O meio contendo os componentes do soro pode também ser usado para produzir o referido anticorpo. A produção de cada lote a montante foi iniciada com o revitalização de um conteúdo do frasco do banco de células mestre (MCB) ou Banco de Células de Trabalho (WCB) de células Sp2/0 que abrigam a sequência polinucleotídica de mAb B. Após reanimação do frasco de banco de células, uma série das etapas de desenvolvimento da semente foi realizada para gerar o inóculo final com número adequado de células e inoculado no biorreator de produção. O processo de cultura de células em biorreator foi conduzido de forma bem controlada com vários parâmetros de controle on-line e off-line para expressar o anticorpo monoclonal mAb B, de maneira constitutiva. A proteína foi secretada pelas células na forma solúvel.
[0140] Foram produzidos vários lotes de uma composição compreendendo o anticorpo monoclonal. Um inóculo do mAb B foi cultivado em biorreatores de 200 L contendo um meio de cultura de células líquido. O anticorpo maduro codificado por estes ácidos nucleicos é mAb B e compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 11 e a sequência de aminoácidos da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 12. A cultura celular foi realizada em ambiente controlado, mantendo pH 7,0 ± 0,3 com gás CO2 e/ou bicarbonato de sódio, conforme e quando necessário. A concentração de oxigênio dissolvido foi mantida a 30 ± 10% de saturação com aspersão de ar e/ou gás oxigênio e pelo controle da velocidade de agitação no biorreator. Os biorreatores foram operados a uma temperatura de cerca de 36,0 °C a cerca de 37,0 °C.
[0141] O meio de crescimento contém os componentes a seguir:
[0142] Componentes Concentração por litro
[0143] BD CellTM MAb ACF 12.860 gm
[0144] Células foram desenvolvidas sob as condições acima mencionadas por dois dias. A partir do dia 2, a alimentação foi iniciada e continuada até o final do lote.
Os componentes do meio a seguir foram alimentados para o meio de cultura celular como alimentação comum -
[0145] Meio de crescimento conteve os componentes a seguir: Componentes Concentração por litro
L-Glutamina 2 mM diariamente a partir do dia 2 para frente até o dia antes da coleta Meio de alimentação do reforço celular 7a 1% de alimentação (v / v) com relação ao volume de trabalho inicial no biorreator a partir do dia 3 para frente até o dia antes da coleta Meio de alimentação do reforço celular 7b 0,3% de alimentação (v / v) com relação ao volume de trabalho inicial no biorreator a partir do dia 3 para frente até o dia antes da coleta
[0146] A duração da cultura foi de cerca de 5 a 7 dias. A idade celular in vitro (dias de cultura desde o degelo inicial do banco de células mestre até a colheita) foi de 33 dias ou menos. Depois disso, o sobrenadante clarificado da cultura de células foi colhido por centrifugação e filtração profunda do meio de cultura de células. Este sobrenadante clarificado foi então recondicionado para corresponder substancialmente às condições de equilíbrio da próxima coluna de purificação. O sobrenadante foi então submetido a cromatografia de proteína A e impurezas foram deixadas fluir para fora desta coluna de cromatografia.
[0147] Processo de purificação a jusante para obter a substância de fármaco de anticorpo monoclonal mAb B
[0148] Processo de purificação de anticorpo monoclonal mAb B foi realizado com diversas operações unitárias que compreendem a clarificação celular, recondicionamento, cromatografia, inativação viral, depuração do vírus e ultrafiltração- diafiltração da membrana. Na purificação por cromatografia, estiveram envolvidas várias técnicas de cromatografia de interação, tais como cromatografia por afinidade e outras técnicas adequadas de cromatografia e de filtração. A inativação viral foi conduzida em condição de baixo pH por um determinado período de tempo e a depuração do vírus foi realizada por nano-filtração. O recondicionamento e/ou a troca de tampão foi realizado por ultrafiltração-diafiltração convencional da membrana.
