JP4768730B2 - 狂犬病ウイルスを中和することができる結合分子およびそれらの用途 - Google Patents
狂犬病ウイルスを中和することができる結合分子およびそれらの用途 Download PDFInfo
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Description
以下、本発明で使用する用語の定義を記す。
結合分子
本明細書において用いる「結合分子」という用語は、モノクローナル抗体(キメラ、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体など)を含むインタクト型免疫グロブリンを指すか、または、インタクト型免疫グロブリンと競合して免疫グロブリンの結合パートナー(例えば狂犬病ウイルス、あるいはGタンパク質などの狂犬病ウイルスのフラグメント)と特異的結合を形成するような免疫グロブリンのフラグメントを備える、抗原結合領域および/または可変領域を指す。その構造に関係なく、抗原結合性フラグメントは、インタクト型免疫グロブリンによって認識される抗原と同一の抗原に結合する。抗原結合性フラグメントを、結合分子のアミノ酸配列のうちの、少なくとも2連続のアミノ酸残基、少なくとも5連続のアミノ酸残基、少なくとも10連続のアミノ酸残基、少なくとも15連続のアミノ酸残基、少なくとも20連続のアミノ酸残基、少なくとも25連続のアミノ酸残基、少なくとも30連続のアミノ酸残基、少なくとも35連続のアミノ酸残基、少なくとも40連続のアミノ酸残基、少なくとも50連続のアミノ酸残基、少なくとも60連続のアミノ酸残基、少なくとも70連続のアミノ酸残基、少なくとも80連続のアミノ酸残基、少なくとも90連続のアミノ酸残基、少なくとも100連続のアミノ酸残基、少なくとも125連続のアミノ酸残基、少なくとも150連続のアミノ酸残基、少なくとも175連続のアミノ酸残基、少なくとも200連続のアミノ酸残基、または少なくとも250連続のアミノ酸残基、のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドあるいはポリペプチドから構成することが可能である。
本明細書において用いる「相補性決定領域」という用語は、免疫グロブリンなどの結合分子の可変領域中に存在する塩基配列を意味し、通常、抗原上の認識されるエピトープに対して形状および電荷分布において相補的である抗原結合部位に大きな影響を及ぼす。CDR領域はタンパク質あるいはタンパク質断片の直線状エピトープ、不連続エピトープ、あるいは立体構造エピトープに特異的である可能性があり、これらのエピトープは天然の構造をとるタンパク質上に存在するか、または、ある場合には、例えばSDS中で溶解することによって変性したタンパク質上に存在する。また、エピトープはタンパク質の翻訳後修飾から構成される可能性もある。
本明細書において用いる「機能的変異体」という用語は、元の結合分子(親結合分子)のヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列と比較して1つ以上のヌクレオチドおよび/またはアミノ酸が変化したヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列を有しており、かつ、例えば狂犬病ウイルスまたはその断片などといった結合パートナーに対する結合を、依然として親結合分子と競合することができる結合分子を指す。つまり、親結合分子のヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列における修飾は、ヌクレオチド配列によってコードされる結合分子、あるいはアミノ酸配列を含む結合分子の結合能に重大な影響を与えたりこれを変化させたりはせず、すなわちその結合分子は依然としてターゲットを認識し結合することができる。機能的変異体は、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、挿入、および欠失などの、保存的な配列修飾を有する可能性がある。これらの修飾は、例えば部位特異的突然変異導入法やPCRを用いたランダム突然変異導入法などの、当技術分野では周知の標準的な技術によって導入可能である。
本明細書において用いる「ホスト」という用語は、クローニングベクターまたは発現ベクターのようなベクターが導入された生物あるいは細胞を指すことを意図されている。生物あるいは細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。この用語は、対象となる特定の生物あるいは細胞だけでなく、その生物あるいは細胞の子孫にも当てはまるということが理解されなくてはならない。後の世代に突然変異あるいは環境の影響のいずれかによる特定の修飾が生じる可能性があるため、これらの子孫は実際には元の生物あるいは細胞と同一ではない可能性があるが、それでもなお、本明細書において用いる「ホスト」という用語の範囲内に含まれる。
「ヒト」という用語は、本願明細書において定義される結合分子に適用した際には、ヒトから直接得られた分子か、ヒトの塩基配列に基づいた分子かのいずれかを意味する。結合分子がヒトの塩基配列に由来するか又はヒトの塩基配列に基づいているのなら、その後修飾を加えたとしても、本明細書の全体を通して使用する場合には依然として「ヒト」結合分子であると見なす。言い換えると、「ヒト」という用語は、結合分子に適用した際には、可変領域または定常領域のいずれかに基づくヒト生殖細胞系列免疫グロブリン塩基配列に由来する可変領域および定常領域を有する結合分子、ヒトの体内またはヒトリンパ球内で生じたのではない結合分子、または修飾された形態の結合分子を含むことを意図されている。従って、ヒト結合分子は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンの塩基配列によってコードされていないアミノ酸残基を含む可能性があり、置換および/または欠失(例:試験管内で、例えばランダム突然変異導入法または部位特異的突然変異導入法によって導入された変異、または生体内で体細胞変異によってもたらされた変異)を含むことがある。本明細書において用いる「〜に基づいた」という言葉は、核酸配列が鋳型から正確に複製される状況か、例えばエラーを起こしやすいPCR法によってマイナーな変異を伴う状況か、あるいは鋳型に正確に合致するかまたはマイナーな変更を伴って合成される状況を指す。ヒトの塩基配列に基づいた半合成分子もまた、本明細書において用いる「ヒト」結合分子あるとみなす。
本明細書において用いる「モノクローナル抗体」という用語は、単一の分子構成(すなわち一次構造)を有する抗体分子調製物、すなわち単一のアミノ酸配列を有する抗体分子調製物を意味する。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。従って、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、単一の結合特異性を示す抗体であって、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンの塩基配列に由来するか、基づいた可変領域および定常領域、または合成配列に完全に由来する可変領域および定常領域を有する該抗体を指す。モノクローナル抗体を作製する方法は問題とされない。
本発明で用いる「核酸分子」という用語は、ヌクレオチドの多量体型を指し、RNA、cDNA、ゲノムDNA、およびこれらの合成型、および前記物質の混合ポリマーの、センス鎖およびアンチセンス鎖双方を含む。ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはどちらかの種類のヌクレオチドの修飾型を指す。この用語には、一本鎖および二本鎖のDNAも含まれる。加えて、ポリヌクレオチドには、天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドのいずれかまたは両方が、天然のヌクレオチド結合および/または非天然のヌクレオチド結合によって結合したポリヌクレオチドが含まれる可能性もある。当業者ならば容易に理解できるように、核酸分子は化学的または生化的に修飾されうるし、もしくは非天然ヌクレオチド塩基又は誘導体化ヌクレオチド塩基を含みうる。このような修飾には、例えば、ラベル化、メチル化、1つまたは複数の天然ヌクレオチドのアナログによる置換、ヌクレオチド間の修飾(例えば、非荷電性の結合(例:メチルホスホネート、リン酸トリエステル、アミド亜リン酸エステル、カルバミン酸エステルなど)、荷電結合(例:ホスホロチオネート、ホスホロジチオエートなど)、懸垂部分(pendent moieties)(例:ポリペプチド)、インターカレータ(例:アクリジン、プソラレンなど)、キレート剤、アルキル化剤、および修飾された結合(例:α‐アノマー核酸など))が含まれる。上記の用語はまた、一本鎖、二本鎖、部分的二重らせん、三重らせん、ヘアピン構造、円形、および南京錠型の立体構造などの、任意のトポロジー構造を含むよう意図されている。また、ポリヌクレオチドの、水素結合やその他の化学的相互作用を介して目的の配列に結合する能力を模倣した合成分子も含まれる。このような分子は当技術分野においては周知であり、例えば、分子骨格においてリン酸結合をペプチド結合で置換した分子などが含まれる。核酸の塩基配列について言及した場合、特に明記しない限りは、その相補鎖も含まれる。従って、特定の配列を有する核酸分子について言及した場合、その相補鎖およびその相補的配列も含まれると理解すべきである。相補鎖もまた、例えばアンチセンス療法、ハイブリッド形成プローブ、およびPCRプライマーに有用である。
「薬学的に許容される賦形剤」とは、好ましい剤形または便利な剤形を調製するために、薬物、薬剤、あるいは結合分子などの活性分子と配合するあらゆる不活性物質を意味する。この「薬学的に許容される賦形剤」は、非毒性であるか、または、少なくとも、使用する用量および濃度では、使用目的において、毒性が服用者にとって許容される程度であるかであって、そして薬物、薬剤または結合分子を含む製剤の他の成分と適合性を有する賦形剤である。
「暴露後予防(PEP)」は狂犬病にかかった動物に暴露したおそれがある人に行なう必要がある。起こり得る暴露には、動物咬傷などの咬傷暴露(例:歯による皮膚へのあらゆる侵入)および非咬傷暴露が含まれる。非咬傷暴露には、研究室や洞穴における大量のエアロゾル化狂犬病ウイルスへの暴露、および、狂犬病により死亡した患者から角膜移植手術を受けたレシピエントが含まれる。開放創、擦り傷、粘膜、あるいは理論的にはかき傷が、狂犬病にかかった動物の唾液または他の潜在的に感染性を有する物質(例えば神経組織)によって汚染した場合にも、非咬傷暴露が生じる。例えば狂犬病にかかった動物をなでたり、狂犬病にかかった動物の血液、尿、または糞便との接触したりするなどの他の接触は、それだけでは暴露とならず、暴露後予防の適応とはならない。PEPは暴露後できるだけ早く開始しなければならない。暴露が起こっていない場合は、暴露後予防は必要でない。全ての暴露後予防の処方計画において、過去に免疫化された人を除いて、能動免疫法および受動免疫法を並行して行なわなくてはならない。