[0149] No final do processo de purificação, o anticorpo monoclonal mAb B purificado foi filtrado através de um filtro de 0,2 µm, assepticamente, e armazenado sob condição de congelamento em sistema de fechamento de recipiente adequado. Todo o processo de purificação foi monitorado e controlado com parâmetros físicos e físico- químicos apropriados relacionados ao anticorpo monoclonal mAb B e seu processo de purificação. Quando avaliado por cromatografia analítica de exclusão de tamanho de alto desempenho, a substância medicamentosa mAb B mostrou apresentar pureza superior a 99%.
[0150] Exemplo 3: Preparação de coquetel de anticorpo que compreende anticorpos equipotentes
[0151] Para preparar um coquetel de anticorpos compreendendo uma quantidade equipotente de dois anticorpos, um valor de potência em IU/mg foi atribuído à substância de fármaco purificada de mAbs A e mAbs B realizando um teste RFFIT. As substâncias de fármaco individuais mAbs A e mAbs B foram diluídas com base na concentração (mg/mL) para chegar a um valor de potência semelhante em IU/mL por tampão citrato de pH 6,0 contendo cloreto de sódio e polissorbato. Para preparar um coquetel de anticorpos compreendendo anticorpos equipotentes, tanto a substância medicamentosa diluída dos mAbs A quanto os mAbs B foram adequadamente misturados.
[0152] Exemplo 4: Fabricação de coquetel de anticorpo monoclonal
[0153] Coquetel de anticorpo foi preparado por misturar quantidades equipotentes de substâncias de fármaco dos anticorpos monoclonais mAb A e mAb B na presença de tampão de citrato de pH 6,0 contendo cloreto de sódio e polisorbato. A composição foi realizada por etapas em um recipiente adequado. O pH da solução em diferentes estágios da composição foi controlado e a mistura da solução foi conduzida minuciosamente. Após a conclusão da composição, uma alíquota do volume formulado foi retirada e analisada quanto ao pH e osmolaridade. Para redução da carga biológica e filtração estéril do volume final formulado, filtros de grau esterilizante de 0,2 µm foram usados, antes do enchimento dos frascos de vidro ou seringas. A integridade do filtro foi testada antes (pré) e depois (pós) da filtração da massa. O enchimento foi realizado usando uma bomba e o volume de enchimento foi verificado por peso ao longo de todo o processo de enchimento. O fechamento on-line dos recipientes primários preenchidos foi conduzido, simultaneamente, em condições estéreis. Após a colocação da rolha, foi realizada a selagem flip-off. O produto final assim preparado fornece uma composição farmacêutica estável que se manteve estável por pelo menos 36 meses sob condições de temperatura de armazenamento em tempo real no sistema de fechamento de recipiente especificado.
[0154] Exemplo 5: estudos in vitro de mAb A e mAb B
[0155] A reatividade cruzada in vitro dos candidatos a mAbs selecionados foi medida em uma seleção de RABV e vírus relacionados à raiva isolados de espécies hospedeiras específicas e áreas geográficas em vários conjuntos de experimentos.
Primeiramente, RABV (genótipo 1) de cães da Ásia (Índia, Filipinas e Tailândia etc.), África (Norte da África, África Subsaariana, etc.) e do Novo Mundo foram incluídos. Além disso, RABV (genótipo 1) de mangusto(s) da África do Sul foram incluídos. Além disso, a capacidade de neutralização dos mAbs (mAb A e mAb B) contra os vírus relacionados à raiva, como EBLV-1, EBLV -2, (genótipo 5, 6) ABLV (genótipo 7), vírus Duvenhage (genótipo 4), espécies isoladas incluindo o vírus Irkut, Khujand e Aravan foram testados.
[0156] Monocamadas de células NA foram infectadas com RABV selecionado e cepas de vírus relacionados à raiva em uma multiplicidade de infectividade de 0,1 por 1 h a 37 °C em 5% de CO2. O inóculo de vírus foi então removido, meio fresco foi adicionado às células e as células foram subsequentemente incubadas por 72 h a 37 °C em 0,5% de CO2. Posteriormente, os sobrenadantes da cultura foram coletados e titulados em células BHK 21. Até três passagens foram conduzidas para obter títulos de vírus suficientes. Os vírus foram armazenados a -80 °C até uso posterior.