結合分子の相互作用(例えば抗体およびその結合パートナー(例:抗原))に関して、本願明細書において用いる「特異的に結合」という用語は、この相互作用が、ある特定の構造(例えば結合パートナー上の抗原決定基またはエピトープ)の存在に依存していることを意味する。換言すれば、結合パートナーが他の分子や生物の混合物中に存在するときでも、抗体は選択的に結合パートナーに結合するか結合パートナーを認識する。結合は、共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用、あるいは両者の組み合わせによって媒介される。さらに言い換えると、「特異的に結合」という用語は、免疫特異的に抗原またはその断片に結合し、他の抗原には免疫特異的に結合しないことを意味する。免疫特異的に抗原に結合する結合分子は、他のペプチドやポリペプチドに対してより低い親和性で結合することができ、これは例えばラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ELISA)、BIACORE、または当技術分野において周知の他のアッセイによって測定することができる。免疫特異的に抗原に結合する結合分子またはそのフラグメントは、関連抗原と交差反応する可能性がある。免疫特異的に抗原に結合する結合分子またはそのフラグメントは、関連抗原と交差反応しないことが望ましい。
「治療に有効な量」という用語は、狂犬病の暴露後予防に有効である、本明細書において定義される結合分子の量を意味する。
「ベクター」という用語は、第2の核酸分子をホストに導入するために挿入することができる核酸分子を意味し、ホスト内で複製され、場合によっては発現する。換言すると、ベクターは、自身に結合した核酸分子を輸送することができる。本願明細書において用いる「ベクター」という用語は、クローニングベクターおよび発現ベクターの双方を意図している。ベクターには、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体(BAC)および酵母人工染色体(YAC)、そしてバクテリオファージまたは植物または動物(ヒトを含む)のウイルスに由来するベクターが含まれるが、これらに限定されない。ベクターは、予定されるホストによって認識される複製開始点を備え、そして発現ベクターの場合には、ホストによって認識されるプロモータおよび他の制御領域を備える。第2の核酸分子を含むベクターは、例えば形質転換、トランスフェクション、または細菌あるいはウイルスの侵入機構を利用して、細胞内に導入される。例えば、植物細胞および同類のものにおいてしばしば使用するエレクトロポレーションまたは微粒子銃などの、核酸を細胞内に導入する他の方法も周知である。核酸を細胞内に導入する方法は、とりわけ細胞の種類やその他いろいろに依存する。これは、本発明に決定的なものではない。ある種のベクターは、自身が導入されるホスト内で自律複製できる(例えば、細菌複製開始点を有するベクターは、細菌内で複製することができる)。他のベクターは、ホストへ導入された直後にホストのゲノムに組み込まれ、その結果、ホストのゲノムと共に複製される。
本発明は、狂犬病ウイルスに特異的に結合して中和することができる結合分子を提供する。さらに、本発明は、これらの結合分子の少なくとも結合領域をコードする核酸分子に関する。さらに本発明は、狂犬病ウイルスに起因する状態を発現する危険のある被験者への、暴露後予防における本発明の結合分子の用途を提供する。
ヒト抗狂犬病抗体CR-57およびCR-JBのエピトープの認識
CR-57およびCR-JBと呼ばれるヒト抗狂犬病抗体が互いに重複したり互いに競合したりしないエピトープを認識するかどうかという問題に取り組むために、CR-57およびCR-JBと呼ばれるヒト抗狂犬病抗体のエスケープウイルスを生成した。CR-57およびCR-JBは、対応する抗体遺伝子の重鎖および軽鎖可変領域をコードする領域をpcDNA3002(Neo)という名の単一のヒトIgG1発現ベクターへ導入する操作を経て、基本的には記載された通りに生成した(Jones et al., 2003参照)。その結果得られたベクターであるpgSO57C11およびpgSOJBC11は、欧州細胞培養コレクション(ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Great Britainに、1996年2月29日にNo.96022940として寄託され、登録商標PER.C6(登録商標)として市場に出された細胞系由来の細胞において、一時的発現をさせるために使用した。これらの抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号122 〜 129に示す。狂犬病ウイルス株CVS-11(0.5ml)の連続希釈液(10−1〜10−8の幅の希釈液)を一定量(〜4 IU/ml) のCR-57またはCR-JB抗体(0.5ml)と共に、37℃/5%CO2の条件の下で1時間インキュベートしたのち、マウス神経芽腫細胞(MNA細胞)またはBSR細胞(ベビーハムスター腎様細胞系列;Baby Hamster Kidney-like cell line)を含むウェルに加えた。ヒトモノクローナル抗体CR-57またはCR-JBのいずれかの存在下で3日間の選択(セレクション)の後、潜在的なエスケープウイルスを含む培地(1ml)を回収し、更に使用するまで4℃で保存した。