[0157] Os ensaios de inibição de foco fluorescente rápido (RFFIT) ou ensaios de neutralização de vírus de anticorpo fluorescente (FAVN) foram realizados em células BHK 21 usando um vírus constante e abordagem de método de mAbs variável.
Cada mAbs (purificado ou sobrenadante) foi diluído em série (10,0 - 0,03 IU/mL) e incubado com 104 FFU/mL do RABV e vírus relacionados com a raiva a serem testados.
Para determinar a potência neutralizante de cada mAbs, 100% de redução do vírus de teste pelo mAb A e mAb B foi comparada com a redução de 100% do mesmo vírus de teste por uma imunoglobulina da raiva padrão internacional (SRIG, 2ª preparação de imunoglobulina da raiva humana, Institute for Biological Standards and Control, Potters Bar, UK). SRIG, aqui utilizado, é uma imunoglobulina da raiva derivada de humanos que também pode ser mencionada como HRIG. O teste foi lido após 24 horas de incubação.
[0158] 55.1 Estudo in vitro de neutralização de vírus pelos mAbs selecionados Tabela: 1 Padrão de neutralização de Mab A e SRIG usando 17 RABV e vírus relacionados à raiva. As caixas fechadas (cinza) representam a presença de vírus viáveis MAb A IU/mL SRIG IU/mL Cepa do vírus 1 0. 0. 0.1 0.0 0. 1 0. 0. 0.1 0.0 0. 5 2 1 5 2 1 0 5 25 25 63 03 0 5 25 25 63 03 CVS 11 SAD B19
PV Kelev Raposa Européia Cão da Turquia Cão da Etiopia Cão da India Cão do Mexico Lobo de Sarajevo Lince-USA
EBLV 1 EBLV 2 Raposa Européia do Leste Raposa polar Cão de Azerbaijan Cão do Nepal # as caixas fechadas representam a presença de vírus viáveis Tabela:2 Padrão de neutralização de Mab B e SRIG usando 17 RABV e vírus relacionados à raiva. As caixas fechadas (cinza) representam a presença de vírus viáveis MAb B IU/mL SRIG IU/mL Cepa de Vírus 10 5 2 1 0,5 0,25 0,125 0,063 0,03 10 5 2 1 0,5 0,25 0,125 0,063 0,03 CVS 11 SAD B19
PV Kelev Raposa européia Cão da Turquia Cão da Etiopia Cão da India Cão do Mexico Lobo de Sarajevo Lince USA EBLV 1 EBLV 2 Raposa do leste europeu Raposa polar Cão do Azerbaijan Cão do Nepal # as caixas fechadas represente presença de vírus viáveis
[0159] Ambos os mAbs foram testados como um anticorpo purificado ressuspenso a partir de uma potência de 10 IU/mL até uma diluição de 0,03 IU/mL. Além disso, os anticorpos foram considerados complementares em seu potencial de neutralização. O teste demonstrou que os anticorpos selecionados eram comparáveis ao SRIG no que diz respeito à amplitude da neutralização do vírus.
[0160] 5.2 Estudo in vitro da neutralização do vírus pelo mAbs selecionado
[0161] Nos ensaios de teste in vitro, sete RABV diferentes (2 cepas de laboratório e 5 cepas de campo de RABV) foram usados para determinar a potência de neutralização de cada mAb. Além disso, 4 vírus diferentes relacionados à raiva representando os genótipos 4, 5 e 6, bem como 4 isolados de lissavírus de morcego da Ásia Central e da Sibéria Oriental [vírus do morcego australiano (ABV), vírus Aravan (ARAV), vírus Khujand (KHUV) e Irkut vírus (IRKV)] foram incluídos no painel de vírus.