続いて、それらの細胞を4℃で20分間アセトン固定し、抗狂犬病N-FITC抗体複合体(Centocor社)を用いて37℃/5%CO2の条件の下で、オーバーナイトで染色した。ウェル毎の細胞増殖巣の数を免疫蛍光測定法により記録し、1〜6個の細胞増殖巣を含むウェルの培地を、ウイルスを増幅させるために選択した。全てのE57エスケープウイルスは、E57B1という例外を除き、単一の細胞増殖巣から生成された(E57B1は3個の細胞増殖巣)。EJBエスケープウイルスは、1個の細胞増殖巣(EJB3F)、3個の細胞増殖巣(EJB2B)、4個の細胞増殖巣(EJB2C)、5個の細胞増殖巣(EJB2E, 2F)、または6個の細胞増殖巣(EJB2D)からそれぞれ単離された。各々のエスケープウイルスを、成長特性に基づき、BSRまたはMNA細胞を用いてスモールスケールでまず増幅した。その後、これらの小さなウイルスバッチを、BSRまたはMNA細胞においてウイルスをラージスケールで更に増幅するために用いた。続いて、それぞれのエスケープウイルスバッチのタイター、およびウイルス中和アッセイでの使用に最適なエスケープウイルス希釈物(24時間後に80〜100%を感染させる濃度)を決定するために、増幅されたウイルスをMNA細胞において漸増した。
狂犬病ワクチンを接種されたドナーの末梢血リンパ球を用いたScFvファージ・ディスプレイ・ライブラリの構築
狂犬病ワクチンの接種を受けた4人のヒトの被験者の静脈から、最後のブーストの一週間後に、50mlの血液を採取した。Ficollの細胞密度分画を用いて、これらの血液サンプルから末梢血リンパ球(PBL)を単離した。血清は−20℃で冷凍保存した。狂犬病ウイルス糖タンパク質をトランスフェクションされた293T細胞のFACS染色により、血清中に抗狂犬病抗体が存在に関して、陽性が確認された。有機相分離(TRIZOL(登録商標))、続いてエタノール沈殿を用いて、PBLから全RNAを調整した。得られたRNAをDEPCで処理した超純水に溶かし、その濃度を260nmでの吸光度測定によって決定した。その後、RNAを、100 ng/μlの濃度に希釈した。次に、以下のように、1μgのRNAをcDNAに変換した:全10μlのRNAに、13μlのDEPC処理した超純水および1μlのランダムな6量体(DNA)(500 ng/μl)を加え、得られた混合物を65℃で5分間加熱し、氷浴上で急冷した。そこへ、8μlの5×First-Strand buffer、2μlのdNTP(それぞれ10mM)、2μlのDTT(0.1M)、2μlのRnase阻害剤(40 U/μl)、および2μlのSuperscript(登録商標)III MMLV 逆転写酵素(200 U/μl)を加え、室温で5分間インキュベートした後、50℃で1時間インキュベートした。 反応は、熱不活性化、すなわち、混合物を75℃で15分間インキュベートすることにより、停止させた。
狂犬病ウイルス糖タンパク質を特異的に認識する単鎖Fvフラグメントを有するファージの選択
抗体フラグメントの選択は、抗体ファージ・ディスプレイ・ライブラリ、一般的なファージディスプレイ技術、およびMAbstract(登録商標)技術を用いて、基本的には米国特許番号第6,265,150号およびWO 98/15833(これらは共に参照することによって本明細書に組み込まれる)に記載の通りに行なった。使用した抗体ファージライブラリは、2つの異なる半合成scFvファージライブラリ(JK1994およびWT2000)と、上の実施例2に記載した通りに調製した免疫scFvファージライブラリ(RAB-03-G01およびRAB-04-G01)である。第一の半合成scFvファージライブラリ(JK1994)は“de Kruif et al. (1995b)”に記載されており、第二の半合成scFvファージライブラリ(WT2000)は、基本的に“de Kruif et al. (1995b)”に記載された通りに作製した。簡潔には、このライブラリは、CDR領域に変異を組み込む変性オリゴヌクレオチドを用いて、重鎖および軽鎖V遺伝子の内部に変異を組み込まれた半合成体の形式を有する。VH3重鎖遺伝子のみを、カッパおよびラムダ軽鎖と組み合わせて使用した。重鎖のCDR1およびCDR3、そして軽鎖のCDR3を、"de Kruif et al. (1995b)"の記載と同様のPCRをベースにした方法で合成的に再現した。このように作製したV領域遺伝子を順次scFvの形式としてファージミドベクターにクローン化し、ファージライブラリを生成するために前述の方法で増幅した。更に、WO 02/103012(参照することによって本明細書に組み込まれる)に記載されている方法およびヘルパーファージを本発明で使用した。狂犬病ウイルス糖タンパク質を認識するファージ抗体を同定するために、全狂犬病ウイルス(狂犬病ウイルスピットマン・ムーア(Pitman-Moore)株)をβ‐プロピオラクトンでの処理によって不活性化したもの、狂犬病ウイルス糖タンパク質(狂犬病ウイルスERA株)を精製したもの、および/または狂犬病ウイルスGタンパク質(狂犬病ウイルスERA株)を発現するトランスフェクション細胞を用いて、ファージ選択実験を行った。
狂犬病ウイルス糖タンパク質に特異的な単鎖ファージ抗体の検証
上記のスクリーニングによって選択した単鎖ファージ抗体の特異性、すなわち狂犬病ウイルスGタンパク質への結合をELISAによって検証した。加えて、単鎖ファージ抗体の、5%FBSへの結合も検証した。この目的のために、狂犬病ウイルスGタンパク質または5%FBSの調合液をMaxisorp(登録商標)ELISAプレートにコートした。コーティングの後、プレートをPBS/1%Protifar中で、室温で1時間ブロッキングを行なった。選択された単鎖ファージ抗体を、等容積のPBS/1%Protifar中で15分間インキュベートすることによって、ブロッキングされたファージ抗体を得た。プレートを空にし、ブロッキングされたファージ抗体をウェルに加えた。続いて1時間のインキュベーションへと進むことが可能となり、プレートを0.1% Tween-20を含むPBS中で洗浄し、結合したファージ抗体をペルオキシダーゼに結合した抗M13抗体を用いて(492nmでの吸光度測定を用いて)検出した。同時にコントロールとして、この手順を単鎖ファージ抗体を使用しないか、ネガティブコントロールとしてCD8 (SC02-007)に対する単鎖ファージ抗体を使用するか、またはポジティブコントロールとして狂犬病ウイルス糖タンパク質(scFvSO57)に対する単鎖ファージ抗体を用いることによって行った。表8に示すように、選択されたファージ抗体で、SC04-001、SC04-004、SC04-008、SC04- 010、SC04-018、SC04-021、SC04-026、SC04-031、SC04-038、SC04- 040、SC04-060、SC04-073、SC04-097、SC04-098、SC04-103、SC04- 104、SC04-108、SC04-120、SC04-125、SC04-126、SC04-140、SC04-144、SC04-146およびSC04-164と呼ばれるファージ抗体が、固定された精製狂犬病ウイルスGタンパク質への有意な結合を示した一方、FBSへの結合は観測されなかった。上記の通りに作製した、不活性化された完全な狂犬病ウイルスを用いたELISA分析においても、同一の結果が得られた(データは図示せず)。
狂犬病ウイルスに特異的なscFvの特徴
選択された特異的な単鎖ファージ抗体(scFv)のクローンからプラスミドDNAを得て、標準的な技術によってヌクレオチド配列を決定した。SC04-001、SC04-004、SC04-008、SC04-010、SC04-018、SC04-021、SC04-026、SC04-031、SC04-038、SC04-040、SC04-060、SC04-073、SC04-097、SC04-098、SC04-103、SC04-104、SC04-108、SC04-120、SC04-125、SC04-126、SC04-140、SC04-144、SC04-146およびSC04-164と呼ばれるscFvのヌクレオチド配列(クローニングのための制限酵素認識部位を含む)は、それぞれ、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号179、配列番号181、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号191、配列番号193、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201および配列番号203に示される。SC04-001、SC04-004、SC04-008、SC04-010、SC04-018、SC04-021、SC04-026、SC04-031、SC04-038、SC04-040、SC04-060、SC04-073、SC04-097、SC04-098、SC04-103、SC04-104、SC04-108、SC04-120、SC04-125、SC04-126、SC04-140、SC04-144、SC04-146およびSC04-164と呼ばれるscFvのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202および配列番号204に示される。
狂犬病ウイルスに特異的なscFvによる試験管内での狂犬病ウイルスの中和(修正RFFIT)
選択されたscFvが狂犬病ウイルス感染を阻止する能力があるかを判断するために、試験管内での中和アッセイ(修正RFFIT)を行った。scFvの調合液を1:5希釈から始めて、3倍連続希釈した。狂犬病ウイルス(CVS-11株)を、80〜100%の感染率を与える濃度で各希釈物に加えた。ウイルス/scFvの混合物を、MNA細胞に添加する前に37℃/5%CO2の条件で1時間インキュベートした。感染後24時間(34℃/5%CO2の条件)の時点で、細胞を4℃で20分間アセトン固定し、抗狂犬病N-FITC抗体複合体(Centocor社)を用いて最低3時間染色した。その後、蛍光顕微鏡を用いて狂犬病ウイルス感染があるかについて細胞を分析し、50%エンドポイントの希釈物を決定した。50%エンドポイントの希釈物とは、このアッセイ中でウイルス感染が50%阻害される希釈物を指す(実施例1参照)。複数のscFvが狂犬病ウイルスに対して中和活性を示すことが確認された(表10参照)。
scFvを用いた狂犬病ウイルスGタンパク質競合ELISA
互いに重複したり競合したりしないエピトープに結合する抗体を同定するために、狂犬病糖タンパク質の競合ELISA分析を実施した。精製された狂犬病ウイルス糖タンパク質(1mg/ml;狂犬病ウイルスERA株)を PBS中で1:1000希釈した液(50μl)を用いて、Nunc-Immuno(登録商標) Maxisorp F96プレート (Nunc)を4℃でオーバーナイトでコートした。コートされなかったタンパク質を洗い流し、ウェルを100μl PBS/1%Protifarを用いて室温で1時間ブロッキングした。続いて、ブロッキング溶液を取り除き、PBS/1%Protifar溶液中の精製されていない抗狂犬病ウイルスscFv(2倍希釈液)を50μl加えた。ウェルを100μlのPBS/0.05% Tween-20で5回洗浄した。その後、ビオチン化した抗狂犬病ウイルス競合IgGであるCR-57bioを各ウェルに50μlずつ加え、5分間室温でインキュベートし、その後ウェルを100μlのPBS/0.05% Tween-20で5回洗浄した。CR-57bioの結合を検出するために、ストレプトアビジン-HRP抗体(Becton Dickinson)の1:2000希釈物をウェルに50μl加え、室温で1時間インキュベートした。ウェルを再び上記の通りに洗浄し、OPD reagens (Sigma)を100μl加えることによって、ELISA分析をさらに進めた。1M H2SO4を50μl加えることによって反応を停止させ、492nmでの吸光度測定を行った。