Tabela: 3 Padrão de Neutralização de SRIG, mAb A e B usando RABV e os vírus relacionados a raiva SRIG mAb A mAb B 1:125 1:625 1:125 1:625 1:125 1:625 1:25 1:25 1:25 1:5 1:5 1:5 IU/mL Cepa do vírus
CVS -11 Gua xini m,
US Gray fox,
TX Arcti c fox, Alas ka Gam bá,
US Gam bá,
CVS -11 Duv enha ge Irkut Arav an Khuj and
EBL V-1
EBL V-2 # as caixas fechadas representam a presença de vírus viáveis
[0162] Há uma reatividade cruzada in vitro de amplo espectro dos mAbs candidatos contra a raiva e alguns outros lissavírus. Todos os vírus da raiva e relacionados à raiva foram neutralizados por qualquer um dos anticorpos monoclonais. Além disso, os anticorpos foram considerados complementares em seu potencial de neutralização. O teste demonstrou que os anticorpos selecionados eram comparáveis ao SRIG no que diz respeito à amplitude da neutralização do vírus. Os dados demonstraram similaridade entre os anticorpos e SRIG em sua capacidade de neutralizar a raiva e RABV diferentes como os lissavírus.
[0163] 5.3 Estudo in vitro de neutralização de vírus por coquetel de mAb A e mAb B, HRIG e ERIG
[0164] O experimento foi conduzido contra isolados de vírus da raiva de rua e a cepa CVS.
Tabela 4: Padrão de Neutralização do coquetel de mAb, HRIG e ERIG Neutralização do Vírus Cepa Fonte de Coquetel mAb do HRIG ERIG isolados (mAb A e mAb B) vírus 10 IU 100 IU 10 IU 100 IU 10 IU 100 IU CVS - 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % SV1 Cão 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % SV2 Canino 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % SV3 Humano 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % SV4 Cão 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % SV5 Humano 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % SV6 Humano 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % SV7 Cão 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % SV8 Cão 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % SV9 Cão 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % SV10 Bovino 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 %
[0165] Foi observado que o coquetel de mAbs A e B neutralizou todos os isolados similares à neutralização por HRIG (preparação de imunoglobulina da raiva humana) e ERIG (preparação de imunoglobulina da raiva de equino).
[0166] Exemplo 6: Estudos de potência in vivo de coquetel de mAb
[0167] 6.1. Estudo de potência in vivo de coquetel de mAb, ERIG e HRIG
[0168] Neste estudo, camundongos foram usados como modelo animal. Os animais desafiados com vírus foram divididos em 5 grupos de estudo: 1) Grupo de controle injetado com solução salina normal; 2) injetado com 0,2 IU / coquetel de mAb de camundongo; 3) injetado com 0,4 IU / coquetel de mAb de camundongo; 4) injetado com 0,2 IU / camundongo HRIG; 5) injetado com 0,4 IU / camundongo ERIG.
[0169] Neste estudo, vírus CVS e 10 cepas de vírus de rua foram usados para desafiar os animais. O coquetel de mAb foi administrado em duas doses de 0,2 IU / camundongo e 0,4 IU / camundongo para comparar com uma dose semelhante de HRIG e ERIG. A diluição do mAb a ser testado foi calculada com base nas doses recomendadas de HRIG (20 IU / Kg) e ERIG (40 IU / Kg). Cada camundongo foi injetado com HRIG a 0,2 IU / camundongo no grupo 4 e ERIG a 0,4 IU / camundongo no grupo 5. O coquetel de mAb foi testado em ambas as doses de 0,2 IU / camundongo e 0,4 IU / camundongo no grupo 2 e no grupo 3, respectivamente.
[0170] Cada grupo com 8 camundongos foi desafiado com 100 LD50 de cada vírus mencionado. Após 1 hora de desafio do vírus, o grupo de controle recebeu 100 µL de solução salina normal inoculada no mesmo local da inoculação do vírus. O restante dos quatro grupos recebeu uma das diluições dos mAbs filtrados na mesma área onde o vírus foi inoculado. Os camundongos foram mantidos em observação por 1 mês.