選択された抗狂犬病ウイルス単鎖Fvからの、完全なヒト免疫グロブリン分子(ヒトモノクローナル抗狂犬病ウイルス抗体)の作製
SC04-001、SC04-008、SC04-018、SC04-040およびSC04-126と呼ばれるscFvの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、オリゴヌクレオチドを用いてPCRで増幅し、それぞれに制限酵素認識部位、および/またはIgG発現ベクターpSyn-C03-HCg1(配列番号277参照)およびpSyn-C04-Cl(配列番号278参照)における発現のための配列を付け加えた。VH遺伝子およびVL遺伝子を表12および表13に示したオリゴヌクレオチドを用いてそれぞれ増幅し、PCR産物をpSyn-C03-HCg1ベクターおよびpSyn-C04-Clベクターへそれぞれクローニングした。
IgGによる狂犬病ウイルスGタンパク質競合ELISA
ヒトモノクローナル抗狂犬病ウイルスGタンパク質IgGが互いに重複したり競合したりしないエピトープに結合するか調べるため、競合実験を行った。狂犬病Gタンパク質でコートしたウェルを、複数の濃度(0〜50ig/ml)の非標識抗狂犬病ウイルスGタンパク質のIgGと共に、1時間室温でインキュベートした。その後、それぞれのウェルに、異なるビオチン化抗狂犬病ウイルスIgG(1ig/ml)を50μl加え、室温で5分間インキュベートし、直ちに100μlのPBS/0.05% Tween-20で5回洗浄した。続いて、ストレプトアビジン-HRP抗体(Becton Dickinson)の1:2000の希釈物を50μl加えて室温で1時間インキュベートし、上記の通りに洗浄し発色させた。非標識IgGの濃度の増加に伴うシグナルの減少は、2つの抗体が互いに競合していて、同じエピトープまたは重なり合うエピトープを認識することを示す。
狂犬病ウイルスの試験管内での中和の際の抗狂犬病IgGの加法的/相乗的効果(修正RFFIT)
抗狂犬病ウイルスGタンパク質のIgGが狂犬病ウイルスの中和において加法的または相乗的効果をもたらすかを決定するために、様々な組み合わせのIgGを試験した。まず、修正RFFITによって、それぞれの抗体単独での(IU/mgの単位での)効力を決定した(実施例1参照)。次に、IU/mgの量を等しくそろえて抗体の組み合わせを調製し、修正RFFITの試験を行った。抗体の組み合わせ各々の効力を決定し、期待される効力と比較することができる。もしも、抗体の組み合わせの効力が、組み合わせの中に存在する個々の抗体の効力の和と同じ値になるならば、これらの抗体は相加的な効果を有する。もしも抗体の組み合わせの効力の方が大きいのならば、抗体は狂犬病ウイルスの中和において相乗的な効果を有する。
組み換えヒト抗狂犬病ウイルス抗体によって認識されるエピトープの、PEPSCAN-ELISAによる同定
狂犬病ウイルスERA株のGタンパク質の細胞外ドメインより、15mer直線状ペプチドおよびループ状/環状ペプチドを合成し(狂犬病ウイルスERA株の糖タンパク質Gの完全なアミノ酸配列については配列番号207を参照されたい、細胞外ドメインはアミノ酸20-458からなる;EMBLデータベースにおける狂犬病ウイルスERA株の糖タンパク質のタンパクIDはJ02293である)、前述のように、クレジットカード状のミニPEPSCANカード(1枚のカードにつき455個のペプチドのフォーマット)を用いてスクリーニングを行った(Slootstra et al. , 1996; WO 93/09872)。全てのペプチドをアミノ酸末端でアセチル化した。全てのループ状のペプチドにおいて、位置2および位置14をシステインで置き換えた(acetyl-XCXXXXXXXXXXXCX-minicard)。準備したペプチド中で、位置2および位置14のシステインの近傍に他のシステインが存在した場合、それらをアラニンで置き換えた。ループ状のペプチドは標準的なFmoc法で合成し、スカベンジャー付きのトリフルオロ酢酸を用いて脱保護した。続いて、脱保護したペプチドを、1,3- ビス(ブロモメチル)ベンゼンを含む炭酸水素アンモニウム(20mM、pH7.9/アセトニトリル(1:1(v/v))溶液0.5mM中で、カードの上で反応させた。カードを、溶液に完全に浸った状態で30〜60分間穏やかに振盪した。最後に、過剰のH2Oを用いてカードを十分に洗浄し、PBS中に1%SDS/0.1%β‐メルカプトエタノールを含む破壊バッファ(pH7.2)中において70℃で30分間超音波処理を行い、続いてH2O中で45分間超音波処理を行った。ヒトモノクローナル抗体を上述の通りに作製した。これらの抗体の、各直線状ペプチドおよびループ状ペプチドへの結合を、PEPSCANに基づいた酵素免疫測定法(ELISA)を用いて検証した。