Tabela: 7 - Estudo animal do coquetel de mAb, ERIG e HRIG em camundongos desafiados com vírus Experim Ce % de sobrevivência Modelo ent pa Place Coquetel mAb HRIG ERIG Animal No. do bo (mAb A + mAb B) 0.2 IU/ 0.4 IU/
vír 0.2 IU/ 0.4 IU/ camundo camundo us camundo camundo ngo ngo ngo ngo
CV 0 100 100 100 100
SV 10 100 100 100 100 1
SV 10 100 100 100 100 2
SV 0 100 100 100 100 3
SV 20 100 100 100 100 4 Camundo SV 1 0 100 100 100 100 ngo 5
SV 0 100 100 100 100 6
SV 10 100 100 100 100 7
SV 10 100 100 100 100 8
SV 0 100 100 100 100 9
SV 0 100 100 100 100 10
[0171] Os resultados fornecidos na tabela 7 mostram que a taxa de sobrevivência de 100% foi observada no grupo de estudo tratado com anticorpo monoclonal antirrábica (HRIG, ERIG e coquetel de mAb). Enquanto no grupo de controle desafiado com CVS, 100% de mortalidade foi observada.
[0172] Também prova que o coquetel de mAb da presente invenção é tão potente quanto os anticorpos atualmente aprovados (HRIG e ERIG).
[0173] 6.2 Estudo de potência in vivo do coquetel de mAb e HRIG
[0174] A fim de estabelecer a correlação PK / PD para o projeto apropriado de estudo clínico em humanos, o estudo de eficácia in vivo em hamsters desafiados com vírus da raiva (CVS-11) foi realizado.
[0175] A determinação da eficácia foi baseada no número de hamsters que sobrevivem a uma dose letal de vírus da raiva, após o tratamento com a dose igual do coquetel de mAb da amostra de teste e o HRIG padrão (Kamrab, Kamada Ltd., Beit-Kama, Israel).
[0176] Os animais do estudo foram randomizados com base em seu peso corporal e divididos em diferentes grupos de tratamento. Os animais infectados com o vírus foram divididos (10 animais em cada grupo) nos três grupos seguintes: 1) um grupo injetado com o vírus CVS-11 sozinho; 2) um grupo injetado com vírus CVS-11 e coquetel de mAbs antirrábica individualmente; 3)) um grupo injetado com o vírus CVS-11 e HRIG padrão (Kamrab, Kamada Ltd., Beit-Kama, Israel).
[0177] A preparação do vírus da raiva com um título de LD50 conhecido foi adequadamente diluída e 200 µL administrados no músculo gastrocnêmio direito de cada hamster. A solução formulada do coquetel de mAbs antirábica e o padrão Kamrab foram administrados em 6 horas em grupos definidos no mesmo local da injeção de vírus em condições de alimentação. O nível de dose selecionado foi de 15 UI / hamster para minimizar o volume da dose no local da injeção (~ 100 μL). Hamsters foram observados diariamente para quaisquer sinais clínicos de raiva, como paralisia ou morte. Após a observação de quaisquer sinais de infecção pelo vírus da raiva, os animais foram sacrificados por asfixia com dióxido de carbono. O % de sobrevivência foi verificado após 30 dias do desafio com o vírus. Os resultados do estudo são mostrados na tabela 8.
Tabela: 8 Estudo em animal de coquetel de mAb e dosagem de HRIG sem vacina após 6 horas de desafio de vírus CVS-11 Grupo (Fármaco Dose Experiment Modelo Desafio administrado 6 % de (via Sobrevivência No. Animal de vírus horas após sobrevivência i.m.) desafio de vírus) 100 Controle 4/10 40% µL
HRIG 100 (Kamrab, CVS- µL Kamada Ltd., 5/10 50% 11 (15 1 Hamsters Beit-Kama, (i.m. IU) Israel) route) 100 Teste µL (coquetel 9/10 90% (15 mAb) IU)
[0178] O estudo de eficácia in vivo do coquetel de mAb em comparação com HRIG (Kamrab, Kamada Ltd., Beit-Kama, Israel) foi realizado para demonstrar o potencial de neutralização do vírus do coquetel de mAb em hamsters desafiados pelo vírus da raiva. Neste estudo, onde os animais foram tratados 6 horas após o desafio do vírus, mostrou 90% de sobrevivência pelo coquetel de mAb da presente invenção. É melhor que 50% de sobrevivência por HRIG (Kamrab, Kamada Ltd., Beit-Kama)
[0179] Exemplo 7: Estudo clínico de fase III de coquetel mAb
[0180] A eficácia de um coquetel compreendendo mAb A e mAb B foi estudada em um estudo clínico humano de fase III randomizado, multicêntrico, de rótulo aberto, controlado por comparador para avaliar e comparar a eficácia e segurança do coquetel com um HRIG em um ambiente de PEP, onde ambos foram administrados em conjunto com uma vacina antirrábica.