共有結合したペプチドを含む455個のウェルを有するクレジットカード状のポリプロピレンカードを、抗体(10ig/ml;5%のウマ血清(v/v)および5%のオボアルブミン(w/v)を含むブロッキング液中に溶解)と共にインキュベートした(4℃、オーバーナイト)。洗浄後、ペプチドを抗ヒト抗体ペルオキシダーゼ(1/1000希釈物)と共にインキュベートし(25℃で1時間)、続いて、ペルオキシダーゼ基質を洗浄後、2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-スルホン酸) (ABTS)および2il/mlの3%H2O2を加えた。(直線状ペプチドおよびループ状ペプチドに対する)コントロールを、抗ヒト抗体ペルオキシダーゼのみと共にインキュベートした。1時間後、発色現象を測定した。ELISAの発色現象を、CCDカメラおよび画像処理システムを用いて定量化した。この装置は、CCDカメラおよび55mmレンズ(ソニー製CCDビデオカメラXC-77RR、ニコン製“micro-nikkor 55 mm f/2.8 レンズ”)、カメラアダプター(ソニー製カメラアダプターDC-77RR)、および画像処理ソフトウェアパッケージOptimas, version 6.5(Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, U.S.A.)から構成される。Optimasは、pentium II コンピュータシステム上で作動した。
試験管内中和アッセイを用いた、抗狂犬病ウイルスGタンパク質IgGの中和効力の決定(修正RFFIT)
作製したヒトモノクローナル抗体の中和効力を実施例1に記載の通り、修正RFFITによって決定した。16個のIgGが狂犬病CVS-11株を1000 IU/mgより大きな効力で中和し、2 IU/mgより低い効力を有するIgGは2つだけであった(表15参照)。16個の抗体のうちの8個の効力は、一時的に発現させて作製したCR-57の効力を上回り、これらが狂犬病ウイルスの暴露後予防においてCR-57よりも効果的であることを示唆した。一時的に発現させて生成したCR-57の効力は、約3800 IU/mgタンパク質(表1および表15参照)であった一方、安定的に生成されたCR-57は5400 IU/mgタンパク質(データは示さず)の効力を示した。興味深いことに、同定された中和ヒトモノクローナル抗体の大半は、重鎖可変生殖系列遺伝子3−30を有する(表9参照)。
抗狂犬病ウイルスIgGによるE57エスケープウイルスの試験管内での中和
新規のヒトモノクローナル抗狂犬病抗体の特徴を更に調べるため、IgGのE57エスケープウイルスに対する中和活性を、上記のように修正RFFITによって調べた。抗狂犬病ウイルスIgGの大半は、6種類のE57エスケープウイルスの全てに対して良好な中和活性を示した(表16参照)。一方、CR04-008、CR04-018およびCR04-126は、それぞれ、E57エスケープウイルスの6/6、2/6、および3/6を中和しなかった。「中和しない」とは、1:100の抗体希釈物を用いても50%エンドポイントに到達しないことを意味する。CR04-021、CR04-108、CR04-120、CR04-125、およびCR04-164の中和活性は、エスケープウイルスの個数を増やすに従って有意に減少した。このことは、これらの抗体のエピトープは、E57エスケープウイルス糖タンパク質の影響を直接的または間接的に受けることを意味する。上記に基づくと、暴露後予防の処置のための抗狂犬病カクテルにおいて、複数の抗狂犬病ウイルスIgGはCR-57と適合する。特に、上記で同定した6つの独自のIgGのパネル、すなわち、抗体CR04-010、CR04-040、CR04-098、CR04-103、CR04-104、およびCR04-144は、E57エスケープウイルスに対して良好な中和効力を示し、このことは、これらの抗体によって認識されるエピトープはCR-57によって導入されたアミノ酸変異の影響を受けなかったことを示唆する。抗体CR04-098は各エスケープウイルスに対して3000 IU/mgよりも大きな効力を示しため、最も有望である。
抗狂犬病抗体CR-57およびCR04-098のエピトープ認識
CR-57およびCR04-098と呼ばれるヒトモノクローナル抗体が互いに重複たり、互いに競合したりしないエピトープを認識することを確認するため、CR04-098と呼ばれるヒトモノクローナル抗体のエスケープウイルスを、基本的にはCR57のエスケープウイルスについて記載したのと同様の方法で作製した(実施例1参照)。手短に言うと、ウェル毎の細胞増殖巣の数を免疫蛍光測定法により記録し、好適には1個の細胞増殖巣を含むウェルの培地を、ウイルスを増幅させるために選択した。全てのE98エスケープウイルスは、E982(2個の細胞増殖巣)およびE98-4(4個の細胞増殖巣)という例外を除き、単一の細胞増殖巣から生成された。中和指数がlog2.5よりも小さいウイルスをエスケープ変異体と定義した。中和指数は、「ウイルスおよびモノクローナル抗体(約4 IU/ml)を感染させたBSR細胞培養液中に産生された、1mlあたりの感染性ウイルス粒子の個数」を「ウイルスのみが感染したBSRまたはMNA細胞培養液中に産生された、1mlあたりの感染性ウイルス粒子の個数」から引くことによって求めた(log(モノクローナル抗体非存在下でのウイルス1mlあたりの細胞増殖巣形成単位数−log(モノクローナル抗体存在下でのウイルス1mlあたりの細胞増殖巣形成単位数))。log2.5よりも小さな指数はエスケープウイルスが存在する証拠とした。
CR57およびCR04-098によって認識されるエピトープの保存の評価