[0181] O estudo compreendeu 308 indivíduos com exposição (ões) de categoria III da OMS de animais suspeitos de raiva que foram divididos igualmente em dois braços. Em um braço, os indivíduos receberam um coquetel de mAb (40 UI / kg) em conjunto com uma vacina antirrábica (VaxiRab N; Cadila Healthcare Ltd. Ahmedabad, Índia) e no outro braço, um HRIG (Imogam® (20 UI / kg, Sanofi Pasteur SA França) com vacina antirrábica.
[0182] Em ambos os braços, os fármacos sendo comparados foram administrados diretamente na área circundante das lesões da mordida de um animal com raiva (local único / locais múltiplos) e o volume restante foi administrado nas diferentes partes do corpo por via intramuscular. Ambos os fármacos foram administrados no dia 0 em conjunto com uma vacina antirrábica de acordo com o regime de Essen para a vacinação antirrábica (cinco doses intramusculares nos dias 0, 3, 7, 14 e 28). O estudo foi seguido por 84 dias para cada indivíduo.
[0183] Resultados:
[0184] Ambas os fármacos, coquetel Mab e HRIG, foram consideradas pelo menos comparáveis em termos de títulos de RVNA avaliados em pontos de tempo iniciais (dias 3 e 7) e pontos de tempo tardios (dias 14, 28 , 42 e, 84). O estudo demonstrou que o coquetel de mAb como HRIG, forneceu uma janela de proteção ininterrupta, ou seja, sem neutralizar significativamente a vacina antirrábica ao longo da duração do estudo.
Além disso, os títulos de ponto de tempo tardio conforme observados nos dias 28, 42 e 84 foram maiores no braço do coquetel de mAb em comparação com HRIG, confirmando que o coquetel de mAb de murino neutralizou a vacina (imunização ativa) menos do que o policlonal de origem humana ( HRIG), demonstrando a vantagem dos anticorpos monoclonais de murinos sobre os anticorpos humanos no cenário PEP.
Incorporação por referência
[0185] A descrição completa de cada um dos documentos de patentes e artigos científicos aqui referidos é incorporada por referência para todos os fins.
[0186] Equivalentes
[0187] A invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou das características essenciais da mesma. As realizações anteriores devem, portanto, ser consideradas em todos os aspectos ilustrativas, em vez de limitar a invenção aqui descrita. O escopo da invenção é, portanto, indicado pelas reivindicações anexas, em vez da descrição anterior, e todas as alterações que se inserem dentro do significado e intervalo de equivalência das reivindicações se destinam a ser abrangidas nas mesmas.
Claims (29)
1. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato que compreende: (a) CDRH1 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 1; (b) CDRH2 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 2; (c) CDRH3 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 3; (d) CDRL1 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 4; (e) CDRL2 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 5; e (f) CDRL3 que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 6.
2. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 7 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 8.
3. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato que compreende: (a) uma cadeia pesada que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 9 e (b) uma cadeia leve que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 10.
4. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato que compreende: (a) uma cadeia pesada que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 11 e (b) uma cadeia leve que compreende um polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 12.
5. Coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais, caracterizado pelo fato que um dos anticorpos é um anticorpo monoclonal conforme reivindicado na reivindicação 1.
6. Coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais, caracterizado pelo fato que um dos anticorpos é um anticorpo monoclonal conforme reivindicado na reivindicação 4.
7. Coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais, caracterizado pelo fato que os dois anticorpos são anticorpos monoclonais conforme reivindicados na reivindicação 1 e na reivindicação 4.
8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato que é um isótipo IgG, preferivelmente IgG1 ou IgG2.
9. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato que é um anticorpo monoclonal de murino.
10. Anticorpo monoclonal de murino ou coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino para a PEP de exposição à raiva e vírus relacionados à raiva, caracterizado pelo fato que o anticorpo permite uma imunização ativa para gerar e manter uma resposta imune efetiva.
11. Anticorpo monoclonal de murino ou coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir do anticorpo monoclonal ou coquetel conforme reivindicado nas reivindicações 1 - 9.
12. Combinação de um anticorpo monoclonal de murino e uma vacina antirrábica, em que o anticorpo monoclonal de murino é conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de ser para a
PEP de exposição à raiva e vírus relacionados à raiva.
13. Uso de um anticorpo monoclonal de murino de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser para a PEP de exposição à raiva e vírus relacionados à raiva.
14. Combinação de um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de murino e vacina antirrábica, em que os anticorpos monoclonais de murino são conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de ser para a PEP de exposição à raiva e vírus relacionados à raiva.
15. Uso de um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser para a PEP de exposição à raiva e vírus relacionados à raiva.
16. Composição caracterizada pelo fato que compreende um anticorpo monoclonal ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
17. Composição de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato que compreende excipientes selecionados a partir de tampão, açúcar, poliol, amino ácido, tensoativo e polímero.
18. Composição de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato que compreende excipientes selecionados a partir de tampão de citrato, polisorbato 80, cloreto de sódio.
19. Composição de acordo com de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizada pelo fato de ser é uma formulação liofilizada.
20. Composição de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato que o anticorpo monoclonal ou um dos anticorpos de um coquetel está presente na faixa de 1 IU/mL a 5000 IU/mL, preferivelmente 100 IU/mL to3000 IU/mL, mais preferivelmente 150 IU/mL ou 300 IU/mL ou 600 IU/mL.
21. Composição de acordo com o reivindicado na reivindicação 16,
caracterizada pelo fato que o coquetel está presente na faixa de 100 IU/mL a 150 IU/mL, preferivelmente 400 IU/mL a 1500 IU/mL, mais preferivelmente 300 IU/mL ou 600 IU/mL ou 1200 IU/mL.
22. Anticorpo monoclonal ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser administrado via infiltração em e em torno do campo de exposição e/ou por via intramuscular em campo(s) distante(s) a partir do campo da lesão.
23. Anticorpo monoclonal ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato que é administrado em uma dose de 1 IU/Kg a 100 IU/Kg, preferivelmente 10 IU/Kg a 80 IU/Kg, mais preferivelmente 40 IU/Kg.
24. Anticorpo monoclonal ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato que é administrado até 7 dias após a exposição iniciando imediatamente após a exposição.
25. Conjunto caracterizado pelo fato que compreende um anticorpo monoclonal ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais conforme reivindicados em qualquer uma das reivindicações precedentes.
26. Método para diagnosticar raiva, caracterizado pelo fato de usar um anticorpo monoclonal ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais conforme reivindicados em qualquer uma das reivindicações precedentes.
27. Método para detectar raiva vírus, caracterizado pelo fato de usar um anticorpo monoclonal ou um coquetel de pelo menos dois anticorpos monoclonais conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes.
28. Processo para a produção de um anticorpo conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes por um método de cultura celular, caracterizado pelo fato que compreende: i) cultivar a célula hospedeira de sistema de expressão, preferivelmente célula Sp2/0 que expressa anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar a raiva vírus; e ii) isolar e recuperar anticorpo monoclonal capaz de se ligar e de neutralizar um vírus da raiva expresso na referida célula hospedeira.
29. Processo para a purificação de um anticorpo conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser por uma técnica adequada de cromatografia ou de purificações.
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