CR-57の最小結合領域(配列番号332中のアミノ酸KLCGVL;CR57によって認識される狂犬病ウイルス糖タンパク質の領域であることが、PEPSCANおよびアラニンスキャニング技術によって決定された領域)を229個の遺伝子型1の狂犬病ウイルス分離株のヌクレオチド配列と比較し、エピトープの保存を評価した(表18参照)。サンプル集合には、ヒト分離株、コウモリ分離株、およびイヌ分離株または狂犬病のイヌに噛まれたであろうと最も考えられる家畜からの分離株が含まれた。最小結合領域の各部位のアミノ酸の出現頻度分析から、エピトープを形成する必須のな残基が高度に保存されていることが判明した。位置1に存在するリジンは99.6%の分離株で保存され、229個の分離株のうち1つにおいてのみ、保存的なK>R変異が観測された。位置2および3(LおよびC)は完全に保存されていた。中央部のシステイン残基は糖タンパク質のフォールディングに構造的にかかわり、全リッサウイルスを通して保存されると考えられている(Badrane and Tordo, 2001を参照)。位置4のグリシンは98.7%の分離株で保存され、229個の分離株のうち3つにおいて荷電アミノ酸への変異がみられた(1/229の分離株でG>R変異、2/229の分離株でG>E変異)。5番目の位置もまた、1つの分離株で保存的なV>I変異が観測されたという以外を除き、保存されていた。アラニン置換スキャンによって必須の残基ではないと決定された6番目の位置においては、街上分離株(srreet isolates)に有意な多様性がみられた;すなわち、70.7%の株でL、26.7%の株でP、2.6%の株でSであった。総合すると、遭遇する可能性のある狂犬病ウイルスの約99%は、CR-57によって認識されると予測される。
Claims (15)
- 狂犬病ウイルス中和活性を有する結合分子であって、
前記結合分子が、配列番号39のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号63のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを備える結合分子、又は
配列番号39のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列の相同性を有し、かつ配列番号39と比較して1以上のアミノ酸が改変されている重鎖可変領域と、配列番号63のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列の相同性を有し、かつ配列番号63と比較して1以上のアミノ酸が改変されている軽鎖可変領域とを備え、かつ狂犬病ウイルス又はその断片に対して特異的に結合するために、配列番号39と配列番号63とを備える結合分子と競合することが可能であり、かつ狂犬病ウイルス中和活性を依然として有する結合分子であることを特徴とする結合分子。 - 結合分子がヒト由来であることを特徴とする請求項1記載の結合分子。
- 結合分子がIgGであることを特徴とする請求項1又は2記載の結合分子。
- 請求項1〜3のいずれか一つに記載の結合分子を備え、さらに少なくとも1つのタグを備える免疫コンジュゲート。
- 請求項1〜3のいずれか一つに記載の結合分子をコードする核酸分子。
- 請求項5に記載の核酸分子を少なくとも1つ備えるベクター。
- 請求項6に記載のベクターを少なくとも1つ備えるホスト細胞。
- ヒト細胞である、請求項7に記載のホスト細胞。
- 請求項1〜3のいずれか一つに記載の結合分子を生産する方法であって、
a)請求項7または8に記載のホスト細胞を、結合分子の発現を起こすような条件の下で培養する工程、および、
b)発現した結合分子を回収する工程、から構成される方法。 - 請求項1〜3のいずれか一つに記載の結合分子を含む医薬品組成物であって、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含む医薬品組成物。
- 狂犬病ウイルス中和活性を有し、かつ狂犬病ウイルスの互いに異なった、競合しないエピトープに結合する少なくとも1つの追加的な結合分子を含み、
追加的な結合分子が、配列番号273のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号275のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを備えることを特徴とする請求項10に記載の医薬品組成物。 - 医薬品として使用される、請求項1〜3のいずれか一つに記載の結合分子、請求項4に記載の免疫コンジュゲート、または請求項10〜11のいずれか一つに記載の医薬品組成物。
- 狂犬病ウイルスの診断、予防、治療、またはそれらの組み合わせにおいて使用される、
請求項1〜3のいずれか一つに記載の結合分子、請求項4に記載の免疫コンジュゲート、
または請求項10〜11のいずれか一つに記載の医薬品組成物。 - 狂犬病ウイルスの診断、予防、治療、またはそれらの組み合わせのための薬剤の調剤において、請求項1〜3のいずれか一つに記載の結合分子、請求項4に記載の免疫コンジュゲート、または請求項10〜11のいずれか一つに記載の医薬品組成物を使用する方法。
- 少なくとも1つの請求項1〜3のいずれか一つに記載の結合分子、請求項4に記載の免疫コンジュゲート、または請求項10〜11のいずれか一つに記載の医薬品組成物、またはこれらの組み合わせを備えたキット。
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